JPH06507420A - Vaccines against mucosal pathogens and their production method - Google Patents

Vaccines against mucosal pathogens and their production method

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JPH06507420A
JPH06507420A JP5508757A JP50875793A JPH06507420A JP H06507420 A JPH06507420 A JP H06507420A JP 5508757 A JP5508757 A JP 5508757A JP 50875793 A JP50875793 A JP 50875793A JP H06507420 A JPH06507420 A JP H06507420A
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JP5508757A
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ブラハムバット，ヒマンシュ
ヴィーランド，ユルゲン
ブラウンリー，ロバート・エム
ティミス，ケニース
ホワイト，ディヴィッド・シー
グツマン，カルロス・エイ
ウォーカー，マーク・ジェイ
ファウンテイン，マイケル・ダヴリュ
Original Assignee
ゲゼルシャフト・フュア・ビオテクノロギッシェ・フォルシュンク・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング　（ゲー・ベー・エフ）
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]

粘膜の病原体に対するワクチンとその製法問題点 百日咳は普通小児に多い重い呼吸器疾患で、１９３０年代までは小児の疾病率、 死亡率の主原因の一つであった。その後百日咳菌（Ｂｏｒ−ｄｅｔｅｌｌａ　ｐ ｅｒｔｕｓｓｉｓ　、病原菌）を加熱滅菌した全細胞調製品の非経口予防接種が 普及し、社会的、経済的状況が好転したため、先進国に於いては百日咳の発生率 が著しく減少した。しかしこの２０年の間にこの病気の発生率か急激に増加して おり、これは百日咳ワクチンに原因すると思われる副作用の可能性を心配した親 達かワクチンの接種を控えるようになったためである。この副作用はその程度が 穏やかな局所的反応からしつこい号泣を経て永久脳症にまで及んでおり、国によ っては法的責任を恐れた医者が予防接種の勧めを躊躇している。その上ワクチン の効果がメーカーによって著しい相違があり、全てのワクチン調製品が有効であ るわけではない。 近年百日咳の研究の主な課題の一つは、反応原性を少なくし免疫原性を高めたは っきり規定された無細胞ワクチンの開発にあるか、百日咳の非常に複雑な病原性 と感染後の免疫学的防御機構に関する知識が十分でないためその開発は遅れてい る。百日咳菌は病原性に付随する幾つかの因子を有するが、その内のどれが人体 の防御抗原であるか、又との因子かワクチンの反応原性と関連しているかに就い て結論が得られていない。精製した抗原、即ち解毒した百日咳毒素と繊維状血球 凝集素とをベースにしたワクチンがスウェーデンでの実地試験である程度の効果 を示したか、このワクチンか防御作用に関連の可能性のある他の抗原により汚染 されていたことは明らかである。従って、反応原性のない効果の高いワクチンは 未だ利用できず、これに代わる方法の開発が必要である。本発明者等は、経口又 は鼻腔内投与後に空気の経路で免疫応答を刺激するために、百日咳菌抗原を含む リポソームが使用できるがどうかを研究した。 序説 先進国に於ける百日咳の発生率は、百日咳菌を加熱滅菌した全細胞調製品の非経 口予防接種の普及により著しく減少したが、この予防接種に関連のある副作用の 可能性が広く知れ渡ってこの接種を受ける人が減少し［４８１、ワクチンの製造 に関連してその効果にばらつきがあり［ｌ９１、又百日咳の発生率の９５％を占 める低開発国では予防接種の体制ができていない［３４］ため、百日咳は依然と して世界的の問題である。 ワクチンの効果に再現性を欠く理由の一つに、感染に対する防壁の第一線として 必要な粘膜の免疫システムを刺激するのに百日咳菌抗原の非経口投与では充分で ない点が考えられる。疫学的検討結果によれば、現在のワクチンは感染よりもむ しろ病気を防御するようてある［１１１。抗原の経口又は鼻腔内投与の方が防御 効果が大きいだけでなく非経口投与に関連した副反応の多くを避けることができ るようである。しかし、経口投与された抗原は短時間の免疫反応を誘導するだけ てあることが多く、この反応を促進するためにアジュバントを必要とする。 リン脂質二重層小胞（リポソーム）は非常に多種の生物学的活性物質を特定の組 織に運搬するシステムとして使用されており、最近では幾つかの細菌抗原及びウ ィルス抗原に対する免疫応答を高めるための免疫学的アジュバントとして用いら れるようになった［１７］。 ここでは、肺の中の百日咳菌表面抗原に対する免疫学的応答を高めるための運搬 システムとしてのリポソームの可能性に就いて報告する。 換言すれば、百日咳菌はヒトの呼吸器管に感染する百日咳の病原学的要因である 。この病気には特に小児が罹りやすく、神経の病気から死を招くこともある［６ ２１゜保健上での百日咳の疾病率及び死亡率の影響は報告の不足から普通低く見 られがちであるか、百日咳による或いは百日咳に関連した発病数は年間六千万件 、死亡者は年間五十万Å以上と推定される［３４１゜予防接種が強制されていな い国での百日咳の感染率は非常に高く、１７〜１９才の人の血清の９５％迄か百 日咳に対する抗体を含んでいる１１５１゜先進国では加熱滅菌した全細胞ワクチ ンの接種が普及しているため百日咳の発生率は非常に減少した［１２］。このワ クチンによる恩恵は、稀ではあるが重症の副作用の危険に比べて極めて大きいこ とは明らかであるが、安全性と免疫原性に就いての一般的懸念の結果予防接種の 割合か減少した［２２．３３］。更に幾つかの国例えばアメリカ合衆国では、免 疫感作率が高いにもかかわらず年間３０．０００〜１２５、０００の百日咳の発 病かある［５５まために全細胞ワクチンの効果か疑問視されている。従って、は っきり規定された毒性のない、免疫原性の高い新世代のワクチンが強（要望され ている。はっきり規定された無細胞ワクチン中に封入するために百日咳菌の幾つ かの毒性因子か考慮されており、解毒した百日咳毒素（ＰＴ）と繊維状血球凝集 素（ＦＨＡ）とがその第一の候補である［２９．４０］。非経口経路により投与 された従来のサブユニットワクチンは先ず体液の免疫性を誘導するか、粘膜の抗 体応答は低い。しがし、百日咳菌は呼吸器管の粘膜を通して感染し、自然の感染 の後に特異性免疫グロブリン（Ｉｇ）Ａが誘導される［５７１゜そのような抗体 は宿主をコロニー形成と病気の両方に対してよく防御するようである。従って、 空気の経路で粘膜の免疫を刺激する手段を開発し、感染と病気の両方に対するこ の手段の防御効果を評価することは検討の価値があると思われる。 リポソームは薬剤、抗原、ホルモン、遺伝子物質の運搬システムとして効果的に 用いられている［１７１゜又リポソームに封入した抗原による次のような免疫が 有望な成果を収めた。即ち寄生虫［４，２４，２５゜４５、４９］、ウィルス［ １０，３８］、細菌［８，１８，４３，４６，５２，６１］の抗原に対して経口 ［１８，４３，４５，６１１及び非経口［４，８，１０，２４，２５，４６，４ ９，５２］経路が使用された。リポソームに封入した抗原を使用し、保護免疫［ ４，８゜１８、２４．２５．４５．４９．５２］、或いは少なくとも細胞の仲介 ［８１及び体液の応答［１０，４６１の結果が得られた幾つかの研究に於いて、 このようなリポソームのアジュバントとしての能力が実証された。リポソームの アジュバント活性は、小胞の大きさと構造、脂質の構成、表面の電荷、抗原の局 在、免疫される動物の種、免疫の経路、ラメラの分布と数のような幾つかの因子 によって決まるようである。経口投与の抗原をリポソームに組み合わせると、抗 原の吸収を高めて細胞プロセッシングを行わせ、Ｔ細胞へのプレゼンテーション と局部のリンパ節への受入れを容易にする。この過程が体液性、分泌性、及び細 胞仲介の免疫応答の誘発を改善する［１．２．１７．５８］。 本報告には、マウスを経口的に免疫にした後で、特異性の全身性又は分泌性免疫 応答を誘発するための、ＦＨＡ及びＰＴを封入したりボソームの能力に就いて記 載した。 一つの実施例によれば、本発明は粘膜の病原体に対するワクチンに関するもので あり、ワクチンがリポソームの運搬システムから成り或いは反応成分として該運 搬システムを含み、該運搬システムが脂質小胞から成り又はこれを含むようなワ クチンに於いて、前記脂質小胞がその外膜に組み込まれた少なくとも１種の粘膜 の病原体抗原を含むことを特徴とするワクチンに関する。 本発明の前記ワクチンは、粘膜の病原体がボルデテラ属、特にＢ型、百日咳菌、 赤痢菌又は連鎖球菌の一種の株であることを特徴とすることができる。 本発明の前記ワクチンは又、前記抗原が百日咳菌の外膜タンパク質（ＯＭＰ）の 一つの調製品であることを特徴とすることができる。 本発明の前記ワクチンは又、前記抗原が百日咳菌の一つのリボ多糖（ＬＰＳ）で あることを特徴とすることができる。 本発明の前記ワクチンは又、前記抗原が百日咳菌の繊維状血球凝集素及び／又は 百日咳毒素であることを特徴とすることができる。 本発明の前記ワクチンは又、百日咳菌の外膜タンパク質（ＯＩＪＰ）の一つの調 製品と同じく百日咳菌の一つのリボ多糖（ＬＰＳ）との両方を抗原として含むこ とを特徴とすることができる。 本発明の前記ワクチンは又、脂質小胞による前記ワクチンが大豆をベースとした 小さい多重膜リン脂質小胞であることを特徴とすることができる。 もう一つの実施例によれば、本発明は本発明によるワクチンの調製方法に関し、 溶剤希釈微粒子担体技術により一種又は数種の抗原を脂質小胞に組み込むことを 特徴とする。 百日咳菌のリボ多糖（ＬＰＳ）と外膜タンパク質（ＯＭＰ）との調製品を大豆か らのリン脂質から成る多重膜リポソーム（Ｌｙｐｈａｓｏｍｅ”、　ファウシテ ィン・ファマシューティカルス（Ｆｏｕｎｔａｉｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ ａＩｓ）　、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）に組み込んだ。この被覆リポソームをマウスに経 口又は鼻腔内接種で投与した所、肺洗浄液に抗原特異性の抗体応答が認められた 。免疫応答を誘発するのにＯＭＰ−被覆リポソームの方がＯＭＰｊｌ製品単独よ りも明らかに有効であった。最初の免疫処理後３０日目に追加免疫（ブースター ）を行ったマウスの場合が応答が最高であった。最高の応答は追加免役後２０日 目に得られたが、特異性抗体は二次免疫後７５日目にも尚検出できた。 これらの結果は、このリポソーム抗原運搬システムが百日咳菌の感染を有効に防 御するために必要と思われる分泌性抗体応答を刺激する能力を備え、且つ各種の 百日咳菌からのタンパク質候補及び／又はＬＰＳ抗原の運搬にも適用できる筈で あることを示している。 リポソームはこれまで生体内の抗体応答を誘発するために用いられてきたか、鼻 腔内免疫感作又は経口投与後の肺の抗体応答に就いての報告は見当たらないが、 このような検討はかなり重要である。 現在の全ての百日咳ワクチンが非経口的に投与されており、この方法がコロニー 形成とその後の感染を防御する第一線として必要な粘膜の免疫システムを刺激す るには不充分であると思われるからである。事実、現在のワクチンが感染を防ぐ よりもむしろ病気を防ぐことを示唆する疫学的証拠もある。抗原の経口又は鼻腔 内投与は防御効果を向上するだけでなく、非経口ワクチン接種に関連した副反応 、例えばタンパク質抗原の調製品を汚染する少量の遊離ＬＰＳによる内毒素ショ ックを避けることができる。本発明者等が示すように、ＬＰＳを封入したリポソ ームでは恐ら＜　ＬＰＳの脂質Ａの部分の宿主細胞膜への挿入が妨げられるため に内毒素ショックは起こらない。 このような運搬システムは動物の宿主に粘膜経路、即ち主として肺又は腸管から 侵入する、その他の細菌病原体に対するワクチンにも適用できると思われる。 百日咳菌のリポソームに組み込んだ繊維状血球凝集素（ＰＨＡ）と解毒した百日 咳毒素（ＰＴ）とをワクチンとしてマウスに経口的に投与した所、ＦＨＡ−及び ＰＴ−特異性免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｇが血清中に、又１ｇＧと［ｇＡとの両方 が肺洗浄液中に検出された。封入抗原により免疫にされたマウスの抗体力価は、 封入されていないＰＨＡ及びＰＴによる免疫のマウスの力値よりも明らかに高く 、リポソーム担体のアジュバント活性を示している。この結果は、ＦＨＡ及びＰ Ｔ　（又恐らく他の百日咳抗原）に対する免疫反応をヒトの中に誘発するこの研 究が有用であり、又百日咳菌の感染と病気の両方を防御するための大規模の免疫 に利用される可能性のあることを示している。 次に本発明を図面及び実験部ＡとＢとにより詳細に説明する。 図面の簡単な説明 図１ 小胞の５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（ＳＯＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）。試料 を１１％の分離ゲルで分析した。１　：　ＯＭＰ−被覆小胞、２：百日咳菌のＯ ＭＰ調製品、３二百日咳菌の全細胞、４：分子量標識。 図２ 小胞の電子顕微鏡検査。被覆なしの小胞（Ａ）とＯＭＰ−被覆小胞（Ｃ）とを酢 酸ウラニル４％で負に染色した。矢印が多重膜を示す。Ｂ（被覆なしの小胞）と Ｄ（ＯＭＰ−被覆小胞）は一方向金属シャドウィング後の小胞である。ＯＭＰ− 被覆小胞を始めに抗−〇ＭＰ抗体、次にタンパク質Ａ・全複合体でインキュベー トした（Ｅ：染色していない小胞、Ｆ：金属シャドウィング後）、金の粒子（矢 印で表示）はＯＭＰ小胞の外面にあるＯＭＰ材料を示す。対照試験としてＯＭＰ −被覆小胞を始めにプレ免疫の免疫グロブリン、次にタンパク質Ａ・全複合体（ Ｇ）、又はタンパク質Ａ・金複合体単独（Ｈ）でインキュベートした。ＯＭＰ− 被覆小胞の標識は検出されなかった。黒棒は０．２ｍをあらゎす。 図３ ＯＭＰ−被覆小胞及び組み込まなかったＯＭＰ調製品とを鼻腔内予防接種した後 のマウスの肺洗浄液の抗体力値（抗−ＯＭＰ）。黒棒は標準偏差を示す。 図４ ＯＭＰ−被覆小胞を鼻腔内予防接種した後のマウスの肺洗浄液の抗体力値（抗− ＯＭＰ）に及ぼすワクチンの用量の影響。 図５ ＯＭＰ−被覆小胞を鼻腔内投与により免疫にしたマウスの投与後の抗体応答の存 続期間。マウスにワクチンを投与し図示の日に殺して肺の洗浄液からの抗−ＯＭ Ｐカ値を測定した。黒捧は標準偏差を示す。 図６ 肺洗浄液と血清のウェスタンプロット分析。百日咳菌のＯＭＰを分離ゲル１１％ を用いた５ＯＳ−ＰＡＧＥにより分離しプロットした。ストリップｌと２はＯＭ Ｐ−被覆小胞で免疫にしたマウスからプールした肺洗浄液でインキュベート、ス トリップ３と４とは被覆なしのＯＭＰで免疫にしたマウスからプールした肺洗浄 液でインキュベート、ストリップ５はＯＭＰ−被覆小胞で免疫にしたマウスから プールした血清でインキュベート、ストリップ６は被覆なしの小胞で免疫にした マウスからプールした血清でインキュベートした。ストリップｌと３とは第２の 抗体としてペルオキシダーゼを抱合した抗マウスＩｇＡでインキュベートし、ス トリップ２．４．５．６は抗マウス［ｇＧでインキベートした。矢印は主要３２ 　ｋｄタンパク質を示す。 図７ ＬＰＳ−被覆小胞の銀染色。ｌ二百日咳菌から抽出したＬＰＳ、２：被覆なしの 小胞、３：ＬＰＳ−被覆小胞。 図８ リポソームへのＦＨＡとＰＴとの組込み。レーンｌ：分子質量標準、レーン２． 封入していないリポソーム、レーン３：遊離のＦＨＡ　、レーン４：リポソーム に封入したＦＨＡ　、レーン５：遊離のＰＴ、レーン６・　リポソームに封入し たＰＴ、　ＦＨＡとＰＴのサブユニットは矢印で示してあり、標準の分子質量と 同様にキロダルトンである。 図９ リポソームの電子顕微鏡検査。負に染色した被覆なしのリポソーム（Ａ）。ＢＨ Ａ−被覆リポソームの負に染色後（Ｂ）、一方向金属シャドウィング後（Ｃ）、 ポリクロナール抗−ＦＨＡ抗体とタンパク質Ａ・全複合体とによるインキュベー ト後の金属シャドウィングなしくＤ）と育り（Ｅ）、プレ免疫血清とタンパク質 Ａ・全複合体とによるインキュベート後（Ｆ）。Ｇ：金粒子。黒棒は０．２μｍ を示す。 図ｌ０ ＰＴ−被覆リポソームの電子顕微鏡検査。ＰＴ−被覆リポソームの酢酸ウラニル ４％（ｐＨ４，５）で負に染色後（Ａ）、ポリクロナール抗−ＦＨＡ抗体とタン パク質Ａ・全複合体とによるインキュベートと金属シャドウィング後（Ｂ）、対 照試験としてプレ免疫の血清、次にタンパク質Ａ・全複合体によるインキュベー トと金属シャドウィング後（Ｃ）、ポリクロナール抗−ＰＴ抗体とタンパク質Ａ ・全複合体とによりインキュベートしたポスト包理標識（Ｄ）。Ｇ：金粒子。黒 捧は０．１μｍを示す。 図１１ 遊離のＦＨＡ及びリポソーム被覆（Ｌ、　Ｃ，）Ｆｌ（Ａを経口投与したマウス の血清中（Ａ）及び肺洗浄液中（Ｂ）の抗−ＦＨＡ特異性抗体のレベル。標準偏 差を垂直の線で表示。 図１２ 遊離のＰＴ及びリポソーム被覆（Ｌ、　Ｃ，）ＰＴを経口投与したマウスの血清 中（Ａ）及び肺洗浄液中（Ｂ）の抗−ＰＴ特異性抗体のレベル。標準偏差を垂直 の線で表示。 実験の部Ａ、ワクチンの調製とその成分材料と方法 株と培養 百日咳Ｄ３００４２１　（血清型１．２．３）［３］をポルデー・ジャングベー ス（Ｄｉｒｃｏ）の上で１％（容量／容量）及び１５％（容量／容量）の繊維素 を除去したウマの血液で培養した。大量の生産にはモディファイド・ホーニブル ツク（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｈｏｒｎｉｂｒｏｏｋ）培地［６６１を使用した。 リボ多糖の調製 百日咳菌の４８時間培養の２ｒを遠心により採取し、リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ： 　ＮａＣ１８ｇ／ｊ？　、にＣ１Ｏ，２ｇ／β、　Ｋ）Ｉｔ　Ｐｏａ　Ｏ，２ｇ ／ｌ。 ＮａＪＰＯ４・２Ｈｔ０２．９　ｇ／Ｌ　ｐＨ７，４）で１回洗浄した。細胞を 蒸留水で７５ｍｆになるように再懸濁し６５°Ｃで３０分インキュベートした。 これに等容の９０％（重量／容量）フェノールを加え、攪拌しなから６５°Ｃで ４５分インキュベートした。この懸濁液を氷上で冷却し、＋０．０００Ｘｇで１ ０分遠心した。上部の水の層を除き、ｔｏ、　０００　Ｘ　ｇで１０分遠心して デブリを除去した。水冷アセトン２容を加えて１晩インキユベートしてリボ多糖 （ＬＰＳ）を沈澱した。この沈澱を４°Ｃで１０．０００Ｘｇで１０分遠心して 収集し、７０％のアセトンで洗浄した。乾燥したベレットを蒸留水２０ｍ　ｌに 再懸濁し、１００．０００　Ｘｇで２時間超遠心し、ペレットを蒸留水で２回以 上洗浄してから凍結乾燥した。 外膜タンパク質の調製 百日咳菌の４８時間培養の２ｉ！を遠心により採取し、ＰＢＳで１回洗浄した。 細胞をＰＢＳ　５０　ｍｌに再懸濁し加熱滅菌した（５６°Ｃ１３０分）。 フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＦＳ）を加えて最終濃度を０．１ｍ Ｍとし、細胞を音波処理（氷の上で１分間の１０個のパルス、パルスの間に１分 の冷却）して破壊し、破壊しなかった細胞を５．０００×ｇて１０分遠心して除 去し、エンベロープを１００．０００　Ｘ　ｇで１時間の遠心により収集した。 次にこのエンベロープを２％のトリトンＸ−１００２０ｍｌ　、　ＭｇＣ１ｚ　 ７．５　ｍＭ、　ＨＥＰＥＳ　（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−エ タンスルホン酸）　（ｐＨ７，４）　５０　ｍＭに再懸濁し、氷の上に１時間放 置後、１００．ＯＯＯＸｇで１時間遠心してから同し緩衝液で１回洗浄し、得ら れたＯＭＰ調製品を蒸留水で２回洗浄した。タンパク質の濃度の測定にはＬｏｗ ｒｙ法の改良法［３１］を使用した。 小胞の調製 ＬｙｐｈａｚｏｍｅＴＭは小さい多重膜リン脂質小胞の特許形態であるが、これ を百日咳菌ＬＰＳ及びＯＭＰ調製品を含むようにして、ファウシテイン・フ了− マシューティカルス・インク、　（Ｆｏｕｎｔａｉｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ ｃａｌｓ　Ｉｎｃ、）の開発した溶剤希釈微粒子担体技術［５３１を用いて、ア メリカン・レシチン・カンパニー、二ニー・ヨーク（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｌｅｃ ｉｔｈｉｎ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）の精製した大豆ホスファチ ドから調製した。精製した脂質混合物の組成はホスファチジルコリン、ホスファ チジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、及び中性脂質で、その比率は約８ ・ｌ：ｏ、７・０．３であった。 マウスの免疫感作 ４〜５週齢の雌のＢａ１ｂ／ｃマウスを５グループに分けて免疫にした。 鼻腔内免疫の場合はマウスをエーテルで麻酔し、ＰＢＳで希釈したワクチン５０ μｌを外側の鼻孔に置いて吸入するようにした。経口投与ではワクチンをＰＢＳ で適当に希釈し、免疫の直前に胃の酸性を中和するために等容の重炭酸カルシウ ムの３％ＰＢＳ溶液（ｐｔ（８，０）を添加した。６〜８時間水を遠ざけたマウ スにこの５０μｌを徐々に与えた。特に断らない限り、１日目と４日目にマウス の免疫感作を、又３００日目追加免疫を実施した。ｌ用量は、ＯＭＰ−被覆では タンパク質４μＩｇ、　ＬＰＳ−被覆小胞と被覆なしの小胞では１５Ｍｇの乾燥 重量とした。追加免疫１０日後に、特に断らない限り頚椎脱臼によりマウスを殺 して腕の動脈から放血した。気管にシリンジで挿管し、ＰＭＦＳ　０゜１　ｍＭ を含む氷冷ＰＢＳ　Ｏ，７ｍｊ７を肺に満たしてから抜き取り、これを４回繰り 返して肺洗浄液を得た。各々のマウスからその約０．５ｍｉ！を採り、４°Ｃに 於いて１０．０００　Ｘｌｉで１０分遠心してデブリを除去し、−２０°Ｃて保 存した。 ＯＭＰに対する抗血清 ＯＭＰ調製品を不完全フロインドアジュバントと１：ｌの割合て最終の容積がｌ 　ｍｊ！になるように乳化し、これを１匹の３月齢のチンチララビット（こ、１ 日目（２００μｇ）、３００日目１００μｇ）及び４００日目１００μｇ）を皮 下及び筋肉内に注射した。５００日目ラビットを殺して、免疫グロブリンを得ら れた血清からタンパク質Ａ・セファロースＣＬ４Ｂクロマトグラフィーにより精 製した。 ５ＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンプロット分析タンパク質とＬＰＳとをドデシル硫 酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＯ３−ＰＡＧＥ）により既 述のように分離した［３０］。タンパク質はクーマシーブルーで、ＬＰＳは銀で 染色した［５９１゜ウェスタンプロット法を既述のように実施した［５１゜簡単 に言えば、タンパク質を半乾燥転移細胞を用い、トリス２５　ｍＭ、グリシン１ ９２ｍＭ、メタノール２０％、ｐＨ８，３を転写緩衝液として、又ウシ血清アル ブミンの５％ＰＢＳ溶液をブロッキング剤として使用して、ニトロセルロースに 転写した。ＰＢＳで１＝４に希釈した肺洗浄液又はＰＢＳで１：１０に希釈した 血清サンプルをブロックした膜に加えて３７℃で１時間インキュベートした。Ｐ ＢＳで３回洗浄後パーオキシダーゼ抱合ヤギ抗マウスＩｇＡ　（サザン・バイオ テクノロジー・アソシエイツ・インク（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ ｌｏｇｙ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ　Ｉｎｃ、）　）又は抗マウスＩｇＧ（ジャク ソン・イムノリサーチ・ラボラドリース（Ｊａｃｋｓｏ口１ｍｍｕｎ。 ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を加えて３７°Ｃで１時間イ ンキュベートし、膜をＰＢＳて３回洗浄し、４−クロロ−１−ナフトールを基質 として使用して発色させた。 ＥＬＩＳＡ法 マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ　Ｍａｘｉｓｏｒｐ）を４°Ｃで１晩ＯＭ Ｐの０、　Ｉ　Ｍ　ＮａＨＣＯｘ溶液ｐＨ９，６（ウェル当たり５０μ！中５μ ｇ）又はＬＰＳの５０ｍＭ）リス塩酸ｐＨ９，６，２０ｍＭ　ＭｇＣ１を溶液（ ウェル当たり５０μｌ中１　ｍｇ）で被覆した後、プレートを洗浄し、コウシ胎 児血清（ＦＣＳ）のＰＢＳ溶液（ウェル当たり１００μりで３７℃で１時間ブロ ックした。洗浄後、ＦＣＳのｌＯ％ＰＢＳ溶液で種々の濃度に希釈した血清又は 肺洗浄液をプレートに加えて（ウェル当たり５０μｉ’）３７℃で１時間インキ ュベートした。プレートを洗浄し、ＦＣＳのｌＯ％ＰＢＳ溶液でＩ　：　１００ ０の割合に希釈したパーオキシダーゼ抱合ヤギ抗マウス１ｇＡ又は抗マウス［ｇ Ｇをウェル当たり５０μｌずつ加えて、プレートを前回のようにインキュベート し、洗浄後基質（クエン酸０．２５Ｍ。 ＮａＪＰＯ，０，２５Ｍ、　ＨｔＯｔ　Ｏ，００１５％、０−フェニルジアミン ジハイドロクロライド０．３　ｍｇ／ｍ！りを各ウェル当たり５０μｌずつ加え て発色させた。室温で３０分放置後、５０μ！の０．２５　Ｍ　Ｈ！ＳＯ４を加 えて反応を停止し、Ａ４．。をバイオラッド・モデル・３５５０・マイクロプレ ート・リーダー（Ｂｉｏｒａｄ　ｍｏｄｅｌ　３５５０　ｍ１ｃｒｏｐｌａｔｅ 　ｒｅａｄｅｒ）を用いて測定した。結果は５匹のマウスのサンプルから得られ た値の平均値であり、ＥＬ［ＳＡユニットは非免疫マウスから得られたバックグ ラウンド値を差し引いた後でＡ　ａ　ｓ。に相当する希釈ファクターを掛けた値 である。対照マウスからの希釈していない肺洗浄液と血清サンプル（１：５０に 希釈）は実質的にゼロの読みを与えた。 電子顕微鏡 被覆なし及びＯＭＰ−被覆の小胞を酢酸ウラニルの４％水溶液（ｐＨ４，５）を 用いてヴアレンタイン（Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ）等の方法［６０１により負に染色 した。金属シャドウィングには２個の小胞サンプルをニッケル製グリッドを覆っ た新たに調整したホルムバール（ポリビニルホルマール）の膜の上に吸収させ、 蒸留水で洗浄、風乾後白金で一方向（角度２０°）にシャドウィングした。 免疫電子顕微鏡法 被覆なし及びＯＭＰ−被覆の小胞をニッケル製グリッドを覆った新たに調整した コロジオンの膜の上に吸収させて、蒸留水で注意して洗浄した。室温で風乾後精 製した抗体（［ｇＧ　１００μｇ／タンパク質ｍｌ＞で室温で３０分処理した。 プラスチック瓶からＰＢＳ　（リン酸カリウム０．１　Ｍ、　ＮａＣ１Ｏ，１５ Ｍ、　ｐＨ６，９）を穏やかにスプレーして結合していない抗体を除き、タンパ ク質Ａ・全複合体（金粒子径１０　ｎｍ、　０．０３のＡ。。）を滴下してグリ ッドを室温で１０分インキュベートして、結合した抗体が電子顕微鏡で見えるよ うにした。次にグリッドを始めは０．０１％のＴｗｅｅｎ　２０を含むＰＢＳ、 次に蒸留水で洗浄した。風乾後グリッドを白金で一方向（角度２０°）シャドウ ィングした。対照実験では、精製したプレ免疫の免疫グロブリン又はタンパク質 Ａ・全複合体だけでサンプルを処理した。サンプルをＺｅｉｓｓの電子顕微鏡Ｃ ＥＭ　９０２又は１０Ｂを用い、８０　ｋＶの加速電圧で、検定した拡大率によ り調へた。 実験の部への結果 ＯＭＰ−被覆小胞の分析 ＯＭＰ−被覆小胞とＯＭＰ調製品を５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（図１）で分析して実質 的に同一のタンパク質を含んでいることを見出した。これは木組込み技術が特異 性タンパク質を優先的に選択しないことを示している。 被覆なしの小胞調製品ではタンパク質は検出されなかった（結果は記載せず）。 被覆なし及びＯＭＰ−被覆の小胞の電子顕微鏡検査の結果両方の小胞は多重膜で その大きさは０．２〜２μｍの間であった（図２Ａ−Ｄ）。しかし、ＯＭＰ−被 覆の小胞は被覆なしの小胞と比べてその形態学的外観を異にし、ＯＭＰの組込み によりＯＭＰ小胞は水庖を示した（図２Ｄ）。このような小胞を抗−〇ＭＰ抗原 でインキュベートした所、小胞外面のＯＭＰ物質の位置を示す標識が小胞に明瞭 に示された（図２Ｅ、　２Ｆ）。対照試験では標識は認められなかった（図２Ｇ 、　２Ｈ）。 ＯＭＰ−被覆小胞による免疫感作 被覆小胞のアジュバント活性を調べるため、異なるグループのマウスに、ＯＭＰ −被覆小胞と小胞を被覆するのに使用したＯＭＰ調製品とをタンパク質の濃度を 同じにして鼻腔内にワクチン投与した所、ＯＭＰ−被覆小胞で免疫にしたマウス の肺洗浄液中の［ｇＡ及び［ｇＧの力価がＯＭＰ調製品で免疫にしたマウスに比 べて約４倍であった（図３）。 又ＯＭＰ−被覆小胞で免疫にしたマウスの血清中のＩｇＧの力価はＯＭＰ調製品 で免疫にしたマウスの約２倍であった。被覆なしの小胞で免疫にしたマウスはＯ ＭＰに対して免疫応答を示さなかった（結果は記載せず）。共通の粘膜免疫シス テムの存在は充分確証されているか、鼻腔内及び経口経路による免疫感作の効果 を比較するのは興味があった。鼻腔内及び経口経路により免疫にしたマウスの肺 洗浄液の力価は同様であった（表１）。１次応答は４日目の第２の免疫感作から １０日後に検出されたが、追加免疫後の著しい力価の増加は３００日目現れた。 １次応答のピークが何時起こったかは測定されなかったか、４００日目追加免疫 をせずに段したマウスの力価の方が１０日後の力価よりも高かったので、そのピ ークが１０日後に起こったことは明らかである。血清中のＩｇＧ力価は肺の応答 の場合と同様であった（結果は記載せず）。 肺の中で最大の応答を誘発するのに必要な用量は６〜１２μｇ（２回の１次免疫 感作と１回の追加免疫の合計用量）（図４）である。１２０μｇのタンパク質で 免疫にしたマウスの応答は弱く、高濃度では阻害効果が生ずることを示している 。しかし、１．２５μｇという低い用量でも肺洗浄液中に尚特異性抗体を認める ことができた。免疫応答の持続を調べるために３００日目追加免疫後、種々の間 隔を置いてマウスを犠牲にした（図５）。［ｇＡと［ｇＧとの最大の応答は共に 追加免疫２０日後に起こったが、７５日後にも尚特異性免疫グロブリンを肺の中 に認めることができた。 免疫応答のウェスタンプロット分析 経口及び鼻腔内経路により免疫にしたマウスからの肺洗浄液及び血清のサンプル を一緒にプールして、ウェスタンプロット法で分析した（図６）。ＯＭＰ−被覆 小胞で免疫にしたマウスからの肺洗浄液は幾つかのＯＭＰバンドと反応したが、 信号は抗マウス［ｇＧに対する方が抗［ｇＡに対するよりも明らかに強かった。 これは両方の検出システムの結合活性又は感度の差によるものか、或いは気管の 低い箇所で［ｇＧ応答がＩｇＡ応答よりも顕著であったためと思われる。ネトラ ッド（Ｎｅｄｒｕｄ）等［３６１は、不活性化したセンダイウィルスで経口及び 鼻腔内経路により免疫にした後で、気管の低い箇所ではＩｇＧが優勢な応答で、 気管の高い箇所ではＩｇＡが優勢な応答であったと報告した。本報の対照試験で は被覆なしの小胞で免疫にしたマウスから得られた肺洗浄液にはＯＭＰバンドに 対する信号は認められなかった（図６、レーン３と４）。ＯＭＰ−被覆小胞で免 疫にしたマウスからプールした血清もいくつかのＯＭＰバンドと反応した（図６ 、レーン５）。血清と肺洗浄液のいずれも主要３２　ｋｄ　ＯＭＰと反応したが 、血清の応答は低分子量の方のバンドを優先し、一方分泌物の応答は高分子量の 方のバンドを優先した。被覆なしの小胞で免疫にしたマウスからの血清は写真に は認めることができなかった（図６、レーン６）が、主要３２　ｋｄ　ＯＭＰと 非常に僅かの反応を示した。 ＬＰＳ−被覆小胞による免疫感作 百日咳菌から分離したＬＰＳ及びＬＰＳで被覆した小胞を５ＤＳ−ＰＡＧＥ及び 銀染色により分析した。いずれも同様の泳動パターンを示しく図７）、ベブラー （Ｐｅｐｐｌｅｒ）　［４２］が記載したａｂ表現型であった。即ち、野生型の 百日咳菌は二つの別個の粗ＬＰＳを有し、これが５ＤＳ−ＰＡＧＥ後にａ及びｂ と呼ばれた２個のバンドとして現れた。