JPH06502069A - Vaccinia vector, vaccinia gene and its expression product - Google Patents
Vaccinia vector, vaccinia gene and its expression productInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.
Description
【発明の詳細な説明】 ワタシニアベクター、ワクシニア遺伝子及びその発現生成物本発明は、組換え型 ワクシニアウィルスベクターに関する。特に、本発明は、ウィルスの弱毒化、ウ ィルスの潜在的な強化された免疫原性、ウィルス内への異種遺伝子配列の挿入の ための部位の提供、かくして提供された組換え型ウィルスベクターの使用に関す る。これは又ワクシニア遺伝子の発現生成物であるタンパク質にも関する。[Detailed description of the invention] Cotton vaccinia vector, vaccinia gene and its expression product The present invention provides recombinant Regarding vaccinia virus vectors. In particular, the present invention provides virus attenuation, Potentially enhanced immunogenicity of the virus, due to the insertion of foreign gene sequences within the virus. provision of sites for the use of the recombinant viral vectors thus provided. Ru. It also relates to proteins that are expression products of the vaccinia gene.
生きたワクシニアウィルスは、天然痘に対する免疫を与え天然痘を撲滅するため のワクチンとして用いられた。ワクシニアウィルス（ＶＶ）は、ポックスウィル ス族の始原型メンバーであり、従つて広く研究されてきた。これは、宿主細胞の 細胞質内で復製する大きなりＮＡ含有ウィルスである。約１８５０００塩基対の 直線２重鎖ゲノムは、少なくとも２００のタンパク質をコードする潜在能を有す る。（Ｍｏｓｓ。Live vaccinia virus provides immunity to smallpox to eradicate smallpox It was used as a vaccine. Vaccinia virus (VV) is a poxvirus It is a prototypical member of the Su tribe and has therefore been widely studied. This is the host cell It is a large NA-containing virus that reproduces within the cytoplasm. approximately 185,000 base pairs The linear duplex genome has the potential to encode at least 200 proteins. Ru. (Moss.
Ｂ（１９９０年）、「ウィルス学」内、Ｂ、Ｎ、 Ｆｉｅｌｄｓ Ｅｄ、 ｐ２ ０７９〜２１１１０Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。細胞質複 製部位は、ワクシニアウィルスかそのゲノムの転写及び複製に必要な数多くの酵 素及びタンパク質因子をコートすることを必要とする。このウィルスは又、多細 胞宿主内のウィルス復製を変調し宿主免疫系の回避を助けるさまざまな因子もコ ードする（Ｍａｓｓ、 Ｂ （１９９０年）。 「ウィルス学Ｊ中。Ｂ、 Ｎ。B (1990), “Virology”, B, N. Fields Ed, p2 079-21110 Raven Press, New York). cytoplasmic complex The production site contains the numerous enzymes necessary for transcription and replication of the vaccinia virus or its genome. Requires coating with protein and protein factors. This virus is also highly detailed. Various factors that modulate virus reproduction within the host and help evade the host immune system are also involved. (Mass, B. (1990). Virology J Junior High School. B, N.
Ｆｉｅｌｄｓ Ｅｄ、 ｐｐ２０７９〜２１１１． Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ＞。分子遺伝学における進歩は、その他の生体に由来する遺 伝子を含み発現する組換え型ワクシニアウィルスの構築を可能にした（再考のた めにはＭａｃｋｅｔｔ、 ！＋！、 ＆ Ｓｍ１ｔｈ ＧＬ （１９８６年） 、Ｊ、 Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ６７、２０６７〜２０８２参照）。組換え梨ウィ ルスは、ウィルスの通常の複製サイクル中その感染力を保持し外来性遺伝子（単 数又は複数）を発現する。組換え梨ウィルスでの動物の免疫化は、外米性遺伝子 によって発現されるタンパク質を含むワクシニアウィルスによって発現されたタ ンパク質に対する特異的な免疫応答を結果としてもたらし、いくつかのケースに おいては、外来性遺伝子の由来する元である病原性生体に対する保護を与えた。Fields Ed, pp2079-2111. Raven Press, New York>. Advances in molecular genetics have led to the development of genes derived from other organisms. This made it possible to construct a recombinant vaccinia virus that contains and expresses the gene (for reconsideration). Hello Mackett! +! , & Sm1th GL (1986) , J. Gen Virol 67, 2067-2082). Recombinant pear wi The virus retains its infectivity during the normal replication cycle of the virus and number or plurality). Immunization of animals with recombinant pear virus proteins expressed by vaccinia virus, including proteins expressed by resulting in a specific immune response against the protein and in some cases In some cases, it conferred protection against the pathogenic organism from which the foreign gene was derived.
従って組換え型ワクシニアウィルスは、人体医学又は獣医学において新しいワク チンとして潜在的利用分野をもつ。このタイプの新しい生ワクチンの利点として は、ワクチン製造及び投与のコストか低いこと（ウィルスか自己複製するため） 、体液性及び細胞性免疫応答の両方を誘発すること、凍結しないでもウィルスワ クチンか安定していること及び多くの病原体に対して効果のある多価ワクチンを 構築するため異なる生体からワクシニアウィルス内に多くの外来性遺伝子を挿入 することか実用的であることなどかある。このアプローチの欠点は、稀少なワク チンｌ！Ｉ連合併症をひき起こすものとして認識されてきたウィルスワクチンの 使用である。Therefore, recombinant vaccinia virus is a new vaccine in human or veterinary medicine. It has a potential field of use as a chin. The advantages of this type of new live vaccine are The cost of vaccine production and administration is low (because the virus is self-replicating) , induce both humoral and cell-mediated immune responses, and suppress virus release even without freezing. Multivalent vaccines that are stable and effective against many pathogens Inserting many foreign genes into vaccinia virus from different organisms to construct There are practical things to do. The disadvantage of this approach is that rare Chin l! Viral vaccines that have been recognized as causing complications is of use.
出願人は今、ウィルスゲノム内の明白でない遺伝子配列を識別した。本出願では 、右側近くの逆転末端反復（ＩＴＲ）からの２つの遺伝子Ｂ１５Ｒ及びＢＩ８Ｒ の構造について記述されており、互いに関連し免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパー ファミリーに関連し又ヒト（Ｓｉｍｓ、 Ｊ、Ｅ、。Applicants have now identified a non-obvious genetic sequence within the viral genome. In this application , two genes from the inverted terminal repeat (ITR) near the right side, B15R and BI8R The structures of the immunoglobulin (Ig) superorganisms are described and are related to each other. Related to the family and humans (Sims, J.E.).
Ａｃｒｅｓ、 Ｒ，Ｂ、 Ｇｒｕｂｉｎ、 Ｃ，Ｅ、 ＭｃＭａｈａｎ、 Ｃ， Ｊ、、 ＷｉｇｎａｌＬ、 Ｊ、Ｌ（１９８９）。Acres, R.B., Grubin, C.E., McMahan, C. J., Wignall, J. L. (1989).
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ８６．８９４６−８ ９５０）及びマウス（Ｓｉｍｓ Ｊ。Proc, Natl, Acad, Sci, USA 86.8946-8 950) and mouse (Sims J.
Ｅ、、 Ｍａｒｃｈ、 Ｃ，Ｊ、、 Ｃｏｓｍａｎ、 Ｄ、、 ＷＩｄｒｎｅｒ 、 Ｍ、Ｂ、、 ＭａｃＤｏｎａｌｄ、 Ｈ，Ｒ，。E, March, C, J, Cosman, D, WIdrner , M.B., MacDonald, H.R.
ＭｃＭａｈａｎ、 Ｃ，Ｊ、、 Ｇｒｕｂｉｎ、 Ｃ，Ｅ、、 Ｗｉｇｎａｌｌ 、 Ｊ、Ｍ、、 Ｊａｃｋｓｏｎ、 Ｊ、Ｌ、。McMahan, C.J., Grubin, C.E., Wignall , J.M., Jackson, J.L.
Ｃａ１ｌ、 Ｓ、Ｍ、、 Ｆｒ１ｅｎｄ、 Ｄ、、 Ａｌｐｅｒｔ、 Ａ、Ｒ， 、Ｇ１１ｌｉｓ、 Ｓ、、 Ｕｒｄａｌ、 Ｄ、Ｌ及びＤｏｗｅｒ、 Ｓ、に、 （１９８８）、 ５ｃｉｅｎｃｅ ２４１．５８５−５８９）のインターロイキ ン−ルセプタ−（ＩＬ−ＩＲ）に関連する複数のタンパク質をコードするもので あることか示されている。Ｂ１８Ｒの生成物は、感染初期に細胞表面上で発現さ れ、それに対して向けられた抗体は、直接ウィルス感染力を中和させることなく ウィルス感染に対する抵抗力を付与する（Ｕｅｄａ Ｙ、、 Ｍｏｒｉｋａｔｖ ａ、 Ｓ、及びＭａｔｓｕｕｒａ、 Ｙ、（１９９０年）。Ca1l, S, M, Fr1end, D, Alpert, A, R, , G11lis, S, , Urdal, D, L and Dower, S, (1988), 5science 241.585-589) Interloiki It encodes multiple proteins related to IL-IR receptor (IL-IR). Something is being shown. B18R products are expressed on the cell surface early in infection. Antibodies directed against it do not directly neutralize virus infectivity. Provides resistance to virus infection (Ueda Y, Morikatv a, S., & Matsuura, Y. (1990).
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７７、５８８−５９８： Ｕｅｄａ Ｙ、及びＴａｇａｙ ａ、ｆ、 （１９７３年）、Ｊ。Virology 177, 588-598: Ueda Y, and Tagay a, f, (1973), J.
Ｅｘｐ、 １Ｊｅｄ、１３８．１０３３−１０４３； Ｉｋｕｔａ、 Ｋ、、 Ｍｉｙａｍｏｔｏ、 Ｈ，及びＫａｔｏ。Exp, 1Jed, 138.1033-1043; Ikuta, K. Miyamoto, H., and Kato.
Ｓ、（１９８０）Ｊ、 Ｇｅｎ、 Ｖｉｒｏｌ、 ４７．２２７−２３２） 、 出願人は、これらの遺伝子生成物のいずれもインターロイキン−１及び／又は６ を結合することかでき、これらのサイトカインかその天然のレセプターに達する のを防ぐことかできるということを提案している。その結果炎症反応は低減され 、ウィルスの複製は強化される。これはウィルス免疫回避の新たな方法を構成し ている。出願人は同様に、ここで第３の遺伝子５ａｌＬ４Ｒの構造も開示してい る。この遺伝子は、Ｃ型動物性レクチン全般及び失活されたＢリンパ球上で発現 される細胞表面タンパク質であるＣＤ２３に関係づけられると思われる。ウィル ス弱毒化に対する５ａｌＬ４Ｒの適用可能性については、以下でさらに詳しく論 述する。S, (1980) J, Gen, Virol, 47.227-232), Applicants believe that any of these gene products may be interleukin-1 and/or interleukin-6. can bind to these cytokines or their natural receptors. We are proposing that we can prevent this from happening. As a result, the inflammatory response is reduced. , viral replication is enhanced. This constitutes a new method of viral immune evasion. ing. Applicant also discloses herein the structure of a third gene, 5alL4R. Ru. This gene is expressed in all C-type animal lectins and inactivated B lymphocytes. It appears to be related to CD23, a cell surface protein that is associated with Will The applicability of 5alL4R to attenuate the virus is discussed in more detail below. Describe.
出願人は、（ｉ）ウィルスの弱毒化をさらに大きくするため、及び／又は（ｉｉ ）組換え型ワクシニアウィルスの免疫原性を高めるため及び／又は（伍）遺伝子 挿入部位をさらに多くして、より多くの外米性ＤＮＡをウィルス内に含み入れる ことができるようにするため、遺伝子配列のうちの単数又は複数のものを不活性 化させる二ともできれば、或いは又これらの遺伝子配列のうちの単数又は複数の ものの一部分又は全てを欠失させることもできる、ということを提案している。Applicants may (i) further attenuate the virus; and/or (ii) ) To enhance the immunogenicity of recombinant vaccinia virus and/or (5) genes Create more insertion sites to include more foreign DNA into the virus Inactivate one or more of the gene sequences so that or alternatively, one or more of these gene sequences. It is proposed that part or all of something can be deleted.
しかしながら、ウィルス複製のために遺伝子配列が不可欠である場合、ウィルス 弱毒化は、さらに、ウィルス復製のために機能する状態にタンパク質を保ちなが ら病原性に影響を及ぼすタンパク質機能に不利に作用するように、遺伝子生成物 を変えることによって（例えば遺伝子レベルでの操作による）もたらされうる。However, if the gene sequence is essential for viral replication, the virus Attenuation also helps keep proteins in a functional state for virus reproduction. Gene products that adversely affect protein function that affect virulence (e.g., by manipulation at the genetic level).
本発明の一態探に従うと、ａ）本書中ｉ） ＢＩ５Ｒ，ｉｉ） ＢＩ８Ｒ，１ｉ ）ＳａｌＬ４ｆ？と呼称されているヌクレオチド配列のうちの単数又は複数のも のの一部分又は全てがウィルスゲノムから欠失され・及び／又はｂ）これらのヌ クレオチド配列のうちの単数又は複数が外来性ＤＮＡの挿入又は突然変異によっ て不活性化させられ：及び／又はＣ）前記ヌクレオチド配列のうちの単数又は複 数がこのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質生成物の機能を変え るへく変更される、ワクシニアウィルスベクターが提供されている。ヌクレオチ ド配列の突然変異は、単数又はｖＩＩ数のヌクレオチドの欠失、付加、置換又は 逆転によってもたらされうる。According to one aspect of the present invention, a) In this book i) BI5R, ii) BI8R, 1i )SalL4f? one or more of the nucleotide sequences referred to as b) some or all of these are deleted from the viral genome; and/or b) some or all of these One or more of the cleotide sequences may be modified by insertion of foreign DNA or by mutation. and/or C) one or more of said nucleotide sequences. number changes the function of the protein product encoded by this nucleotide sequence Vaccinia virus vectors are provided that are highly modified. Nucleochi Mutations in the code sequence include deletions, additions, substitutions or deletions of a single or vII number of nucleotides. It can be brought about by reversal.
単数又は複数の異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を、ウィルスゲノム内 に取り込むことが可能である。異種ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、ウィル スゲノムからの単数又は複数の欠失によって作り出された単数又は複数の連結部 位の中に挿入することができる。異種ペプチドというのは、野性型ワクシニアウ ィルスによって通常コードされないものである。代表的には、異種ヌクレオチド 配ＩＩＩは、免疫原又は望まれるポリペプチド生成物をコードする。免疫原性ポ リペプチドは、感染中病原性生体によって発現され感染を受けた固体には外来性 と見えるエピトープに対し実質的に相同である。A DNA sequence encoding one or more heterologous polypeptides is inserted into the viral genome. It is possible to incorporate into The DNA sequence encoding the heterologous peptide is junction(s) created by deletion(s) from the genome can be inserted into the position. A heterologous peptide is a wild-type vaccinia is not normally encoded by viruses. Typically, a heterologous nucleotide Sequence III encodes the immunogen or desired polypeptide product. Immunogenicity Repeptides are expressed by pathogenic organisms during infection and are foreign to the infected individual. substantially homologous to an epitope that appears to be
本発明の組換え型ワクシニアウィルスは、免疫原性の強化に対する潜在能を育す る。これは、免疫抑制をひき起こすワクシニア遺伝子（例えばインターロイキン レセプタ及び相補体相同体及び１ｇＥに対するヒトＦｃＲ）の欠失によってか或 いは又免疫応答を増強する遺伝子の挿入（ｆ４えばワクシニアウィルス内の真正 ＣＤ２３遺伝子を発現すること）によって、結果として得られるものである。Recombinant vaccinia virus of the invention develops potential for enhanced immunogenicity Ru. This is due to the vaccinia genes that cause immunosuppression (e.g. interleukin by deletion of the receptor and complement homolog and human FcR for 1gE Alternatively, the insertion of a gene that enhances the immune response (e.g. f4, an authentic gene in the vaccinia virus) CD23 gene).
従って、本発明は、ａ）本書中ｉ） Ｂ１５Ｒ，ｉｉ） Ｂ１８Ｒ，ｉｉ） ５ ａｌＬ４Ｒと呼称されている免疫抑制をひき起こす単数又は複数のワクシニアヌ クレオチド配列の一部分又は全てがウィルスゲノムから欠失され；及び／又はｂ ）免疫抑制をひき起こすこれらのワクシニアヌクレオチド配列のうち単数又は複 数のものが外来性ＤＮＡの挿入又は突然変異によって不活性化され：及び／又は Ｃ）免疫抑制をひき起こす前記ワクシニアヌクレオチド配列のうちの単数又は複 数のものか、このヌクレオチドによりコードされるタンパク質生成物の機能を変 えるべく変更されワクシニアウィルスを提供している。特に、ワクシニアヌクレ オチド配列は、本書中５ａｌＬ４Ｒと呼称される配列であってよい。Therefore, the present invention provides: a) in this document i) B15R, ii) B18R, ii) 5 One or more vaccinia dogs that cause immunosuppression called alL4R part or all of the cleotide sequence is deleted from the viral genome; and/or b ) One or more of these vaccinia nucleotide sequences that cause immunosuppression. a number of which are inactivated by insertion of foreign DNA or mutation; and/or C) one or more of said vaccinia nucleotide sequences that cause immunosuppression; number or alter the function of the protein product encoded by this nucleotide. We provide a vaccinia virus that has been modified as much as possible. In particular, vaccinia nuclei The otide sequence may be the sequence referred to herein as 5alL4R.
