【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
改良されたドメイン間幾何を有するキメラ毒素類発明の背景
本発明は、キメラ毒素分子を構築するための組換えＤＮＡ技術の使用に関する。
多くのホルモン類、毒素類および他の生物活性蛋白類によって主張される非常に
選択的な効果は、このような蛋白類が１種類以上の機能的に異なったポリペプチ
ドドメインを有するので、ある程度可能である。いくつかの植物および細菌毒素
は、例えば、細胞結合、膜トランスロケーンコン、および中毒の原因となる個々
のドメイン類で進化した。種々のドメイン類によって授けられる特性の組合せに
よって、非常に有効な生物活性分子が得られる。
ジフテリア毒素（ＤＴ）は天然マルチドメイン蛋白の例である。ＤＴは多くのド
メイン類からなり、それらの各々は固有の機能を授け、それらの全ては組み合わ
せて非常に活性な毒素分子を生じる。ＤＴは、分子のアミノ末端で始まる、以下
のとおり特徴付けられ得る：疎水性リーダーシグナル配列Ｓ（アミノ酸Ｖａｌ−
Ｂ−Ａｌａ−１）； ｒ延長因子２」と称される真核蛋白合成因子のニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド依存性アデノシンニリン酸（ＡＤＰ）リボシル化を
触媒するドメインを含む酵素的に活性な断片Ａ（アミノ酸Ｇ１ｙ＋ Ａｒｇｕｓ
） ：切断ドメインを含有するプロテアーゼ感受性ジスルフィドループ１．（ア
ミノ酸ＣＶＳ＋ａｓ Ｃｙｓ、。１）；ならびにトランスロケーションドメイン
および第２ジスルフイドループ（＋２、アミノ酸Ｃ）’Ｓｎｓ＋ Ｃ）’Ｓ４ｔ
＋）をフランクする普遍性（ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ）結合ドメインを含む断片
Ｂ（アミノ酸５ｅｒｎ４−Ｓｅｒｓｓｓ）。ＤＴが感受性真核細胞を中毒させる
プロセスは、少なくとも以下の工程を含む＝（１）ジフテリア毒素の結合ドメイ
ンは感受性細胞の表面の特異的セッター類に結合する： （ｉｔ）そのレセプタ
ーに結合する一方、毒素分子はエンドサイトーンス小胞中に取り入れられる；（
ｆｆｉ）取り入れられる前、またはエンドサイト−シス小胞内で、該毒素分子は
断片ＡおよびＢの間の１１切断ドメイン中の蛋白分解切断を受ける。（■）エン
ドサイトーンス小胞のｐＨが６未満に低下すると、毒素は、自然に、エンドソー
ム膜中に挿入される。
（ｖ）該膜中に包埋されると、毒素のトランスロケーションドメインは断片Ａの
細胞質ゾル中への導出を促進する； （ｖｉ）断片Ａのドメインに残存する触媒
活性は中毒細胞の死の原因となる。／ニードモナス（Ｐ ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
）エキソトキシンＡによる、およびことによるとある種の別の天然毒素による細
胞死滅の機構は非常に類似している。
種々の官能性ドメイン類（ポリペプチドまたは非ペプチドのいずれか）を含有す
るヒト生産毒素分子の治療的効果は、長年、真価が認められてきた。ポール・エ
ールリッヒ（Ｐａｕｌ Ｅｈｒｌｉｃｈ）、エールリッヒ（１９０６）、コレク
チ’７ド・スタデイズ・オン・イムニティ（Ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ５ｔｕｄｉｅ
ｓ ｏｎ Ｉ ｍｍｕｎｉｔｙ）、２ ： ４４２−４４７は、特異的標的に対
する親和性を有する分子（標的または細胞結合ドメイン）と細胞毒性薬として作
用する分子（細胞毒性ドメイン）を併有した二官能性分子の構築物を示唆する最
初のものである。
それ以来、多くの生物的および化学的部分が、選択的細胞毒性、すなわち、標的
された細胞毒性の程度を示す分子を生産する試みにおいて種々の方法で結合され
た。初期の試みは、非ペプチド毒素の、可溶性分子または抗体へのコンンユゲー
シコンによって特徴が表された。より最近は、分子遺伝学の出現は、新規なマル
チドメインキメラ毒素蛋白をコードするキメラ遺伝子の工学を承認した。例えば
、マーフィー（Ｍｕｒｐｈｙ）、Ｕ、Ｓ、特許第４．６７５．３８２号を参照。
これは本明細書に引用記載されており、ＤＴの酵素活性（毒素）ドメイン、ＤＴ
の切断ドメイン、ＤＴのトランスロケーションドメイン、および第２蛋白から誘
導された細胞特異的結合ドメインを含むハイブリッド蛋白類の構築物を教示する
。上記マーフィーの文献に開示されているハイブリッド蛋白類は、毒性を授ける
ＤＴ毒素ドメイン類と、非常に選択的な細胞結合特性を授ける別の蛋白、例えば
インターロイキン２（ＩＬ−２）由来のドメインとを併有する。
該構成成分の固有の特性の改良、すなわち、例えばモノクローナルのようなより
非常に特異的な細胞結合剤の使用、および、例えば植物または細菌毒素のような
大きい効力の毒素の使用は、改良された毒素コンジュゲート体への主要なルート
であった。二官能性分子の細胞結合実体および細胞死滅実体を結合する方法は、
これらの分子の性能を改良する試みにおいても考慮された。これらの試みは、主
要成分の活性を保存すること、溶解度を増加させること、細胞特異的結合剤に結
合された細胞毒性剤の割合を増大させること、または中毒において必要な工程、
例えば毒素ドメインの、分子の残存部からの切断を行うことの容易さを増大させ
ることに向けられた。
種々のスペーサーまたはリンカ一部材は、上記の長所を現実化する試みにおいて
、コンジュゲート−毒素類のドメイン類（または非ペプチド官能性実体）間に置
かれた。ロウランド（Ｒｏｖｌａｎｄ）ら、（１９７５）、ネイチャー（Ｎａｔ
ｕｒｅ）、２５５：４８７は、化学的毒素類および抗体間のリンカ−としてのポ
リグルタミン酸（分子量＝３５，０００）の使用が抗体に対する毒素の結合を指
向することが好ましいと報告している。
「この結合工程でＩｇの化学的構造による妨害を最小にすることによって、コン
ジュゲート体が、高濃度の薬物を伴い、かつ抗体活性をあまり損失させずに生産
される。・・・不活性中間担体を介して抗体に細胞毒性剤を連結することの概念
は、種々の薬物、種々の担体およびより純度の高い抗体調製物の使用の可能性を
伴って、将来の改良された癌化学治療について広い範囲を提供する。」
モンシニイ（Ｍｏｎｓｉｇｎｙ）ら、（１９８０）ＦＥＢＳレターズ（ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔｅｒｓ）、１１９：１８１は、薬物および担体間でのスペーサーを含
有するペプチドの挿入によって、例えば抗体の如き担体にコンジュゲートしたダ
ウノルビシンのような薬物の活性を最大にすることを報告している。スペーサー
・アーム、２−（１−チオーβ−Ｄ−グリコピラノシル）−エタノイル−Ｌ −
ａｒｇ−Ｌ−１ｅｕは、血清プロテアーゼによってではなく、リゾソームブロテ
アーゼによって切断され得る。
「技術的理由のために、および薬物の活性が置換または化学的修飾されると部分
的または全体的に損失されるので、我々は、薬物−一担体コンンユゲート体が血
清中で安定であり、標的細胞の内側に遊離薬物を誘導するリゾソームプロテアー
ゼによって特異的に***され得るようなスペーサーを案出した。」アーノン（Ａ
ｒｎｏｎ）ら、（１９８２）、イムノロジカル・リビュー（Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒ
ｅｖ、）、６２：５は、抗体にダウノマイシンを結合するためのデキストランの
使用を報告している。
「この方法を使用する理由は２つあった。第一に、より高い細胞毒性活性に誘導
すべき、抗体分子当たり多量の薬物結合かえられることが予想される。第二に、
薬物および担体間のスペーサー・アームとしてのマクロ分子の使用が立体障害を
あまり伴わずに、故に、より高い効力で、コンジュゲート体表面の薬物部分のよ
り高い暴露を可能にする際の長所を証明できた。」トウリイット（Ｔ ｒｕｅｔ
）ら、（１９８２）、ブロン−ディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オ
ブ・サイエンシズ・ニー・ニス・エイ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、 Ｕ Ｓ Ａ）、７９ ： ６２６−６２９は、１〜４アミノ酸残基長
さのスペーサー・アームによってダウノルビンンをスクシニル化ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）に結合させることを報告している。該スペーサー・アームの目的
は、薬物およびＢＳＡ分子間でリソソーム切断させることであった。
ネヴイル（Ｎｅｖｉｌｌｅ）ら、（１９８９）、ＪＢＣ，２６４：１４６５３−
１４６６１は、切断可能な架橋剤がＤＴ−抗原コンジュゲート体の効力を３〜１
０倍増強することを報告している。架橋剤は酸性ｐＨで切断可能であり、か（し
て、酸性区画において切断される。大きい効力は、大きいトランスロケーション
に誘導する増強された細胞内毒素−毒素レセプター相互作用に左右されると思わ
れる。該コンジュゲート体は切断の後ではなく前に立体的に妨害されると思われ
る。非ペプチド架橋剤、ビス−マレイミドエチオキシプロパンが使用された。
グリーンフィールド（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ）ら、ＰＣＴ／ＵＳ８５１００１９
７は、毒性および抗体がスペーサーペプチドによって結合される毒素−抗体コン
ジュゲート体を開示している。
「本発明は、細胞毒性断片を標的細胞にトランスロケートするのに適している幾
何、このようなトランスロケーションの前にその結合断片を保持する能力、およ
び／または細胞毒性部分を可溶化する能力を有する毒素コンジュゲート体を提供
するように設計される。本発明の１つの態様では、該スペーサーは、該分子の細
胞毒性部分を細胞膜に容易に接近させるように設計される。典型的な抗体（結合
）断片のサイズがほとんどの細胞毒性断片のものよりも非常に大きい場合に、こ
こには、抗体または抗体断片の完全なバルクによって押し付けられた毒性部分に
よる細胞膜への接近の相当な立体妨害がある。・・・このトランスロケーション
を有効にするために、該スペーサーは、Ａ部分を細胞膜に到達させるのに充分に
フレキシブルであり、かつそれに充分な能力を持たせるのに充分に延長されるこ
とが必要で一般に、本発明は、キメラ毒素のアミノ末端で開始される、順次、（
ａ）ジフテリア毒素の酵素的に活性な断片Ａ：（ｂ）ジフテリア毒素の断片Ａに
隣接している切断ドメイン１．を含む断片：（ｃ）（ｉ）ジフテリア毒素の断片
Ｂの疎水性膜内外領域の少な（とも一部分であって、該断片が少な（とも５０個
、好ましくは少なくとも８０個のジフテリア毒素アミノ酸残基の欠失を有し、該
欠失が該膜内外領域の該部分に対するＣ−末端であり、該断片がドメイン１２を
含まないもの、または（ｉｉ）ジフテリア毒素の断片Ｂの疎水性膜内外領域の少
なくとも一部分を含む断片であって、該ジフテリア毒素の該断片Ｂが天然ジフテ
リア毒素のアミノ酸残基３８６に対するＣ−末端にジフテリア毒素配列を含まな
いものを含む断片：（ｄ）スペーサー（以下に定義する）、および（ｅ）細胞特
異的ポリペプチドリガンドの一部分であって、該細胞特異的ポリペプチドリガン
ドが細胞増殖因子、好ましくはリンホカイン、例えば、インターロイキン２（Ｉ
Ｌ−２）またはインターロイキン４（ＩＬ−４）であるものを含むペプチド結合
によって一緒に結合した蛋白断片を含むキメラ毒素を特徴とする。細胞特異的ポ
リペプチドリガンドの該部分はポリペプチドリガンドの結合ドメインの少なくと
も一部分を含み、該結合ドメインの該部分はキメラ毒素を、該リガンドに対する
Ｔ−細胞またはＢ−細胞担持レセプターの如きリンパ球のような標的細胞に選択
的に結合させるのに有効である。
本明細書で使用する場合、細胞増殖因子は、哺乳動物の細胞にある細胞表面レセ
プターに結合し、細胞の増殖の原因となる蛋白を意味する。好ましい細胞増殖因
子は、リンホカイン類であり、すなわち、リンパ球に結合してその増殖を刺激す
る細胞増殖因子である。
好ましい具体例では、Ｄ Ａ Ｂ ３＋ｎは細胞毒性部分、すなわち上記（ａ）
、（ｂ）および（Ｃ）である。（ＤＡＢ３８Ｑは、メチオニン、それに続く天然
ＤＴの残基１−３８６、それに続く天然ＤＴの残基４８４および４８５からなる
。）ＤＡＢ３．、の構築は、本明細書に引用記載する、１９９０年３月２日出願
のＵＳＳＮ ４８８゜６０８に開示されている。
好ましい具体例としては、スペーサーが：少な（とも５個のアミノ酸長さ、好ま
しくは１０〜３０個のアミノ酸長さであり、ＤＴ断片ＤＡＢ４ｉｓ （ＤＡＢ４
８５はメチオニンに天然ＤＴの最初の４８４個のアミノ酸残基が続（ものからな
る）およびＩＬ−２のアミノ酸残基２−１３３の間にある場合、１．０００以上
、より好ましくは１．１２５以上、最も好ましくは１．１３５以上のＢ、。１．
値を有し：少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％の、リシン、セリン
、グリシン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、トレオニ