しＰＳで被覆した小胞により経口及び鼻 腔内経路で免疫にしたマウスからの肺洗浄液には特異性１ｇＡは認められなかっ たが（表２）、特異性１ｇＧ応答は検出された。しかし、ＬＰＳに対する特異性 １ｇＡは、マウスをＯＭＰ−被覆小胞で免疫にした場合に検出された。ＯＭＰ− 被覆小胞の銀の染色は、この小胞がＬＰＳ−被覆小胞に比べてＬＰＳを約１／１ ０　ｔ、か含んでいないにもかかわらすＬＰＳの存在を示唆しており（結果は記 載せず）、これはＯＭＰ−被覆小胞に存在するタンパク質かＬＰＳ抗原の適切な プレゼンテーションのために必要であることを示している。又［ｇＧ応答はＯＭ Ｐ−被覆小胞により免疫にしたマウスの方がＬＰＳ−被覆小胞により免疫にした マウスよりも高かった。鼻腔内経路による免疫の方が経口免疫よりも免疫応答を 誘発するのに作動であるようである。ＬＰＳに対する特異性１ｇＧが血清中に検 出され、マウスの免疫にＯＭＰ小胞を使用しても又ＬＰＳ小胞を使用してもその 力価は同様であった。 実験の部への考察 ＯＭＰ又はＬＰＳで被覆した小胞はこれらの抗原に対する分泌性及び全身性免疫 応答を誘発するのに有効であることが判った。しかし、ＬＰＳに対する分泌性１ ｇＡ応答はＯＭＰ−被覆小胞による免疫感作の後でのみ検出され、ＬＰＳ−被覆 小胞では検出されなかった。これはＯＭＰ調製品中のタンパク質抗原がＩｇＡ応 答の刺激に於いてアジュバント効果を有するためと思われ、恐らくタンパク質抗 原が、Ｂ細胞イソタイプの直接１ｇＭからＩｇＡへの切換えを仲介するヘルパー Ｔ細胞のプレゼンテーションに必要である［５４］。ＯＭＰ小胞で免疫にしたマ ウスはＯＭＰｌｉ製品で免疫にしたマウスに比べて約４倍の分泌性抗体力価を示 した。このリポソームのアジュバント活性の一般的理由は不明であるが、被覆し た小胞がＯＭＰ調製品よりもリンパ系組織の中で長く存続することは可能である 。ある粘膜組織中の免疫応答がとこか他の箇所の分泌性応答を誘導しようとする 共通の粘膜免疫システムが存在することは現在一般に受け入れられている［３２ １゜しかし、腸管付属リンパ組織（ＧＡＬＴ）及び気管支付属リンパ組織（ＢＡ ＬＴ）の中で働くシステムの調節機構が相違しているという幾つかの証拠がある ［２８１゜本研究ではマウスを経口的に又は鼻腔内で免疫にしてもＯＭＰに対す る力価は同様であったが、ＬＰＳに対する力価は鼻腔内で免疫にした方が高いよ うであった。ＯＭＰ−被覆小胞で鼻腔内で免疫にしたマウスの最高の応答は３０ ０日目追加応答後２００日目生じた。しかし分泌性抗体は免疫感作後７５日経過 しても同誌められた。この点は、抗百日咳＋ｇＡがヒトの自然感染から３力月後 でも鼻咽頭腔の分泌中に認められたが、非経口による予防接種の場合にはこれが 認められないと言うグツドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）等［１６１の観察と関連して 特に興味かある。更に百日咳の自然感染の方が非経口による予防接種与よりも免 疫か有効で長く持続することは一般に認められている。 本研究では予防接種後の体液性応答のみを調査したが、他の研究に於いて、抗原 被覆リポソームが細胞仲介免疫（ＣＭＩ）を誘発し得ることが示された［２４１ ゜百日咳菌に対するＣＭ［の防御作用は現在の所不明ではあるが、ヒトの感染後 の種々の抗原に対するＣＭＩ応答が報告されている［７．１４］。 百日咳の病原性は複雑で、どの抗原を無細胞ワクチンに含ませるべきかは未だ明 らかでない。百日咳毒素と繊維状血球凝集素とをベースにした非経口ワクチンが スウェーデンの実地試験である程度の防御作用を示した［４１］が、このワクチ ンが防御作用に関連の可能性のある他の抗原により汚染されていたことは明らか である［５１］、抗−ＬＰＳ抗体の防御作用に於ける役割は明らかでない。ラビ ット抗−ＬＰＳ抗体は、これを病原細菌と混合すると、マウスを感染がら保護し なかった［４７］が、ヒトの場合抗−ＬＰＳ抗体はコロニー形成を妨げるのに寄 与することが指摘された［６８１゜分泌性応答を誘発するために本研究で使用し たＯＭＰ−被覆リポソームは疑いもなく未精製のワクチンである。しかし、これ らの抗原に対する抗体刺激を高めるリポソーム運搬システムは、繊維状血球凝集 素、百日咳毒素、或いはマウスモデルで防御作用のあることが判った毒素［６７ ］と関連のある６９　ｋｄ　ＯＭＰのような精製した表面抗原を組み込むのに使 用できた。これらのリポソームを調製するために使用した大豆脂質源は比較的安 価で、ワクチンの大量生産に有利である。 一方百日咳菌の完全な防御には幾つかの抗原に対する免疫応答が必要になると思 われ、将来のワクチンがはっきり規定された精製した成分のみから成るべきであ ると言うのは恐らく誤った独断であろう。経口投与により、粗ワクチンの非経口 投与に関連した、特にＬＰＳに関連した有毒な副作用の多くを避けることができ よう。百日咳毒素に関連した副作用も低減することが期待される。しかし、リポ ソームに組み込む前に調製品をトキソイド化するか、又は最近発表された、免疫 学的には活性であるが生物学的には不活性の百日咳毒素を発現する百日咳菌変異 体［３７１を使用するのが望ましい。全細胞ワクチンを経口投与した１５．００ ０人の幼児の調査結果では、効力は非経口投与の場合と変わらなかったが、経口 投与の場合副反応が実質的に起こらなかった［９１　ことは注目に値する。しか し、経口免疫感捏による免疫の持続期間についてはそれ以上調査されなかった。 結論として、この研究は、百日咳菌表面抗原に対する分泌性抗体の刺激を高める のにリポソーム運搬システムが有用であることを示した。しかし、これがマウス をコロニー形成から保護するのか、又個々の百日咳菌表面抗原用の運搬システム として使用できるかどうか確かめるために更に研究する必要がある。 実験の部Ｂ：治療学的検討 材料と方法 抗原封入小胞の調製 ＦＨＡは以前にサトー（Ｓａｔｏ）等［５０］が報告した百日咳菌Ｔｏｈａｍａ 株から精製した。ＰＴはニス・クリズイー（Ｓ、　Ｃｒｙｚｙ）が親切にも送付 されたものをムノズ（Ｍｕｎｏｚ）等 Problems with vaccines against mucosal pathogens and their production methods Whooping cough is a serious respiratory disease that commonly affects children, and was one of the main causes of morbidity and mortality in children until the 1930s. Subsequently, parenteral vaccination using heat-sterilized whole-cell preparations of Bor-detella pertussis (a pathogenic bacterium) became widespread, and as social and economic conditions improved, the incidence of pertussis decreased in developed countries. significantly decreased. However, over the past 20 years, the incidence of the disease has increased rapidly, and this has led to concerns from parents concerned about possible side effects believed to be caused by the whooping cough vaccine. This is because many people have begun to refrain from vaccination. This side effect ranges in severity from mild local reactions to persistent crying to permanent encephalopathy, and is Doctors are hesitant to recommend vaccination for fear of legal liability. Furthermore, vaccine efficacy varies markedly between manufacturers, and all vaccine preparations are effective. It's not like that. In recent years, one of the main challenges in pertussis research has been to develop drugs that are less reactogenic and more immunogenic. The development of a well-defined acellular vaccine has been delayed, either because of the highly complex pathogenesis of pertussis or because of insufficient knowledge about the immunological defense mechanisms following infection. Ru. Bordetella pertussis has several factors that are associated with its pathogenicity, but it is unclear which of these factors are protective antigens for the human body, or which are related to the reactogenicity of vaccines. No conclusion has been reached. A vaccine based on purified antigens, namely detoxified pertussis toxin and filamentous hemagglutinin, has shown some efficacy in field trials in Sweden, or whether this vaccine or other antigens that may be associated with protection have been tested. It is clear that it was contaminated. Therefore, highly effective vaccines without reactogenicity are not yet available, and alternative methods must be developed. The inventors have determined that oral or investigated whether liposomes containing Bordetella pertussis antigens could be used to stimulate immune responses via the air route after intranasal administration. Introduction The incidence of pertussis in developed countries is based on parenteral measurements of heat-sterilized whole cell preparations of Bordetella pertussis. This has decreased significantly due to the widespread use of oral immunizations, but the number of people receiving this vaccination has decreased as the possibility of side effects associated with this vaccination has become widely known [481, and there are variations in effectiveness related to vaccine production. [l91, which also accounts for 95% of the incidence of whooping cough] Pertussis remains a serious problem in underdeveloped countries due to lack of vaccination systems [34]. This is a worldwide problem. One reason for the lack of reproducibility in vaccine efficacy is that parenteral administration of B. pertussis antigens is not sufficient to stimulate the mucosal immune system, which is the first line of defense against infection. It is possible that there is no such thing. Epidemiological studies show that current vaccines are more effective than infection. It is said to protect against diseases [111. Oral or intranasal administration of antigen not only provides greater protection but also avoids many of the side effects associated with parenteral administration. It seems that However, orally administered antigens often induce only short-lived immune responses and require adjuvants to enhance this response. Phospholipid bilayer vesicles (liposomes) contain a large variety of biologically active substances in specific groups. Recently, several bacterial antigens and Used as an immunological adjuvant to increase immune response to viral antigens. [17] Here, we report on the potential of liposomes as delivery systems to enhance immunological responses to B. pertussis surface antigens in the lungs. In other words, Bordetella pertussis is the pathogenic agent of pertussis, which infects the human respiratory tract. Children are particularly susceptible to this disease, and it can lead to death from neurological disorders [6 21. Is the impact of whooping cough on health in terms of morbidity and mortality rates likely to be underestimated due to lack of reporting? It is estimated that the number of illnesses caused or related to whooping cough is 60 million per year, and the number of deaths is estimated to be more than 500,000 per year [341° Vaccination is not compulsory] The infection rate of whooping cough in this country is very high, with up to 95% of serum samples from people aged 17 to 19 years old being infected with pertussis. 1151° In developed countries, heat-sterilized whole cell vaccines containing antibodies against pertussis are used. The incidence of whooping cough has decreased significantly due to the widespread use of immunization.[12] This wa The benefits of cuttingin are far outweighed by the risk of rare but serious side effects. However, general concerns about safety and immunogenicity have resulted in reduced vaccination rates [22,33]. Additionally, some countries, such as the United States, Despite the high immunization rate, there are 30,000 to 125,000 pertussis cases per year. The effectiveness of whole-cell vaccines is being questioned because of the disease [55]. Therefore, A new generation of well-defined, non-toxic, highly immunogenic vaccines is strongly desired. Some virulence factors of Bordetella pertussis have been considered for inclusion in well-defined acellular vaccines. detoxified pertussis toxin (PT) and filamentous hemagglutinin (FHA) are the first candidates [29.40]. Conventional subunit vaccines administered by the parenteral route first Inducing immunity or mucosal anti-inflammatory Physical response is low. However, B. pertussis is transmitted through the mucous membranes of the respiratory tract, and after natural infection specific immunoglobulin (Ig) A is induced [571] Such antibodies protect the host from both colonization and disease. They seem to defend well against it. Therefore, we have developed a means of stimulating mucosal immunity through the air route, which will help protect against both infection and disease. It seems worthwhile to evaluate the protective effectiveness of these measures. Liposomes have been effectively used as a delivery system for drugs, antigens, hormones, and genetic material [171] The following immunizations using antigens encapsulated in liposomes have also shown promising results: That is, oral administration [18,43,45,611] for antigens of parasites [4,24,25°45,49], viruses [10,38], and bacteria [8,18,43,46,52,61]. and parenteral [4,8,10,24,25,46,49,52] routes were used. Using antigens encapsulated in liposomes, protective immunity [4,8°18,24,25,45,49,52], or at least cell-mediated [81] and humoral responses [10,461] were obtained. Several studies have demonstrated the potential of such liposomes as adjuvants. The adjuvant activity of liposomes depends on several factors, such as vesicle size and structure, lipid composition, surface charge, antigen localization, species of animal being immunized, route of immunization, and lamellar distribution and number. It seems to be decided. When orally administered antigens are combined with liposomes, anti- It enhances the uptake and cellular processing of the protein, facilitating its presentation to T cells and its uptake into local lymph nodes. This process is humoral, secretory, and cellular. improving the induction of cell-mediated immune responses [1.2.17.58]. This report describes the ability of bosomes to encapsulate FHA and PT to induce specific systemic or secretory immune responses after orally immunizing mice. I posted it. According to one embodiment, the invention relates to a vaccine against mucosal pathogens, the vaccine comprising a liposomal delivery system or containing the carrier as a reactive component. a delivery system, the delivery system consisting of or containing lipid vesicles; The present invention relates to a vaccine characterized in that said lipid vesicles contain at least one mucosal pathogen antigen integrated into their outer membrane. The vaccine according to the invention may be characterized in that the mucosal pathogen is a strain of the genus Bordetella, in particular type B, Bordetella pertussis, Shigella or Streptococcus. The vaccine according to the invention may also be characterized in that the antigen is a preparation of an outer membrane protein (OMP) of Bordetella pertussis. The vaccine of the invention may also be characterized in that the antigen is a ribopolysaccharide (LPS) of Bordetella pertussis. The vaccine of the invention may also be characterized in that the antigen is filamentous hemagglutinin of Bordetella pertussis and/or pertussis toxin. The vaccine of the invention may also contain as antigens both a preparation of the outer membrane protein (OIJP) of Bordetella pertussis as well as a ribopolysaccharide (LPS) of Bordetella pertussis. It can be characterized by: The vaccine according to the invention can also be characterized in that the lipid vesicle vaccine is a soybean-based small multilamellar phospholipid vesicle. According to another embodiment, the invention relates to a method for the preparation of the vaccine according to the invention, characterized in that one or more antigens are incorporated into lipid vesicles by solvent-diluted microparticle carrier technology. A preparation of ribopolysaccharide (LPS) and outer membrane protein (OMP) of Bordetella pertussis was prepared from soybeans. Multilamellar liposomes (Lyphasomes) composed of phospholipids such as Fountain Pharmaceuticals (U, S, A, ). This coated liposome was administered to mice. When administered by oral or intranasal inoculation, antigen-specific antibody responses were observed in lung lavage fluid. OMP-coated liposomes are better at eliciting an immune response than OMPjl product alone. It was also clearly effective. The best response was in mice given a booster 30 days after the initial immunization. The best response was obtained 20 days after the booster immunization, but specific antibodies could still be detected 75 days after the secondary immunization. These results demonstrate that this liposomal antigen delivery system effectively prevents B. pertussis infection. It has been shown that this method has the ability to stimulate the secretory antibody response that is thought to be necessary for controlling pertussis, and that it should also be applicable to the delivery of protein candidates and/or LPS antigens from various B. pertussis strains. Liposomes have previously been used to induce antibody responses in vivo, or Although there are no reports of pulmonary antibody responses following intracavitary immunization or oral administration, such studies are of considerable importance. All current pertussis vaccines are administered parenterally, and this method stimulates the mucosal immune system, which is necessary as a first line of defense against colonization and subsequent infection. This is because it seems to be insufficient to In fact, there is some epidemiological evidence to suggest that current vaccines prevent disease rather than infection. Oral or intranasal administration of antigen not only improves protection, but also reduces side effects associated with parenteral vaccination, such as endotoxin shock due to small amounts of free LPS contaminating preparations of protein antigens. You