ワクシニアウィルスか免疫応答を増強する異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ 配列を含む場合、ＤＮＡ配列はＣＤ２３をコードすることができる。DNA encoding vaccinia virus or a heterologous polypeptide that enhances the immune response If it does, the DNA sequence can encode CD23.
本発明の組換え型ワクシニアベクターは、ウィルスゲノム内に連結されたＤＮＡ 配列によってコードされる異種ペプチドに対する特異性をもつＴ細胞又はモノク ローナル及びポリクローナル抗体の産生のための免疫原として用いることかでき る。ここで用いた抗体という語は、親抗体と同じ特異性をもつ親抗体の誘導体及 び抗体フラグメントも同様に＊＊＊するものとしてみなされるべきである。The recombinant vaccinia vector of the present invention comprises DNA linked within the viral genome. T cells or monoclonal cells with specificity for the heterologous peptide encoded by the sequence Can be used as an immunogen for the production of local and polyclonal antibodies Ru. The term antibody as used herein refers to derivatives of the parent antibody that have the same specificity as the parent antibody. Antibody fragments and antibody fragments should be considered as such as well.
本発明は同様に、提供された組換え型ワクシニアベクターを使用することにより 得られたモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体：抗血清及び／又はＴ細胞を も提供する。The present invention also provides for the use of recombinant vaccinia vectors. Obtained monoclonal antibodies, polyclonal antibodies: antiserum and/or T cells Also provided.
この組換え型ウィルスベクターを用いることによって産生された抗体は、例えば 臨床試料中の抗原の検出などといった診断用テスト及び処置において使用可能で ある：又、これらの抗体は、受動免疫化のための投与のため治療的に又は予防の ために使用することもできる。Antibodies produced using this recombinant viral vector are, for example, Can be used in diagnostic tests and procedures, such as detecting antigens in clinical samples. These antibodies can also be used therapeutically or prophylactically for administration for passive immunization. It can also be used for
同様に提供されているのは、提供された組換え型ワクンニ了ベクターを用いて得 たモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗血清及び／又はＴ細胞を含む診 断用テストキットである。Also provided are the results obtained using the provided recombinant vaccine vector. Diagnostic tests involving monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, antisera and/or T cells It is a discontinuation test kit.
さらに提供されているのは、この組換え型ワクシニアウィルスを含むワクチン及 び薬剤である。これらは、すてに示した理由により、一般のワクシニアウィルス 株に比べ高い安全性と免疫原性を有している可能性かある。Additionally, vaccines and vaccines containing this recombinant vaccinia virus are being provided. It is a drug. These are the common vaccinia viruses for the reasons given above. There is a possibility that it has higher safety and immunogenicity than other strains.
本発明のもう一つの態様に従うと、上述のものの中から選択された１つのヌクレ オチド配列によってコードされるポリペプチド及びこれらのポリペプチドの対立 遺伝子及び変異体が提供されている。According to another aspect of the invention, one nucleus selected from the above-mentioned Polypeptides encoded by octide sequences and conflicts of these polypeptides Genes and variants are provided.
本発明は同様に、このようなポリペプチドをコードするサブゲラミックＤＮＡ配 列、かかるＤＮＡを含む組換え型クローニング及び発現ベクター、二のようなポ リペプチドを産生ずることのできる組換え型微生物及び細胞培養をも内含してい る。The present invention also provides subgeramic DNA sequences encoding such polypeptides. recombinant cloning and expression vectors containing such DNA; It also includes recombinant microorganisms and cell cultures capable of producing repeptides. Ru.
本発明は同様に、ａ） ｉ ） ＢＩ５Ｒ，ｉｉ） ＢＩ８Ｒ，１ｉｉ）Ｓａｌ Ｌ４Ｒと呼称されているヌクレオチド配列のうちの単数又は複数のものの一部分 又は全部をウィルスゲノムから欠失させる二と：及び／又は前記ヌクレオチド配 列を突然変異させること又は外来性ＤＮＡを挿入することによって前記ヌクレオ チド配列のうちの単数又は複数のものを不活性化させること：及び／又はＣ）こ のヌクレオチドによりコードされるタンパク質生成物の機能を変えるべく前記単 数又は複数のヌクレオチド配列を変更させることを含む、ワクシニアウィルスベ クターを弱毒化させる方法をも提供する。The present invention also includes a) i) BI5R, ii) BI8R, 1ii) Sal A portion of the nucleotide sequence or sequences designated as L4R or by deleting the entire nucleotide sequence from the viral genome. by mutating the sequence or inserting foreign DNA. and/or C) inactivating one or more of the sequence(s). said single nucleotide to alter the function of the protein product encoded by said nucleotide. vaccinia virus vectors, including altering the number or multiple nucleotide sequences. It also provides a method to attenuate the vector.
本発明は同様に、本書に規定されているようなワクシニアウィルスベクターを用 いることを含む、ワクチン又は薬剤の調製方法をも提供する。The present invention also provides for the use of vaccinia virus vectors as defined herein. A method of preparing a vaccine or medicament is also provided.
本発明は同様に、本書に開示されているヌクレオチド配列ＢＩ５Ｒ及びＢ１８Ｒ によってコードされる翻訳生成物を提供する。これらの翻訳生成物は、抗炎症剤 として利用できる。The invention also relates to the nucleotide sequences BI5R and B18R disclosed herein. provides a translation product encoded by. These translation products are anti-inflammatory agents It can be used as
本発明は又、抗炎症剤の調製のためにこれらの翻訳生成物を用いる方法も提供す る。The invention also provides methods of using these translation products for the preparation of anti-inflammatory agents. Ru.
図面の簡単な説明 本発明をさらに明確に理解できるようにするため、以下に列挙された図を参照し ながら、識別された遺伝子配列についてさらに詳しく論述する。Brief description of the drawing In order to be able to understand the invention more clearly, please refer to the figures listed below. However, the identified gene sequences will be discussed in more detail.
図１ （Ａ） ＋８６ｋｂ ＶＶゲノムのＨｉｎｄＩ［［制限地図である。遺伝 子Ｂ１５Ｒ及びＢＩ８Ｒ及び５ｅｒｐｉｎ遺伝子の転写位置及び方向を示すべく 、９．８ｋｂＳａｌｌｌフラグメントは拡張されている（Ｓｍｉｔｈ、 Ｇ、Ｌ 、、 Ｈｏｗａｒｄ、 Ｓ、Ｔ。Figure 1 (A) +86kb HindI restriction map of the VV genome. genetics To show the transcriptional position and direction of the offspring B15R and BI8R and 5erpin genes. , the 9.8kbSall fragment has been expanded (Smith, G.L. ,, Howard, S.T.
及びＣｈａｎ、 Ｙ、Ｓ、 （１９８９年）、 Ｊ、 ｇｅｎ、 Ｖｉｒｏｌ、 ７０．２３３３〜２３４３） （このセルビン（ｓｅｒｐｉｎ）遺伝子という 命名は、遺伝子がＨｉｎｄＤＩＢの左端部から始まって１５番目及び１８８番目 ＯＲＦであり、ゲノム末端に向かって右方へ転写されることを示している）。（ Ｂ）遺伝子旧５Ｒのヌクレオチド配列及び演揮されたアミノ酸配列。潜在的転写 制御シグナルは下線がほどこされており、Ｎ末端における考えられるシグナルペ プチドは囲みがほどこされている。Ｎ連鎖された炭水化物（ＮＸＳ／Ｔ）の付加 のための部位は、囲みがほどこされ、１ｇドメイン内でジスルフィド結合を形成 する可能性のあるｃｙｓ残基は点彩されている。（Ｃ）遺伝子Ｂ１８Ｒのヌクレ オチド配列及び演揮されたアミノ酸配列。もう１つの１１株からのこの遺伝子の 公表された配列（Ｕｅｄａ。and Chan, Y. S. (1989), J. gen. Virol. 70.2333-2343) (This gene called serpin) The naming is based on the 15th and 188th genes starting from the left end of HindDIB. ORF, indicating that it is transcribed rightward toward the end of the genome). ( B) Nucleotide sequence and derived amino acid sequence of gene old 5R. latent transcription Regulatory signals are underlined, indicating possible signal pairs at the N-terminus. The petite is enclosed. Addition of N-linked carbohydrates (NXS/T) The site for is boxed and forms a disulfide bond within the 1g domain. Possible cys residues are dotted. (C) Nucleus of gene B18R Otide sequence and performed amino acid sequence. of this gene from another 11 strains. Published sequence (Ueda.
Ｙ、、 Ｍｏｒｉｋａｗａ、 Ｓ及びＭａｔｓｕｕｒａ、 Ｙ、（！９９０）、 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７７、５８８〜５９４）とは異なる配列の３つのアミノ 酸位置か示されている。その他の特徴は（Ｂ）と印のついたものと同じ。Y, Morikawa, S and Matsuura, Y, (!990), Virology 177, 588-594) Acid positions are indicated. Other features are the same as those marked (B).
図２、ヒト及びマウスの［Ｌ−ＩＲ、ヒｌ−ｒＬ−６Ｒ、ＶＶ赤血球凝集素（Ｖ ＶＨＡ）の［ｇドメイン、）７ンクリン（Ｆａｓｃｉｃｌ ｉｎ） Ｍのドメイ ン１、ミニリン関連糖タンパク質のドメイン３及び１ｇカッパのＶ−ドメインと 、ＢＩ５Ｒ及び８１８Ｒからの１ｇドメインのアミノ酸整列。１ｇドメインのβ −鎖構造を形成するものと予言された領域は、整列の上に示されている。６つ以 上の配列において同一である残基は、囲みかほとこされている。β＃ｆＢ及びＣ の間のいくつかの残基は省かれた。簡略化のため同様にβ−ｊ！Ｄ及び該当する 場合にはＣ′及びＣ″も省略されている。鎖ＣとＥの間の比較的高い残基数（約 ３０以上）は、■ドメインを示している。Figure 2. Human and mouse [L-IR, human l-rL-6R, VV hemagglutinin (V VHA) [g domain,) 7 Fasciclin (Fascicl in) M domain domain 1, minirin-related glycoprotein domain 3, and the V-domain of 1gkappa. Amino acid alignment of the 1g domain from , BI5R and 818R. β of 1g domain - Regions predicted to form chain structures are indicated above the alignment. 6 or more Residues that are identical in the above sequence are boxed or highlighted. β#fB and C Some residues between were omitted. Similarly, β−j! for simplification. D and applicable In some cases C' and C'' are also omitted. A relatively high number of residues between chains C and E (approximately 30 or more) indicates ■ domain.
図３、ヒト及びマウスからのＩＬ−ＩＲの外部領域及びヒトＩＬ−６Ｒのシグナ ル配列及び単一１ｇドメインとの、ＢＩ５Ｒのアミノ酸整列。配列整列を最大限 にするための空隙か導入され、ダッソユ記号で示されている。４つの配列が整列 している場合、囲みは３つの配列内の同一のアミノ酸配列を示し、その他の場合 、囲みは整列された配列全てにおいて完全な保存を示す。Ｎ連鎖された炭水化物 の付加のための潜在的部位には下線かほとこされている。矢印及び番号は、１ｇ 構造単位のドメイン間ジスルフィド結合を形成するものと予言されたノステイン を印づけしている。Figure 3. External regions of IL-IR from humans and mice and signals of human IL-6R. Amino acid alignment of BI5R with the sequence and single 1g domain. Maximize array alignment A void is introduced to make the hole, which is indicated by the Dassoille symbol. 4 arrays aligned , the box indicates the identical amino acid sequence in the three sequences, otherwise , boxes indicate complete conservation in all aligned sequences. N-linked carbohydrates Potential sites for addition are underlined or highlighted. Arrows and numbers are 1g Nostein predicted to form interdomain disulfide bonds in structural units is marked.
図４、遺伝子５ａｌＦ３Ｒのだめのヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示してい る。Figure 4 shows the nucleotide and amino acid sequences of the gene 5alF3R. Ru.
図５、ワクシニアウィルス遺伝子５ａｌＬ４Ｒ及び５ａｌＦ３Ｒ（命名し亘され た５ａｌＦ２Ｒ，Ｓｍ１ｔｈ Ｇ、Ｌ、 Ｃｈａｎ、 Ｙ、Ｓ、 ？ｉＨｏｗａ ｒｄ、 Ｓ、Ｔ、 Ｊ、 Ｇｅｎ。Figure 5. Vaccinia virus genes 5alL4R and 5alF3R (named and passed) 5alF2R, Sm1th G, L, Chan, Y, S,? iHowa rd, S, T, J, Gen.
Ｖｉｒｏｌ、 ７２．１３４９．１９９１）の疎水性グラフを示す。水平軸上の 垂直線は２０５のアミノ酸のブロックを示す。Virol, 72.1349.1991) shows a hydrophobicity graph. on the horizontal axis Vertical lines indicate blocks of 205 amino acids.
図６、ワクシニアウィルス（ＳａｌＦ３ＲによってフードされるＶＶＦ３Ｒ）、 鶏痘ウィルスＦＲＶ２．８ ＆ ＩＩ （Ｔｏｍｌｅｙ ｅｔ ａｌ、、 、１ ． ｇｅｎ、 Ｖｉｒｏｌ、 ６９゜１０２５（＋９８８））からの類似のレク チン様分子＋ｇＥに対するヒト低親和カレセプタ（ＨＦｃＲ＞（Ｋｉｔｕｔａｎ ｉ ｅｔ ａｌ、、 Ｃｅ１１４７．６５７． （１９８６））。Figure 6, vaccinia virus (VVF3R hooded by SalF3R), Fowlpox virus FRV2.8 & II (Tomley et al., 1 ．． gen, Virol, 69°1025 (+988)) Human low affinity coreceptor (HFcR) for chin-like molecule + gE (Kitutan i et al, Ce1147.657. (1986)).
Ｈｅｍ１ｔｒｉｐｔｅｒｕＳ ａｍｅｒｒｃａｎｓからの凍結防止ポリペプチド （ＡＦＰ） Ｎｇｅｔ ａｔ、 、Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ２６１． １５６９０ （１９８６））及びＭｅｇａｂａｌａｎｕｓ ｖｏｓａ（ａｃｏｒ ｎ’ ｂａｒｎａｃｌｅ）からのレクチン（ＡＢｌｅｃ）（Ｍａｒａｍｏｔｏ及 びＫｏｍｉＹａ。Antifreeze polypeptide from Hemltripteru S amerrcans (AFP) Nget at, J, Biol, Chem, 261. 15690 (1986)) and Megabalanus vosa (acor lectin (ABlec) (Maramoto and By KomiYa.
Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ、、 ８７４．２８５（１９８ ６））と、ワクシニアウィルス５ａｌＬ４Ｒ遺伝子（ＷＬ４Ｒ）のアミノ酸整列 を示す。６つ以上の配列内で保存されている残基には囲みがほどこされている。Biochem, Biophys, Acta, 874.285 (198 6)) and amino acid alignment of vaccinia virus 5alL4R gene (WL4R) shows. Residues that are conserved within six or more sequences are boxed.
図７．５ａ１４Ｒ遺伝子のヌクレオチド配列及び演鐸されたアミノ酸配列を示す 。潜在的転写制御信号には下線が付され、経験的に決定さた後期ＲＮＡのための 開始部位は′°で示されている。Ｎ連鎖炭水化物の付加用の潜在的部位は、疎水 性Ｎ末端シグナルペプチドと同様に、囲まれている（ＮＳＴ）。示されているヌ クレオチド配列は、ワクシニアウィルス株ＷＲの５ａｌｌＬフラグメントの左端 部から１７５３〜２４９８の位置からマツピングしている。Figure 7. Shows the nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the 5a14R gene. . Potential transcriptional control signals are underlined and empirically determined for late RNAs. The starting site is indicated by ′°. Potential sites for the addition of N-linked carbohydrates are hydrophobic (NST), as well as the N-terminal signal peptide. Shown The cleotide sequence is at the left end of the 5allL fragment of vaccinia virus strain WR. It is mapped from the positions 1753 to 2498.
図８、遺伝子Ｂ１５Ｒ（図８Ａ）及びＢ１８Ｒ（図８Ｂ）からのｍＲＮＡのＳｌ ヌクレアーゼ保護分析。プローブは本文中に記述されているとおりに用いられて いる。レーンｌ〜４はＭ１３配列決定梯子であり、レーン５はハイブリッド形成 のために用いられるプローブを示し、レーン６〜８は、それぞれｔＲＮＡ、初期 又は納期ＲＮＡとのハイブリッド形成によって保護されたＤＮＡフラグメントを 示している。Figure 8, Sl of mRNA from genes B15R (Figure 8A) and B18R (Figure 8B) Nuclease protection analysis. Probes were used as described in the text. There is. Lanes 1-4 are M13 sequencing ladder, lane 5 is hybridization Lanes 6 to 8 show the probes used for tRNA, initial or DNA fragments protected by hybridization with delivery RNA. It shows.