ン、アスパラギンまたはアルギニンからなる群からのアミノ酸からなり； 、Ａ
ｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ −８ｅｒ−５ｅｒ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−
Ｔｈｒ （以下、（１−１０）と記す）、Ｐｒ。
−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙ （以下、（１−７Ｇ１ｙ
）と記す）、Ｐｒ。
−Ｔｈｒ−８ｅｒ−３ｅｒ−８ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ （以下、（１−７Ｌｙｓ
）と記す）、またはそれらの多重体（多重体の数は、以下、肩文字で記す、例え
ば（１−１０）２と表し、これは（１−１０）サブユニットの２倍直列コピー（
２ｔａｎｄｅｍ ｃｏｐｉｅｓ）を示す）のいずれかと少なくとも６０％、好ま
しくは少なくとも８０％相同であり。
該キメラ毒素の標的細胞に対する親和性を、当該スペーサーを欠損している以外
は該キメラ毒素と同一である第２キメラ毒素の標的細胞に対する親和性よりも大
きくシ；あるいは、該キメラ毒素に、当該スペーサーを欠損している以外は該キ
メラ毒素と同一である第２キメラ同一によって示された標的細胞に対する細胞毒
性よりも少なくとも２倍大きい標的細胞に対する細胞毒性を示させるものが挙げ
られる。
本明細書で使用する場合、ジフテリア毒素または天然ジフテリア毒素は、コリネ
バクテリウム・ジフセリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅ
ｒｉａｅ）によって分泌されるジフテリア毒素蛋白の５３５アミノ酸残基成熟形
態を意味する。天然ジフテリア毒素をコードする遺伝子の対立遺伝子の配列は、
本明細書中に引用記載する、グリーンフィールド（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ）ら、
（１９８３）、プロシーデインゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ
イエンシズ・ニー・ニス・エイ（Ｐ ｒｏｅ、 Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ Ｓ Ａ）、８０ ： ６８５３−６８５７において
見られる。本明細書で使用する場合、酵素的に活性な断片Ａは天然ＤＴのアミノ
酸残基Ｇ１ｙｌ＝Ａｒｇ１９３、または該天然配列の酵素的に活性な誘導体また
は類似物を意味する。本明細書で使用する場合、切断ドメイン１．は天然ＤＴの
Ｃｙｓ１８６およびＣｙｓ２０１に及ぶ領域内のプロテアーゼ感受性ドメインを
意味する。本明細書で使用する場合、断片Ｂは天然ＤＴの５ｅｒ１９４〜５ｅｒ
５３５の領域を意味する。本明細書で使用する場合、断片Ｂの疎水性膜内外領域
または疎水性ドメインは、内在性膜蛋白（ｉｎｔｅｇｒａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ
ｐｒｏｔｅｉｎ）の二層−スパンニング螺旋と構造類似性を有しており、かつ
、天然ジフテリア毒素のアミノ酸残基３４６〜アミノ酸残基３７１にほぼ位置す
るか、またはそれらから誘導されるアミノ酸配列を意味する。本明細書で使用す
る場合、ドメイン１□は天然ＤＴのＣｙｓ４６１およびＣｙｓ４７１に及ぶ領域
を意味する。本明細書で使用する場合、断片Ｂの普遍性真核結合部位（ｇｅｎｅ
ｒａｌｉｚｅｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ５ｉｔｅ）は、ＤＴ
を真核細胞の表面上のその天然レセプターに結合させる原因となる天然ＤＴのＣ
−末端の５０個のアミノ酸残基内の領域を意味する。断片Ｂの普遍性真核結合部
位は本発明のキメラ毒素に含まれない。
本明細書で使用する場合、スペーサーは以下の特徴を１つ以上有するポリペプチ
ドである・（１）ジフテリア毒素断片ＤＡＢ４ｓｓの配列およびＩＬ−２のアミ
ノ酸残基２−１３３の間にある場合、１０００以上、好ましくは１．１２５以上
、最も好ましくは１１３５以上の正規化されたＢ値（Ｂ、。、。）（本明細書に
引用記載する、カープラス（Ｋａｒｐｌｕｓ）ら、（１９８５）、ナトウルヴイ
ーセンシャフテン（Ｎａｔｕｒｖｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ）、７２：２１２
の定義に従う）を有するアミノ酸残基を有する：（２）そのアミノ酸残基の少な
くとも６０％、好ましくは少なくとも８０％かりシン、セリン、グリシン、プロ
リン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、トレオニン、アスパラギン
またはアルギニンからなる群から選択される；（３）配列Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈ
ｒ−８ｅｒ−３ｅｒ−８ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒまたは該配列の
多重体を有する：（４）（３）で挙げた配列または該配列の多重体と少なくとも
６０％、好ましくは少なくとも８０％相同である。（５）配列Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−
３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙまたは該配列の多重体を有する；（６
Ｘ５）で挙げた配列または該配列の多重体と少なくとも６０％、好ましくは少な
くとも８０％相同である。（７）配列Ｐｒｏ−Ｔｈｒ −Ｓｅｒ −Ｓｅｒ −
５ｅｒ−Ｔｈｒ −Ｌｙｓまたは該配列の多重体を有する：または（８Ｘ７）で
挙げた配列または該配列の多重体と少なくとも６０％、好ましくは少な（とも８
０％相同である。
ポリペプチド配列中の残基のＢ、。１．値は、カープラスら（上記文献）の方法
（Ｂ、。、１法）を使用して、例えば、選択した蛋白配列の各々の箇所でアルフ
ァ炭素原子間のフレキンビリティを予想するＦＬＥＸＰＲＯ（インテリジェネテ
ィクス（Ｉ ｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）、マウンテン・ビ、−（ＣＡ））
のようなコンピュータープログラムを用いて決定することができる。ＦＬＥＸＰ
ＲＯは隣接アミノ酸におけるアルファ炭素原子の原子温度因子（Ｂ値またはデバ
イ−ワラ−（Ｄｅｂｙｅ−Ｗａｌｌｅｒ）因子とも称される）の平均値から、選
択したアミノ酸残基の鎖フレキンビリティを計算する。該Ｂ値は蛋白における該
原子のその平均位置からの平均平方置換である。フレキシブルな配置はそれらの
置換が大きくてもよいので、高いＢ値を有する。
ＦＬＥＸＰＲＯにおけるあるアミノ酸のＢ、。、１値は、その隣接するアミノ酸
のＢ、。、。値によって影響される。ＦＬＥＸＰＲＯによって計算されたあるア
ミノ酸の予想フレキシビリティは、該配列におけるその箇所に最も近い７個のア
ミノ酸のＢ７゜１．、値（近隣を考慮に入れる）の加重和である。ウエートは、
２個の最外アミノ酸については領２５；その次の２個については０．５；中央ア
ミノ酸に隣接する２個については０．７５；および中央アミノ酸自体については
１である。各アミノ酸について、該ウエートは、Ｂ７゜２．、値（近隣を考慮に
入れる）によって多重化される。アミノ酸配列をＦＬＥＸＰＲＯにインプットす
ると、該プログラムはＢ ５ｅｔｓ値を計算し、７−アミノ酸残基断片および該
７−アミノ酸残基断片の各々についてのピークＢ、。１．、値を表示する。
１未満の正規化されたＢ値は、硬性アミノ酸を示し、１よりも大きい値はフレキ
シブルなアミノ酸を示す。多（の蛋白の所見は、アラニン、バリン、ロイシン、
イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、システィン、メ
チオニンおよびヒスチジンのアミノ酸類が硬性の傾向があり、リジン、セリン、
グリシン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、トレオニン
、アスパラギン、およびアルギニンのアミノ酸類がフレキシブルの傾向があるこ
とを示唆している。（カープラスら（上記文献））。
スペーサーとして使用される配列は、例えば、それらが天然である否かに拘わら
ず、キメラ毒素を構築するのに使用されるポリペプチド類の１つから、他の天然
配列から、または合成配列からのようにいずれの供給源からも誘導され得る。
本発明は、また、蛋白断片をコードする領域を含む融合遺伝子によってコードさ
れるキメラ毒素、該キメラ毒素をコードするＤＮＡ配列、キメラ毒素をコードす
る該Ｄ Ｎ Ａ配列を含有する発現ベクター、該発現ベクターによって形質転換
される細胞、および該形質転換細胞を培養し、培養細胞または上清からキメラ毒
素を単離することを含むキメラ毒素を生産する方法を特徴とする。
本発明は、また、配列Ａｌａ −Ｐｒｏ−Ｔｈｒ −Ｓｅｒ −Ｓｅｒ −５ｅ
ｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ −Ｌｙｓ−Ｔｈｒまたは該１０残基サブユニツトの直列反
復体（スペーサーをコードするＤＮＡにおける官能性または二官能性１／２制限
酵素認識部位リンカ−配列の包含から生じる各端部（または直列反復体の個々の
サブユニット間）で１または２種類のさらなる残基を有するまたは有しない）を
有するスペーサーペプチド類、該スペーサーペプチド類（官能性または二官能性
１／２制限酵素認識部位りンカー配列を有するかまたは有しない）をコードする
ＤＮＡセグメント、これらのＤＮＡを含有するベクター、これらのベクターで形
質転換された細胞、および該形質転換細胞を培養し、該培養細胞または上清から
スペーサーを単離することを含むスペーサーペプチドを作製する方法を特徴とす
る。
好ましい具体例としては、スペーサーをコードするＤＮＡセグメントであって、
スペーサーがサブユニットＡｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−５ｅｒ−５ｅｒ−
Ｔｈｒ−Ｌｙｓ −ＬＹＳ−Ｔｈｒの直列反復体であり、該スペーサーにおける
サブユニ・ントの各存在をコードするＤＮＡ配列がスペーサーまたはキメラ毒素
におけるサブユニットの全ての他の存在をコードするＤＮＡ配列と非相同であり
、該非相同性が直列反復サブユニットをコードする配列間の組換えを防止するの
に充分であるＤＮＡセグメントが挙げられる。
本発明は、また、各サブユニットをコードするＤＮＡがすべての他のサブユニツ
トをコードするＤＮＡと非相同であるような各サブユニット−暗号配列のコドン
を選択することによってスペーサー−ペプチド−コード化ＤＮＡの直列反復サブ
ユニット間の組換えを防止する方法であって、該非相同性が直列反復サブユニツ
ト間の組換えを防止するのに充分である方法を特徴とする。
本発明は、また、スペーサー（官能性または二官能性１／２制限酵素認識部位リ
ンカ−配列を有するかまたは有しない）をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有す
る発現ベクター、該発現ベクターで形質転換された細胞、および該形質転換細胞
を培養し、該培養細胞または上清からスペーサーを単離することを含むスペーサ
ーを生産する方法を特徴とする。
本発明の分子は、キメラ毒素のリガンド部分が結合するレセプターを有する細胞
に対する改良された結合親和性および改良された細胞毒性を示す。自己免疫疾患
、同種異系移植片反応、および他のリンパ球依存性症状の管理において、インタ
ーロイキン（または他の増殖因子）レセプターを認識する細胞結合部分を使用す
るキメラ毒素は標的細胞の部位について固有のインターロイキン（または他の増
殖因子）と競合しなければならない。かくして、初期細胞結合工程の最適化は、
細胞結合部分がインターロイキンレセプターのようなリガンドを認識するキメラ
毒素において特に重大である。
本発明の他の特徴および長所は、以下に記載する好ましい具体例および請求の範
囲から明らかであろう。
好ましい具体例の記載
４、 Chimeric Toxins with Improved Interdomain Geometry Background of the Invention The present invention relates to the use of recombinant DNA technology to construct chimeric toxin molecules. The highly selective effects claimed by many hormones, toxins, and other biologically active proteins are due to the fact that such proteins contain more than one functionally distinct polypeptide.
