JPH06500258A - 水溶液中の還元性又は酸化性物質を反応させる方法及びポテンシオメトリックセル - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 水を浄化する方法 本発明は、水溶液中で還元性又は酸化性物質を反応させる方法に関する。

環境汚染が増大するに伴い、真水の調達が益々重要になる。しばしば、水を飲料 水又は用水として使用するために不純物を除去するかもしくは水溶液中の不純物 の含量を決定することが必要である。

一方では、水溶液からの問題となる物質の除去は一連の種々の物理化学的方法に より達成することができる。例としては、ここでは濾過、交換クロマトグラフィ ー及び／又は逆浸透を挙げる。しかしながら、これらの方法では問題となる物質 は分解されず、これらは全系の分離された領域内で濃縮される。分離後に、これ らの物質はその後高い濃度で再び環境に放出される他方では、問題となる物質は また生物学的方法、即ち生きた細菌細胞内での酵素分解により除去することがで きる。しかしながら、この細胞内での分解は、また一連の困難と結び付いている 。例えば、生きた細菌細胞の固定化の際に問題が生じる、即ち細菌の代謝副生成 物が浄化された水を汚染する。更に、生きた系内で、誘導時間、及び基質並びに また生成物が克服すべき大きな拡散障壁（例えば固定化マトリックス及び細胞膜 ）に基づく長い反応時間が必要である。最後に、また細胞も問題となる物質によ って侵されかつ破壊される。

従って、本発明の課題は、従来技術水準の欠点が少なくとも部分的に排除された 、水を浄化する方法を提供することであった。

本発明による課題は、処理すべき水溶液を固定化オキシドレダクターゼと、場合 により共固定化（Ｃｏ−ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）電子伝達体の存在下に接触さ せ、かつ同時に還元又は酸化等量物質を供給することよりなる、水溶液中で還元 性又は酸化性物質を反応させる方法により解決される。

本発明で使用する用語“反応”は、水分析のための還元性又は酸化性物質の部分 的除去並びにまた水浄化のための完全な除去も包含する。この場合、物質の水分 析測定は完全な除去とは実質的に、試料から測定物質の検出のために十分な量だ けを反応させることにより区別される。

生きた細胞の代わりに固定化酵素を使用することにより、水浄化のために生きた 微生物を使用する際に生じる前記の全ての問題が解決される。更に、問題となる 物質は物理化学的浄化法のように系の部分領域内に富化されないだけでなく、直 接環境を汚染しない形に転換することができる。

本発明の方法により、酸化もしくは還元等量物質は固定化バイオ触媒（オキシド レダクターゼ群の酵素）及び場合により付加的に共固定化電子伝達体により問題 物質に伝達される。本発明による方法を水溶液中での還元性物質の反応のために 使用する場合には、電子は除去すべき物質に伝達されるが、本発明による方法を 水溶液中での酸化性物質の反応のために使用する場合には、それに対して除去す べき物質の電子が酸化剤に伝達される。第１図は、硝酸塩の亜硝酸塩への還元の 例で還元過程を図示するものである。この反応の第１の部分工程は、還元等量物 質（この場合には、電気分解で発生した原子水素）の電子伝達体への伝達である 。そこから、第２の部分工程で還元等量物質は酵素にトレードレダクターゼ）に 、次いでそこから最後に基質（硝酸塩）に伝達され、該基質はこのようにして亜 硝酸塩に還元される。これらの３つの部分工程は、互いに無関係に進行する。本 発明による方法によれば、これらの３つの反応が１つの全系に結合される（第２ 図参照）。

本発明による方法は、特に飲料水又は廃水から問題物質を除去するために及び飲 料水又は廃水の分析のために利用される。本発明による方法によれば、（ａ）無 機塩及び （ｂ）有機化合物 からなる群から選択される物質を反応させることができる。有機塩としては、例 えば硝酸塩、硫酸塩、シアン化物、硫化物（ないしはＨ，Ｓ）及び燐酸塩を除去 することができる。水溶液中で反応させることができる有機物質としては、特に 除草剤、殺菌剤、油、フェノール、溶剤、脂肪、洗浄剤（界面活性材、洗剤）が 挙げられる。このことは、脂肪族又は芳香族炭化水素（例えばジオキシン）、燐 有機化合物、アルコール、ケトン、フェノール又は類似の化合物を本発明による 方法により水溶液中で反応させることができることを意味する。特に有利である のは、アルコール、特にメタノールの除去及び／又は測定（酸化による）又はハ ロゲン化炭化水素の除去及び／又は測定（還元脱ハロゲン化による）である。