図９、！１ｌｒ５０に分泌糖タンパク質といったようなりＩ５Ｒ遺伝子産物の識 別。細胞は、ＷＴウィルス（レーン２． ３． ７． ＆８）又は組換え盟ウィ ルスｖＡＡｌ （レーン４，５．９＆１０）のいずれかに感染させられているか 、或いは又擬似感染を受け（レーン１＆６）、感染中の早期（レーン２，４．７ ＆９）又は晩期（レーン３． ５． ８＆ＩＯ）のいずれかにＣ３５Ｓ）−メチ オニンで標識付けされた。レーン１〜５は、細胞抽出物＆６〜ｌＯ上清を示す。Figure 9! Identification of I5R gene products such as secreted glycoproteins in 1lr50. another. Cells were infected with WT virus (lanes 2, 3, 7, & 8) or recombinant virus. rus vAAl (lanes 4, 5.9 & 10) , or also pseudo-infected (lanes 1 & 6) and early during infection (lanes 2, 4.7). &9) or late (lanes 3.5.8 &IO). Labeled with onin. Lanes 1-5 show cell extract & 6-1O supernatant.
ポリアクリルアミドゲル上に試料を走らせ、オートラジオグラフを作成した。ｖ ＡＡＩ感染を受けた細胞の上溝内の１Ｊｒ５０にタンパク質の位置は、矢印で表 されている図１０． ＩＰＴＧ Ｋ存在下又は不在下でのプラークサイズ。Ｂ５ Ｃ−１単層は、ＩＰＴＧの存在下又は不在下でＷＴ、 ＶＳＡＤ７又はｖＳＡＤ ９に感染させた２日後、細胞をクリスタルバイオレットで染色し写真撮影した。Samples were run on polyacrylamide gels and autoradiographs were created. v The location of the protein at 1Jr50 in the superior groove of AAI-infected cells is indicated by an arrow. Figure 10. Plaque size in the presence or absence of IPTG K. B5 C-1 monolayers were WT, VSAD7 or vSAD in the presence or absence of IPTG. 9, the cells were stained with crystal violet and photographed.
図１１、Ｂ５Ｃ−１１をＩＰＴＧの存在下又は不在下てｖＳＡＤ７又はｖＳＡＤ ９のいずれかで感染させた感染は、１つの細胞につき１０のプラーク形成単位（ ｐｆｕ） （図版Ａ＆Ｂ）又はＯ，０Ｏ１ｐｆｕ／細胞（図版Ｃ＆Ｄ）であった 。感染後の表示した回数での感染細胞内に存在するウィルスを、Ｂ５Ｃ−］細胞 の新鮮重複単層上のプラーク検定によって測定した。FIG. 11. B5C-11 with vSAD7 or vSAD in the presence or absence of IPTG. Infections with either 9 or 10 plaque forming units per cell ( pfu) (Pictures A & B) or O,0O1 pfu/cell (Pictures C & D) . Virus present in infected cells at the indicated times after infection was detected in B5C-] cells. was measured by plaque assay on fresh duplicate monolayers.
［ＮＩ２、ｖＳＡＤ９の形態形成。５ｒｎＭのＩＰＴＧを伴う又は伴わないｖＳ ＡＤ９により２５ｐｆｕ／細胞で感染させたＢ５Ｃ−１細胞を、２％のグルチル アルデヒドでの固定前に６時間、１２時間及び２４時間インキュベートし、包理 し、切断し電子顕微鏡で観察した。（Ａ ’）ウィルスファクトリ及びＩＮＶ粒 子ｔ４１を示すＩＰＴＧの不在下での細胞２４ｈｐｉの断面、１〜３は（Ｂ）と 同じ。倍率５８００ Ｘ。（Ｂ）２４ｈｐｉてＩＰＴＧ無しのｖＳＡＤ９ウィル スファクトリの詳細；（］）部分的に形成された脂質の三日月形。[Morphogenesis of NI2, vSAD9. vS with or without 5rnM IPTG B5C-1 cells infected with AD9 at 25 pfu/cell were infected with 2% glutyl. Incubate for 6, 12 and 24 hours before fixation with aldehyde and embedding. It was then cut and observed under an electron microscope. (A’) Virus factory and INV grain Cross sections of cells 24 hpi in the absence of IPTG showing offspring t41, 1-3 (B) and same. Magnification 5800X. (B) vSAD9 will without IPTG at 24hpi Sfactory details; (]) Partially formed lipid crescent.
（２）完全に脂質に囲まれた早期未成熟粒子。（３）凝縮ヌクレオチドを含む未 成熟粒子。倍率３６０００ ｘ、（Ｃ） ＩＰＴＧの無い状態で産生された矢印 で示された成熟ＩＮＶ。倍率３６０００ Ｘ。（Ｄ）２４ｈｐｉで、［ＰＴＧ存 在下て産生された成熟ＪＮＶ、倍率３６０００ Ｘ。ＣＥ）矢印によって示され た例である、２重膜でとり囲まれた多数のＩＮｖを示すＩＰＴＧ２４ｈｐｉの存 在下でのν５ＡＤ９感染細胞のミクロウィルスの横断面。倍率３６０００ Ｘ。(2) Early immature particles completely surrounded by lipids. (3) Non-containing nucleotides containing condensed nucleotides mature particles. Magnification 36000x, (C) Arrow produced in the absence of IPTG Mature INV shown in . Magnification 36000X. (D) At 24 hpi, [PTG exists] Mature JNV produced in situ, magnification 36,000X. CE) indicated by the arrow As an example, the presence of IPTG24hpi showing numerous INv surrounded by a double membrane. Microvirus cross-section of v5AD9-infected cells in the presence of cells. Magnification 36000X.
（Ｆ）ＩＰＴＧ存在下での２４ｈｐｉ細胞：（１ンゴルジ誘導膜、イ２）成熟ウ ィルス粒子ととり囲む外膜か細胞の原形質膜と融合した後のＥＥＶの退出。(F) 24hpi cells in the presence of IPTG: (1) Ngolgi-induced membrane, (2) mature mice. EEV exit after fusion with the virus particle and the surrounding outer membrane or plasma membrane of the cell.
図１３．５ａｌＬ４Ｒ糖タンパク質の免疫プロット分析。細胞を、指示通１ リ ５ｍＭのｒＰＴＧ及び／又はｌμｇ／−のツニカマイシンの存在下（＋）又は不 在下（−）で、２４時間ＷＲ（レーンｌ及び２）又はｖＳＡＤ９（レー１ ン３ 〜６）に感染させるか、又は擬似感染（レーン７及び８）させた。抽出物を５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥで消散させ、ニトロセルロースへと移し、抗５ａｌＬ４Ｒ血清てイ ンキュベートさせ、アルカリホスファターゼフンシュゲートされたロバ抗ウサギ Ｉｇ（材料と方法）を用いて免疫複合体を検出した。観察したタンパク質の分子 量はｋＤａ単位で示されている。Figure 13. Immunoplot analysis of 5alL4R glycoprotein. Recycle the cells according to the instructions. In the presence (+) or absence of 5mM rPTG and/or lμg/- tunicamycin. 24-hour WR (lanes 1 and 2) or vSAD9 (lane 1 and 3) ~6) or mock infected (lanes 7 and 8). 5D extract Resolved by S-PAGE, transferred to nitrocellulose, and treated with anti-5alL4R serum. Donkey anti-rabbit incubated and alkaline phosphatase funshugate Immune complexes were detected using Ig (Materials and Methods). Observed protein molecule Quantities are given in kDa.
図１４．９６のウェル組織培養皿の中で４ Ｘ ｌ０７ｐｆｕのＩＨＤ−ＪＩＮ Ｖ （図版Ｄ）又はＥＥＶ（図版Ａ−Ｃ，Ｅ＆Ｆ）精製されたウィルス粒子上で 炭素コーティングされた銅の４００メツシユグリツドを浮遊させた。グリッドを ＰＢＳ及びＴＢＳで２分間洗浄し、次に５０％のエタノール中で３０秒間洗浄し た。その後ウィルスコーティングされたグリッドをＴＢＧ（ＴＢＳ ｐＨ８，２ ，０，１％ＢＳＡ Ｃ分画Ｖ〕、１％ゼラチン）中で１５分間インキュベートし てから、抗−３ａｌＬ４Ｒ（図版Ａ＆Ｃ−Ｅ）又は１％のＢＳＡを含むＴＢＳ中 の１１５０に希釈された無関係なウサギの血清（図版Ｆ）又は同じものの中で１ １５に希釈された親和ｆｆｌ＊された抗−５ａｌＬ４Ｒ特異１ｇ（図版Ｂ）のい ずれかを含むウェルに移した。５０分間Ｉｇ内で３０分間インキュベートして結 合Ｉｇを検出した。グリッドを５分間ＴＢＧ内で次にＴＢＳ内で洗浄してから、 タンパク質を２％グルチルアルデヒドを含むＴＢＳ中で固定した。ウィルス粒子 を最後に２％の酢酸ウラニルを用いてネガティブ染色した。Figure 14. 4 x 107 pfu of IHD-JIN in a 96-well tissue culture dish V (Plate D) or EEV (Plates A-C, E&F) on purified virus particles. 400 mesh grids of carbon coated copper were suspended. grid Wash in PBS and TBS for 2 minutes, then in 50% ethanol for 30 seconds. Ta. After that, the virus-coated grid was washed with TBG (TBS pH 8,2). , 0,1% BSA [C fraction V], 1% gelatin) for 15 minutes. in TBS containing anti-3alL4R (Plates A&C-E) or 1% BSA. of an unrelated rabbit serum diluted to 1150 (Panel F) or 1 in the same of anti-5alL4R-specific 1g (Plate B) diluted to 15%. were transferred to wells containing either one of the two. Incubate for 30 min in Ig for 50 min. Combined Ig was detected. Wash the grids in TBG for 5 min then in TBS before washing. Proteins were fixed in TBS containing 2% glutyraldehyde. virus particles Finally, negative staining was performed using 2% uranyl acetate.
以下に記す遺伝子操作は全て、標準的手順（分子クローニング、ｅｄｓ、 Ｓａ ｍｂｒｏｏｋ、 Ｆｒ１ｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒ ｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、 １９８９年）に従 って行なわれ、酵素反応に用いられる条件は、製造業者（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が推奨する通りであった。All genetic manipulations described below were performed using standard procedures (molecular cloning, eds, Sa mbrook, Fr1tsch & Maniatis, Co1d Spr ing Harbor Laboratory Press, 1989). The conditions used for the enzymatic reaction were as specified by the manufacturer (GIBCO-BRL). Life Technologies).
ヌクレオチド及びアミノ酸配列の決定 ワクシニアウィルスゲノム（ＷＲＩりの５ａｌｌＩ及び５ａｌｌＬ制限フラグメ ントのヌクレオチド配列は、立証済みの方法（Ｓａｎｇｅｒ Ｆ、 ｅｔａｌ、 （１９８０）、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、、（４３，１６１−１７８）及び Ｂａｎｋｉｅｒ、 Ａ、 及びＢａｒｒｅｌｌ、 Ｂ、Ｇ、 （１９８３） Ｔ ｅｃｈｎｉｑｕｅ ｉｎ Ｌｉｆｅ ５ｃｉｅｎｃｅｓ（生命科学技術）８５０ ８、１−３４． Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、にょって決定された。Determination of nucleotide and amino acid sequences Vaccinia virus genome (5allI and 5allL restriction fragments of WRI) The nucleotide sequence of the sample was determined using proven methods (Sanger F, et al. (1980), J, Mo1. Biol, (43, 161-178) and Bankier, A. and Barrell, B.G. (1983) T. echnique in Life 5sciences (life science technology) 850 8, 1-34. It was decided by Elsevier.
例えば、リファンピンン耐性突然変異体（Ｂａｌｄｉｃｋ、 Ｃ，Ｊ、 ＆ Ｖ ｏｓｓ。For example, rifampin-resistant mutants (Baldick, C. J. & V. oss.
Ｂ、 （１９８９） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５６．１３８−１４５）から誘導さ れたウィルスＤＮＡを含むコスミド６がらワクシニアウィルス（ＷＡ株）の９． ８ｋｂの５ａｌｌｌフラグメントを分離させ、Ｓａｉ！切断ｐＵｃＩ３へとり。B, (1989) Virology 156.138-145) 9 of vaccinia virus (WA strain) from cosmid 6 containing the viral DNA. The 8kb 5all fragment was isolated and Sai! Cut into pUcI3.
−ニングさせてプラスミドｐｓａｌｌ ｒを形成させた。プラスミド配列がら５ ａｌｌフラグメントを分離させ、Ｔ ４ ＤＮＡリガーゼで自己連結させた。音 波処理によって円形分子を無作為にせん断し、Ｔ −Ｉ ＤＮＡポリメラーゼ及 びフレノウ酵素で末端修復し、３００以上のヌクレオチドのフラグメントをＳｍ ａ Ｉ切断ＶＩ３＋ｎｐ１８ ヘとクローニングした。ｒ、”Ｓ） −ｄＡＴＰ 及び緩衝液勾配ポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｇｇｉｎ、 Ｍ、Ｄ、、 Ｇｉｂ ｓｏｎ、 Ｔ、Ｊ。-ning to form plasmid psallr. Plasmid sequence 5 The all fragments were separated and self-ligated with T4 DNA ligase. sound The circular molecules are randomly sheared by wave treatment, and T-I DNA polymerase and The ends were repaired with Flenow enzyme and the fragment of more than 300 nucleotides was converted into Sm. a I-cleaved VI3+np18 was cloned. r,”S)-dATP and buffer gradient polyacrylamide gels (Biggin, M.D., Gib. son, T, J.
＆ Ｈａｎｇ、 Ｇ、Ｆ、 （１９８３年）、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃ ａｄ、 Ｓｃｉ、 ＬＩＳＡ、 ８０．３６９３−３６９５）を用いるジデオキ シヌクレオチド連鎖終端方法（Ｓａｎｇｅｒ Ｆ。& Hang, G, F. (1983), Proc, Natl, Ac. ad, Sci, LISA, 80.3693-3695) Cynucleotide chain termination method (Sanger F.
ｖｉｃｋｌｅｎ、Ｓ ＆ ＣｏｕＩｓａｎ、Ａ、Ｒ，（１９７７） Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ。Vicklen, S. & Couisan, A. R. (1977) Proc. Natl, Acad, Sci, USA.
７４、５−１６３−５４６７）を用いて、一本鎖ＤＮＡを調製し、配列決定した 。さらに詳細については、（Ｂａｎｋｉｅｒ、 Ａ、Ｔ、、 Ｗｅｓｔｅｒｎ、 Ｋ、 Ｍ ＆ Ｂａｒｒｅｌｌ。74, 5-163-5467), single-stranded DNA was prepared and sequenced. . For further details, see (Bankier, A. T., Western, K, M & Barrell.
Ｂ、Ｇ、 （＋９８７）、 Ｗｕ Ｒ，（ｅｄ、） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ ｕｚｙｍｏｌｏｇｙ （酵素学的方法）１５５、５１〜９３ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 Ｌｏｎｄｏｎ中５）を参照のこと。同様にして６．３ｋｂのＳ ａ Ｉ Ｉ Ｌ、フラグメントを処理した。B, G, (+987), Wu R, (ed,) Methods in E uzymology (enzymological methods) 155, 51-93 Academic See Press, London 5). Similarly, 6.3kb S a I IL, fragments were processed.
コンピュータ解析 音波デジタイザを用いてオートラジオグラフィからヌクレオチド配列データを読 み取り、ＶＡＸ８３５０コンピュータ上でＤＢＡＵＴＯ及びＤＢｔＪＴｒＬプロ グラム（Ｓｔａｄｅｎ、 Ｒ，（１９８０） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒ ｅｓ、 ８゜３６７３−３６９４； ５ｔａｄｅｎ、 Ｒ，（１９８２） Ｎｕ ｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 １０．４７３１−４７５１）を用いて隣接 配列の形にまとめた。０ＲＦＦＩＬＨ及びＤＥＬＩＢプログラム（Ｍ、 Ｂｏｕ ｒｓｎｅｌｌ、 Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ、 ｆ（ｏｕｇｈｔｏｎ、 ＵＫ、）を用いて６つのフレームの形にフンセンサス配 列を翻訳した。ＦＡＳＴＰプログラム（Ｌｉｐｍａｎ、 Ｄ、Ｊ、 ＆ Ｐｅａ ｒｓｏｎ、 ＩＲ，（＋９８５） ５ｃｉｅｎｃｅ ２２７゜１４３５〜１４４ １）を用いてワクシニアアミノ酸配列の出願人独自のデータベースに対し又５Ｗ ＩＳＳＰＲＯＴタンパク質データベースバージヨン１４に対してオーブンリーデ ィングフレームを比較した。多数のタンパク質配列の整列を、Ｍ［ＪＬＴＡＬ ｆＧＮプログラムＣＢａｒｔｏｎ、 Ｇ、Ｊ、 ＆Ｓｔｅｒｎａｂｅｒｇ、 Ｌ Ｊ、Ｅ （１９８７） Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、 １９８．３２７〜３３７ ）を用いて行なった。computer analysis Reading nucleotide sequence data from autoradiography using a sonic digitizer DBAUTO and DBtJTrL programs on a VAX8350 computer. Gram (Staden, R, (1980) Nucleic Ac1ds R es, 8°3673-3694; 5taden, R, (1982) Nu Adjacent using cleic Ac1ds Res, 10.4731-4751) Organized into an array. 0RFFILH and DELIB programs (M, Bou rsnell, In5 posture of Animal Health, Using f(oughton, UK,), arrange the sensus sus in the form of six frames. Translated columns. FASTP program (Lipman, D. J. & Pea rson, IR, (+985) 5science 227° 1435-144 1) against the applicant's own database of vaccinia amino acid sequences. Ovenriede against ISSPROT protein database version 14 compared the working frames. The alignment of a large number of protein sequences is performed using M[JLTAL fGN program C Barton, G. J. & Sternaberg, L. J, E (1987) J, Mo1. Biol, 198.327-337 ) was used.
