JPH06507313A - Method and apparatus for immobilized enzyme reactions - Google Patents

Method and apparatus for immobilized enzyme reactions

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JPH06507313A
JPH06507313A JP4511388A JP51138892A JPH06507313A JP H06507313 A JPH06507313 A JP H06507313A JP 4511388 A JP4511388 A JP 4511388A JP 51138892 A JP51138892 A JP 51138892A JP H06507313 A JPH06507313 A JP H06507313A
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アフェヤン，ナウバー　ビー．
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パーセプティブ　バイオシステムズ　インコーポレイテッド
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 固定化酵素反応のための方法および装置光里勿分団 本発明は一般的には、酵素反応を行うための方法と装置に関する。特に、本発明 は、潅流性マトリックス上に固定化した酵素を用いて、高い生産性の酵素反応を 行うための方法と装置に関する。[Detailed description of the invention] Methods and apparatus for immobilized enzyme reactions Hikari Nado Branch The present invention generally relates to methods and apparatus for performing enzymatic reactions. In particular, the present invention performs highly productive enzymatic reactions using enzymes immobilized on perfusable matrices. It relates to a method and apparatus for performing the same.

光尻ｑ宵量 固定化酵素技術において、技術は、固定化酵素の用途および開発以上に、重要性 が増大しているとして位置づけられている。Hikarijiriq evening amount In immobilized enzyme technology, technology is more important than the application and development of immobilized enzymes. is positioned as increasing.

酵素の固定化は、高い特異性と感受性を有する反応システムを提供し、そして通 常、酵素の安定性を増加させる。それにより、広い応用性を持った、有用な多方 面の道具として酵素を使用することができる。固定化酵素リアクター（ＩＭＥＲ ）は、医学上の臨床分析や治療目的のための使用と同様に、化学、薬学、食品、 生物治療などの産業上の利用分析を含む多数の生産工程に採用されている。Immobilization of enzymes provides a reaction system with high specificity and sensitivity, and Usually increases enzyme stability. This makes it useful in many ways with wide applicability. Enzymes can be used as surface tools. Immobilized enzyme reactor (IMER) ) is used in chemistry, pharmacy, food, as well as use for medical clinical analysis and therapeutic purposes. It has been adopted in numerous production processes, including analysis for industrial applications such as biological therapy.

近年、技術上から酵素リアクターのいくつかの限界が上げられている。これらの 主なものとして、酵素固定化の一般的な方法をあげることができ、この方法はＩ ＭＥＨの容量、コスト、スピードに影響を与えている。In recent years, several technical limits have been raised for enzyme reactors. these The main method is the general method of enzyme immobilization, and this method is impacting MEH capacity, cost, and speed.

固定化酵素技術として公知の種々の方法があるが、もっとも一般的なものであり 、ＩＭＥＲ技術として多方面で有用な方法としては、マトリックス結合酵素の利 用があげられる。固定化酵素システムに使用する支持マトリックスの性質は、固 定化酵素の機能にとって重要である。たとえば、連続流下型リアクターでは、弱 い構造安定性しか持たない素材では、使用することができない、さらに、通常大 きな表面積／容積比を持つものが必要とされている。理想的な支持マトリックス は、目的物の結合を促進させ、生産の抑制を減少させ、必要とする値に見かけ上 の至適ｐＨをシフトさせ、酵素の安定性を増加させ、微生物の増殖を抑制するも のである。生産コストと操作の容易さも、さらに考慮されるべき点である。There are various methods known as immobilized enzyme technology, but the most common one is , a method useful in many fields as IMER technology is the use of matrix-bound enzymes. I have something to do. The nature of the support matrix used in immobilized enzyme systems is It is important for the function of catabolic enzymes. For example, in continuous flow reactors, Materials with limited structural stability cannot be used, and are typically A material with a large surface area/volume ratio is needed. ideal support matrix promotes target binding, reduces production inhibition, and increases the apparent value to the required value. It also shifts the optimum pH of the enzyme, increases the stability of enzymes, and suppresses the growth of microorganisms. It is. Production costs and ease of operation are additional considerations.

代表的な例として、液体クロマトグラフィーで有用な支持マトリックスを上げる 。特に有用なマトリックスは、必要な高い表面積／容積比を持つ多孔性粒子から なっている。さらに、液体クロマトグラフィー用の伝統的な素材は、その立体的 、科学的、および機械的特性に基づいた操作上の制約により特徴づけられている ０例えば、軟質性多孔性粒子は、容易に潰れてしまうために、５Ｑｐｓｉを超え る圧力をかける目的には使用することができない、この事実は、このようなマト リックス素材に固定化した酵素の中を、基質溶液の通過を行わせ、効果的な酵素 反応を起こさせるには制約があることを予想させる。A typical example is a support matrix useful in liquid chromatography. . Particularly useful matrices are made of porous particles with the required high surface area/volume ratio. It has become. Furthermore, traditional materials for liquid chromatography are characterized by their three-dimensional characterized by operational constraints based on , scientific, and mechanical properties. 0 For example, soft porous particles can be easily crushed and This fact indicates that such matrices cannot be used to apply pressure. The substrate solution is passed through the enzyme immobilized on the RIX material, and the enzyme is effectively Make it predictable that there are constraints to triggering a reaction.

高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）では、１００μｍ程度の直径を有する 軟質、粒子状、ゲル状の素材を使用する代わりに、より小型で直径１０−２０μ ｍ程度の、固い、多孔性の、実質的に均質なビーズを使用している。そしてこれ らの素材は、スチレンジビニールヘンゼンのような固いポリマーか、あるいはシ リカゲルのような無機質の素材から作られている。In high performance liquid chromatography (HPLC), it has a diameter of about 100 μm. Instead of using soft, particulate or gel-like materials, smaller size 10-20μ diameter hard, porous, substantially homogeneous beads of the order of m. and this These materials can be hard polymers such as styrene divinyl henzhen, or silicone. It is made from an inorganic material like licagel.

このような小さなビーズを高密度に充填すると液体を流すために高い抵抗力が発 生するため、装置は速やかに液体を移動させるために、高い圧力で操作できるよ うにデザインされている。When these small beads are densely packed, a high resistance force is generated to allow liquid to flow. The device must be able to operate at high pressures to move liquid quickly. It is designed like a sea urchin.

さらに悪いことには、低分子量の溶媒以外の溶媒の流下速度は、従来のＨＰＬＣ マトリックスでは制限されており、−次的には、対流性である粒子の間の大量移 送と比較した場合、このためＨＰＬＣ担体の穴の大きさの範囲での大量移送は、 拡散性となっている。従って、対流性の移送が抑制される部分での孔に存在する 酵素に対して酵素の基質が拡散するための時間が必要である。そして生産物が拡 散して戻るためには、その時間が反応比率の制限因子となっている。確実な至適 流速以上では、未反応基質の通過させることのみにしか、流速の増加は使われな い。更に、孔中でのこれらの拡散の制限は、基質と最終産物の有意な阻害をもた らす、この阻害に打ち勝つためには、技術としての酵素リアクターには、どのよ うな時間条件であっても酵素部位に供給される基質濃度を制限するために、しば しば「ストップ−フロー」プロトコールおよび／または複合順列基質注入（マル チプル　シーケンシャル　サブストレート　インジェクション）が採用されてい る。これらのプロトコールによって阻害作用を制限することができる場合でも、 非常に時間がかかり、分析の場合には望まないようなエラーが発生する。ｉ定し た流下速度は、担体の表面に負荷することのできる酵素と共に、速度を基本的に は制限している。一般には、この工程のみでは、完了までにに数時間から数日が 必要である。To make matters worse, the flow rate of solvents other than low molecular weight solvents is Mass transfer between particles is restricted in the matrix and, in turn, convective. Therefore, bulk transfer in the range of hole sizes in HPLC supports is It is diffusible. Therefore, the presence of pores in areas where convective transport is suppressed Time is required for the enzyme's substrate to diffuse into the enzyme. and the products are expanded The time it takes to disperse and return is the limiting factor for the reaction rate. guaranteed optimum Above the flow rate, increases in flow rate are only used to pass unreacted substrate. stomach. Furthermore, these diffusion restrictions in the pores resulted in significant inhibition of substrates and final products. However, in order to overcome this inhibition, what kind of technology is required for the enzyme reactor? To limit the concentration of substrate delivered to the enzyme site even under Often “stop-flow” protocols and/or multiple permuted substrate injections (multiple Triple sequential substrate injection) is adopted. Ru. Even if these protocols can limit inhibitory effects, It is very time consuming and introduces errors that are undesirable in the case of analysis. i set The flow rate, along with the enzyme that can be loaded onto the surface of the carrier, essentially determines the rate. is restricted. Generally, this step alone takes several hours to several days to complete. is necessary.

この拡散阻害作用を減少させるための方策としては、多孔性粒子の外に面した表 面上にのみに酵素を負荷するための方法開発してきた。これは、酵素負荷の時間 枠を減少させることができるが、結局システムの処理能力を制限することになる 。さらにまた、担体粒子の大きさは、処理能力の向上には寄与するかもしれない が、通常は、担体粒子のより長い拡散経路をもたらすにすぎない。においで、固 定化酵素の、溶媒の拡散流下速度への依存性を減少させるかもしくは取り除くこ とは、それらの生産性を増加させる。As a measure to reduce this diffusion inhibition effect, the outer surface of porous particles We have developed a method for loading enzymes only on surfaces. This is the time of enzyme loading You can reduce the number of slots, but this will ultimately limit the system's processing power. . Furthermore, the size of carrier particles may contribute to improved throughput. However, it usually only provides a longer diffusion path for the carrier particles. smell, solid reducing or eliminating the dependence of the analysing enzyme on the rate of diffusive flux of the solvent. and increase their productivity.