水溶液からの還元性及び参加性物質の完全な除去の他に、本発明による方法を用 いると、物質の分析測定が可能である。そのためには、例えば水流の一部だけを 固定化オキシドレダクターゼと、場合により共固定化電子伝達体の存在下に接触 させかつ同時に還元又は酸化等量物質を供給することができる。供給された還元 ないしは酸化等量物質の消費は、直接水流中の測定すべき物質の濃度に比例する 。次いで、この消費の確認、ひいては測定すべき物質の濃度の測定は、また自体 公知方法に基づき、例えば電位差又は電流滴定測定により行うことができる。

オキシドレダクターゼ及び場合により電子伝達体の固定化は、固体の保持体で行 う。適当な保持体は、当業者に周知である。例えば合成樹脂（ナイロン、ポリア クリルアミド、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン等）、ポリサツカリド （アガロース、デキストラン等）、珪酸塩（珪砂、シリカゲル、ガラス、セラミ ック等）並びに別の固体（珪素、黒鉛）、従ってしばしば酵素固定もしくは固定 化のために使用される材料が該等する。共固定化電子伝達体の存在が必要である 場合には、これらは有利には酵素、即ちオキシドレダクターゼと同じ保持体上に 存在し、かつオキシドレダクターゼと電子伝達体は直接的分子的隣接関係で固体 保持体に固定化されている。他面、電子伝達体はまた直接固定化酵素に、又は酵 素が直接固定化型伝達体に結合されていてもい。

保持体の三次元的顕微鏡的構造は、任意に選択することができる。該保持体は、 円筒状（棒、糸）、平面（シート）、球又はネット状であってよい。微細分され た形、即ち球直径０．５〜１２０μｍ１特に有利には１〜６０μｍを有する球状 及び多孔質である保持体を使用するのが有利である。

酵素及び電子伝達体は、マトリックスに直接的に、交差結合によるか又は化学結 合手（スペーサ）を介して、酵素又は保持体の前処理を行って又は行わずに、結 合させることができる。このような方法は、当業者に周知である。例えば、エポ キシ、シアンプロミド、ジイソシアネート、スルホニルクロリド、カルボジイミ ド又は２−フルオル−１−メチルピリジニウムトルエン−４−スルホネート（Ｅ ＭＰ）、グルタルアルデヒド、ＥＤＣ又は別の化合物に固定化が可能である。

保持体のシアンプロミドでの活性化は、例えばＫｏｈｎ及びｆｉｌｃｈｅｃｋ著 “ＢｉｏｃｈｅＩ！、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｗｍ、　１０７　（ １９８２）、　８７８−８８４）に記載されている。保持体の有機スルホニルク ロリドによる活性化は、同様に公知である（　Ｎ１５ｓｏｎ及びＭｏ５ｂａｃｈ 著“Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍ＋ｓ、　１０２　 （１９８１）、　４４９−４５７）　。保持体マトリックスのヒドロキシル基を トリエチルアミンの存在下にＴＭＰと反応させることによる活性化する方法は、 ＮｇＯ著　“Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ、４　（１９８６）、１３ ４−１３７に記載されている。この場合には、リガンド（本発明の場合には、オ キシドレダクターゼ又は電子伝達体）がアミノ基又はチオール基を介して活性化 されたマトリックスに結合される。更に、例えば１．１′−カルボニルジイミダ ゾールでのカルボニル化による保持体の活性化も公知である（Ｈｅａｒｎ、　Ｍ ｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１３５　（１９８７）、　１０２−１１３）。オ キシドレダクターゼ及び電子伝達体の固定化のために、（活性化した又は活性化 されていない）保持体マトリックスを直接オキシドレダクターゼ又は電子伝達体 と反応させるか、又はまず２官能性スペ一サ分子と反応させ、該分子に第２工程 でオキシドレダクターゼ又は電位伝達体を結合させることができる。有利に使用 される固定法は、ジイソシアネート法（Ｂｉｅｂｒｉｃｈｅｒ及びＬｕｃｅ、米 国特許第４１７７０３８号明細書）、グルタルジアルデヒド（Ｋｏｒｎ　ｅｔ　 ａｌ、　。

Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　６５　（１９７２）、　５２５−５２９）及びＥ ＤＣ法（ヤマダｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｓｉｓｔｒｙ　２０　（１９８１） 、　４８３６−４８４２）である。

問題物質を水溶液中で反応させるためには、本発明によれば固定化されたオキシ ドレダクターゼを使用する。物質を水溶液中で酸化により反応させる場合には、 オキシダーゼを使用し、−刀物質の還元反応のためにはレダクターゼを使用する 。オキシダーゼないしはレダクターゼは水中で反応すべき物質に対して酵素特異 性を有するべきである。例えば、メタノールの酸化のためにはアルコールオキシ ダーゼを使用する。多工程式酸化又は還元法では、複数の酵素を同時に又は連続 して使用することができる。例えば、硝酸塩の亜硝酸塩への還元のためにはニト レートレダクターゼ、亜硝酸塩のＮ、Ｏへの還元のためにはニドリットレダクタ ーゼ及びＮｅｏ　のＮ２への還元のためにはＮ、Ｏレダクターゼが必要である。