以下では、出願人の識別した個々の遺伝子配列ＢＩ５Ｒ，ＢＩ８Ｒ及び５ａｌＬ ４Ｒについて詳細に記述する。In the following, the individual gene sequences BI5R, BI8R and 5alL identified by the applicant will be described. The 4Rs will be described in detail.
遺伝子Ｂ１５Ｒ及びＢＩ８Ｒ 右側逆転末端反復（ＩＴＩ？）近くからの遺伝子Ｂ１５Ｒ及びＢＩ８Ｒ（図１） は、１つのＮ末端疎水性配列、Ｎ連鎖された炭水化物のための可能性ある付着部 位及びＣ末端近くの疎水性残基を有するそれぞれ３６．５ｋＤａ及び４０．７ｋ Ｄａのタンパク質をコードするものとして予言されている。これらの特性１よ、 成熟タンパク質が、ウィルス粒子、細胞表面又は分泌糖タンパク質のいずれかで あることと一貫性をもつ。Genes B15R and BI8R Genes B15R and BI8R from near the right inverted terminal repeat (ITI?) (Figure 1) is one N-terminal hydrophobic sequence, a possible attachment site for N-linked carbohydrates. 36.5kDa and 40.7k, respectively, with hydrophobic residues near the position and C-terminus. It is predicted to encode the Da protein. These characteristics 1, The mature protein is either a viral particle, a cell surface or a secreted glycoprotein. Be consistent with something.
８１５１？と呼称される遺伝子のヌクレオチド配列及び演榎されたアミノ酸配列 は、図ＩＢに示されている。ＢＩ５Ｒについて示されたヌクレオチド配列は、ワ クシニアウィルスＨｉｎｄＩＩ［Ｂフラグメントの左端がら１１４６２〜＋２６ ６４のヌクレオチドであり、コーディング領域は１１５８４〜＋２５６１のヌク レオチド位置（又は５ａｌｌｌフラグメントの左から８１５〜１７９２のヌクレ オチドにある。8151? The nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the gene called is shown in Figure IB. The nucleotide sequence shown for BI5R is Cuccinia virus HindII [left end of B fragment 11462-+26 64 nucleotides, the coding region extends from 11584 to +2561 nucleotides. leotide position (or nucleotides 815-1792 from the left of the 5all fragment) It's in Ochido.
同様にして、Ｂ１８Ｒと呼称される遺伝子のヌクレオチド配列及び演鐸されたア ミノ酸配列は図ＩＣに示されている。ＢＩ８Ｒについて示されたヌクレオチド配 列は、ワクシニアウィルスＨｉｎｄｌＩ［Ｂフラグメントの左端から１５４４８ 〜１６７４１のヌクレオチドであり、コーディング領域はヌクレオチド位ｉｔ １５４４８〜１６７４１（又は５ａｌｌｌフラグメントの左端から４７９９〜５ ８５１のヌクレオチド）にある。Similarly, the nucleotide sequence of the gene called B18R and the extracted atom The amino acid sequence is shown in Figure IC. Nucleotide sequence shown for BI8R Columns indicate vaccinia virus HindlI [15448 from the left end of the B fragment. ~16,741 nucleotides, and the coding region is at nucleotide position it 15448-16741 (or 4799-5 from the left end of the 5all fragment 851 nucleotides).
アミノ酸の呼称には単一の文字コードか用いられる。A single letter code is used to designate amino acids.
Ｂ１５Ｒ及びＢＩ８Ｒは各々、免疫グロブリン（１ｇ）スーパーファミリー（Ｗ ｉｌｌｉａｍｓ、 Ａ、Ｆ、及びＢａｒｃｌａｙ、 Ａ、Ｎ （＋９８８）、 Ａｎｎ、 Ｒｅｖ、ｒｍｍｕｎｏｌ。B15R and BI8R are each members of the immunoglobulin (1g) superfamily (W illiams, A.F., and Barclay, A.N. (+988), Ann, Rev, rmmunol.
６、３８１〜４０５）の特徴をもつ３つのドメイン、すなわちドメイン内ジスル フィド架橋を形成する一対のシスティン、β鎖構造を形成するものとして予言さ れている配列及びβ鎖Ｃ内の不変的トリプトファンを有している。Ｂ１５Ｒ中で は、これらのシスティンは、４８及び９９゜１４３及び１９４、及び２４２及び ３０９の位置に存在する。Ｂ１８Ｒ中では、対応するシスティンは位ｆｌ１７３ 及び１２９． １７２及び２２１及び２７３及び３３３の位置にある。Ｂ１５１ ？中のこれらのシスティン対の間の距離（５１，５１及び６７個の残基）は、最 初の２つのドメインかＣ領域であり、一方３番目のドメインかＶ−ドメインであ りうることを示唆している。6, 381-405), i.e., intradomain disulfide A pair of cysteines forming a fido bridge, predicted to form a β-strand structure. sequence and a constant tryptophan in β-strand C. In B15R These cysteines are 48 and 99 degrees, 143 and 194, and 242 and It exists at position 309. In B18R, the corresponding cysteine is at position fl173 and 129. They are located at positions 172, 221, 273, and 333. B151 ? The distances between these cysteine pairs (residues 51, 51 and 67) in the The first two domains or C-regions, while the third domain or V-domain This suggests that it is possible.
ＢＩ８Ｒについては、距離（５６，４９及び６１）は、これらかＣドメインであ ることを示唆している。これらの領域は、ＩＬ−ＩＲ（インターロイキンｌレセ プタ及びインターロイキン６レセブタ） 、ＶＶ赤血球凝色素および１ｇカッパ （Ｈｉｌｓｃｈｍａｎ、 Ｎ及びＨｏｐｐｅ ５ｅｙｅｒ’ｓ、 Ｚ、 （１９ ６７）Ｐｈｙｓｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ３４８．１０７７−１０３０）、ファン クリンＩＩ （Ｈａｒｒｅｌｓｏｎ。For BI8R, the distances (56, 49 and 61) are This suggests that These regions are linked to the IL-IR (interleukin l receptor). Pta and interleukin 6 receptor), VV hemagglutinin and 1g kappa (Hilschman, N. and Hoppe 5eyer's, Z. (19 67) Physiol, Chem, 348.1077-1030), Fan Clin II (Harrelson.
Ａ、 Ｌ、及びＧｏｏｄｍａｎ、 Ｃ，Ｓ、（１９８８）、 ５ｃｉｅｎｃｅ ２４２．７００−７０８）、ニワトリ神経細胞付着分子（ＮＣＡＭ） （Ｈｅｍ ｐｅｒｌｅｙ、 Ｊ、Ｊ、、 Ｍｕｒｒａｙ、 Ｂ、Ａ、。A.L., & Goodman, C.S. (1988), 5science. 242.700-708), chicken neural cell adhesion molecule (NCAM) (Hem perley, J. J., Murray, B. A.
εｄｅ１ｍａｎ、 Ｇ、Ｍ、及びＣｕｎｎｒｎｇｈａｍ、 Ｂ、Ａ、 （１９８ ６）、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ。εde1man, G. M., and Cunningham, B. A. (198 6), Proc, Natl, Acad.
Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ８３．３０３７−３０４１）及びミニリン関連糖タンパク質 （Ｓａｌｚｅｒ。Sci, USA 83.3037-3041) and minirin-related glycoproteins (Salzer.
Ｊ、Ｌ、、 Ｈｏｌｍｅｓ、 Ｗ、Ｐ、及びＣｏｌｍａｎ、 Ｄ、Ｒ，（１９８ ７）、 Ｊ、 ＣｅＨＲｉｏｔ、 １０４．。J, L., Holmes, W. P., & Colman, D. R. (198 7), J, CeHRiot, 104. .
９５７−９６５）の選択された［ｇドメインと整列されている（図２）。この整 列において、β鎖ｃ’、ｃ’及びＤは簡略化のため省略されている。ドメイン用 ジスルフィド架橋を形成するシスティン及び３ＭＩＣ内のトリプトファンは完全 に保存されている。ワクシニアタンパク質と１ｇグループの間の関係は、ＡＬ／ ＩＧＮプログラム（Ｄａｙｈｏｆｂ、 Ｍ、０．。957-965) are aligned with the selected [g domains (Fig. 2). This arrangement In the columns, β-strands c', c' and D have been omitted for simplicity. for domain Cystine forming disulfide bridges and tryptophan in 3MIC are completely is stored in. The relationship between vaccinia protein and 1g group is IGN program (Dayhofb, M, 0.
Ｂａｒｋｅｒ、 Ｗ、Ｃ，及びＨｕｎｔ、 Ｌ、Ｔ、 （１９８３）、 Ｍｅｔ ｈ、 Ｅｎｚｙｍｏｌ、 ９１．５２４−５４５）を用いて統計的計算分析によ って確認された（表１）。Ｂ１５Ｒの場合、最高の個々の評点は、ヒト及びマウ スのＩＬ−ＩＲドメインに対して見られる。Ｂ１８Ｒのドメイン２は同様に、ｒ Ｌ−ＩＲｌ’メインに対して充分な評点を示し、全体として広範な１ｇドメイン に対してきわめて背量な評点か存在する。Barker, W.C., & Hunt, L.T. (1983), Met h, Enzymol, 91.524-545) by statistical calculation analysis. It was confirmed (Table 1). For B15R, the highest individual score was found for the IL-IR domain of Similarly, domain 2 of B18R is r Scored well for the L-IRl' main, with an overall broad range of 1g domains. There are extremely poor ratings for this.
ＩＬ−１１？及びＩＬ−６Ｒの細胞外領域とのＢ１５Ｒの整列及び上述の個々の ドメイン１内列（１：ｌ）ハ、ＩＩ、−ＩＲ，ＩＬ−６Ｒ及びｖｖｒｖｒｇドメ インノ間の関係かその他の１ｇメンバーよりも密であることを示している。これ は以下の観察によって例証される。IL-11? and alignment of B15R with the extracellular region of IL-6R and the individual Domain 1 internal column (1:l) C, II, -IR, IL-6R and vvrvrg domain This shows that the relationship between Inno is closer than that of other 1g members. this is illustrated by the following observation.
（］） ＩＬ−ＩＲの外部領域及びＢ１５Ｒは、きわめて類似した長さを有する 。(]) The external region of IL-IR and B15R have very similar lengths .
（２） ドメイン１内のβＭＡ及びＧの始め近く及びＩＬ−ＩＲ及びＢ１８Ｒの ドメイン２内の類似の位置において、ＩＬ−ＩＲ及びＢ１５Ｒ，Ｂ１８Ｒ内には 、付加的なシスティンが保存されている。これらのシスティンは、もう１つのド メイン内ジスルフィド結合を可能にする確率の高い位置において、ＩｇＣドメイ ンの３次元構造内にある。(2) Near the beginning of βMA and G in domain 1 and of IL-IR and B18R At similar positions within domain 2, within IL-IR and B15R, B18R are , an additional cysteine is conserved. These cysteines are connected to another IgC domains at positions with a high probability of allowing intramain disulfide bonds. within the three-dimensional structure of the engine.
（３１８１５１？、 両方）ＩＬ−ＩＩ？及びｒＬ−６Ｒノ中には、ドメイン１ 及び２のβＭＢ内に不変システィンに続いてプロリンか存在する。これはこの位 置において通常でない残基である。Ｂ（８ドメイン１もこの位置にプロリンを含 む。(318151?, both) IL-II? and in rL-6R, domain 1 There is an invariant cysteine followed by proline within the βMB of 2 and 2. This is about this It is an unusual residue in position. B (8 domain 1 also contains proline at this position) nothing.
＋４１ ＢＩ５Ｒ及び両方のＩＬ−ＩＲ配列のドメイン３のβ鎖下においては、 その他の１ｇドメインに典型的なグリシンか存在しない。さらに、他の場合には 不変であるテロノンが両方のＩＬ−ＩＲ及びＢ１５Ｒにおいてフェニルアラニン で置換されている。+41 Under the β-strand of domain 3 of BI5R and both IL-IR sequences, Glycine, typical of other 1g domains, is absent. Furthermore, in other cases Theronone, which is unchanged, is phenylalanine in both IL-IR and B15R. has been replaced with
（５）アミノ酸配列の拡散性にもかかわらずＩＬ−ＩＲｓ及びＢ１５Ｒのドメイ ン１、β鎖下において、グリコジル化部位か保存されている。(5) Despite the diffusivity of the amino acid sequence, the domains of IL-IRs and B15R The glycosylation site under the 1st and β-strands is conserved.
（６）ドメイン３は、付加的なシスティンを含まず、Ｂ１５Ｒ，ＢＩ８Ｒ及び［ Ｌ−ＩＲ内で１及び２よりも長い。(6) Domain 3 does not contain additional cysteines and contains B15R, BI8R and [ Longer than 1 and 2 in L-IR.
きわめて最近、付加的な（タイプ■）ヒト及びマウスのインターロイキンｌレセ プタの配列か報告された（ Ｍｃ！Ｊａｈａｎ池、ＥＭＢＯＪ、 １０゜２８２ １〜２８３２．１９９１）。これらは、前述のタイプＩのＩＬ−ルセブタに比べ て、ワクシニアウィルスＢＩ５Ｒ及びＢＩ８Ｒ遺伝子により密に関係している。Very recently, additional (type ■) human and mouse interleukin receptors have been identified. (Mc! Jahanike, EMBOJ, 10゜282 1-2832.1991). These are compared to the aforementioned type I IL-Rusebuta. It is more closely related to the vaccinia virus BI5R and BI8R genes.
実際、ワクシニアＢ１５Ｒは、ヒト及びマウスのタイプ■のＩＬ−ルセブタと、 そのいずれかがタイプＩ ＩＬ−ルセブタに対して有する関係よりも密な関係を 育している。タイプエ及び■の両方のＩＬ−ルセブタかＩＬ−１に結合するもの として示されているため、Ｂ１５Ｒ及びＢＩ８Ｒのいずれか又は両方の生成物も 又このサイトカインを結合するという確率はきわめて高い。In fact, vaccinia B15R is associated with human and mouse type II IL-Rusebuta. any of them have a closer relationship than they have to Type I IL-Rusebuta. I'm growing up. Typee and ■ both IL-Rusebuta or those that bind to IL-1 Therefore, the products of either or both of B15R and BI8R are also Also, the probability of binding this cytokine is extremely high.
遺伝子Ｂ１５Ｒ及びＢ１８Ｒかワクシニアウィルス感染細胞内で発現さ０るか否 かを見極めるため、これらの遺伝子に相応するｍＲＮＡをＳｌヌクレアーゼ保護 実験によって分析した。ＢＩ５ＲｍＲＮＡの検出のために用いられる放射線標識 付けされたプローブは、ワクシニアウィルス５ａｌｌＩ制限フラグメントの左端 からの５ａｌｌ−ＸｂａｌフラグメントをＰｔＪＣＩＩ８へとクローニングする ことによって調製さｎた。このプラスミドは、ＢＩ５Ｒのコーディング頑に対し 相補的なオリゴヌクレオチド及びｐｕｃ目８に対し相補的な汎用プライマーを用 いたポリメラーゼ連鎖反応用の鋳型として用いられた。ＰＣ！？生成物は、精製 され、ポリヌクレオチドキナーゼを用いてγ〔３２］−ＡＴＰで標識付けされ、 ５ａｌｌＩで消化され、１０２４ｂｐのフラグメントか分離された。これは、宿 主免疫応答に対してｖ■により利用された初期又は後期ウィルスのｍＲＮＡハイ ブリッドのメカニズムに従って、ハイブリッド形成された。Whether genes B15R and B18R are expressed in cells infected with vaccinia virus. In order to determine whether the mRNAs corresponding to these genes are Analyzed by experiment. Radiolabel used for detection of BI5R mRNA The attached probe is located at the left end of the vaccinia virus 5allI restriction fragment. Cloning the 5all-Xbal fragment from into PtJCII8 Prepared by: This plasmid is unique to the coding robustness of BI5R. Using complementary oligonucleotides and universal primers complementary to puc order 8. It was used as a template for polymerase chain reaction. PC! ? The product is purified labeled with γ[32]-ATP using polynucleotide kinase, It was digested with 5allI and a 1024 bp fragment was isolated. This is an inn Early or late viral mRNA levels utilized by v for the main immune response hybridized according to the hybridization mechanism.
提案されているか又は立証済みであるその他のメカニズムとしては、Ｃ４６結合 タンパク質の分泌相同体による相補系との干渉（Ｋｏｔｗａｌ。Other mechanisms that have been proposed or proven include C46 binding. Interference with the complementation system by secreted homologues of the protein (Kotwal.
Ｇ、 Ｊ、及びＭｏ５ｓ Ｂ （１９８８）、 Ｎａｔｕｒｅ ３３５．１７６ −１７８） 、及び細胞障害性Ｔ細胞に対するペプチドの呈示を阻止しくＢｏｕ ｒｓｎｅｌｌ、 Ｍ、Ｅ、Ｇ、。G, J, and Mo5s B (1988), Nature 335.176 -178) and to prevent the presentation of peptides to cytotoxic T cells. rsnell, M, E, G.