それゆえに、速やかに負荷することができ、事実上拡散抑制のない固定化酵素を 提供することが、本発明の目的である。さらに、基質と生産物の阻害が制限され ている固定化酵素反応のための方法と装置を提供することが、本発明の別の目的 である。Therefore, it is possible to use immobilized enzymes that can be loaded quickly and have virtually no diffusion inhibition. It is an object of the present invention to provide. Additionally, substrate and product inhibition is limited. It is another object of the present invention to provide a method and apparatus for immobilized enzyme reactions that It is.

受入れ可能でかつ実施するための作用効果が十分である固定化酵素反応を行うた めの方法と装置を提供することが、本発明のさらなる目的である。To perform an immobilized enzyme reaction that is acceptable and effective enough to perform. It is a further object of the present invention to provide a method and apparatus for.

発凱二！ｈ 本発明は、酵素固定化の可能な潅流性マトリックスと酵素反応に使用するための マトリックスの用途に関する。潅流性のマトリックスは、従来入手できるものと 同じ平均直径を有している粒子状態であり、強固性、多孔質性、高表面積性素材 からなっている。潅流性マトリックスの立体構造は、対流性の液体の移送が、粒 子の中、および粒子の間のいずれでも可能なように形成されている。潅流性のマ トリックスで１０−２０μｍの直径の粒子は、相対的には巨大な直径（６０００ −８０００人）の貫通孔を有しており、貫通孔には小さな径（５００−１５００ 人）の閉鎖した分岐孔があり、内部は表面と高度な網目状態を呈している。Hatsukaiji! h The present invention provides a perfusible matrix capable of immobilizing enzymes and a matrix for use in enzyme reactions. Concerning the uses of matrices. Perfusable matrices are conventionally available and A solid, porous, high surface area material that is in the form of particles with the same average diameter. It consists of The tertiary structure of the perfusible matrix allows convective liquid transport to It can be formed both inside the child and between the particles. perfusion Particles with a diameter of 10-20 μm in Trix have a relatively large diameter (6000 μm). -8,000 people), and the through holes have small diameters (500-1,500 people). There are closed branch pores (humans), and the interior is highly meshed with the surface.

潅流性マトリックスは、接触する液体の流下流速での、粒子内の対流性の流下を 決定づけることによって、粒子内の貫通孔に対する、粒子間の流下経路の平均直 径の相対的に小さなものの比率によって特徴づけられる。得られた網目構造は、 粒子中の拡散経路の長さを限定しており、そのため粒子の孔での大量移送は、高 速流下比率を超えた大範囲の拡散よりむしろ対流によって制御されている。潅流 マトリックスは、充填された粒子から構成されており、粒子の直径は充填したヘ ッドの粒子間空隙の平均直径から決定される。好ましい実施例においては、粒子 的貫通孔の平均直径に対する平均粒子直径の比率は、７０以下であり、特に好ま しくは５０以下である。好ましい分岐孔の直径は約３００−７００人である。さ らに低い比率では（そして相当するような大きな粒子内孔のサイズ）は粒子の孔 の作用を実際的に減少させる０粒子間と粒子内の孔を通過する対流性の流下速度 の好ましい比率は、１０：１から１００：１の間である。A perfusible matrix allows convective flow within the particles at the flow velocity of the contacting liquid. By determining the average directness of the flow paths between particles with respect to the through holes in the particles. It is characterized by the proportion of relatively small diameters. The obtained network structure is The length of the diffusion path in the particles is limited, so the bulk transport through the particle pores is highly The rapid flow rate is controlled by convection rather than by large-scale diffusion. perfusion The matrix is made up of filled particles, and the diameter of the particles is It is determined from the average diameter of the interparticle voids in the pad. In a preferred embodiment, particles The ratio of the average particle diameter to the average diameter of the target through-holes is particularly preferably 70 or less. or less than 50. The preferred branch hole diameter is about 300-700 mm. difference At even lower ratios (and correspondingly large intraparticle pore sizes), the pore size of the particles The convective flow velocity through interparticle and intraparticle pores practically reduces the effect of The preferred ratio of is between 10:1 and 100:1.

固定化酵素を含む潅流性マトリックスにおいて、移動相の速度は、例えば、酵素 結合能を失うか、または基質変換作用を失うかした場合以外、従来型のＨＰＬＣ システムの１０−１００倍以上に上げることができる。典型的な場合には、１０ ００ｃｍ／　ｈ　ｒ以上の移動相の流速を達成することができる。さらに、シス テムが非潅流モードで操作されていたとしても、潅流性マトリックスで特徴づけ られている有意な抑制された拡散性通過経路は、基質あるいは生産物の阻害を、 明らかに促進する。クロマトグラフィーの文脈上、潅流マトリックスの素材の記 載は、米国特許出願番号３７６．８８５（１９８９年７月６日出ｔｉｌｌ）現在 米国特許番号　、およびＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　８：２０３−２０６　 （１９９０）に明示されている。この開示は、引用とともに、本発明と一体とな っている。潅流マトリックスの素材は、米国マサチューセ゛ン州ケンフ゛リッジ のＰｒｅＳｅｐｔｉｖｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、　Ｉｎｃ、から購入可能である 。In perfusible matrices containing immobilized enzymes, the velocity of the mobile phase is e.g. Conventional HPLC unless it loses binding ability or loses substrate conversion ability The system can be increased by 10-100 times or more. In a typical case, 10 Mobile phase flow rates of 00 cm/hr or more can be achieved. Furthermore, the system Characterize with perfusability matrix even if the system is operated in non-perfusion mode Significantly inhibited diffusive passages that inhibit inhibition of substrate or product Obviously promote. In the context of chromatography, it is important to note the material of the perfusion matrix. As of U.S. Patent Application No. 376.885 (until July 6, 1989) US Patent Number, and Bio/Technology 8:203-206 (1990). This disclosure, together with the citation, is incorporated herein by reference. ing. The material for the perfusion matrix was manufactured by Kempf Ridge, Massachusetts, USA. Available from PreSeptive Biosystem, Inc. .

一つの実例において、本発明は、固定化酵素からなる、貫通孔の内部表面部分と 相互に作用する基質と、貫通孔で特定される複数の種類の粒子を充填して作成し た潅流性マトリックスを使用する、酵素的反応を持続するための方法である。酵 素基質の溶液は、貫通孔を通過する基質の拡散比率以上に大きな比率で貫通孔を 対流性の液を流下させるに充分な速度で、マトリ・ノクスを通過させる。In one embodiment, the present invention provides an internal surface portion of a through-hole comprising an immobilized enzyme. Created by interacting substrates and filled with multiple types of particles identified in the through-holes. A method for sustaining enzymatic reactions using a perfusible matrix. fermentation The solution of the elementary substrate passes through the through-hole at a rate greater than the diffusion rate of the substrate passing through the through-hole. The matri nox is passed at a velocity sufficient to cause the convective liquid to flow down.

別の実例として、マトリックスは、第一の貫通孔のセ・ノドの構成は第二の貫通 孔のセットの構成より大きな平均直径を有しているような、相互に連結している 第一と第二の貫通孔のセ・ントを特定して提供される。酵素はそれ自体公知かあ るいは新規な方法である化学的操作を使用して、第二の貫通孔のセント同士相互 に連通している表面部分を含んでいるマトリックスの全表面に固定化する。酵素 基質の溶液は、両方の貫通孔のセ・ノドを通過して対流性流下を引き起こし、さ らに、第二のセット中の基質の拡散速度より大きな速度で、第二の貫通孔のセフ ）を通過して対流性流下を引き起こすために充分な速度で、マトリックスを通過 させる。As another illustration, the matrix may be configured such that the configuration of the first through hole is different from that of the second through hole. interconnected such that the set of pores has a larger average diameter than the configuration The centers of the first and second through holes are identified and provided. Is the enzyme itself known? Or, using a novel method of chemical manipulation, the cents of the second through-hole are interconnected. The entire surface of the matrix is immobilized, including the surface portion that is in communication with the matrix. enzyme The substrate solution passes through the center of both through-holes, causing convective flow and Additionally, the safety of the second through-hole is increased at a rate greater than the rate of diffusion of the substrate in the second set. ) through the matrix with sufficient velocity to cause convective flow let

その他の実例において、本発明は、第一と第二の貫通孔のセントを通過して対流 性の流下を起こさせるために構築されてＩ、ｚる、第一と第二の貫通孔のセント を相互に連結したことにより特定されるマトリックスを利用した、酵素的反応を 持続するための方法を提供するものである。どちらの貫通孔セントも、酵素溶液 と酵素を用いる反応性のある酵素基質溶液をチャネリングさせて通過させるため に、貫通孔の複数から構成されている。In other embodiments, the present invention provides for convective flow through the first and second through-holes. I, z, the first and second through holes are constructed to cause the sexual flow to occur. An enzymatic reaction using a matrix specified by interconnecting It provides a way to sustain. Both through-holes contain enzyme solution. To channel and pass a reactive enzyme substrate solution using an enzyme and It is composed of a plurality of through holes.

マトリックスは、さらにまた、酵素の固定化が可能な相互反応性を有する表面部 分を含んでいる。そしてこの領域は第二の孔のセットの構成を持つ液体の伝達中 に存在する。The matrix furthermore has an interreactive surface area on which enzymes can be immobilized. Contains minutes. And this area is in the liquid transmission with the configuration of the second set of holes exists in

好ましくは、酵素は、酵素を含有する溶液をマド肝ノクス中を通過させることに よって、マトリックスの表面に固定化する。Preferably, the enzyme comprises passing the enzyme-containing solution through a mud liver. Therefore, it is immobilized on the surface of the matrix.

