JPH06501270A - ヒト骨由来インスリン様成長因子結合タンパク - Google Patents
ヒト骨由来インスリン様成長因子結合タンパクInfo
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- JPH06501270A JPH06501270A JP4510060A JP51006092A JPH06501270A JP H06501270 A JPH06501270 A JP H06501270A JP 4510060 A JP4510060 A JP 4510060A JP 51006092 A JP51006092 A JP 51006092A JP H06501270 A JPH06501270 A JP H06501270A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ヒト骨由来インスリン様成長因子結合タンパク発明の分野
本発明は、骨代謝に関しており、より詳しくは、ヒト骨から単離された新規イン
スリン様成長因子結合タンパク(IGFBP)によって媒介される骨代謝過程に
関する。さらに詳しくは、本発明は、骨細胞増殖に対するインスリン様成長因子
−n (IGF−II)の影響を可能にするヒト骨由来IGFBP (hBD−
IGFBP)と称されるIGFBPに関する。
発明の背景
ヒト血漿に存在する2つの最も豊富な成長因子、IGF−IおよびI GF−n
は、構造がプロインスリンに似ており、かつ多くの組織において、アナポリック
な、および急性の両方のインスリン様活性を有するポリペプチド類から構成され
る[ダウファグイ(D aughaday)ら、エンドタリン・リビュ(E n
docrineRev、)、10:68−91 (1989)コ。ラットおよび
マウスを使用する種々の研究は、胎児ホルモンであるIGF−IIとともに、主
要なIGFとしてIGF−Iを力説するが、最近の発見は、成人の骨代謝におけ
るIGF−IIの重要な役割を指摘した。IGF−nは、ヒトの骨中に存在する
最も豊富な成長因子であることが見いだされ、ヒトの骨細胞によって生産される
最も豊富な成長因子である。
さらに、ICF−nは、ヒトの骨細胞に対して***誘発性であるいくつかの成長
因子のうちの1つである。また、IGFBP−4と称される、最近精製された抑
制性IGFBPが、無血清条件で約40%まで基底骨細胞増殖を抑制することが
判明し、これによって、付加される成長因子の不在下、rGFの内因性生産が実
質的に細胞増殖に寄与することが示唆された。最後に、IGF−n受容体阻止抗
体が、基底骨細胞増殖を抑制することが判明し、これによって、IGF−nが重
要な骨細胞成長因子であることが示唆された[モハン(Mohan)ら、プロウ
ス・ジェネティクス・アンド・ホールモウンズ(Growth、 Geneti
cs and Horrsones)、6 :1−9 (1990)およびモハ
ン(Mohan)ら、クリニカル・オールソウビーディマウス・アンド・リレイ
テッド・リサーチ(CIin、 0rthopedics & Rel。
R−es、 )、263 :3O−48(1990)]。
最近、IGFを特異的に結合する、構造的に関連するタンパク系が種々の組織に
おけるIGF作用の変調に関係することも明らかになった。4種類のヒトIGF
BP (hIGFBP−1、hIGFBP−2、hIGFBP−3およびhIG
FBP−4と記す)が単離され、単離されたcDNAクローンのヌクレオチド配
列から完全なアミノ酸配列が予想された〔モハン(Mohan)ら、クリニカル
・オールソウビーディマウス・アンド・リレイテッド・リサーチ(Clin。
0rthopedics & Re1. Res、 )、2.63 :30−4
8 (1990);バクスター(B axter) ら、Prog、Growt
h Factor Res、1 : 49−68 (1989):ビンカート(
B 1nkert)ら、イー・エム・ビー・オー・ジャーナル(EMBOJ、)
8 : 2497−2502 (1988);ブリュワー(B rever)ら
、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション
ズ(B iochem。
Biophys、Res、Coml1.) 152 :1289−1297 (
1988)ニブリンクマン(B rinkman)ら、イー・エム・ビー・オー
・ジャーナル(EMBOJ、)7:2417−2423 (1988):リー(
Lee)ら、Mo1. Endocrinol、2 :404−411 (19
88)+ラブド(Wood)ら、Mo1. Endocrinol、2 : 1
176−1185 (1988);ラトウア=(LaTour) ら、Mo1.
Endocrinol。
4 :1806−1814 (1990);およびシマサキ(S himasa
ki)ら、Mol。
Endocrinol、4 :1451−1458 (1990)を参照]。
IGFBP−1は、羊水、胎盤膜、脱落膜およびHEP G2肝細胞癌細胞を含
む種々の供給源から単離された。これらの種々の供給源から単離されたrGFB
P−1タンパクのN−末端アミノ酸配列は、同一であることが判明した。HEP
G2、ヒト子宮およびヒト胎盤cDNAライブラリー由来のIGFBP−1をコ
ードするcDNAのクローニングおよび完全な配列が報告された。T GFBP
−2は、ラット肝細胞(BRL−3A)およびマディンーダービイ(Madin
−Darby)ウシ胃細胞から回収された調整培地から精製した。IGFBP
−2をコードする遺伝子は、BRL−3Aおよびヒト胎児肝臓cDNAライブラ
リーからクローン化された。IGFBP−3は、IGF−IまたはIGF−II
、約85キロダルトンの酸不安定性糖タンパク、および53キロダルトンの酸安
定性筒タンパクであるIGFBP−3分子間の150キロダルトンの3成分複合
体として血清中にある。IGFBP−3は、ヒト血清から等質性に精製され、I
GFBP−3をコードするcDNAのクローニングおよび配列決定が報告されて
いる。IGFBP−4は、もともと、抑制性IGFBPとしてヒト骨細胞調整培
地から、およびラット血清から精製された。最近、ヒト骨細胞cDNAライブラ
リーおよび肝臓cDNAライブラリーから単離されたIGFBP−4cDNAク
ローンのクローニングおよび配列決定が報告された。これら4種類のIGFBP
に加えて、マーチン(Martin)ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー(J 、 B fol、 Chew、 )、265 : 4124
−4130 (1990)、ロガニ(Roghani)ら、エフ・イー・ビーー
xス・レターズ(FEBS Lett、)、255 : 253−258 (1
989)およびザッフ(Zapf)ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリー(J 、 B iol、 Chew、 )、265 +14892−
14898 (1990)には、各々、ヒト脳を髄液由来、Ao 2804形質
転換線維芽細胞によって調整された培地由来、および低血糖血清由来のIGFB
Pの部分精製が報告されている。これは、IGF−1にまさるIGF−IIにつ
いての強い親和性を示す。
か(して、当該技術文献には、種々の供給源によって生産され、かつIGFへの
本質的に異なる結合特性および種々の生物学的機能を示す種々のIGFBPが記
載されている。例えば、IGFBP−1、IGFBP−3およびIGFBP−4
は、はぼ等しい親和性でIGF−IおよびIGF−IIの両方を結合するが、一
方、IGFBP−2、ならびに羊水、線維芽細胞およびヒト血清から精製された
IGFBPは、ICF−Iよりも高い親和性でIGF−IIを結合する。機能に
関しては、IGFBP−1は、絨毛癌細胞中、およびヒト線維芽細胞中でI G
FBP−1の増殖作用を抑制すること、および増強することの両方を示した[エ
ルギン(E Igin)ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
(J、Biol。
Cha+*、)、84 + 3254−3258 (1987)およびリドボス
(Ritvc)s)ら、エンドクリノロジー(E ndocrinology)
、122:2150−2157 (1988)]。IGFBP−3は、繊維芽細
胞中で培養条件に依存してIGF−I作用を抑制または刺激することを示した[
デ・メロウ(De Mellow)ら、バイオケミカル・アンド・バイオフィジ
カル・リサーチ・コミュニケーションズ(Bioche■。
Biophys、Res、Com1.)、 156 :199−204 (19
88)コ。 IGFBP−1およびIGFBP−3とは対照的に、IGFBP−
4は、単に、骨細胞においてIGF−IおよびICF−II作用を抑制すること
を示した[モハン(Mohan)ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・
アカデミ−・オブ・サイエンシズ(Proc、Natl、Acad、 Sci、
USA) 、86 : 8338−8342 (1989) ]。