Ｆｏｕｌｄｓ、ｒ、Ｊ、、 Ｃａｍｐｂｅｌｌ、 Ｊ及びＢ１ｎｎ５． ｌＪ、 Ｌ （１９８８）、 Ｊ、 ｇｅｎ。Foulds, r. J., Campbell, J. and B1nn5. lJ, L (1988), J, gen.
Ｖｉｒｏｌ、 ６９． １９９５−３００３； Ｓｍ１ｔｈ、 Ｇ、Ｌ、 Ｈｏ ｗａｒｄ、 Ｓ、Ｔ、及びＣｈａｎ、 Ｙ、Ｓ。Virol, 69. 1995-3003; Sm1th, G, L, Ho ward, S.T., and Chan, Y.S.
（１９８９）、 Ｊ、 ｇｅｎ、 ＶｉｒＯｌ、 ７０．２３３３−２３４３） 、白血球と感染病巣の浸潤を制限する（Ｐａｌｕｍｂｏ、 Ｇ、Ｊ、、 Ｐｉｃ ｋｕｐ、 Ｄ、Ｊ、、 Ｆｒｅｄｒｉｃｋｓｏｎ、 Ｔ、Ｎ、。(1989), J, gen, VirOl, 70.2333-2343) , limit the infiltration of leukocytes and infectious foci (Palumbo, G. J., Pic. kup, D.J., Fredrickson, T.N.
Ｍｃｌｎｔｙｒｅ、 Ｌ、Ｊ、及びＢｕＩＩｅｒ、 Ｒ，Ｍ、Ｌ、 （１９８９ ） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、 １７２．２６２−２７３）可能性のあるセワンタンパ ク質分解酵素阻害因子の発現、なとか含まれる。McIntyre, L. J., & BuIIer, R. M. L. (1989 ) Virology, 172.262-273) Possible Sewantampa This includes the expression of protein-degrading enzyme inhibitors.
タンパク質配列比較によると、これらの■■タンパク質か互いに対して（２２， ５％の同一性）、ヒト及びマウスのＩＬ−ＩＲ、ヒトＩＬ−６Ｒ（Ｙａｍａｓａ ｋｉ、 Ｋ、、 Ｔａｇａ、 Ｔ、、 Ｋｉｒａｔ、 Ｙ、、 Ｙａｗａｔａ、 Ｈ，、Ｋａｗａｎｉｓｈｉ。Protein sequence comparisons show that these ■■ proteins are similar to each other (22, 5% identity), human and mouse IL-IR, human IL-6R (Yamasa ki, K,, Taga, T, Kirat, Y, Yawata, H., Kawanishi.
Ｙ、、５ｅｅｄ、 Ｂ、、 Ｔａｎｉｇｕｃｈ、 Ｔ、、 Ｈｉｒａｎｏ、 Ｔ 及びＫｉｓｈｉｍｏｔｏ、 Ｔ、（１９８８）。Y,,5eed,B,,Taniguch,T,,Hirano,T and Kishimoto, T. (1988).
Ｐｒｏｃ、 Ｊｐｎ、 Ａｃａｄ、 ６４．２０９−２１１）及び免疫グロブリ ン（Ｉｇ）スーパーファミリー（ＷｉｌｌｉａＯ］ｓ、 Ａ、Ｆ、及びＢａｒｃ ｌａｙ、 Ａ、Ｎ、 （１９８８）、 Ａｎｎ。Proc, Jpn, Acad, 64.209-211) and immunoglobulin Ig superfamily (WilliamO), A, F, and Barc lay, A.N. (1988), Ann.
Ｒｅｖ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、 ６．３８１−４０５）に対して関係を育するとい うことかわかる。このグループメンバーは、可変的な数の構造的に類似したドメ イン（１ｇドメイン）を含み、さまざまな機能を果たすか、統一テーマは細胞間 の又はサイトカン結合による表面反復である。ｖ■赤血球凝色素は、このスーパ ーファミリーのもう１つのメンバーである（Ｊｉｎ、 Ｄ、、 Ｌｉ、 Ｚ、、 Ｊｉｎ、 Ｑ、 Ｙｕｗｅｎ、 Ｈ，及びＨｏｕ、 Ｙ、 （１９８９）、 Ｊ。Rev. Immunol, 6.381-405) I understand that. This group member consists of a variable number of structurally similar domains. In (1g domain), it plays a variety of functions, but the unifying theme is between cells. or surface repeats due to cytocan binding. v ■ Hemagglutinating dye is this super - Another member of the family (Jin, D,, Li, Z,, Jin, Q., Yuwen, H., and Hou, Y. (1989). J.
Ｅｘｐ、 Ｍｅｄ、 １７０．５７１−５７６） 、 ＶＶ株ＩＨＤからの８１ ８Ｒ配列は、最近報告されているか、インターロイキンレセプタ及び１ｇスーパ ーファミリーに対する関係は論述されなかった。（Ｕｅｄａ、 Ｙ、、 Ｓｌｏ ｒｉｋａｗａ、 Ｓ、及びｍａｔｓｕｕｒａ、 Ｙ、（１９９０）、 Ｖｉｒｏ ｌｏｇｙ １７７、５８８−５９４）。Exp, Med, 170.571-576), 81 from VV strain IHD The 8R sequence has recently been reported or – Relationship to family was not discussed. (Ueda, Y,, Slo Rikawa, S., and Matsuura, Y. (1990), Viro logy 177, 588-594).
当該出願人は、ここで８１５Ｒ及びＢＩ８Ｒについてのヌクレオチド及びアミノ 酸配列データを識別し、ヒト及びマウスのＩＬ−ＩＲ、ヒトＩＬ−６Ｒ及び免疫 グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーに対するＢ１５Ｒ及びＢＩ８Ｒの遺伝子 産物間の驚くべき相同性を識別した。Applicant herein discloses the nucleotide and amino acid for 815R and BI8R. Identify acid sequence data, human and murine IL-IR, human IL-6R and immune B15R and BI8R genes for the globulin (Ig) superfamily A surprising homology between the products was identified.
サイトカインＩＬ−１及びＩＬ−６は、そのそれぞれの天然レセプタに結合する ことによって、侵入する病原体に対する免］疫応答を媒介し、炎症をひき起こす 。ｖ■は、［Ｌ−１及び［Ｌ−６に対するレセプタを擬態するタンパク質を産生 ずることにより免疫応答のこの部分で奮闘しているように思われる。かくして、 これらの■■タンパク質の機能は、サイトカンかその天然レセプターに到達しな いようにするためこれらを結合させるというものであるように思われる。このよ うにして、ウィルスは自らに向けられた炎症反応を減少させる。かくしてウィル スはさらに効果的に複製することかできる。出願人の提案は、ワクシニアウィル スの有害性を少なくするために二の驚くべき発見事実を使用し、かくしてワクチ ンとしてのその使用に付随する問題及び／又はその池の問題が改善されるように することにある。最近の報告書では（Ｐｅｒｋｕｓ、 Ｍ、 Ｇｏｅｂｉｌ、 Ｓ、Ｊ、、 Ｄａｕｉｓ、 Ｓ、Ｗ、、 Ｊｏｈｎｓｏｎ。Cytokines IL-1 and IL-6 bind to their respective natural receptors mediate an immune response against invading pathogens and cause inflammation. . v■ produces proteins that mimic receptors for [L-1 and [L-6]. It appears that this part of the immune response is struggling. Thus, The function of these It seems that the idea is to combine these to make it easier. This way In this way, the virus reduces the inflammatory response directed against itself. Thus Will can be replicated even more effectively. Applicant's proposal is vaccinia will Two surprising discoveries can be used to make vaccines less harmful, thus making vaccines less harmful. so that the problems associated with its use as a pond and/or its ponding problems are ameliorated. It's about doing. In a recent report (Perkus, M., Goebil, S, J., Dauis, S. W., Johnson.
ＧＰ、、 Ｎｏｒｔｏｎ、 Ｅ、に、及びＰａｏｌｅｔｔｉ、 Ｅ （１９９１ ）、 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８０．４０６−４１０）、ワクシニアウィルスのコ ペンハーゲン株のゲノムの大きい近末端区分か、インビトロウィルス複製にとっ て可欠なものであることが示されており、又二こで紹介されたＢＩ５Ｒ及びＢＩ ８Ｒのヌクレオチド配列とコペンハーゲン株について可欠なものと報告されたも のとの比較（Ｇｏｅｂｅｌ、 Ｓ、Ｊ、、 Ｊｏｈｎｓｏｎ、 Ｇ、Ｐ、、 Ｐ ｅｒｋｕｓ、 Ｍ、 Ｄａｕｉｓ、 Ｓ、Ｗ、。G.P., Norton, E., & Paoletti, E. (1991 ), Virology 180.406-410), vaccinia virus co A large proximal segment of the genome of the Penhagen strain may not be suitable for in vitro viral replication. BI5R and BI, which have been shown to be essential for The nucleotide sequence of 8R and those reported to be essential for the Copenhagen strain Comparison with (Goebel, S. J., Johnson, G. P., P. erkus, M., Dauis, S.W.
Ｗｉｎｓｌｏｗ、 Ｊ、Ｐ、及びＰａｏｌｅｔｔｉ、 Ｅ、 （１９９０）、 ＶｉｒｏｌｏｇＹ １７９．２４７−２６６）は、ＷＲ遺伝子Ｂ１５Ｒ及びＢ１ ８Ｒか非必須領域内に含み入れられていることを示している。しかしながら、こ れらの遺伝子のいずれか又は両方かＷＲ株のウィルスの復製にとって可決なもの であるか否かは、まだ今後立証すべきこととして残されている。これらのＯＲＦ の欠失は、ウィルス減衰の適切な手段を提供することかできるだろう。Winslow, J. P., & Paoletti, E. (1990). VirologY 179.247-266) is the WR gene B15R and B1 8R is included in a non-essential region. However, this Either or both of these genes are relevant for the reproduction of the WR strain virus. Whether or not this is the case remains to be proven in the future. These ORFs Deletion of the virus could provide an adequate means of virus attenuation.
ヌクレオチド配列Ｂ１５Ｒ及びＢ１８Ｒによってコードされた翻訳産物はインタ ーロイキンｌ又はインターロイキン６を結合する可能性が高いと思われることか ら、これらのタンパク質産物は、抗炎症剤として役立つだろう。タンパク質は、 当該技術分野において周知の技術に従って組換え型システム内で産生されつる。The translation products encoded by the nucleotide sequences B15R and B18R are - Does it seem likely that it binds leukin-1 or interleukin-6? These protein products could serve as anti-inflammatory agents. Protein is produced in recombinant systems according to techniques well known in the art.
かくして、ここで提供されているヌクレオチド配列は、適切な表現ベクター（必 ずしもワクシニアとはかぎらない）の中に挿入されつる。このときこのベクター を、これらの特定のタンパク質の産生に適した細胞系統を形質転換するために使 用することができる。Thus, the nucleotide sequences provided herein may be Sushi is inserted into the vaccinia (not necessarily vaccinia). At this time, this vector are used to transform cell lines suitable for the production of these specific proteins. can be used.
ａｌＬ４Ｒ 当該出願人は、５ａｌＬ４Ｒに関係する遺伝子である５ａｌＦ３Ｒ（命名し直さ れた５ａｌＦ２Ｒ，Ｓｍ１ｔｈ ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ、 ７２．１３４９−１３７６、１９９１年）を開示する特許出願（ＰＣＴ／ＧＢ９ ０１００４９３）をすでに提出した。alL4R The applicant has identified 5alF3R (renamed), a gene related to 5alL4R. 5alF2R, Sm1th et al, J, Gen Virol, 72.1349-1376, 1991) 0100493) has already been submitted.
５ａｌＦ３Ｒと呼称された遺伝子のヌクレオチド配列及び演揮されたアミノ酸は 、図４に示されている。アミノ酸の名称のためには、単一の文字コードか使用さ れている。５ａＦ３Ｒ遺伝子のコーディング領域は５ａｌｌＦフラグメントの左 端からヌクレオチド５９５と１０７１の間で遺伝子地図を作製する。−次翻訳産 物の分子量は、１８．１キロダルトン（ｋＤ）であるものと予言されている。ア ミノ末端近くには、タンパク質を細胞膜と結びつけさせるか又は細胞膜を通って 分泌させると思われている一連の疎水性アミノ酸が存在する。カルボキシ末端近 くには、３つの潜在的Ｎ！！！鎖グリコジルｆヒ部位が存在し、これは成熟遺伝 子生成物が塘タンパク質であることを表わしている。The nucleotide sequence and expressed amino acid of the gene designated 5alF3R are , shown in FIG. For amino acid names, a single letter code or It is. The coding region of the 5aF3R gene is to the left of the 5allF fragment. A genetic map is constructed between nucleotides 595 and 1071 from the end. −Next translation product The molecular weight of the product is predicted to be 18.1 kilodaltons (kD). a Near the amino terminus, the protein is attached to the cell membrane or passes through the cell membrane. There is a series of hydrophobic amino acids that are thought to induce secretion. near carboxy terminus In particular, there are three potential N! ! ! A chain glycosyl f-hi site is present, which is the mature genetic This indicates that the child product is a tom protein.
驚くべきことに、当該出願人はここで、５ａｌＦ３Ｒ，Ｃ型動物性レクチン全般 及びＣＤ２３に対する相同性を示しこれらに構造的に関係していると思われるこ こでは５ａｌＬ４Ｒと呼称する遺伝子を識別した。遺伝子５ａｌＬ４Ｒは、ワク シニアウィルス株ＷＲの５ａｌｌＬフラグメントの左側端部から１７５５〜２４ ９８を地図作製する。Surprisingly, the applicant has now disclosed that 5alF3R, C-type animal lectin in general It shows homology to CD23 and appears to be structurally related to these. Here, a gene called 5alL4R was identified. The gene 5alL4R is 1755-24 from the left end of the 5allL fragment of senior virus strain WR Map 98.
図４に示されているＳａ ｌ Ｆ３Ｒ及び図８に示されている５ａｌＬ４Ｒの演 揮されたアミノ酸配列と、タンパク質データベース５ＷＩＳＳＰＲＯＴを比較す ると、い（つかの有意な相同性か立証された。これらは、図６に示されている。Performance of Sa F3R shown in Fig. 4 and 5alL4R shown in Fig. 8. Compare the determined amino acid sequence with the protein database 5WISSPROT. Several significant homologies were established; these are shown in Figure 6.
遺伝子５ａｌＦ３Ｒ及び５ａｌＬ３Ｒによってコードされたアミノ酸配列は、さ まざまなレクチンに対する配列相同性を示し、最も近い相同体（ＳａｌＦ３Ｒの 場合）はヒトＣＤ２３ （以下参照）である。特に、遺伝子５ａｌＦ３Ｒ及び５ ａｌＬ４Ｒによってコードされたアミノ酸配列は、ｒｇＥに対するヒトの低親和 性Ｆｃレセプタのアミノ酸配列（Ｋｊ ｔｕｔａｎｉｅｔ ａｌ、（１９８６） 、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、２６１． １５６９０−５）（５）及びＳｌ ｅｇｂａｌａｎｕｓｒｏｓａ （ａｃｏｒｎ ｂａｒｎａｃｌｅ）からのレクチ ンのアミノ酸配列（ＭａｒａｍＯｔＯ。The amino acid sequences encoded by genes 5alF3R and 5alL3R are It shows sequence homology to various lectins, with the closest homolog (SalF3R case) is human CD23 (see below). In particular, genes 5alF3R and 5 The amino acid sequence encoded by alL4R has a low human affinity for rgE. Amino acid sequence of sexual Fc receptor (Kj Tutani et al. (1986) , J. Biol, Chem, 261. 15690-5) (5) and Sl Lecture from egbalanusrosa (acorn barnacle) Amino acid sequence of MaramOtO.
Ｋ ＆ Ｋａｍｉｙａ、 Ｈ，（１９８６） Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｃｈｅ ＋ｎ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ、、 ８７４゜２８５−２９５）との配列 相同性を示している。５ａｉＦ３Ｒは、ＩｇＥについてのヒト低親和性Ｆｃレセ プタ（ＦｃＲ）の９２アミノ酸領域全体にわたり２６．１％のアミノ酸同一性を 育し、Ｈｅｍ１ｔｒｉρｔｅｒｕｓ ａｒｎｅｒｒｃａｎｓからの凍結防止ポリ ペプチドの９８アミノ酸領域全体にわたり２２，４％のアミノ酸配列同一性を、 又Ｍｅｇａｂａｌａｎｕｓ ｒｏｓａからのレクチンの６３アミノ酸領域全体に わたり２７．０％のアミノ酸同一性を育している。５ａｌＦ３Ｒ及び５ａＩＬ４ Ｒは、互いに対する配列相同性（図６）と類似した疎水性グラフ（図５）を示す 。K & Kamiya, H, (1986) Biochem, Bioche +n, Biophys, Acta, 874°285-295) Showing homology. 5aiF3R is a human low affinity Fc receptor for IgE. 26.1% amino acid identity over the entire 92 amino acid region of FcR (FcR) Antifreeze poly from Hem1triρterus arnerrcans 22.4% amino acid sequence identity over the entire 98 amino acid region of the peptide, In addition, the entire 63 amino acid region of the lectin from Megabalanus rosa They share 27.0% amino acid identity. 5alF3R and 5aIL4 R shows sequence homology to each other (Fig. 6) and similar hydrophobicity graph (Fig. 5) .