本発明の好ましい態様においては、液体の混合物は、第二のセットを通過させる 速度と、第二の孔のセ・ノド中の酵素の拡散流下速度より、第二の孔を通過する 対流性液体流下速度より第一のセットを通過させる速度を早めたような、両方の 孔のセットを通過させて対流性流下起こさせるために充分な速度で、マトリック スを通過させる。第二の孔のセットのメンバーの立体構造と、相互作用表面領域 は、溶質が拡散する時間と相互反応領域から拡散させるための時間は、溶質が領 域を対流的に通過して行く時間より短いか同じであるような速度で、第二の孔の セントのメンバーを通過しながら流下させる。In a preferred embodiment of the invention, the liquid mixture is passed through a second set of According to the speed and diffusion flow rate of the enzyme in the second pore, it passes through the second pore. Both convective liquids flow faster than the first set. the matrix at a velocity sufficient to cause convective flow through the set of holes. pass through. Conformation of members of the second pore set and interacting surface area The time for the solute to diffuse and the time for the solute to diffuse out of the interaction region are of the second hole at a speed that is less than or equal to the time it takes to convectively pass through the area. Let it flow down as it passes through the members of St.

酵素基質と固定化酵素の間の反応を起こすためには、その場合基質溶液は、固定 化酵素によって基質の触媒反応を起こさせるに充分な液体流下比率で、マトリッ クスを通過させる。好ましい態様としては、この溶液の流下比率は、両方の孔の セントを通過させて対流性の液体流下を起こさせるに充分なものである。このこ とは、動力学的に非常に好ましい条件下で、酵素反応を進めることを特徴とする 特異的な立体構造と、流下速度は、以下に、より詳細に説明する。In order to cause a reaction between an enzyme substrate and an immobilized enzyme, the substrate solution must then be The matrix is heated at a liquid flow rate sufficient to cause catalysis of the substrate by the catalytic enzyme. Let the gas pass through. In a preferred embodiment, the flow rate of this solution is sufficient to cause convective liquid flow to pass through the cent. this child is characterized by proceeding with an enzymatic reaction under very kinetically favorable conditions. The specific conformation and flow rate will be explained in more detail below.

さらに、その他の５！！様において、本発明は、マトリックス中の連ｌｆｔ　’ ６Ｍ域での、一連の酵素反応を進行させるための方法を提供する。この方法では 、それぞれの酵素は、潅流溶液の流下速度と、マトリックス上の結合可能部位全 てが飽和されるためには不十分な濃度で負荷される。さらに酵素は、酵素反応に 使用するために負荷される。潅流流下速度は、流下部の全ての結合可能部位に酵 素を結合させるようにしているために、最初に結合させる酵素が、その最初の接 触で、固定化酵素と別個の領域を形成している、結合可能部位を飽和してしまう 。続いて負荷される第二の酵素は、飽和された結合部位の、固定化した最初の酵 素を含む、この領域を流下して通過していく、そして続いて最初の結合可能部位 の下に結合してゆく、固定化した第二の酵素から構成される第二の別個の領域を 形成する。同様にして、追加された酵素は、これらの第一と第二の領域を通過し て、カラムの更に下部の結合可能領域にその位置を占めてゆく、この複数の操作 で、異なる酵素が充分に結合した別個の領域ができる。この方法は、与えられた 基質に異なる酵素反応が必要とされる場合、特に有用である０例えば、ＩＭＥＲ は、天然に認められる酵素複合体の作用を代換させることを可能とする。さらに また、複数の異なる反応が対象の物質を得るために必要とすることがある。この 場合には第一の酵素と基質の反応により形成される物質は、続く領域での固定化 酵素による反応の基質となる。好ましいＢ様では、本システムの、すべての反応 の至通勤力学は、一つの当てられた流下比率によって達成することができる。In addition, 5 others! ! In this case, the present invention provides a method for linking lft' in a matrix. A method for proceeding with a series of enzymatic reactions in the 6M range is provided. in this way , each enzyme depends on the flow rate of the perfusion solution and the total number of possible binding sites on the matrix. is loaded at an insufficient concentration to saturate it. Furthermore, enzymes are used in enzymatic reactions. Loaded for use. The rate of perfusion flow is determined by the rate at which all possible binding sites in the flow Because the enzyme is designed to bind elements together, the enzyme that binds them first contact saturates the possible binding sites that form a separate region with the immobilized enzyme. . The second enzyme that is subsequently loaded is the first immobilized enzyme with saturated binding sites. flowing down through this region, and subsequently the first possible binding site. a second separate region consisting of an immobilized second enzyme that binds to the Form. Similarly, the added enzyme passes through these first and second regions. This multiple operation takes up its position in the joinable area further down the column. This creates distinct regions where different enzymes are fully bound. This method uses the given For example, IMER is particularly useful when the substrate requires a different enzymatic reaction. makes it possible to replace the action of naturally occurring enzyme complexes. moreover Also, several different reactions may be required to obtain the substance of interest. this In some cases, the substance formed by the reaction of the first enzyme and substrate is immobilized in the subsequent region. Serves as a substrate for enzyme reactions. In the preferred case B, all reactions of this system The best commuting dynamics of can be achieved by one applied downflow ratio.

さらにまた、複数の酵素系は、異なる基質の触媒反応を行わせるために使用でき る６本方法のとくに好ましい有用な応用は、臨床分析において、体液サンプルの 異なる成分の存在及び／または濃度を分析することである。この場合には、異な った酵素を、別々の領域に隔離しておく必要はない。Furthermore, multiple enzyme systems can be used to catalyze different substrates. A particularly preferred and useful application of the six methods is in clinical analysis of body fluid samples. Analyzing the presence and/or concentration of different components. In this case, different There is no need to isolate the enzymes that are used in different regions.

さらにまた他の応用では、本発明は、第一と第二の貫通孔のセットであって、こ のセットは酵素溶液または酵素基質をマトリックスを通過させるようにチャネリ ングさせている、複数の孔から構成されているそれぞれの孔セットであり、これ を通過する対流性の液体の流下を行わせるような立体構造をとっている、第一と 第二の穴のセントが相互に連結しあっていることで特定される、強固なマトリッ クスを含む新規な酵素リアクターを提供する。さらにマトリックスは、固定化酵 素からなる表面領域と第二の貫通孔のセントの構成を持つ液体の連結で特定され る。第一と第二の貫通孔のセットを構成する関連した立体構造と表面領域は、固 定されており、そのため、あらかしめ選択された速度で、溶液がマトリックスを 通過すると、どちらの孔セットを通過する液体にも対流が発生する。その結果と して、たとえ拡散が必要であったとしても、本システムでは、高速の流下速度以 外では「拡散範囲」は存在しない。In yet another application, the invention provides a set of first and second through holes, A set of channels that allow the enzyme solution or enzyme substrate to pass through the matrix. Each hole set is made up of multiple holes that are The first and A solid matrix identified by the interconnected cents in the second hole. The present invention provides a novel enzyme reactor containing a coax. In addition, the matrix Identified in the liquid connection with a surface area consisting of an elemental element and a configuration of a second through-hole cent. Ru. The associated conformations and surface areas that make up the first and second through-hole sets are rigid. is determined so that the solution passes through the matrix at a pre-selected rate. Upon passage, convection will occur in the liquid passing through either set of holes. The result and Therefore, even if diffusion is necessary, this system does not allow There is no "diffusion range" outside.

本発明の装置の一つの実施態様では、複数の異なった酵素をマトリックス表面に 固定化している。さらに異なる酵素は、連続した領域のマトリックス上に固定化 することができる。In one embodiment of the device of the invention, a plurality of different enzymes are applied to the surface of the matrix. It is fixed. Further different enzymes are immobilized on the matrix in contiguous areas can do.

本発明のその他の実施態様においては、強固なマトリックスは、第一の貫通孔セ ントに続いている隙間容積を特定する、複数の中間面の粒子から構成されている 。それぞれの粒子の一つづつは、貫通孔の多様性を特定している。この貫通孔は 第二の孔に続き、酵素学的に活性な表面領域が分布している貫通孔であり、液体 の伝達中にあって封鎖されている孔の多様性を有している。好ましくは、貫通孔 、分岐孔、相互連結孔は異方性である。さらに好ましい粒子は、５０μｍ以上の 平均直径であり、特に好ましくは１００μｍ以上の平均直径であり、７０以下の 平均直径比率の粒子的貫通孔を有している。好ましい粒子の幾何学構造は、ボロ ンと呼ぶ相互粘着性の小粒子を作り上げている小さな、類似の固まりを接着させ たクラスターからなっている。本粒子の製造に適した素材は、ポリスチレン　ジ ビニルベンゼンの共重合体である。このような粒子は、米国マサチューセッツ州 ケンブリッジ所在のＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ、か ら市販されている。In other embodiments of the invention, the rigid matrix comprises a first through hole section. consists of multiple interplane particles that identify interstitial volumes that follow the . Each particle specifies a variety of through-holes. This through hole The second pore is followed by a through pore in which the enzymatically active surface area is distributed and the liquid It has a variety of pores that are blocked during transmission. Preferably a through hole , branched pores, and interconnected pores are anisotropic. More preferable particles have a particle diameter of 50 μm or more. The average diameter is particularly preferably 100 μm or more, and 70 μm or less. It has particulate through holes with an average diameter ratio. The preferred particle geometry is boron small, similar clumps that stick together to form small, mutually adhesive particles called particles. It consists of clusters. The material suitable for manufacturing this particle is polystyrene. It is a copolymer of vinylbenzene. Such particles are found in Massachusetts, USA. PerSeptive Biosystems, Inc., Cambridge It is commercially available.

本発明のこれらの利用およびその他の利用は、同様に引用されている特徴につい て、それぞれの見解を通して、同様な部分を引用している、以下の付属の図面と 共に詳細な説明を参照することによりさらによく理解されるものである。These and other uses of the invention are similar to the cited features. The accompanying drawings and drawings below, which cite similar parts, through each view. Both may be better understood by reference to the detailed description.

