JPH06502311A - DNA structure to provide RNA therapy - Google Patents
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- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.
Description
【発明の詳細な説明】 ＲＮＡ療法を提供するためのＤＮＡ構造発明の分野 本発明は、遺伝子療法の分野に関するものであり、さらに詳しくは標的細胞内に 治療ＲＮＡ分子を発生させることができる新規なりＮＡ槽構造およびこのような 構造をヘパドナウィルス感染を抑制するために使用することと、選別したアンチ センスＲＮＡ療法を、この治療法によって利益を受ける患者に対して提供するた めに使用することに関するものである。[Detailed description of the invention] Field of DNA Structure Invention for Providing RNA Therapy The present invention relates to the field of gene therapy, and more particularly to the field of gene therapy. Novel NA cisterna structures and such structures that can generate therapeutic RNA molecules structure to inhibit hepadnavirus infection and screened anti-virus to provide sense RNA therapy to patients who would benefit from this therapy. It is related to the use of
従来の技術の説明 最近の組換えＤＮＡ技術の進歩によって、遺伝子療法への大きな期待は実現に近 付いた。現在では、通常の感染経路で作用するウィルス粒子を介した、哺乳項の 細胞への遺伝子物質の導入を可能にする技術が開発されている（例えば、Ｄ。Description of conventional technology Recent advances in recombinant DNA technology have brought great promise for gene therapy closer to realization. I got it. At present, the infection of mammals through virus particles that act through the usual infection routes is now known. Techniques have been developed that allow the introduction of genetic material into cells (e.g. D.
ＭｃＣｏｒｍｉｃｋＳＢｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：６８９−９３ （１ ９８５）参照）。レトロウィルスは、遺伝子挿入を実現するためのベクターとし て特に有効であると報告されてきた（Ｗ、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、５ｃｉｅｎｃｅ、 ２２６ ： ４０１−０９ （１９８４））。この治療法は、治療を行なう部位 がら取り出した自己細胞の中ヘレトロウィルスベクターを ｅｘ ｖｉｖｏ で 導入したのちその細胞の再移植を行なうことが特徴となっている。McCormick SBio-Technology 3:689-93 (1 985)). Retroviruses are used as vectors to achieve gene insertion. have been reported to be particularly effective (W, Anderson, 5science, 226: 401-09 (1984)). This treatment method is applied to the area to be treated. Heretroviral vectors are extracted from autologous cells ex vivo. The feature is that the cells are re-transplanted after introduction.
遺伝子療法のもう一つの方法は、遺伝子の機能を特異的にブロックするために、 アンチセンスＲＮＡの使用を伴うものである（１．Ｈｅｒｓｋｏｗｉ ｔｚ、Ｎ ａｔｕｒｅ、３２９：２１９−２２ （１９８７ＬおよびＭ、Ｉｎｎｏｕｅ、Ｇ ｅｎｅ、７２ ： ２５−３４ （１９８８）を参照）。Another method of gene therapy is to specifically block the function of a gene. It involves the use of antisense RNA (1. Herskiwitz, N. ature, 329:219-22 (1987L and M, Innoue, G. ene, 72: 25-34 (1988)).
遺伝子転写産物の ｉｎ ｖｉｖｏ での切断および不活化を実現するために、 一般にリポザイムとして知られている、高度に配列特異的なエンドリボヌクレア −ゼを使用することも提案されている。この方法によれば、遺伝子の転写された 配列情報を用いて、特異的なＲＮＡ転写産物を一つまたはそれ以上のりボザイム の標的にし、発現するりポザイムが ｉｎ ｖｉｖｏ で転写産物を切断し、対 応する遺伝子の発現を抑制することが可能になるはずである（Ｊ、Ｈａｓｅｌ。To achieve in vivo cleavage and inactivation of gene transcripts, highly sequence-specific endoribonucleas, commonly known as lipozymes It has also been proposed to use -ze. According to this method, the transcribed genes Using sequence information to target specific RNA transcripts to one or more oligozymes The expressed lipozyme cleaves the transcript in vivo and It should be possible to suppress the expression of the corresponding genes (J, Hasel.
ｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ、３３４ ： ５８５−９１ （１９８８））、広範囲な 標的ＲＮＡの切断を指示する特異的なりボザイムは、ヌクレオチド配列の一部を 変更することによって設計することが可能である。このようにリボザイムは、特 異的な細胞またはウィルスのＲＮＡの破壊を標的とすることができる。ff et al., Nature, 334: 585-91 (1988)), a wide range of Specific ribozymes that direct the cleavage of target RNA cut part of the nucleotide sequence into It is possible to design by changing. In this way, ribozymes are Destruction of foreign cellular or viral RNA can be targeted.
細胞内に、リボザイムをコードする外部のＤＮＡを導入する試みは、今日までの ところ、リボザイムのコピー数が相対的に少ないことから、この方法が遺伝子療 法で果たすと期待される将来の臨床効果について懸念が生じている。To date, no attempt has been made to introduce external DNA encoding ribozymes into cells. However, because the copy number of ribozyme is relatively small, this method is not suitable for gene therapy. Concerns have been raised about the future clinical impact the law is expected to have.
１００．０００コピーまたはそれを超える相対的に大量のコピー数で標的細胞内 に生じさせることができる、独自のＤＮＡ構造が提供される。本発明のＤＮＡ構 造は、ＤＮＡ分子の形式での本構造の自律的な複製を可能にする第−ＤＮＡ断片 、治療ＲＮＡ分子を発生させることができる第二ＤＮＡ断片、そして、第二のＤ ＮＡ断片から構成され、標的細胞の中でＲＮＡ分子の形式で自発的な複製が可能 な第三ＤＮＡ断片から構成される。in target cells at a relatively large copy number of 100,000 copies or more. A unique DNA structure is provided that can be generated. DNA structure of the present invention The structure is a first DNA fragment that enables autonomous replication of this structure in the form of a DNA molecule. , a second DNA fragment capable of generating a therapeutic RNA molecule, and a second D Composed of NA fragments, capable of spontaneous replication in the form of RNA molecules in target cells It is composed of a third DNA fragment.