相同性は、これらの遺伝子によってコードされたタンパク質が、レクチン又はＩ ｇＨに対するヒト低親和性ＦｃＲの相同体として機能することを示唆している。Homology indicates that the proteins encoded by these genes are lectins or I It is suggested that it functions as a homolog of the human low affinity FcR for gH.
ＩｇＨに対するヒト低親和性ＦｃＲは、Ｂ細胞増殖を調節する上で中心的重要性 をもつ活性化されたＢリンパ球上で発現される細胞表面タンパク質であるＣＤ２ ３と同じであることから後者の相同性はきわめて重要である（Ｇｏｒｄｏｎ、 Ｊ、 ＆ Ｇｕｙ Ｇ、Ｒ。Human low affinity FcRs for IgH are of central importance in regulating B cell proliferation CD2, a cell surface protein expressed on activated B lymphocytes with The latter homology is extremely important as it is the same as 3 (Gordon, J. & Guy G.R.
（１９８７）、Ｉｍ＋ｍｕｎｏｌ、 Ｔｏｄａｙ、旦、 ３３９）。(1987), Im+munol, Today, Dan, 339).
従って、５ａｌＦ３Ｒ又は５ａｌＬ４Ｒによりコードされるワクシニアウィルス タンパク質は、Ｂ細胞の増殖及び／又は分化を制限してウィルスによる感染に対 する宿主の免疫応答を低減させるため、清浄なＣＤ２３分子の拮抗体として機能 することかできる。従って、ウィルスゲノムからのこの遺伝子の欠失は、ウィル スに対する宿主の免疫応答を強化することになる。この結果として、ウィルス増 殖がさらに制限され、ひいては弱毒化することになる。同様にこの遺伝子が欠如 している組換え型ワクシニアウィルスによって発現された外来性タンパク質に対 する免疫応答が強化され、このようなワクチン候補の効率か改善されることも又 可能である。ＣＤ２３のワクシニア相同体を含む又は含まないワクシニア組換え 体における真正ヒトＣＤ２３タンパク質の発現は同様に、異種病原体からの抗原 を発現する組換え型ワクシニアウィルスワクチンの免疫原性をも強化しつる。Therefore, vaccinia virus encoded by 5alF3R or 5alL4R The protein limits B cell proliferation and/or differentiation to resist infection by viruses. acts as an antagonist of the clean CD23 molecule to reduce the host immune response I can do something. Therefore, deletion of this gene from the viral genome This will strengthen the host's immune response to the virus. As a result, the virus is increasing. Reproduction will be further restricted and the virus will be attenuated. Also lacking this gene against foreign proteins expressed by recombinant vaccinia virus. It may also be possible to enhance the immune response and improve the efficiency of such vaccine candidates. It is possible. Vaccinia recombination with or without a vaccinia homolog of CD23 Expression of authentic human CD23 protein in the body is similar to antigens from foreign pathogens. It also enhances the immunogenicity of recombinant vaccinia virus vaccines expressing Vaccinia virus.
タンパク質かレクチンとしての代聾的な又は付加的な機能を有する場合、これは 、標的細胞に対するウィルスの付着における役目を果たすことかできる。従って 、二の能力における機能中の遺伝子の欠失は、ウィルス粒子の細胞感染能力か減 少するために、ウイルス弱毒化という結果をもたらすことになる。If the protein has a surrogate or additional function as a lectin, this , can play a role in the attachment of the virus to target cells. Therefore Deletion of a functional gene in the second capacity reduces the ability of the virus particle to infect cells. As a result, the virus becomes attenuated.
中断され部分的に欠失された５ａｌＦ３Ｒ遺伝子のコーディング領域を伴う突然 変異体ウィルスか構築された。ＥｃｏＲｒ及び５ａｌｌで消化されたｐＬｌｃＩ ３内にワクシニアウィルスの５ａｌｌＦフラグメントの最も左の３５２４ｂｐ（ Ｓａｌｌ−ＥｃｏＲＩ ＤＮＡフラグメント）を連結することによって、プラス ミドｐＰＲＯＦか構築された。このプラスミドは、５ａｌＦ３Ｒの全コーディン グ領域を含み、コーディング配列内で２回だけ切断するＮ５ｉｌで消化された（ 図２）。消化さたＤＮＡを平滑末端を作り出すべくバクテリオファージＴ ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理し、２つのフラグメントのうちの大きい方をアガロー スゲル電気泳動によってｖｔ製した。このフラグメントを、ワクシニアウィルス ７．５にプロモータ配列に接合された大腸菌キサンチングアニンホスフォリボシ ルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子を含むゲル精製されたＤＮＡフラ グメントと連結させた。後者のフラグメントは、ＥｃａＲ１でプラスミドｐＧｌ ）ｔ０７／１４を消化させ（Ｂｏｙｌｅ Ｄ、Ｂ、及びＣｏｕｐａｒ Ｂ、Ｅ、 Ｈ，Ｇｅｖｅ ６５゜＋２３−８ （１９８８））、それに続いてＤＮＡポリメ ラーゼで消化ＤＮＡを処理して（フレノウフラグメント）平滑末端を作り出し２ ． Ｉｋｂ ＤＮＡフラグメントを分離することによって得られた。連結された ＤＮＡを大腸菌へとクローニングし、結果として得られた細菌コロニーを適切な 制限酵素を用いて望ましいプラスミドの存在についてスクリーニングした。この 処置を通して、ワクシニアウィルス７．５にプロモータの制御下でＥｃｏｇｐｔ 遺伝子の機能的コピーによって１００ｂｐの５ａｌＦ３Ｒコーディング配列か置 換されたプラスミドｐＳＡ０３Ｇか分離された。Suddenly, with the coding region of the 5alF3R gene interrupted and partially deleted. A mutant virus was constructed. pLlcI digested with EcoRr and 5all 3 contains the leftmost 3524 bp of the 5allF fragment of vaccinia virus ( By ligating Sall-EcoRI DNA fragment), plus A mid-pPROF was constructed. This plasmid contains the entire coding sequence of 5alF3R. was digested with N5il, which contains the coding region and cuts only twice within the coding sequence ( Figure 2). Bacteriophage T4 was used to generate blunt ends from the digested DNA. Treat with DNA polymerase and transfer the larger of the two fragments to agarose. VT was produced by gel electrophoresis. This fragment is added to the vaccinia virus. 7.5 E. coli xanthine guanine phosphoribosi grafted to the promoter sequence Gel-purified DNA fragment containing the Ecogpt gene connected to the component. The latter fragment was cloned into plasmid pGl with EcaR1. ) t07/14 (Boyle D, B, and Coupar B, E, H. Geve 65°+23-8 (1988)), followed by DNA polymerization. The digested DNA is treated with enzyme (Flenow fragment) to create blunt ends. ．． Obtained by separating the Ikb DNA fragment. connected The DNA is cloned into E. coli and the resulting bacterial colony is transformed into a suitable Restriction enzymes were used to screen for the presence of the desired plasmid. this Through treatment, vaccinia virus 7.5 has Ecogpt under the control of the promoter. A functional copy of the gene replaces the 100 bp 5alF3R coding sequence. The converted plasmid pSA03G was isolated.
プラスミドｐＳＡＤ３Ｇを、野性型（ＷＴ）ワクシニアウィルスに感染したＣＶ −１細胞内にトランスフェクションさせ、３７°Ｃで４８時間経過後これらの細 胞に由来するウィルス後代を次に、マイコフェノール酸（ＶＰＡ）、牛サンチン 及びヒボキサンチンの存在下で新鮮なＣＶ−１細胞上で平板培養させた。これら の薬剤は、εｃｏｇｐｔ遺伝子を含みこれを発現する組換え型ウィルスのみの複 製を可能にする（Ｂｏｙｌｅ ＆ Ｃｏｕｐａｒ１９８８前出） Ｆａｌｋｎｅ ｒ ＆ Ｍｏ５ｓ、 Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、 ６２．１８４９〜５４． １９８８ ） 、３回にわたるプラーク精製の後、ウィルスをさらに大きいＣＶ−１細胞培 養内で増幅させた。ウィルスＤＮＡのサザンプロット分析は、ウィルスゲノム内 の予言された場所にＥＣＯｇｐｔ遺伝子が存在し、５ａｌＦ３Ｒ遺伝子の機能的 コピーは全く残らず、その他のウィルスゲノムＤＮＡの再配置が全く起こらなか ったことを確認した。５ａｌＦ３Ｒの欠如したウィルスは生存可能であることか ら、これらのデータは遺伝子の５ａｌＦＯＲＦ３かインビトロウィルス復製にと って可欠なものであることを立証した。CV infected with plasmid pSAD3G and wild type (WT) vaccinia virus. -1 cells, and after 48 hours at 37°C, these cells were The virus progeny derived from the cells were then treated with mycophenolic acid (VPA), bovine santhin. and plated on fresh CV-1 cells in the presence of hypoxanthine. these This drug is made using only a recombinant virus that contains the εcogpt gene and expresses it. (Boyle & Coupar 1988 supra) Falkne r & Mo5s, J, Virol, 62.1849-54. 1988 ), and after three rounds of plaque purification, the virus was transferred to a larger CV-1 cell culture. It was amplified in Yonai. Southern blot analysis of viral DNA reveals that within the viral genome The ECOgpt gene is present at the predicted location, and the 5alF3R gene is functionally No copies remain and no other rearrangements of viral genomic DNA occur. I confirmed that it was. Is a virus lacking 5alF3R viable? These data indicate that the gene 5alFORF3 may be used for in vitro viral reproduction. proved to be indispensable.
５ａｌＦ３Ｒコーデイング領域の不活性化か弱毒化されたウィルスを生成するこ とになる確率は、その領域か正常なウィルス複製中に発現されるか否かに左右さ れる。この点に関して、感染の初期段階及び後期段階中にこの領域から転写され たウィルスｒｎＲＮＡをノーサンプロット法により分析した。５ａｌＦ３Ｒのコ ーディング頑のみに対して相補的な一本鎖の放射線標識付けされたＤＮＡプロー ブが、約６００のヌクレオチドの初期ｍＲＮＡ種を検出した。感染後期において 、二のｍＲＮＡは、ノーサンプロット上でスミア（塗抹漂本）として現われる不 均一な長さのいくつかのＲＮＡ種によって置換された。後期ワクシニアウィルス ｍＲＮＡの不均一な長さのため、これかＳａ ｌ Ｆ３Ｒプロモータから又はさ らに上流から開始するいずれかのｍＲＮＡを表わす可能性かある。このデータは 、遺伝子５ａｌＦ３Ｒが感染中初期に又、場合によっては後期ても確かに転写さ れるという結論づけを可能にするものである。Inactivation of the 5alF3R coding region or generation of an attenuated virus The probability of this occurring depends on whether the region is expressed during normal viral replication. It will be done. In this regard, transcribed from this region during early and late stages of infection Viral RNA was analyzed by the Northam blot method. 5alF3R co A single-stranded radiolabeled DNA probe complementary to the detected an initial mRNA species of approximately 600 nucleotides. In the late stage of infection , the second mRNA appears as a smear on the Northam plot. replaced by several RNA species of uniform length. late vaccinia virus Due to the non-uniform length of the mRNA, it is difficult to determine whether it is from the F3R promoter or from It is also possible that it represents any mRNA starting upstream. This data is , the gene 5alF3R is certainly transcribed early during infection, and in some cases late as well. This makes it possible to conclude that
５ａｌＬ４Ｒについても同様の研究を行なった。ウィルス感染細胞から分離され たｍＲＮＡの分析（Ｓｌヌクレアーゼ保護実験による）は、感染後期にＲＮＡが ５ａｌＬ４Ｒ遺伝子の５′末端でＴＡＡＡＴＧモチーフから転写されることを実 証した。５ａｌＬ４Ｒの１つのｌ ＰＴＧ誘発可能な形態のみを発現するウィル スか、ワクシニアウィルス１４にタンパク質について記述したものと順位の要領 で構築された（Ｒａｄｒｉｇｕｅｙ及びＳｍｉ ｔｈ。Similar studies were conducted on 5alL4R. isolated from virus-infected cells Analysis of mRNA (by Sl nuclease protection experiments) revealed that late in infection, RNA We demonstrated that the 5' end of the 5alL4R gene is transcribed from the TAAATG motif. I testified. Viruses expressing only one PTG-inducible form of 5alL4R Description of proteins in vaccinia virus 14 and ranking points Constructed in (Radriguey and Smith).
Ｎｕｉｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ １８．、５３４７−５３５１ ． １９９０） ｏ要するに、ポリメラーゼ連鎖反応により５ａｌＬ４Ｒオーブ ンリーデイングフレームのコピーか構築され、ＩＰＴＧ誘発可能ワクソニアウイ ルス４ｂプロｚ−夕の下流で、プラスミドｐＰＲ３４内にクローニングされた（ Ｒｏｄｒｉｇｕｙ及びＳｍ１ｔｈ、 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７７、２３！Ｊ〜２ ５０．１９９０）。このプラスミドは、ＷＴワクシニアウィルス株”＃Ｒの感染 を受けた細胞の中にトランスフェクションされ、ＴＫ遺遺伝子円内５ａｌＬ４Ｒ 遺伝子のＩＰＴＧ誘発可能コピーを含むチミジン牛ナーゼ陰性ウィルス（ν５Ａ Ｄ７）か分離さ０た。次に５ａｌｌＬフラグメントの左端から１０５０〜２９９ ３の位置からの１．９ｋｂの５ｐｅｌ ＤＮＡフラグメントか分離され、Ｘｂａ ｌで消化されたプラスミドｐＵｃＩ３内へ連結されてプラスミドｐＳＡＤ２を 形成した。二のプラスミドは、大腸菌内で増幅さｎ、精製され、次に５ａｌＬ４ Ｒ遺伝子コーデイング領域の５′末端より下流５３ｂｐて切断するＮａｅｌて消 化された。次にＤＮＡは５ｃａｌで部分的に消化され、コーディング領域の３′ 末端の上流４０ｂｐの位置で５ｃａｌで切断された線型ＤＮＡフラグメントか分 離された。次にこのＤＮＡフラグメントは、遺伝子５ａｌＦ３Ｒについて上述し たとおりに分離され平滑末ｍ／ヒされたワクシニアウィルス７．５にプロモータ に連鎖された大ｌｌ！菌Ｅ、 ｃｏｌｉ ｇｐｅ遺伝子を含むＤＮＡフラグメン トと連結された。結果として得られたプラスミド（ｐＳＡＤ８と呼ばれる）は、 Ｅｃｏｇｐｔ遺伝子で欠失され置換さた４１５ｂｌｌの５ａ１４Ｒを有する。こ のプラスミドは、大喝菌内で増幅され、精製され、次にワクシニアウィルスｖＳ ＡＤ７に感染したＣＶ−Ｉｎｎ円内へランスフェクションされた。組換え嬰ウィ ルスは、ＩＰＴＧ及びマイコフェノール酸の存在下で選択され、びき続きプラー ク精製及び増幅された。ＴＫ遺遺伝子円内５ａｌＬ４Ｒｉｌ！伝子の［ＰＴＧ誘 発可能形懸を又εｃｏｇｐｔによって置換された５ａｌＬ４Ｒの内因性コピーを もつ組換え型ウィルスは、ＶＳＡＤ９と呼ばれた。サザンプロット法によるｖＳ ＡＤ７及びｖｓＡＤ９のゲノムＤＮＡの分析は、これらのウィルスが予言通りの 構造を有することを確認した。Nuileic Ac1ds Re5earch 18. , 5347-5351 ．． 1990) In short, 5alL4R orbs were produced by polymerase chain reaction. A copy of the leading frame is constructed and IPTG triggerable. Cloned into plasmid pPR34 ( Rodriguy and Sm1th, Virology 177, 23! J~2 50.1990). This plasmid was used to infect WT vaccinia virus strain “#R”. 5alL4R within the TK gene circle Thymidine bovine enzyme-negative virus (ν5A) containing an IPTG-inducible copy of the gene D7) was separated. Next, 1050-299 from the left end of the 5allL fragment A 1.9kb 5pel DNA fragment from position 3 was isolated and ligated into plasmid pUcI3 digested with l to create plasmid pSAD2. Formed. The second plasmid was amplified in E. coli, purified, and then 5alL4 The Nael eraser cuts 53 bp downstream from the 5' end of the R gene coding region. was made into The DNA is then partially digested with 5cal, 3′ of the coding region. A linear DNA fragment cut with 5 cal at a position 40 bp upstream of the end. Separated. This DNA fragment is then used as described above for the gene 5alF3R. Promoter was added to the blunt-ended vaccinia virus 7.5 isolated as described above. A big chained to! DNA fragment containing Bacterium E, coli gpe gene connected with The resulting plasmid (called pSAD8) It has 415 bll of 5a14R deleted and replaced in the Ecogpt gene. child The plasmid was amplified in Bacillus major, purified, and then vaccinia virus vS AD7 was transfected into infected CV-Inn circles. recombinant baby ruses were selected in the presence of IPTG and mycophenolic acid, followed by a was purified and amplified. TK gene circle 5alL4Ril! Denji's [PTG invitation] The endogenous copy of 5alL4R was also replaced by εcogpt. The recombinant virus was called VSAD9. vS by Southern plot method Analysis of AD7 and vsAD9 genomic DNA shows that these viruses predictably It was confirmed that it has a structure.