該技術文献は、また、組織特異的方法で、種々のIGFBPの生産が本質的に異
なって変えられることを示唆する。例えば、IGFBP−1生産は、インスリン
によって変えられるが、一方、IGFBP−3生産は、成長ホルモンによって変
えられる[バクスター(B axter)ら、Prog、 Growth Fa
ctor Res、、1:49−68 (1989)]。これらの発見は、種々
のrGFEPの固有の調節と関連してそれらの多様性によってIGF活性が局在
化された組織特異的方法で変えられることを示唆する。
当技術分野では、IGFBPを介する骨代謝においてrGF−IおよびIGF−
■機能を関係付けることがまだ必要であり、かくして、骨細胞によって生産され
、かつヒト骨基賀に存在するIGFBPを同定することが必要である。かがるr
GFBPは、骨代謝をtJ1節することに関係すると思われ、臨床アッセイにお
いて使用されて、骨代謝における欠損の診断において情報を提供することができ
る。
骨のIGF依存性成長を増強するIGFBPは、特に、骨粗セ症のような代謝性
骨疾患の治療のための治療用途において有用である。全く驚くべきことに、本発
明は、これらおよび他の関連する要求を満足する。
発明の概要
本発明は、IGF媒介骨形成および細胞増殖に関係する代謝障害の臨床的診断お
よび治療のための方法および組成物を提供する。さらに詳しくは、本発明は、ヒ
ト骨由来rGF結合タンパク(hBD−、IGFBP)を提供する。I GF−
IIおよびIGFBPを同時に投与するという条件下で、hBD−IGFEPは
、1GF−Uと相乗効果的に作用して、IGF−If媒介細胞増殖を増強する。
精製hBD−rGFBPは、また、強い親和性でヒドロキシアパタイトに結合し
、かくして、骨に対して特異的に分子を指向させるための試薬、例えば、IGF
−nおよび/またはIGF−1,他の成長図子、または骨吸収もしくは形成に影
響を及ばす薬物を提供し、かくして、例えば、骨折および骨粗髭症または骨肉腫
のような骨疾患の治療に有用である。hBD−IGFBPは、創傷治癒の治療に
おいて、および皮膚修復においても使用される。hBD−4GFBPは、例えば
、治療薬による骨障害の治療の間、骨形成速度のマーカーとして診断学的に使用
される。
hBD−4GFBPは、骨代謝および他の障害をもつ患者由来の試料におけるI
CFレベルの臨床学的評価用試薬としても使用される。
図面の簡単な説明
箪1図、hBD−IGFBPのN−末端アミノ酸配列と他の既知のIGFBPの
N−末端アミノ酸配列との比較。該配列は、最大同一性を与えるように並べる。
第2図、hBD−IGFBPの競合結合曲線。該試料は、非標識IGF−Iおよ
びrGF−nの存在または不在下で、標!110F−IIを使用して結合タンパ
ク活性についてアッセイした。
第3図、F PLCMono Qクロマトグラフィ一工程におけるヒト骨抽出物
のタンパクプロフィール(A)およびIGFBP活性プロフィール(B)。50
冨lずつのHA結合画分プールのアリニット3つをIGF−nアフィニティカラ
ムに適用した。得られた3つの親和性結合画分をプールし、Mono Q陰イオ
ン交換カラムに付した。280n■での吸光度によってタンパクのプロフィール
をモニターした。21/ずつ、2分ずつの画分を回収した。該両分のアリコツト
を10倍に希釈し、結合タンパク活性についてアッセイした。IGFBP活性は
、特異的に結合した標識IGF−IIの量で表される。
第4図、精製の種々の段階でのhBD−IGFBPのリガンドプロット分析。
試料50μlを5DS−PAGE (3〜27%勾配液)に付し、ニトロセルロ
ース膜に移し、標識IGF−nでプロットし、オートラジオグラフに付した。レ
ーンa1ヒト骨抽出物のHA結合画分:レーンb、ICF−II親和性結合画分
;レーンcSMono Q IGFBPビークA;レーンd、Mono Q I
GFBPビークB;レーンe、Mono Q IGFBPビークCおよびレーン
f、 Mono Q I GFBPビークD0
詳細な具体例の説明
本発明は、IGF−Iに対するよりも大きい親和性でIGF−IIに特異的に結
合する、精製および単離したヒト骨由来IGFBPを提供するものである。該タ
ンパクは、所望により、例えば、ヒト骨調製物、ヒト骨細胞調整培地、またはヒ
ト血清から抽出されたタンパクから均質に精製される。特に、医薬用途のために
、少なくとも約50%の実質的に純粋なhBD−IGFBFが好ましく、少なく
とも約70〜80%がより好ましく、95〜99%以上の均質性が最も好ましい
。
部分的にまたは均質に精製した後、所望により、次に、hBD−IGFBPを、
例えば、診断用、免疫原として、治療用などに使用しでもよい。
本発明のhBD−IGFBPは、ヒドロキシアパタイト・アパタイト・クロマト
グラフィー、次いで、IGF−nを有するカラム上でのアフィニティクロマトグ
フィーに付して精製してもよく、最後に、FPLC系を使用してMono Q陰
イオン交換クロマトグラフィーによってさらに純粋に精製してよい。精製したタ
ンパクの見かけの均質性は、例えば、5DS−PAGE上の単一バンドとしてそ
の移動によって、およびN−末端配列分析について単一アミノ酸配列の生産によ
って示される。精製機構において、hBD−IGFBPに対して特異的に指向す
る抗体を使用する抗体カラム上でのアフィニティクロマトグフィーを使用するこ
ともできる。さらなる精製は、とりわけ、液体クロマトグラフィー、勾配遠心、
およびゲル電気泳動のような慣用の化学的精製手段によって行ってもよい。タン
パク精製方法は、当該技術分野で知られており[一般に、本明細書中に引用記載
するスコウブス、アール(Scopes、R,)、プロティン・ピューリフイケ
ーション(P rotein P urification)、スブリンガーー
バーラグ、ニューヨーク(1982)をt照]、本明細書に記載するhBD−I
GFBPの精製に用いることもできる。
IGF−nおよびIGF−IへのhBD−IGFBPの特異的結合は、ポリエチ
レングリコール沈殿アッセイによって示される。この態様において、本発明は、
特異的受容体およびhBD−IGFBPに結合させるICFの決定因子の構造−
機能研究において有用な精製タンパクを提供する。さらに、本発明の精製hBD
−IGFBPの有用性を、以下の本発明の他の態様の説明に記載する。
本発明の精製IGFBPは、固有のものであり、従来同定された全てのIGFB
Pとは異なっている。ヒトIGFBP−1、IGFBP−2、IGFBF−3お
よびIGFBP−4は、刊行物に記載されているhBD−IGFBPのアミノ酸
配列とは異なるアミノ酸配列によって特徴付けられる。脳を髄液、線維芽細胞調
整培地およびヒト血清から精製されたIGFBPについて報告されたN−末端ア
ミノ酸配列は、hBD−IGFBPのN−末端アミノ酸配列とは異なる。
本発明の均質なヒトrGFBP (hBD−IGFBP)は、第1図に示すN−
末端アミノ酸配列と同一または実質的に同一のN−末端アミノ酸配列によって特
徴付けられる。本発明の目的で、第1図に示すN−末端アミノ酸配列と実質的に
同一のN−末端アミノ酸配列は、保存的アミノ酸置換もしくは他のアミノ酸置換
、IGF−IもしくはIGF−IIへの実質的に同一のタンパクの結合に具体的
に影響を及ぼさないか、または以下に記載の用途においてその機能を具体的に変
化させない挿入もしくは欠失の存在を除いて、第1図のN−末端アミノ酸配列と
同一のアミノ酸配列を意味すると理解される。
組換え経路によってhBD−IGFBPを産生するために、本発明のhBD−I
GFBPをコードする遺伝子は、好適な発現ベクターにおける挿入によってクロ
ーン化および発現され、次いで、これを使用して組換えhBD−IGFBPポリ
ペプチドの発現に適している宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトする。
精製hBD−IGFBPのアミノ末端配列の少なくとも一部分、典型的には約1
4〜約25ヌクレオチドを示す1個以上の合成オリゴヌクレオチドプローブを使
用して、ヒト骨細胞cDNAライブラリーをスクリーニングする。標準的な方法
に従って、最長挿入を含有するポジティブクローンを配列決定する。推定された
アミノ酸配列を精製タンパクのN−末端アミノ酸配列と比較し、推定されたアミ
ノ酸配列に基づいて予想された分子量およびアミノ酸組成物を、精製hBD−I
GFBPについて認められたものと比較する。次いで、該クローンを使用して、
一般に、例えば、サムブルーフ(S ambrook)らのモレキュラー・クロ
ーニング。
ア・ラボラトリ−・マニュアル(Molecular Cloning、 A
LaboratoryManual)、1989 コールド・スプリング・ハー
バ−・プレス、ニューヨーク(本明細書中に引用記載される)に記載されている
ような、標準的な方法を使用することによって組換えhBD−IGFBPを生産
する。
別の態様において、本発明は、ポリペプチドおよびhBD−IGFBPの断片に
関する。ポリペプチドおよびhBD−IGFBPの断片は、組換え発現系から単
離されるか、あるいは、メリフィールド(Merrifield)のフェデレー
ション・プロシーディンゲス(Fed、Proc、)21 : 412 (19
62)、メリフィールド(Merrifield)のジャーナル・オブ・アメリ