can avoid locks. As shown by the inventors, liposol containing LPS In this system, endotoxic shock does not occur, probably because the insertion of the lipid A portion of LPS into the host cell membrane is prevented. Such a delivery system would also be applicable to vaccines against other bacterial pathogens that enter the animal host by the mucosal route, ie primarily through the lungs or intestinal tract. Filamentous hemagglutinin (PHA) incorporated into liposomes of Bordetella pertussis and detoxified Bordetella pertussis When mice were orally administered with cough toxin (PT) as a vaccine, FHA- and PT-specific immunoglobulin (Ig)G were detected in the serum, and both 1gG and [gA] were detected in the lung lavage fluid. It was done. The antibody titers in mice immunized with encapsulated antigen were clearly higher than those in mice immunized with unencapsulated PHA and PT, indicating the adjuvant activity of the liposome carrier. This result indicates that this study induces an immune response in humans against FHA and PT (and possibly other pertussis antigens). This study shows that B. pertussis is useful and has the potential to be used in large-scale immunization to protect against both infection and disease. Next, the present invention will be explained in detail with reference to the drawings and experimental sections A and B. Brief Description of the Figures Figure 1 5DS-PAGE (SOS-polyacrylamide gel electrophoresis) of vesicles. Samples were analyzed on an 11% resolving gel. 1: OMP-coated vesicles, 2: OMP preparation of B. pertussis, 3. Whole cells of B. pertussis, 4: molecular weight label. Figure 2 Electron microscopy of vesicles. Uncoated vesicles (A) and OMP-coated vesicles (C) were washed with vinegar. Negative staining with uranyl acid 4%. Arrows indicate multiple membranes. B (uncoated vesicles) and D (OMP-coated vesicles) are vesicles after unidirectional metal shadowing. OMP-coated vesicles were incubated first with anti-MP antibody and then with protein A total complex. (E: unstained vesicles, F: after metal shadowing), gold particles (arrows) (marked) indicates OMP material on the outer surface of the OMP vesicle. As control experiments, OMP-coated vesicles were incubated first with pre-immune immunoglobulin and then with protein A total complex (G) or protein A gold complex alone (H). No labeling of OMP-coated vesicles was detected. The black bar is 0.2m long. Figure 3. Antibody titers (anti-OMP) in lung lavage fluid of mice after intranasal vaccination with OMP-coated vesicles and unincorporated OMP preparations. Black bars indicate standard deviation. Figure 4 Effect of vaccine dose on antibody titers (anti-OMP) in lung lavage fluid of mice after intranasal vaccination with OMP-coated vesicles. Figure 5 Presence of antibody responses after administration of OMP-coated vesicles in mice immunized by intranasal administration. Continuation period. Mice were vaccinated and sacrificed on the days indicated, and anti-OMP levels were measured from lung lavage fluid. Black squares indicate standard deviation. Figure 6 Western plot analysis of lung lavage fluid and serum. OMP of Bordetella pertussis was separated and plotted by 5OS-PAGE using 11% separation gel. Strips 1 and 2 were incubated with pooled lung lavage fluid from mice immunized with OMP-coated vesicles; Trips 3 and 4 were pooled lung lavages from mice immunized with uncoated OMP. strip 5 was incubated with pooled serum from mice immunized with OMP-coated vesicles, and strip 6 was incubated with pooled serum from mice immunized with uncoated vesicles. Strips 1 and 3 were incubated with peroxidase-conjugated anti-mouse IgA as a second antibody and Trip 2.4.5.6 was incubated with anti-mouse [gG. Arrows indicate the major 32 kd protein. Figure 7. Silver staining of LPS-coated vesicles. LPS extracted from B. pertussis, 2: uncoated vesicles, 3: LPS-coated vesicles. Figure 8 Incorporation of FHA and PT into liposomes. Lane 1: molecular mass standard, lane 2. Unencapsulated liposomes, Lane 3: Free FHA, Lane 4: FHA encapsulated in liposomes, Lane 5: Free PT, Lane 6: FHA encapsulated in liposomes. The subunits of PT, FHA and PT are indicated by arrows and have a standard molecular mass in kilodaltons. Figure 9 Electron microscopy of liposomes. Negatively stained uncoated liposomes (A). After negative staining of BHA-coated liposomes (B) and after unidirectional metal shadowing (C), incubation with polyclonal anti-FHA antibody and protein A total complex. D) and growth without metal shadowing after treatment (E) and after incubation with pre-immune serum and protein A total complex (F). G: Gold particles. The black bar indicates 0.2 μm. Figure 10 Electron microscopy of PT-coated liposomes. After negative staining of PT-coated liposomes with uranyl acetate 4% (pH 4,5) (A), PT-coated liposomes were stained with polyclonal anti-FHA antibody. After incubation with protein A/total complex and metal shadowing (B), vs. As a control test, incubation with pre-immune serum followed by protein A total complex. After metal shadowing (C), post-embedding labeling incubated with polyclonal anti-PT antibody and protein A total complex (D). G: Gold particles. The black mark indicates 0.1 μm. Figure 11. Levels of anti-FHA-specific antibodies in serum (A) and lung lavage fluid (B) of mice orally administered free FHA and liposome-coated (L, C,) Fl (A). Differences are shown as vertical lines. Figure 12. Levels of anti-PT specific antibodies in serum (A) and lung lavage fluid (B) of mice orally administered free PT and liposome-coated (L, C,) PT. The standard deviation is displayed as a vertical line. Experimental Part A, Vaccine Preparation and Its Components Materials and Methods Strain and Culture Pertussis D300421 (serotype 1.2.3) [3] The cells were incubated with 1% (vol/vol) and 15% (vol/vol) defibrinated horse blood on a bathtub (Dirco). Modified hornible for high volume production Modified Hornibrook medium [661] was used. Preparation of ribopolysaccharide 2 r of a 48-hour culture of Bordetella pertussis was collected by centrifugation and diluted with phosphate buffer (PBS: NaCl 18 g/j?, ClO, 2 g/β, K) It Poa O, 2 g/l. Washed once with NaJPO4.2Ht02.9 g/L pH 7.4). Cells were resuspended in distilled water to 75 mf and incubated at 65°C for 30 minutes. To this was added an equal volume of 90% (wt/vol) phenol and incubated at 65°C for 45 minutes without stirring. The suspension was cooled on ice and centrifuged at +0.000Xg for 10 minutes. The upper water layer was removed and debris was removed by centrifugation at 0.000 x g for 10 minutes. Two volumes of water-cooled acetone were added and incubated overnight to precipitate ribopolysaccharide (LPS). The precipitate was collected by centrifugation at 10,000×g for 10 minutes at 4°C and washed with 70% acetone. Resuspend the dried pellet in 20 ml of distilled water, ultracentrifuge for 2 hours at 100,000 After washing, it was freeze-dried. Preparation of Outer Membrane Proteins 2i of 48-hour culture of Bordetella pertussis! was collected by centrifugation and washed once with PBS. The cells were resuspended in 50 ml of PBS and heat sterilized (56°C for 130 minutes). Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMFS) was added to a final concentration of 0.1 mM and cells were disrupted by sonication (10 pulses of 1 min on ice, 1 min cooling between pulses). Remove unbroken cells by centrifugation at 5,000 x g for 10 minutes. The envelopes were collected by centrifugation at 100.000 x g for 1 hour. The envelope was then treated with 20 ml of 2% Triton Tansulfonic acid) (pH 7.4) Resuspend at 50 mM and leave on ice for 1 hour. After placing, 100. Centrifuge in OOOXg for 1 hour and wash once with the same buffer to obtain a The OMP preparation was washed twice with distilled water. A modified Lowry method [31] was used to measure the protein concentration. Preparation of Vesicles Lyphazome™, a proprietary form of small multilamellar phospholipid vesicles, containing Bordetella pertussis LPS and OMP preparations, was manufactured by Fountain Pharmaceuticals Inc. ) developed a solvent-diluted microparticle carrier technology [531]. Purified soy phosphatide from American Lecithin Company, New York Prepared from de. The composition of the purified lipid mixture is phosphatidylcholine, phosphatide, For tidylethanolamine, phosphatidic acid, and neutral lipids, the ratio was approximately 8·l:o, 7·0.3. Immunization of mice 4-5 week old female Balb/c mice were divided into 5 groups and immunized. For intranasal immunization, mice were anesthetized with ether and 50 μl of the vaccine diluted in PBS was placed in the outer nostril for inhalation. For oral administration, the vaccine is appropriately diluted in PBS and immediately before immunization, an equal volume of calcium bicarbonate is added to neutralize gastric acidity. A 3% PBS solution of PBS (pt(8,0)) was added.The mice were kept away from water for 6-8 hours. 50 μl of this was gradually given to each patient. Unless otherwise specified, mice were immunized on days 1 and 4, and boosted on day 300. The dose was 4 μlg protein for OMP-coated and 15 Mg dry weight for LPS-coated and uncoated vesicles. Ten days after boosting, mice were killed by cervical dislocation unless otherwise specified. He then exsanguinated blood from an artery in his arm. The trachea was intubated with a syringe, the lungs were filled with ice-cold PBS O, 7mj7 containing 0.1 mM PMFS, and then withdrawn, and this was repeated 4 times. The lungs were returned to obtain lung lavage fluid. About 0.5mi from each mouse! Centrifuge at 10,000 Xli for 10 minutes at 4°C to remove debris, and store at -20°C. It existed. Antiserum against OMP The OMP preparation was mixed with incomplete Freund's adjuvant in a 1:l ratio to a final volume of l mj! This was emulsified to give a 3-month-old chinchilla rabbit (200 μg on day 1, 100 μg on day 300) and 100 μg on day 400. Injected subcutaneously and intramuscularly. On the 500th day, I killed a rabbit and got immunoglobulin. Protein A was purified from the collected serum by Sepharose CL4B chromatography. Manufactured. 5DS-PAGE and Western blot analysis Proteins and LPS were analyzed using dodecyl sulfate. They were separated by sodium acid polyacrylamide gel electrophoresis (SO3-PAGE) as previously described [30]. Proteins were stained with Coomassie blue and LPS with silver [591° Western blotting was performed as previously described [51° Briefly, proteins were stained with semi-dry metastases, 25 mM Tris, 1% glycine, 92mM, methanol 20%, pH 8.3 as the transfer buffer, and bovine serum alkaline Bumin in 5% PBS was used as a blocking agent to transfer to nitrocellulose. Lung lavage fluid diluted 1:4 in PBS or serum samples diluted 1:10 in PBS were added to the blocked membrane and incubated for 1 hour at 37°C. After washing three times with PBS, peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgA (Southern Biotechnology Associates Inc.) or anti-mouse IgG (Japanese) was added. Add Son ImmunoResearch Laboratories (Jackso mouth 1 mm. research Laboratories)) and incubate at 37°C for 1 hour. After incubation, the membrane was washed three times with PBS and color was developed using 4-chloro-1-naphthol as a substrate. ELISA method Microtiter plates (Nunc Maxisorp) were incubated overnight at 4 °C in OMP 0, IM NaHCOx solution pH 9,6 (50 μg per well) or LPS (50 mM) in lithium hydrochloride pH 9,6, 20 mM MgC1. After coating the solution (1 mg in 50 μl per well), the plate was washed and the calf Infant serum (FCS) in PBS (100 μl per well) was blotted for 1 hour at 37°C. I checked. After washing, serum or lung lavage fluid diluted at various concentrations in 10% FCS in PBS was added to the plate (50 μi' per well) and incubated for 1 hour at 37°C. It was incubated. The plate was washed and 50 μl per well of peroxidase-conjugated goat anti-mouse 1 gA or anti-mouse [g After washing, 50 μl of substrate (citric acid 0.25 M, NaJPO, 0.25 M, HtOtO, 0.015%, 0-phenyldiamine dihydrochloride 0.3 mg/ml) was added to each well for color development. After leaving at room temperature for 30 minutes, add 50μ! of 0.25M H!SO4. A4. . Bio-Rad Model 3550 Micropre It was measured using a biorad model 3550 m1 crop reader. Results are the average of values obtained from samples from five mice, and EL[SA units are the background values obtained from non-immunized mice. A a s after deducting the round value. is multiplied by a dilution factor corresponding to . Undiluted lung lavage fluid and serum samples (diluted 1:50) from control mice gave readings of essentially zero. Electron Microscopy Uncoated and OMP-coated vesicles were negatively stained by the method of Valentine et al. [601] using a 4% aqueous solution of uranyl acetate (pH 4,5). For metal shadowing, two vesicle samples were absorbed onto a freshly prepared formvar (polyvinyl formal) membrane over a nickel grid, washed with distilled water, air dried, and then unidirectionally (at a 20° angle) with platinum. ) was shadowed. Immunoelectron Microscopy Uncoated and OMP-coated vesicles were absorbed onto freshly prepared collodion membranes over nickel grids and carefully washed with distilled water. Air-dry at room temperature The prepared antibody ([gG 100 μg/ml protein] was treated for 30 minutes at room temperature. The binding was performed by gently spraying PBS (potassium phosphate 0.1 M, NaClO, 15 M, pH 6.9) from a plastic bottle. proteins, except for antibodies that do not Add a drop of gold substance A/total complex (gold particle size 10 nm, 0.03 A...) to the grid. Incubate the cells at room temperature for 10 minutes until the bound antibodies are visible under an electron microscope. I did it. The grids were then washed first with PBS containing 0.01% Tween 20 and then with distilled water. After air drying, the grid was shadowed with platinum in one direction (at an angle of 20°). In control experiments, samples were treated with purified preimmune immunoglobulin or protein A total complex alone. The samples were analyzed using a Zeiss electron microscope C EM 902 or 10B at an accelerating voltage of 80 kV and at a verified magnification. I'm in bad shape. Results to Experimental Section Analysis of OMP-coated vesicles OMP-coated vesicles and OMP preparations were analyzed by 5DS-PAGE (Figure 1) and found to contain virtually identical proteins. This indicates that tree