This is possible to some extent because it has a domain. Some plant and bacterial toxins, for example, have evolved individual domains responsible for cell binding, membrane translocation, and intoxication. to the combination of properties conferred by various domain classes.
Thus, highly effective bioactive molecules are obtained. Diphtheria toxin (DT) is an example of a naturally occurring multidomain protein. DT has many
It consists of main classes, each of them confers a unique function, and all of them can be combined.
and produce highly active toxin molecules. DT can be characterized as follows, starting at the amino terminus of the molecule: a hydrophobic leader signal sequence S (amino acids Val-B-Ala-1); Nicotinia
Enzymatically active fragment A (amino acids G1y+Argus) containing a domain that catalyzes midadenine dinucleotide-dependent adenosine diphosphate (ADP) ribosylation: Protease-sensitive disulfide loop containing a cleavage domain 1. (a
Mino acid CVS+as Cys. 1); and fragment B (amino acids 5ern4-Sersss) containing the generalized binding domain flanking the translocation domain and the second disulfide loop (+2, amino acids C)'Sns+C)'S4t+). The process by which DT poisons susceptible eukaryotic cells includes at least the following steps: (1) binding domain of diphtheria toxin;
binds to specific setters on the surface of susceptible cells: (it) its receptors;
(ffi) or within the endocytotic vesicle, the toxin molecule binds to the 11 cleavage domain between fragments A and B. undergoes proteolytic cleavage. ()en
When the pH of the docytone vesicles drops below 6, the toxin naturally
inserted into the mucous membrane. (v) Once embedded in the membrane, the translocation domain of the toxin facilitates the egress of Fragment A into the cytosol; (vi) The catalytic activity remaining in the domain of Fragment A is responsible for the death of intoxicated cells. Cause. / Pseudomonas exotoxin A and possibly some other natural toxins.
The mechanism of cell death is very similar. Containing various functional domains (either polypeptide or non-peptide)
The therapeutic effects of human-produced toxin molecules have been recognized for many years. Paul E
Paul Ehrlich, Ehrlich (1906), Collek
Collected 5 studies on Immunity, 2: 442-447.
molecules (target or cell-binding domains) that have an affinity for
The most recent example suggests the construction of a bifunctional molecule with a cytotoxic domain (cytotoxic domain).
It is the first one. Since then, many biological and chemical moieties have been combined in various ways in an attempt to produce molecules that exhibit selective cytotoxicity, ie, targeted degrees of cytotoxicity. Early attempts were characterized by the conjugation of non-peptide toxins into soluble molecules or antibodies. More recently, the advent of molecular genetics has led to new
We have approved the engineering of a chimeric gene encoding a chimeric toxin protein. See, eg, Murphy, U.S. Patent No. 4.675.382. This is cited herein and includes the enzymatically active (toxin) domain of DT, the cleavage domain of DT, the translocation domain of DT, and the inducer from a second protein.
The present invention teaches the construction of hybrid proteins containing derived cell-specific binding domains. The hybrid proteins disclosed in the above Murphy article combine DT toxin domains that confer toxicity with domains from another protein, such as interleukin 2 (IL-2), that confer highly selective cell binding properties. It also has. Improvements in the inherent properties of the constituents, i.e. the use of more highly specific cell-binding agents, such as monoclonals, and the use of high potency toxins, such as plant or bacterial toxins, have been improved. This was the main route to toxin conjugates. Methods of conjugating cell-binding and cell-killing entities in bifunctional molecules have also been considered in attempts to improve the performance of these molecules. These attempts mainly
preserving the activity of key components, increasing solubility, and binding to cell-specific binding agents.
Increasing the proportion of cytotoxic agent combined or increasing the ease with which steps necessary in intoxication can be carried out, e.g. cleavage of the toxin domain from the remainder of the molecule.
It was aimed at Various spacer or linker members have been placed between conjugate-toxin domains (or non-peptide functional entities) in an attempt to realize the above advantages. Rovland et al. (1975), Nature, 255:487, describes the use of polymers as linkers between chemical toxins and antibodies.
The use of riglutamic acid (molecular weight = 35,000) directs the binding of toxins to antibodies.
It is reported that it is preferable to “By minimizing interference with the Ig chemical structure during this binding step,
Dugates are produced with high drug concentrations and without significant loss of antibody activity. ...The concept of linking cytotoxic agents to antibodies via inert intermediate carriers is open to future improvements, with the possibility of using different drugs, different carriers, and more purified antibody preparations. Provides a wide range of cancer chemotherapy treatments. ” Monsigny et al., (1980) FEBS Letters, 119:181, include spacers between drug and carrier.
conjugated to a carrier, such as an antibody, by insertion of a peptide with
It has been reported to maximize the activity of drugs such as unorubicin. The spacer arm, 2-(1-thioβ-D-glycopyranosyl)-ethanoyl-L-arg-L-1eu, is not activated by serum proteases but by lysosomal bronchitis.
can be cleaved by enzymes. “For technical reasons, and because the activity of the drug is partially or totally lost when substituted or chemically modified, we believe that the drug-carrier conjugate
Lysosomal proteases that are stable in the serum and direct free drug inside target cells
We devised a spacer that could be specifically cleaved by the enzyme. Arnon et al., (1982), Immunol Rev, 62:5, report the use of dextran to conjugate daunomycin to antibodies. "The reason for using this method was twofold. First, it would be expected to alter the amount of drug binding per antibody molecule, which should lead to higher cytotoxic activity. Second, it would reduce the amount of drug binding between drug and carrier. The use of macromolecules as spacer arms of the drug moiety on the surface of the conjugate can be used with less steric hindrance and, therefore, with higher potency.
We have demonstrated its advantages in allowing higher exposure. ”Truet et al. (1982), Brodinges of the National Academy of Sciences
Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 79:626-629 succinylated bovine serum albumin with a spacer arm of 1 to 4 amino acid residues in length.
reported that it binds to min (BSA). The purpose of the spacer arm was to cause lysosomal cleavage between drug and BSA molecules. Neville et al. (1989), JBC, 264:14653-14661, report that cleavable crosslinkers enhance the potency of DT-antigen conjugates by 3-10 times. The cross-linker is cleavable at acidic pH and is thus cleaved in the acidic compartment. The greater efficacy is likely dependent on enhanced intracellular toxin-toxin receptor interactions that induce greater translocation. The conjugate appears to be sterically hindered before, rather than after, the cleavage.
Ru. A non-peptide crosslinker, bis-maleimidoethyoxypropane, was used. Greenfield et al., PCT/US8510019 7, discuss toxicity and toxin-antibody complexes in which the antibody is linked by a spacer peptide.
A jugate body is disclosed. ``The present invention provides a number of molecules suitable for translocating cytotoxic fragments into target cells.
What, the ability to retain its bound fragments before such translocation, and
The toxin conjugates are designed to provide toxin conjugates that have the ability to solubilize and/or cytotoxic moieties. In one embodiment of the invention, the spacer is at the tip of the molecule.
The cytotoxic moiety is designed to have easy access to the cell membrane. This occurs when the typical antibody (binding) fragment size is much larger than that of most cytotoxic fragments.
This involves the toxic moieties imposed by the complete bulk of the antibody or antibody fragment.
There is considerable steric hindrance of access to the cell membrane due to ...To enable this translocation, the spacer must be sufficiently flexible to allow the A moiety to reach the cell membrane and sufficiently elongated to give it sufficient capacity.
In general, the present invention involves cleavage starting at the amino terminus of the chimeric toxin and sequentially flanking (a) enzymatically active fragment A of diphtheria toxin: (b) fragment A of diphtheria toxin. Domain 1. (c) (i) Fragment of diphtheria toxin A small portion of the hydrophobic transmembrane region of B; (ii) the hydrophobic transmembrane region of fragment B of diphtheria toxin; small number of
a fragment comprising at least a portion of said diphtheria toxin, said fragment B of said diphtheria toxin being a native diphtheria toxin;
does not contain a diphtheria toxin sequence at the C-terminus to amino acid residue 386 of ria toxin.
(d) a spacer (defined below); and (e) a cell-specific fragment.
a portion of a foreign polypeptide ligand, the cell-specific polypeptide ligand
chimeric toxins comprising protein fragments linked together by peptide bonds, the latter being a cell growth factor, preferably a lymphokine, such as interleukin 2 (IL-2) or interleukin 4 (IL-4). shall be. cell-specific ports
The portion of the polypeptide ligand comprises at least one of the binding domains of the polypeptide ligand.
The portion of the binding domain is effective to selectively bind the chimeric toxin to a target cell, such as a lymphocyte, such as a T-cell or B-cell bearing receptor for the ligand. As used herein, cell growth factors are cell surface receptors found on mammalian cells.
refers to a protein that binds to protein and causes cell proliferation. Preferred cell growth factor
The offspring are lymphokines, that is, they bind to lymphocytes and stimulate their proliferation.
It is a cell growth factor. In a preferred embodiment, D A B 3+n is a cytotoxic moiety, ie (a), (b) and (C) above. (DAB38Q consists of methionine followed by residues 1-386 of native DT followed by residues 484 and 485 of native DT.) DAB3. , is disclosed in USSN 488°608, filed March 2, 1990, incorporated herein by reference. In a preferred embodiment, the spacer is: small (both 5 amino acids long, preferably
The DT fragment DAB4is (DAB4 85 is a methionine followed by the first 484 amino acid residues of natural DT).
B of 1.000 or more, more preferably 1.125 or more, most preferably 1.135 or more when located between amino acid residues 2-133 of IL-2). 1. having the value of: at least 60%, preferably at least 80% of lysine, serine, glycine, proline, aspartic acid, glutamic acid, glutamine, threonine.
, Ala-Pro-Thr-8er-5er-5er-Thr-Lys-Lys-Thr (hereinafter referred to as (1-10)), Pr. -Lys-5er-Gly-Thr-Gin-Gly (hereinafter referred to as (1-7G1y)), Pr. -Thr-8er-3er-8er-Thr-Lys (hereinafter referred to as (1-7Lys)), or a multiplex thereof (the number of multiplexes is hereinafter referred to as superscripts, e.g.
(1-10)2, which indicates 2-fold tandem copies of the (1-10) subunit) and at least 60%, preferably
or at least 80% homologous. The chimeric toxin has an affinity for the target cell that is greater than the affinity for the target cell of a second chimeric toxin that is identical to the chimeric toxin but lacks the spacer.
or, the chimeric toxin except for lacking the spacer.
Cytotoxicity against target cells exhibited by a second chimera that is identical to Melatoxin
Examples include those that exhibit cytotoxicity against target cells that is at least twice as great as that of the target cell. As used herein, diphtheria toxin or native diphtheria toxin is the 535 amino acid residue mature form of the diphtheria toxin protein secreted by Corynebacterium diphtheriae.
means the state of The sequences of alleles of the gene encoding natural diphtheria toxin are described in Greenfield et al. (1983), Proceedings of the National Academy of Sciences, incorporated herein by reference.