２迎ＪＬＩμ０１肌 図１は、本発明の明示するところに従って、固定化酵素を含む対流性マトリック スを形成するに場合に使用する好ましい粒子の模式図を示す。2 Ying JLIμ01 skin FIG. 1 shows a convective matrix containing immobilized enzyme according to the teachings of the present invention. FIG.

図２は、本発明の実施態様である装置の模式図を示す。FIG. 2 shows a schematic diagram of an apparatus that is an embodiment of the invention.

図３Ａは種々の反応条件下で行われる潅流性固定化酵素反応をグラフ化した図面 である。Figure 3A is a graph of perfusate immobilized enzyme reactions carried out under various reaction conditions. It is.

■員星脱皿 本発明の酵素リアクターのマトリックスは、幾何学構造により特徴付けられてい る。この幾何学構造は、その多孔性に関して、双形態性あるいは複形態性であり 、酵素の固定化を可能ととする相互反応領域を有している。マトリックスは、大 きな直径の孔のセットで特定され、このような孔は、粒子の床の間に生しる間隙 によって特定され、粒子は圧力勾配と床を通過する液体の流下速度を決定してお り、さらにより小さな直径の孔のセントが存在する（すなわち異方性貫通孔）、 より小さな孔は、それぞれの粒子に広がっている。上記境界レベルでの液体流下 速度では、これらの孔は、拡散によって、実質的に粒子の全表面領域に対して、 酵素の溶液または酵素基質の溶液を送達する。■Member star removal plate The matrix of the enzyme reactor of the invention is characterized by a geometric structure. Ru. This geometry is dimorphic or polymorphic with respect to its porosity. , has an interaction region that allows enzyme immobilization. The matrix is large These pores are defined by a set of pores of large diameter; The particles are determined by the pressure gradient and the rate of flow of the liquid through the bed. and even smaller diameter pore cents are present (i.e. anisotropic through-holes), Smaller pores extend through each particle. Liquid flow at the above boundary level At high velocity, these pores spread over virtually the entire surface area of the particle by diffusion. Deliver a solution of enzyme or enzyme substrate.

図１は、本発明に使用するに適したマトリックス粒子１０を模式的に示している 。図で示したように、さらに粒子外の孔あるいは、相対的に大きな平均直径（粒 子間の間隙によって特定される）を持つチャネル１２に対して、粒子１０を利用 したマトリメスは、粒子１０の本体よって特定される孔としてここに具体化され ている貫通孔１４の第２のセットからなる０粒子１０によって特定されているも のは、拡散性の移送孔１６のセットである。さらにまた孔１２の平均直径は、貫 通孔１４より大きい。本発明の固定化酵素リアクターによれば、粒子がベッドに 密着充填された場合に、孔１４内部の対流性流下を引き起こすようなベッド中で 、実際に達成可能な液体流速の限界値が存在し、孔１２と１４の平均直径の比率 は、孔１４の内部での拡散の比率以上である。上記の限界ベッド速度では、ベッ ドは、潅流領域で運転していると言われている。この潅流領域では、酵素と基質 の接触は、対流移送によりそれほど長く結合していない。この潅流限界が得られ る場所は、いくつかの因子に依存しているが、主として、第一と第二の孔のセッ トの平均直径の比率に依存している。ここでは、孔１２と１４がそれぞれ対応す る。その比率をより小さくすることで、限界速度をより低くする。好ましい態様 においては、粒子的貫通孔の平均直径の比率は、７０以下であり、特に好ましく は５０以下である。Figure 1 schematically shows a matrix particle 10 suitable for use in the present invention. . As shown in the figure, there are also extra-particle pores or relatively large average diameters (grain Particles 10 are utilized for channels 12 with The matrices are here embodied as pores defined by the body of the particle 10. The second set of through-holes 14 that are identified by zero particles 10 are is a set of diffusive transfer holes 16. Furthermore, the average diameter of the holes 12 is It is larger than the through hole 14. According to the immobilized enzyme reactor of the present invention, particles are placed in the bed. in a bed that, if closely packed, would cause convective flow inside the hole 14; , there exists a limit value of the liquid flow rate that can be practically achieved, and the ratio of the average diameters of holes 12 and 14 is greater than or equal to the diffusion rate inside the hole 14. At the above limit bed speed, the bed is said to be operating in a perfusion area. In this perfusion area, the enzyme and substrate contact is not very long coupled due to convective transport. This perfusion limit is obtained The location of the first and second holes depends on several factors, but primarily It depends on the ratio of the average diameter of the Here, holes 12 and 14 correspond to each other. Ru. By making the ratio smaller, the limit speed is made lower. Preferred embodiment The ratio of the average diameter of the particulate through-holes is particularly preferably 70 or less. is 50 or less.

本発明に従うことで、粒子１０は、酵素を固定化することが可能な粒子内に、大 表面領域１８を含むことになる。多数の本技術と関係した公知技術の内の一つを 使用して、酵素は共有的に、高い濃度で表面１８に付着させる。酵素とマトリッ クス素材の組成に依存して、共有結合は、カルボキシ、アミノ、ヒドロキシル、 スルフヒドリル、ヒドロキシフェニル基および／またはその他の基などの様な官 能基との間で行うことができる。According to the present invention, the particles 10 have a large amount of enzyme immobilized therein. It will include surface area 18 . One of the many known technologies related to this technology When used, the enzyme is covalently attached to the surface 18 in high concentration. Enzymes and matrices Depending on the composition of the bulk material, covalent bonds can be carboxy, amino, hydroxyl, functional groups such as sulfhydryls, hydroxyphenyl groups and/or other groups. This can be done between functional groups.

さらに、マトリックスは最初に、与えられた結合プロトコールで、必要な官能基 をつくり出すために配分することもできる。Additionally, the matrix is initially assembled with the required functional groups for a given binding protocol. It can also be allocated to create.

さらにまた、ペンダント型の鎖は、末端官能基の表面と、表面から離れた位置に 「鎖」で結合した固定化酵素中にカンブリングさせて導入して、その表面を結合 させることができる。さらにまた酵素は、三機能***差結合の中間でマトリック スの表面と共有的に結合させることもできる。さらに、マトリラスの共有固定化 の方法についての詳細は、先行技術である引用の幾つかを参照することができる 。このような文献として以下のものを上げる。　Ｆａｌｂ、Ｒ，Ｄ、、　Ｅｎｚ ｙｍｅ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ＋Ｖｏ１．２．ｐｐ、６フー７６゜１９７３． 　Ｐｙｅ、Ｅ、他編、プレナムプレス、ニューヨーク、およびＷｈｉｔｅ　ａｔ 　ａｌ、、（１９８０）Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｃｒｏｂ、Ｔｅｃｈｎｏｌ、２：８ ２−９０゜さらにまた、酵素はマトリックス支持体に非共有結合させることがで きる。非共有結合は共有結合以上に多くの利点があり、それらのおもなものは費 用効果の適応性の点である。与えられた酵素は公知の非共有性相互作用の幾つか を利用して、マトリックスに結合させることができる。その後、酵素的変換が行 われ、酵素は引き続いて溶出される。マトリラスはその後、同じか或いは異なっ た酵素を再度負荷され、それによって与えられた酵素及び／またはりアクタ−シ ステムの寿命が延長される。Furthermore, the pendant chains are located at the surface of the terminal functional group and at a position remote from the surface. The surface is bonded by introducing cambling into the immobilized enzyme linked by “chains”. can be done. Furthermore, the enzyme is matrix-mediated in the middle of trifunctional cross-linking. It can also be covalently bonded to the surface of the substrate. Additionally, covalent immobilization of matrilas For details about the method, reference may be made to some of the prior art citations. . The following are cited as such documents: Falb, R, D, Enz yme Engineering+Vo1.2. pp, 6fu76゜1973. Pye, E. et al., Plenum Press, New York, and White at al., (1980) Enzyme Microb, Technol, 2:8 2-90° Furthermore, the enzyme can be non-covalently attached to the matrix support. Wear. Non-covalent bonds have many advantages over covalent bonds, chief among them being cost. The point is the adaptability of the effect of use. A given enzyme has several known non-covalent interactions. can be used to connect to the matrix. Enzymatic conversion then takes place. The enzyme is subsequently eluted. Matrilus is then the same or different The enzyme and/or reactivation enzyme thus provided is reloaded with the added enzyme. The life of the stem is extended.

さらにまた、複数の基質変換は、マトリックスに結合した与えられた酵素によっ ておこなわれ、マトリックスは溶出され、そして置き換えられる。酵素の除去は 強固な化学結合を破壊する必要がない場合には、粗抽出または「はぎとり」条件 は必要とせず、酵素を再度使用することが好ましい、さらに非共有結合は、結合 を達成するに必要な酵素のコンフオメーシゴンの変形を最小限にすることに考慮 されている。酵素の溶出をもたらさない条件での、非共有結合固定化酵素を用い た基質の変換を行うことが必要であることは、先行技術から理解されるはずであ る。これは、緩衝液ｐＨおよび／または塩条件のような、種々の反応パラメータ ー操作によって達成できる。非共有結合酵素固定化に特にを用なマトリックスは 、疎水結合によって結合するマトリックス（例えば逆相マトリックス等）または イオン交換体を含むものである。Furthermore, multiple substrate conversions can be performed by a given enzyme bound to a matrix. The matrix is eluted and replaced. Removal of the enzyme Crude extraction or “stripping” conditions when there is no need to break strong chemical bonds is not required and it is preferable to use the enzyme again; furthermore, non-covalent bonding is Consideration is given to minimizing the deformation of the enzymatic conformation necessary to achieve has been done. using non-covalently immobilized enzymes under conditions that do not result in enzyme elution. It should be understood from the prior art that it is necessary to carry out conversion of the substrate. Ru. This depends on various reaction parameters such as buffer pH and/or salt conditions. – Can be achieved through manipulation. The matrix is particularly suitable for non-covalent enzyme immobilization. , matrices bound by hydrophobic bonds (e.g. reversed-phase matrices) or It contains an ion exchanger.