ハロゲン化された有機化合物の還元脱ハロゲン化のためには、１種以上のデハロ ゲナーゼを使用することができる。

ニトレートレダクターゼは、菌類：アスペルギルス（＾ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ） 又は高級植物（Ｃａｍｐｂｅｌｌ　ｉｎ：　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒａｎｄ　Ｇｅｎ ｅｔｉｃ　Ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｎ１ｔｒａｔｅ　Ａｓ５１ｍ１ｌａｔｉｏｎ 、　ｐ。

１２５−１５４．　ｔｒａｙ　ｕｎｄ　Ｋｉｎｇｈｏｒｎ、０ｘｆｏｒｄ　Ｕｎ ｉｖ、Ｐｒｅｓｓ　１９８９出版）、例えばトウモロコシ（Ｚｅａ　ｗａｙｓ） から得ることができる。ニドリット及びＮｅｏレダクターゼは、ロドシュードモ ナス　スフェロイデスｆ、　ｓｐ、デニトリフィカンス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄ ｏｍｏｎａｓ　５ｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ　ｆ、ｓｐ、　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａ ｎｓ）から得られる（　Ｍｉｃｈａｌｓｋｉ及びＮＩｃｋｏｌａｓ著、Ｂｉｏｃ ｈｉｉ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、＾ｃｔａ　８２８　（１９８５）、１３０−１３７； 　ｌ１ｉｃｈａｌｓｋｉ　ｅｔ　ａｉ、、　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ 、＾ｅｔａ　８７２　（１９８６）、　５Ｏ−６０）　から得られる。デヒドロ ゲナーゼは、例えば沈殿物中に存在する微生物（Ｓｕｆｌｉｔａ　ｅｔ　ａｌ。

、　５ｃｉｅｎｃｅ　２１８　（１９８２）、１１１５−１１１７）　、キサン トノ（クテル・オートトロフィクス（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ　ａｕｔｏｔｒ ｏｐｈｉｅｕｓ）　（Ｊａｎｓｓｅｎ　ｅｔ　ａｔ、、Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ 　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　１１ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　４９　（１９８ ５）、　６７３−６７７）　、メタン酸化性細菌（Ｌｉｔｔｌｅ　ｅｔ　ａｌ、 、　Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ ｏｇｙ　５４　（１９８８）、　９５１−９５６）又はアントロノくクテル種（ Ｓｃｈｏｌｔｚ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍ ｅｎｔａｌ　）ｌｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇＶ　５４　（１９８８）、　３０３４− ３０３８）から得ることができる。メタノールの酸化分解のためには、例えば酵 母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）由来のアルコールオキシダーゼ（ＥＣ１，１ ，３，１３）を使用することができる。反応の際に、ホルムアルデヒドが生成し 、該ホルムアルデヒドを次いで２つの別の工程でアルデヒド・ヒドロゲナーゼに よりギ酸塩に、次いでホルミエート・デヒドロゲナーゼでＣＯ２及び■１□０に 分解する。しかしながら、本発明の方法によれば、その都度所望の目的にために 好適である別のオキシドレダクターゼも使用することもできる。このためには、 当該の酵素を不溶性保持体に例えば化学架橋を介して共有結合させる。その都度 の結合及び保持体及び酵素に基づき、固定化された酵素は、遊離溶液中で出発活 性度の４０〜１００％を示す。

酸化の場合には、酸化すべきを物質から電子が取り出され、一方還元に際には電 子が還元すべき物質に伝達される。このためには一般に電子伝達体が必要である 。遊離酵素における生理学的系においては、電子伝達体はしばしばＮＡＤ＋であ り、これはＮＡＤＨに還元することができる。固定化された系においては、ＮＡ Ｄはこの課題を一般に満足しない。その代わりに、一連の別の合成電子伝達体を 利用することができる。

一般に、これは染料である。染料としては、例えば］ブロムフェノールブルー、 ビオロゲン群の代表的物質（ビピリジニウム染料）、メチレンブルー、フェナジ ン又はレザルジンが有利であることが立証されている。特に有利であるのは、ア ズルＡ１ブロムフェノールブルー、シバクロンブルー、ニュートラルレッド及び サフラニンＴである。調査のためには、選択した染料をマトリックスに結合させ た。この場合には、被覆密度は、はぼマトリックスのそれぞれの第２の結合位置 が染料分子により覆われるように選択した。中間に存在する結合位置に、その都 度使用したオキシドレダクターゼを結合させた。この際、固定化により全系の特 性は一部分変化したことが判明した。有利なオキシドレダクターゼのために電子 伝達体として作用することができるあらゆる染料は、この機能を固定化された酵 素にために満足することもできない。