See in Proe, Natl. Acad, Sci, USA, 80: 6853-6857. As used herein, enzymatically active fragment A is the amino acid of natural DT.
acid residue G1yl=Arg193, or an enzymatically active derivative of the native sequence or
means similar. As used herein, cleavage domain 1. refers to the protease-sensitive domain within the region spanning Cys186 and Cys201 of native DT. As used herein, fragment B refers to the region 5er194 to 5er535 of native DT. As used herein, the hydrophobic transmembrane region or hydrophobic domain of fragment B has structural similarity to the bilayer-spanning helix of an integral membrane protein, and Located approximately between amino acid residues 346 and 371 of natural diphtheria toxin.
or an amino acid sequence derived therefrom. As used herein
In this case, domain 1 refers to the region spanning Cys461 and Cys471 of the native DT. As used herein, the genericized eukaryotic binding 5ite of Fragment B refers to the C-terminus of native DT that is responsible for binding DT to its natural receptor on the surface of eukaryotic cells. means a region within 50 amino acid residues of Universal eukaryotic junction of fragment B
are not included in the chimeric toxins of the present invention. As used herein, a spacer is a polypeptide having one or more of the following characteristics:
(1) Sequence of diphtheria toxin fragment DAB4ss and amino acid of IL-2
between amino acid residues 2-133, a normalized B value (B,.,.) of 1000 or more, preferably 1.125 or more, most preferably 1135 or more (as cited herein , Karplus et al. (1985), Natourvi
-According to the definition of Naturvissenschaften, 72:212): (2) having a small number of that amino acid residue;
At least 60%, preferably at least 80% of glycine, serine, glycine, protein
selected from the group consisting of phosphorus, aspartic acid, glutamic acid, glutamine, threonine, asparagine or arginine; (3) the sequence Ala-Pro-Th r-8er-3er-8er-Thr-Lys-Lys-Thr or Having a multiplex: (4) At least 60%, preferably at least 80% homologous to the sequence listed in (3) or a multiplex of said sequence. (5) having the sequence Pro-Lys-3er-Gly-Thr-Gin-Gly or a multiplex of said sequence; at least 60%, preferably less than the sequence listed in (6 X5) or a multiplex of said sequence;
They are at least 80% homologous. (7) having the sequence Pro-Thr -Ser-Ser-5er-Thr-Lys or a multiplex of said sequence: or having at least 60%, preferably less than (both 80% homology.B,.1 values of residues in a polypeptide sequence can be calculated using the method of Karplus et al. alpha at each location in the array
FLEXPRO (Intelligenete) predicts flexinability between carbon atoms.
It can be determined using a computer program such as Intelligenetics, Mt. FLEXP RO is the atomic temperature factor (B value or device) of the alpha carbon atom in adjacent amino acids.
From the average value of the Debye-Waller factor),
Calculate the chain flexibility of the selected amino acid residue. The B value is the mean square displacement of the atom from its average position in the protein. Flexible arrangements have high B values because their displacements may be large. B of certain amino acids in FLEXPRO. , 1 value is B of the adjacent amino acid. ,. Affected by value. A certain algorithm calculated by FLEXPRO
The expected flexibility of a amino acid is the seven amino acids closest to that point in the sequence.
B7゜1 of amino acids. , is a weighted sum of values (taking into account the neighborhood). The weights are region 25 for the two outermost amino acids; 0.5 for the next two;
0.75 for the two flanking amino acids; and 1 for the central amino acid itself. For each amino acid, the weight is B7°2. , multiplexed by value (taking into account the neighborhood). Input the amino acid sequence into FLEXPRO
The program then calculates the B5ets values for the 7-amino acid residue fragment and the peak B for each of the 7-amino acid residue fragments. 1. , display the value. A normalized B value less than 1 indicates a rigid amino acid and a value greater than 1 indicates a flexible amino acid.
Indicates a simple amino acid. Protein findings include alanine, valine, leucine, isoleucine, tyrosine, phenylalanine, tryptophan, cysteine, and methane.
The amino acids thionine and histidine tend to be rigid, while the amino acids lysine, serine, glycine, proline, aspartic acid, glutamic acid, glutamine, threonine, asparagine, and arginine tend to be flexible.
It suggests that. (Karplus et al. (cited above)). The sequences used as spacers can be derived, for example, from one of the polypeptides used to construct the chimeric toxin, whether they are natural or not, from other natural sequences, or from synthetic sequences. may be derived from any source. The present invention also provides a protein fragment encoded by a fusion gene comprising a region encoding a protein fragment.
a chimeric toxin, a DNA sequence encoding the chimeric toxin, a chimeric toxin encoding the chimeric toxin;
An expression vector containing the DNA sequence, a cell transformed by the expression vector, and the transformed cell are cultured, and the chimeric toxin is extracted from the cultured cells or supernatant.
A method of producing a chimeric toxin includes isolating a chimeric toxin. The present invention also provides the sequence Ala-Pro-Thr-Ser-Ser-5er-Thr-Lys-Lys-Thr or the serial inverse of said 10 residue subunits.
reconstitution (functional or bifunctional 1/2 restriction enzyme recognition site in the DNA encoding the spacer) at each end (or between individual subunits of a tandem repeat) resulting from the inclusion of an enzyme recognition site linker sequence. DNA segments encoding said spacer peptides (with or without a functional or bifunctional 1/2 restriction enzyme recognition site linker sequence); vectors containing the DNA of
A transformed cell, and a method for producing a spacer peptide comprising culturing the transformed cell and isolating a spacer from the cultured cell or supernatant.
Ru. A preferred embodiment is a DNA segment encoding a spacer, wherein the spacer is a tandem repeat of the subunit Ala-Pro-Thr-Ser-5er-5er-Thr-Lys-LYS-Thr; - the DNA sequence encoding each occurrence of the subunit is non-homologous to the DNA sequence encoding every other occurrence of the subunit in the spacer or chimeric toxin, and the non-homology results in a pairing between sequences encoding tandemly repeated subunits; Includes a DNA segment that is sufficient to prevent replacement. The present invention also provides that the DNA encoding each subunit is unique to all other subunits.
A method for preventing recombination between tandem repeat subunits of spacer-peptide-encoding DNA by selecting codons in each subunit-coding sequence to be non-homologous to DNA encoding said non-peptide. Homology with serially repeated subunits
The invention is characterized by a method that is sufficient to prevent recombination between cells. The present invention also provides a spacer (functional or bifunctional 1/2 restriction enzyme recognition site linker).
(with or without a linker sequence);
an expression vector comprising an expression vector, a cell transformed with the expression vector, and a spacer comprising culturing the transformed cell and isolating the spacer from the cultured cell or supernatant.
The invention is characterized by a method for producing. The molecules of the invention exhibit improved binding affinity and improved cytotoxicity to cells that have receptors to which the ligand portion of the chimeric toxin binds. In the management of autoimmune diseases, allograft reactions, and other lymphocyte-dependent conditions,
– using cell-binding moieties that recognize leukin (or other growth factor) receptors
chimeric toxins contain specific interleukins (or other