カン・ケミカル・ソサイエティ(J、AtChetSoc、)85 : 214
9 (1963)、またはバラニイ・アンド・メリフィールド(Barany
and Merrifield)のザ・ペブタイディス(TheP eptid
es)、第2巻、第1〜284頁(1979)アカデミツク・プレス、ニューヨ
ーク(各々、本明細書中に引用記載する)の固相法によって、または自動ペプチ
ド合成器の使用によって合成されてもよい。「ポリペプチド」なる語は、少なく
とも約3個、典型的には6個以上、100〜200個までまたはそれ以上のアミ
ノ酸の配列を意味し、全タンパクを含む。例えば、ヒドロキシアパタイトおよび
/またはIGF−mを結合するhBD−IGFBPタンパクの部分は、種々の方
法によって、例えば、プロテアーゼまたは化学薬剤で精製hBD−IGFBPを
処理してそれを断片化し、次いで、断片が標識IGF−nまたはヒドロキシアパ
タイトに結合することができるかを決定することによって、同定される。次いで
、ポリペプチドを合成し、抗原として使用して、IGF−IIまたはヒドロキシ
アパタイト−hBD−IGFBP相互作用などを阻害する。本明細書で使用する
場合、hBD−IGFBPなる語は、前後関係が他のことを示さない限り、タン
パク、ポリペプチドおよびその断片を含むことを意味すると理解されるべきであ
る。
別の態様では、本発明は、ヒドロキシアパタイト/hBD−IGFBP/IGF
−If相互作用を調節し、次いで、治療学的および/または予防学的に、hBD
−IGFBPまたはIGF−ffのようなそのリガンドに直接または間接的に連
結させることができる障害を処置する手段を提供する。本発明の結合タンパクを
有することによって、IGF−n、ヒドロキシアパタイトまたは他のリガンドと
hBD−4GFBPとの相互作用を刺激または阻害するアゴニストまたはアンタ
ゴニストを同定する。アゴニストまたはアンタゴニストのいずれかで、hBD−
IGFBPまたはIGF−nに応答する細胞の代謝および反応性は制御され、し
たがって、問題の疾患を緩和させるか、または、ある場合には予防する手段を提
供する。
か(して、本発明は、リガンド/hBD−IGFBP相互作用によって媒介され
る事象のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法
を提供する。かかるスクリーニングアッセイは、リガンド/結合タンパク相互作
用の態様が目的とされる程度に依存して、種々のフォーマットを使用し得る。
例えば、かかるアッセイは、結合タンパクに結合し、それによって、IGF−I
Iまたはヒドロキシアパタイトとの相互作用を遮断または阻害する化合物を同定
するように設計され得る。他のアッセイは、hBD−rGFBPと置換できる化
合物を同定するように設計することができる。また、他のアッセイを使用して、
hBD−JGFBPに対するIGFの会合を阻害または促進し、それによって、
1GFに対する細胞応答を媒介する化合物を同定することができる。
別の態様において、本発明は、IGF−Iにまさる選択的親和性でI GF−n
を結合するタンパクを提供する。第2図は、リガンドとしてのhBD−IGFB
p[125iコIGF−Tlお、kU競合物とし−CO)IGF−1よび1GF
−11の競合的結合曲線を示す。IGFBPから結合[1!j I]I GF−
Hの50%を置換するためには、IGF−I約Long/m/およびIGF−n
1r+g/mlが必要であり、これによって、トレーサーを置換する際に、I
GF−IIがIGF−Iよりも10倍高く有効であることが判明した。[”’r
]IGF−rをトレーサーとして使用した場合でさえ、IGF−Ifは、まだ、
トレーサーを置換する際に、IGF−1よりも(4倍)有効であった。これらの
結果から、IGFBPはIGF−1よりも大きい親和性でIGF−nを結合する
ことが分かる。典型的には、I 0F−IIに対するhBD−IGFBPの結合
親和性は、約10−9Mから約10−1!Mまで、またはそれ以上の範囲であり
、おそらく、少な(とも約1O−I11〜10−11Mの範囲であるが、一方、
IGF−rに対するhBD−IGFBPの結合親和性は、約10倍低い、すなわ
ち、約10−IMから約10−10Mの範囲である。IGF−IにまさるIGF
−IIに対するhBD−IGFBPの選択的親和性によって、ヒトの骨において
IGF−■がIGF−1よりも10〜15倍豊富である理由を説明することがで
きた。
本発明は、少なくとも約10″9Mから約10−11Mまで、またはそれ以上で
ある、ヒドロキシアパタイトに対するhBD−IGFBPの強い結合親和性を利
用するhBD−IGFBPの治療的および医薬的組成物を提供する。本発明のh
BD−IGFBPは、強い変性剤、例えば、4MグアニジンHCIの存在下でさ
え、ヒドロキシアパタイトに結合するが、一方、精製IGF−IIは、ヒドロキ
シアパタイトに結合しない。かくして、hBD−IGFBPは、骨の中で、また
は骨に対して、IGF−IIを固着するか、または標的とする手段または媒体(
vehicle)を提供する。IGF−nは、当業者に容易に明らかである結合
手段を介してhED−IGFBPに化学的に結合することができるが、いずれの
タンパクの望ましい活性も実質的に減少させるべきではない。
IGFまたは以下に記載する他の分子のような、骨組織または細胞を標的とする
ことができる別の分子へのhBD−IGFBPの結合は、架橋剤の使用によるよ
うな、よ(知られている研究室的方法を使用して、化学結合によって製造するこ
とができる。化学的に結合されるという語は、タンパク分子が、典型的にはお互
いに、典型的には共有結合によって、結合することを意味する。好ましい結合方
法は、hBDiGFBP/IGF−■分子間の少なくとも1個の共有結合の形成
である。該結合は、直接的であってもよく、この結合としては、合成的結合基を
含む結合が挙げられるか、あるいは、間接的であってもよく、これは、例えば、
血漿アルブミンの如きタンパクもしくはペプチド、または他のスペーサー分子の
ような介在部分を有する結合を意味する。例えば、該結合は、例えば、カルボン
イミド、グルタルアルデヒド、3−(2−ビリジジチオ)プロピオン酸N−スク
シンイミジル(SPDP)および誘導体、ビス−マレイミド、4−(N−マレイ
ミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート(SMCC)のような異種
二官能価または同種二官能価架橋剤、天然タンパクの酸化もしくは還元または酵
素による処理などを介する炭水化物、ジスルフィド、カルボキシルまたはアミノ
基のような、個々の分子との反応性基による外因性架橋剤なしの架橋によるもの
であってもよい。タンパク分子を化学的に架橋させる方法は、当該技術分野で一
般に知られており、米国特許第4.355.023号、第4.657.853号
、第4.676.980号、第4.925.921号および第4.970.15
6号、ならびにイムノテクノロジー・カタログ・アンド・ハンドブック(I m
mun。
Technology Catalogue and Handbook)、ピ
アス・ケミカル・カンパニー(Pierce CheIlical Co、)
(1989) (各々、本明細書中に引用記載する)には、多くの異種および同
種二官lFl:価薬剤が開示されている。一般に、かかる架橋は、IGF−ff
またはhED−IGFBPの所望の機能に実質的に影響を及ぼすべきではない。
IGF−IIおよびhBD−IGFBPのハイブリッド、キメラもしくは融合タ
ンパク分子またはその部分は、例えば、本明細書中に引用記載する米国特許第4
゜859.609号およびサムブルーフら(前出)の記載に従って、組換えDN
A技術によって調製することができる。
骨におけるIGF−II/hBD−IGFBP複合体の付着によって、骨吸収お
よびヒドロキシアパタイトの溶解の間、該複合体が放出され、吸収部位付近の骨
芽細胞の増殖を刺激することによって新しい骨形成が開始される。かくして、工
GF−IIおよびヒドロキシアパタイトの両方に対するhBD−IGFBPの高
い親和性に基づいて、本発明は、とりわけ、骨に対して特異的にIGF−IIお
よび/またはIGF−Iを指向させるのに有用な治療薬および組成物を提供する
。
新規hBD−IGFBPShBD−IGFBP/TGF−Ifおよび他のコンジ
ュゲート、hBD−IGFBPに対する抗体およびそのアンタゴニスト、並びに
それらから調製される医薬組成物は、特に、種々のhBD−IGFBPおよびI
GF−II関連疾患の治療のための投与に有用である。好ましくは、該医薬組成
物は、例えば、皮下、筋肉内もしくは静脈内のように非経口的に、または局所的
に、経口的に、エアロゾル、鼻腔内デリバリ−などを介して投与することができ
る。かくして、本発明は、許容される担体、好ましくは水性担体に溶解した。h
BD−IGFBP、hBD−4GFBP/IGF−Uおよび他のコンジュゲート
、hBD−IGFBPに対する抗体およびそのアンタゴニストの溶液、あるいは
、hBD−IGFBPおよびIGF−IIのカクテルからなる非経口投与用組成
物を提供する。例えば、水、緩衝化水、0.4%食塩水、0.3%グリシンなど
のような種々の水性担体を使用することができる。これらの組成物は、慣用の、