何らかの酵素固定化方法において、基本的なデザインの基準は得られる酵素リア クターの酵素活性を最大化することである。In any enzyme immobilization method, the basic design criteria are The aim is to maximize the enzymatic activity of the vector.

例え、リアクターが高度の安定性と酵素の繰り返し使用が可能であったとしても 、結合ステップでの酵素活性の明らかな失活は、リアクターを経済的に実行不可 能にしてしまう、従って固定化のための化学は酵素にとって矛盾があってはなら ない。Even if the reactor has a high degree of stability and the enzyme can be used repeatedly. , the apparent deactivation of enzyme activity in the binding step makes the reactor economically unfeasible. Therefore, the chemistry for immobilization must be compatible with the enzyme. do not have.

リアクターマトリックスの単位重量当たり酵素活性の総量は、　別の重要な因子 である。過剰な容積増加を避ける目的で、リアクターはマトリラス素材当たり、 少なくとも１００Ｕ／Ｈの酵素活性を保持させておくべきであり、ここで酵素活 性の単位（Ｕ）は、１分間に変換される基質ｌマクロモルとして定義されている 。The total amount of enzyme activity per unit weight of the reactor matrix is another important factor. It is. In order to avoid excessive volume increase, the reactor is Enzyme activity should be maintained at least 100 U/H; The unit of sex (U) is defined as 1 macromole of substrate converted per minute. .

連続運転を意図とした酵素リアクターに関する重要な考察は、カラム流下のため のマトリックス適合化である０通常、高度の表面積を達成するために、マイクロ ポーラスな素材を使用している。しかし、この素材は拡散による基質移送には効 率の悪い結果しか得られない０表面積の増加はさらにまた、粒子サイズを小さく することによっても達成できる。しかしリアクターのカラム流下能力は通常、不 満足なものである。An important consideration for enzyme reactors intended for continuous operation is that Matrix adaptation of 0 is typically used to achieve a high degree of surface area. Made of porous material. However, this material is ineffective for substrate transport by diffusion. Increasing surface area with poor results also reduces particle size. It can also be achieved by doing. However, the column flow capacity of the reactor is usually inadequate. It's satisfying.

これらの問題をさけるために、高度に多孔質化した堅い素材が使用される。その 素材は、複数の粒子１０からなるマトリックスが酵素固定化に特に良く適合して いるかののように、見かけ上見える０例外的に、高い表面積／容積比率を達成で きる対流性粒子（典型的には１０−２０μｍの粒子で３Ｏ−５０ｎ？／ｍｌのオ ーダー）は、能力を妥協することなしに、小容量であ固定化酵素反応の役割を果 たすことができる。さらに潅流システムの速やかな入力は、結合能力の低下を起 こさずに必要な時間内に（数秒から数分）潅流リアクターシステムへの酵素の速 やかな負荷を可能にする。さらに、先行技術でのこれらの技術を正しく評価する ことで、システムの速やかな入力とその小型化が、反応プロトコールを開発しさ えすればいつでも、素早くそして容易な反応パラメータの操作を可能にする。To avoid these problems, highly porous, rigid materials are used. the The material has a matrix of particles 10 that is particularly well suited for enzyme immobilization. Exceptionally high surface area/volume ratio can be achieved. Convective particles (typically 10-20 μm particles with 3O-50n?/ml) (addresser) performs the role of immobilized enzyme reactions in small volumes without compromising performance. I can do it. Furthermore, rapid input of the perfusion system may cause a decrease in binding capacity. Quickly transfer enzymes into perfusion reactor systems within the required time (seconds to minutes) without straining. Allows easy loading. Furthermore, properly evaluating these technologies in the prior art Therefore, rapid input of the system and its miniaturization make it easier to develop reaction protocols. This allows quick and easy manipulation of reaction parameters at any time.

実際的には、どの様な酵素であっても、平等に多様性のある、本発明の酵素リア クターに使用することができる。さらに、複数の異なった酵素を、複数の異なっ た基質の反応を触媒するためのマトリックス上に固定化することができる。有用 な酵素にはオキシド−レダクターゼ、トランスフェラーゼ、ハイドロラーゼ、リ アーゼイソメラーゼなどが含まれる。を用な応用として、産業上利用する広い範 囲のものが含まれる。化学、食品、香料産業、生物治療、殺虫剤無毒化酵素の固 定化による排水処理、製薬工業特にラセミ混合物から光学異性体の分離などが上 げられる。いくつかの、医学上の有用な応用の中で、体外取り出し装置の部品と してのＩＭＥＲの使用がある。さらに種々の臨床分析として、体液試料中の１ま たはそれ以上の対象物質の存在および／または濃度を分析することを上げること ができる。Practically speaking, any enzyme can be used with an equally diverse array of enzymes according to the invention. can be used for vectors. In addition, multiple different enzymes can be can be immobilized on a matrix to catalyze the reaction of a substrate. useful Enzymes include oxido-reductase, transferase, hydrolase, and reductase. This includes enzyme isomerase. It has a wide range of industrial uses, including Includes surrounding items. Chemistry, food, fragrance industry, biological therapy, pesticide detoxification enzyme solidification Wastewater treatment by can be lost. Among several useful medical applications, it is used as a component in external extraction devices. There is a use of IMER as Furthermore, for various clinical analyses, one or more samples in body fluid samples may be used. analysis of the presence and/or concentration of or more target substances; Can be done.

さらに、本発明のＩＭＥＲは特定の酵素反応と代謝反応の生化学分析に有用であ る。Furthermore, the IMER of the present invention is useful for biochemical analysis of specific enzymatic and metabolic reactions. Ru.

さらに、酵素の単離と精製にとって、次のようなことが注目されている。相対的 に未精製及び／または異質性の酵素の調製で、細胞からの抽出、細胞熔解、部分 精製した酵素単離物、及び細胞全体などが、酵素活性を持つものとして使用する ことができる。従って、ここで使用する「酵素」の用語は、これらの形態全てに おいて、酵素の触媒作用を含む、広い意味を持っている。Furthermore, the following points are attracting attention for the isolation and purification of enzymes. Relative Preparation of unpurified and/or heterogeneous enzymes by extraction from cells, cell lysis, partial Purified enzyme isolates and whole cells are used as having enzymatic activity. be able to. Therefore, the term "enzyme" as used here applies to all of these forms. It has a broad meaning, including the catalytic action of enzymes.

また、−回の通過によって一連の酵素的変換を行うための、マトリックス表面上 の連続領域に、異なったタイプの複数種の酵素を固定化することもできる０例え ば、天然の状態で一連の酵素反応を行う複合体として通常は作用している酵素類 は次の方法で潅流マトリックスに連続的に固定化できる。マトリックス上の結合 可能領域すべてを飽和するには不十分な量の、一連の第一の酵素ｆＡ縮温溶液、 カラム中に充填した状態のマトリックスに供給する。溶液はさらに、潅流を起こ すに充分な液体流下速度で供給する。この流下速度、あるいはそれ以上では、酵 素は実質的に通過することですべての結合可能部位に接触し、それによって第一 の結合可能部位を飽和し、固定化酵素の隔離領域を形成する。同様にしてマトリ ックス上の結合可能領域すべてを飽和するには不十分な濃度量で、一連の第二の 酵素を含む液を追加する。潅流性の流下比率では、マトリックスに供給される第 二の溶液中の酵素は、固定化した第一の酵素を含む、飽和結合部位を流下して通 過し、次いでカラムのさらに下部の第一の結合可能領域に結合し始め、固定化酵 素の第二の領域を形成する。さらに別の異なった酵素を同じ方法で追加すること ができる。追加できる酵素の数は、主にカラムの容量と、充分な触媒作用を行う ためにに必要な酵素濃度よってのみ制限されるだけである。一連の酵素反応を行 うための最適な動力学は、類似の反応比率を持つ酵素を使用する必要があること 、及び／または最も遅い反応をさせる至適キネテックスを提供するような流下速 度を限定することは先行技術によって評価可能である。Also, - on the matrix surface for carrying out a series of enzymatic transformations by passing For example, multiple types of enzymes of different types can be immobilized in a continuous region of For example, enzymes that normally act as a complex that performs a series of enzymatic reactions in their natural state. can be continuously immobilized on a perfusion matrix by the following method. Joins on the matrix a series of first enzyme fA condensing solutions in an amount insufficient to saturate all possible areas; It is supplied to the matrix packed in the column. The solution also causes perfusion. feed at a sufficient liquid flow rate to At this flow rate or higher, fermentation The element passes through and contacts virtually all possible binding sites, thereby making the first saturates the possible binding sites of and forms an isolation region for the immobilized enzyme. Similarly, Matori A series of second Add the solution containing the enzyme. The perfusate flow rate is the The enzyme in the second solution flows down through the saturated binding sites containing the immobilized first enzyme. the immobilized enzyme, which then begins to bind to the first binding area further down the column. Forms an elementary second region. Adding yet another different enzyme in the same way Can be done. The number of enzymes that can be added depends mainly on column capacity and sufficient catalytic activity. is limited only by the enzyme concentration required for the purpose. Perform a series of enzymatic reactions Optimal kinetics for the reaction require the use of enzymes with similar reaction ratios. , and/or a flow rate that provides the optimum kinetics for the slowest reaction. Limiting the degree can be evaluated by the prior art.