reproductive factors). Thus, optimization of the initial cell binding step is particularly critical for chimeric toxins in which the cell binding moiety recognizes a ligand such as an interleukin receptor. Other features and advantages of the invention are described below in the preferred embodiments and claims.
It should be clear from the surroundings. Description of preferred specific examples 4.
【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]
図面
第１図はＤＴ分子および種々の融合蛋白の線図である。
第２図は好ましい具体例のプラスミド類の構築の模式図である。
改良されたドメイン間幾何を有するキメラ毒素の構造および合成りＡＢ４Ｈ（１
１０）−ＩＬ−２は、以下の順序で、Ｍｅｔ ；成熟天然ＤＴのアミノ酸残基１
〜Ｈｉｓ”’： Ｇｌｙ；アミノ酸残基Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−５ｅ
ｒ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ（（１−１０）と称する；Ｈｉｓ
：成熟天然ＤＴのＡｌａ４ｇ！、およびＩＬ−２のアミノ酸残基２〜１３３から
なるキメラ毒素ポリペプチドである。キメラ毒素ＤＡ８４ｍｓ−（１１０） Ｉ
Ｌ−２のＤＴ部分は、ＤＴ断片Ａの全ておよび成熟天然ＤＴの残基４８５に延長
するＤＴ断片Ｂの一部分を含む。ＤＴの構造に関する第１図ａを参照。第１図す
はＤＡ８４ｍｓ−Ｉ Ｌ−２の構造を示す。第１図すにおいて、幅広い棒は、融
合蛋白を示し、細い連結線は欠失を表し、棒上の数字はＤＡＢ命名法（以下に記
載する）におけるアミノ酸残基番号であり、棒の下の数字は天然ＤＴのアミノ酸
残基ナンバリングに対応し、クロスハツチングは両親媒性領域を示し、暗くした
部分は膜内外領域と対応し、ＩＬ−２−２−１３３はＩＬ−２のアミノ酸残基２
−１３３を示し、Ａ１ａ＝アラニン、Ａｓｎ＝アスパラギン、Ａｓｐ＝アスパラ
ギン酸、Ｃｙｓ＝７ステイン、Ｇ１ｙ＝グリシン、Ｈｉｓ＝ヒスチジン、Ｉ １
ｅ＝イソロイシン、Ｍｅｔ＝メチオニン、Ｔｈｒ＝トレオニン、Ｔｙｒ＝チロシ
ンおよびＶａｌ＝バリンである。（ＤＴ−ＩＬ−２毒素について採用された命名
法は、ＤＡＢ＋ｓｓ （１１０） ＩＬ ２によって説明され、ここで、Ｄはジ
フテリア毒素を示し、ＡおよびＢはこれらのＤＴ断片に関する野生型配列を示し
、かっこに入っている数字はスペーサーポリペプチドを表し、ＩＬ−２は成熟ヒ
トインターロイキン−２配列を示す。下付き数字は融合蛋白におけるＤＴ関連ア
ミノ酸の数を示し、その最後はスペーサーのＣ−末端にあり、そこで該スペーサ
ーが挿入される。ＤＴの最後の２つのコドンが１／２５ｐｈＩ部位としての機能
も果すことに注意する。ｔａｘシグナル配列の欠失およびｔｒｃプロモーターか
らの発現がメチオニン残基のＮ−末端への付加を生じるので、ＤＡＢ−ＩＬ−２
融合毒素のナンバリングは天然ジフテリア毒素のものを有する相の外に＋１であ
る）。
ＤＡＢ＜ａｓ （１１０） ＩＬ ２は、ＤＡＢ４ａｓ ＩＬ ２から構築した
。ＤＡＢ４１１６ １Ｌ−２を担持するｐＤＷ２４は、以下のとおり構築した。
ｐＵｃ１８にュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂ
ｉｏＬａｂｓ））をＰｓｔＩおよびＢｇｌＩで消化し、複製のイー・コリ（Ｅ、
ｃｏｌｉ）起源、ポリリンカー領域、およびβ−ラクタマーゼ遺伝子（ａｍｐ
’ ）の３°部分を担持するＰｓｔｌ−ＢｇｌＩ断片を回収した。プラスミドｐ
ＫＫ−２３３−２（ファルマンア（Ｐ ｈａｒｍａｃｉａ） ）をＰｓｔＩおよ
びＢｇｌＩで消化し、２つの転写ターミネータ−およびβ−ラクタマーゼ遺伝子
の５°部分を担持するＰｓｔＩ−ＢｇｌＩ断片を回収した。これらの２つの回収
した断片を一緒に連結することによってｐＤＷ２２を構築した。
プラスミドｐＤＷ１５からヒトＩＬ−２をコードするＢａｍＨＩ−３ａｌＩ断片
を単離しくウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）ら、（１’９８８）、ヌークリイ
ンク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、）、１６
：１０４５３−１０４６７）、ＢａｍＨＩ／５ａｉｌ消化ｐＤＷ２２（上記に記
載）にそれを連結することによってｐＤＷ２３を構築した。
ｐＤＷ２４を以下のとおり構築した。ｔｒｃプロモーターおよび翻訳開始コドン
（ＡＴＧ）を担持しているＢａｍＨＩ−ＮｃｏＩ断片をプラスミドｐＫＫ２３３
−２（ファルマシア）から単離した。５ｐｈＩおよびＨａｅＩ［でｐＡＢｃ５０
８（ウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）ら、（１９８７）、蛋白工学（Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、１ ： ４９３−４９８）を消化し、ＤＴ
のアミノ酸残基１〜４８５をコードしている配列を含有するＨａｅｎ−８ｐｈＩ
断片を回収することによって、ＤＴのアミノ酸残基１〜４８５をコードしている
ＤＮＡ配列を得た。該Ｈａｅｎ−３ｐｈＩ断片にＮｃｏＩ／ＨａｅＩＩリンカ−
（５°ＣＣＡＴＧＧＧＣＧＣ３’）を連結し、次いで、該構築物を、予め単離し
たｔｒｃプロモーターを担持するＢａｍＨＩ−ＮｃｏＩ断片に連結した。この結
果、以下の順序で、ｔｒｃプロモーター、ＮｃｏＩ部位（ＭｅｔにＡＴＧ開始コ
ドンを供給する）、および天然ＤＴの残基１〜４８５をコードする配列を有する
ＢａｍＨＩ−５ｐｈＩ断片を生じる。この断片を、１３ａｍＨＩおよび５ｐｈｘ
で消化したｐＤＷ２３に挿入した。得られたプラスミドをｐＤＷ２４と称した。
ｐＤＷ２４を第２図に示す。ＤＡＢ４ａｓ Ｉ Ｌ−２に対応する挿入を太線で
示す。第２図において、黒塗り円はＮｃｏＩ部位を示し、白抜き円はＮｓｉ Ｉ
部位を示し、白抜き菱形はＣｌａＩ部位を示し、黒塗り正方形はＨｐａＩＩ部位
を示し、白抜き正方形は５ｐｈＩ部位を示し、黒塗り三角形は５ａｌＩ部位を示
す。ｐＤＷ２４によってコード化された融合蛋白（ＤＡＢ４ｓｓ Ｉ Ｌ ２）
は廿Ｃプロモーターから発現され、ヒトＩＬ−２のアミノ酸２〜１３３に融合し
たＭｅｔ、次いで、成熟ＤＴのアミノ酸１〜４８５からなる。
ポリペプチドスペーサー、（１−１０）をコードしているＤＮＡを合成し、ｐＤ
Ｗ２４に挿入した。ｐＤＷ２４をＤＴ配列の３°末端の５ｐｈＩ部位で切断し、
スペーサー（またはその多重体）をコードしている合成配列を挿入した。該（１
−１０）スペーサーの１．２および３倍コピーをコードしている合成配列の配列
を第１表に示す。
第１表： スペーサー配列
ＣＴ ＣＣＧ ＡＣＣＡＧＣＴＣＴ ＡＧＣＡＣＴ ＡＡＡ ＡＡＧ ＡＣＴ
ＣＡＴ Ｇ２、ｃｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔ
ｈｒ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｔｈｒ −ＧＴ ＧＣＡ ＣＣＧ ＡＣＴ ＡＧＣＡＧ
ＣＴＣＴ ＡＣＴ ＡＡＧ ＡＡＡ ＡＣＡ−＾１ａ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ
Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｔｈｒ ＨｉｓＧＣＴ ＣＣＴ
ＡＣＣＴＣＴ ＴＣＴ ＡＧＣＡＣＧ ＡＡＧ ＡＡＧ ＡＣＧ ＣＡＴ Ｇ３
、 Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌ
ｙｓ Ｌｙｓ Ｔｈｒ −ＧＴ ＧＣＡ ＣＣＧ ＡＣＴ ＡＧＣＡＧＣＴＣＴ
ＡＣＴ ＡＡＧ ＡＡＡ ＡＣＡ−＾１ａ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ
Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ａｌａ−ＧＣＴ ＣＣＴ
ＡＣＣＴＣＴ ＴＣＴ ＡＧＣＡＣＧ ＡＡＧ ＡＡＧ ＡＣＧ ＣＡＴ Ｇ
ＣＴ−ＣＧＡ ＧＧＡ ＴＧＧ ＡＣＡ ＡＣＡ ＴＣＧ ＴＧＣＴＴＣＴＴＣ
ＴＧＣＧＴＡ ＣＧＡ−官能性５ｐｈＩ部位
２３ ２４ ２５ ２６ ２７ ２ｇ ２９ ３０ ３１ ３２Ｐｒｏ Ｔｈｒ
Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｔｈｒ １ｌｉｓＣＣＧ
ＡＣＣＡＧＣＴＣＴ ＡＧＣＡＣＴ ＡＡＡ ＡＡＧ ＡＣＴ ＣＡＴ Ｇ１
／２ Ｓｐｈ■部位にアニーリングできる４−塩基延長は、各スペーサー配列を
コードしているＤＮＡ断片のいずれの末端にも存在する。各スペーサーにおいて
、コドン置換は、５ｐｈＩ部位を１つだけ再生するようにこれらの５ｐｈＩ認識
部位の１つを破壊する。第１表、配列１に関して、第１０コドンの３位における
Ｇの代わりのＴの使用は、スペーサーの３°末端で５ｐｈＩ部位の発生を防止す
る。
配列２では、Ｇ１ｙコドンの２位におけるＣの代わりのＧの使用はスペーサーの
５°末端で５ｐｈＩ部位の発生を防止する。配列３は、配列１の５′末端で官能
性５ｐｈＩ部位を維持し、その部位で配列２のスペーサーを連結し、配列２のス
ペーサーの３°に再生５ｐｈｒ部位を残し、配列３のスペーサーのいずれの末端
にも二官能性５ｐｈｒ部位を残すことによって作製される。
かくして、第１表からの配列１の、ＤＡＢ４８６− Ｉ Ｌ ２またはＤＡＢ３
．、−ＩＬ−２の５ｐｈＩ部位への挿入は以下のスプライス／ジャンクション：
天然ＤＴのＨｉｓ”’残基： Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−３ｅｒ−８ｅ
ｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ；３°延長によってコードされたＨｉｓ残
基、天然ＤＴのＡｌａ”’：およびＩＬ−２配列の第２アミノ酸を有する融合蛋
白を生じる。
第１表からの配列２の、ＤＡＢ４８６ ＩＬ−２またはＤＡＢ３゜−ＩＬ−２の
５ｐｈＩ部位への挿入は以下のスプライス／ジャンクション：天然ＤＴのＨｉｓ
”’；オリゴヌクレチドの５゛末端で３′延長から誘導されたＧ１ｙ残基； 、
Ａｌａ −Ｐｒｏ −Ｔｈｒ −Ｓ ｅｒ −Ｓｅｒ −Ｓ ｅｒ −Ｔｈｒ
−Ｌｙｓ −Ｌｙｓ −Ｔｈｒ −Ａｌａ −Ｐ ｒｏ −Ｔｈｒ −Ｓｅｒ
−・５ｅｒ−８ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ： ３’延長によってコ
ードされたＨｉｓ残基；天然ＤＴのＡ１ａ４８５．およびＩＬ−２配列の第２ア
ミノ酸を有する融合蛋白を生じる。
第１表からの配列３の、ＤＡＢ４８６ ＩＬ−２またはＤＡＢｓａｓ Ｉ Ｌ−
２の５ｐｈＩ部位への挿入は以下のスプライス／ジャンクンコン：天然ＤＴのＨ
１Ｓ４８４残基：オリゴヌクレチドの５゛末端で３゛延長から誘導されたＧ１ｙ
残基；Ａｌａ−Ｐ ｒｏ −Ｔｈｒ −Ｓｅｒ −Ｓｅｒ −Ｓｅｒ −Ｔｈｒ
−Ｌ ｙｓ −Ｌ ｙｓ −Ｔｈｒ −Ａｌａ −Ｐ ｒｏ −Ｔｈｒ |
３ｅｒ −Ｓｅｒ −Ｓｅｒ −Ｔｈｒ −Ｌｙｓ −Ｌｙｓ −Ｔｈｒ −Ｈ
ｉｓ −Ａｌａ −Ｐｒｏ −Ｔｈｒ −Ｓｅｔ −５ｅｒ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−
Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ； ３°延長によってコードされたＨｉｓ残基。
天然ＤＴのＡ１８４８３．およびＩＬ−２配列の第２アミノ酸を有する融合蛋白
を生じる。３つのサブユニットを、イン・ビトロで配列１および２を連結するこ
とによって付加して配列３を得てもよく、次いで、これをキメラ毒素に挿入する
か、あるいは、配列２にあるキメラ毒素の５ｐｈＩ部位に配列１を挿入してもよ
い。
各々、（１−１０）の２倍および３倍コピーをコードする第１表からの配列２ま
たは３の挿入は類似構造を生じる。（１−１０）配列の反復体が存在する場合、
逐次的（１−１０）暗号配列間のＤＮＡホモロジーを最小にするようなコドンが
選択される。これは、（１−１０）コード化ＤＮＡの逐次的コピー間の相同性組
換えから生じると思われる再配列を防止する。
ｃｔｙおよびＨｉｓ残基（スペーサー配列の各末端でリンカ−によってコードさ
れた）の存在は、リンカ−のＢ、。、１値に影響を及ぼさない（データは示さな
い）。
ＤＡＢ４ｓｓ ｒＬ−２の配列にＦＬＥＸＰＲＯプログラム（上記）を適用する
ことによって、（１−１０）スペーサー配列を同定した。第２表はＦＬＥＸＰＲ
Ｏによって決定されたＤＡＢａａａ ＩＬ２における１０個の最もフレキシブル
な７−アミノ酸セグメントを示す。
融合蛋白の最もフレキシブルな７アミノ酸伸張がＢ、。２、値１．１３５を有す
るＤＡＢ４ｓｇ ＩＬ ２のアミノ酸残基４８７〜４９３であることが判明した
。こわらの７個のアミノ酸はＩＬ−２のアミノ酸残基２−８と一致する。これら
の７個のアミノ酸はＤＡＢｓａｓ ＩＬ−２およびＤＡＢｚｓｓ Ｉ Ｌ−２（
試験した他のＤＴキメラ毒素の毒性特徴を完全に欠いている分子）にある最もフ
レキシブルなものでもあった。ＩＬ−２の最初の１０個のアミノ酸残基は結晶中
の規則的な配列を形成しないことが知られており（ブランドツバ−（Ｂ ｒａｎ
ｄｈｕｂｅｒ）、（１９８７）、サイエンス（Ｓ ｃｉｅｎｃｅ）、２３８ ：
１７０７−１７０９）、か（して、フレキシブルであるので、ＩＬ−２の全体の
最初の１０個のアミノ酸残基を（１−１０）スペーサーとして使用した。ＤＢＡ
４８６ １ Ｌ−２に挿入すると、第３表に示すとおり、（１−１０）スペーサ
ーは新しい構築の最もフレキシブルな配列である。
第３表：
ＤＡＢａａａ ＩＬ ２からＤＡＢｓｓｅ （１１０） ＩＬ ２をｔｌｌｌ’
ａした。ＤＡＢ３＋＋ｅ ＩＬ−２ハ、ｐＤＷ２４カラ３０９ ｂ ｐ Ｈｐａ
ＩＩ−８ｐｈＩ制ｆｆｌ断片ヲ除去し、それをオリゴヌクレオチドリンカー２６
１／２７４ （第４表）と置換してプラスミドｐＤＷ２７を得ることによって構
築された（第１図）。
第４表・オリゴヌクレオチドリンカー
このリンカ−は、Ｐｒｏ３８３からＴｈｒ３８７の断片Ｂ配列を修復し、この位
置でＩＬ−２配列にイン−フレーム融合させる。がくして、ＤＡＢａａａ ＩＬ
−２において、Ｔｈｒ３８７およびＨｉｓ４８５間の９７個のアミノ酸を欠失し
た。
上記のとおり、スペーサー（第１表を参照）をコードしているＤＮＡを５ｐｈＩ
部位ＴｐＤＷ２７１：挿入する。：、 とｌ：よっｒＤＡＢｓｇｅ （１１０）
ＩＬ−２を構築した。ＤＡＢｓａｓ （１１０）−１Ｌ ２は、３０９ｂｐ
ＨｐａＩ［−５ｐｈＩ断片の除去およびそれをＰｒｏ３８３からＴｈｒ３８７の
断片Ｂ配列を修復するリンカ−と置換することによってｐＤＷ２４（ＤＡＢ４１
６−ＩＬ−２）から直接得られてもよ（、該ポリペプチドリンカ−をコードし、
該ＩＬ−２配列にイン−フレーム融合させる。
ＤＴの配列はグリーンフィールド（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ）ら、（１９８３）、
プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・ニ
ー・ニス・エイ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、８０ ：
６８５３−６８５７に開示されている。ＩＬ−２をコードする配列は、本明細
書に引用記載する、ウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）ら、（１９８８）、ヌー
クリイック・アシッズ・リサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ、）、１
６ ： １０４５３−１０４６７ｉ：、開示されティルアフライト・バイオシス
テムズ・ディエヌエイ・ンンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ ＤＮＡ −Ｓ ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）で合成された。ＩＬ−２の配列はウ
ィリアムスら（１９８８）ヌークリイック・アシッズ・リサーチ、１６ ：１０
４５３−１０４６７に開示されている。オリゴヌクレオチドリンカーを使用する
成熟ＤＴをコードしている配列のＡＴＧへの融合は、本明細書に引用記載する、
ビシャイ（Ｂｉｓｈａｉ）ら、（１９８７）、ジャーナル・オブ・バクテリオロ
ジー（Ｊ、Ｂａｃｔ、）、１６９：５１４０−５１５１に開示されている。
ＤＴ断片をスペーサーの存在下または不在下でネズミ・インターロイキン４（Ｉ
Ｌ−４）に融合したキメラ毒素も構築した。当業者に公知の方法によって、ＤＡ
Ｂ４ａａ−ＩＬ−４、ＤＡＢ３゜−ＩＬ−４およびＤＡＢ３８１１ （１−１０
）”−ＩＬ−４を構築した。すなわち、まず、ＤＡＢａａａ−（１１０）” Ｉ
Ｌ ２融合物（ｐＤＷ２７から誘導）を含有するプラスミドを５ｐｈＩおよび
）（ｉｎｄｍで消化してＩＬ−２暗号配列を除去し、次いで、ＩＬ−４をコード
するＤＮＡのセグメントを挿入することによってＤＡＢｘｓｅ （１−１０）！
Ｉ Ｌ ４を構築した。ＩＬ−４コ一ド化断片は、スペーサーコード化ＤＮＡの
３゛末端への挿入およびイン−フレーム融合をさせるリンカ−を含む。ＤＡＢ４
８６ １Ｌ−４およびＤＡＢ３゜−Ｉ Ｌ−４は、各々、ｐＤＷ２４およびｐＤ
Ｗ２７の類似処理によって作製された。ネズミＩＬ−４の配列は、本明細書に引
用記載する、シー（Ｌｅｅ）ら、（１，９８６）、プロシーディンゲス・オブ・
ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・ニー・ニスーｚイ（Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ Ｓ Ａ）、８３ ＋ ２０６１−２