好ましい実施例によれば、本発明の構造は第三ＤＮＡ断片として、Ｄ型肝炎ウィ ルスとして知られる特異的ＲＮＡサテライト因子の複数のコピーを含み、これが 標的細胞内での複製によって、同一および相補的な二つのＲＮＡ配列を形成する 。この第三ＤＮＡ断片に挿入される第二ＤＮＡ断片は、Ｄ型肝炎ウィルスのゲノ ムの一つを超えるコピーを含み、これがリボザイムまたはアンチセンスＲＮＡ分 子をコードし、標的細胞内で上記のように発現する。Ｄ型肝炎ウィルスのゲノム のＤＮＡコピーは、リポザイムまたはアンチセンスをコードする挿入を含み、従 来のクローニング／発現ベクター、好ましくはＳＶ４０に組み入れられて、ＤＮ Ａ分子の形で自発的に複製可能なりＮＡ構造を形成し、さらにＲＮＡが指定する ＲＮＡ複製を続けるようなＨＤＶのＲＮＡ転写産物をもたらす。According to a preferred embodiment, the structure of the invention contains hepatitis D virus as a third DNA fragment. Contains multiple copies of a specific RNA satellite factor known as rus, which Forms two identical and complementary RNA sequences by replication within the target cell . The second DNA fragment inserted into this third DNA fragment is the hepatitis D virus genome. contains more than one copy of the ribozyme or antisense RNA component. encodes a child and is expressed as described above in the target cell. Hepatitis D virus genome The DNA copy contains an insert encoding a lipozyme or antisense, and DN is incorporated into a conventional cloning/expression vector, preferably SV40. It is capable of spontaneous replication in the form of an A molecule, forms an NA structure, and is further specified by RNA. resulting in HDV RNA transcripts that continue RNA replication.
本発明の構造の臨床応用では、本構造によってコードしたりボザイムまたはアン チセンスＲＮＡが、Ｂ型肝炎ウィルスのＲＮＡブリゲノムを指定する。結果とし て生じた構造を、Ｂ型肝炎ウィルスのたんばく質被膜によって包まれたピリオン の形で投与することにより、Ｂ型肝炎の慢性保菌者のＢ型肝炎ウィルス感染を効 果的に抑制することが期待されている。当然ながら、本発明は、ＲＮＡ療法を提 供する手段として、他のりボザイムおよびアンチセンスＲＮＡを含む他の治療上 有効なＲＮＡの部位特異的な提供を可能にする、より広範囲な応用の可能性をも っている。In clinical applications of the structures of the present invention, the structures encode This sense RNA specifies the RNA genome of the hepatitis B virus. As a result The structure formed by the pillion is surrounded by the protein coat of the hepatitis B virus. By administering it in the form of It is hoped that this will be effectively suppressed. Of course, the present invention also provides RNA therapy. Other therapeutic agents, including other ribozymes and antisense RNA, may be used as a means of providing It also has the potential for a wider range of applications by enabling the site-specific delivery of effective RNA. ing.
本発明のＤＮＡ構造の顕著な優位性の中には、相対的なコピー数の大きさ、組織 特異性、自己限定複製がある。Among the significant advantages of the DNA structure of the present invention are its relative copy number size, organization, There is specificity, self-limiting replication.
本発明に従ったＢ型肝炎ウィルスの感染を治療するＤＮＡ構造と方法は、現在十 分な治療を受けることができない相当な数に及ぶＨＢＶ保菌者が必要としている 救済を提供し、それによってこれらの保菌者が肝硬変および肝細胞癌を起こす危 険を減らすことができるであろう。DNA structures and methods for treating hepatitis B virus infection according to the present invention are currently well known. This is needed by a significant number of HBV carriers who cannot receive adequate treatment. provide relief and thereby reduce the risk of these carriers developing liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. It would be possible to reduce the risk.
図面の簡単な説明 添付した図面を参照： 図１は、δ抗原の合成に含まれる単位長の環状ゲノム（図ＩＢ）およびアンチゲ ノム（図ＩＣ）のＨＤＶ ＲＮＡおよびｍＲＮＡ （図ＩＡ）の構造的な特徴を 描いたものであり、自己切断部位（０）、ポリアデニル化部位（）、ポリアデニ ル化シグナル（ロ）、そして後者のシグナルの上流、δ抗原のオーブンリーディ ングフレーム（１９５アミノ酸）を示す図である。Brief description of the drawing See attached drawing: Figure 1 shows the unit-length circular genome (Figure IB) involved in the synthesis of the δ antigen and the antigen Structural features of HDV RNA and mRNA (Fig. IA) of Nome (Fig. IC) The self-cleavage site (0), polyadenylation site (), polyadenylation site signal (b), and upstream of the latter signal, the oven-ready signal for the δ antigen. FIG.
図２は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を 指定する、本発明のＤＮＡ構造によってコードされる３５塩基のりポザイムの触 媒性ループの予測される二次構造を示しており、本構造のＨＤＶ由来断片の塩基 ７９６と７９８の間に挿入が起こっていることを示す。アステリスク（本）は、 可能な塩基対を示す：矢印はＣＡ Ｔ遺伝子上のＲＮＡ切断の部位を示す。２１ のヌクレオチドから成る上方の鎖は、配列１． Ｄ、 Ｎｏ、１と名付け、４８ のヌクレオチドをもつ下方の鎖は配列１． Ｄ、 Ｎｏ、２と名付ける。Figure 2 shows the chloramphenicol acetyltransferase (CAT) gene. The specified 35 base gluepozyme catalytic converter encoded by the DNA structure of the present invention The predicted secondary structure of the medicinal loop is shown, and the bases of the HDV-derived fragment of this structure are shown. It shows that an insertion has occurred between 796 and 798. The asterisk (book) is Possible base pairs are shown: arrows indicate sites of RNA cleavage on the CA T gene. 21 The upper strand of nucleotides has the sequence 1. Named D, No. 1, 48 The lower strand with nucleotides has sequence 1. Name it D, No. 2.
ゲノムの二つのコピーで構成される。オーディオラジオグラフィは、修飾された 一部１）の三つのＤＮＡコピーで構成される構造によって形質転換された同一の 細胞から得たＲＮＡ、図２に示した抗ＣＡ Ｔリボザイムを含むように修飾され たＨＤＶゲノムの二つのＤＮＡコピーで構成される構造、δ抗原発現クローン（ レーン３）、そして形質転換されていない細胞（レーン４；負の調節）と比較す る。Consists of two copies of the genome. audioradiography qualified Identical cells transformed by a construct consisting of three DNA copies of part 1) RNA obtained from cells was modified to contain the anti-CA T ribozyme shown in Figure 2. A structure composed of two DNA copies of the HDV genome, the δ antigen-expressing clone ( lane 3) and compared to untransformed cells (lane 4; negative regulation). Ru.