よく知られている滅菌技術によって滅菌され得る。該組成物は、例えば、酢酸ナ
トリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムな
どの如き、pH調節および緩衝化剤、毒性調節剤などのような、生理的条件に近
づけるのに必要とされるような、医薬的に許容される補助剤を含有してもよい。
これらの製剤中の所ヱのhBD−IGFBP、hBD−IGFBP/IGF−n
、またはhBD−IGFBPに対する抗体もしくは他のそのアンタゴニストの濃
度は、広範囲に、例えば、約0.00001%未満から、一般に、約1001%
もしくは少なくとも約0.001%から、約0.05〜0.1重量%まで、変化
することができ、主として、選択された個々の投与形態、処置される症状、例え
ば、骨折修復、骨粗髭症、手術または外傷性創傷修復、骨肉腫または乳癌のよう
な腫瘍など、および処理される被検者、すなわち、成人、子供または新生児に従
って、液体体積、粘度などによって選択される。
かくして、中等度の骨変性病に罹患している成人を処置するための、典型的な静
脈内輸液用医薬組成物は、無菌リンゲル溶液250 d、およびhBD−IGF
BFまたはhBD−IGFBP/IGF−I+約50冨g〜5gを含有するよう
に調製される。実際の、非経口的または経口的に投与可能な化合物の製造方法は
、当業者に知られているか、または明白であり、例えば、レミントンズ・ファー
マシューティカル・サイエンス(Retiington’s Pharmace
utical 5cience)、第16版、マッシ・パブリッシング・カンパ
ニー(Mack Publishing Company)、ペンシルベニア州
イーストン(1982)(本明細書中に引用記載する)にさらに詳細に記載され
ている。
本発明のhBD−4GFBPもしくはhBD−IGFBP/ICF−IIを含有
する組成物またはそのカクテルは、予防的および/または治療的処置のために投
与することができる。治療的用途では、既にhBD=IGFBPまたはIGF−
■関連疾患に罹患している患者に、該疾患およびその合併症を治療するか、また
は少なくとも部分的に停止させるのに充分な量の組成物を投与する。これを行う
のに充分な量は、「有効治療量」として定義される。この使用のための冑効量は
、疾患、すなわち、骨粗財症、骨折、創傷、腫瘍などにおける骨の変性、および
その重篤度、患者の年齢、ならびに患者の全身の健康状態に左右される。一般に
、該投与量は、1時間の輸液につき体重1kg当たりhBD−IGFBPまたは
hBD〜IGFBP/TGF−IIII、0〜約500μ9の範囲であり、1時
間の輸液につきl&g当たりhBD−IGFBPまたはhBD−■GFBP/■
GF−■10〜50μすの投与量で使用されるのがより一般的である。本発明の
物質を重篤な疾患状態で使用する場合、外来物質の最小化および外来物質応答の
不在を考慮して、これらの医薬組成物を実質的に過剰に投与することは可能であ
り、該投与は処置医によって望ましいと思われることもある。
予防的用途では、本発明のhBD−IGFBPまたはhBD−IGFBP/IG
F−ffを含有する組成物またはそのカクテルを、まだ疾患状態ではない、@者
に投与して、該疾患に対する患者の抵抗力を増大させる。かかる投与量は、「有
効予防量」と定義される。この使用では、正確な投与量は、患者の健康状態など
に左右されるが、一般に、1時間の輸液につき1kg当たり1〜500μ9の範
囲であり、特に、1時間につき1&g当たり10〜50μ9である。好ましい予
防的使用は、重篤な骨変性病の危険状態の患者の処置のためである。
当該組成物の単回または複数回投与は、処置医によって選択された投与量および
投与形態で行うことができる。いずれにしても、当該医薬製剤は、例えば、患者
を処1するのに充分な量のhBD−IGFBPまたはhBD−IGFBP/IG
F−Uを提供すべきである。
別の態様では、本発明は、IGF−Tlに応答する骨細胞増殖を刺激するのに有
効な薬物を提供する。無血清条件における骨細胞へのIGF−ffの外因性添加
はそれらの増殖を増加させる。このIGF−Hの増殖効果は、IGF−Irと共
働してhBD−IGFBPの添加によって増強される。このhBD−IGFBP
およびIGF−nの組合せの相乗作用、すなわち、いずれかの薬物で得られた結
果を個々に合わせことによって達成される付加効果よりも大きい相乗作用は、い
ずれのタイプの細胞における他のIGFBPについても報告されていない。かく
して、本発明は、骨形成が悪化する骨障害(例えば、骨粗髭症)の処置用治療薬
を提供する。当該医薬組成物は、hBD−IGFBP、および、所望により、I
GF。
ならびに生理学的に許容される担体および/または賦形剤からなる。
本発明は、hBD−4GFBPがプロテアーゼからIGFを保護することによっ
てIGFの半減期を増加させ、骨に対して特異的にIGFを指向させ、および/
または、IGFの増殖作用を増強させるので、全身性創傷治癒および皮膚修復に
おいて使用して、IGFの効力および半減期を増加させることができる薬物を提
供する。
種々の方法で、例えば、投与前に一晩、中性pHで精製hBD−IGFBPおよ
びIGFの濃縮物をインキュベートすることによつて、hBD−IGFBP十
IGFの複合体を調製することができる。組成物中のhBD−IGFBPおよび
IGFの濃度は、広範囲に変化することができるが、はぼ等モルであるのが好ま
しい。他の製剤は、本明細書の内容から当業者に明らかであろう。別々に製剤化
した場合、hBD−IGFBPの組成物とIGF−II組成物とは、別々に、ま
たは、同時に投与することができる。別々に投与する場合、典型的には、まず、
hBD−IGFBPを投与し、次いで、IGF−IIを投与する。かかる組成物
は、局所骨形成(例えば、骨折修復)を刺激するために特定の領域で投与するか
、または骨粗鬆症のような骨障害の処置におけるように、全身性骨形成を増加さ
せるために全身的に投与することができる。
別の具体例では、本発明は、より有効なIGF分子の製造方法を提供する。IG
FおよびhBD−IGFBPの構造機能分析は、hBD−IGFBPへの結合に
関係するrGFの領域を同定することができる。アミノ酸置換基、挿入または欠
失によって修飾されたIGF分子を製造することができ、その結果、修飾された
分子は、高い親和性でIGF受容体およびhBD−IGFBPに結合するが、I
GFBP−4およびIGFBP−3のような抑制性IGFBPには結合しない。
かかる修飾IGF分子を、全身性創傷治癒および皮膚修復の促進において有効な
同化剤として供することができる。別の具体例では、hBD−IGFBPの断片
結合する能力のような所望の機能を持つが、一方、この機能について不可欠では
ない分子の別の部分を消去する。断片は、個々に使用されるか、または、−緒に
合わせてもよい。
IGFに加えて、本発明のhBD−IGFBPは、骨に対して、関心のある他の
分子を指向させるのに有用である。該分子は、直接的または間接的に、骨の形成
または吸収に影響を及ぼす。当業者に明らかであるように、この方法で、種々の
因子を骨組織に対して指向させることができる。代表的な例としては、例えば、
骨形態発生タンパク(BMP)のような骨形成を刺激するもの、TGF、、線維
芽細胞成長因子(FGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、グルココルチコ
イドまたは1.25−ジヒドロキシビタミンD3のような、ある種の癌において
望ましい場合に骨形成を低下させる因子、マクロファージコロニー刺激因子(M
−CSF)およびインターロイキンのような骨吸収を増大させる化合物、ならび
にビスホスホネートおよびカルシトニンのような骨吸収を低下させる化合物が挙
げられる。該化合物は、前記の結合手段、ならびに、所望により、融合およびキ
メラタンパクを含む、様々な方法で、本発明のhBD−IGFBPと一緒にする
ことができる。典型的には、成長因子のような前記の標的化合物は、骨組織約1
0pg/mA〜約50nq/xiの範囲の濃度で骨組織の表面に送達される。
別の態様では、本発明は、代謝性骨疾患または骨折形成を持つ患者から採取した
臨床的試料における骨形成を評価するための診断マーカーを提供する。hBD、
IGFBPがIGF−II作用の重要な修飾物質であり、IGF−IIが重要な
ヒトの骨成長因子であるという発見に基づいて、hBD−IGFBPのレベルは
、骨代謝の障害をモニターするのに使用することができる。ここで、異常レベル
のhBD−IGFBPは、障害の存在を示す。かくして、本発明は、治療薬によ
る骨障害の処置の間、骨形成をモニターするための臨床診断用骨形成マーカーに
関する試薬を提供することでもある。hBD−IGFBPまたはその抗体の組成
物は、ヒトの血漿、血清または尿のような生体液中におけるhBD−IGFBP
の検出および定量に使用することができる。
当業者によって認識されるように、多くのタイプのイムノアッセイが、本発明に
ける使用のために利用可能である。例えば、直接的および間接的結合アッセイ、
競合アッセイ、サンドイッチアッセイなどは、一般に、例えば、米国特許第4゜
642.285号、第4.376.110号、第4.016.043号、第3.