embedding technology does not preferentially select specific proteins. No protein was detected in the uncoated vesicle preparation (results not shown). Electron microscopy of uncoated and OMP-coated vesicles revealed that both vesicles were multilamellar with a size between 0.2 and 2 μm (FIGS. 2A-D). However, OMP-covered The coated vesicles had a different morphological appearance compared to the uncoated vesicles, and OMP vesicles exhibited phlegm due to OMP incorporation (Fig. 2D). When such vesicles were incubated with anti-○MP antigen, the vesicles clearly displayed labels indicating the location of OMP substances on the vesicle outer surface (FIGS. 2E and 2F). No labeling was observed in control tests (Figures 2G, 2H). Immunization with OMP-coated vesicles To examine the adjuvant activity of coated vesicles, different groups of mice were treated with OMP-coated vesicles and the OMP preparation used to coat the vesicles at the same protein concentration. After intranasal vaccination, titers of [gA and [gG] in the lung lavage fluid of mice immunized with OMP-coated vesicles increased compared to mice immunized with OMP preparations. The total amount was approximately 4 times higher (Figure 3). Also, the titer of IgG in the serum of mice immunized with OMP-coated vesicles was approximately twice that of mice immunized with OMP preparations. Mice immunized with uncoated vesicles showed no immune response to OMP (results not shown). Common mucosal immune system It was interesting to compare the efficacy of intranasal and oral immunizations to see if the existence of immunization is well established. Lung lavage fluid titers from mice immunized by the intranasal and oral routes were similar (Table 1). The primary response was detected 10 days after the second immunization on day 4, but a significant increase in titer after the booster immunization appeared at day 300. Either it was not determined when the peak of the primary response occurred, or the titer in mice challenged without boosting on day 400 was higher than the titer at day 10, so It is clear that the arc occurred after 10 days. IgG titers in the serum were similar to those in the lung response (results not shown). The dose required to induce a maximal response in the lungs is 6-12 μg (total dose of two primary immunizations and one booster) (Figure 4). Mice immunized with 120 μg of protein had a weak response, indicating that higher concentrations produce an inhibitory effect. However, even at a low dose of 1.25 μg, specific antibodies could still be observed in the lung lavage fluid. for various periods after the 300-day booster to examine the persistence of the immune response. Mice were sacrificed at intervals (Figure 5). Maximal responses for both [gA and [gG] occurred 20 days after the boost, but specific immunoglobulin could still be seen in the lungs 75 days later. Western blot analysis of immune responses Lung lavage fluid and serum samples from mice immunized by the oral and intranasal routes were pooled together and analyzed by Western blot method (Figure 6). Lung lavage fluid from mice immunized with OMP-coated vesicles reacted with several OMP bands, but the signal was clearly stronger for anti-mouse [gG than for anti-[gA]. This may be due to differences in avidity or sensitivity of both detection systems, or because the gG response was more pronounced than the IgA response in the lower part of the trachea. Netra Nedrud et al. [361] found that after immunization with inactivated Sendai virus by oral and intranasal routes, responses were predominantly IgG in the lower trachea and IgA in the higher trachea. It was reported that there was a response. In the controlled study in this report Lung lavage from mice immunized with uncoated vesicles showed that OMP bands No signal was observed for this purpose (Fig. 6, lanes 3 and 4). Immunization with OMP-coated vesicles Pooled serum from infected mice also reacted with some OMP bands (Fig. 6, lane 5). Although both serum and lung lavage fluid reacted with the major 32 kd OMP, the serum response favored the lower molecular weight band, whereas the secretory response favored the higher molecular weight band. Serum from mice immunized with uncoated vesicles was not visible in the photograph (Figure 6, lane 6), but showed very little reaction with the major 32 kd OMP. Immunization with LPS-coated vesicles LPS and LPS-coated vesicles isolated from Bordetella pertussis were analyzed by 5DS-PAGE and silver staining. All showed similar migration patterns (Fig. 7) and had the ab phenotype described by Peppler [42]. That is, wild-type B. pertussis had two distinct crude LPSs, which appeared as two bands called a and b after 5DS-PAGE. Oral and nasal administration via PS-coated vesicles Although no specific 1gA was observed in lung lavage fluid from mice immunized by the intracavitary route (Table 2), specific 1gG responses were detected. However, specific 1gA for LPS was detected when mice were immunized with OMP-coated vesicles. Silver staining of OMP-coated vesicles suggested the presence of LPS, even though these vesicles contained approximately 1/10 t less LPS than LPS-coated vesicles (results is written (not shown), indicating that proteins present in OMP-coated vesicles are required for proper presentation of the LPS antigen. [gG responses were also higher in mice immunized with OMP-coated vesicles than in mice immunized with LPS-coated vesicles. Immunization by the intranasal route appears to be more effective at eliciting an immune response than oral immunization. 1gG specific for LPS was detected in serum. The titers were similar whether OMP or LPS vesicles were used to immunize mice. Experimental Discussion Vesicles coated with OMP or LPS were found to be effective in eliciting secretory and systemic immune responses against these antigens. However, secretory 1 gA responses to LPS were detected only after immunization with OMP-coated vesicles, but not with LPS-coated vesicles. This is because the protein antigen in the OMP preparation responds to IgA. This is thought to be because it has an adjuvant effect in the stimulation of the protein, and is probably due to the protein anti-inflammatory effect. is required for helper T cell presentation, which mediates a direct B cell isotype switch from 1gM to IgA [54]. Ma immunized with OMP vesicles mice showed approximately 4 times higher secreted antibody titers than mice immunized with OMPli products. did. The general reason for this adjuvant activity of liposomes is unknown, but It is possible that the vesicles persist longer in lymphoid tissues than OMP preparations. It is now generally accepted that a common mucosal immune system exists, in which an immune response in one mucosal tissue seeks to induce a secretory response elsewhere [32 1. However, the intestinal accessory lymphoid tissue (GALT ) and the bronchial accessory lymphoid tissue (BALT) [281° In this study, immunization of mice either orally or intranasally did not result in OMP. against The titers against LPS were similar, but the titers against LPS were higher with intranasal immunization. It was. The best response of mice immunized intranasally with OMP-coated vesicles occurred 200 days after the 300 day booster response. However, secreted antibodies were detected even 75 days after immunization. In this regard, Goodman et al. found that antipertussis + gA was observed in the secretion of the nasopharyngeal cavity even 3 months after natural infection in humans, but this was not observed in the case of parenteral vaccination. [This is particularly interesting in relation to the observation of 161.] Furthermore, natural pertussis infection is more effective than parenteral vaccination. It is generally acknowledged that the virus is effective and long-lasting. Although this study only investigated humoral responses after vaccination, other studies have shown that antigen-coated liposomes can induce cell-mediated immunity (CMI) [241 Although the protective effect of CM against Bordetella pertussis is currently unknown, CMI responses to various antigens after human infection have been reported [7.14]. The pathogenesis of pertussis is complex, and it remains unclear which antigens should be included in acellular vaccines. It's not clear. A parenteral vaccine based on pertussis toxin and filamentous hemagglutinin showed some protection in a Swedish field trial [41], but this vaccine The role of anti-LPS antibodies in protection is unclear, although it is clear that the cells were contaminated with other antigens that may be associated with protection [51]. rabbi Anti-LPS antibodies did not protect mice from infection when mixed with pathogenic bacteria [47], but in humans anti-LPS antibodies did not help prevent colonization. [681°] used in this study to induce a secretory response. The OMP-coated liposomes are undoubtedly crude vaccines. But this Liposomal delivery systems that enhance antibody stimulation against these antigens are capable of delivering purified antibodies such as filamentous hemagglutinin, pertussis toxin, or the 69 kd OMP, which is related to toxins that have been shown to be protective in mouse models [67]. used to incorporate surface antigens. I was able to use it. The soy lipid source used to prepare these liposomes is relatively cheap. This makes it advantageous for mass production of vaccines. On the other hand, complete protection against Bordetella pertussis is likely to require an immune response to several antigens, suggesting that future vaccines should consist only of well-defined and purified components. To say so would probably be a mistaken opinion. Oral administration would avoid many of the toxic side effects associated with parenteral administration of crude vaccines, particularly with LPS. It is also expected to reduce side effects related to pertussis toxin. However, lipo Toxoidize the preparation prior to incorporation into the cytoplasm, or use a recently published B. pertussis mutant [371] that expresses an immunologically active but biologically inactive pertussis toxin. is desirable. The results of a study of 15,000 infants who received whole-cell vaccines orally showed that the efficacy was no different from that of parenteral administration, but it was noted that there were virtually no side effects when administered orally [91]. worth it. deer However, the duration of immunity from oral immunization was not further investigated. In conclusion, this study demonstrated the utility of the liposome delivery system in enhancing the stimulation of secreted antibodies against B. pertussis surface antigens. However, further studies are needed to see if this protects mice from colonization and whether it can be used as a delivery system for individual B. pertussis surface antigens. Experimental Part B: Therapeutic Studies Materials and Methods Preparation of antigen-loaded vesicles FHA was purified from Bordetella pertussis strain Tohama as previously described by Sato et al. [50]. PT was kindly sent by Nis Kryzy (S, Cryzy) to Munoz et al.

【３５】の方法により解毒した。Ｌｙｐｈ ａｚｏｍｅ”リポソームは、百日咳菌ＦＨＡとＰＴとを含む小さい多重膜脂質小 胞の特許形態であるが、これをファウシティン・ファーマシューティカルス・イ ンク（Ｆｏｕｎｔａｉｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ　Ｉｎｃ、　）の開 発した溶剤希釈微粒子担体技術［５３ｊを用いてアメリカン・レシチン・カンパ ニ　、　二ニーΦＥ−り（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｌｅｃｉｔｈｉｎ　Ｃｏｍｐａｎ ｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）の精製大豆ホスファチドから調製した。精製した脂質 混合物の組成はホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホス ファチジン酸及び中性脂質で、その比率は約８：１：０．７：０．３であった。 マウスの免疫感作 ５〜６週齢の雌のＢａ１ｂ／Ｃマウス（チャールズ・リヴアー、エムエル、イタ リー（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ、　Ｍｌ、　Ｉｔａｌｙ）を５グループに分 けて経口投与により免疫にし、次の定めにより別々に籠に入れた。グループａ・ 　リポソーム封入ＦＨＡ；　グループｂ：　リポソーム封入ＰＴ：　グループＣ ：リポソーム封入ＦＨＡとリポソーム封入ＰＴ；　グループｄ：遊離のＦＨＡ　 ；　グループｅ：遊離のＰＴ；　グループｆ：遊離のＦＨＡとＰＴ；対照グルー プ：被覆なしのリポソームを用いた免疫。ワクチンの投与は、０日目と４日目に タンパク質を１用量（４μｇ）、次に３００日目追加免疫を同じ用量で実施した 。６〜８時間水を遠ざけたマウスにＰＢＳで希釈したワクチン５０μｌと免疫の 直前に胃の酸性を中和するために添加した等容の重炭酸カルシウムの３％リン酸 塩緩衝液（ＰＢＳ：　ＮａＣ１ｓ、ｏ　ｇ／ｊ’、　ＫＣＩ　２．Ｏｇ／Ｉ！、 　ＮａＪＰＯ４２Ｈ＊０２．Ｏｇ／ｌ。 ＫＨ２ＰＯ４２，Ｏｇ／ｌ　、　ｐＨ８，０）溶液とを徐々ニ与えた。追加免疫 後１０日百計マウスを犠牲にしてサンプルを採取した。犠牲にしたマウスの腕の 動脈を切断して放血し、採取した血清を分離して−２０”Ｃで保存した。肺洗浄 液は気管にカニユーレを挿入し、プロテアーゼインヒビターとして２　ｍＭのフ ェニルメタンスルホニルフルオリドを含む氷冷ＰＢＳ　Ｏ，５ａｈｌｌでゆっく り洗浄して集め、各々のマウスからそれぞれ約０．５ｍｌの肺洗浄液を採取し、 ４℃に於いて１０，０００　Ｘｇで５分遠心してデブリを除き一２０″Ｃで保存 した。 免疫学的技術 ＦＨＡに対するモノクロナール抗体Ｐ１２Ｈ３［１３］　とＰＴサブユニットＳ ｌ　（ＰＩ９）、　Ｓ４／Ｓ５ダブレツト（Ｅ２０５）及びＳ２とＳ３　（Ｐ： ２５１）と反応するモノクロナール抗体の反応混液とをウェスタンプロット法の 実験［５１に使用した。遊離及びリポソームに封入したＦＨＡとＰＴとを電気泳 動用緩衝液と１：１の比率で混合し、タンパク質をラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ） ［３０］の方法に従って、３．８５％のアクリルアミド濃縮用ゲルと１０％のア クリルアミド分離用ゲルとを用いて電気泳動した。半乾燥転移細胞（ＢｉｏＲａ ｄ）を用い、２５ｍＭトリス、グリシン１９２ｍＭ、メタノール２０％（ｐ）Ｉ 　８．３）を転写緩衝液とし、０．３％脂肪ミルクのｌＯ％ＰＢＳ溶液（ｐＨ７ ，４）をブロッキング剤として使用し、タンパク質をニトロセルロース膜（Ｂｉ ｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｓ、　Ｓ、ｒ、１．、　Ｍｌ、Ｉｔａｌｙ）に転写した。ブ ロックした膜に、第１の抗体、即ちＰＩ３）１３とＰＩ９．　Ｅ２０５．　Ｅ２ ５１（７）ハイブリドーマ上清をＰＢＳてｌ：２０に希釈した反応混液（ｐＨ７ ，４）との両方を加えて２時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄後、ＰＢ Ｓで１：５００に希釈したウマ・ダイコン・パーオキシダーゼ抱合ヤギ抗マウス 　［ｇＧ　（サザン・バイオテクノロジー・アソシェイッ・インク。 バーミンガム、アラバマ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ａ ｓ５ｏｃｉａｔｅｓ　Ｉｎｃ、。 Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｎ＋、　Ａｌａ、）　）を加えて膜を１時間インキュベート し、膜の洗浄後、４−クロロ−１−ナフトールを基質として使用して発色させた 。 プレ染色の分子量標識はパイオーラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）から購入した。 血清及び肺洗浄液中に存在するＦＨＡ及びＰＴに対するサブクラス特異性抗体を 測定するために、エンザイムリングドイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ） を次のように実施した。Ｎｕｎｃ　Ｍａｘｉｓｏｒｐ　［ｍｍｕｎｏ−ｍｏｄｕ ｌｅの９６ウエルのプレートを０．　Ｉ　Ｍ　ＮａＨＣＯｓで希釈したＦＨＡ又 はＰＴ　（ｐＨ９，６，ウェル当たり５０μｌ中６０ｎｇ、４°ｃで１晩インキ ユベート）で被覆し、ウェルをコウシ胎児血清（Ｆｅ３．　フロラ・ラボラドリ ース・インク、イルヴアイン、ユナイテッド・キングダム（ＰｌｏｗＬａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、、［ｒｖｉｎｅ、　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｋｉｎｇｄｏｍ） の１０％ＰＢＳ溶液１００μｌで３７℃で２時間ブロッキングした。続いてプレ ートをＰＢＳで３回洗浄し、Ｆｅ２の１０％ＰＢＳ溶液で１＝５０に希釈した血 清サンプル又は１：１０に希釈した肺洗浄液を各ウェルに１００μβずつ加えた 。３７°Ｃで６０分放置後にプレートを再び洗浄し、［ｇＧ、［ｇＭ又はＩｇＡ 重鎖に対するアルカリ性ホスファターゼ抱合ヤギ抗マウス抗体をＦｅ２の１０％ ＰＢＳ溶液で１：５００に希釈して各ウェルに１００μｌずっ加え、３７℃で２ 時間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、基質溶液（ｐ−ニトロフェニ ルホスフェイトジナトリウム塩の１０ｍｇ／ｍ　ｌジェタノールアミン緩衝液溶 液、ｐＨ９，８）を各ウェルに１００μｌずっ加えて発色させた。室温で３０分 後、３．ＯＭ　ＮａＯＨ５０μｌを加えて反応を停止し、ティドーリチック・マ ルチスキャン　ＭＣＣマイクロプレート・リーダー（Ｔｉｔｒｅｔｅｋ　Ｍｕｌ ｔｉｓｋａｎ　ＭＣＣｍ１ｃｒｏｐｌａｔｅ　ｒｅａｄｅｒ）　（Ｆｌ。 Ｗ）によりＡ４゜６を測定した。全てのサンプルを同時に同じ日に処理し、各血 清又は各肺洗浄液のサンプルを別個にアッセイし、ＥＬＩＳＡ測定の空試験には 抗原を含まないリポソームで免疫にしたマウスの血清又は肺洗浄液を用いた。結 果は各免疫グループ毎の平均値で示した。標準偏差は各グループ内の個々のマウ スサンプルの間のばらつきである。 電子顕微鏡検査 被覆なし、ＦＨＡ−被覆及びＰＴ−被覆リポソームを酢酸ウラニルの４％水溶液 （ｐＨ４，５）を用いてヴアレンタイン（Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ）等［６０］の方 法により負に染色した。