本発明の予備的な実施のためのシステムの模式図を図２に示している。酵素基質 ２０の溶液は、ポンプ２２により酵素リアクター２４に圧送される。酵素リアク ター２４は、粒子１０の充填床からなるマトリックスを含んでいる０粒子１０の 充填床からなるマトリックスは潅流されており、その一方、別のマトリラス形成 物も使用できる。マトリラスは強固なものであることが必要であり、そのため実 質的な圧力低下に耐えることができ、さらに無理のない、好ましい圧力低下で、 カラム２４を通過する酵素基質溶液の対流性チャネリングを可能にする、貫通孔 のセットを形成させる０粒子１０の相互作用性表面領域１８の上には酵素が固定 化されている０本発明の実例では、酵素基質２０の溶液、リアクター２４を通過 し、それにより酵素リアクターから出る生産物の流路２６に、酵素反応産物を産 出させる。A schematic diagram of a system for a preliminary implementation of the invention is shown in FIG. enzyme substrate The solution of 20 is pumped to the enzyme reactor 24 by the pump 22. Enzyme Reac The filter 24 contains a matrix of 0 particles 10 containing a matrix consisting of a packed bed of particles 10. A matrix consisting of a packed bed is perfused, while another matrix formation You can also use objects. The matrilus needs to be strong and therefore practical. Can withstand qualitative pressure drops, and with reasonable and favorable pressure drops, Through-holes allow convective channeling of enzyme substrate solution through column 24 An enzyme is immobilized on the interactive surface area 18 of the particle 10 forming a set of In an embodiment of the invention, a solution of enzyme substrate 20 is passed through reactor 24. thereby producing an enzyme reaction product in the product flow path 26 exiting the enzyme reactor. Let it come out.

さらにまた、本装置は自動化システムの一部でもある。この場合には、多方性サ ンプリングバルブ２８を備える。このバルブは、酵素を、溶媒洗浄、溶媒溶出、 溶媒再回収や溶媒「除去」などを含む、全ての必要とする溶媒や緩衝液と同様に 、負荷する目的で使用することができる。リアクター２４の出口のバルブ３０は 、生産物の流路２６と検出機３２、排出物回収器３４あるいは生産物回収器３６ を接続している。さらにバルブの位置はコンピュータで制御できる。Furthermore, the device is also part of an automation system. In this case, the multidirectional A spring valve 28 is provided. This valve is suitable for enzyme, solvent wash, solvent elution, as well as all necessary solvents and buffers, including solvent recovery and solvent “stripping”. , can be used for loading purposes. The valve 30 at the outlet of the reactor 24 is , product flow path 26 and detector 32, waste collector 34 or product collector 36. are connected. Furthermore, the position of the valve can be controlled by a computer.

上に説明したように、溶液２０が酵素リアクター２４と貫通孔１４の立体構造お よび相互反応性表面１８の酵素を通過する場合の速度は、本発明の実施上重要で ある。これは、間隙孔１２と貫通孔１４の両方を通過対流性の流下をもたらす流 速は、極端な圧力低下を起こさずに達成できるようにすることである。As explained above, the solution 20 changes the three-dimensional structure of the enzyme reactor 24 and the through-hole 14. The rate of passage through the enzymes and the interreactive surface 18 is important in the practice of the present invention. be. This creates a convective flow through both the interstitial hole 12 and the through hole 14. The speed is such that it can be achieved without excessive pressure drop.

さらにまた、真の潅流操作にとっては、貫通孔１４での対流性の流速は、貫通孔 １４での溶液２０の拡散速度より大きくする必要がある。Furthermore, for true perfusion operations, the convective flow rate in the through-hole 14 is The diffusion rate of the solution 20 at 14 must be greater than that of the solution 20 at 14.

本発明の特に好ましいＢ様では、潅流粒子とその貫通孔は、潅流状態で行う基質 の変換を進めるために充分な平均直径を有している。孔を通過する溶質の大量移 送の一つの測定では、ＶＬ／Ｄで表される無次元量である、特徴的なペクレ数（ Ｐｅ）を与える。ここでは、■は孔を通過する対流速度、Ｌはその長さ、Ｄは孔 を通過する溶質の拡散速度である。全ての条件下で、従来のポーラスマトリック スシステムでは、多孔性物質中の拡散移送に対する対流性の比率を説明するペク レ数は、常に１より少ない数であった。潅流システムでは、第二の孔セット（貫 通孔）でのベクレ数は、常に１以上となる。前記のことから粒子（および関係し た粒子内の貫通孔）の大きさは、流速とベクレ数に影響を与えることが明らかで ある０例えば、４０００人の粒子内の貫通孔を有する１０μｍの粒子および１０ −’Ｃｉ／秒の拡散速度を有する溶質の場合には、限界流下速度は３００Ｃ１／ 時間である。この限界値以上では、上昇した圧力の低下とこれまで達成可能であ ったレベル以上のマトリックスの単位容積当たりの速度増加を起こすことが明ら かである。特に高い生産性は流下速度を１０００−４０００ｃｍ／時間とするこ とで達成できる。In particularly preferable embodiment B of the present invention, the perfusion particles and their through holes are formed on the substrate in the perfusion state. has a sufficient average diameter to proceed with the conversion. Massive movement of solutes through the pores One measurement of transmission is the characteristic Péclet number ( Pe) is given. Here, ■ is the convective velocity passing through the hole, L is its length, and D is the hole is the rate of diffusion of solute through . Conventional porous matrix under all conditions For gas systems, a specific model describing the ratio of convective to diffusive transport in porous materials is used. The number of rows was always less than one. The perfusion system uses a second set of holes (through-holes). The Beclet number at the hole (through hole) is always greater than or equal to 1. From the above, particles (and related It is clear that the size of the through holes (inside the particles) affects the flow velocity and the Beclet number. For example, if there are 4,000 10 μm particles with through holes within the particles and 10 For a solute with a diffusion rate of −’Ci/s, the critical flow rate is 300Ci/s. It's time. Above this limit, the increased pressure decreases and hitherto achievable. It has been shown that the velocity increases per unit volume of the matrix above the level That's it. Particularly high productivity is achieved by setting the flow rate to 1000-4000 cm/hour. This can be achieved with

ＩＭＥＲで通常使用している粒子サイズは、従来のＨＰＬＣマトリックスより実 質的に大きなサイズであり、しばしば１００−１０００μｍの単位である。この 範囲のサイズ粒子からなる潅流性マトリックスは、２−２０μｍの範囲の粒子内 質通孔をもつことができる。このように、２００ＩＪｍの粒子と１０−’ｄ／秒 程度の孔拡散速度を有する溶質で、１以上のベクレ数を得るために、限界流下速 度は、約０．３ＣＩ／時間にして、孔（あるいは３０Ｃ１／時間の孔速度に対し て１％のベッドのみの場合）での対流を達成する必要がある。従って、潅流は非 常に緩やかな圧力低下と充分に遅い流速で達成可能である。その場合、たとえ流 速を必要とする反応であっても、ｍ１７分の流下量であっても、酵素変換反応が 失敗することはない。The particle sizes typically used in IMER are more practical than traditional HPLC matrices. Qualitatively large in size, often on the order of 100-1000 μm. this A perfusible matrix consisting of particles in the range of 2-20 μm in size Can have a pawn hole. Thus, with a particle of 200 IJm and 10 −’d/s In order to obtain a Beclet number of 1 or more for a solute with a pore diffusion rate of The rate should be approximately 0.3 CI/hour, and convection (if only 1% of the bed) needs to be achieved. Therefore, perfusion is This is always achievable with a slow pressure drop and a sufficiently slow flow rate. In that case, even if Whether the reaction requires high speed or a flow rate of 17 m, the enzymatic conversion reaction You can't fail.

より小さな粒子（１０μｍの粒子）での、固定化酵素反応のための最適触媒動力 学は、潅流限界に以下の流速において減少を必要とするかもしれない。しかし、 先行技術によって正しく評価されるであろう、小さな粒子からなり、高い限界流 速を必要とする潅流マドリンスは、たとえ酵素反応が潅流モード以下で進行した 場合であっても有用である。これにはいくつかの理由がある。まず最初に酵素そ れ自身は、潅流モードで負荷され、従来のシステムを使用するに必要な時間、カ ラムを負荷できるようにしている。第二に、増加した粒子内質通孔の大きさは、 実質的に、従来の孔のマトリックスで特定される孔の作用を減少させる。第三に 、粒子間と粒子内の孔の比率の減少と、これらのマトリメスを特徴づける、粒子 内拡散性の通過距離の実質的な減少しは、停滞した移動相内に溶質が蓄積したた めに起こる基質または酵素の阻害を実際に取り除く。Optimal catalytic power for immobilized enzyme reactions with smaller particles (10 μm particles) The science may require a reduction in flow rates below the perfusion limit. but, consisting of small particles and high critical flow, as would be correctly evaluated by the prior art. Perfusion treatments that require high speeds are recommended even if the enzymatic reaction proceeds below the perfusion mode. It is useful even in cases. There are several reasons for this. First of all, the enzyme itself is loaded in perfusion mode and requires less time and care than using a conventional system. It allows you to load ram. Second, the increased intergranular pore size is Substantially reduces the effect of pores specified in conventional pore matrices. Third , a reduction in the ratio of inter-particle and intra-particle pores characterizes these matrimes, particles The substantial decrease in intradiffusive travel distance is due to the accumulation of solutes in the stagnant mobile phase. actually eliminates substrate or enzyme inhibition that occurs due to

本発明は、以下に示されている、限定を加えていない実施例から、さらに良く理 解されるものである。The invention will be better understood from the non-limiting examples given below. It is something that can be understood.