０６５に開示されている。これらの構築に使用した配列はＤＮＡＸ（カリフォル
ニア）から入手した。
オリゴヌクレオチドおよび核酸を以下のとおり合成および操作した。アプライド
・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）３８０ Ａ Ｄ
ＮＡシンセサイザー（アプライド・バイオシステムズ・インコーホレイテッド（
Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩ ｎｃ、 ）、カリフォルニア州フォ
スター・シティ）でシアノエチルホスホルアミダイト化学を使用して、オリゴヌ
クレオチドを合成した。合成の後、オリゴヌクレオチドを、製造者による指示に
従って、オリゴヌクレオチド・ビューリフイケーシコン・カートリッジ（Ｏｌｉ
ｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ
Ｘアプライド・バイオシステムズ・インコーホレイテッド、カリフォルニア州フ
ォスター・シティ）上でクロマトグラフィーによって精製した。精製したオリゴ
ヌクレオチドをＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、ＩｇＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ
８，０）に再懸濁した。
相補鎖をアニールするために、等モル濃度の各鎖を１００＋＋Ｍ ＮａＣ１の存
在下で混合し、９０℃に１０分間加熱し、ゆっくりと室温に冷却させた。
プラスミドＤＮＡを、アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、［（１９８９）、カー
レント・プロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ ｉｏｌｏｇｙ）、ジョン・
ウィリー・アンド・サンズ（Ｊ ｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆５ｏｎｓ）、ニューヨ
ークコのアルカリ性溶解／塩化セシウム勾配法によって精製した。ＤＮＡを、製
造者にニュー・イングランド・バイオロジー（Ｎｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＢ １ｏ
ｌａｂｓ）、マサチューセッツ州ビバリーおよびベセスダ・リサーチ・ラボラト
リーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、
メリーランド州ゲイザースバーグ）によって推奨されるように制限エンドヌクレ
アーゼで消化した。アガロース−ＴＢＥゲルからプラスミド構築のための制限断
片を抽出し、−緒に連結しくオリゴヌクレオチドリンカーの存在下または不在下
で）、標準的な方法を使用してイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）を形質転換するのに
使用した。アウスベルら、（１９８９）、上記文献およびマニアティス（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ）ら、（１９８２）、モレキュラー・クローニング・ラボラトリ−”
マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａ
ｎｕａｌ）、コールド・スプリングｅハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング・”
ｚ＜−（Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ）、ニューヨークを参照。プラス
ミドＤＮＡ配列決定は、シークエナーゼ（ユナイテッド・スティン・バイオロジ
カルズ（Ｕｎｉｔｅｄ ５ｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅ＋ａｉｃａｌｓ）、オハイ
オ州クリーブランド）を使用して、クラフト（Ｋｒａｆｔ）ら、（１９８８）、
ノくイオ・テクニクス（Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、６：５４４−５４７
によって変形されたサンが−（Ｓ ａｎｇｅｒ）ら、（１９８７）、プロシーデ
ィンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・ニー・ニス・
エイ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
ＵＳＡ）７４ ： ５４６３−５４６７のジデオキシ鎖読み終わり法（ｄｉｏｘ
ｙ ｃｈａｉｎｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）に従って行った。
キメラ毒素の発現および精製
キメラ毒素の発現および精製は以下の通りであった。ここで使用する全てのＤＴ
−関連ＩＬ−２融合蛋白は、ｔｒｃプロモーターからのイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌ
ｉ）菌株ＪＭＩＯＩの細胞質中で発現された［本明細書に引用記載する、アマン
（Ａ＋ａｎｎ）ら、（１９８５）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、４０ ＋ １８３−１
９０１ 、組換えイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）を、マイクロゲン・ファーメンタ
−（Ｍｉｃｒｏｇｅｎ Ｆ ｅｒｍｅｎｔｏｒ） ［二ニー・プランスヴイック
・サイエンクティフイク（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｖｉｃｋ ５ｃｉｅｎｃｔｉｆｉ
ｃ）、ニュー・シャーシー州エディソン］中、１０１容量で、１０菖ｇ／ｍｌカ
サミノ酸［ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）、ミシガン州デトロイトコ、５０μｇ／諺ｌ
アンピシリンおよび０．５％ｇ／ｍｌｆミンを補足したＭ９最小培地［マニアテ
イス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、（１９８２）上記文献］中で増殖させた。細菌培
養物を３０℃で増殖し、５１／分で空気を散布した。培養物の吸光度（Ａｓ。。
ｎｍ）が０．３に達した時、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドの
添加によってキメラｔａｘ遺伝子の発現が誘発された。誘発の２時間後、遠心に
よって細菌を収穫し、緩衝液＃１１０１（ＤＯＩ ＫＨ２ＰＯ４，１０１Ｍ Ｅ
ＤＴＡ、７５０ｍＭ ＮａＣ１，０，１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８，０）中に再
懸濁し、音波処理（ブランソン・ソニファ−（Ｂｒａｎｓｏｎ ５ｏｎｉｆｉｅ
ｒ）によって溶解した。全細胞およびデブリを、２７．ＯＯＯｘｇでの遠心によ
って除去し、次いで、清澄抽出液をフィルター滅菌し、抗ジフテリア毒素イムノ
アフィニティカラムに適用した。結合した蛋白を４Ｍグアニジン・塩酸塩で溶離
し、β−メルカプトエタノールの添加によって１％に低下させ、次いで、７．５
ｘ６００ｍｍ Ｇ４０ｏｏｐｗカラム（トーソーハース（ＴｏｓｏＨａｓｓ））
上で高速液体クロマトグラフィーによって大きさによって分類した。使用前に、
融合毒素をＨＥＰＥＳ緩衝化ハンクス平衡塩類溶液（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））（
ｐＨ７，４）に対して徹底的に透析した。精製したジフテリア毒素をリスト・バ
イオロジカル・ラボラトリーズ（Ｌ ｉｓｔＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ）（カリフォルニア州キャンベル）から購入した。ピアース・プ
ロティン・アッセイ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓ５ａｙ ｒｅａ
ｇｅｎｔＸピアース・ケミカル・コーポレイシコン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ Ｃｏ、）、イリノイ州ロックフォード）を使用することによって全精製
蛋白の濃度を測定した。
細胞毒性
種々のキメラ毒素の、ＨＵＴ１０２／６ＴＧ細胞（高親和性ＩＬ−２レセプター
を有する）およびＹＴ２Ｃ２細胞（生親和性（ｐ ７５）レセプターだけを有す
る）によって［１’Ｃ］−ロイシン取込みを遮断する用量応答能力を測定した。
第４表は、［”Ｃａ−ロイシン取込みを５０％抑制するのに必要な毒素の濃度（
ＩＣ，。）をモルで示す。
第５表 細胞毒性
第５表に示すとおり、スペーサーペプチドの添加によって、ＤＡＢｓａｅ Ｉ
Ｌ −２キメラ毒素の毒性は約５倍増大する。（１−１０）スペーサーの２倍コ
ピー（ＤＡＢｓａｅ−（１−１０）” ＩＬ−２）または（１−１０）スペーサ
ーの３倍コピー（ＤＡＢ３ａ＊ （１１０）３−Ｉ Ｌ ２）の効果は実質的に
スペーサーの１倍コピー（ＤＡＢｓｓｅ （１１０） ＩＬ２）と同一の効果を
有する。
Ｄ Ａ Ｂ ４．、またはＤＡＢｓａｅを（ＩＬ−２構築物について使用したと
同一のスペーサーを用いるかまたは用いずに、第１表参照）ＩＬ−４に融合した
キメラ毒素も分析した。ＩＬ−４−レセプター担持細胞に対する細胞毒性に関し
て試験すると、ＤＡＢｓｓｓ−（１１０）”−Ｉ Ｌ ４は、ＤＡＢ４ｍｓ−Ｉ
Ｌ−４よりも約１０倍大きい細胞毒性であることが判明したＤＡＢｓａｅ Ｉ
Ｌ ４よりも２〜１０倍大きい細胞毒性であることが判明した。
ＤＴ断片のメラニン細胞刺激性ホルモンへの融合物へのスペーサーの付加は細胞
毒性への影響を持たなかった。
以下のとおり、細胞毒性アッセイを行つた。ＩＬ−２キメラ毒素について、培養
ＨＵＴ １０２／６ＴＧ（ラド（Ｔｓｕｄｏ）ら、（１９８６）、プロシーディ
ンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・ニー・ニス・エ
イ（Ｐ ｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ Ｓ Ａ）、８３：９６９４）またはＹ
Ｔ２Ｃ２（テシガワリ（Ｔｅｓｈｉｇａｗａｒｉ）ら、（１９８７）、ジャーナ
ル・オブ・イクスペリメンタル・メディシン（Ｊ 、 Ｅ ｘｐ、 Ｍｅｄ、
）、１６５ ： ２２３）細胞を、１０％ウシ胎児血清（セレクト（Ｃｅｌｌｅ
ｃｔ）、ＧＩＢＣＯ）、２ｍＭグルタミン、ならびに各々５０ ＩＵおよび５０
μｇ／ｍｌまでのベニ／リンおよびストレプトマイシンで補足したＲＰＭＩ １
６４０培地（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）、ニューヨーク州グランド・アイランド）中
に維持した。
細胞を完全培地中ウェル当たり５Ｘ１０’の濃度で、９６ウ工ルＶ字底プレート
（リンブローフロー・ラボラトリーズ（Ｌｉｎｂｒｏ−Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ）、バージニア州マクリーン）に接種した。毒素または毒素関連物
質を変動濃度（１０”Ｍ〜１０−’Ｍ）に添加し、５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃
で１８時間、該培養物をインキュベートした。インキュベーション後、該プレー
トを１７０Ｘｇで５分間遠心し、該培地を除去し、１．０μＣｉ／Ｗ［”Ｃ］−
ロイシン（二ニー・イングランド・ヌークリア（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕ
ｃｌｅａｒ）、マサチューセッツ州ボストン）を含有するロイシン不含培地（Ｍ
ＥＭ、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）） ２００μｌと置換した。３７℃でさらに９０分
後、該プレートを１７０ｘｇで５分間遠心し、培地を除去し、４ＭＫＯＨの添加
によって細胞を溶解した。１０％トリクロロ酢酸の添加によって蛋白を沈殿させ
、次いで、セルハーベスタ−（スカトロン（Ｓ ｋａｔｒｏｎ）、バージニア州
スターリン）を使用してガラス繊維フィルター上で不溶性物質を収集した。標準
的な方法に従って、フィルターを洗浄し、乾燥させ、計数した。培地だけで培養
した細胞を対照として供した。ＣＴ４Ｒ細胞（ウィリアム・イー・ボール（Ｗｉ
ｌｌｉａｍ Ｅ、 Ｐａｕｌ）、ＮＩＨ）、Ｐ８１５細胞（ＡＴＣＣ）またはＣ
ＴＬＬ２（ＡＴＣＣ）をウェル当たり細Ｆ＆ｌＸｌ０’個で接種し、４０時間イ
ンキュベートした以外は、同様の方法でＩＬ−４キメラ毒素を試験した。
競合置換試験
第６表は、種々のキメラ毒素による高親和性ＩＬ−２レセプター（ＨＵＴＩＯ２
細胞ンおよび中親和性ＩＬ−２レセプター（ＹＴ２Ｃ２細胞）から［Ｉ Ｈｌ
］−標識ＩＬ−２の競合置換を示す。
第６表 競合置換
第６表に示すとおり、（１−１０）スペーサーペプチドのＤＡＢｓｓｓ−ＩＬ
２への挿入によって結合親和性は増大する。スペーサーの２倍コピーの挿入（Ｄ
ＡＢｓｓｓ−（１１０）２−ＩＬ−２）またはスペーサーの３倍コピーの挿入（
ＤＡＢｓｓｓ−（１１０）３− Ｉ Ｌ ２）は、実質的にスペーサーの単一コ
ピーの挿入（ＤＡＢｓｕ （１１０） ＩＬ ２）と同一の効果を有する。
［１２’Ｉ］−ｒｌ Ｌ−２の組換え体Ｉ Ｌ−２（ｒｌ Ｌ−２）およびキメ
ラ毒素の競合置換を以下のとおり測定した。実質的にはワン（Ｗａｎｇ）ら（１
９８７、ジャーナル・オブ・イクスペリメンタル・メディシン（Ｊ 、 Ｅｘｐ
、 Ｍｅｄ、 ）、１６６ ：１０５５−１０６９）によって記載されたとおり
、放射性標識ＩＬ−２結合アッセイを行った。細胞を収穫し、細胞培養培地で洗
浄し、５ Ｘ １０６／ｍｌに再懸濁し、５％ＣＯｉ下、３７℃で３０分間、増
加濃度の非標識ｒｌＬ−２またはキメラ毒素の存在または不在下、［４６１コー
ｒＩＬ−２（０，７μＣｉ／μＣ上ル）とインキュベートした。次いで、該反応
を８０％５５０液（アキュメトリック・インコーホレイテッド（Ａｃｃｕｍｅｔ
ｒｉｃ Ｉ ｎｃ、 ）、カンザス州エリザベスタウン）：２０％パラフィン油
（ｄ＝１．０３９／ｍＡ’）の混合物上にかぶせ、微量遠心した。次いで、遊離
および結合リガンドを表す各試料の水性相およびペレットを、各々、ヌークリア
・シカゴ・ガンマカウンター（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｃｈｉｃａｇｏ ｇａ＋ｕ＋ａ
ｃｏｕｎｔｅｒ）で計数した。レセプターに結合する放射性標識ｒｌＬ−２の
５０％を置換するのに必要な非標識リガンドの濃度から見かけの解離定数に６′
を決定した。
使用
本発明の改良キメラ毒素を、例えば癌またはポリペプチドリガンドが選択的に結
合し得る望ましくない細胞の類の存在によって特徴付けられる他の症状のような
医学的疾患に罹患している、例えばヒトのような哺乳動物に投与する。投与され
る蛋白の量は疾患の種類、疾患の広範性、および疾患に罹患している哺乳動物の
種の大きさで変化するであろう。一般に、使用量は、癌の治療に使用される他の
細胞毒性剤に対して使用されるこれらの範囲であろうが、場合によっては、改良
キメラ毒素の特異性および増大した毒性のためにより低い量が必要であろう。
いずれの慣用の方法を使用しても、例えば、注射によってまたは時間放出型移植
によって、改良キメラ毒素を投与することができる。該改良キメラ毒素はいずれ
の非毒性の医薬的に許容される担体物質と組合わせることもできる。
他の具体例は以下の請求の範囲内である。
！
リンカ−２７４／２６１
↓
ＦＩＧ、 ２
国際調査報告
ｍ −一一一＋ｍ ＦＰ、−、、、、爵 Drawings FIG. 1 is a diagram of the DT molecule and various fusion proteins. FIG. 2 is a schematic diagram of the construction of preferred embodiments of plasmids. Structure and synthesis of the chimeric toxin with improved interdomain geometry AB4H(110)-IL-2 has the following sequence: Met; amino acid residues 1 to His'' of mature native DT: Gly; The group Ala-Pro-Thr-3er-5er-3er-Thr-Lys-Lys-Thr (referred to as (1-10); His: Ala4g! of mature native DT, and amino acid residues 2 to 133 of IL-2 The DT portion of the chimeric toxin DA84ms-(110) IL-2 includes all of DT fragment A and a portion of DT fragment B that extends to residue 485 of mature native DT. See Figure 1a for the structure of DA84ms-IL-2.
Synthetic proteins are shown, thin connecting lines represent deletions, and numbers on bars follow DAB nomenclature (described below).