金属シャドウィングには、３００メツシユのニッケル製 グリッドを覆った新たに調製したコロジオンの上にリポソームを吸収させ、蒸留 水で洗浄、風乾後、白金で１５°の角度に一方向金属シャドウイングを行った。 免疫電子顕微鏡法では、被覆なし又は抗原で被覆したリポソームを３００メツシ ユのニッケル製グリッドを覆った新たに調製したコロジオンの上に吸収させて、 蒸留水で注意して洗浄した。室温で風乾後グリッドをタンパク質１１製抗−ＦＨ Ａ又はＰＴポリクロナール又はモノクロナール抗体（ＩｇＧ　１．２５μｇ／タ ンパク質ｍｆ）で室温で６０分処理した。結合していない抗体をプラスチック瓶 からＰＢＳ（ｐＨ６，９）を穏やかにスプレーして除き、タンパク質Ａ・全複合 体（金粒子径１０　ｎｍ、　０．０１のＡｃｔ。）を滴下してグリッドを室温で １５分インキュベートして、結合した抗体を電子顕微鏡で見えるようにした。次 にグリッドを先ず０．０１％のＴｗｅｅｎ　２０を含むＰＢＳ、次に蒸留水で洗 浄した。風乾後、グリッドを白金で一方向（１５°の角度）に金属シャドウィン グするか、或いは金属シャドウィングなしで調べた。対照試験には、精製したプ レ免疫の血清又はタンパク質Ａ・全複合体だけてサンプルを処理した。標識のボ スト包理には、連続温度低下法に従ってＬｏｗｉｅｒｙｌ　Ｋ４Ｍ樹脂を用い標 識プロトコルを記載通りに適用して百日咳毒素リポソームを包理した［６４］。 サンプルをＺｅｉｓｓの電子顕微鏡ＥＭ　ＩＯＢを用い、８０　ｋＶの加速電圧 で、検定した拡大率により調べた。 実験の部Ｂの結果 ＦＨＡとＰＴとを含むリポソームの大きさの測定ＦＨＡとＰＴで被覆したリポソ ームの大きさはコールタ−・カウンター・モデル（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｃｏｕｎｔ ｅｒ　ｍｏｄｅｌ）　Ｎ４Ｍ　ＰＴを用いて分析した。 空試験及びＦｌ（Ａ又はＰＴで被覆したリポソームの平均直径は、それぞれ２２ ７　ｎｍ（９５％が２１１〜２４３　ｒ＋ｍの範囲）、２３６　ｎｍ　（９５％ が２１９〜２５３　ｎｍの範囲）及び２４４　ｎｍ　（９５％か２２６〜２６２ 　ｎｍの範囲）であった。 このデータから、リポソームにＦＨＡ又はＰＴを封入してもその平均直径にはあ まり影響しないことが判る。 ＦＨＡとＰＴとを含むリポソームのウェスタンプロット分析小胞中のＦＨＡとＰ Ｔとの存在を、ウェスタンプロット分析（図８）により、Ｐ１２Ｈ３モノクロナ ール抗体（レーン２．３．４）とＰＴサブユニット５１−４に対するハイブリド ーマ上清の反応混液（レーン２゜５．６）とを使用して確認した。遊離のＰＨＡ とＦＨＡ−被覆リポソームとの間のＦＨＡ含有量の差異は認められなかった（レ ーン３．４）が、遊離ＰＴとリポソームに組み込んだＰＴとの間にははっきりし た差異が見られた（レーン５．６）。これはＳｌ／Ｓ４とＳ２／Ｓ３とのそれぞ れに特異性のモノクロナール抗体の結合親和力に相違があるのが、リボソームへ のＳｌと５４１５サブユニツトの組込みが優先するのかのいずれかであると思わ れる。空試験の被覆なしのリポソームの中にはタンパク質は検出されなかった（ レーン２）。 ＦＨＡとＰＴとを含むリポソームの免疫電子顕微鏡分析被覆なし、ＦＨＡ−被覆 及びＰＴ−被覆のリポソームの電子顕微鏡検査から、これらのリポソームは大き さの異なる多重膜小胞であることが判明した（図９．Ａ、　Ｂ、　Ｃ，図３．Ａ ）。しかし、ＦＨＡ−被覆及びＰＴ−被覆のリポソームは被覆なしのリポソーム に比べてその形態学的外観を異にする（図９Ａと８７図９Ａと図１ＯＡとの比較 ）。これは恐ら＜　ＦＨＡ、　ＰＴのリポソームへの組込みによるものである。 ＦＨＡ−被覆リポソームを先ず抗−Ｆｌ（Ａポリクロナール又はモノクロナール 抗体、次にタンパク質Ａ・全複合体によりインキュベートした所、ＦＨＡ−リポ ソームの表面に強い標識化パターンを生じた（図９ＤとＥ）。モノクロナールの 方が標識化は軽度であった（データは記載せず）。 ＰＴ−被覆リポソームのポリクロナール抗ＰＴ抗体によるインキュベーションで の標識化パターンはＦＨＡ−被覆リポソームの場合より遥かに弱かった（図９． Ｄと図１０．８との比較）。標識強度がバックグラウンド標識より僅かしか強く なかったこともあったので、ポスト包理標識化によりＰＴかリポソーム膜の上で 検出できることを示そうと試みた。従来の方法ではリポソームの外側に付着した 抗原反応部位だけが検出でき、リポソーム膜の内側に存在する部位は検出できな かった。図１０．　Ｄは膜の周囲の標識を示すリポソームの図であり、ＰＴが外 側の膜に組み込まれたことを示している。照合試験（図９．Ｆと図１０．　Ｃ） ではごく僅かの金粒子しか検出されなかった。 予防接種したマウス中の百日咳菌ＦＨＡとＰＴとに対して特異な抗体応答 遊離のＦＨＡとＰＴ、及びＰＴとＦＨＡ抗原封入リポソーム原型ワクチンの両方 が特異性血清及び粘膜抗体応答を誘発した（図１０．１１）。 ＦＨＡ又はＰＴを全体で１２μｇの用量を等量ずつ３回に分けて経口投与して免 疫にしたマウスには、全身性（主としてＩｇＧ）と肺分泌性（主としてＩｇＧと ＩｇＡ　）の抗体応答が得られた（図１０ＡとＢ）。ＦＨＡを封入したリポソー ムで免疫にしたマウスには遊離のタンパク質を経口投与して免疫にしたマウスに 比べて約３倍の抗体力価が存在していることから、リポソームをベースにしたシ ステムのアジュバント活性がＦＨＡの場合に確認された（図１０）。遊離及びリ ポソームに封入したＰＨＡとＰＴとを同時にワクチンとして投与した場合抗ＰＨ Ａ抗体応答は阻害されなかった。肺洗浄液中に検出されたＦＨＡに特異のＩｇＭ の力価は僅かであった（データは記載せず）。 ＰＴによる免疫によっても同様な結果か得られた（図１１ＡとＢ）。 ＦＨＡの場合と同様に、両方のタンパク質（ＦＨＡとＰＴ）による同時免疫感作 は良い抗ＰＴ抗体応答を与えた。 実験の部Ｂの考察 百日咳に対する現在の非経口ワクチンは、感染を防ぐよりも臨床での百日咳の防 御に有効である。しかし、新たな安全なワクチンを考える場合、免疫感作の方策 を再考し、呼吸気管が百日咳感染の入口であることと、粘膜レベルでの有効な応 答を刺激するワクチンには感染を防止する可能性があることとを考慮に入れるの が適切であると思われる。分泌性１ｇＡと特異性１ｇＧ　（血清から毛細管を通 しての滲出により得られ、呼吸器官下部の主な１ｇ）が初期段階の細菌の付着と コロニー形成とを妨げ、それによって病気の根絶を容易にすることができるよっ てある。 経口及び非経口の経路で投与された抗原のプロセシングには、抗原の特異性と１ ｇクラスの特性に関して相違があり［２，６，２７，５８］　、［ｇＡ応答がワ クチン経口投与の典型である。バイエル板を被覆する特殊型Ｍ細胞は抗原性物質 を上皮細胞の下のリンパ球まで通過させ、そこでプロセシングされた抗原がＩｇ Ａ前駆Ｂ細胞に供与される。このＢ細胞はリンパ管システムを経由して種々の粘 膜まで移動し、そこでＩｇＡ分泌プラズマ細胞を産生ずる。Ｔリンパ球はバイエ ル板のにその帰着パターン（ｈｏｍｉ口ｇ　ｐａｔｔｅｒｎ）を得ることができ よう［５８１゜幾つかの抗原の場合に、粘膜及び全身性の免疫応答か経口投与に よって得られ［２３，２６，５６，６１］　、非経口経路で投与された抗原によ り誘発された免疫応答よりも有効で効力の持続期間が長い。経口投与の百日咳菌 全細胞ワクチンの効果は非経口投与ワクチンと同等である［９］。本発明者等は 最近、サルモネラｓｐｐ、の組換え体ａｒｏＡムタンにより経口的に免疫感作し た後で、ＦＨＡ及びＰＴのＳｔサブユツトに対して特異性肺粘膜応答のあること を示した［２１．６３］。現在の研究は、百日咳菌に対する全身性及び粘膜の免 疫応答が遊離のＦＨＡとＰＴによる経口免疫感作の後に得られることを示すこと によって、前記の観測結果を広げようとしている。ＦＨＡとＰＴとのリポソーム 運搬システムへの封入により、アジュバント効果が得られ、抗体応答を大いに改 善する。抗原の経口投与後の抗原特異性Ｔサプレッサー細胞による耐性と全身性 抑圧、及び特異性分泌性＋ｇＡの既存のレベルによる吸収の問題が報告されてい るが［６，５８］、これらの現象は本発明者等の実験では見られなかった。 Ｆｌ（Ａ−被覆リポソームとＰＴ−被覆リポソームとの両方で免疫にしたマウス の抗体レベルは単一の抗原で免疫にした場合と同じであったことは強調に値する 。従って本発明者等は、最近重要な保護抗原であることが示された百日咳菌の６ ９　ｋＤａ外膜タンパク質を含む多重抗原を運搬するのに本研究が使用し得ると の結論である［３９］。組換え体ＦＨＡを発現する大腸菌株［２ｏ１、ＰＴを過 剰生産するボルデテラ５ｐｐ１株［６４，６９］　、及びＰＴの遺伝的解毒の方 法［４４，６９］が現在利用することができ、リポソームのベースとなるサブユ ニットワクチン用の無毒の全遺伝的成分を高収率で生産することが容易になろう 。事実１次及び２次の免疫応答がリポソームと関連したジフテリア毒素により高 められた［１１ので、幼児のワクチン体制での従来のＤＴＰワクチンを置き換え ることのできる多価ワクチンの出現が予想される。 百日咳菌の感染の防御を仲介する機構はまだ明らかでない。非経口免疫感作とそ の後の体液及び細胞の応答とは常に関連しているとは限らない［４４］。更に、 百日咳の病気を防御するために細胞が仲介する免疫応答が生体内で重要であると 信じられている［７．１４］。リポソームは細胞仲介の免疫性を誘導することが 知られているので、本研究に使用した運搬システムが、文献にある抗体応答に加 えてＦＨＡ及びＰＴに対する細胞仲介応答を誘導するかどうかの確認も興味があ る。 ここで報告した結果は出発点に過ぎない。脂質Ａ、水酸化アルミニウムなどのよ うなアジュバント活性を有することが既知の他の物質の組込みは分泌性＋ｇＡプ ライミングに追加の効果又は相乗的効果を与えるものと思われる（４３，４６］ 。ビタミンＡの投与により経口ワクチン投与後の免疫応答か改善されよう［２１ ゜免疫か得られる期間の長さ、最適の予防接種計画及び刺激後の防御などを含む その他の問題も研究しなければならない。 サブユニットワクチンが侵入部位から離れた箇所の免疫応答を誘発するための運 搬システムとして、リポソームの使用は極めて有望である。経口経路により百日 咳ワクチンに関連して局所的に最も起こり易い副作用を軽減又は除去し、アジュ バント活性が細胞仲介及び体液の免疫応答を高めることができよう。リポソーム は化学的に安定で、生産が容易で、生物により分解される。段階■及び■での試 験にリポソームを使用したがその毒性は報告されていない［１，１７］。更にリ ポソームの生産に使用する安価な原料が生産原価の低減に寄与する。ワクチンの 経口投与はいずれの場合にも非経口予防接種に比へて経費を大幅に削減でき、特 に健康保健対策に金のがかる地方の新開地に於ける予防接種プログラムのキーポ イントである。 ＬＩ　（ＴｈｌＰ−被覆ワクチンの経口及び鼻腔内投与により免疫にしたマウス の肺洗浄液中の百日咳菌ＯＭＰに対する抗体の力価投与経路　１０日後２ １ｇＡ　ＩｇＧ 経口０．１０＋０．０６ｅ０．１１＋０．０５鼻腔内　０．１１＋０．０３　０ ．３５＋０．１７４０日後１ 追加免疫なし１　追加免疫あり ［ｇＡ　ＩｇＧ　ＩｇＡ　ＩｇＧ 経口　ｎｄ’　ｎｄ’　４．６±２．０　６．５±１．１鼻腔内　０．４０＋０ ．１８　０．４８＋０．３５　５．１＋１．５　６．６＋１．５ａ：最初の免疫 後の日数、ｂ＝最初の免疫後３０日日月追加免疫、Ｃ：標準偏差、ｄ：口ｄ＝測 測定ず 炙２　ＬＰＳ−被覆小胞及びＯＭＰ−被覆小胞の経口及び鼻腔内投与後のマウス 肺洗浄液中の百日咳菌ＬＰＳに対する抗体の力価経口　鼻腔内 ＩｇＡ　ＩｇＧ　［ｇＡ　ＩｇＧ ＬＰＳ−小胞　０．０　＋０．０５’　０．３７＋０．１２　０．０　＋０．０ ５　０．４６ｆＯ，２１０ＭＰ−小胞　０．６６＋０．５１　１．１　＋０．３ ４　１．６±０．２３　１．６±０．１４ａ：標準偏差 文献 ［１１アリソン・エイ・シー（Ａｌｌｉｓｏｎ　Ａ、Ｃ，）及びジー・グレゴリ アゾイス（Ｇ、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ）、１９７４、免疫学的アジュバントと してのリポソーム、Ｎａｔｕｒｅ　２５２．２５２゜［２１ビエネンストック・ ジエー（Ｂｉｅｎｅｎｓｔｏｃｋ　Ｊ、）及びエイ・ディー・ビフス（Ａ、Ｄ、 Ｂｅｆｕｓ）、１９８０、Ｍｕｃｏｓａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　４１：２ ４９−２７０゜［３１ブラウンシー・アール・エム（Ｂｒｏｗｎｌｊｅ　Ｒ，Ｍ 、）、ジエイ・ジー・コート（Ｊ、　Ｇ、　Ｃｏｏｔｅ）及びアール・バートン （Ｒ，Ｐａｒｔｏｎ）、１９８５、百日咳菌の表現型変化の間のアデニル酸シク ラーゼ活性、Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１３１．２７−３８゜［ ４１ブロウ・アール（Ｂｕｌｏｗ　Ｒ，）及びジエイ・シー・ブースロイド（Ｊ 、　Ｃ，Ｂｏｏｔｈｒｏｙｄ）、　１９９１．リポソーム中のｐｓｏ抗原の免疫 感作による致命的トキソプラズマ症病原体感染に対するマウスの防御、Ｊ、　１ ｍｍｕｎｏ１．１４７：３４９６−３５００゜［５１バーネット・ダヴリュ・エ ヌ（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ　Ｗ、Ｎ、）、１９８１、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリ アクリルアミドゲルからのタンパク質の未修飾ニトロセルロースへの　１ウエス タンプロツト法１電気泳動転写及び抗体と目″Ｉ標識タンパク質Ａとを用いたラ ジオグラフによる検出、Ａｎａｌｙｔ、Ｂｉｏ−ｃｈｅｍ、１２１：１９５−２ ０３゜［６１クゼールキンスキー・シー（Ｃｚｅｒｋｉ口ｓｋｙ　Ｃ，）、ニス ・ジエイ・プリシス（Ｓ、Ｊ、Ｐｒ１ｎｃｅ）、　ｘス−１ム・ミカレク（Ｓ、 　Ｍ、　Ｍｉｃｈａｌｅｋ）。 ニス・ジャクソン（Ｓ、　Ｊａｃｋｓｏ口）、　エム・ダヴリュ・ラッセル（Ｍ 、　Ｗ、　Ｒｕ５ｓｅｌｌ）、ゼット・モルドヴイーヌ（Ｚ、　Ｍｏ１ｄｏｖｅ ａｎｕ）、ジエイ・アール・マツクギ−（Ｊ、　Ｒ，ＭｃＧｈｅｅ）　及びジエ イ・メステｔ−−（Ｊ、Ｍｅｓｔｅｃｋｙ）、　１９８７、末梢血液ａＲｅｒ抗 原摂取でのＩｇＡ抗体産生細胞：ヒトの共通粘膜免疫システムに対する証拠、Ｐ ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ。 ８４・２４４９−２４５３゜ ［７］　Ｆ・マシス）’Ｊス・ティー−ｚム（ＤｅＭａｇｉｓｔｒｉｓＴ、Ｍ、 ）、エム・ロマバＭ、Ｒｏｍａｎｏ）、　ｆ−ス・ヌイ（Ｓ、Ｎｕｔｉ）、　７ −）Ｌｔ　・ラップｔ　ＩＪ（Ｒ，Ｒａｐｐｕｏｌｉ）及びエイ・タグリアブー （Ａ、Ｔａｇｌｉａｂｕｅ）、１９８８、ボルデテラ属に対する切開ヒトＴ細胞 応答、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１６８：１３５１−１３６２゜ ［８１デシデリオ・ジエイ・ケイ（Ｄｅｓｉｄｅｒｉｏ　Ｊ、Ｖ、）　及びニス ・ジー・キャンベル（Ｓ、Ｇ、Ｃａｍｐｂｅｌｌ）、　１９８５、リポソーム会 合。抗原による実験マウスのサルモネラ症に対する免疫、１ｎｆｅｃｔ、［ｍ− ｍｕｎ、　４８：６５８−６６３゜ ［９１フォーク・ダヴリュ（Ｆａｌｋ　Ｗ、）、ケイ・エイチ・ポフラー（Ｋ。 Ｈ，Ｈｏｆ　１ｅｒ）、ケイーロザネリ（Ｋ、　Ｒｏｓａｎｅｌｌｉ）及びアー ル・クルッ（Ｒ。 Ｋｕｒｚ）、　１９８１　、経口百日咳予防接種の現在と将来、Ｆｏｒｔｓｃｈ ｒ、　Ｍｅｄ。 ９９：ｌ３６３−１３６６゜ ［１０ｊ　フランシス・エム・ジエイ（Ｐｒａｎｃｉｓ　Ｍ、　Ｊ、　）、　シ 町エム・フラー（Ｃ，Ｍ、　Ｆｒｙ）、ディー・エル−ｏ−ラング（Ｄ、１．Ｒ ｏｗｌａｎｄｓ）、　ｘフ・ブラウン（Ｆ、　Ｂｒｏｗｎ）、ジエイ・エル・ピ ッチル（Ｊ、Ｌ、Ｂｉｔｔｌｅ）、　７−ル・エイ・ホーフテン（Ｒ，Ａ、　Ｈ ｏｕｇｈｔｅｎ）　及びアール・エイ・ラーナー（Ｒ，Ａ、Ｌｅｒｎｅｒ）、　 １９８５、***ウィルスの合成ペプチドによる免疫学的ブライミング、Ｊ、Ｇ ｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、６６：２３４７−２３５４゜［１１］　ファイン・ビ町イー ・エム（Ｆｉｎｅ　Ｐ、Ｅ、Ｍ、）　及びジエイ・エイ・クラーク（Ｊ、　Ａ、 　Ｃ１ａｒｋｓｏｎ）、１９８２、百日咳の再発：ワクチンノ効能の評価に対す る関連性、Ｌａｎｃｅｔ　１．　６６６−６６９゜［１２］　ファイン・ビー・ イー・エム（Ｆｉｎｅ　Ｐ、　Ｅ、　Ｍ、　）及びジエイ・エイ・クラーク（Ｊ 、Ａ、Ｃ１ａｒｋｓｏｎ）、　１９８７、百日咳ワクチンの効能中の反射、Ｒｅ ｖ、［ｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、９：８６６−８８３゜［１３１フランク・ディー・ ダヴリュ（Ｆｒａｎｋ　Ｄ、Ｗ、）　及びシー・ディー・パーカー（Ｃ，Ｄ、Ｐ ａｒｋｅｒ）、　１９８４、百日咳菌に対するモノクロナール抗体の分離とキャ ラクタリゼーション、Ｊ、Ｂｉｏｌ、５ｔａｎｄ、　１２：３５３−３６５゜ ［１４］　キ７　ＩＪ　ング・エイ・ジエイ・エイチ（Ｇｅａｒｉｎｇ　Ａ、Ｊ 、Ｈ，）、シーアール・バード（Ｃ，Ｒ，Ｂｉｒｄ）、ケイ・リードヘッド（Ｋ 、　Ｒｅｅｄｈｅａｄ）　及びエム・トーマス（Ｍ、Ｔｈｏｍａｓ）、　１９８ ９、百日咳菌感染に対するヒトの細胞免疫応答、ＦＢＭＳ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ ｌ、［ｍｍｕｎｏｌ、　４７＋２０５−２１２゜［１５１ギアマンコ・エイ（Ｇ ｉａｍｍａｎｃｏ　Ａ、）、エイ・シャリーニ（Ａ、Ｃｈｉａｒｉｎｉ）、ティ ー・ストロフオリー＝（Ｔ、５ｔｒｏｆｆｏｌｉｎｉ）、ディー・トーｖティア （Ｄ、Ｄｅ　ＩＪａｔｔｉａ）、エム・シャラーノンテ（Ｍ、　Ｃｈｉａｒａｒ ｎｏｎｔｅ）、エム・イー・モジエン（Ｍ、　Ｅ、　Ｍｏ５ｃｈｅｎ）　、アイ ・ムラ（１，Ｍｕｒａ）。 ジー・リボ（Ｇ、Ｒｉｇｏ）、　ニス・タオルニナ（Ｓ、Ｔａｏｒｒｎｉｎａ） 、−Ｔ−イ・サルザナ（Ａ、　５ａｒｚａｎａ）、ジー・マッツｙ　（Ｇ、　Ｍ ａｚｚａ）及びビー・スカルパ（Ｂ、５ｃａｒｐａ）、　１９９１、イタリアに 於ける百日咳の血清疫学、Ｒｅｖ、　Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、１３：１２１６− １２２０゜［１６１グ・ソドマン・ワイ・イー（Ｇｏｏｄｍａｎ　Ｙ、巳、）、 エイ・ジエイ・ウォート（Ａ、　Ｊ、　Ｗｏｒｔ）　及びエフ・エル・ジャクラ ン（Ｆ、　Ｌ、　Ｊａｃｋｓｏｎ）（１９８１）、最近の感染の指標としての鼻 咽頭腔分泌中の百日咳免疫グロブリンＡの検出用のエンザイムリンクトイムノソ ルヘントアツセイ。 Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、＋３：２８６−２９２゜［１７１グレゴ リアゾイス・ジー（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ　Ｇ、）、　１９９０、免疫学的ア ジュバント・リポソームに対する役割、［ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ、　 １１：８９−９７゜ ［１８１グレゴリ−・アール・エル（Ｇｒｅｇｏｒｙ　Ｒ，Ｌ、）、−１−ス・ エム・ミカレク（Ｓ、　Ｍ、　Ｍｉｃｈａｌｅｋ）、ジー・リチャードソン（Ｇ 、　Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ）、シー・ハーモン（Ｃ，Ｈａｒｍｏｎ）、ティー・ ヒルトン（Ｔ、　Ｈｉｌｔｏｎ）及びジェイ・アール・マツクギ−（Ｊ、Ｒ，Ｍ ｃＧｈｅｅ）、　１９８６、リポソーム中の連鎖球菌５ｏｂ−ｒｉｎｕｓ　ｒｉ ｂｏｓｏｍａｌ調製品の経口投与に対する免疫応答のキャラクタリゼーション、 １ｎｆｅｃｔ、［ｍｍｕｎ、　５４ニア８０−７８６゜［１９］　グリフイス・ イー（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ　Ｅ、）　（１９８８）　、全細胞百日咳ワクチンの 効能、書籍［百日咳に於ける病原性と免疫（Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄ　 Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　ｉｎ　Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）Ｊ　（編者　エイ・シー・ワー ドロウ（Ａ。 Ｃ，Ｗａｒｄ　ｌａｗ）　及びアール・バートン（Ｒ，Ｐａｒｔｏｎ））　３５ ３−３７４頁、出版社Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ　Ｌｔｄ、　Ｇ ｕｉｌｄｆｏｒｄ、　Ｕ、Ｋ。 ［２０１グツマン・シー・エイ（ＧｕｚｍＡｎ　Ｃ，Ａ、　）、エム・ジェイ・ ウォーカー（Ｍ、Ｊ、Ｗａｌｋｅｒ）、　−１−ムーｏ−ド（Ｍ、　Ｒｏｈｄｅ ）及びケイ・エフ・ティミス（Ｋ、Ｎ、Ｔｉｍｍ１ｓ）、　１９９１、大腸菌及 びネズミチフス菌ａｒｏＡ中の百日咳菌繊維状血球凝集素の直接発現、Ｉｎｆｅ ｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、　５９：３７８７−３７９５゜ ［２１１グツマン・シー−エイ（Ｇｕｚｍａｎ　Ｃ，Ａ、）、アール−エム・ブ ラウンジー（Ｒ，Ｍ、　Ｂｒｏｗｎ　ｌ　ｉｅ）、　ジエイ・カデュラガムワ（ Ｊ、　Ｋａｄｕｒｕｇａｍｕｗａ）、エム・ジエイ・ウォーカー（Ｍ、　Ｊ、Ｗ ａｌｋｅｒ）及びケイ・エフ・ティミス（Ｋ、Ｎ、Ｔｉｍｍ１ｓ）、　１９９１ ．ネズミチフス菌ａｒｏＡ及び百日咳菌の繊維状血球凝集素を発現する侵入性大 腸菌株による経口免疫感作後のマウスの肺の中の抗体応答、［ｎｆｅＣｔ、Ｉｍ ｍｕｎ、　５９：４３９１−４３９７゜［２２１ホウラン・シー・ビー（Ｈｏｗ ｓｏｎ　Ｃ，Ｐ、）及びエイチ・ケイ・フィンベルブ（Ｈ，Ｖ、Ｆｉｎｅｂｅｒ ｇ）、　１９９２、百日咳及び風疹ワクチン接種後の副作用：医学学会の報告の 要約、ＪＡＭＡ　２６７・３９２−３９６゜［２３］　Ｅ　ハ：／セン・エイチ （Ｊｏｈａｎｓｅｎ　Ｈ，）、エフ・ホイビー（Ｎ、Ｈｏ１ｂｙ）及びニス−ニ ス・ペブルセン（Ｓ、Ｓ、Ｐｅｄｅｒｓｅｎ）、　１９９１．緑膿菌アルギン酸 塩による実験的免疫がＩｇＡ及び［ｇＧ抗体応答を誘発、ＡＰＭ　［Ｓ、９９： １０６１−１０６８゜ （２４１カール・エル・ビー（ＫａｈＬ　Ｌ、Ｐ、）、アール・レルチャック（ １’ｌ。 Ｌｅｌｃｈｕｋ）、シー・エイ・スコツト（Ｃ，Ａ、５ｃｏｔｔ）及びジエイ・ ビーズレイ（Ｊ、Ｂｅｅｓｌｅｙ）、１９９０、ＢＡＬＢ／Ｃマウスを皮膚リー シ、７＝７症から保護するリーシュマニア主要抗原リポソームのキャラクタリゼ ーンヨン、５８：３２３３−３２４１゜ ［２５］　カール・エル・ビー（Ｋａｈｌ　Ｌ、Ｐ、）、シー−エイ・スコツト （Ｃ。 Ａ、　５ｃｏｔｔ）、アール・シルチー１−ツク（Ｒ，Ｌｅｌｃｈｕｋ）、ノー ・グレゴリアゾイス（Ｇ、　Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ）及びエフ・ワイ・リウ（ Ｆ、Ｙ、Ｌｉｅｗ）、　１９８９、リーシュマニア主要抗原／リポソームを使用 したマウスの皮膚り一シュマニア症に対する予防接種、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　 １４２＋　４４４１−４４４９゜［２６］　カンチル・エイ（Ｋａｎｔｅｌｅ　 Ａ、）、　−１−イチ・アヴリロミ（Ｈ，Ａｖｒｉｌｏｍｍｉ）及びアイ・ヨキ ネン（１，Ｊｏｋｉｎｅｎ）、１９８６、チフス菌に対する経口予防接種後の特 異性免疫グロブリンを分泌するヒトの血液細胞、Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、１ ５３：１１２６−１１３１゜［２７］　カンチル・エイ（Ｋａｎｔｅｌｅ　Ａ、 ）、　エイチ・アヴリロミ（Ｈ，Ａｖｒｉｌｏｍｍ　ｉ　）　、ジェイ・エム・ カンチル（Ｊ、Ｍ、Ｋａｎｔｅｌｅ）、エル・リンタラ（Ｌ、　Ｒｉｎｔａｌａ ）及びビー・エイチ・メカラ（Ｐ、　Ｈ，Ｍｅｋｅｌａ）、１９９１、生の、滅 菌した経口、滅菌した非経ロチフス菌Ｔｙ２１ａワクチンに対するヒトの免疫応 答の比較、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ、Ｐａ−ｔｈｏｇｅｎ、　ＩＯ：１１７−１２６ ゜［２８１ケラト・ケイ（Ｋｅｔｔ　Ｋ、）、ビー・ブランドツァエグ（Ｐ、　 Ｂｒａｎｄｔｚａｅｇ）、ジエイ・ランドル（Ｊ、　Ｒａｄｌ）及びノエイ・エ フ・ハーイジマン（Ｊ、Ｆ、Ｈａａｉｊｍａｎ）、　１９８６、ヒトのリンパ系 器官及び種々の分泌組織に於ける［ｇＡ産生細胞の異なるサブクラスの分布、Ｊ 、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３６：３６３１−３６３５゜ ［２９１キムラ・エイ（Ｋｉｍｕｒａ　Ａ、）、ティー・マウントゾウロス（Ｔ 、　Ｍｏｕｎｔｚｏｕｒｏｓ）、ディー・エイ・レルマン（Ｄ、　Ａ、　Ｒｅｌ ｍａｎ）、ニス・ファルコウ（Ｓ、　Ｆａｌｋｏｗ）　及びジエイ・エル・コラ エル（Ｊ、　Ｌ、　Ｃｏｗｅｌｌ）、　１９９０、百日咳繊維状血球凝集素：マ ウスの呼吸感染モデルに於ける保護抗原及びコロニー形成因子としての評価、Ｉ ｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　５８ニア−１６゜［２０］　ラエムリ・ニー・ケ イ（Ｌａｅｍｍｌｉ　Ｕ、に、）　１９７０、バタテリオファージＴ４の頭部の 構築の際の構造タンパク質の切開、Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０−６８５゜ ［３１１ラーソン・イー（Ｌａｒｓｏｎ　Ｅ、）、ビー・ホーレット（Ｂ、　Ｈ ｏｗｌｅｔｔ）及びエイ・ジャゲンドルフ（Ａ、Ｊａｇｅｎｄｏｒｆ）、１９８ ６、タンパク質測定用Ｌｏｗｒｙ法の人工還元剤増強、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、＋５５：２４３−２４８゜［３２１メステラキー・ジエイ（Ｍｅｓｔｅｃｋ ｙ　Ｊ、）、１９８７、共通の粘膜免疫システムと外部分泌中に免疫応答を誘発 するための最近の方策、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、［ｍｍｕｎｏｌ、７：２６５−２７６゜ ［３３１ミラー・ディー・エル（Ｍｉｌｌｅｒ　Ｄ、Ｌ、）、アール・アルダ− スレイト（Ｒ，Ａｌｄｅｒｓｌａｄｅ）及びイー・エム・ロス（Ｅ、ＩＪ、Ｒｏ ｓｓ）、　１９８２、百日咳と百日咳ワクチン：危険と恩恵の討論、Ｅｐｉｄｅ ｍｉｏｌ、Ｒｅｖ、４＋１−２４゜［３４１ミューシー・エイ・ニス（Ｍｕｌｌ ｅｒ　Ａ、Ｓ、）、ジエイ・リーウヴエンブルク（Ｊ、　Ｌｅｅｕｗｅｎｂｕｒ ｇ）及びディーニス・ブラット（Ｄ、　Ｓ、　Ｐｒａｔｔ）。 １９８６、百日咳　疫学と規制、Ｂｕｌｌ、　ＷＨｏ、　６４：３２１−３３１ ゜［３５］　ムノズ・ジエイ・ジエイ（Ｍｕ口ｏｚ　Ｊ、Ｊ、）、エイチ・アラ イ（Ｈ，Ａｒａｉ）　及びアール・エル・コール（Ｒ，Ｌ、Ｃｏ１ｅ）、　１９ ８１、百日咳菌がらの百日咳の房状の血球凝集素のマウス防御、ヒスタミン感作 活性、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、　３２：２４３−２５０゜１３６］　ネトラ ド・ジエイ・ジー（Ｎｅｄｒａｄ　Ｊ、　Ｇ、　）、エックス・ビー・リャン（ Ｘ、　−Ｐ、　ｌｊａｎｇ）及びエム・イー・ラム（Ｍ、　Ｅ、　Ｌａｍｍ）、 　１９８９、マウスのセイダイウィルスによる経口免疫感作、Ｃｕｒｒ、Ｔｏｐ ｉｃ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１４６：１１７−１２２゜ ［３７］　ネンシオニ・エル（Ｎｅｎｃｉｏｎｉ　Ｌ、）、エム・ピザ（Ｍ、　 Ｐｉｚｚａ、）。 エム・ブグノル（Ｍ、　Ｂｕｇｎｏｌｌ）、ティー・ド・マンストリス（Ｔ、Ｄ ｅ　Ｍａｇｉｓｔｒｉｓ）、　エイ・ディ・トマソ（Ａ、Ｄｉ　Ｔｏｍｍａｓｏ ）、　エフ・ジョヴアンニ（Ｆ、　Ｇｉｏｖａｎｎｏｎｉ）、アール・マネッテ ４−　（Ｒ，Ｍａｎｅｔｔｉ）、アイ・マルノリ（［、Ｍａｒｓｉｌｉ）、ジ・ マチウシ（Ｇ、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ）、ディー・ヌッシ（Ｄ、　Ｎｕｃｃｉ）、 アール・オリケイエリ（Ｒ，０１ｉｖｉｅｒｉ）、ビー・ピレリ（Ｐ、　Ｐｉ　 １ｅｒｉ）、アール・プレゼンティ−−１−（Ｒ，Ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｉ）、　 −Ｌル・ケイラ（Ｌ、　Ｖｉ　Ｉ　ｌａ）、　ジェイ・ジー・フリーテンベルブ （Ｊ、　Ｇ、　Ｋｒｅｅｔｅｎｂｅｒｇ）、ニス・シルヴエストリ（Ｓ、５ｉｌ ｖｅｓｔｒｉ）、エイ・タグリアブー（Ａ、　Ｔａｇｌｉａｂｕｅ）及びアール ・ラボウリ（Ｒ，Ｒａｐｏｕｌｉ）、　１９９０．普通は不活性の百日咳毒素変 異体のキャラクタリゼーション二百日咳に対する新しいワクチンの候補、　Ｉｎ ｆｅｃｔ、　［ｍｍｕｎ、　５８：１３０８−１３１５゜［３８１ノイラト・ア ール・エイ（Ｎｅｕｒａｔｈ　Ｒ，Ａ、）、　−ｒ−ス・ビー・ケント（Ｓ、Ｂ 、　Ｋｅｎｔ’）及びエフ・ストリック（Ｎ、５ｔｒｉｃｋ）、　１９８４、肝 炎ＢウィルスのＰｒｅ−３遺伝子コードの免疫支配エピトープの位置と化学的合 成、５ｃｉｅｎｃｅ　２２４：３９２−３９４゜［３９１ノヴオトニー・ビー（ Ｎｏｖｏｔｎｙ　Ｐ、）、　−ｒ−イ・ビー・チュブ（Ａ、　Ｐ。 Ｃｈｕｂｂ）、ケイ・コランレイ（Ｋ、　Ｃｏｗｎｌｅｙ）及びアイ・ジー・チ ャールズ（（、Ｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ）、　１９９１　、百日咳菌の６９　ｋＤａ 外膜タンパク質の生物学的、保護的性質：無細胞百日咳ワクチンの新しい製剤、 Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、１６４：１１４−１２２゜［４０１エーランダー ・アール・エム（Ｏｌａｎｄｅｒ　Ｒ，Ｍ、）、エイ・ムオティアラ（Ａ、Ｍｕ ｏｔｉａｌａ）、　１ム・カルヴオネン（Ｍ、　Ｋａｒｖｏｎｅｎ）、ティー・ クロンネン（Ｔ、　Ｋｕｒｏｎｅｎ）及びケイ・ルネベルグーニマン（Ｋ、　Ｒ ｕｎｅｂｅｒｇ−Ｎｙｍａｎ）、　１９９０　、百日咳菌Ｔｎ５変異体、二つの 異なるマウス系統の精製したＰＴとＦＨＡ及びマウスの鼻腔内感染モデルでの受 動免疫に対する血清抗体応答、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ、Ｐａｔｈｏｇｅｎ、　８： ３７−４５゜［４１１オーリン・ビー（Ｏｌｉｎ　Ｐ、）及びジェイ・ストアサ エター（Ｊ、　５ｔｏｒｓａｅｔｅｒ）、　１９８９、無細胞百日咳ワクチンの 効能、Ｊ、　Ａｍｅｒ、　Ｍｅｄ、　Ａｓ５ｏｃ、２６１：５６０−５６２゜ ［４２１ペブシー・エム・ニス（Ｐｅｐｐｌｅｒ　Ｍ、Ｓ、）、　１９８４、百 日咳菌の株の二つの物理的、血清学的に異なるリボ多糖とその表現型変種、Ｉｎ ｆｅｅｔ、　［ｍｍｕｎ、４３：２２４−２３２゜［４３１ピエーセ・エフ・エ フ（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｎ、Ｆ、）及びジェイ・ビー・サツシ・ジュニア（Ｊ、Ｂ、 　５ａｃｃｉ　Ｊｒ、）　１９８４、脂質Ａによるリポソーム会合コレラ毒素の 粘膜免疫原性の増強、Ｒｅｖ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、　６：５６３−５６ ６゜［４４１ボダ・エイ（Ｐｏｄｄａ　Ａ、）、　−Ｌル・ネンシオニ（Ｌ、　 Ｎｅｎｃｉｏｎｉ）、ティ・エム・ド・マンストリス（Ｔ、Ｍ、Ｄｅ　Ｍａｇｉ ｓｔｒｉｓ）、エイ・ディ・トマ゛バＡ、Ｄｉ　Ｔｏｍｍａｓｏ）、ビー・ブッ ス（Ｐ、Ｂｏｓｓｔ＋）、：Ｌス・ヌテ４（Ｓ、Ｎｕｔｉ）、ビー・ピレリ（Ｐ 、Ｐｉｌｅｒｉ）、　Ｌス・ペボロ−：（Ｓ、Ｐｅｐｐｏｌｏｎｉ）。 エム・ブグノリ（Ｍ、　Ｂｕｇｎｏｌｉ）、ビー・ルギエロ（Ｐ、　Ｒｕｇｇｉ ｅｒｏ）、エル・マルシリ（Ｌ、Ｍａｒｓｉｌｉ）、エイ・ディエリコ（Ａ、Ｄ ’Ｅｒｒｉｃｏ）、−１−イ・タグリアブー（Ａ、　Ｔａｇｌｉａｂｕｅ）及び アール・ラブオり（Ｒ，Ｒａｐｐｕｏｌ　ｉ）。 １９９０、遺伝的に不活性化した百日咳毒素変異体ＰＴ−９に／１２９Ｇで免疫 にした成人篤志者に於ける代謝体液及び細胞の応答、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１ ７２８６１−８６８゜ ［４５１シーレム・エイ（Ｒｈａｌｅｍ　Ａ、）、シー・ボアディオ（Ｃ，Ｂｏ ｕｒｄｉｅｕ）、ノー・ルフｔ　（Ｇ、　Ｌｕｆ　ｆａｕ）及びビー・ベリー（ Ｐ、Ｐｅｒｙ）、　１９８８、リポソームニ封入したＮｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙ ｌｕｓ　ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓの成人抗原によるマウスの予防接種、Ａｎｎ 、［ｎｓｔ、Ｐａ５ｔｅｕｒ／Ｉｍｍｕｎｏ１．　＋３９：１５７−１６６゜［ ４６１リチャーズ・アール・エイ（Ｒｉｃｈａｒｄｓ　Ｒ，Ａ、）、−Ｌム・デ ィー・ハイレ（Ｍ、　Ｄ、　Ｈａｙｒｅ）、ダヴリュ・ティー・ホックメイアー （Ｗ、　Ｔ、　Ｈｏｃｋｍｅｙｅｒ）及びシー・アール・アーケイング（Ｃ，Ｒ ，Ａｌｖｉｎｇ）、　１９８８、ボソーム、脂質Ａ、及び水酸化アルミニウムは 合成マラリャスボロゾイト抗原に対する免疫応答を高める、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍ ｍｕｎ、　５６：６８２−６８６゜［４７］　ロバートラン・エイ（Ｒｏｂｅｒ ｔｓｏｎ　Ａ、）、　：Ｌルーエイ・イー・アンスワース（Ｌ、Ａ、Ｅ、Ａｓｈ ｗｏｒｔｈ）、　−ｒ−イ・バスカーヴイル（Ａ、　Ｂａ５ｋｅｒｖｉｌＩｅ） 及びエル・アイ・アイアンス（Ｌ、１．Ｉｒｏｎｓ）、１９８５、百日咳菌によ るマウスの鼻腔内感染に対する防御、Ｄｅｖｅｌｏｐ、　Ｂｉｏｌ、　５ｔａｎ ｄａｒｄ。 ６］　：１６５−１７２゜ ［４８１ロバートラン・エイ（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ　Ａ、）、エル・アイ・アイ アンス（Ｌ、　１．　Ｉｒｏｎｓ）及びエル・エイ・イー・アンスワース（Ｌ、 　Ａ、　Ｅ、　Ａｓｈｗ。 ｒｔｈ）、　１９８５、百日咳ワクチン：現状と将来の予想、Ｖａｃｃｉｎｅ　 ３：１１−２２゜ ［４９１ラッセル・ディ・ジー（Ｒｕｓｓｅｌ　Ｄ、Ｇ、）及びジエイ・アレキ サンダー（Ｊ、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ）、　＋９８８、リポソーム中ニ再構成シタ ハツキリ規定した膜抗原による皮膚リーシュマニア症に対する有効な免疫感作、 Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４０：　ｌ’７４−１２７９゜［５０］　サト＝’フ イ（ＳａｔｏＹ、）、シエイーｘルーコウェル（Ｊ、Ｌ、Ｃｏｗｅｌｆ）、　エ イチ・サト（Ｈ，５ａｔｏ）、デ４−−ジーーＡ−スチン（Ｄ、　Ｇ、　Ｂｕｒ ｓｔｙｎ）及びシー・アール・マンクラーク（Ｃ，Ｒ，Ｍａｎｃｌａｒｋ）、　 １９８３、百日咳菌からの血液凝集素の分離と精製、Ｉｎｆｅｃｔ、［ｍｍｕｎ 、　６１：３１３−３２０ｃ＋［５１ｊ　シャヒン・アール・ディー（Ｓｈａｈ ｉｎ　Ｒ，Ｄ、）、エム・ジエイ・ブレナン（Ｍ、　Ｊ、　Ｂｒｅｎｎａｎ）、 ゼット−ｘム・す（Ｚ、　Ｍ、　Ｌｉ）、ビ町ディー・メアデ（Ｂ、　Ｄ、　Ｍ ｅａｄｅ）及びシー・アール−マンクラーク（Ｃ，Ｒ，Ｍａｎｃｌａｒｋ）、　 ＋９９０、百日咳菌の６９　ｋｄ外膜タンパク質の保護容量と免疫原性のキャラ クタリゼーション、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１７１：６３−７３゜［５２１スニ ップ・エイチ（８口１ｐｐｅ　）！、）、ジエイ・イー・ジー・ヴアン・ダム（ Ｊ、　Ｅ、　Ｇ、　ｖａｎ　Ｄａｍ）、ｘイ・ジェイ・ヴアン・ホウテ（Ａ、　 Ｊ、　ｖａｎ　Ｈｏｕｔｅ）、ジエイ・エムーｚヌ・ウィシーズ（Ｊ、　Ｍ、　 Ｎ、　Ｗｉ　Ｉ　１ｅｒｓ）、ジエイ・ビー・カマ−リング（Ｊ、　Ｐ、　Ｋａ ｍｅｒｌｉｎｇ）及びジエイ・エフ・ジー・ヴライジエントハート（Ｊ、Ｆ、Ｇ 、ＶＩｉｅｇｅｎｔｈａｒｔ）、　１９８３、肺炎双球菌タイプ３に対する半合 成ワクチンの調製、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、　４２：８４２−８４４゜ ［５３１スペイン特許２０１３５３１．１９９０．溶剤希釈微粒子担体の調製方 法、１９９０年３月３０日。 ［５４］　ストロバ町ダヴリュ（Ｓｔｒｏｂｅｒ　Ｗ、）及びエム・シ町スネラ −（Ｍ、Ｃ，５ｎｅｌｌｅｒ）、１９８８、ＩｇＡ　Ｂ細胞分化に伴う細胞及び 分子のイベント、Ｍｏｎｏ、Ａｌｌｅｒｇｙ　２４．　ＩＢＭ−１９０゜［５５ ］　サラターリール・ダヴリュ（Ｓｕｔｔｅｒ　Ｒ，Ｗ、）及びニス・エル・コ チ（Ｓ、Ｌ、Ｃｏｃｈｉ）、１９９２、アメリカ合衆国に於ける百日咳の入院加 療数と死亡率＋９８５−１９８８．国内報告の完全性の評価、ＪＡＶＡ　２６７ ：３８６−３９１゜ （５６１スヴエナーホルム・エイ・エム（ＳｖｅｎｎｅｒｈｏｌＯＩＡ、Ｍ、） 、ディー−Ｘイ・サック（Ｄ、　Ａ、　５ａｃｋ）　、　ジエイ・ホルムグレン （Ｊ、　Ｈｏｌｍｇｒｅｎ）及びビー・ケイ・バーダン（Ｐ、に、Ｂａｒｄｈａ ｎ）、１９８２、コレラＢザブユニット３０５−３０８による免疫感作後の腸の 抗体応答、Ｌａｎｃｅｔ　３０５−３０８゜［５７］　トーマス・エム・ジー（ Ｔｈｏｍａｓ　Ｍ、Ｇ、）、イー・エル・エイ・７　ッ：／　ユ’７−　ス（Ｅ 、　Ｌ、　Ａ、　Ａｓｈｗｏｒｔｈ）、イー・ミラー（１３，Ｍｉｌｌｅｒ）及 びエイチ・ビー・ラムバー）（Ｈ，Ｐ、Ｌａｍｂｅｒｔ）、　１９８９　、百日 咳感染後及び全細胞ワクチンによる免疫感作後の百日咳毒素、繊維状血球凝集素 及び凝集原２．３に対する血清１ｇＧ　、　（ｇＡ　、　ＩｇＭの応答、Ｊ、　 Ｉｎｆｅｃｔ。 ＤｉＳ、　１６０：８３８−８４５゜ ［５８］　ト７シ・ジュニア・ティー・ビー（Ｔｏｍａｓｉ　Ｊｒ、　Ｔ、Ｂ、 ）、１９８３、粘膜表面での免疫制御機構、Ｒｅｖ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、　 ５（ｓｕｐｐｌ）：５７８４−３７９２゜ ［５９１ツァイ・シー・エム（Ｔｓａｉ　Ｃ，Ｍ、）及びシー・イー・フラッシ ュ（Ｃ，Ｅ、Ｆｒａｓｈ）、１９８２、ポリアミドゲル中の多糖類の内のりボ多 糖を検出するだめの敏感な銀染色、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１１９：　１ １５−１１９゜［６０１ヴ７レンタイン・アール・シー（Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ　 Ｒ，Ｃ，）、ビー・エム・シャピロ（Ｂ、　Ｍ、　５ｈａｐｉｒｏ）及びイー・ アール・スタットマン（Ｅ、　Ｒ。 Ｓｔａｄｔｍａｎ）、１９６８、グルタミン合成酵素Ｘ■の調節、大腸菌からの 酵素の電子顕微鏡調査、Ｂｉｏｃｈｅｍ　７：２１４３−２１５２゜［６１１ワ クスマン・ディ（Ｗａｃｈｓｍａｎｎ　Ｄ、）、　ジエイ・ビー・クライン（Ｊ 、Ｐ、　Ｋｌｅｉｎ）、エム・スコシー・（Ｍ、５ｃｈｏｌｌｅｒ）、ジェイ・ オギア−（Ｊ、０ｇ１ｅｒ）、エフ・アッカーマンズ（Ｆ、　Ａｃｋｅｒｍａｎ ｓ）及びアール・エム・フランク（Ｒ，Ｍ、Ｆｒａｎｋ）、１９８６、リポソー ムと会合した連鎖球菌変異体炭水化物タンパク質抱合体により経口的に免疫にし たラットでの血清及び唾液の抗体応答、Ｉｎｆｅｃｔ、　［ｍｏ＋ｕｎ、　５２ ：４０８−４１３゜ｔ６２］　ウォーカー・イー（Ｗａｌｋｅｒ　Ｅ、）　、百 日咳の臨床的観点、書籍エイ・シー・ワードロウ（Ａ、　Ｃ，Ｗａｒｄｌａｗ） 及びアール・バートン（Ｒ。 Ｐａｒｔｏｎ）（編者）　、　Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎ ｉｔｙ　ｉｎ　Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ　（百日咳の病原性と免疫）、出版社Ｊｏｈ ｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ、　Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ　２７３−２８２ 頁。 ［６３１ウォーカー−ｚム・ジエイ（１！ｔａｌｋｅｒ　Ｍ、　Ｊ、　）、’　 ｘム−ｏ−ド（Ｍ。 Ｒｏｈｄｅ）、ケイ・エフ・ティミス（Ｋ、　Ｎ、　Ｔｉｍｍ１ｓ）及びシー・ エイ・グズマン（Ｃ，Ａ、ＧｕｚｍＡｎ）、　１９９２、ネズミチフス菌ａｒｏ Ａ、チフス菌Ｔｙ２１ａ及び組換え体百日咳毒素サブユニットを発現する発病性 大腸菌によるマウスの経口免疫感作後の特異性肺粘膜及び全身性免疫応答、１ｎ ｆｅＣｔ、　Ｉｍｍｕｎ、に寄稿。 ［６４１ウォーカー・エム・ジエイ（Ｗａｌｋｅｒ　Ｍ、Ｊ、）、エム・ロード （Ｍ。 Ｒｏｈｄｅ）、ジェイ・ウェーランド（Ｊ、　Ｗｅｈｌａｎｄ）及びケイ・エフ ・ティミス（Ｋ、Ｎ、Ｔｊｍｍｉｓ）、１９９Ｌ　ｂｖｇ−陰性Ｂｏｒｄｅｔｅ ｌｌａ　ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ中て百日咳毒素を構成的、誘導的に発現 するためのミニトランスポゾンの構築、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　５９ ：４２３８−４２４８゜［６５１ウォーカー・エム・ジエイ（Ｗａｌｋｅｒ　Ｍ 、　Ｊ、　）、ジエイ・ウェーランド（Ｊ、　Ｗｅｈｌａｎｄ）、ケイーｚヌ・ ティミス（Ｋ、Ｎ、　Ｔｉｍｍ１ｓ）、ビー・ラウバッチＣＢ、　Ｒａｕｐａｃ ｈ）及びエム・エイ・シュミットＣＭ、Ａ、　Ｓｃｈｍｉｄｔ）、　１９９１、 百日咳毒素のはっきり規定したエピトープを認識し、チャイニーズハムスター卵 巣に対するその毒素を中和するマウスのモノクロナール抗体のキャラクタリゼー ション、　１ｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、　５９・４２４９−４２５１゜ ［６６１ワードロウ・エイ・シー（Ｗａｒｄｌａｗ　Ａ、　Ｃ，）、　アール− １＜−）ン（Ｒ，Ｐａｒｔｏｎ）及びエム・ジエイ・フッカ−（Ｍ、Ｊ、Ｈｏｏ ｋｅｒ）、　１９７６、百日咳菌の培養変異体中の防御抗原、ヒスタミン感作因 子、及びエンベローブポリペプチドの損失、Ｊ、Ｍｅｃｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ 、　９：８９−１００゜［６７１ウニイス・エイ・エイ（Ｗｅｉｓｓ　Ａ、Ａ、 ）及びイー・エル・ヒユーレット（Ｅ、Ｌ、Ｈｅｗｌｅｔｔ）、１９８６、百日 咳菌の毒性因子、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、４０：６６１−６ ８６゜［６８１ウィンスネス・アール（Ｗｉｎｓｎｅｓ　Ｒ，）、ティ・ロンネ ス（Ｔ、　Ｌｏｎｎｅｓ）、ビー・モグステン（Ｂ、Ｍｏｇｓｔｅｎ）及びビー ・ビー・ベンダル（Ｂ。 Ｐ、Ｂｅｎｄａｌ）、１９８５、白血球増加症促進因子、繊維状血清凝集素リボ 多糖及び百日咳の際に誘発された補体結合抗体に結合するタンノ＜り質に対する 予防接種と病気後の抗体反応、Ｄｅｖｅｌｏｐ、　Ｂｉｏｌ、　５ｔａｎｄａｒ ｄ。 ６１：　３５５−３６５゜ ［６９］　ズイーレイ・ジ−アール（Ｚｅａｌｅｙ　Ｇ、Ｒ，）、ニス・エム・ ルーズモア（Ｓ、　Ｍ、　Ｌｏｏｓｍｏｒｅ）　、アール・ケイ・ヤコブ（Ｒ， Ｋ、　Ｙａｃｏｏｂ）　、ニス・エイ・コツクル（Ｓ、Ａ、Ｃｏｃｋｌｅ）、　 −ｒ−イ・ビー・ノ１−ベルト（Ａ、　Ｂ、　Ｈｅｒｂｅｒｔ）、エル・ディー ・ミラー（Ｌ、Ｄ、Ｍｉｌｌｅｒ）、　エフ・ジエイ・マ・ノカイ（Ｎ、　Ｊ、 λ１ａｃｋａｙ）　及びエム・エイチ・ネイン（Ｍ、Ｈ，Ｎｅ１ｎ）、　１９９ ２、遺伝的に不活性化された百日咳毒素を過剰生産する百日咳菌株の構築、Ａｐ ｐｌ、Ｅｎｖ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　５８＋２０８−２１４゜図３ 小胞　調製品 図４ 図５ 追加免疫感作後の日にち フロントページの続き （７２）発明者　ケイーランド、ユルゲンドイツ連邦共和国　デー−３３００ブ ラウンシュヴアイク、マンエローデル・ヴエーク（７２）発明者　ブラウンリー 、ロバート・エムドイツ連邦共和国　デー−３３００ブラウンシュヴアイク、マ ンエローデル・ヴエーク（７２）発明者　ティミス、ケニース ドイツ連邦共和国　デー−３３００ブラウンシュヴアイク、マンェローデル・ヴ エーク（７２）発明者　ホワイト、ディケイッド・シーアメリカ合衆国　テネシ ー　３７９３２−２５６７、ノックスヴイル、スーツ　３００、リサーチ・ドラ イヴ　１０５１５ （７２）発明者　グツマン、カルロス・エイイタリア国　１６１３２　ジエフア 、１０、ケイアレ・ベネデート　ＸＶ （７２）発明者　ウォーカー、マーク・ジェイオーストラリア国　ノース・サウ ス・ウェスト　２５００、ウーロンゴング、ピー・オー・ボックス　１１４４ （７２）発明者　ファウシテイン、マイケル・ダヴリュドイツ連邦共和国　デー −３３００ブラウンシュヴアイク、マンェローデル・ヴエーク It was detoxified by the method described in [35]. Lyph azome" liposomes are a proprietary form of small multilamellar lipid vesicles containing Bordetella pertussis FHA and PT, which were developed by Faucitin Pharmaceuticals Inc. (Fountain Pharmaceuticals Inc.) American lecithin campa using solvent-diluted particulate carrier technology [53j] It was prepared from purified soy phosphatide from D. and N. P. E. (American Lecithin Company, New York). The composition of the purified lipid mixture is phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, and phosphatidylethanolamine. The ratio of fatidic acid and neutral lipids was approximately 8:1:0.7:0.3. Immunization of mice 5-6 week old female Ba1b/C mice (Charles Liver, M.L., Italy) Charles River, Ml, Italy) was divided into 5 groups. The animals were then immunized by oral administration and placed in separate cages according to the following rules. Group a: liposome-encapsulated FHA; Group b: liposome-encapsulated PT; Group C: liposome-encapsulated FHA and liposome-encapsulated PT; Group d: free FHA; Group e: free PT; Group f: free FHA and PT; control group Immunization using uncoated liposomes. The vaccine was administered with one dose (4 μg) of protein on days 0 and 4, followed by a boost on day 300 with the same dose. Mice were deprived of water for 6 to 8 hours and treated with 50 μl of vaccine diluted in PBS and an equal volume of 3% phosphate buffered calcium bicarbonate (PBS: NaC1s) added to neutralize gastric acidity just before immunization. , o g/j', KCI 2.Og/I!, NaJPO42H*02.Og/l.KH2PO42,Og/l, pH 8,0) solution was gradually given. Ten days after boosting, 100 mice were sacrificed and samples were collected. The arm artery of the sacrificed mouse was cut and exsanguinated, and the collected serum was separated and stored at -20"C. Lung lavage. A cannula was inserted into the trachea, and 2 mM of the protease inhibitor was added to the solution. Slowly dissolve in ice-cold PBS O containing phenylmethanesulfonyl fluoride. Approximately 0.5 ml of lung lavage fluid was collected from each mouse, centrifuged at 10,000 xg for 5 minutes at 4°C to remove debris, and stored at -20°C.Immunological Technique: Monoclonal antibody P12H3 [13] against FHA and a reaction mixture of monoclonal antibodies that react with PT subunit S l (PI9), S4/S5 doublet (E205), and S2 and S3 (P: 251) were analyzed by Western blotting. experiment [51. Free and liposome-encapsulated FHA and PT were electrophoresed. Mixed with working buffer in a 1:1 ratio, the protein was packed in a 3.85% acrylamide concentrating gel and 10% acrylamide concentration gel according to the method of Laemmli [30]. Electrophoresis was performed using a crylamide separation gel. Using semi-dry metastasis cells (BioRad), 25mM Tris, 192mM glycine, 20% methanol (p)I 8.3) was used as the transfer buffer, and 0.3% fat milk in 10% PBS solution (pH 7,4). was used as a blocking agent and the proteins were transferred to a nitrocellulose membrane (Bio-Rad Labs, S, r, 1., Ml, Italy). Bu The first antibodies, namely PI3)13 and PI9. E205. E2 51(7) hybridoma supernatant was diluted 1:20 with PBS and a reaction mixture (pH 7,4) was added and incubated for 2 hours. After washing three times with PBS, horse radish peroxidase-conjugated goat anti-mouse [gG (Southern Biotechnology Associates Inc., Birmingham, AL) diluted 1:500 in PBS was added. , Ala, )) was added and the membrane was incubated for 1 h, and after washing the membrane, color was developed using 4-chloro-1-naphthol as a substrate. Pre-stained molecular weight labels were purchased from Bio-Rad. To measure subclass-specific antibodies against FHA and PT present in serum and lung lavage fluid, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was performed as follows. Nunc Maxisorp [mmuno-module 96-well plate was 0. FHA or diluted with IM NaHCOs was inked with PT (pH 9.6, 60 ng in 50 μl per well, overnight at 4°C). The wells were coated with fetal calf serum (Fe3. Blocking was performed at 37° C. for 2 hours with 100 μl of a 10% PBS solution from Plow Laboratories Inc., [rvine, United Kingdom]. Then play The cells were washed three times with PBS and blood diluted 1=50 with a 10% PBS solution of Fe2. 100 μβ of supernatant sample or lung lavage fluid diluted 1:10 was added to each well. After 60 min at 37°C, plates were washed again and 100 μl of alkaline phosphatase-conjugated goat anti-mouse antibody against [gG, [gM or IgA heavy chain] diluted 1:500 in 10% Fe2 in PBS was added to each well. and incubated at 37°C for 2 hours. Wash the plate again and add substrate solution (p-nitrophenylate). phosphate disodium salt in 10 mg/ml jetanolamine buffer 100 μl of a solution (pH 9, 8) was added to each well to develop color. After 30 minutes at room temperature, 3. Stop the reaction by adding 50 μl of OM NaOH, and add 50 μl of OM NaOH. A4°6 was measured using a Titretek Multiscan MCC microplate reader (Fl.W). All samples were processed at the same time and on the same day, and each blood A sample of serum or each lung lavage fluid was assayed separately, and blanks for ELISA measurements were performed using serum or lung lavage fluid from mice immunized with antigen-free liposomes. Conclusion The results are shown as the average value for each immune group. Standard deviations are for individual mice within each group. This is the variation between samples. Electron microscopy Uncoated, FHA-coated and PT-coated liposomes were examined using a 4% aqueous solution of uranyl acetate (pH 4,5) as described by Valentine et al. [60]. stained negatively by the method. For metal shadowing, liposomes were adsorbed onto freshly prepared collodion over a 300 mesh nickel grid, washed with distilled water, air dried, and unidirectionally metal shadowed with platinum at a 15° angle. Ta. For immunoelectron microscopy, 300 ml of uncoated or antigen-coated liposomes were The collodion was soaked onto freshly prepared collodion over a nickel grid of water and carefully washed with distilled water. After air-drying at room temperature, the grids were treated with protein 11 anti-FHA or PT polyclonal or monoclonal antibodies (IgG 1.25 μg/t). protein mf) for 60 minutes at room temperature. Unbound antibodies were removed from the plastic bottle by gentle spraying of PBS (pH 6,9), protein A total complex (gold particle size 10 nm, Act. 0.01) was added dropwise and the grid was brought to room temperature. Bound antibodies were visualized by electron microscopy. The grids were then washed first with PBS containing 0.01% Tween 20 and then with distilled water. Purified. After air drying, metal shadow the grid with platinum in one direction (15° angle). or without metal shadowing. For control studies, purified protein Samples were processed with only serum or protein A total complex of Les immunizations. The button on the sign For stock embedding, standard Lowieryl K4M resin was used according to the continuous temperature reduction method. Pertussis toxin liposomes were encapsulated by applying the pertussis toxin liposomes protocol as described [64]. The samples were examined using a Zeiss electron microscope EM IOB with an accelerating voltage of 80 kV and a verified magnification. Results of Experimental Part B Measurement of the size of liposomes containing FHA and PT Liposomes coated with FHA and PT The field size was analyzed using the Coulter Counter model N4M PT. The average diameters of blank and Fl(A or PT coated liposomes) were 227 nm (95% ranged from 211 to 243 r+m), 236 nm (95% ranged from 219 to 253 nm) and 244 nm (95% ranged from 219 to 253 nm), respectively. 