正の調節、すなわち感染したチンパンジーの肝臓から得たＲ Ｎ 、Ａ 、およ び分子重量マーカーφＸ／ＨａｅＩＩＩも示す（それぞれレーンＣおよびＭ）。positive regulation, i.e., RN, A, and The molecular weight marker φX/HaeIII is also shown (lanes C and M, respectively).
矢印は、オラジオグラフィであり；ＣＯ３７細胞から取り出したｍＲＮ、Ａが、 ＣＭＶ−ｒＥプロモーターの活性化によってＣＡＴを発現したことを示す。細胞 は、（ｉ）抗ＣＡＴリボザイム挿入をもたない、ＨＤＶを含むプラスミドベクタ ーｐＳＶＬ（レーン２）、（ｉｉ）図２に示した抗ＣＡＴリポザイムを含むよう に修飾した同一のプラスミド（レーン３）、（ｉｉｉ）野性型ＨＤＶで構成され る構造（レーン４）によって形質転換した。分子重量マーカーと未分解プローブ の部分標本も手挿入が起こることで、三種類のヘパドナウィルス（ＷＨＶ、、Ｇ ＳＭＶ、およびＨＢＶ）のゲノム上の保護された部分に対して臨床応用をもつと 期待されている。Arrows indicate oraradiography; mRNA extracted from CO37 cells, A. This shows that CAT was expressed by activation of the CMV-rE promoter. cell (i) A plasmid vector containing HDV that does not have an anti-CAT ribozyme insertion. -pSVL (lane 2), (ii) containing the anti-CAT lipozyme shown in Figure 2. (lane 3), (iii) the same plasmid modified with wild-type HDV; (Lane 4). Molecular weight markers and undegraded probes The partial specimens were also manually inserted, resulting in three types of hepadnaviruses (WHV, G It has clinical applications for protected parts of the genome of SMV and HBV). It is expected.
アステリスク（＊）は可能な塩基対を示す；矢印はへバドナウィルスゲノム上の ＲＮＡ切断部位を示す。２０ヌクレオチドをもつ上方の鎖は配列Ｌ Ｄ、 Ｎｏ 。Asterisks (*) indicate possible base pairs; arrows indicate hebadnavirus genomes. RNA cleavage sites are shown. The upper strand with 20 nucleotides has the sequence LD, No. .
４と名付け、５５のヌクレオチドをもつ下方の鎖は配列ｒ、 Ｄ、 Ｎｏ、５と 名付ける。4, and the lower strand with 55 nucleotides has the sequence r, D, No, 5. Name it.
詳細な説明 次の用語および文章は、以下の本発明の説明のために意味を定義するものであ１ 、治療ＲＮＡ分子−一治療の目的のために細胞内で利用することができるＲＮＡ 分子。例えば、上記で論じたりボザイムで構成されるＲＮＡ分子は、選別したウ ィルスまたは細胞のＲＮＡに対して結合し、酵素性の切断活性を行使するように 設計することができる。さらに、選別したウィルスまたは細胞のＲＮＡと相補的 になるようにＲＮＡ配列を設計することで、そのＲＮＡ種と結合し、不活性化す ることができる。リボザイムと「アンチセンスＪＲＮ、Ａ、はどちらも、存寄な 遺伝子産物の発現を抑制することによって、またはＲＮＡ種の機能に依存するウ ィルスの複製を抑制することによって、細胞内で治療上の意味をもつことができ る。detailed description The following terms and sentences have defined meanings for the purposes of the following description of the invention. , therapeutic RNA molecule - an RNA that can be utilized within a cell for therapeutic purposes molecule. For example, RNA molecules discussed above and composed of bozymes can be binds to viral or cellular RNA and exerts enzymatic cleaving activity can be designed. In addition, complementary to the selected viral or cellular RNA By designing the RNA sequence so that it binds to that RNA species and inactivates it. can be done. Both ribozyme and antisense JRN, A are by suppressing the expression of gene products or by relying on the function of RNA species. can have therapeutic implications within cells by inhibiting virus replication. Ru.
２、自律的複製−一細胞内の他のＤＮＡまたはＲＮＡ分子の複製に依存しない、 ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の複製。一般に、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、複製の開 始点をもち、細胞性ポリメラーゼがそれを「複製可能な」種と認識できれば、自 発的に複製することができる。2. Autonomous replication - independent of the replication of other DNA or RNA molecules within a cell; Replication of DNA or RNA molecules. Generally, DNA or RNA molecules are If it has a starting point and the cellular polymerase can recognize it as a “replicable” species, then can be spontaneously copied.
３、同一および相補的ＲＮＡ−一同−ＲＮＡ鎖は同一のヌクレオチド配列で構成 されるのに対し、その相補的鎖はワトソンークリック塩基対の関係にある。3. Identical and Complementary RNA - Identical - RNA strands are composed of identical nucleotide sequences whereas the complementary strands are in a Watson-Crick base pairing relationship.
４、コピー数−一冶療ＲＮ、へを含むＲＮＡＭのｍ胸当たりの数。4. Copy number - m breast number of RNAM containing monotherapeutic RN.
本発明のＤＮＡ構造は三つの断片で構成される。東−の断片は、適切な宿生細胞 の中での、ＤＮＡ分子としてのＤＮＡ構造全体を自律的に複製するための手段を 含む。この断片は、選別した宿生細胞の中で複製操作が可能な複製開始点をもつ ような数多くのベクターの中から選別することができる。適切なベクターとして は、例えば、大腸菌の中で自律的な複製を可能にするｐＢＲ３２２プラスミド誘 導体、選別した動物の細胞の中で自律的な複製が可能な５Ｖ４Ｑベースのプラス ミドベクター、あるいは１種類を超える宿主細胞の中で構造を複製できる「組み 合わせ」ベクターがある。好ましい実施例では、組み合わせベクター、すなわち ＳＶ４０配列だけでなくｐＢＲ３２２配列をそなえ、大腸菌およびいくつかの培 養された動物細胞（例えばＣｏＳサル細胞）の両方で繁殖させることができるｐ ＳＶＬ （Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ）を使用する。The DNA structure of the present invention is composed of three fragments. The eastern fragment is a suitable host cell. A method for autonomously replicating the entire DNA structure as a DNA molecule within include. This fragment has an origin of replication that can be manipulated in selected host cells. It is possible to select from a large number of vectors such as as a suitable vector For example, the pBR322 plasmid inducer allows autonomous replication in E. coli. Conductor, 5V4Q-based plus capable of autonomous replication in selected animal cells midvectors, or "assembly vectors" that are capable of replicating the structure in more than one type of host cell. There is a ``match'' vector. In a preferred embodiment, a combinatorial vector, i.e. It contains not only the SV40 sequence but also the pBR322 sequence, and is compatible with E. coli and some culture media. p that can be propagated both in cultured animal cells (e.g. CoS monkey cells) Use SVL (Pharmacia).