また、本発明による方法のためにたオキシドレダクターゼと共固定化された電子 伝達体として無毒性の食品染料も適当であることが判明した。固定化した状態で 電子伝達体として作用することができる食品染料の例は、例えばクルクミン及び その誘導体、キノリン染料（例えばキノリンエロー）及びパテントブルー染料（ 例えばパテントブルーＶ）である。本発明による方法のための電子伝達体として 食品染料を使用する際に大きな利点は、その低い毒性に基づく。このことは水溶 液を有害物質から浄化し、引き続き飲料水として又は／及び飲料を製造するため に使用するような実施態様において特に重要である。若干の食品染料のもう１つ の利点は、その安い価格であり、例えばクルクミンはメチルビオロゲンよりも著 しく廉価である。

水溶液中での硝酸塩の還元反応の場合には、例えば以下の組み合わせが特に好適 であることが判明した：アズルＡ又はブロムフェノールブルーと一緒に固定化さ れたトウモロコシからなるニトレートレダクターゼ、ニュートラルレッド又はサ フラニンＴと共固定化した酵素混合物ニトレート及びＮ２０レダクターゼ。

更に、トウモロコシからのニトレートレダクターゼと、共固定化した食品染料、 クルクミン又はノ（テントブルーｖ１の組み合わせ、並びにニトレートレダクタ ーゼと、共固定化した食品染料、クルクミン、パテントブルーＶ又はキノリンエ ローとの組み合わせが特に好適であることが立証された。

しかしながら、別の系のためには、天然の電子伝達体、特に膜に由来する酵素錯 体に関与するような電子伝達体も有利である。天然の電子伝達体の例は、アスコ ルビン酸塩、鉄蛋白賀（フラボ蛋白質、フェリトキシン、ルビトキシン、サイト クロム）、フラビン（ＦＡＤ、ＦＭＮ）　、ピリジンヌクレオチド（ＮＤＡ、Ｎ ＡＤＰ）　、プテリン、プテリジン及びキノン（例えばウビキノン）である。

たオキシドレダクターゼとして、電子伝達性コツアクタを既に含有する蛋白質を 使用する場合には、電子伝達体の共固定化は不必要である。このような蛋白質の 例は、アルコールオキシダーゼであり、この場合にはフラボ蛋白質が該当する。

本発明による方法では還元及び酸化が問題であるので、還元又は酸化等量物質を 調達しなければならない。このことは原理的には、適当な物質を添加することに より行うことができる。例えば浄化すべき水溶液に還元剤としてジチオニット（ Ｓｗａｎ２−）又は水素を適当な触媒と一緒に（分子水素を原子水素に分解する ために）と−緒に使用することができる。酸化剤としては、例えばＨ２０□又は 水溶液中にすでに存在する酸素が適当である。しかしながら、この化学的レドッ クス反応は、使用される物質の毒性（Ｓ　ｔｏ　４”−、ＨｚＯｔ）に基づく問 題及びまたコストの理由からの問題が特に飲料水の浄化の場合に発生する。

従って、再生可能な還元又は酸化等量物質は電気化学的方法、特に水の電気分解 により発生させるのが有利である。水の電気分解的分解は、ヒドロキシトイオン （ＯＨ−）及びヒドロニウムイオン（Ｈ３０”）は発生する。正の電荷を持つヒ ドロニウムイオンは、陰極（マイナス電極）に向かって移動し、そこで電子を吸 収し、水と原子水素に分解する。この原子水素は不安定でありかつ急速に結合し て、Ｈ，ガスを発生する。

相応して、負の電荷を持つヒドロキシトイオンは陽極（プラス電極）に向かって 移動し、そこで電子を放出し、水と原子酸素に分解する。しかしながら、陰極に 隣接してオキシダーゼもしくはアクターゼ並びに場合により電子伝達体が存在す ると、その都度のオキシドレダクターゼに対して特異性基質の急速酸化又は還元 が行われる。例えば、固定化された染料は、極く寿命の短い原子水素によって陰 極で極めて急速に還元され、その際還元は電位差に比例する（７０ポルトまで） 。この場合、電子伝達の有効性は、陰極の表面の太きさに依存する。

緩衝されない系内では、電気化学的レドックス反応の場合には、プロトン及びヒ ドロキシトイオン濃度は１〜２分以内で既にまさに高い。このことは緩衝されて いない系の活性度を（ｐＨ値値化化基づき）強度に制限する、それというのも水 、特に飲料水を浄化する際には、該溶液にも緩衝塩は供給されないからである。