The number below the bar corresponds to the amino acid residue numbering of natural DT, the crosshatching indicates the amphipathic region, and the darkened area corresponds to the transmembrane region. IL-2-2-133 indicates amino acid residues 2-133 of IL-2, A1a=alanine, Asn=asparagine, Asp=asparagine.
Gic acid, Cys=7stein, G1y=glycine, His=histidine, I1e=isoleucine, Met=methionine, Thr=threonine, Tyr=tyrosine
and Val=valine. (The nomenclature adopted for the DT-IL-2 toxin is described by DAB+ss (110) IL2, where D
phtheria toxin, A and B represent the wild type sequences for these DT fragments, numbers in parentheses represent spacer polypeptides, and IL-2 represents the mature human
The interleukin-2 sequence is shown. Subscript numbers indicate DT-related linkages in the fusion protein.
indicates the number of amino acids, the last of which is at the C-terminus of the spacer, where the spacer
is inserted. Note that the last two codons of DT also serve as 1/25phI sites. Deletion of tax signal sequence and trc promoter?
The numbering of the DAB-IL-2 fusion toxin is +1 outside of the phase with that of the native diphtheria toxin, since their expression results in the addition of a methionine residue to the N-terminus.
). DAB<as (110) IL2 was constructed from DAB4as IL2. pDW24 carrying DAB4116 1L-2 was constructed as follows. pUc18 (New England BioLabs) was digested with PstI and BglI to remove the E. coli origin of replication, the polylinker region, and 3° of the β-lactamase gene (amp'). The Pstl-BglI fragment carrying the moiety was recovered. Plasmid pKK-233-2 (Pharmacia) was incubated with PstI and
A PstI-BglI fragment carrying two transcription terminators and a 5° portion of the β-lactamase gene was recovered. pDW22 was constructed by ligating these two recovered fragments together. The BamHI-3alI fragment encoding human IL-2 was isolated from plasmid pDW15, as described by Williams et al. (1'988), Nuclei.
Nucleic Acids Research, 16
:10453-10467), BamHI/5ail digested pDW22 (described above).
pDW23 was constructed by ligating it to pDW24 was constructed as follows. A BamHI-NcoI fragment carrying the trc promoter and translation initiation codon (ATG) was isolated from plasmid pKK233-2 (Pharmacia). pABc508 (Williams et al., (1987), Protein Engineering, 1: 493-498) was digested with 5phI and HaeI to obtain the sequence encoding amino acid residues 1 to 485 of DT. By recovering the Haen-8phI fragment containing DT, a DNA sequence encoding amino acid residues 1 to 485 of DT was obtained. A NcoI/HaeII linker (5°CCATGGGCGC3') was ligated to the Haen-3phI fragment, and the construct was then
ligated into a BamHI-NcoI fragment carrying the trc promoter. This conclusion
As a result, we inserted the trc promoter, NcoI site (Met and ATG start co-located) in the following order.
A BamHI-5phI fragment having a sequence encoding residues 1-485 of native DT is generated. This fragment was inserted into pDW23 digested with 13amHI and 5phx. The resulting plasmid was designated pDW24. pDW24 is shown in FIG. The insertion corresponding to DAB4as IL-2 is shown in bold. In Figure 2, the filled circle indicates the NcoI site, the open circle indicates the Nsi I site, the open diamond indicates the ClaI site, the filled square indicates the HpaII site, and the open square indicates the 5phI site. , the filled triangle indicates the 5alI site.
vinegar. The fusion protein encoded by pDW24 (DAB4ss IL 2) is expressed from the 廿C promoter and is fused to amino acids 2-133 of human IL-2.
Met followed by amino acids 1-485 of mature DT. DNA encoding the polypeptide spacer, (1-10) was synthesized and inserted into pD W24. pDW24 was cut at the 5phI site at the 3° end of the DT sequence, and a synthetic sequence encoding a spacer (or multiple thereof) was inserted. The sequences of the synthetic sequences encoding 1.2 and 3 copies of the (1-10) spacer are shown in Table 1. Table 1: Spacer sequence CT CCG ACCAGCTCT AGCACT AAA AAG ACT CAT G2, cly Ala Pro Thr Ser Ser Ser T hr Lys Lys Thr -GT GCA CCG ACT AGCAG CTCT ACT AAG AAA ACA-^1a Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr HisGCT CCT ACCTCT TCT AGCACG AAG AAG ACG CAT G3 , Gly Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr -GT GCA CCG ACT AGCAGCT CT ACT AAG AAA ACA-^1a Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr His Ala-GCT CCT ACCTCT TCT AGCACG AAG AAG ACG CAT G CT-CGA GGA TGG ACA ACA TCG TGCTTCTTC TGCGTA CGA-functional 5phI site 23 24 25 26 27 2g 29 30 3 1 32Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr 1lisCCG ACCAGCTCT AGCACT AAA AAG ACT CAT A 4-base extension capable of annealing to the G1/2 Sph site is present at either end of the DNA fragment encoding each spacer sequence. In each spacer, a codon substitution destroys one of these 5phI recognition sites to restore only one 5phI site. For Table 1, Sequence 1, the use of T instead of G in position 3 of codon 10 prevents the generation of a 5phI site at the 3° end of the spacer.
Ru. In sequence 2, the use of G instead of C in position 2 of the G1y codon prevents the generation of a 5phI site at the 5° end of the spacer. Sequence 3 maintains a functional 5phI site at the 5' end of Sequence 1, ligates the spacer of Sequence 2 at that site, and connects the spacer of Sequence 2.
It is created by leaving a regenerating 5 phr site at 3° of the spacer and a bifunctional 5 phr site at either end of the spacer of sequence 3. Thus, DAB486-IL2 or DAB3. of sequence 1 from Table 1. , - Insertion into the 5phI site of IL-2 results in the following splice/junction: His"' residue of native DT: Ala-Pro-Thr-3er-3er-8e r-Thr-Lys-Lys-Thr; 3° A fusion protein with a His residue encoded by an extension, the Ala"' of the native DT: and the second amino acid of the IL-2 sequence.
produces white. Insertion of sequence 2 from Table 1 into the 5phI site of DAB486 IL-2 or DAB3°-IL-2 involves the following splice/junction: His'' of the native DT; from the 3' extension at the 5' end of the oligonucleotide. Induced G1y residue; Thr: Co by 3' extension
encoded His residue; A1a485. of natural DT. and the second arm of the IL-2 sequence.
Generates a fusion protein with amino acids. Insertion of sequence 3 from Table 1 into the 5phI site of DAB486 IL-2 or DABsas IL-2 involves the following splice/junction: H 1S484 residue of native DT: 3' extension at the 5' end of the oligonucleotide. G1y residue derived from; Ala-Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Lys-Lys-Thr-Ala-Pro-Thr | Thr-His-Ala-Pro-Thr-Set-5er-3er-Thr-Lys-Lys-Thr; His residue encoded by a 3° extension. Natural DT A18483. and the second amino acid of the IL-2 sequence. By joining the three subunits in vitro with sequences 1 and 2,
or sequence 1 may be inserted into the 5phI site of the chimeric toxin located in sequence 2.
stomach. Two or more sequences from Table 1 encoding double and triple copies of (1-10), respectively.
Insertion of or 3 results in a similar structure. If repeats of the (1-10) sequence exist, codons are selected that minimize DNA homology between the sequential (1-10) coding sequences. This prevents rearrangements that would result from homologous recombination between successive copies of the (1-10) encoding DNA. cty and His residues (encoded by linkers at each end of the spacer sequence)
) is present in the linker B. , does not affect the 1 value (data not shown)
stomach). The (1-10) spacer sequence was identified by applying the FLEXPRO program (described above) to the sequence of DAB4ss rL-2. Table 2 shows the 10 most flexible 7-amino acid segments in DABaaa IL2 as determined by FLEXPRO. The most flexible 7-amino acid stretch of the fusion protein is B. 2, has a value of 1.135
The amino acid residues were found to be amino acid residues 487 to 493 of DAB4sg IL2. The seven amino acids of Kowara match amino acid residues 2-8 of IL-2. These seven amino acids are the most common amino acids found in DABsas IL-2 and DABzss IL-2, molecules that completely lack the toxicity characteristics of other DT chimeric toxins tested.