本発明のＤＮＡ構造はまた、適切な標的細胞の中でＲＮＡとして複製可能な断片 も含む。一般にこのような断片は、複製開始点をそなえた選ばれたウィルスのＲ ＮＡゲノムのｃＤＮＡコピーとして得ることができる。逆転写酵素を使用するこ とによってＲＮＡからｃＤＮＡのコピーを得る過程はよく知られており、技術に 精通した人によって普通に用いられている。The DNA constructs of the invention also include fragments that can be replicated as RNA in appropriate target cells. Also included. Generally, such fragments contain the R of the selected virus, which contains the origin of replication. It can be obtained as a cDNA copy of the NA genome. Using reverse transcriptase The process of obtaining a copy of cDNA from RNA by Commonly used by knowledgeable people.
自律的に複製するＲＮＡが有利である要因は、「サテライトＲＮＡＪとして知ら れているＲＮ、Ａウィルス様因子のＮ類である。Ｄ型肝炎ウィルスはこの種票の ウィルス採種の一つである。好ましい実施例では、感染したつｙドチャックの肝 細胞からＤ型肝炎ウィルスゲノムを得て、ｃＤＮＡ分子の中に逆転写し、ゲノム 全体のｃＤＮＡコピーを提供するためにこれらを組み合わせる。次に、従来のク ローニング技術を用いて、）（ＤＶのｃＤＮＡをｐＳＶＬベクターの中に挿入す る。The advantage of autonomously replicating RNA is that it is known as ``satellite RNAJ.'' RN, which is the N class of A virus-like factors. Hepatitis D virus is of this type. This is one type of virus seeding. In a preferred embodiment, the liver of an infected chuck is The hepatitis D virus genome is obtained from cells, reverse transcribed into cDNA molecules, and the genome These are combined to provide the entire cDNA copy. Next, the traditional Using the cloning technique, insert the (DV cDNA) into the pSVL vector. Ru.
本発明の構造がそなえる重要な性質の一つは請求める効果を実現するためには、 このようなＨＤＶ由来のｃＤＮＡ挿入が、二つあるいはそれ以上構造の中に存在 しなければならないことである。One of the important properties of the structure of the present invention is that in order to achieve the desired effect, Two or more such HDV-derived cDNA insertions are present in the structure. It is something that must be done.
これまで述べてきたように、本構造は選別された宿主細胞の中で一つのＤＮＡ分 子全体を自律的に複製することができる。さらに、ＨＤ〜′由来のｃＤＮ、Ａ断 片は、選別された標的細胞の中でＲＮＡ分子として自律的に複製することができ る。As mentioned above, this structure allows one DNA segment to be present in selected host cells. Entire children can be replicated autonomously. Furthermore, the cDNA derived from HD~', the A fragment fragments can autonomously replicate as RNA molecules in selected target cells. Ru.
しかし本構造は、最後に治療ＲＮＡ分子を発生させることになるＤＮＡ断片を含 むように修飾されるまでは、治療上の有効性をもたない。ＲＮＡ種としての治療 ＲＮＡ分子の複製を可能にするためには、この断片を本構造のＲＮＡ由来部分に 挿入しなければならない。断片のいずれの機能部分をも分離しないように、ＲＮ Ａ由来断片の中の挿入部位を選ぶことが重要である。好ましい実施例では、二つ のウッドチャックのＨＤＶ由来ｃＤＮＡのそれぞれの構造内挿入は、７９５と７ ９８の間の位置で挿入が行なわれる。この位置はＨＤＶゲノムの、臨界二次構造 形成、遺伝子発現、そして複製開始点に関わる部分を避けていることが利点であ る。このＨＤＶゲノムの構造と構成を、治療ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ断片 の挿入位置とともに図１のＡからＣに示す。ウッドチャックＨＤＶゲノムの配列 と構成ニツイては、Ｋｕｏら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６２：１８５５−６１ （１９ ８８）と、Ｔａｙｌｏｒ、Ｓｅｍ１ｎａｒｓ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １：１ ３５−４１ （１９９０）に詳細に記述されている。However, this structure contains the DNA fragment that will ultimately generate the therapeutic RNA molecule. It has no therapeutic efficacy until it is modified to do so. Treatment as RNA species To enable replication of the RNA molecule, this fragment is inserted into the RNA-derived portion of the structure. must be inserted. RN so as not to separate any functional parts of the fragment. It is important to choose the insertion site within the A-derived fragment. In the preferred embodiment, two The respective structural insertions of the woodchuck HDV-derived cDNAs are 795 and 7. Insertion occurs at positions between 98 and 98. This position is a critical secondary structure of the HDV genome. The advantage is that it avoids areas involved in formation, gene expression, and origins of replication. Ru. The structure and composition of this HDV genome can be synthesized into DNA fragments encoding therapeutic RNA molecules. It is shown in A to C of FIG. 1 along with the insertion position. Woodchuck HDV genome sequence Kuo et al., J. Virol, 62:1855-61 (19 88) and Taylor, Sem1nars in Virology 1:1 35-41 (1990).
治療ＲＮＡを発生させるＤＮＡ挿入は、例えば、リボザイムまたは特異的な標的 ＲＮ、Ａを指定する「アンチセンスＪ ＲＮＡ分子をコードする配列によって構 成することができる。両方の型の挿入を設計するためには、標的ＲＮＡのヌクレ オチド配列を知る必要がある。関連したりポザイムの構造はＨａｓｅｌｏｆｆと ＧｅｒｌａｃｈＳＮａｔｕｒｅ、３３４：５８５−９１ （１９８８）のもので ある。The DNA insertion that generates the therapeutic RNA can be performed using, for example, a ribozyme or a specific target. RN, A is designated by an antisense J RNA molecule-encoding sequence. can be achieved. To design both types of insertions, the target RNA nucleotide You need to know the punchline sequence. The structure of related pozymes is Haseloff and GerlachSNature, 334:585-91 (1988). be.
概説は、Ｃｅｃｈ、Ｊ、Ａｍｅｒ、Ｍｅｄ、Ａｓ５ｎ、２６０：３０３０−３４ （Ｎｏｖ、２５．１９８８）を参照。Reviewed in Cech, J. Amer, Med, As5n, 260:3030-34. (Nov. 25.1988).