従って、本発明による方法は、有利には、固定化オキシドレダクターゼ並びに場 合により共固定化電子伝達体を含有する電位差計セル内で、適当な電圧で還元又 は酸化等量物質を発生させかつセルを連続的に浄化すべき溶液を貫流させること により実施する。この場合には、セル内での溶液の滞在時間は、０．２〜５セル 容積／分、特に０．５〜２セル容積／分に調整するのが好ましいことが立証され た。この際には、共固定化たオキシドレダクターゼ並びに場合により電子伝達体 はセル内に抑留され、一方過剰のイオンはセルから洗い出される。分離された陽 極及び陰極を有する系を使用するのが有利である。必要な電気分解結合は、例え ば粗いガラスフィルタを介して可能にすることができる。両者の電極の溶離液は 、反応後に再び一緒にすることができる。この場合には、全系の貫流後に再び中 性ｐＨ値が達成される。

しかしながら、浄化すべき水溶液に体する緩衝塩の添加が許容され得る適用分野 も存在する。この場合には、貫流セルはかならずしも必要でない。

水溶液中での物質の反応のために複数の還元又は酸化工程が必要である（例えば 硝酸塩の還元の際）場合には、極く一般的に、場合により種々の電子伝達体が共 固定化されていてもよい、複数の異なった酵素を使用する必要がある。従って、 例えば１つのセルは、それぞれ異なった保持体上に種々異なった酵素／電子伝達 体系を含有することができる。しかしながら、複数のセルを直列接続することも 可能であり、この場合には１つのセル内には例えば１つの酵素／電子伝達体系の みが存在する。最後に挙げた方法が有利である。

浄化すべきないしは分析すべき水溶液中の問題物質の濃度は、広い範囲を有する ことができる。即ち、この濃度に相応して、本発明による方法の条件も変動する ことができる。問題物質の濃度が低い場合には、相応して小さいセル装置（即ち 少ない酵素及び場合により電子伝達体量又は／及び少ない量のレドックス等量物 質）又は／及び貫流セルでは高い貫流速度が可能である。問題物質の濃度が高い 場合には、それに相応して大きなセル装置又は／及び低い貫流速度が必要である 。更に、高すぎる問題物質濃度は水で希釈することにより適当な温度に低下させ ることができる。本発明による方法を適用するための濃度範囲は０．０１〜ｍｍ 　ｏ　Ｉ　／　Ｉ　〜約１０ｍｍｏｌ／Ｉが有利であり、但しこの場合それ以上 、それ以下の値も排除するものでない。

電気分解セル内の電位差は、使用されるオキシレダクターゼに基づき決定しなけ ればならない。例えば、硝酸塩還元の場合には、４Ｖを越える電圧ではレダクタ ーゼは一定の時間帯内で不活性化されることが判明した。それに対して、アルコ ールオキシダーゼの存在下でのメタノールの酸化は１０ｖを越える電圧で実施す ることができる。

更に、本発明の対象は、電極体及び固定化オキシレダクターゼ並びに場合により 共固定化電子伝達体を含有する、水溶液中で還元性又は酸化性物質を反応させる ポテンシオメトリックセルである。この場合には、電極体の形は自体任意であっ てよい。該電極体は糸状又はリボンとして形成されていてもよい（螺旋状、線状 ）、また螺旋状に巻かれたフィルムであうよ（、更に穿孔を有する中実電極、積 み重ねられたフリットからなる装置又は製編されたネットであってもよい。本発 明の電極体の有利な実施態様は、第３〜８図から明らかである。

第３図及び第４図は、それぞれ線及びリボン状に形成された電極を示し、該電極 は螺旋状（第３図）又は直線状（第４図）で微粒子状保持体からなる酵素含有マ トリックスを貫通して延びている。第５図及び第６図は一体電極を示し、該電極 は酵素含有マトリックス内に埋め込まれており、この場合には電極は穿孔された ブロック（第５図）又は螺旋状に巻かれたフィルム（第６図）として形成されて いる。第７図及び第８図はマルチピース型電極を示し。該電極は上下に積み重ね られたフリット（第７図）又はネット（第８図）として形成されていてもよい。

本発明によるセル中のオキシドレダクターゼ及び場合により存在する電子伝達体 は、例えば直接、架橋により又はスペーサを介してエポキシ、シアンプロミド、 ジイソシアネート、カルポジミド、グルタルジアルデヒド、ＥＰＣ又はＦＰＭ化 合物を介して保持体に固定化されている。電極体として、半導体材料、例えばシ リコン又は黒鉛を使用する場合には、オキシドレダクターゼ及び場合により電子 伝達体は直接電極体の表面に固定化されていてもよい。