879゜262号、第3.852.157号、第3,850,752号、第3.
839,153号、第3.791.932号、バーロウ・アンド・レイン(Ha
rlot and Lane)、アンチボディズ・ア・ラボラトリ−・マニュア
ル(Antibodies、 ALaboratory Manual)、コー
ルド・スプリング・ハーバ−・パブリケイションズ(Cold Spring
Harbor Publications)、ニューヨーク州(1988)に記
載されている(各々本明細書中に引用記載する)。1つのアッセイフォーマット
では、hBD−rGFBPへの抗体の結合を測定し、次いで、抗体を、例えば、
標識抗1gG、IgMおよび/またはIgAヒト抗体によって検出することによ
って、hBD−IGFBPを直接的に定量化する。別のフォーマットでは、結合
について標識または非標識bBD−IGFBPと競合させることによって、患者
のhBD−rGFBPを測定することができる。例えば、放射性核種、粒子(例
えば、金、鉄、磁性粒子、赤血球)、フルオー(fluors)、酵素、酵素基
質、酵素補因子、酵素阻害剤、リガンド(特に、ハブテン)、化学発光体などの
種々の標識を使用することができるが、好ましくは、放射性核種である。
かくして、かかるアッセイにおいて有用なhBD−IGFBPまたはその抗体は
、ELI SA微量滴定ウェル、マイクロビーズ、濾過膜のような不溶性または
固体支持体、不溶性または沈殿可能な可溶性ポリマーなどに付着させて親和性樹
脂として機能することができる。hBD−IGFBPに対する抗血清またはモノ
クローナル抗体は、典型的には、ウサギ、ヤギ、マウスなどのような非ヒト起源
である。hBD−IGFBPの検出に有用なキットも提供することができる。こ
こで、hBD−JGFBPおよび/またはその抗体は、一般に、単独で、または
、さらなる試薬、標識、および/または抗抗体などと一緒に、容器中で、凍結乾
燥形態で提供される。hBD−IGFBPポリペプチドおよび抗体は、標識に結
合されていても、または結合されていなくてもよく、トリス(Trfs)、リン
酸塩、炭酸塩などの緩衝剤、安定剤、殺菌剤、不活性タンパク、例えば、血清、
アルブミンなどと一緒にキットに含まれる。しばしば、有効成分を希釈するため
に不活性増量剤または賦形剤を含むのが望ましい。ここで、賦形剤は、全組成物
の約1〜99%存在していてもよい。
本発明のhBD−IGFBFポリペプチドを結合する、診断用または治療用抗体
は、様々な手段によって生産することができる。非ヒト、例えばマウスのモノク
ローナル抗体の生産は、よく知られており、例えば、組換え体または合成hBD
−IGFBP分子またはその選択された部分(例えば、ペプチド)で該動物を免
疫化することによって行われる。例えば、所望により、選択されたスクリーニン
グによって、主にIGFによる認識の原因となるようなhBD−IGFBP分子
の領域を同定することができる。免疫化動物から得られた抗体生産細胞を固定化
し、スクリーニングするか、あるいは、まず、例えばhBD−IGFBPを結合
する抗体の生産についてスクリーニングし、次いで、固定化する。
以下の実施例は、説明のために提供するものであって、限定するものではない。
実施例1
hBD−IGFBPの精製のためのヒト骨抽出物の調製全股関節部置換手術の間
に得られたヒトの大腿頭を、使用するまで一20℃で冷凍貯蔵した。帯ノコギリ
を使用して骨を切断し、hBD−IGFBP抽出のためにウイリイ・ミル(Wi
ley m1ll)中で微粒子に粉砕した。モハン(Mohan)ら[ビオンミ
力・エト・ビオフィジ力・アクタ(B iochem、 B 1ophys、
A eta)、884 : 234〜242 (1986)コの記載に従って、
最初に水および4MグアニジンHCIで抽出した後、4MグアニジンHCA’お
よびプロテアーゼ阻害剤の存在下、10%エチレンジアミン四酢酸塩(EDTA
)による大腿頭骨粉末の脱塩によって骨タンパクを抽出した(グアニジンEDT
A抽出物)。次いで、該グアニジンEDTA抽出物を、YM5 (5キロダルト
ン分子量遮断器)膜を使用してアミコン(Amicon)中で濃縮し、hBD−
IGFBPの精製のために使用した。
実施例2
ヒトの骨細出物由来のhBD−IGFBPの精製および特徴付はモハン(Moh
an)ら(同書)の記載に従って、4MグアニジンdcI中で、ヒトの骨細出物
をヒドロキシアパタイト(HA)クロマトグラフィーに付した。臭化シアノーゲ
ン活性化セファロース4Bビーズに、ヒトの骨から精製したIGF−4250μ
すを結合させることによって、I GF−I[アフィニテイカラムを構築した。
YM5膜を使用して、アミコンセル中でHA結合フラクシ珊ンのプールを約30
0m1に濃縮し、20倍量の、プロテアーゼ阻害剤(100曹Mεアミノカプロ
ン酸、5mMベンズアミジン、])M塩化フェニルメチルスルホニル)を含有す
るリン酸カリウム緩衝液(10ffiMリン酸カリウム、pH6,0)に対して
透析した。IGF−nアフィニティカラムをリン酸カリウム緩衝液で平衡化し、
その後、ヒトの骨抽出物の透析HA結結合シラクシコンブールアリコツト5Qz
l(全タンパク約3〜4Kg/■l)をカラムに付加した。次いで、該カラムを
リン酸カリウムで広範囲に洗浄して、未結合タンパクを完全に除去した。結合タ
ンパクを301Mトリス−酢酸塩(pH7,2)/4MグアニジンーH(J20
〜25冨lで溶離した。YM5膜を使用してアミコンセル中で親和性結合フラク
ションを濃縮し、次いで、20mMトリス−HCl緩衝液(pH8,0)に対し
て透析した。該透析した親和性結合フラクションを、予めトリス−HCl緩衝液
で平衡化させた7フルマシ7 (Pharmacia) F P L CMon
o Q陰イオン交換カラムに付加した。
20IIMトリスーH(J緩衝液中O〜IMNaC/の直線勾配液で結合タンパ
クを100分間のうちに溶離した。
hBD−IGFBP活性は、ポリエチレングリコール沈殿法によって測定した。
すなわち、室温で60分間、O,LM HEPESlo、1%ウシ血清アルブミ
ン10.1%トリトン(Triton)Xl 00/44mM Na2COs1
0.02%NaH3CpH6,0)25Oal中、”SImWilGF−r*t
は1GF−Tl 25.000〜50.000cpmと一緒に、アッセイされる
べき試料50μlをインキュベートした。この混合物に2%免疫血清グロブリン
100μlおよび25%ポリエチレングリコール500μlを添加し、次いで、
遠心した。これらの条件下、ポリエチレングリコールは、ICF−IまたはIG
F−IIおよびhBD−IGFBP間の大きい複合体を沈殿するが、未結合IG
F−1またはIGF−IIは沈殿しなかった。次いで、PEG沈殿物中の”5I
−IGF−nの量を計数した。過剰の非標識IGF−IまたはIGF−]1の存
在下で該アッセイを行うことによって、非特異的結合を測定し、前記で得られた
値から、沈殿した”I−IGF−Iまたは宜”I−IGF−Hの量を差し引いた
。
hBD−1GFBPの見かけの分子量を測定するために、トレーサーとして1!