治療ＲＮＡを発生させる配列は、いくつかの方法で本構造のＲＮＡ由来部分に挿 入することができる。好ましい実施例では、選別したｍＲＮＡまたはウィルスＲ ＮＡ種指定リボザイムをコードする、オリゴヌクレオチドのポリメラーゼ連鎖反 応（ＰＣＲ）増幅を伴う。特異的な例には、クロラムフェニコールアセチルトラ ンスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードするｍＲＮＡを指定したりポザイム（Ｈａｓ ｅｌｏｆｆとＧｅｒｌａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ、３３４ ： ５８５−９１ （１ ９８８）、およびＢ型肝炎プリゲノムＲＮＡの分離を標的とするりポザイムが含 まれる。これらのりボザイムの構造を図式的に図２（配列１． Ｄ、 Ｎｏ、２ ） 、図５（配列ｒ、 Ｄ、 Ｎｏ、４）にそれぞれ示す。Ｂ型肝炎ウィルスの ブリゲノムＲＮＡを指定するりボザイムは、感染細胞でのＢ型肝炎ウィルスの複 製を抑制する大きな効果をもつことが期待されている。Sequences that generate therapeutic RNA can be inserted into the RNA-derived portion of the structure in several ways. can be entered. In a preferred embodiment, the selected mRNA or virus R Polymerase chain reaction of oligonucleotides encoding NA species-specific ribozymes (PCR) amplification. Specific examples include chloramphenicol acetyltra Specify the mRNA encoding sferase (CAT) or create a pozyme (Has Eloff and Gerlach, Nature, 334: 585-91 (1 988) and lipozymes that target the isolation of hepatitis B pregenomic RNA. be caught. The structure of these ribozymes is schematically shown in Figure 2 (sequence 1.D, No. 2). ) and are shown in FIG. 5 (array r, D, No. 4), respectively. hepatitis B virus Ribozyme, which specifies the hepatitis B genome RNA, inhibits the replication of hepatitis B virus in infected cells. It is expected to have a significant effect in suppressing manufacturing costs.
挿入を実現するための、リボザイムをコードするオリゴヌクレオチドの挿入は、 ウッドチャックＨＤＶゲノムの７９５−７９８の位置を取り囲む部分の両側に配 列相補的に接している。オリゴヌクレオチドは、本構造に対してハイブリッドを 形成し、次に、技術上周知の方法によってＰＣＲ増幅を受ける。その結果生じる 集団は、オリゴヌクレオチド挿入を含む構造をほとんど排除して構成される。Insertion of an oligonucleotide encoding a ribozyme to achieve insertion is located on either side of the portion surrounding positions 795-798 of the woodchuck HDV genome. The columns are complementary and touching. The oligonucleotide hybridizes to this structure. and then undergo PCR amplification by methods well known in the art. resulting The population is constructed to largely exclude structures containing oligonucleotide insertions.
本発明の構造の中に配列を挿入する別の方法には、ＲＮＡ由来断片上の適切な位 置に、ＰＣＲ増幅オリゴヌクレオチド指定変異源によって、上述のように制限酵 素切断部位を導入することが含まれる。次に、治療ＲＮＡ分子をコードする挿入 を、制限切断とライゲーションを含む伝統的な組換えＤＮＡ法を用いて、本構造 内に導入することができる。Another method of inserting sequences into the constructs of the invention involves inserting sequences at appropriate positions on RNA-derived fragments. At the same time, PCR amplified oligonucleotide-directed mutagenesis was performed using restriction enzymes as described above. This includes introducing an elementary cleavage site. Next, inserts encoding therapeutic RNA molecules This construct was constructed using traditional recombinant DNA methods including restriction cutting and ligation. It can be introduced within.
標的細胞に加えると、本発明のＤＮＡ構造は、治療ＲＮＡ分子をコードするＲＮ Ａ複製可能断片を提供することができる。これは、それぞれの標的細胞内に非常 に大量のコピー数の治療ＲＮＡ分子を発生させることができるため、治療ＲＮＡ 分子を提供するための以前の方法に（らべて明瞭な利点となる。すでに述べたよ うに、小さなコピー数で提供された治療ＲＮＡ分子は、臨床的に有効な効果を提 供するとは考えられない。それとは対照的に本発明の構造は、標的細胞に加えた ときに、細胞あたり１００．０００まで、あるいはそれを超える数の治療ＲＮＡ 分子のコピーを生産することができる。このようにして発生したりポザイムは、 標的としたＲＮＡ種に対し、容易に判断できるだけの抑制効果をもつことができ る。この効果については、下記の例３でさらに詳細に示す。When added to a target cell, the DNA constructs of the present invention provide RNA encoding therapeutic RNA molecules. A replicable fragment can be provided. This is very important within each target cell. Therapeutic RNA molecules can be generated in large copy numbers in This is a distinct advantage compared to previous methods for delivering molecules, as already mentioned. Therefore, therapeutic RNA molecules provided in small copy numbers may provide clinically beneficial effects. I can't imagine offering it. In contrast, the constructs of the present invention have been added to target cells. Sometimes up to or more than 100,000 therapeutic RNAs per cell Copies of molecules can be produced. Pozymes generated in this way are It can have an easily determined inhibitory effect on the targeted RNA species. Ru. This effect is shown in more detail in Example 3 below.
ＨＤＶ由来の構造を用いてこのような大量のコピー数を実現できる手段は、図１ に示すようなり型肝炎ウィルスの複製周期に起因しており、Ｔａｙｌｏｒ、Ｓｅ ｍ１ｎａｒｓ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １：１３５−４１ （１９９０）によ って、さらに完全に記述されている。ＨＤＶ由来のｃＤＮＡ断片て構成されるＤ ＮＡ構造を標的細胞に加えると、治療ＲＮＡ挿入を含むＨＤＶゲノミックＲＮＡ が転写によって細胞内に形成される。その後、完全なアンチゲノムの相補的ＲＮ Ａ配列を形成することによって、ＨＤＶゲノムが復製される。ゲノム性およびア ンチゲノム性のＲＮＡ配列はどちらも連続した復製過程を経ることが可能で、Ｈ ＤＶゲノムとアンチゲノムの両方のコピーを多数形成する。しかし、ＨＤＶゲノ ムの方が、ＨＤＶアンチゲノムよりも多重に形成されることが示されている。し たがって、細胞内で複製されたゲノムの大量なコピー数の大部分は、ＨＤＶケノ ムと同一なＲＮＡ種で構成される。これは、治療ＲＮＡ分子を含むように設計さ れたゲノムの鎖なので、それに対応する大量のコピー数の治療ＲＮＡを形成し、 その結果として、立証可能で臨床的に有効な分量の治療ＲＮＡ分子が各標的細胞 内に生じる。A means by which such large copy numbers can be achieved using HDV-derived structures is shown in Figure 1. This is due to the replication cycle of the hepatitis virus, as shown in Taylor, Se. According to m1nars in Virology 1:135-41 (1990) It is more fully described. D composed of cDNA fragments derived from HDV Adding the NA structure to target cells will generate HDV genomic RNA containing the therapeutic RNA insertion. is formed within the cell by transcription. Then the complementary RN of the complete antigenome By forming the A sequence, the HDV genome is recreated. Genomic and a Both antigenomic RNA sequences are capable of undergoing a continuous reproduction process, and H It forms multiple copies of both the DV genome and antigenome. However, HDV Geno The HDV antigenome has been shown to be more multiplexed than the HDV antigenome. death Therefore, most of the large number of copies of the genome replicated within the cell is It is composed of the same RNA species as the system. It is designed to contain therapeutic RNA molecules. strand of the genome, forming a corresponding large number of copies of the therapeutic RNA, As a result, a verifiable and clinically effective amount of therapeutic RNA molecules is delivered to each target cell. arise within.