そのための選択的に、保持体として天然の材料又は合成物質からなるポリマーを 利用することができ、該ポリマーは複数の化学的に異なった結合位置を所定の間 隔で提供する（例えば２官能性）ので、酵素及び電子伝達体は交番に直接並列し て分子隣接関係で結合することができる。これらのポリマーは通電することが好 ましい。電極上にオキシドレダクターゼ及び場合により電子伝達体を直接固定す る場合には、還元又は酸化等量物質を直接電極体からオキシドレダクターゼ又は 場合により電子伝達体に伝達することができ、しかも水の電気分解は不必要であ る（即ち、該反応は１゜２８Ｖの水電位未満で行うことができる）。

さもなければ、固定化は、電極体の構成成分でない適当な保持体又は適当な保持 体の混合物に行う（上記参照）。

この場合、固体の保持体は、電極体を保持体中に埋め込むことができるので、微 細に細分した形で形成されているのが有利である（例えば第３〜８図参照）。

また、電極体として、孔又は穴内に、酵素及び場合により電子伝達体を固定化さ れた形で含有する微粒子状保持体が存在する一種の金属スポンジを使用すること ができる。このようなスポンジ状材料は、例えば有孔フィルム又は金網のパケッ トからなっていてもよ（、この場合には保持体粒子は金網又はフィルムの孔もし くは穴内に配置されることになる。

本発明によるセルは、貫流セルとして構成されているのが有利である。このため には、セルは例えば２つの向かい合った側面でガラスフリットにより制限されて いてもよい。その際には、該セルから形成された室を浄化すべき液体は調整可能 な速度で貫流するので、酵素の不活性化をもたらすことのあるｐＨ移動が回避さ れる。

更に、本発明は、飲料水又は廃水中の還元性又は酸化性物質を反応させるために 本発明によるポテンシオメトリックセルを使用することに関する。特に、本発明 によるセルは、硝酸塩、メタノール又はハロゲン化された炭化水素の反応、即ち 測定及び特に除去のために使用することができる。

次に、第１〜８図と関連して本発明の詳細な説明する。図中、 第１図は、硝酸塩を亜硝酸塩に還元する実施例での還元過程を示す図、 第２図は、硝酸塩を亜硝酸塩に還元するための固定化された酵素及び電子伝達体 及び電極を有する本発明による装置を示す図、 第３図は、酵素含有マトリックス中に埋め込まれた、螺旋状に形成された電極体 を有するポテンシオメトリックセルを示す図、この場合、第３ａ図は該セルの縦 断面図及び第３ｂ図は横断面図である、第４図は、酵素含有マトリックス内に埋 め込まれた、線状の直線形電極体を有するボテンシオメトリックセルを示す図、 第５図は、酵素含有マトリックス内に埋め込まれた、一体の、穿孔されたブロッ クとして形成された電極体を有するポテンシオメトリックセルを示す図、第６図 は、酵素含有マトリックス内に埋め込まれた、一体の、螺旋状に巻かれたフィル ムとして形成された電極体を有するポテンシオメトリックセルを示す図第７図は 、酵素含有マトリックス内に埋め込まれた、マルチピース型の、上下に積み重ね られたネットからなる電極体を有するポテンノオメトリックセルを示す図、及び 第８図は、酵素含有マトリックス内に埋め込まれた、マルチピース型の、上下に 積み重ねられたフリ、ソトからなる電極体を有するポテンシオメトリックセルを 示す図 である。

実施例１ 硝酸塩の亜硝酸塩への分解 硝酸塩の亜硝酸塩への還元は、３工程で行う。第１工程では、硝酸塩をニトレー トレダクターゼで亜硝酸塩に還元する。第２工程で、亜硝酸塩をニトレートレダ クターゼによりＮ、Ｏに還元しかつ第３工程でＮ１３をＮ２０レダクターゼによ りＮ！に還元する。

アスペルギルス及びトウモロコシ（Ｚｅａ　５ａｙｓ）由来のニトレートレダク ターゼ並びにロドシュードモナス０スフエロイデス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏ＊ ｏｎａｓ　５ｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）由来のニドリット及びＮ！Ｏレダクターゼ を調査した。アスペルギルス由来のニトレートレダクターゼは、ベーリンガーマ ンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　１ｌａｎｎｈｅｉｓ）社から入手した。トウ モロコシから免疫アフィニティークロマトグラフィー的に純粋なニトレートレダ クターゼを、Ｒｕｏｆｆ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８９）、　Ｂｉｏｃｈｅｓ、　 ＢＩｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ。