95% (in the range of 226-262 nm).From this data, encapsulating FHA or PT in liposomes has no effect on the average diameter. It turns out that it has no effect. Western blot analysis of liposomes containing FHA and PT The presence of FHA and PT in the vesicles was determined by Western blot analysis (Figure 8) using P12H3 monoclonal antibody (lane 2.3.4) and hybrid against PT subunit 51-4. Confirmation was made using the reaction mixture of the 100ml supernatant (lane 2°5.6). No difference in FHA content between free PHA and FHA-coated liposomes was observed (Rep. 3.4), there is a clear difference between free PT and PT incorporated into liposomes. A difference was observed (lane 5.6). This is for Sl/S4 and S2/S3 respectively. The difference in binding affinity of the monoclonal antibodies with these specificities is thought to be due to preferential incorporation of Sl and 5415 subunits into ribosomes. No protein was detected in the blank uncoated liposomes (lane 2). Immunoelectron microscopy analysis of liposomes containing FHA and PT Electron microscopy of uncoated, FHA-coated, and PT-coated liposomes revealed that these liposomes were multilamellar vesicles of different sizes (Fig. 9.A, B, C, Figure 3.A). However, FHA-coated and PT-coated liposomes differ in their morphological appearance compared to uncoated liposomes (compare Figures 9A and 87 and Figure 1OA). This is probably due to the incorporation of <FHA, PT into liposomes. FHA-coated liposomes were first incubated with anti-Fl (A polyclonal or monoclonal antibody and then with protein A total complex), and FHA-coated liposomes A strong labeling pattern was generated on the surface of the somes (Fig. 9D and E). Labeling was milder with monoclonal (data not shown). The labeling pattern of PT-coated liposomes upon incubation with polyclonal anti-PT antibodies was much weaker than that of FHA-coated liposomes (compare Figure 9.D with Figure 10.8). Since the labeling intensity was sometimes only slightly stronger than the background labeling, we attempted to show that it could be detected on the PT or liposome membranes by post-embedding labeling. Conventional methods can only detect antigen-reactive sites attached to the outside of liposomes, and cannot detect sites located inside the liposome membrane. won. Figure 10. D is an illustration of a liposome showing labeling around the membrane, with PT outside. This shows that it was incorporated into the side membrane. Only a few gold particles were detected in the verification tests (Figures 9.F and 10.C). Specific antibody responses to Bordetella pertussis FHA and PT in vaccinated mice. Both free FHA and PT and liposomal prototype vaccines encapsulating PT and FHA antigens elicited specific serum and mucosal antibody responses (Figure 10). .11). FHA or PT was administered orally in three equal doses at a total dose of 12 μg. Systemic (mainly IgG) and pulmonary secretory (mainly IgG and IgA) antibody responses were obtained in infected mice (FIGS. 10A and B). Liposo containing FHA Mice immunized with the liposome-based system had antibody titers approximately three times higher than those immunized with the free protein orally. Adjuvant activity of the stem was confirmed in the case of FHA (Figure 10). free and free When PHA and PT encapsulated in posomes were administered simultaneously as a vaccine, anti-PHA antibody responses were not inhibited. The titer of FHA-specific IgM detected in the lung lavage fluid was small (data not shown). Similar results were obtained by immunization with PT (FIGS. 11A and B). As with FHA, co-immunization with both proteins (FHA and PT) gave good anti-PT antibody responses. Discussion of Experimental Part B Current parenteral vaccines against pertussis are more effective in preventing pertussis in the clinic than in preventing infection. It is effective for control. However, when considering a new safe vaccine, it is important to reconsider immunization strategies and recognize that the respiratory trachea is the entry point for pertussis infection, and that effective responses at the mucosal level are possible. It seems appropriate to take into account that vaccines that stimulate responses have the potential to prevent infection. Secretory 1gA and specific 1gG (from serum through capillary Obtained by exudation as a respiratory tract, the main 1g) in the lower respiratory tract can prevent early stage bacterial adhesion and colonization, thereby facilitating eradication of the disease. There is. There are differences in the processing of antigens administered by oral and parenteral routes with respect to antigen specificity and 1 g class properties [2,6,27,58], and [gA responses are This is typical of oral administration of cutin. The specialized M cells that coat Beyer's patches pass antigenic material to the lymphocytes beneath the epithelial cells, where the processed antigen is donated to IgA precursor B cells. These B cells are transported to various mucous membranes via the lymphatic system. It migrates to the membrane where it produces IgA-secreting plasma cells. T lymphocytes are bye In the case of some antigens, mucosal and systemic immune responses or oral administration [23,26,56,61], and by antigen administered by parenteral route. It is more effective and has a longer duration of efficacy than the immune response elicited by the immune system. Orally administered B. pertussis whole cell vaccines are as effective as parenterally administered vaccines [9]. The present inventors recently immunized orally with recombinant aroA mutan of Salmonella spp. showed that there was a specific lung mucosal response to the St subunits of FHA and PT [21,63]. Current research focuses on systemic and mucosal immunity to Bordetella pertussis. We seek to extend these observations by showing that an infectious disease response is obtained after oral immunization with free FHA and PT. Encapsulation of FHA and PT into a liposomal delivery system provides an adjuvant effect and significantly modifies antibody responses. do good Tolerance and systemic suppression by antigen-specific T suppressor cells and absorption problems due to pre-existing levels of specific secretory +gA after oral administration of antigen have been reported. However, these phenomena were not observed in our experiments [6, 58]. It is worth emphasizing that antibody levels in mice immunized with both Fl(A- and PT-coated liposomes) were the same as when immunized with a single antigen. We therefore Our conclusion is that this study can be used to deliver multiple antigens, including the 69 kDa outer membrane protein of Bordetella pertussis, which has recently been shown to be an important protective antigen [39]. Expressing E. coli strain [2o1, PT Overproducing Bordetella 5pp1 strain [64,69] and genetic detoxification of PT methods [44,69] are currently available, and the subunits that form the basis of liposomes are It will be easier to produce non-toxic whole genetic components for knit vaccines in high yields. In fact, both primary and secondary immune responses are enhanced by diphtheria toxin associated with liposomes. Replacement of traditional DTP vaccines in infant vaccine regimes [11] It is anticipated that a multivalent vaccine will emerge that can The mechanisms mediating protection against B. pertussis infection are still unclear. Parenteral immunization and its are not always associated with subsequent humoral and cellular responses [44]. Furthermore, it is believed that cell-mediated immune responses are important in vivo to protect against pertussis disease [7.14]. Because liposomes are known to induce cell-mediated immunity, it is possible that the delivery system used in this study could add to the antibody responses found in the literature. It would also be interesting to see if this induces cell-mediated responses to FHA and PT. Ru. The results reported here are only a starting point. lipid A, aluminum hydroxide, etc. The incorporation of other substances known to have adjuvant activity, such as secretory + gA It appears to have an additional or synergistic effect on liming (43,46). Administration of vitamin A may improve the immune response after oral vaccination [21]. Other issues must also be studied, including the length of time immunity is achieved, optimal vaccination regimens, and post-stimulation protection. The ability of subunit vaccines to elicit immune responses distant from the site of entry The use of liposomes as a delivery system is extremely promising. 100 days by oral route Reduce or eliminate the most likely local side effects associated with cough vaccines and Bunt activity could enhance cell-mediated and humoral immune responses. Liposomes are chemically stable, easy to produce, and biodegradable. Trial in stages and Liposomes were used in this study, but their toxicity was not reported [1, 17]. Furthermore, The inexpensive raw materials used to produce posomes contribute to lower production costs. In all cases, oral administration of vaccines can significantly reduce costs compared to parenteral vaccination, and Key points for vaccination programs in new areas in rural areas where health measures are expensive. It is an int. LI (Titer of antibodies against Bordetella pertussis OMP in the lung lavage fluid of mice immunized by oral and intranasal administration of ThlP-coated vaccine Route of administration After 10 days 2 1 gA IgG Oral 0.10+0.06e0.11+0.05 Intranasal 0 .11 + 0.03 0 .35 + 0.1740 days later 1 No booster 1 With booster [gA IgG IgA IgG Oral nd' nd' 4.6±2.0 6.5±1.1 Intranasal 0.40+0 .18 0 .48+0.35 5.1+1.5 6.6+1.5a: Number of days after first immunization, b=30 days after first immunization, booster immunization, C: standard deviation, d: mouth d=measurement not measured Roasted 2 Mice after oral and intranasal administration of LPS-coated and OMP-coated vesicles. Titer of antibodies against Bordetella pertussis LPS in lung lavage fluid Oral Intranasal IgA IgG [gA IgG LPS-vesicles 0.0 +0.05 '0.37+0.12 0.0 +0.0 5 0.46fO,210MP-Vesicle 0.66+0.51 1.1 +0.3 4 1.6±0.23 1.6±0.14a: Standard deviation References [11 Allison A.C. and G. Gregory Gregoriadis, G., 1974, immunological adjuvants and Bienenstock J. and A.D. Befus, 1980, Mucosal Immunology, 41:2 49-270° [31 Brownlje R, M., J. G. Coote and R. Parton, 1985. Bulow R, J.C. Boothroyd, 1991. Immunization of pso antigens in liposomes. Protection of mice against lethal toxoplasmosis pathogen infection by sensitization. Burnette W, N., 1981, Transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose. Template method 1 Electrophoretic transfer and labeling using antibodies and I-labeled protein A Detection by Geograph, Analyt, Bio-chem, 121:195-203° - Michalek (S, M, Michalek). Nice Jackson (S, Jackso mouth), M.D. Russell (M, W, Ru5sell), Z. Moldoveine (Z, Mo1dove anu), J.R. McGhee and Jie. Mestecky, J., 1987, Peripheral blood aRer anti- IgA antibody-producing cells in ingestion: Evidence for the human common mucosal immune system, Proc, Natl, Acad, Sci, USA. 84・2449-2453゜ [7] DeMagistrisT, M, Romano, S, Nuti, 7-) Lt. Rappuoli, R. and Tagliabue, A., 1988, Dissected human T cell responses to Bordetella sp., J. Exp. Med, 168:1351-1362° [81 (Desiderio J, V,) and Niss G. Campbell (S, G, Campbell), 1985, Liposome Association. If. Immunization of experimental mice against salmonellosis by antigens, 1nfect, [m-mun, 48:658-663°] [91 Falk W., K.H. K., Rosanelli) and A. Kurz, R., 1981, The present and future of oral pertussis vaccination, Fortschr, Med. 99:l363-1366゜ [10j Francis M, J, C, M, Fry, D, 1. Rowlands, x F. Brown, G.L.P. Bittle, J.L., 7-R.A. Houghten and R.A. Lerner, 1985. Immunological briming of foot-and-mouth disease virus with synthetic peptides. , J. Gen. Virol, 66:2347-2354° [11] Fine P. E. M. and J. A. Clarkson, 1982. Pertussis. Recurrence: Regarding evaluation of vaccine efficacy Lancet 1.666-669° [12] Fine P. E. M. and J. A. Clarkson, 1987. Efficacy of pertussis vaccines. Rev, [nfect, Dis, 9:866-883°] [131 Frank D. W. and C. D. Parker, 1984, Pertussis. Isolation and capture of monoclonal antibodies against bacteria Lactalization, J, Biol, 5tand, 12:353-365° [14] Ki7 IJ Gearing A, J, H, C, R, Bird, K. Reedhead, K. and Thomas, M., 1989, Human Cellular Immune Response to Bordetella Pertussis Infection, FBMS, Microbiol, [mmunol, 47+205-212° [151 G. iammanco A,), A. Chiarini, T. - Stroffolini (T, 5 troffolini), D, De IJatia, M, Chiarar nonte, M, E, Mo5chen, Ai Mura (1) , Mura). G. Rigo, S. Taorrnina, T. I. Sarzana (A, 5arzana), G. Mazza and B. Scarpa, 1991, Seroepidemiology of pertussis in Italy, Rev, Infect, Dis, 13:1216-1220° [161 Goodman Y., A.J. Wort) and F.L. Jakra Jackson, F. L. (1981) Enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of pertussis immunoglobulin A in nasopharyngeal secretions as an indicator of recent infection. Luhento Atsusei. J, Cl1n, Microbiol, +3:286-292° [171 Gregor Gregoriadis G., 1990, Immunological Role for dejuvant liposomes, [mmunology Today, 11:89-97° [181 Gregory R,L, -1-S, M, Michalek, G. Richardson, G., Harmon, C., Hilton, T. and Ghee, J.R., 1986. Streptococcus 5ob- in liposomes. Characterization of the immune response to oral administration of Rinus ribosomal preparations, 1nfect, [mmun, 54 nia 80-786° [19] Griffiths E. (1988), Efficacy of whole cell pertussis vaccines, Book [19] Pathogenesis and Immunity in Pertussis J (Editor: A.C.W. Ward Law, A.C. and Parton, R. 35, pp. 3-374, Publisher John Wiley and 5ons Ltd, Guildford, U.K. [201 Guzman C.A., M.J. Walker, M.Rohde and K.F. Timis. , Timmls), 1991, Escherichia coli and Direct expression of Bordetella pertussis filamentous hemagglutinin in Salmonella typhimurium aroA, Infect, Immun, 59:3787-3795° [211 Guzman C.A., R.M.B. Brownie, R.M., Kadurugamuwa, J., Walker, M.J., and Timms, K.F., 1991. A large invasive strain expressing filamentous hemagglutinin of Salmonella typhimurium aroA and Bordetella pertussis. Antibody responses in the lungs of mice after oral immunization with S. enterica strains [nfeCt, Im mun, 59:4391-4397° [221 Howson C.P. and H.K. Fineberg, H.V., 1992, Adverse reactions after pertussis and rubella vaccination: Summary of reports of medical societies, JAMA 267, 392-396° [23] Johansen H. , F. Ho1by (N, Ho1by) and Nis-ni S. Pedersen, 1991. Experimental immunization with P. aeruginosa alginate elicits IgA and [gG antibody responses, APM [S, 99: 1061-1068゜ (241 KahLL, P, R Lelchuk, C, A, 5cott and J, Beesley) ), 1990, BALB/C mice were exposed to skin lesions. Characterization of Leishmania major antigen liposomes that protect against Shi, 7=7 disease 58:3233-3241゜ [25] Kahl L.P., C.A. Scott, R.Lelchuk, No. - Gregoriadis, G. and Liew, F.Y., 1989, Vaccination against cutaneous leishmaniasis in mice using Leishmania major antigen/liposomes, J. Immunol, 142+ 4441-4449゜[26] Kantele A, -1-Ichi Avrilommi and Ai Yoki Jokinen, 1986, Special effects after oral vaccination against Salmonella typhi. Human blood cells secreting heterosexual immunoglobulins, J. Infect. Dis, 153:1126-1131° [27] Kantele A, H, Avrilommi, JM. Kantele, J.M., Rintala, L. and Mekela, P.H., 1991. Human immune response to oral and sterile parenteral Rotyphimurium Ty21a vaccines. Comparison of Answers, Microbial, Pa-thogen, IO:117-126 ゜ [281 Kett K, P, Brandtzaeg, J, Radl and Noei E Haaijman, J.F., 1986, Distribution of different subclasses of gA-producing cells in human lymphoid organs and various secretory tissues. J. Immunol. 