ＣＡＴｍＲＮＡ指定リボザイムのすうな、治療ＲＮＡが目的とする効果は、下記 の例３で記述するように、本発明のＤＮＡ構造を用いて培養細胞を形質転換する ことによって立証された。しかし、本発明のより大きな効果としては、前記ＤＮ Ａ構造の臨床応用を意図している。Ｄ型肝炎ウィルスのライフサイクルの独自な 側面は、本発明の構造を ｉｎ ｖｉｖｏ で肝細胞に直接提供することを可能 にする。これが可能である理由は、Ｄ型肝炎ウィルスは宿主細胞からウィルス自 身をパッケージングまたは解放することができないためである。ＨＤＶは、他の ヘパドナウィルスによって供給される機能に依存して、そのライフサイクルの一 部を終える。例えば、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）が必要なパッケージング機能 を提供すると、ＨＤＶエンベロープがＨＢＶエンベロープと同様な標的シグナル をもち、その結果その標的細胞範囲を肝細胞に特異化する。The intended effects of therapeutic RNA, such as the CAT mRNA designated ribozyme, are as follows: The DNA constructs of the invention are used to transform cultured cells as described in Example 3 of It was proven by this. However, the greater effect of the present invention is that the DN It is intended for clinical application of the A structure. The unique life cycle of the hepatitis D virus Aspects allow the structure of the invention to be provided directly to hepatocytes in vivo. Make it. This is possible because the hepatitis D virus can release the virus itself from host cells. This is because they cannot package or release themselves. HDV is other Depending on the functions provided by the hepadnavirus, part of its life cycle is Finish the section. For example, packaging functions that require hepatitis B virus (HBV) If the HDV envelope provides a target signal similar to that of the HBV envelope, , thereby specifying its target cell range to hepatocytes.
これらのＨＢＶ依存パッケージング過程は ｉｎ ｖｉｔｒｏ で実行可能なの で、必要なＨＢＶのヘルパー機能を含むように培養細胞を形質転換するために本 発明のＤＮＡ構造を最初に使用することができる。治療ＲＮＡをコードする挿入 を含んだ本構造のＨＤＶ由来断片は、ＨＤＶゲノム内とアンチゲノム内に転写さ れ、はじめに述べたように大量のコピー数に増幅される。その後これらのゲノム は、完全なピリオンがＨＢＶ標的シグナルを運ぶときにパッケージされ、解放さ れる。次に、治療ＲＮＡ挿入をもつＨＤＶゲノムを含んだピリオンを、適切な調 整製剤の形でヘパドナウィルスに感染した、轡者に投与することができる。ピリ オンは、すでに存在するヘパドナウィルス感染の部位の肝細胞を標的とし、そし て感染する。これらの標的細胞内では、ＨＤＶゲノムが複製可能であり、無数の 治療ＲＮＡのコピーを生産する。ブリゲノムまたは他のＨＢＶ ＲＮＡ種を指定 するりボザイムとなるように治療ＲＮＡを設計すれば、ＨＢＶのライフサイクル が中断され、ＨＢＶが誘発する疾患症状を抑制する。These HBV-dependent packaging processes can be performed in vitro. In order to transform cultured cells to contain the necessary HBV helper functions, The inventive DNA structure can be used for the first time. Insertion encoding therapeutic RNA The HDV-derived fragment containing this structure is transcribed into the HDV genome and antigenome. and, as mentioned in the introduction, are amplified to a large number of copies. Then these genomes is packaged and released when the intact pillion carries the HBV targeting signal. It will be done. The pillion containing the HDV genome with the therapeutic RNA insertion is then subjected to appropriate preparation. It can be administered in the form of a therapeutic preparation to delinquent individuals infected with hepadnavirus. Pili On targets liver cells at the site of pre-existing hepadnavirus infection and become infected. Within these target cells, the HDV genome is replicable and contains countless Produce copies of therapeutic RNA. Specify yellowtail genome or other HBV RNA species If therapeutic RNA is designed to be a Suribozyme, the life cycle of HBV can be improved. is interrupted, suppressing HBV-induced disease symptoms.
以下の例は、本発明をさらに詳細に記述するために提供する。これらの例は、単 に説明することを意図しているものであり、発明を制限することは意図していな い。明記したちの以外、一般のクローニング法はＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏ１ｅ ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ （１９８９）に記載された方法に従う。The following examples are provided to further describe the invention. These examples are simple and are not intended to limit the invention. stomach. Unless otherwise specified, general cloning methods are described by Sambrook et al., Mole cular Cloning, Co1d Spring Harbor Lab (1989).
例１ ウッドチャックのＤ型肝炎ウィルスゲノムの二つのｃＤＮＡコピーを含むＤＮＡ ベクターの構造。Example 1 DNA containing two cDNA copies of the woodchuck hepatitis D virus genome Vector structure.