3I−IGF−nを使用して、リガンドブロフト分析を行った。この方法では、
プレキャスト3〜2フ
下、試料50μlを電気泳動に付した。エレクトロブロッティングによるニトロ
セルロースに対する試料の移動の後、該ニトロセルロース膜を放射性標識IGF
−■と一緒にインキュベートした。未結合放射性標識IGF−IIを洗浄した後
1、ホーセンループ( Ho5senloop)らEアナリティカル・バイオケ
ミストリー(Anal. B iochem. )、154 :138−143
(1986)]の記載に従って、該膜をオートラジオグラフィに付した。
アプライド・バイオシステムズ・モデル(Appl.ied Biosyste
ss model) 4 20分析器で試料のアミノ酸組成物を分析し、アプラ
イド・バイオシステムズ・モデル(Applied Biosystess m
odel) 4 7 0 A気相タンパクシークエンサーでN−末端配列を決定
した[モハン(Mohan)ら、ビオシミ力・エト・ビオフィジ力・アクタ(
B iochim. B 1ophys. A eta)、966 : 44−
55 (1988)]。
第3図は、Mono Qクロマトグラフィ一工程における親和性結合フラクショ
ンブールのタンパクプロフィールおよびIGFBP活性プロフィールを示す。真
のIGFBP−4が溶出する領域(フラクション9〜15、O.LM NaCj
りにはタンパク吸光度ピークもIGFBP活性ピークもなく、かくして、これに
よりて、骨由来IGFBPがIGFBP−4でないことが示唆された。しかしな
がら、種々のNaC1濃度で溶出する4つのタンパク吸光度ピークがあった。こ
の4つのタンパクピークのうち、最初の2つのピーク(AおよびB)は、有意な
rGFBP活性を含有するが、一方、最後の2つのタンパクピーク(CおよびD
)は、IGFBP活性をあまり有しなかった。
ヒトの前抽出物中に存在するIGFBPの見かけの分子量を測定するために、リ
ガンドブロッティングおよび[”I]IGF−n親和性標識を使用した。第4図
は、HΔ結合、rGF−4結合およびMono Qタンパクビークをドデシル硫
酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、ニトロセルロースに対
して移動させ、次いで、[”SI]IGF−11 トレーサーでプローブしたり
ガンドブロットを示す。HA結合およびIGF−II結合フラクション中に存在
する主たるIGFBPは、見かけの分子量29kDaを有した。さらに、これら
のフラクションは、68および43kDa分子量マーカー間で幅広く、強度の低
いバンドも示した。Mono Qクロマトグラフィーによって、主たる29kD
a IGFBPを、より高分子量のIGFBPから分離した。Mono Qピー
クAは、29kDaで主バンドおよび24kDaで副バンドを示した。Mono
QピークBは、68および43kDaマ一カー間で広く拡散したバンドおよび
29kDaで副バンドを示した。
Mono QピークC(王たるタンパク吸光度ピークを示す)およびDは、29
kDaに弱バンドを示しただけであった。これらのデータは、ヒトの前抽出物中
の生たるIGFBPが29kDa IGFBPであることを示唆している。
Mono Qピーク膜中の29kDa IGFBPのアミノ酸組成およびN−末
端アミノ酸配列は、共に、固有であると思われ、他の公知のIGFBPに対して
限定された配列類似性を持っている(第1表、第2表:第1図)。
第1表:hBD−IGFBPおよび公知のIGFBPのアミノ酸組成ピークA
IGFBP−1 1GFBP−2 1GFBP−3 1GFBP−4asx 8
.1 6.8 6.6 6.8 8.0g1x 5.9 13,2 13.9
10.2 12.2ser 9.3 9.0 3.5 10.2 5.9g1y
9.0 7.3 11.8 8.7 9.7his 5.1 2.6 3.8
2.7 4.6arg 6.3 4.3 6.9 7.2 8.0thr 6
.3 3.8 3.8 3.4 2.5ala 7.9 11.1 7.3 6
.8 6.8pro 5.8 7.7 9.3 8.7 8.9tyr 3.7
2.6 1.7 3.4 1.3val 6.6 3.8 5.5 5.3
3.8met 3.5 1.3 3.1 0.8 1.7cys 5。5 7.
7 6.6 6.8 8.4i1e 3.3 3.8 1.4 2.3 2.5
Ieu 6.8 7.3 9.0 7.2 8.0phe 2.9 1.7 1
.0 1.9 2.11ys 4.0 3.8 4、5 7.2 5.1trp
2.1 0.3 0.4 0.4直径10諺諺のイモピロン(immobil
on)腹違断器をメタノールに浸漬し、ミリボア(Milipore)濾過ユニ
ット中に!き、ゴムOーリングを用いて空間に保持した。イモピロン膜を水で洗
浄し、ピークAlx1を介して濾過することによって、ピークAにおけるBPを
膜中に固定した。アミノ酸組成研究のために腹の半分を使用した。
第2表+ Mono QビークAにおけるhBD−IGFBPのアミノ末端配列
残基 アミノ酸(p■01)
1) L=59.4
2) G=50.1
3) F=34.8
4)F=48.0
8) E=20.6
9) P=22.2
10) D=15.2
13) A=22.8
14) A=32.8
15) L=28.5
N−末端アミノ酸配列分析のためにh BD−I GF B P 50pmol
を使用した。
合わせた平均反復収率は、86.3%であった。X=未知。
したがって、29kDa IGFBPをヒトの骨由来IGFBP (hBD−I
GFBP)と称した。主たる配列(Leu−Gly−Phe−Phe−Vat−
X−Val −Glu −Pro−Asp−Asp−Lys−Ala−Ala−
Leu)に加えて、N−末端で1個または2個のアミノ酸を欠失しているMon
o QビークAにおけるさらなる配列の存在に関する証拠があった。精製29k
Da IGFBPの5℃で一夜の貯蔵によって、29kDaバンドが消失し、2
4kDaに主バンドおよびいくつかの低分子量の副バンドが出現するので、精製
hBD−IGFBPは、タンパク分解的切断に敏感であると思われる。24kD
aバンドのN−末端配列分析の後、得られた配列(Leu−Gly−Phe−X
−Val−X−X−Glu−Pro−X−X−Lys)は、29kDa IGF
BPの配列と類似していた。さらに、24kDa IGFBPの貯蔵によって、
リガンドブロフト分析による測定の結果、それが消失し、非常に小さいIGFB
P活性しか含有しないと思われるいくつかの低分子量タンパクバンドが出現した
。これらの結果と一致する、IGFBPに関連するプロテアーゼが、最近報告さ
れた。
Mono QビークBは、異なるアミノ酸組成を持つと思われ、骨細胞に対する
IGF−nの作用を増強しなかった。ビークBを配列決定する本発明者らの試み
が不成功であることが示された。生たるタンパクビーク(フラクション45、ビ
ークC)の最初の数サイクルの配列決定から、読み取り可能な配列を持たない多
数のアミノ酸が得られた。か(して、非常に小さいIGFBP活性しか含有しな
いMono QビークCおよびDは、29kDa IGFBPの分解生成物を表
す。
Mono Q精製hBD−IGFBPビークのN−末端配列から、主たる配列に
加えて(おそらく、このIGFBPを分解するIGFBPプロテアーゼの同時精
製によって)1個または2個のアミノ酸を欠失したさらなる配列が得られるので
、ならびに、システィン残基が誘導されないので、本発明のhBD−IGFBP
配列の7位のバリンおよび10位のアスパラギン酸は、システィンであってもよ
い(システィン残基はIGFBP系の種々のメンバーの間に保存された)。Mo
n。
Q精製ヒト骨由来IGFBPの5℃での貯蔵によって、5DS−PAGEによっ
て、29kDa IGFBPが消失し、より低分子量のIGFBPが出現した。
低分子量のIGFBPを配列決定したが、7位および10位にシグナルがなかっ
たので、これらの位置に、各々、バリンおよびアスパラギン酸は見られなかった
。
これらの発見によって、1つの具体例でhBD−IGFBPがL−G−F−F−
V−X−C−E−P−C−D−に−A−A−Lの配列を持つことが示唆される。
前記考察も考慮に入れるhBD−IGFBPについての別の配列は、L−G−5
−F−V−H−C−E−P−C−D−E−に−A−Lであり、この配列は、キエ
ファー(K 1efer)ら[バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リ
サーチ・コミュニケーションズ(Biochem、 Biophys、 Res