136:3631-3635. Kimura A., T. Mountzouros, D. A. Relman, Nis Falkow S. and J.E. L. Cola. Cowell, J.L., 1990, Pertussis filamentous hemagglutinin: Evaluation as a protective antigen and colonization factor in a mouse respiratory infection model, Infect, Immun, 58 near-16° [20] Laemli N.K. Laemmli U, 1970, Dissection of structural proteins during construction of the head of batatteriophage T4, Nature 227:680-685° [311 Larson E, B. , Howlett) and Jagendorf, A., 1986, Artificial reducing agent enhancement of the Lowry method for protein determination, Anal, Biochem, +55:243-248° [321 Mestecky J,) , 1987, Recent strategies for eliciting immune responses during the common mucosal immune system and exocrine secretion, J, Cl1n, [mmunol, 7:265-276° [331 Miller D, L, ), R, Alderslade and E, IJ, Ross, 1982, Pertussis and Pertussis Vaccine: A Debate of Risks and Benefits, Epide miol, Rev, 4+1-24° [ 341 Muller A, S., J. Leeuwenburg and Dinis Pratt, D.S. 1986, Pertussis Epidemiology and Regulation, Bull, WHO, 64:321-331. ゜ [35] Mu-oz J, J, H-Ara H, Arai and R,L, Col, 1981, Mouse protection of pertussis tufted hemagglutinin from Bordetella pertussis, histamine sensitization activity, Infect, Immun, 32: 243-250゜136] Netra Nedrad J, G, X, B, Ljang and M, E, Lamm, 1989, Oral immunization of mice with Seidai virus. Sensitization, Curr, Topic, Microbiol, 146:117-122° [37] Nencioni L, M, Pizza. M. Bugnoll, T. De Magistris, A. Di Tommaso, F. Giovannoni, R. Manette 4- (R. , Manetti), Ai Marnoli ([, Marsili), Matteucci (G), Nucci (D), Nuccieri (R, 01i), Pi 1eri (P), R, Presentini (R, Presentini), -L Le Queira (L, Vi I la), J. G. Kreetenberg (J, G, Kreetenberg), Nis Silvestri (S, ), A. Tagliabue and R. Rapouli, 1990. Usually inactive pertussis toxin Characterization of a new vaccine candidate against pertussis, Infect, [mmun, 58:1308-1315° [381 Neurath A Neurath R, A, S, B Kent' and F Strick, 1984, Liver Location and chemical composition of the immunodominant epitope of the Pre-3 gene code of the influenza B virus. 5science 224:392-394° [391 Novotny P, -r-I.B. Chubb, K. Counley and I.G.C. Charles, G., 1991, Biological and protective properties of the 69 kDa outer membrane protein of Bordetella pertussis: new formulations of acellular pertussis vaccines, J. Infect, Dis, 164:114-122° [401 Olander R,M, A, Muotiala, M, Karvonen, T, Kuronen, and Kei Runeberguniman (T, Kuronen). K., Runeberg-Nyman), 1990, Purified PT and FHA of Bordetella pertussis Tn5 mutants of two different mouse strains and their susceptibility in a murine intranasal infection model. Serum antibody response to dynamic immunization, Microbial, Pathogen, 8: 37-45° [411 Olin P. and Jay Storeasa] J, 5torsaeter, 1989, Efficacy of acellular pertussis vaccine, J, Amer, Med, As5oc, 261:560-562° [421 Peppler M, S, 1984, Two physically and serologically distinct ribopolysaccharides and their phenotypic variants of B. pertussis strains, In feet, [mmun, 43:224-232° [431 P.F. Pierce N.F. and J.B. Satsushi Jr. 1984, Enhancement of mucosal immunogenicity of liposome-associated cholera toxin by lipid A, Rev. Infect. Dis, 6: 563-56 6゜ [441 Podda A, - L, Nencioni, T, M, De Magi stris, A. D. Thomas B.A., Di Tommaso), B.B. P, Bosst+, L. Nuti, P. Pileri, S. Peppoloni. M, Bugnoli, P, Ruggiero, L, Marsili, A, D'Errico, -1-I Tagliabue and R, Rappuol i. 1990, Metabolic humoral and cellular responses in adult volunteers immunized with genetically inactivated pertussis toxin mutant PT-9/129G, J, Exp, Med, 172861-868° [451 Seelem Rhalem A, C, Bourdieu, G, Luffau and P, Perry, 1988, Adult antigen of Nippostrongy lus brasiliensis encapsulated in liposomes. Vaccination of mice by Ann, [nst, Pa5teur/Immunol. +39:157-166゜ [461 Richards R.A., -L.M.D. Hayre, M.D., Hockmeyer, W.T., and Alving, C.R., 1988. Bosomes, Lipid A, and Aluminum Hydroxide. Enhances the immune response to synthetic Malaria borozoite antigens, Infect, Immuno, 56:682-686° [47] Robertson A, L. E. Unsworth, L. A. E. Ashworth, A. Baskerville and L. I. Irons, 1985. Protection against intranasal infection in mice, Develop, Biol, 5tan dard. 6]: 165-172° [481 Robertson A, L.I. Anse (L, 1. Irons) and L.A.E. Unsworth (L.A.E., Ashw. rth), 1985, Pertussis vaccine: current status and future prospects, Vaccine 3:11-22° [491 Russell D.G. , G.) and J. Aleki. Alexander (J, Alexander), +988, reconstitution in liposomes Effective immunization against cutaneous leishmaniasis with sharply defined membrane antigens, J. Immunol, 140: 1'74-1279° [50] Sat. SatoY, J.L. Cowelf, E. Ichi Sato (H, 5ato), D, G, Burstyn (D, G, Burstyn) and C, R, Manclark (C, R, Manclark), 1983, Hemagglutinin from Bordetella pertussis. Separation and Purification, Infect, [mmun, 61:313-320c+[51j Shah in R,D, M, J, Brennan, Z-xM. Z, M, Li), B, D, Meade and C, R, Manclark, +990, Protective capacity and immunity of the 69 kd outer membrane protein of Bordetella pertussis. J. Exp. Med. 171:63-73° [521 Sun. Up H (8 mouthfuls 1ppe)! ), G.E.G. van Dam, A.J. van Houte, J.E.G. van Dam, A.J. van Houte, J.E.G. M, N, Wi Iers), J, P, Kamerling and J, F, G, VIegenhart, 1983, Diplococcus pneumoniae. Half combination for type 3 Preparation of adult vaccines, Infect, Immun, 42:842-844° [531 Spanish Patent 2013531.1990. How to prepare solvent diluted particulate carrier Act, March 30, 1990. [54] Strober W. and M. C. 5neller, 1988, Cellular and molecular events associated with IgA B cell differentiation, Mono, Allergy 24. IBM-190° [55] Sutter R, W. and Nis L. Co. Cochi, S., L., 1992, Pertussis hospitalizations in the United States. Number of patients treated and mortality rate +985-1988. Assessing the Completeness of National Reports, JAVA 267 :386-391° (561 SvennerholOIA, M, D, A, 5ack), J, Holmgren, and BK Verdan (P) , Bardhan), 1982, Intestinal antibody response after immunization with cholera B subunit 305-308, Lancet 305-308° [57] Thomas M.G., E. L.A.7:/U'7-S (E, L, A, Ashworth), E. Miller (13, Miller) and (H.P. Lambert), 1989, 100 Days Serum 1gG, (gA, IgM responses to pertussis toxin, filamentous hemagglutinin and agglutinogen 2.3 after cough infection and immunization with whole-cell vaccines. J, Infect. DiS, 160:838-845° [58] Tomasi Jr., T.B., 1983, Immune control mechanism on the mucosal surface, Rev, Infect, Dis, 5 (suppl): 5784-3792° [591 Tsai・Tsai C.M. and C.E.Flash (C, E, Frash), 1982, Polysaccharide polysaccharide in polyamide gel Sensitive silver stain for detecting sugars, Anal, Biochem, 119: 1 15-119° [601 Valentine R,C, B, M, 5hapiro ) and E. R. Stadtman, 1968, Regulation of glutamine synthetase Wachsmann D, G.B. Klein, M. Scotsy (M, 5choller), J. Ogear (J, 0g1er), F. Ackermans (F, Ackerman) s) and R.M. Frank, 1986, Riposo Oral immunization with streptococcal mutant carbohydrate protein conjugates associated with Serum and saliva antibody responses in infected rats, Infect, [mo+un, 52 :408-413゜t62] Walker E, 100 Clinical Perspectives on Pertussis, Book A.C. Wardlaw and R. Parton (editors), Pathogenesis and Immunity in Pertussis, Publisher John Wiley and 5ons, Chichester pp. 273-282. [631 Walker M. J., M. Rohde, K. N. Timms and C. A. Guzman. C, A, Guzm An), 1992, Specific pulmonary mucosal and systemic immune responses after oral immunization of mice with pathogenic Escherichia coli expressing Salmonella typhimurium aro A, Salmonella typhi Ty21a, and recombinant pertussis toxin subunits. Contributed to 1n feCt, Immun. [641 Walker M, J, M. Rohde, J, Wehland and K, N, Tjmmis, 199L bvg- Construction of a minitransposon for constitutively and inducibly expressing pertussis toxin in Bordetella bronchiseptica, Infect, Immun, 59 :4238-4248゜[651 Walker M, J, Wehland, J, Timms, K, N, Raupach CB, Raupach. ) and M.A. Schmidt CM, A., 1991, Recognizes a well-defined epitope of pertussis toxin and injects it into Chinese hamster eggs. Characterization of a mouse monoclonal antibody that neutralizes its toxin to nests. tion, 1nfect, Immun, 59・4249-4251° [661 Wardlaw A, C, R, Parton and MGA Hooker, M, J , Hooker), 1976, Protective antigen and histamine sensitizer in cultured mutants of Bordetella pertussis. J. Mecl. Microbiol. 9:89-100° [671 Weiss A.A. and E.L. Hewlett, 1986 , 100 days Virulence factors of cough bacteria, Ann, Rev, Microbiol, 40:661-6 86° [681 Winsnes R, T. Ronne Lonnes, T., Mogsten, B. and Bendal, B.P., 1985. Leukocytosis-promoting factor, filamentous serum agglutinin ribopolysaccharide and induced during pertussis. Antibody responses after vaccination and illness against proteins that bind to complement-fixing antibodies, Develop, Biol, 5 standard. 61: 355-365゜ [69] Zealey G, R, Niss M, Loosmore, R, K, Yacoob, Niss. Cockle, A, B, Herbert, Miller, L, D, Miller (N, J, λ1ackay) and M, H, Ne1n, 1992, Construction of a strain of B. pertussis that overproduces genetically inactivated pertussis toxin, Ap pl, Env, Microbiol, 58 + 208 - 214° Figure 3 Vesicle preparation Figure 4 Figure 5 Date after booster immunization Continued from front page (72) Inventor K.Land, Jurgen Federal Republic of Germany Day-3300 Raunschwieg, Mann Eroder Veeck (72) Inventor Brownlee, Robert M. Germany Day-3300 Braunschwieg, Ma. Maneroder Vueig (72) Inventor Timmis, Kennys Federal Republic of Germany Day-3300 Braunschweig, Maneroder Vuejk Ake (72) Inventor White, Decade Sea United States Tennessee - 37932-2567, Knoxville, Suit 300, Research Dra Eve 10515 (72) Inventor Gutsman, Carlos A Italy 16132 Ziehua, 10, Cayale Benedate XV (72) Inventor Walker, Mark Jay Australia North South West 2500, Wollongong, P.O. Box 1144 (72) Inventor Faustein, Michael D'Avreu Germany Day-3300 Braunschwijk, Manneroder Weg.

Claims (9)

【特許請求の範囲】[Claims] １．ワクチンがリボソーム運搬システムから成り或いは反応成分として該運搬シ ステムを含み、該運搬システムが脂質小胞から成り或いはこれを含むようなワク チンに於いて、前記脂質小胞がその外膜に組み込まれた少なくとも１種の粘膜の 病原体抗原を含むことを特徴とする粘膜の病原体に対するワクチン。1. The vaccine consists of a ribosomal delivery system or contains the delivery system as a reactive component. Wagons containing stems, the delivery system of which consists of or includes lipid vesicles. In Chin, the lipid vesicles are incorporated into the outer membrane of at least one mucosal membrane. A vaccine against mucosal pathogens, characterized in that it contains a pathogen antigen. ２．前記粘膜の病原体がボルデレラ属の１種、特にＢ型、百日咳菌、赤痢菌又は 連鎖球菌であることを特徴とする請求の範囲第１項記載のワクチン。2. The mucosal pathogen is one of the genus Borderella, especially type B, Bordetella pertussis, Shigella or The vaccine according to claim 1, which is a streptococcus. ３．前記抗原が百日咳菌の外膜タンパク質（ＯＭＰ）の一つの調製品であること を特徴とする請求の範囲第２項記載のワクチン。3. the antigen is a preparation of the outer membrane protein (OMP) of Bordetella pertussis; The vaccine according to claim 2, characterized in that: ４．前記抗原が百日咳菌の一つのリポ多糖（ＬＰＳ）であることを特徴とする請 求の範囲第２項記載のワクチン。4. The antigen is a lipopolysaccharide (LPS) of Bordetella pertussis. The vaccine according to item 2 of the scope of claim. ５．前記抗原が百日咳菌の繊維状血球凝集素及び／又は百日咳毒素であることを 特徴とする請求の範囲第２項記載のワクチン。5. that the antigen is filamentous hemagglutinin and/or pertussis toxin of Bordetella pertussis; The vaccine according to claim 2, characterized in that: ６．百日咳菌の外膜タンパク質（ＯＭＰ）の一つの調製品と同じく百日咳菌の一 つのリポ多糖（ＬＰＳ）とを抗原として含むことを特徴とする請求の範囲第２項 記載のワクチン。6. One preparation of B. pertussis outer membrane protein (OMP); Claim 2, characterized in that the antigen contains two lipopolysaccharides (LPS). Vaccines listed. ７．脂質小胞による前記ワクチンが大豆をベースにした小さい多重膜リン脂質小 胞であることを特徴とする請求の範囲第１項記載のワクチン。7. The lipid vesicle-based vaccine is based on soybean-based small multilamellar phospholipid molecules. The vaccine according to claim 1, which is a vaccine. ８．前記ワクチンが粘膜を免疫にするための経口投与に、特に腸の通路及び／又 は呼吸の通路、好ましくは呼吸の通路を免疫にするために適用されることを特徴 とする前記請求の範囲のいずれか１項記載のワクチン。8. The vaccine may be administered orally to immunize mucous membranes, especially the intestinal passages and/or characterized in that it is applied to immunize the respiratory passageways, preferably the respiratory passageways. A vaccine according to any one of the preceding claims. ９．溶剤希釈微粒子担体技術により一種又は数種の前記抗原を脂質小胞中に組み 込むことを特徴とする前記請求の範囲のいずれか１項記載のワクチンを調製する 方法。9. One or more of the above antigens can be incorporated into lipid vesicles using solvent-diluted microparticle carrier technology. Preparing a vaccine according to any one of the preceding claims, characterized in that: Method.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002535351A (en) * 1999-01-27 2002-10-22 イデア アクチェンゲゼルシャフト Nasal delivery / immunization with highly compatible carrier
WO2007132790A1 (en) * 2006-05-12 2007-11-22 National University Corporation Hokkaido University Liposome having lipid membrane containing bacterial cell component

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT688206E (en) * 1993-02-26 2000-08-31 Fountain Pharm Inc SYSTEM OF LIBERATION OF VACCINES AND PROLONGED PRESERVATION PRECURSION SOLUTION FOR ENCAPSULATION AT A DISTANCE OF ACTIVE PRINCIPLES
GB9320668D0 (en) * 1993-10-07 1993-11-24 Secr Defence Liposomes containing particulare materials
DE19703437A1 (en) * 1997-01-30 1998-08-06 Luitpold Pharma Gmbh Mixtures of outer membranes and / or cell walls of bacteria for oral immunization against mucosal infections
US6749831B1 (en) 1997-05-16 2004-06-15 Medical Defense Technology, Llc Vaccine against lipopolysaccharide core

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1502774A (en) * 1974-06-25 1978-03-01 Nat Res Dev Immunological preparations
US4199565A (en) * 1979-03-26 1980-04-22 Merck & Co., Inc. Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit
CA1340241C (en) * 1988-06-08 1998-12-15 Fountain Pharmaceuticals, Inc. Method for marking solvent dilution microcarriers
NZ230424A (en) * 1988-08-25 1992-05-26 Liposome Co Inc Liposomal composition comprising an externally disposed antigen
WO1990001947A1 (en) * 1988-08-25 1990-03-08 The Liposome Company, Inc. Affinity associated vaccine
NL9000207A (en) * 1990-01-29 1991-08-16 Duphar Int Res
US7532327B2 (en) * 2004-09-17 2009-05-12 Jmar Research, Inc. Systems and methods for detecting scattered light from a particle using illumination incident at an angle

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002535351A (en) * 1999-01-27 2002-10-22 イデア アクチェンゲゼルシャフト Nasal delivery / immunization with highly compatible carrier
WO2007132790A1 (en) * 2006-05-12 2007-11-22 National University Corporation Hokkaido University Liposome having lipid membrane containing bacterial cell component
JPWO2007132790A1 (en) * 2006-05-12 2009-09-24 国立大学法人 北海道大学 Liposomes with lipid membranes containing bacterial cell components

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