Ｃｏｍ５＋ｕｎ、　１６１．４９６−５０１１：記載されているようにして、製 造した。両者の酵素を使用前に凍結転環した。

まず、固定化染料（１［子伝達体として）を有する遊離酵素の酵素活性を遊離染 料を有していないものと比較して試験した。その際、遊離染料メチルバイロゲン と結合した遊離酵素のアフィニティーを１００％に設定した。還元剤としては、 亜ジチオン酸ナトリウムを利用した。

欅準反応は、５Ｑｍｍｏｌ／ｍｌ　Ｎａ、に−燐酸塩緩衝液ｐＨ７，２０，５ｍ ｌ中にＫＮＯ３２，５／ＩＺｍｏｌを含有していた。染料１．５μｍｏｌを、酵 素１００ｍ単位と混合し、該反応を１０％亜ジチオン酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ ｓ５０μｇ／ｍｌ中）２０μ！の存在下に開始させた。２５℃で１５分間後に、 反応混合物を再酸化し、亜硝酸塩をグリース・イロスベイ（Ｇｒｉｅｓｓ−１１ ｏｓｖａｙ）反応により測定した（　Ｋｕｎｄｕ及びＮ１ｋｏｌａｓ　（１９８ ５）、　Ａｒｃｈ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１４１．５７−６２）。該バッチ を十分に密閉可能な１．５ｍ１反応容器中を貫流させた。対照は染料を含有して いないか、又は加熱により不活性化された酵素を含有していた。酵素１単位は、 メチルバイロゲン３μｍ　ｏ　ｌ　／　ｍ　１　（Ｄ　存在下に１分間当たり硝 酸塩１μｍｏ＋を還元する。この試験結果は、以下の表に示す。

第１表 ニトレートレダクターゼ　ニドリットレダクターゼゼア　アスペルギリルス 染料 アズル＾　３０．８　９．７　１１９ チバクロンブト　３８．６　４８，６　９１．０クレノル豐バイオレフト　１３ ．０　２．０　８４．９」・７ｈ　１０．０　１６．５　６６、５二１−トラト レフＦ　５５．０　１０．８　９４．５！フラニンＴ　４４．５　４，１　６６ ．２チオニン　１４．５　１５．９　６２．６ブロム７エｌ−ル・ブト　２１． ５　８．４　５８．３クルクミン　５１．４　ＮＧ　１１６．４Ａチアド１に− Ｖ　３６．８　ＮＧ　１１２．０キノリンエロー　ＮＧ　ＮＧ　１２１．８湘＝ 試験せず 引き続き、前記の共固定化染料を有する固定化酵素を遊離染料のメチルバイオロ ゲンの存在下での固定化酵素の酵素活性度に相対させて測定した。還元剤として は、亜ジチオンサンナトリウムを利用した。結果は、以下の第２表に示す。

第２表 レダクターゼ：　Ａ　Ｂ　Ｃ 染料： アズル＾　９７．６　３３．１　６２．５チバクロ７７Ｇ−２０，４５０，１５ ５，３二１−トラル・レッド　１６．４　８．７　１０２．０号７ラニ７Ｔ　７ ５．０　３．ＯＮＧ １０ム７工ｌ−ル・ブルー　９３．６　ＮＧ　５０．０クルクミン１０９．７Ｎ Ｇ９７．３ バｔ７）１Ｍ　１１２．２　ＮＧ　１０５．２キｌリンエロー　ＮＧ　ＮＧ　１ １３．３Ａ＝ゼア・ニトレートレダクターゼ Ｂ＝アスペルギルス・ニトレートレダクターゼＣ＝ロドシュードモナス・ニトリ ットレラクターゼＮＧ＝試験せず 第１表及び第２表から、酵素と染料からなる系の特性は固定化により著しく変化 させることが明らかである。トウモロコン（Ｚｅａ　ｍａｙｓ）由来のニトレー トレダクターゼのためには、染料としてはアズルＡ、ブロムフェノールブルー、 クルクミンオヨビパテントブルー■が適当であり、一方ロドシュードモナス由来 のニトレートレダクターゼのためには、染料ニュートラル・レッド、クルクミン 、パテントブルー■及びキノリンエローが特に適当である。

１．２硝酸塩分解の実施 一緒に固定化されたニトレートレダクターゼ及びアズルＡを含有する１ｍ１反応 器セルを、固定化されたニドリット及びＮｅｏレダクターゼを一緒に固定化され たニュートラル・レッドと同時に含有する別の１ｍ１反応器セルに結合した。両 者の反応器セルを直列接続した。２つの異なった基質濃度を調査した。

ａ）高い濃度 １０ｍｍｏｌ／ｌ硝酸塩溶ｇ１１　Ｏｍ　Ｉを、両者のカラム（直列接続）を流 速１　ｍ　ｌ　／　ｍ　ｉ　ｎ及び電圧４Ｖで貫流させた。溶離液中で測定され た硝酸塩及び亜硝酸塩濃度は、第３表に記載する。それによれば、該カラムは酸 化した窒素１２７２μｍｏｌ／ｍｉｎを還元した。