、 Coat) 176 : 219−225 (1991)、シマサキ(S
himasaki)ら、ジャーナル・オブ・ノ<イオロシカルーケミストリー(
J、Biol、Chea+、)266 :10646−10653 (1991
)、およびドo−7プ(Drop)、エンドクリノロジー(Endocrino
l、) 130 :1736−1737 (1992)]のBP−5配列と類似
している。該配列は、天然または導入した置換、付加または欠失に基づく可能な
変異を課せられており、この変異は、対立変異体であってもよく、あるいは、本
明細書で使用される個々の配列決定技術を介して生産されてもよい。本明細書に
記載の方法を使用して、タンパクを単離し、精製し、よく知られている種々の方
法によって配列を決定したことが認識されるであろう。さらに、N−末端配列は
、本発明のbBD−TGFBPをコードする遺伝子のクローニングのために変性
オリゴヌクレオチドプローブを構築させる。
実施例3
骨細胞増殖アッセイにおけるhBD−IGFBPの使用本明細書中に引用記載す
るモ/Xン(Mohan)ら[ビオシミ力・ニド・ビオフイジ力・アクタ(B
iochim、 B 1ophys、 Acta)、884:234−242
(1986)]に記載されている、無血清培地における骨細胞のIGF媒介増殖
についてのアッセイによって、トリクロロ酢酸沈殿可能細胞性物質中への[3H
]チミジンの組込みを測定する。このアッセイは、マウス骨芽細胞株MC3T3
−Elを使用して行われた。48ウ工ル培養皿中の無血清ダルベツコ修飾イーグ
ル培地において、ウェル当たり約10.000個の細胞を平板培養し、モ/\ン
(Mohan)ら(同書)に概略記載されているとおり、[’H]チミジンアッ
セイのために使用した。
このアッセイでは、トリクロロ酢酸不溶性巨大分子中への[3H]チミジンの組
込みによって測定したとおり、hBD−IGFBP自体は、あまり***誘発活性
を持っていなかった(下記第3表)。しかしながら、hBD−IGFBPを、最
大下濃度のIGF−nと一緒にマウス骨細胞の無血清培養物に添加すると、hB
D−IGFBPはIGF−Ifの増殖作用を増強した。IGFBP−3は、IG
F−Iの添加の数時間前に培養物に添加した場合だけ、IGF−7作用を増加さ
せることを示し[モハン(Mohan)ら、プロシーディングズ・オブ・ナショ
ナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・ニー・ニス・エイ(P roc、 N
atl、 Acad。
Sci、USA)、86 : 8338−8342 (1989)およびデ・メ
ロウ(De Mellow)ら、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・
リサーチ・コミュニケーションズ(B iochem、 B 1ophys、R
es、 Coan、 )、156 : 199−204 (1988)]、他の
IGFBPは、IGFおよびIGFBPを同時に添加したという条件下でIGF
の作用を増強することを示したとは思われない。これらのデータは、hBD−I
GFBPが単にIGFに対する受動性担体であるだけではなく、IGFの作用を
有効に調節していることを示唆している。hBD−IGFBPがIGF−m刺激
[”H]チミジン組込みを増強するメカニズムは知られていないが、可能な説明
によって、いくつかのメカニズムが提供されている(限定されない)。例えば、
hBD−IGFBPは、(おそらく、IGFBP−1の場合と同様にRGD配列
を介して)IGF−IIの、その受容体への接近の容易さのために、細胞膜に対
してrGF−IIを指向させる。あるいは、hBD−IGFBPは、そのIGF
−nへの結合のために、IGF−Itの、その受容体に対する親和性を増大させ
、および/または、プロテアーゼからIGF−IIを保護することによって、該
IGF−nの半減期を増加させる。
第3表
骨細胞増殖を誘発するIGF−nに対するhBD−IGFBPの増強効果BSA
対照 100+15 100+22 100+12hBD−IGFBP 128
±18 213±29 116±91GF−n 138±18 265±43
214±24hBD−IGFBP
+ ICF−fr” 195+32 672+74 320±4゜[’H]チミ
ジンの添加前にマウス骨芽細胞株、MC3T3−Elの無血清培養物を、エフェ
クターと一緒に18時間インキュベートした。IGF−IIおよびhBD−IG
FBPの最終濃度は、各々、3および100g/菖lであった。値は、6反復ウ
ェルの平均±SDである。ウシ血清アルブミン(BSA)処理対照培養物中の[
”H]チミ’) ンNm込すは、3+el:r実験テ、各々、1404+217
.237±53および730±91であった。
” hBD−IGFBPおよび1GF−II間の相互作用期間は、cssコンピ
ュータープログラムを使用して、実験、hBD−IGFBPおよびIGF−1間
の三元分析によって、非常に有意であった(P<0.00001)。
実施例4
骨細胞調整培地からのhBD−IGFBPの精製培養物中の骨細胞はhBD−I
GFBPを生産するので、hBD−IGFBPの精製のために、骨細胞培養物か
ら回収した無血清調整培地を使用することもできる。すなわち、骨細胞調整培地
を、YM5 (5キロダルトン分子量遮断)を使用してアミコン中で濃縮し、酢
酸で酸性化し、最終濃度IMにし、セファデックス(S ephadex) G
−100ゲル濾過に付してIGFBPからIGFを分離する。
タンパクを1M酢酸で溶離する。IGFBPを含有するフラクションをプールし
、凍結乾燥し、リン酸塩緩衝化生理食塩水で再構成し、I C;F=Irアフィ
ニティヵラムに付す。次いで、親和性結合タンパクをFPLCMono Q陰イ
オン交換クロマトグラフィーに付してhBD−IGFBPを他のIGFBPから
分離する。
実施例5
hBD−IGFBPについての定量的診断アッセイヒト骨から精製したか、また
は組換え手段によって発現したhBD−IGFBPをポリクローナルおよび/ま
たはモノクローナル抗体生産に使用し、次いで、この抗体をhBD−IGFBP
についての定量的アッセイに使用する。すなわち、hBD−IGFBPをフロイ
ント完全アジュバントと混合し、抗体生産についての確立されたプロトコールに
従うて、ウサギ、モルモット、ラットまたはマウスに注射した。次いで、動物に
、フロイント不完全アジュバントと混合したhBD−IGFBPを3〜4週間ご
とに注射した。ポリクローナル抗血清について、3〜4回注射した後、動物から
採血し、ラジオイムノアッセイまたは他の手段を使用して、hBD−IGFBP
に対する抗体力価を測定した。よく知られている技術を使用して、免疫化動物か
ら得られた抗体生産細胞を永存させることによってモノクローナル抗体を生産す
る。精製したhBD−IGFBPを放射性標識し、シグナル生産トレーサーとし
て使用する。次いで、血清、尿および他の生体液中のhBD−IGFBPレベル
の測定のためのhBD−IGFBPラジオイムノアッセイの展開のために、高い
力価を有するモノクローナル抗体または抗血清を使用する。
一般に、hBD−IGFBPの生産は、骨細胞増殖を増大させる因子で骨細胞を
処理することによって増大させられる。かくして、hBD−IGFBPは、骨粗
髭症のような骨細胞増殖に関連する疾患状態に対する診断的マーカーとして使用
することができる。したがって、低血清hBD−IGFBPは、低い骨形成に関
連する骨粗髭症を示す。hBD−IGFBPは、IGF−II作用を増強するの
で、高血清hBD−IGFBPは、ある種の癌にも関連する。
実施例に
の実施例に記載のとおり、組換え体または精製hBD−rGFBPを使用して、
血清のような生物試料中のIGFのレベルを定量化することができる。非標識競
合相手の存在または不在下、精製hBD−4GFBP 2〜5ngを1251(
GF 40.0OOCI)lと一緒にインキュベートした。競合相手として、I
GF標準または未知量のrGFを含有する試料を使用した。室温で60分間イン
キュポートした後、ウメγグロブリンの存在下、ポリエチレングリコールの添加
によって、hBD(GFBP複合体を沈殿させた。1185Xgで30分間遠心
した後、ガンマ−カウンター中で上清のアリコツトを計数した。種々の濃度の非
標識IGFを用いて標準曲線を作成し、標準曲線を使用して未知の試料中のIG
Fの量を計算した。かくして、IGFに対して高い親和性を有する精製h BD
−I GFBPを利用するこのアッセイによって、生物学的に活性なa離IGF
の量を測定した。
実施PI7