クローニング ＨＤＶに感染したウッドチャックの肝臓から得たＲＮＡを、ｃＤＮＡを作るため にλｇｔｌｌの中で使用した。感染したウッドチャックの肝臓から得た全ＲＮＡ を、グニジンイソチオンアン酸を用いた抽出によって分離し、セシウム塩平衡の 遠心法によって精製した（Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１８ ・５２９４−９９．１９７９）。ショ糖勾配の速度ゾーナル遠心法によってＲＮ Ａをさらに精製し、ＨＤＶのＲＮＡの全長を含む大きさの分類を得た。簡潔にい えば、このＲＮＡを逆転写酵素と不規則オリゴヌクレオチドブライマーによって 、二本鎖ｃＤＮＡＩ：転換した（Ｔａｙｌｏｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈ ｙｓ、Ａｃｔａ ４４２：３２４−３０．１９７６）、サイズ決定ののち、Ｅｃ ｏＲｒリンカ−を付加し、産物をλｇｔｌｌのＥｃｏＲＩ部位に挿入した。得ら れたクローンライブラリーは、最初にサブゲノミック長のδクローンｐｋＤＬに よってスクリーンを行なった（Ｄｅｎｎ ｉ ｓ ｔｏｎら、５ｃｉｅｎｃｅ ２３２：８７３〜７５．１９８６）。さらにスクリーニング過程を経たのち、選 別したクローンをＤＮＡ配列分析し、ウッドチャックＨＤＶの完全なヌクレオチ ド配列を決定した。cloning To create cDNA from RNA obtained from the liver of a woodchuck infected with HDV. was used in λgtll. Total RNA obtained from infected woodchuck liver was separated by extraction with gunidine isothioanic acid, and the cesium salt equilibrium was determined. Purified by centrifugation (Chirgwin et al., Biochemistry 18 ・5294-99.1979). RN by velocity zonal centrifugation of sucrose gradients A was further purified to obtain a size classification containing the full length of HDV RNA. be concise For example, this RNA can be processed by reverse transcriptase and irregular oligonucleotide primers. , double-stranded cDNA I: converted (Taylor et al., Biochim, Bioph ys, Acta 442:324-30.1976), after size determination, Ec An oRr linker was added and the product was inserted into the EcoRI site of λgtll. Obtained The clone library was first transformed into subgenomic length δ clone pkDL. Therefore, a screen was performed (Denn et al., 5science). 232:873-75.1986). After going through a further screening process, DNA sequence analysis of isolated clones revealed the complete nucleotide sequence of woodchuck HDV. The code sequence was determined.
ＤＮＡの配列決定および分析 Ｚａｇｕｒｓｋｙら、Ｇｅｎｅ Ａｎａｌ、Ｔｅｃｈ、２：８９−９４ （１９ ８５）とＴａｂｏｒら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｆ、ＵＳＡ ８４： ４７６７−７１ （１９８７）によって修正されたＳａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ ７４：５４６３−６７ （１９７７）のジ デオキシ鎖停止法を使用して、ヌクレオチド配列決定反応を行なった。未確定の 領域は、修正したＭａｘａｍ−Ｇｉ Ｉｂｅｒｔ法（Ｂｅｎｃｉｎｊら、Ｂ１０ ｔｅＣｎｉｑｕｅｓ Ｊａｎ、／Ｆｅｂ、１９８４、ｐｐ、４−５＞を使用して 確認した。得られた配列情報のコンピューターによる分析は、ライスコンシン大 学の遺伝子コンピューターグループ（Ｄｅｖｅｒｅａｕｘら、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄ ｓ、Ｒｅｓ、１２：３８７−９５．１９８４）の配列分析ソフトウェアパッケー ジを使用して行なった。DNA sequencing and analysis Zagursky et al., Gene Anal, Tech, 2:89-94 (19 85) and Tabor et al., Proc. Nat. Acad, Scf, USA 84: 4767-71 (1987) as modified by Sanger et al., Proc. Nat, Acad, Sci, USA 74:5463-67 (1977). Nucleotide sequencing reactions were performed using the deoxy chain termination method. undetermined The regions were determined using the modified Maxam-Gi Ibert method (Becinj et al., B10 Using teCniques Jan, /Feb, 1984, pp, 4-5> confirmed. Computer analysis of the obtained sequence information was conducted at Rice Consin University. Gene Computer Group (Devereaux et al., Nuc, Ac1d) Res, 12:387-95.1984) sequence analysis software package. This was done using a ji.
選別したクローンのうちの三つを、プラスミドｐＧｅｍ４ＢＩｕｅ （Ｐｒｏｍ ｅｇａ）に転移した。これらの挿入の部分を単一のプラスミドの上に組み立て、 ＨＤＶゲノムの１６７９塩基の１４２７の位置でＥｃｏＲ１部位に対応して配向 し、それによって、ＨＤＶゲノムの全長のＤＮＡコピーを構成した。次に、限定 分解と追加挿入を含む方法によって、全挿入を三量体に構成した。この三量体は 、ＢａｍＨＩとＰｖｕ Ｉ Ｉによって切断し、ＢａｍＨＩとＳｍａ Ｉによっ て切断したベクターｐＳＶＬ （Ｐｈａ ｒｍａｃ ｉ ａ）に強制クローニン グした。結果として生じた構造をｐＳＶＬ ［Ｄ３］と名付けた。Three of the selected clones were transformed into plasmid pGem4BIue (Prom ega). Assemble parts of these inserts onto a single plasmid, Oriented corresponding to the EcoR1 site at position 1427 of base 1679 of the HDV genome. and thereby constructed a full-length DNA copy of the HDV genome. Next, limited All inserts were assembled into trimers by a method that included disassembly and additional inserts. This trimer is , cut by BamHI and PvuII, and cut by BamHI and SmaI. Forced cloning into the cut vector pSVL (Pha rmac ia) I clicked. The resulting structure was named pSVL[D3].
例２ タロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ｍＲＮＡを指定す るりボザイムをコードする断片を提供するための単位長ＨＤＶ配列の修飾。Example 2 Specifies taloramphenicol acetyltransferase (CAT) mRNA. Modification of unit length HDV sequences to provide luribozyme-encoding fragments.