ＩＰＴＧの不在化ですなわち５ａｌＲ４Ｒ遺伝子無しでｖＳＡＤ９ウィルスか正 常に増殖した場合、コードされたタンパク質はウィルス複製にとって可欠なもの となるだろう。一方、ウィルスかＩＰＴＧに依存していた場合、５ａｌＬ４Ｒ遺 伝子はウィルス複製にとって不可欠なものとなる。In the absence of IPTG, that is, without the 5alR4R gene, vSAD9 virus or When constantly multiplied, the encoded protein is essential for viral replication. It will be. On the other hand, if it is dependent on a virus or IPTG, the 5alL4R gene The gene becomes essential for virus replication.
図１Ｏは、ＩＰＴＧウィルスか無い状態で、ＷＴウィルス及びｖＳＡＤ７形態が 正常なサイズのプラークを形成するのに対してｖＳＡＤ９は小さなプラークを形 成するということを示している。ＩＰＴＧ誘発の時点で、ｖＳＡＤ９のプラーク サイズは正常なサイズまで増大する。これは、ｖＳＡＤ９か５ａｌＬ４Ｒ発現無 しに伸展できなかったことを表わしていた。このことは同様に、ＩＰＴＧを伴う 又は伴わないν５ＡＤ９の増殖運動論に従って処理することもてきた。図ＩＩは 、高い感染か重度（ｍｏｉ）で感染した細胞内では、ＩＰＴＧの存在又は不在に よって細胞内ウィルスの産生が影響を受けることはなく、増殖運動論がｖＳＡＤ ７と区別できないものであったことを示している。このことは、５ａｌＬ４Ｒ遺 伝子が感染性細胞内ウィルスの産生に必要とされていないということを立証して いる。Figure 1O shows that WT virus and vSAD7 forms with or without IPTG virus. vSAD9 forms small plaques, whereas normal-sized plaques form. It shows that it will be achieved. At the time of IPTG induction, vSAD9 plaques Size increases to normal size. This indicates that vSAD9 or 5alL4R expression is absent. This indicated that he was unable to fully stretch his legs. This also involves IPTG It has also been treated according to the proliferation kinetics of ν5AD9 with or without ν5AD9. Figure II is , in highly infected or severely infected cells (moi), depending on the presence or absence of IPTG. Therefore, intracellular virus production is not affected and the proliferation kinetics is similar to vSAD. This shows that it was indistinguishable from 7. This means that the 5alL4R remains demonstrated that the gene is not required for the production of infectious intracellular virus. There is.
しかしなから、低いｌ１ｌｏＩでの感染は、最初の１２時間ＩＮ’／の産生がＩ ＰＴＧの存在又は不在によって変わることはないものの、その後ＩＮＶの収量は ［ＰＴＧか含まれていない場合減少するということを示していた。このことは、 感染していない細胞に対するウィルスの効率の良い伸展に５ａｌＬ４Ｒ遺伝子か 必要であるということを表わしていた。二の結論は、感染した細胞内のウィルス の成鶏の電子顕微鏡による分析によって直接裏づけされた（図１２）。ＩＰＴＧ か不在の場合（図版Ａ−Ｃ）、ウィルス形轢形成は、ＩＮＶ粒子の産生に至るま で正常である。However, infection at low l1loI indicates that the production of IN'/ during the first 12 hours is Although unaltered by the presence or absence of PTG, the yield of INV subsequently [It was shown that it decreased when PTG was not included. This means that The 5alL4R gene may be responsible for the efficient spread of the virus to uninfected cells. It showed that it was necessary. The second conclusion is that the virus in infected cells This was directly supported by electron microscopic analysis of adult chickens (Figure 12). IPTG (Panels A-C), virus formation continues until the production of INV particles. is normal.
しかしながら、ＩＰＴＧか存在しないかぎり、ゴルシ膜内でのこれらのＩＮＶ粒 子の発芽及び細胞からの退出も全く見られなかった。図版Ｅ及びＦは、このプロ セスかＩＰＴＧの存在下で起こっているところを示している。集合的にこれらの データは、ＩＮＶの産生のために５ａｌＬ４Ｒ遺伝子産物か必要とされないもの の、ゴルジ誘導膜によるＩＮＶの発達及び細胞からのεεＶ粒子の退出にとって はこれか必要とされる、ということを示している。However, unless IPTG is present, these INV grains within the Golthy membrane Neither germination nor exit of the offspring from the cells was observed. Illustrations E and F are from this professional It shows what is happening in the presence of Seth or IPTG. Collectively these The data indicate that the 5alL4R gene product is not required for the production of INV. for the development of INV and the exit of εεV particles from the cell by Golgi-induced membranes. indicates that this or that is required.
５ａｌＬ４Ｒ遺伝子産物は、大腸菌内のＴｒｐＥ−融合タンパク質として発現さ れた５ａｌＬ４Ｒの領域までポリクローナル抗血清をもち上げることによって識 別された。３２１ｂｐのＡｃｅｌフラグメントを５ａ１４Ｒ遺伝子内から分離し 、プラスミドｐＡＴＨ３（Ｋｏｅｒｎｅｒ他、！Ｊｅｔｈ、 Ｅｎｚｙｍｏｌ、 １９４゜４７７−４９０．１９９１）内にクローニングさせてｐＳＡＤ２４を 形成した。インドールアクリル酸を用いてｐＳＡＤ２４を宿す細菌内で融合タン パク質を誘発させた。The 5alL4R gene product is expressed as a TrpE-fusion protein in E. coli. Identification was achieved by raising polyclonal antiserum to the 5alL4R region. Separated. A 321 bp Acel fragment was isolated from within the 5a14R gene. , plasmid pATH3 (Koerner et al., !Jeth, Enzymol, 194°477-490.1991) to create pSAD24. Formed. Indoleacrylic acid was used to create a fusion protein in bacteria harboring pSAD24. It induced a pallium.
Ｓ１ヌクレーアゼによる消化物及び産物をＭＩ３梯子に対して配列決定ゲル上に 走らせた。結果（図８Ａ）は、ＢＩ５Ｒ遺伝子が、オーブンリーディングフレー ムの最初でＴＡＡＡＴＧモチーフから、感染中後期に転写されることを示してい る。S1 nuclease digest and products were placed on a sequencing gel against an MI3 ladder. I ran it. The results (Fig. 8A) show that the BI5R gene This indicates that the TAAATG motif is transcribed at the beginning of the infection, and is transcribed late during infection. Ru.
Ｂ１８ＲｍＲＮＡ分析の分析用プローブは、ＥｃｏＲＩでワクシニアウィルス５ ａ１１フラグメント（上）の５ａ１１−Ｘｂａｌを含むｐｔＪｃｌＩ８を消化さ せ、５００ｂｐのフラグメントをＭ製することにまって生産された。これを子ウ シ腸内アルカリホスファターゼで税リンさせ、ポリヌクレオチドキナーゼを用い てγ［３２）−ＡＴＰで標識づけし、Ｘｂａｌで消化させ、４７４ｂｐのフラグ メントを分離した。これを、上述のＢＩ５Ｒプローブの場合と同様にウィルスＱ ＩＲＮＡとハイブリッド形成させた。結果（図８Ｂ）は８１８１？Ｊ伝子か感染 初期にＢ１８１？遺伝子の上流から転写されることを示している。これらのデー タはこの遺伝子からのｍＲＮＡのプライマ伸長分析と一致している（Ｕｅｄａ ｅｔ ａｌ、、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７７、５７７−５８８．１９９０）。The analytical probe for B18R mRNA analysis was EcoRI and vaccinia virus 5. The a11 fragment (top) of ptJclI8 containing 5a11-Xbal was digested. A 500 bp fragment was produced using M. This is a child Tax phosphorylation was performed using alkaline phosphatase in the human body and using polynucleotide kinase. was labeled with γ[32)-ATP and digested with Xbal to generate a 474bp flag. ment was separated. Virus Q hybridized with IRNA. The result (Figure 8B) is 8181? J gene or infection B181 in the early days? This shows that it is transcribed from upstream of the gene. these days This is consistent with primer extension analysis of mRNA from this gene (Ueda et al., Virology 177, 577-588.1990).
Ｂ１５ＲかＭｒ５０にの分泌糖タンパク質をコードするということの直接的証拠 か得られてきた。後期ｐ４ｂプロモータから駆動されたＢ１５１？０１？Ｆの第 ２のコピーを含む組換え型ワクシニアウィルス（ＶＡＡ ｌ ）か構築された。Direct evidence that B15R encodes a secreted glycoprotein on Mr50 have been obtained. B151?01? driven from the late p4b promoter. F's number A recombinant vaccinia virus (VAA1) containing 2 copies was constructed.
このウィルスは、強い後期ワクシニア４ｂプロモータの下流でプラスミドｐＲＫ １９（Ｋｅｎｔ、 Ｒ，Ｋ、 ワクシニアウィルスル４ｂ遺伝子プロモータの分 離と分析、ρｈＤ 丁ｈｅｓｉｓ、ケンブリッジ大学、１９８８）内へＢ１５Ｒ ＯＲＦをクローニングする二とによって形成された。This virus has plasmid pRK downstream of the strong late vaccinia 4b promoter. 19 (Kent, R, K, vaccinia virus 4b gene promoter B15R into the analysis, ρhD Dinghesis, University of Cambridge, 1988) was created by cloning the ORF.
結果として得られたプラスミドを、ブロモデオキソウリジンの存在下でヒトチミ ジンキナーゼ陰性細胞上でのプラーク検定によって選択された、ＴＫ遺伝子座の 中に挿入されたＢＩ５Ｒの第２のコピーを含む組換え型ウィルス及び野生型（Ｗ Ｔ）ワクシニアウィルス（ＷＲ株）に感染した細胞内にトランスフエフシコンさ せた。ｖＡＡＩ又はＷＴウィルスのいずれかに感染したＢ５Ｃ−１細胞は、初期 （シトシンアラビノシドの存在下で感染より２〜４時間後）に又は後期（感染よ り６〜８時間後）に（３５Ｓ）−メチオニンで標識づけされ、放射Ｈ７ｌ！識付 けされたタンパク質はポリアシルアミドゲル電気泳動により分解され、オートラ ジオグラフィにより検出された。図９は、ＷＴウィルスには感染していないがｖ ＡＡ １に感染した細胞の上溝中に約Ｍｒ５ＯＫのグリコジル化された細胞外タ ンパク質が存在することを示している。こ（１）９ンバク質は、Ｂ１５Ｒ遺伝子 の産物である。The resulting plasmid was humanized in the presence of bromodeoxouridine. of the TK locus selected by plaque assay on Gin kinase-negative cells. A recombinant virus containing a second copy of BI5R inserted into the wild type (W T) Transfection in cells infected with vaccinia virus (WR strain) I set it. B5C-1 cells infected with either vAAI or WT virus were initially (2-4 hours after infection in the presence of cytosine arabinoside) or late (after infection). 6-8 hours later) and labeled with (35S)-methionine, emitting H7l! identification The separated proteins were resolved by polyacylamide gel electrophoresis and autotransferred. Detected by geography. Figure 9 shows that although it is not infected with the WT virus, v A glycosylated extracellular tag of approximately Mr5OK is present in the superior groove of cells infected with AA1. This indicates the presence of protein. This (1)9 protein is the B15R gene. It is a product of
Ｃ末端疎水性残基が１ｇドメインの最終β鎖を形成し従って膜内外アンカーとし て機能する可能性か低いものとして予言されているにもかかわらず、Ｂ１８Ｒタ ンパク質は感染の初期に細胞表面上に見い出すことができるということが報告さ れている（Ｕｅｄａ、 Ｙ、 Ｍｏｒｉｋａｗａ、 Ｓ及びＭａｔｓｕｕｒａ Ｙ（１９９０）、 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７７．５８８−５９４） 、局在は、 場合によっでは付加的なシスティン間の分子内ジスルフィド結合か関与して（例 えば免疫グロブリンなとの［ｇスーパーファミリーのその池のメンバーについて 発生するようなもの）、タンパク質−タンパク質問の相互作用によって媒介され つる。代替的には、これらのソステインはＡ及びＧβ鎖の間のドメイン内ジスル フィド架橋を形成することかできる。同様のことかＢＩ５Ｒについても言える。The C-terminal hydrophobic residue forms the final β-strand of the 1g domain and thus serves as a transmembrane anchor. Despite predictions that the B18R type is unlikely to function It has been reported that proteins can be found on the cell surface early in infection. (Ueda, Y., Morikawa, S. and Matsuura Y (1990), Virology 177.588-594), localization is In some cases, additional intercysteine intramolecular disulfide bonds are involved (e.g. For example, immunoglobulins [about members of the G superfamily] mediated by protein-protein interactions. Vine. Alternatively, these sosteins are intradomain disulfides between the A and Gβ chains. It is also possible to form fido bridges. The same thing can be said about BI5R.
タンパク質か細胞表面上にとどまるか或いは又放出されるかとは無関係に、両方 のタンパク質について可能性の高い機能はウィルス感染中に組織障害部位でＩＬ −ＩＲ又はＩＬ−６Ｒを結合させ隔絶させることである。これらのサイトカイン はこのときその天然のレセプタに到達できなくなり、その結果、炎症反応は減少 し、ウィルスか哺乳動物宿主体内で伸展し病気をひき起こす能力は増大すること になる。ｆＬ−ＩＲの遮断は直接宿主の炎症反応を減衰させることができる（Ｇ ｅｒｓｈｅｎｗａｌｄ、 Ｊ。Both, regardless of whether the protein remains on the cell surface or is also released. The likely function of this protein is to provide IL-1 at sites of tissue injury during viral infection. - binding and sequestering IR or IL-6R. These cytokines is then unable to reach its natural receptors, and as a result, the inflammatory response is reduced. However, the ability of the virus to spread within the mammalian host and cause disease increases. become. Blockade of fL-IR can directly attenuate host inflammatory responses (G ershenwald, J.
Ｅ、 Ｆｏｎｇ、 Ｙ、 、 Ｆａｈｅｙ、 Ｔ、 Ｊ Ｃａ１ｖａｎｏ、 Ｓ 、ε、 、 Ｃｈｉｚｚｏｎｉ ｔｅ、 Ｒ，、Ｋｉ Ｈａ氏A Ｐ、 Ｌ、 。E, Fong, Y, Fahey, T, J Ca1vano, S , ε, , Chizzoni te, R, , Mr. Ki Ha A P, L, .
Ｌｏｗｒｙ、 Ｓ、 Ｆ、及びＶｏｌｄａｗｅｒ、Ｌ、Ｌ、（１９９０）、Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ８７゜４９６６〜４９７０）。Lowry, S. F., & Voldawer, L. L. (1990), Pr. oc, Natl, Acad, Sci, USA 87°4966-4970).
ＢＩ５Ｒ及びＢＩ８Ｒタンパク質のもう１つの可能性ある機能は、ウィルス粒子 又は感染細胞とその他の細胞との相互作用を媒介することによりウィルスの伸展 を容易にすることである。１ｇスーパーファミリーのメンバー（例えばｖＨＣ抗 原、ＮＣＡＭ ＣＨｅｍｐｅｒｌｅｙ、 Ｊ、 Ｊ、 Ｍｕｒｒａｙ。Another possible function of the BI5R and BI8R proteins is to or spread of the virus by mediating interactions between infected cells and other cells. The goal is to make it easier. 1g superfamily members (e.g. vHC anti- Hara, NCAM CHemperley, J., J., Murray.
Ｂ、 Ａ、 Ｅｄｅ １ｍａｎ、 Ｇ、 Ｍ、及びＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ、 Ｂ 、 Ａ、 （１９８６）、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ １． Ａｃ≠пA Ｓｃｉ。B, A, Ede 1man, G, M, and Cunningham, B , A. (1986), Proc, Nat 1. Ac≠пA Sci.
ＵＳＡ ８３．３０３７−３０４１）及び細胞間タンパク質アマルガム（Ｓｅｅ ｇｅｒ、 ！Ｊ、 Ａ。USA 83.3037-3041) and intercellular protein amalgam (See ger! J.A.
Ｈａｆｆｌｅｙル及びＫａｕｆｍａｎ、Ｔ、Ｃ，（１９８８）、Ｃｅ１ｌ ５５ ．５８９−６００）とのこのような細胞−細胞相互作用の前例は豊富にある。そ れでも、ＩＬ−ＩＲとＩＬ−６Ｒに対する相同性が近くなればなるほど、サイト カインの結合はより確率の高いものとなる。実際、Ｂ１８Ｒ遺伝子産物に対する 抗体はウィルスの感染力を中和することなくウィルスの復製を制限し、免疫血清 の受動的トランスファの後耐性を付与する（Ｕｅｄａ、 Ｙ及びＴａｇａｙａ、 Ｉ（１９７３）Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、 １３８．１０３３−１０４３）。これら の観察事実は、Ｂ１８Ｒタンパク質かサイトカイン（ＩＬ−１）又はＩＬ−６） を結合し、そのレセプタを支持する細胞内でのその正常なｍ能をこれらか媒介す るのを防ぐことと矛盾しない。ＢＩ８Ｒに対する抗体はこれらのサイトカインの 隔絶を阻止し、従って正常な炎症反応が結果として起こり、ウィルス復製が制限 されることになる。ＢＩ５Ｒタンパク質も同様の要領で機能しつる。Haffley and Kaufman, T.C. (1988), Ce1l 55 ．． 589-600)) are abundant. So However, the closer the homology between IL-IR and IL-6R, the more the site Cain's union becomes more probable. Indeed, for the B18R gene product Antibodies limit the reproduction of the virus without neutralizing its infectivity, and the immune serum confers resistance after passive transfer of (Ueda, Y and Tagaya, I (1973) J, Exp, Med, 138.1033-1043). these The observed fact is that B18R protein or cytokine (IL-1 or IL-6) binding and mediating its normal m-ability in cells that support its receptors. consistent with preventing Antibodies against BI8R inhibit these cytokines. Blocking sequestration, thus resulting in a normal inflammatory response and limiting viral reproduction will be done. The BI5R protein functions in a similar manner.