hBD−rGFBPは骨の中でIGF−IIを固定化するヒト骨は、比較的多量
のIGF−IIを含有する。しかしながら、第4表に示すように、1251標識
IGF−II自体は、ヒドロキシアパタイト(当該表は、添加した合計数の10
%未満の非特異的結合だけを示す)またはコラーゲンに特異的に結合しない。I
GF−IIと対照的に、標識hBD=IGFBPはヒドロキシアパタイトへの特
異的結合を示した。生たる血清結合タンパク、すなわち、IGFBP−3が同様
の活性を持っていなかったので、および、hBDiGFBPが骨の他の生成分で
あるコラーゲンに結合しなかったので、ヒドロキシアパタイトへのhBD−IG
FBPの結合は、特異的であった。さらにまた、ヒドロキシアパタイトへのhB
D−IGFBPの結合は、hBD−IGFBP−ヒドロキシアパタイト複合体が
4MグアニジンHC1で解離することができなかったという点で強かった(4M
グアニジノHCIは、抗体−抗原複合体間の相互作用を解離することを示した)
。ヒドロキシアパタイトカラムへの添加前の、標識I GF−nのhBD−IG
FBPとの予備インキュベーションは、ヒドロキシアパタイトカラムへのrGF
−ff結合を有意に増大させた。このIGF−11のヒドロキシアパタイトへの
結合を促進させるhBD−IGFBPの活性は、IGFBP−3がかかる活性を
持っていなかったという点で特異的であった。これらの発見は、通常の条件下で
hBD−IGFBPによってIGF−IIが骨の中で固定化されるという結果と
一致する。
第4表: hBD−IGFBPはヒドロキシアパタイトへのIGF−IIの結合
を実施例8
in vitroでのヒト骨細胞におけるIGFBP−5生産の調節ヒト骨細胞
がil vitroでhBD−IGFBPを生産するかを測定するために、MG
63、TE85、TE89.5aOszおよびU2ヒト骨肉腫細胞ノ無血清培養
物から抽出した全RNAのノーザンプロットを、hBD−IGFBPのN−末端
配列に対するオリゴヌクレオチドプローブを使用して、およびヒトIGFBP−
5cDNAプローブを使用して、ハイブリダイズした(ドクター・シマサキ(D
r、 S hiIIasaki)、う・ジョーラ、カリフォルニア州)。これ
らの研究によって、試験された全ての細胞株がhBD−4GFBP mRNAを
発現したことが明らかになった。ウェスタンリガンドプロット分析によると、I
GF−IおよびIGF−IIは、U2細胞中でhBD−IGFBPの生産を数倍
増加させた。hBD−IGFBPの生物学的特徴によって、このタンパクが骨細
胞におけるIGF−IIの増殖作用を増強したことが明らかになった。
ヒトの骨芽細胞の増殖およびin vitroでプロゲステロンによって刺激さ
れたIGF−IIの生産が報告された。この実験において、IGF調節システム
における他の成分(IGF−I、IGFBPおよびIGF受容体)に対するプロ
ゲステロンの効果は、ヒト骨芽細胞様骨肉腫細胞株MG63において研究された
。全ての実験において、MG63細胞を、1%ウシ血清を含有するDMEM中、
細胞7500個/c、2の密度で平板培養した。−晩インキュベートした後、培
地を無血清に交換した後、プロゲステロンまたは賦形剤(エタノール)を添加し
た。経時研究では、細胞を、1100nプロゲステロンと一緒に0.5時間、2
時間、4時間および6時間インキュベートした。ノーザンプロット分析によって
、各対照と比較して、30分〜6時間、I GF−If、IGF−I、hBD−
IGFBPならびに1型および2型IGF受容体についてのmRNAレベルの増
加が示された。しかしながら、阻害因子IGFBP−4のmRNAレベルは、プ
ロゲステロン添加後、30分程度で減少した。IGFBP−3mRNAレベルの
明確な変化はなかった。か(して、ヒト骨細胞増殖を刺激することを示したステ
ロイドホルモンであるプロゲステロンは、ヒト骨細胞におけるIGFBP−5の
生産を増加させる。骨細胞増殖に対するプロゲステロンの刺激効果は、増大した
IGF生産によって媒介されただけではなく、IGF受容体発現の増加、hBD
−IGFBPの増加(rGF作用を増強する)、および阻害因子IGFBP−4
の減少した生産によっても媒介された。
LGFFVXVEPDDKAAL hBD−IGFBPAPWQCAPC5AE
KLA hlGFBP−IEVLFRCPPCTPERLA hlGFBP−2
AAPG XGQGVQAGCPG ヒト血清F/Gl
B/BOX 100
Fl(i 3A。
FIG、3θ
a b Cd ef
FIG 4
国際調査報告
フロントページの続き
(81)指定国 EP(AT、BE、CH,DE。
DK、ES、FR,GB、GR,IT、LU、MC,NL、SE)、0A(BF
、BJ、CF、CG、CI、CM、 GA、 GN、 ML、 MR,SN、
TD、 TG)、 AT、 AU、 BB、 BG、 BR,CA、 CH,C
3,DE。
DK、 ES、FI、 GB、 HU、JP、 KP、 KR,LK、 LU、
NIG、MN、MW、NL、No、PL、RO、RU、SD、 SE、 US
Claims (23)
- 1.精製および単離したヒト骨由来イスリン様成長因子結合タンパク、hBD− IGFBP。
- 2.ヒト骨または骨細胞調整培地から得られ、IGF−IIおよびヒドロキシア パタイトを結合する、約29kDal分子量の精製hBD−IGFBP。
- 3.骨細胞の増殖を刺激するIGF−IIの能力限増強する請求項2記載の精製 hBD−IGFBP。
- 4.IGF−Iに対してよりもIGF−IIに対して高い特異的結合親和性を有 する請求項2記載のhBD−IGFBP。
- 5.少なくとも10−9Mの結合親和性でヒドロキシアパタイトを結合する請求 項2記載のhBD−IGFBP。
- 6.骨形成に影響を及ぼす化合物に結合される請求項2記載の精製hBD−IG FBP。
- 7.約29kDalの実質的に純粋なhBD−IGFBPタンパクまたはその断 片および医薬的に許容される担体からなる医薬組成物。
- 8.さらに、IGF−IまたはIGF−IIからなる請求項7記載の医薬組成物 。
- 9.IGF−IまたはIGF−IIがhBD−IGFBPに結合される請求項8 記載の医薬組成物。
- 10.患者への局所投与のために製剤化される請求項7記載の医薬組成物。
- 11.患者への非径口投与のために製剤化される請求項7記載の医薬組成物。
- 12.IGFの影響を変調させるのに充分な量の実質的に純粋なhBD−IGF BPおよび医薬的に許容される担体からなる医薬組成物を患者に投与することか らなる、患者におけるIGFの影響の変調方法。
- 13.IGFがIGF−IIである請求項12記載の方法。
- 14.hBD−IGFBPがIGF−IIに結合される請求項13記載の方法。
- 15.患者が変性性骨障害に罹患しているか、または変性性骨障害に対して敏感 である請求項12記載の方法。
- 16.骨障害が骨粗鬆症である請求項15記載の方法。
- 17.創傷または骨折の修復を促進するのに充分な量の実質的に純粋なhBD− IGFBPおよび医薬的に許容される担体からなる医薬組成物を患者に投与する ことからなる、患者における創傷または骨折修復の促進方法。
- 18.送達されるべき化合物に結合した実質的に純粋なhBD−IGFBPまた はその断片および医薬的に許容される担体からなる医薬組成物を患者に投与する ことからなる、患者における骨組織への化合物の送達方法。
- 19.化合物が骨形成または吸収に影響を及ぼす請求項18記載の方法。
- 20.免疫的複合体形成に対して伝導的な条件下で、hBD−IGFBPに特異 的に結合する抗体と生物試料を接触させ、次いで、hBD−IGFBPおよび抗 体の間で免疫的複合体形成の存在を検出し、試料中のhBD−IGFBPの存在 および/または量を測定することからなる、生物試料におけるhBD−IGFB Pの存在の測定方法。
- 21.生物試料が血液、血漿、血清または尿である請求項20記載の方法。
- 22.検出工程が酵素反応、蛍光、発光、または放射能によるものである請求項 20記載の方法。
- 23.免疫的複合体形成に伝導的な条件下、生物試料を、精製した標識hBD− IGFBPおよびhBD−IGFBPに特異的に結合する抗体と接触させ、ここ で、該抗体は支持体に結合されており、次いで、標識hBD−IGFBPおよび 抗体間の免疫的複合体形成の存在を検出し、次いで、試料中のhBD−IGFB Pの存在および/または量を測定することからなる、生物試料におけるhBD− IGFBPの存在の測定方法。
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