抗ＣＡＴリボザイムをコードする配列の付加（ＨａｓｅｌｏｆｆとＧｅｒｌａｃ ｈ、Ｎａｔｕｒｅ、３３４ ：５８５−９１ （１９８ｇ））は、本構造のＨＤ Ｖゲノム由来断片の非必須部分のＰＣＲ増幅オリゴヌクレオチド指定変異誘発に よって達成した。ウッドチャックＨＤＶゲノムの７９７の位置を、変異誘発の位 ！として選んだ。ＨＤＶゲノムの７８９−７９６および７９８−８０２の位置に 対し配列相補的に側面に接した、抗ＣＡ Ｔ ＩＪボザイムをコードする配列で 構成されるオリゴヌクレオチドは、ホスファミダイト化学を使用して合成した（ 配列ＩＤＮｏ、２）ｏ単位長配列を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏ、の酵素 と手順を用いたＰＣＲを使用して、この方法で修飾した。この配列をクローニン グして二量体に構成し、次にｐＳＶＬに転移してｐＳＶＬ［Ｄ２−抗ＣＡＴ］と 名付けた。Addition of sequences encoding anti-CAT ribozymes (Haseloff and Gerlac h, Nature, 334:585-91 (198g)) is the HD of this structure. For PCR amplification oligonucleotide-directed mutagenesis of non-essential parts of V genome-derived fragments Therefore, it was achieved. Position 797 of the woodchuck HDV genome was mapped to the site of mutagenesis. ! I chose it as. At positions 789-796 and 798-802 of the HDV genome A sequence that encodes an anti-CA T IJ bozyme flanked by complementary sequences. The oligonucleotides constructed were synthesized using phosphamidite chemistry ( Sequence ID No., 2) o unit length sequence, Perkin-Elmer Co, enzyme modified in this way using PCR using the procedure. Clone this sequence It is assembled into a dimer and then transferred to pSVL to form pSVL[D2-anti-CAT]. I named it.
例３ 本発明の構造を用いた標的細胞の形質転換と、そこからの治療ＲＮ、Ａ分子を含 むＨＤＶゲノムの複製。Example 3 Transformation of target cells using the structures of the invention and therapeutic RNA containing therefrom, the A molecule. Replication of the HDV genome.
形質転換 上記の例１および例２で述べたように、それぞれの単量体がリボザイム挿入を含 むようなウッドチャックＨＤＶゲノム配列の二量体を、ＳＶ４０をベースにした ベクターｐＳＶＬに組み立てた。その構造は、５Ｖ４０１ａｔｅプロモーターに よって調節されたＲＮＡ転写が、ＨＤＶ ＲＮＡのゲノム転写物を産生じたもの であった。ｐＳＶＬ ［Ｄ２−抗ＣＡＴ９と名付けられたプラスミドは、Ｇｌｕ ｚｍａｎ、Ｃｅ ］ Ｉ ２３ ：１７５−８２ （１９８１）によって最初に 分離されたサルの腎臓細胞株Ｃ０Ｓ７の中に形質変換した。transformation As mentioned in Examples 1 and 2 above, each monomer contains a ribozyme insertion. A dimer of the similar woodchuck HDV genome sequence was created based on SV40. Assembled into vector pSVL. Its structure is based on the 5V401ate promoter. The regulated RNA transcription thus produced genomic transcripts of HDV RNA. Met. The plasmid named pSVL [D2-anti-CAT9 is a Glu zman, Ce] I 23:175-82 (1981) The isolated monkey kidney cell line COS7 was transformed.
ＤＥＡＥデキストラン形質転換法を、Ｃｕ１ｌｅｎ、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ、１５２ ： ６８４−７０４ （１９８７）が記述したように使用した。この方法を、 直径１６ｍｍの糟当たり１００．０００の細胞を使用し、また糟当たり５０μＬ の中に僅か１２０ｎｇのＤＮＡを使用するように規模を小さくした。形質転換の のち、採取までは培地を２日ごとに取り替えた。細胞を洗浄し、スクレーピング によって取り去り、次にその中に含まれるＲＮＡを抽出して、Ｃｈｅｎら、Ｐｒ ｏｃ。The DEAE dextran transformation method was described by Cullen, Meth, Enz, 152. :684-704 (1987). This method 100.000 cells were used per 16 mm diameter cell and 50 μL per cell. The scale was reduced to use only 120 ng of DNA in the sample. of transformation Thereafter, the medium was replaced every two days until harvest. Washing and scraping cells and then extracting the RNA contained therein as described by Chen et al., Pr. oc.
Ｎａｔ、、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｔ；ＳＡ ８３：８７７４−７８ （１９８８） が記述したようにノーサン法分析を行なった。Nat, Acad, Sci, T;SA 83:8774-78 (1988) Northan analysis was performed as described by.
形質転換した細胞のノーザン分析は、図面の図３に示し、すでに記述したように 本構造の治療ＲＮＡを含む）（ＤＶゲノムがＲＮＡ分子としての正常な複製の過 程を経ることができることを立証した。さらに、図４に記述したように、ＨＤＶ の複製は、その中に抗ＣＡＴリポザイムを含む有効な分量を提供するのに十分な 大きさであった。ＣＡＴを発現する標的細胞は、すでに示したように（１） ｐ ５ＶＬ単独、（２） 本発明１７）構造（ｐＳＶＬ ［Ｄ２−抗ＣＡＴ］）ま、 Ｉ’：は（３）ＨＤＶ由来ｃＤＮＡの三量体を含む構造のいずれかを含む構造に よる形質転換に従うが、リポザイム挿入には従わない。本発明の構造による形質 転換は、前記標的細胞の中で、３倍から５倍のＣＡＴ活性の抑制を引き起こした 。Northern analysis of transformed cells is shown in Figure 3 of the drawings and as previously described. (contains therapeutic RNA of this structure) (the DV genome undergoes normal replication as an RNA molecule). We have proven that it is possible to go through the process. Furthermore, as described in Figure 4, HDV replication is sufficient to provide an effective quantity containing anti-CAT lipozyme therein. It was the size. Target cells expressing CAT are, as already shown (1) p 5VL alone, (2) Invention 17) structure (pSVL [D2-anti-CAT]), I': (3) A structure containing any of the structures containing a trimer of HDV-derived cDNA but not lipozyme insertion. Traits due to the structure of the present invention Conversion caused a 3- to 5-fold suppression of CAT activity in the target cells. .
本発明は上記で記述した、あるいは例証した実施例に明確に限定されることなく 、添付した請求項の範囲から逸脱しない限りにおいて変形および修正が可能であ る。The invention is not expressly limited to the embodiments described or illustrated above; , variations and modifications are possible without departing from the scope of the appended claims. Ru.
Ｓ’−ＧＣＡＵＵＵＣＡＧＵＣＡＧＵＵＧＣＵＣＡＡ−３’Ｃ☆ＧＡＧ Ａ＊Ｕ Ｇ＊Ｃ Ｕ ８１′：ｙ゛イシ゛又ト ｐＣＭＶ （ＣＡＴ） 国際調査報告 −−−ｎ−一−−１−ＡＭＨｅ＋’＋Ｍｅ、ＰｅＴＡｌ・・１４７−１S’-GCAUUUCAGUCAGUUGCUCAA-3’C☆GAG A*U G*C U 81': y゛ishi゛matato pCMV (CAT) international search report ---n-1--1-AMHe+'+Me, PeTAL...147-1
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