ウシ小腸アルカリ性ホスファターゼ（ＣＩ−ＡＰ）を潅流性逆相カラム（ＦＯＲ ＯＳ　？１４ＲＭ、　ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ、 マザチェーセンツ州ケンブリッジ、０．ｌＸ２Ｃ１１，直径２０μ−の粒子、４ ０ｂａｒで充填）に非共有的に結合させる。１０ｍ１のＰＨ８，０のトリス（ヒ ドロキメチル）アミノエタンを用いて１ｍｇ／ｍｌの再構成ＣＩ−ＡＰをｐＨ７ ，１の１０ｍＭリン酸緩衝液（Ｐ　Ｂ）で希釈する（１：１００）。次いで、ｎ ｇ量を適切な流速でカラムに負荷する。通常０．１ｍｌ／分から０．５ｍｌ／分 の間で行う。一般的には、カラムは約１０秒間負荷を行う。Bovine small intestine alkaline phosphatase (CI-AP) was purified using a perfusion reversed phase column (FOR). OS? 14RM, PerSeptive Biosystems, Inc. Cambridge, Massachusetts, 0. lX2C11, 20 μ-diameter particles, 4 (filled at 0 bar). 10m1 of Tris (Hydrogen) with a pH of 8.0 Reconstituted CI-AP at 1 mg/ml at pH 7 using , 10mM phosphate buffer (PB) (1:100). Then n Load the column with the appropriate flow rate. Usually 0.1ml/min to 0.5ml/min Do it between. Typically, the column is loaded for about 10 seconds.

酵素基’Ｎｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ、　Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｏ 。Enzyme group 'Np-nitrophenyl phosphate (PNPP, Pierce Co .

イリノイ州ロソクフオルド）はｐＨ９，５の０．５ｍＭ塩化マグネシウムを含む １０ｍＭジエチルアノラミンに溶解させる。(Lossockford, IL) contains 0.5mM magnesium chloride at pH 9.5. Dissolve in 10mM diethylanolamine.

ついで０．１または１．０ｍｇ／ｍ＋のいずれかの濃度で負荷する。基質の反応 は、一定の流下速度と酵素濃度で連続流下システムとして行わせる。生産物は４ ０５　ｎｍの吸収によって確認する。It is then loaded at a concentration of either 0.1 or 1.0 mg/m+. Substrate reaction is performed as a continuous flow system with constant flow rate and enzyme concentration. The product is 4 Confirm by absorption at 0.05 nm.

カラムはＰＢ洗浄によって除去を行い、続いて８０％アセトニトリル／２０％酢 酸からなる除去用溶媒を通し、そしてＰＢを用いて再等張化を行う、ＰＮＰＰを 第二の酵素を負荷する前に通過させることができる。そして溶出液で残存酵素活 性の試験を行った。The column was cleaned by PB washing followed by 80% acetonitrile/20% vinegar. Pass the PNPP through a removal solvent consisting of an acid and re-tonicity using PB. The second enzyme can be passed before loading. The remaining enzyme activity is then extracted from the eluate. A sex test was conducted.

図３Ａおよび図３Ｂは、１０の異なる流速と２つの異なる基質濃度（それぞれ３ Ａと３Ｂは０．１ｍｇ／ｍｌと１．０ｍｇ／ｒｎｌに対応）で酵素濃度と生産物 をプロットして示したものである。基質濃度を１０倍増加させてもシステムの作 用に違いがないことを示している。予想通り、流速の低下は分析感度を向上させ ている。しかし、好ましい基質反応流下速度（即ち０．２ｍ　Ｉ　／　ｍ　ｉ　 ｎ以下）が、本実験で使用している粒子のサイズ（２０μｍ）では限界潅流速度 以下であっても、高濃度および低濃度のどちらの基質濃度でもカーブの直線性（ Ｒ＝１．０００−０．９９０）を維持している。このことは、高濃度基質を連続 的に流下させるようにした場合であっても、本システムにおいては、基質または 生産物の明らかな阻害はないという、劇的な事実を示している。上に示したよう に、本発明の好ましい態様では、ＩＭＥＲを使用するための潅流粒子は、粒子的 対流流下のための限界流速を実質的に減少させている１００−１０００μｍ程度 の直径を有している。Figures 3A and 3B show 10 different flow rates and two different substrate concentrations (3 A and 3B correspond to 0.1 mg/ml and 1.0 mg/rnl) and enzyme concentration and product. is plotted. The system remains functional even with a 10-fold increase in substrate concentration. This shows that there is no difference in usage. As expected, lowering the flow rate improves analytical sensitivity. ing. However, the preferred substrate reaction flow rate (i.e. 0.2 mI/mi n or less) is the critical perfusion rate for the particle size (20 μm) used in this experiment. The linearity of the curve at both high and low substrate concentrations ( R=1.000-0.990). This means that continuous high concentration substrate In this system, the substrate or The dramatic fact is that there is no obvious inhibition of production. as shown above In a preferred embodiment of the invention, the perfused particles for use in IMER are particulate around 100-1000 μm, which substantially reduces the critical flow velocity for convective flow. It has a diameter of

図３０ではカラム容積の１６５０倍量をシステム（ＣＩ−ＡＰ　２５ｎｇを含む ）に潅流速度（３６００ＣＩＩ／時間）で第一と第二の基質変換系の間を通過さ せた（曲線１と曲線２はそれぞれ１ｍｇ／ｍｌのＰＮＰＰを用いて流速範囲に対 応する）。In Figure 30, 1650 times the column volume was added to the system (containing 25 ng of CI-AP). ) between the first and second substrate conversion systems at a perfusion rate (3600 CII/h). (Curves 1 and 2 are each calculated using 1 mg/ml PNPP for a range of flow rates. ).

図３０にプロットしたデータから次のことが判明した。非共有結合固定化酵素の 有意な浸出は、中間では起こらなかった。しかしその他の実験では、酵素を固定 化できる第二〇カラムは、第−〇カラムに直列につなぎ、第一のカラムから流出 してきた液を酵素浸出を試験するために通過させた。基質はこの第二〇カラムを 連続的に通過させた時、有意な基質変換は、実際に酵素が第一〇カラムから浸出 してこないことを示しているこの第二〇カラムでは確認できなかった。The following was found from the data plotted in FIG. Non-covalently immobilized enzymes No significant leaching occurred in the middle. However, in other experiments, the enzyme is immobilized. Column 20, which can be The resulting solution was passed to test for enzyme leaching. Substrate is this 20th column Significant substrate conversion occurs when the enzyme is actually leached from column 10 when passed sequentially. This could not be confirmed in the 20th column, which indicates that no such thing has been done.

本発明の精神と必須の特徴から切り離すことなしに、本発明は、その他の特異的 な形態で実施することが可能である。従って、本発明は、説明することを意図と している先の記載によって特定されるのみでなく、次のクレームからも特定され るものである。Without departing from the spirit and essential characteristics of the invention, the invention may include other specific features. It is possible to implement it in various forms. Accordingly, the present invention is intended to describe It is not only specified by the previous statement that states the claim, but also from the following claim. It is something that

Ｃ１−ＡＰ（ｎ９） Ｃ１−ＡＰ　ｔｎｇｌ Ｆｉｇ、　３Ｂ １／ＦＬＯＷ　ＲＡＴＥ 平成５年１０月１８日C1-AP(n9) C1-AP tngl Fig, 3B 1/FLOW RATE October 18, 1993

Claims (28)