このようなメカニズムは、封入体から精製され、そしてウサギを免疫化するため に使用される新規防■融合タンパク質を構成する。Such a mechanism was purified from inclusion bodies and used to immunize rabbits. Construct a novel anti-fusion protein used for
融合タンパク質を細胞封入体から精製し、ウサギを免疫化するために用いた。こ の血清はＷＴウィルス又はｖＳＡＤ９に感染したＢ５Ｃ−１細胞からのタンパク 質抽出物のウェスタンプロット分析内で使用するか、又はＩＰＴＧ及びチュニカ マイシンの存在下又は不在化で擬似感染させた。図１３は、ＩＶＴ惑染細胞内に は、抗−５ａｌＬ４Ｒ血清によって検出されるＭｒ２２．２３及び２４にの３つ のポリペプチドが存在することを示している。これらの同じタンパク質は、ＩＰ ＴＧの存在下でｖＳＡＤ９に感染した細胞内に見られるが、ＩＰＴＧが削除され た場合及び擬似感染した細胞からは存在しない。チュニカマイシン（Ｎ連鎖グリ コジル化の阻害因子）の存在下では、バンドはＭｒ１９に前駆体で置換される。The fusion protein was purified from cell inclusions and used to immunize rabbits. child The serum contains proteins from B5C-1 cells infected with WT virus or vSAD9. used within Western blot analysis of quality extracts or IPTG and Tunica Mock infections were performed in the presence or absence of mycin. Figure 13 shows that in IVT-contaminated cells are three at Mr22, 23 and 24 detected by anti-5alL4R serum. This indicates the presence of polypeptides. These same proteins are called IP Found in cells infected with vSAD9 in the presence of TG, but when IPTG is deleted. It is absent from infected cells and from mock-infected cells. Tunicamycin (N-linked glycerol) In the presence of codylation inhibitors), the band is replaced by Mr19 with the precursor.
このことはすなわち、−次翻訳産物がタンパク質のＣ末端近くのＮ連鎖炭水化物 のための単一部位でグリコジル化されていることを表わしている。This means that the next translation product is an N-linked carbohydrate near the C-terminus of the protein. This indicates that the protein is glycosylated at a single site.
５ａｌＬ４Ｒによりコードされるタンパク質のパターンは、εとＶエンベロープ の構成要素であるものとして示されている一群のタンパク質に非常に項似してい る（Ｐａｙｎｅ、 Ｌ、Ｇ、Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、 ３１．１４７−１５５．１９ ７９）。The pattern of proteins encoded by 5alL4R is ε and V envelope. are very similar to a group of proteins that have been shown to be constituents of (Payne, L, G, J, Virol, 31.147-155.19 79).
この観察は、ウィルスの発達及び退出のための５ａｌＬ４Ｒの遺伝子産物に対す る必要性と合わせて、ＥＥＶ中に５ａｌＬ４Ｒが存在していることを示唆してい た。このことは、免疫電子顕微鏡法によって実証された。This observation suggests that the gene product of 5alL4R for virus development and egress This suggests the presence of 5alL4R in EEV. Ta. This was demonstrated by immunoelectron microscopy.
図１４は、５ａｌＬ４Ｒ−融合タンパク質に対する抗体か、精製されたＥＥＶ粒 子（図版Ａ−Ｃ，Ｅ）と反応するもののＩＮＶとは反応しない（図版Ｄ）ことを 表わしている。この特異的結合は、膜の透過性化（図版Ｅ）を必要とせず、Ｔｒ ｐＥ−ＳａｌＬ４Ｒ融合タンパク質カラム上の抗５ａｌＬ４Ｒ免疫グロブリンの イムノアフィニティ精製の後に存在した（図版Ｂ）。−次抗体が、無関連のウサ ギの血清であった場合、全粒子の結合は見られなかった（ＦＡ図版）。これらの データは、５ａｌＬ４Ｒでコートされたタンパク質がεＥＶエンベσ−ブの一部 を成すことを実証している。これらの発見事実の意義は３つある：すなわち、ｉ ）このウィルスは、５ａｌＬ４Ｒ遺伝子発現か無い状態で効果的に伸展できない 。従って、５ａｌＬ４Ｒの欠如した欠失突然変異体は減衰されることになる。ｉ ｉ）これらの観察事実は外来性ＤＮＡをウィルスゲノム内に挿入させることので きる部位として５ａｌＬ４Ｒ遺伝子を識別している。１ｉｉ）ウィルスの細胞外 外被タンパク質が、抗体を中和させるための最も重要な標的であることがわかっ ている。（Ｐａｙｎｅ、 Ｌ、Ｇ、。Figure 14 shows whether antibodies against 5alL4R-fusion protein or purified EEV particles were used. Although it reacts with children (Pictures A-C, E), it does not react with INV (Picture D). It represents. This specific binding does not require membrane permeabilization (Panel E) and the Tr Anti-5alL4R immunoglobulin on pE-SalL4R fusion protein column present after immunoaffinity purification (Plate B). - The next antibody was tested in an unrelated rabbit. In the case of serum from P. elegans, no binding of all particles was observed (FA illustration). these The data show that the 5alL4R-coated protein is part of the εEV envelope σ-envelope. It has been demonstrated that this can be achieved. The significance of these findings is threefold: i. ) This virus cannot spread effectively in the absence of 5alL4R gene expression. . Therefore, deletion mutants lacking 5alL4R will be attenuated. i i) These observations suggest that foreign DNA can be inserted into the viral genome. The 5alL4R gene has been identified as a site where 1ii) Virus extracellular The coat protein was found to be the most important target for neutralizing antibodies. ing. (Payne, L.G.
Ｊ、 Ｇｅｎ、 Ｖｉｒｏｌ、５０．８９−１００． １９８０） 、従って、 ５ａｌＬ４Ｒ遺伝子の欠如している組換え型ウィルスを動物又は人間にワクチン 接種した場合、ワクシニアウィルスに対して誘発された免疫は、ＷＴウィルスに よって誘発されるものに比べて効力か低いものとなる。従って、ワクチン再接種 の時点で、ウィルスはより良く複製し、ワクチン再接種に用いられたウィルスに よって発現された外来性抗原に対する免疫応答は、より強いものとなる。J, Gen, Virol, 50.89-100. 1980), therefore, Vaccine animals or humans with a recombinant virus lacking the 5alL4R gene When vaccinated, the immunity induced against vaccinia virus is similar to that of WT virus. Therefore, it is less effective than what is induced. Therefore, revaccination At this point, the virus replicates better and is more susceptible to the virus used for revaccination. Therefore, the immune response to the expressed foreign antigen becomes stronger.
出願人はここで、Ｂ１５Ｒ，ＢＩ８Ｒ及び５ａｌＬ４Ｒについての配列情報を提 供し、ウィルスゲノム中のそのヌクレオチド配列の場所を識別した。The applicant hereby provides sequence information for B15R, BI8R and 5alL4R. and identified the location of its nucleotide sequence in the viral genome.
これだけのことを行なった上で、これらの配列をｖＶゲノム内て失活させるか又 はｖＶゲノムからこれらの配列を欠失させるか、或いは又これらをコードされた タンパク質産物の機能を変えるために変更するかは、当業者ならば可能な範囲内 の作業である。必要とされる標準的手順については、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌ ｏｎｉｎｇ （分子クローニング）ｅｄｓ、 Ｓａｍｂｒｏｏｋ、 Ｆｒ１ｔｓ ｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｕｒＬａｂ ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、 １９８９内に記述されている。Having done all this, we can either inactivate these sequences within the vV genome or deletes these sequences from the vV genome, or alternatively encodes them Modifications to alter the function of a protein product are within the ability of those skilled in the art. This is the work of For the required standard procedures, see Molecular Cl oning (molecular cloning) eds, Sambrook, Fr1ts ch and Maniatis, Co1d Spring HarborLab oratory Press, 1989.
さらに、本書て提供されているワクシニアウィルスベクターを含む有用な製薬及 び免疫原を開発し、抗体などを生産するのに免疫原を使用し：キット及び製薬の 形で抗体を使用し；識別された配列を分離しこれらを組換え体産生方法において 使用することは、当業者の通常の能力の範囲内に入るものである。In addition, useful pharmaceutical products, including the vaccinia virus vectors provided herein, Develop immunogens and use immunogens to produce antibodies, etc.: kits and pharmaceutical products. using antibodies in the form of antibodies; isolating the identified sequences and using these in recombinant production methods. Its use is within the ordinary ability of those skilled in the art.
表１ Ｂ１５ＲＢ１８Ｒ ＢＩ５Ｒｌ Ｂ１８ＲＩ ４．８１ １．８８ ０．５８２ ４．１３ ２，７５ ２．２５ ２．７０３ １．９４ ２．６４ ３．５１ ３．６７−０．２１１Ｌ〜ＩＲ マウス１７．７７ ４．３２ ３．２７ 、３．８７ ４．６４２．２９ ２ ４．７０ ？、６２ ２．２０ ０．３９ ６．４２３．１１ ３ ２．０３ １．７４ ２，６８ ２．９６ ＋、９１３．５５ ＩＬ−ＩＲヒト ｌ ７．６２ ２．３７ ３．２１ ２．５３ ４．６０２． ７８ ２ ４．０７ ８．２９ ＋、２７ ０．３１ ５．８８３．８０ ３ １．０７ １．２９ ４．６４ １．７３ １．６５２．４４ ＩＬ−６Ｒｌニド ５．８７ ３．９８ ５．２８ ３．２４ ６．３０２．１ ０ ＬＩＣＡＭ ６ ４．４０ ４．１３ ６．４４ ２．７９ ５．４３２．４１ ＣＨＮＣＡＭ ｌ ４．＋２ ４．０１ ４．０７ ３．＋９ ５．５４３．２ ８ ！１ｌＡＧ ３ ４．０４ ４．６７ ６．＋７ １．２２ ３．１０３．９６ ＰＤＧＦＲ３２，８４２，８１５，＋４ ３．８８ ４．８６３．２４ ＴＣＲＣＤ３ ５．６５ ４．９５ １．７５ ２．３８ ４．６−１２．６６ ＬＡＲ２５，３３６，５２４，−１６３，２６５，３２２，０７ ＣＥＡ Ｉ ３．４２ ３．５１３ ３．１８ １．２−１ ６．３３４．０７ ＲＰｌｇＲ５３，９２４，４７４，３５１，６７＋、８０３．８１ 表Ｉ ＡＬＩＧＮプログラム（Ｄａｙｈｏｆｆ、 Ｍ、０．、 Ｂａｒｋｅｒ、 Ｗ、Ｃ，及びＨｕｎｔ。Table 1 B15RB18R BI5Rl B18RI 4.81 1.88 0.582 4.13 2,75 2.25 2.703 1.94 2.64 3.51 3.67-0.211L~IR Mouse 17.77 4.32 3.27, 3.87 4.642.29 2 4.70? , 62 2.20 0.39 6.423.11 3 2.03 1.74 2,68 2.96 +, 913.55 IL-IR human 7.62 2.37 3.21 2.53 4.602. 78 2 4.07 8.29 +, 27 0.31 5.883.80 3 1.07 1.29 4.64 1.73 1.652.44 IL-6Rl Nido 5.87 3.98 5.28 3.24 6.302.1 0 LICAM 6 4.40 4.13 6.44 2.79 5.432.41 CHNCAM l 4. +2 4.01 4.07 3. +9 5.543.2 8 ! 1lAG 3 4.04 4.67 6. +7 1.22 3.103.96 PDGFR32,842,815,+4 3.88 4.863.24 TCRCD3 5.65 4.95 1.75 2.38 4.6-12.66 LAR25,336,524,-163,265,322,07 CEA I 3.42 3.513 3.18 1.2-1 6.334.07 RPlgR53,924,474,351,67+,803.81 Table I ALIGN program (Dayhoff, M. 0., Barker, W., C., and Hunt.
Ｌ、 Ｔ、 （１９８３）を用いて計算さｎたその他の１ｇスーパーファミリー メンバーからの選択されたドメインに対するワクンニアウィルスタンバク質旧５ Ｒ及びＢ１８Ｒの［ｇドメインについての票似性評点。このプログラムは、無作 為にスクランプリングした配列の１００の整列の平均評点と２つのドメインにつ いての最高の整列評点を比較している。ランダム化された配列の平均評点からの 標準的偏差の数として、実際の配列の最高の整列に対する評点が示されている。Other 1g superfamilies calculated using L., T. (1983) Vacunnia virus proteins Old 5 for selected domains from members Vote similarity score for [g domain] of R and B18R. This program is free The average score of 100 alignments of sequences scrambled for The best aligned scores are compared. From the average score of the randomized array The score for the best alignment of the actual sequences is shown as the number of standard deviations.
３．１以上の値（確率ＩＯ−りは有意な値であり、一方４． ８． ６． ０及 び７．９の値は、それぞれ１０−’、 １０−’及び１Ｏ−Ｉｓの確率を表わし ている。例示されているドメインは、Ｂ１５Ｒアミノ酸２８−＋１９ （１１， １２１〜２１６ （２１゜２２２〜終り（３１： Ｂ１８Ｒ５３−１４９（１） 、 １５２〜２４１ （２）、 ２５２〜終り（３）；マウスＩＬ−ＩＲ前駆体 （Ｓｉｍｓ、 Ｊ、Ｅ、、 Ｍａｒｃｈ、 Ｃ，Ｊ、、 Ｗｉｄｍｅｒ、 Ｍ、 Ｂ、。A value of 3.1 or more (probability IO-ri is a significant value, while 4.8.6.0 and The values of and 7.9 represent the probabilities of 10-', 10-' and 1O-Is, respectively. ing. The exemplified domain is B15R amino acids 28-+19 (11, 121~216 (21゜222~end (31: B18R53-149 (1) , 152-241 (2), 252-end (3); Mouse IL-IR precursor (Sims, J.E., March, C.J., Widmer, M. B.
ＭａｃＤｏｎａｌｄ、 Ｈ，Ｒ，、ＭｃＭａｈａｎ Ｄｉ、、 Ｇｒｕｂｉｎ、 Ｃ，Ｅ、、 Ｗｉｇｎａｌｌ、 Ｊ、Ｌ。MacDonald, H,R,, McMahan Di, Grubin, C, E, Wignall, J, L.
Ｊａｃｋｓｏｎ、 Ｊ、Ｌ、 Ｃａ１１． Ｓ、Ｍ、 Ｆｒ１ｅｎｄ、 Ｄ、、 Ａｌｐｅｒｔ、 Ａ、Ｒ，Ｇ１１ｌｉｓ、 Ｓ、。Jackson, J.L., Ca11. S, M, Fr1end, D,, Alpert, A, R, G11lis, S.
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２２８−３３２ ＋３１ ；ヒトＩＬ−６Ｒ（Ｙａｍａｓａｋｉ、Ｋ、、Ｔａｇ ａ、 Ｔ、、Ｆｌｉｒａｔ、Ｙ、。228-332 +31; Human IL-6R (Yamasaki, K., Tag a, T,,Flirat, Y,.
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＝＜＜）−ＩＺ＞ａＯ＋ニ〇−ロく〉ψ×乙−片−−〇Ｘ＝Ｗ＜＜Ｚ＜二く−２ 〉ΣωＣ＋１Ｑ１−Ｉロエーｕａｔ−＋ｕｔｐ−ロ←と口〇−＞ＱφＱ＞−ζ− 口（ニーく←←−Ｃ−１＝とφω−’ｉ＜ｃＡ’ｉ＜ψａ←αＺＥ−０至ｍ ＝ ｍ ｔ、ｉ ７：コ −異 １２３４５６７Ｂ １２３４５６７Ｂ ｐｆｕ／ｍｌ ０ｐｆｕ／ｍｌ ） ｐｆｕ／ｍｌ （） ｐｆｕ／ｍｌ ｍ補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成５年４月２６日１=<<)-IZ>aO+ni〇-roku〉ψ×Otsu-kata--〇X=W<<Z<two-2 〉ΣωC+1Q1-I roe uat-+utp-ro← and mouth〇->QφQ>-ζ- Mouth (knee←←−C−1= and φω−’i<cA’i<ψa←αZE−0 to m= m t, i 7: Ko - different 1234567B 1234567B pfu/ml 0pfu/ml ) pfu/ml () pfu/ml m Amendment translation submission form (Article 184-8 of the Patent Act) April 26, 1993 1
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