It was also flexible. It is known that the first 10 amino acid residues of IL-2 do not form a regular array in crystals (Brandhuber, (1987), Science, 238). :
1707-1709), or (because of its flexibility, the entire first 10 amino acid residues of IL-2 were used as (1-10) spacers. When inserted into DBA 486 1 L-2, As shown in Table 3, (1-10) spacer
- is the most flexible arrangement of new construction. Table 3: DABaaa IL 2 to DABsse (110) tllll'a IL 2. DAB3++e IL-2 was constructed by removing the pDW24 color 309 b p Hpa II-8phI ffl fragment and replacing it with the oligonucleotide linker 26 1/274 (Table 4) to obtain plasmid pDW27.
was built (Figure 1). Table 4 - Oligonucleotide linker This linker restores the fragment B sequence from Pro383 to Thr387 and
in-frame fusion to the IL-2 sequence at the site. As a result, 97 amino acids between Thr387 and His485 are deleted in DABaaa IL-2.
Ta. As above, the DNA encoding the spacer (see Table 1) is inserted at the 5phI site TpDW271:. :, and l:yo rDABsge (110) IL-2 was constructed. DABsas(110)-1L2 was obtained directly from pDW24(DAB416-IL-2) by removing the 309bp HpaI[-5phI fragment and replacing it with a linker that restores the fragment B sequence from Pro383 to Thr387. , encodes the polypeptide linker and is fused in frame to the IL-2 sequence. The sequence of DT is from Greenfield et al. (1983), Proceedings of the National Academy of Sciences.
- Nis A (Proc, Natl, Acad, Sci, USA), 80:
6853-6857. The sequence encoding IL-2 is described in Williams et al. (1988), Nu.
Nucleic Acids Research, 16: 10453-10467i: Disclosed by Til-Afright Biosys
It was synthesized with an Applied Biosystems DNA-Synthesizer. The sequence of IL-2 is
Williams et al. (1988) Nuclear Acids Research, 16:10 453-10467. Fusion of sequences encoding mature DT to ATG using oligonucleotide linkers is described in Bishai et al., (1987), Journal of Bacteriology, incorporated herein by reference.
J. Bact. 169:5140-5151. Chimeric toxins were also constructed in which the DT fragment was fused to murine interleukin 4 (IL-4) in the presence or absence of a spacer. DAB4aa-IL-4, DAB3°-IL-4 and DAB3811(1-10)"-IL-4 were constructed by methods known to those skilled in the art. Namely, first, DABaa-(110)"IL-4 was constructed. The plasmid containing the fusion (derived from pDW27) was digested with 5phI and DABxse (1- 10)!IL4 was constructed. The IL-4 encoded fragment contains a linker that allows insertion into the 3' end of the spacer-encoding DNA and an in-frame fusion. DAB4 86 1L-4 and DAB3 -IL-4 was generated by analogous treatment of pDW24 and pDW27, respectively. The sequence of murine IL-4 is cited herein.
Lee et al., (1,986), Proceedings of the National Academy of Sciences, Proc. Natl., Acad, Sci., USA. 83 + 2061-2
065. The sequences used for these constructions were DNAX (California
Obtained from Nia). Oligonucleotides and nucleic acids were synthesized and manipulated as follows. Applied Biosystems 380 A DNA Synthesizer (Applied Biosystems Inc., California)
Oligonucleotides using cyanoethylphosphoramidite chemistry at Star City)
Creotide was synthesized. After synthesis, oligonucleotides are processed according to the manufacturer's instructions.
Therefore, Oligonucleotide Purification Cartridges (Applied Biosystems, Inc., Calif.)
Foster City). The purified oligonucleotides were resuspended in TE buffer (10mM Tris base, IgM EDTA, pH 8.0). To anneal the complementary strands, equimolar concentrations of each strand were added to the presence of 100++M NaCl.
Mix in the presence of water, heat to 90° C. for 10 minutes, and allow to cool slowly to room temperature. Plasmid DNA was extracted from Ausubel et al.
Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York
- Purified by alkaline dissolution/cesium chloride gradient method of wolfberry. Making DNA
Manufacturer: New England Biology, Beverly, Massachusetts, and Bethesda Research Laboratories.
Restriction endonuclei as recommended by Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD).
Digested with Aze. Restriction cuts for plasmid construction from agarose-TBE gels
Pieces were extracted, ligated together (in the presence or absence of oligonucleotide linkers) and used to transform E. coli using standard methods. Ausubel et al. (1989), supra and Maniatis et al. (1982), Molecular Cloning Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory. Laboratory), Cold Spring Harbor, New York. plus
Mid-DNA sequencing was performed using Sequenase (United Stain Biology).
Cals (United 5tates Bioche+aicals), Ojai
Kraft et al. (1988), Bio Techniques, 6:544-547. , procedure
It was carried out according to the dideoxy chain termination method of the National Academy of Sciences of the United States of America (Proc. Natl., Acad, Sci., USA) 74: 5463-5467. Expression and Purification of Chimeric Toxin Expression and purification of chimeric toxin was as follows. All DT-related IL-2 fusion proteins used here were expressed in the cytoplasm of E. coli strain JMIOI from the trc promoter [A+ann ) et al., (1985), Gene, 40 + 183-1
901, recombinant E. coli was grown using Microgen Fermentor [New Brunswick Scientific, Edison, New Chassis]. Medium, 101 capacity, 10 g/ml
Saminoic acids [Difco, Detroit, MI; 50 μg/ml M9 minimal medium supplemented with ampicillin and 0.5% g/ml min.
Maniatis et al. (1982) supra]. bacterial culture
The nutrients were grown at 30°C and sparged with air at 51/min. When the absorbance (As. nm) of the culture reached 0.3, expression of the chimeric tax gene was induced by the addition of isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside. 2 hours after induction, centrifuge
Bacteria were thus harvested, resuspended in buffer #1101 (DOI KH2PO4, 101M EDTA, 750mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 8.0) and sonicated by sonication (Branson 5onifier). Lysed. Total cells and debris were lysed by centrifugation at 27.00 x g.
The clarified extract was then filter sterilized and applied to an anti-diphtheria toxin immunoaffinity column. Bound proteins were eluted with 4M guanidine hydrochloride, reduced to 1% by addition of β-mercaptoethanol, and then sized by high performance liquid chromatography on a 7.5 x 600 mm G40oopw column (TosoHass). Classified by. Prior to use, the fusion toxin was extensively dialyzed against HEPES-buffered Hank's Balanced Salt Solution (Gibco) (pH 7.4). List of purified diphtheria toxins
Purchased from List Biological Laboratories (Campbell, Calif.). Pierce Pu
The concentration of total purified protein was determined by using the lotin assay reagent (Pierce Protein Assay ReagentX, Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Cytotoxicity of various chimeric toxins on HUT102/6TG cells (which have high affinity IL-2 receptors) and YT2C2 cells (which have only bioaffinity (p75) receptors).
The dose-response ability to block [1'C]-leucine uptake was determined by Table 4 shows the concentration (IC,) of the toxin required to inhibit Ca-leucine uptake by 50% in moles. , the toxicity of the DABsae IL-2 chimeric toxin increases approximately 5-fold.
DABsae-(1-10)"IL-2) or (1-10) spacer
The effect of a 3-fold copy of the spacer (DAB3a* (110)3-IL2) has virtually the same effect as a 1-fold copy of the spacer (DABsse (110) IL2). D A B 4. We also analyzed chimeric toxins fused to IL-4, or DABsae (with or without the same spacer used for the IL-2 construct, see Table 1). Regarding cytotoxicity to IL-4-receptor-bearing cells
When tested, DABsss-(110)''-IL 4 was found to be approximately 10 times more cytotoxic than DAB4ms-IL-4. It was found that the addition of a spacer to the fusion of the DT fragment to melanocyte-stimulating hormone had no effect on cytotoxicity. Cytotoxicity assays were performed as follows: IL-2 chimeric toxin For culture HUT 102/6TG (Tsudo et al. (1986), procedure
National Academy of Sciences
(Proc. Natl, Acad, Sci, USA), 83:9694) or Y T2C2 (Teshigawari et al. (1987), Jhana
Journal of Experimental Medicine (J, Exp, Med, ), 165:223) cells were supplemented with 10% fetal bovine serum (Cellect, GIBCO), 2mM glutamine, and 50 IU and 50% each. RPMI 1 supplemented with beni/lin and streptomycin up to μg/ml
640 medium (Gibco, Grand Island, NY). Cells were seeded in 96-well V-bottom plates (Linbro-Flow Laboratories, McLean, Va.) at a concentration of 5×10′ per well in complete medium. toxin or toxin-related material
The plate was added to varying concentrations (10"M to 10-'M) and the culture was incubated for 18 hours at 37°C in a 5% CO2 atmosphere. After incubation, the plate
The cells were centrifuged at 170×g for 5 minutes, the medium was removed, and a leucine-free solution containing 1.0 μCi/W[”C]-leucine (New England Nu clear, Boston, MA) was used. Replaced with 200 μl of medium (MEM, Gibco). After a further 90 minutes at 37°C, the plate was centrifuged at 170 x g for 5 minutes, the medium was removed and the cells were lysed by the addition of 4M KOH, 10% trichloride. Proteins were precipitated by the addition of acetic acid and insoluble material was then collected on glass fiber filters using a cell harvester (Skatron, Stalin, VA). Filters were washed according to standard methods. Cells cultured in medium alone served as controls. CT4R cells (William E., Paul, NIH), P815 cells (ATCC) or CTLL2 (ATCC) Inoculate with 0' cells per well and incubate for 40 hours.
IL-4 chimeric toxins were tested in a similar manner, except that they were incubated. Competitive Displacement Studies Table 6 shows the competitive displacement of [I Hl ]-labeled IL-2 from high affinity IL-2 receptors (HUTIO2 cells) and medium affinity IL-2 receptors (YT2C2 cells) by various chimeric toxins. Table 6 Competitive displacement As shown in Table 6, insertion of the (1-10) spacer peptide into DABsss-IL 2 increases binding affinity. Insertion of two copies of the spacer (DABsss-(110)2-IL-2) or insertion of three copies of the spacer (DABsss-(110)3-IL2) essentially results in a single copy of the spacer.
It has the same effect as inserting a copy (DABsu (110) IL 2). [12'I]-rl L-2 recombinant I L-2 (rl L-2) and texture
Competitive displacement of la toxin was determined as follows. Substantially, Wang et al. (1
Radiolabeled IL-2 binding assays were performed as described by J. Exp. Med, 166:1055-1069). Harvest cells and wash with cell culture medium.
Clean, resuspend at 5 x 106/ml and incubate for 30 min at 37°C under 5% COi.
[461 Co rIL-2 (0.7 μCi/μC)] was incubated in the presence or absence of added concentrations of unlabeled rIL-2 or chimeric toxin. The reaction was then overlaid on a mixture of 80% 550 solution (Accumetric Inc., Elizabethtown, Kansas): 20% paraffin oil (d=1.039/mA') and Microcentrifuged. The aqueous phase and pellet of each sample representing free and bound ligand, respectively, were then counted on a Nuclear Chicago gamma counter. The apparent dissociation constant 6' was determined from the concentration of unlabeled ligand required to displace 50% of the radiolabeled rlL-2 bound to the receptor. Uses The improved chimeric toxins of the present invention can be used, for example, to selectively bind cancer or polypeptide ligands.
for example, to a mammal, such as a human, suffering from a medical disease, such as another condition characterized by the presence of undesirable cell types that may be associated with the disease. The amount of protein administered will vary depending on the type of disease, the extent of the disease, and the size of the species of mammal afflicted with the disease. Generally, the amounts used will be in these ranges used for other cytotoxic agents used to treat cancer, but in some cases are lower due to the improved specificity and increased toxicity of chimeric toxins. amount will be required. The improved chimeric toxin can be administered using any conventional method, eg, by injection or by time-release implantation. The improved chimeric toxin can be combined with any non-toxic pharmaceutically acceptable carrier material. Other embodiments are within the scope of the following claims. ! Linker-274/261 ↓ FIG, 2 International search report m -111+m FP, -,,,,,