【特許請求の範囲】[Claims] １．次のステップからなる酵素反応を行う方法。 （Ａ）粒子の貫通孔と固定化酵素から構成される基質の相互反応性表面領域を特 定している、充填した粒子の複数からなるマトリックスを調製し、次いで （Ｂ）上記の貫通孔を通過する基質の拡散速度より大きな、対流性の上記貫通孔 を通過する液体流下速度を生じさせるためには充分な速度で、上記マトリックス を通って固定化酵素に反応する基質溶液を通過させる。1. A method of performing an enzymatic reaction consisting of the following steps: (A) Identifying the interactive surface area of the substrate consisting of the through-holes of the particle and the immobilized enzyme. Prepare a matrix consisting of a plurality of packed particles with a defined (B) The above-mentioned through-hole has convective properties that are higher than the diffusion rate of the substrate passing through the above-mentioned through-hole. said matrix at a velocity sufficient to cause a liquid flow rate through the matrix. A substrate solution that reacts with the immobilized enzyme is passed through. ２．次のステップからなる酵素反応を行うための方法。 （Ａ）第一と第二の貫通孔のセットの両方とも通過して、対流性の液体を流下さ せることのできる立体構造をとった、相互に連絡しあっている第一と第二の貫通 孔のセットであって、酵素溶液と酵素との反応性基質溶液をマトリックスに通過 させてチャネリングさせるための貫通孔の複数からなる、相互に連絡しあってい る貫通孔のそれぞれ、および第二の貫通孔のセットのメンバーと固定化可能な酵 素による液体の連絡における表面領域から特定されるマトリックスを調製する、 （Ｂ）少なくとも、上記の表面領域の部分に上記酵素を負荷させるために、上記 マトリックスを通して酵素の溶液を通過させる、 （Ｃ）固定化酵素による基質の触媒作用を行わせるために充分な液体の流速で、 上記マトリックスを通して上記固定化酵素を基質と反応させるために、基質溶液 を通過させる。2. A method for performing an enzymatic reaction consisting of the following steps: (A) Both the first and second sets of through holes allow convective liquid to flow down. first and second through-holes that communicate with each other in a three-dimensional configuration that can be A set of pores through which the enzyme solution and the enzyme-reactive substrate solution pass through the matrix. It consists of multiple through holes that communicate with each other for channeling. a member of the second set of through-holes and an immobilizable enzyme. preparing a matrix identified from the surface area in fluid communication with the element; (B) in order to load at least a portion of the surface region with the enzyme; passing a solution of enzyme through the matrix; (C) at a liquid flow rate sufficient to effect catalysis of the substrate by the immobilized enzyme; A substrate solution is used to react the immobilized enzyme with the substrate through the matrix. pass. ３．生産のために液体の流下速度で、上記酵素溶液または基質溶液を上記マトリ ックスに通過させる、請求項２の方法。 両方の貫通孔のセットを通過する対流性の液体の流下、第二の貫通孔のセットを 通過する液体の流下速度より大きな、上記第一の貫通孔を通過する対流性液体の 流下速度、上記第二の貫通孔のセットのメンバーの間を上記酵素または上記基質 の拡散流下速度より大きな、上記第二の貫通孔を通過する対流性液体の流下速度 。3. Add the enzyme solution or substrate solution to the matrix at a liquid flow rate for production. 3. The method of claim 2, wherein the method is passed through a box. Convective liquid flow down through both sets of through holes, the second set of through holes The flow velocity of the convective liquid passing through the first through hole is greater than the flow rate of the liquid passing through. flow rate of the enzyme or the substrate between the members of the second set of through-holes. The flow rate of the convective liquid passing through the second through hole is greater than the diffusion flow rate of . ４．マトリックスが上記表面領域からなる分岐孔の複数を特定する請求項１また は２の方法。4. 2. The method of claim 1, wherein the matrix defines a plurality of branch pores comprising said surface area. is the second method. ５．上記基質が、上記表面領域の一つから、上記第二の貫通孔のセットのメンバ ーの内部に拡散するまでの時間は、上記基質が対流的に上記領域を通過して流下 する時間の１０倍より大きくないような速度で、上記基質溶液が上記マトリック スを通過するところの請求項４の方法。5. the substrate is configured to extend from one of the surface areas to a member of the second set of through-holes; The time it takes for the substrate to diffuse into the interior of the The substrate solution is applied to the matrix at a rate not greater than 10 times as long as 5. The method of claim 4, further comprising passing through a ６．約３００ｃｍ／時間より大きなベッド速度で、上記溶液を上記マトリックス を通過させることによって、ステップＢまたはステップＣを誘導させるところの 、請求項３の方法。6. The solution is passed through the matrix at a bed speed greater than about 300 cm/hour. where step B or step C is induced by passing , the method of claim 3. ７．約１０００ｃｍ／時間より大きなベッド速度で、上記溶液を上記マトリック スを通過させることによって、ステップＢまたはステップＣを誘導させるところ の、請求項３の方法。7. The solution is added to the matrix at a bed speed of greater than about 1000 cm/hr. where step B or step C is induced by passing the 4. The method of claim 3. ８．約３０ｃｍ／時間より大きなベッド速度で、上記溶液を上記マトリックスを 通過させることによって、ステップＣを誘導させるところの、請求項３の方法。8. The solution is passed through the matrix at a bed speed greater than about 30 cm/hour. 4. The method of claim 3, wherein step C is induced by passing. ９．ステップＢの上記酵素溶液が、第一と第二の孔のセットの両方を通過する対 流性液体の流下速度で、上記マトリックスを通過し、さらに上記基質溶液が拡散 性液体の流下速度で上記マトリックスを通過する、請求項２の方法。9. A pair in which the enzyme solution of step B passes through both the first and second set of holes. At the flow rate of the fluid liquid, it passes through the matrix, and the substrate solution is further diffused. 3. The method of claim 2, wherein said matrix is passed through said matrix at a flow rate of said liquid. １０．第一の貫通孔のセットが少なくとも８μｍの平均直径を有する充填した粒 子によって特定されており、そして上記第二の孔のセットが２０００Å以上の平 均直径以上を有する粒子内の貫通孔からなるところの請求項２の方法。10. filled grains in which the first set of through-holes has an average diameter of at least 8 μm and the second set of holes has a flat surface of 2000 Å or more. 3. The method of claim 2, comprising through-holes within the particles having a uniform diameter or greater. １１．第二の貫通孔の平均直径に対する粒子の平均直径の比率が７０以下である 請求項１０の方法。11. The ratio of the average diameter of the particles to the average diameter of the second through-hole is 70 or less The method of claim 10. １２．第二の貫通孔の平均直径に対する粒子の平均直径の比率が５０以下である 請求項１１の方法。12. The ratio of the average diameter of the particles to the average diameter of the second through-hole is 50 or less. 12. The method of claim 11. １３．上記粒子が少なくとも１００μｍの平均直径を有し、そして上記第二の孔 が２μｍ以上の大きさの平均直径を有している粒子の内部の貫通孔からなるとこ ろの、請求項１０の方法。13. said particles have an average diameter of at least 100 μm, and said second pores have an average diameter of at least 100 μm; consists of through-holes inside particles having an average diameter of 2 μm or more. Lono, the method of claim 10. １４．上記分岐孔が７００Å以下の平均直径を有しているところの、請求項４の 方法。14. Claim 4, wherein the branched pores have an average diameter of less than 700 Å. Method. １５．上記表面領域が複数の異なる酵素をそれらの上に固定化したものからなっ ているところの、請求項１または２の方法。15. The surface area consists of a number of different enzymes immobilized thereon. 3. The method of claim 1 or 2, wherein: １６．上記の異なる酵素が上記マトリックス上の連続した領域に固定化されてい るものである、請求項１５の方法。16. The different enzymes mentioned above are immobilized on consecutive areas on the matrix. 16. The method of claim 15. １７．第二の孔のセットの貫通孔でのべクレ数が１以上であるような速度で、基 質溶液がマトリックスを通過させられるところの、請求項１または２の方法。17. the base at a speed such that the Beclet number in the through-holes of the second set of holes is greater than or equal to 1; 3. The method of claim 1 or 2, wherein the quality solution is passed through the matrix. １８．第二の孔のセットの貫通孔でのべクレ数が５以上であるところの請求項１ ７の方法。18. Claim 1, wherein the Beclet number of the through holes of the second set of holes is 5 or more. 7 ways. １９．次で特定する堅いマトリックスからなる酵素リアクター。 相互に連通している第一と第二の貫通孔セットで、それぞれが、酵素に反応性の 基質溶液を上記マトリックスに通過させてチャネリングするための複数の貫通孔 からなり、固定化酵素からなっている表面領域と第二の貫通孔のメンバーで液体 中で伝達されている、上記第一と第二の貫通孔のセットのメンバーの相対的な立 体構造と、上記基質溶液が予備選択された速度で上記マトリックスを通過させた 場合に、通過させるために固定化されている表面領域、両方の貫通孔セットを通 過する対流性の液体の流下、第二の貫通孔のセットを通過する液体の流下速度よ り大きな、上記第一の貫通孔のセットを通過する対流性液体の流下速度、上記第 二の貫通孔のセットのメンバーを上記基質の拡散流下する速度より大きな、上記 第二の貫通孔のセットを通過する対流性液体の流下速度。19. An enzyme reactor consisting of a rigid matrix as specified below. A first and second set of interconnected through-holes, each containing an enzyme-reactive Multiple through-holes for channeling substrate solution through the matrix The surface region consists of an immobilized enzyme and the second through-hole member consists of a liquid the relative standing of the members of said first and second through-hole sets communicated in the structure and the substrate solution was passed through the matrix at a preselected rate. If the surface area is fixed for passage, both sets of through-holes The convective liquid flow through the second set of through holes is the flow velocity of the convective liquid passing through the first set of through holes, The rate of diffusion of the substrate through the members of the second through-hole set is greater than the above The rate of flow of convective liquid through the second set of through holes. ２０．上記表面領域が、それらの上に固定化された複数の異なった酵素からなる ところの請求項１９の酵素リアクター。20. The surface area consists of a number of different enzymes immobilized thereon. However, the enzyme reactor according to claim 19. ２１．上記複数の異なる酵素が、上記マトリックス上の連続したゾーンに固定化 されているところの、請求項２０の酵素リアクター。21. The different enzymes are immobilized in consecutive zones on the matrix 21. The enzyme reactor of claim 20, wherein: ２２．マトリックスが、上記粒子が次で特定されており、上記第一の貫通孔のセ ットを含む間隙の容積を特定する中間性の粒子の複数からなっているところの、 請求項１９の酵素リアクター。 上記第二の貫通孔のセットからなっている貫通孔の多様性、および上記表面領域 からなる閉塞性孔の多様性。22. A matrix is provided in which the particles are identified in the first through-hole section. consisting of a plurality of intermediate particles specifying the volume of the interstitial space containing the The enzyme reactor of claim 19. A multiplicity of through-holes consisting of a second set of through-holes above, and a surface area above Diversity of obstructive pores consisting of. ２３．上記粒子が少なくとも、５０μｍの平均直径を有し、粒子内貫通孔の平均 直径に対する粒子直径の比率が７０以下であるところの請求項２２の酵素リアク ター。23. The particles have an average diameter of at least 50 μm, and the average through-pores within the particles 23. The enzyme reactor of claim 22, wherein the particle diameter to diameter ratio is 70 or less. Tar. ２４．上記粒子がすくなくとも１００μｍの平均直径を有するところの、請求項 ２３の酵素リアクター。24. Claim wherein the particles have an average diameter of at least 100 μm. 23 enzyme reactors. ２５．上記比率が５０以下である請求項２３または２４の酵素リアクター。25. The enzyme reactor according to claim 23 or 24, wherein the ratio is 50 or less. ２６．上記粒子が異方性の貫通孔の複数を特定しているところの、請求項２２の 酵素リアクター。26. 23. wherein said particles define a plurality of anisotropic through-holes. enzyme reactor. ２７．上記粒子が相互接着性多孔質からなっているところの、請求項２２記載の 酵素リアクター。27. 23. The particles according to claim 22, wherein said particles consist of an interadhesive porous material. enzyme reactor. ２８．上記第二の貫通孔のセットを通過する対流性流下速度に対する、上記第一 の貫通孔のセットを通過する対流性流下速度の比率は、１０：１から１００：１ の範囲であるところの請求項１９の酵素リアクター。28. said first relative to the convective flow velocity through said second set of through holes. The ratio of convective flow velocities through the set of through holes is from 10:1 to 100:1 20. The enzyme reactor of claim 19, wherein:
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