ｂ）低い濃度 前記実験を１０ｍｍｏｌ／Ｉ硝酸塩溶液１０ｍ１で繰り返した。溶離液中には、 硝酸塩もまた亜硝酸塩も検されなかった。更に、溶離液中にはＮＯ及びＮ、０（ 酸素ガスでの再酸化後にＨＮＯ２として検出可能）も検出することができなかっ た（第３表）。

第３表 濃度（ｍｍｏｌ） Ｎ　Ｏｓ　−Ｎ　Ｏ２−Ｎ　Ｏ／Ｎ　２０１、高いＮＯ３−濃度 （溶液）　１０．０　０　０ （溶離液）　８．６９　０．３８　０ ２、低いＮＯ３−濃度 （溶液）　１．０　０　０ （溶離液）　０　０　０ 実施例２ アルコールオキシダーゼによるメタノール分解酵母（サツカロマイセス）由来の アルコールオキシダーゼは、既に電子を伝達する補因子を含有するフラボ蛋白質 である。従って、この場合には、電子伝達体（染料）の共固定化が不必要である 。メタノールの分解の際には、ホルムアルデヒドが生成する。

アルコールオキシダーゼ３８単位をフラクトゲルＨＳＫに固定化しかつ電気化学 反応器セル内で調査した。基質としてメタノールを有する１０ｍｍｏｌ／Ｉ燐酸 塩緩衝液中の酵素活性度を１００％に設定した。目的の実験の前に、空気酸素を 除去するために、反応混合物をジチオン酸塩で還元した。この状態で、活性度１ ３単位だけが測定された。引き続き、反応器セルを、酵素周辺で酸化条件が生じ るように、電極につないだ。セル内で１２Ｖ及び１ｍＡで、活性度２１．９単位 （５８％）が測定された。

この結果は、固定化されたアルコールオキシダーゼはまた共固定化されあ電子伝 達体ナシでも、電子を基質から吸収しかつ電解的に発生した酸化剤に伝達するこ とができることを示す。

保持体 Ｆｉｇ　、３ａ　Ｆｉｇ、４ａ 図＝電極体 口＝酵素含有マトリックス Ｆｉｇ、５ａ　Ｆｉｇ、６ａ 囮エ　電極体 ロ：酵素含有マトリックス Ｆｉｇ、５ｂ　Ｆｉｇ、６ｂ 口・電極体 ニレ酵素含有マトリックス Ｆｉｇ　、７ｂ　Ｆｉ　ｇ、８ｂ 手続補正書（自発） 平成５年５月１４日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．酸化性又は還元性物質を水溶被中で反応させる方法において、処理すべき水 溶液を固定化オキシドレダクターゼと、場合により共固定化電子伝達体の存在下 に接触させ、かつ同時に還元及び酸価等量を供給することを特徴とする、酸化性 又は還元性物質を水溶液中で反応させる方法。 ２．オキシドレダクターゼ及び電子伝達体を直接的分子隣接関係で及び／又は直 接結合させて固体の保持体に固定化して使用する、請求の範囲第１項記載の方法 。 ３．電子伝達体として非毒性染料を選択する、請求の範囲第２項記載の方法。 ４．電気分解で発生した再生可能な還元又は酸化等量物質を供給する、請求の範 囲第１項から第３項までのいずれか１項記載の方法。 ５．還元又は酸化等量物質を電気分解により発生させる、請求の範囲第４項記載 の方法。 ６．還元等量物質として原子水素を使用する、請求の範囲第１項から第５項まで のいずれか１項記載の方法。 ７．酸化等量物質として原子酸素を使用する、請求の範囲第１項から第６項まで のいずれか１項記載の方法。 ８．固定化オキシドレダクターゼ並びに場合により共固定化電子伝達体を含有す るポテンシオメトリックセル内で、適当な電圧で還元又は酸化等量物質を発生さ せかつ該セルに浄化すべき溶液を連続的に貫流させる、請求の範囲第４項記載の 方法。 ９．セル内の溶液の滞留時間を０．２〜５セル容積／分に調整する、請求の範囲 第８項記載の方法。 １０．分離された陰極領域及び陽極領域を有するセルを使用し、かつ両者の領域 から流出する溶液を再び合する、請求の範囲第１項又は第９項記載の方法。 １１．多数の直列接続したセルを使用する、請求の範囲第８項から第１０項まで のいずれか１項記載の方法１２．個々のセルが異なった固定化オキシドレダクタ ーゼを含有する、請求の範囲第１１項記載の方法。 １３．水溶液中で、 （ａ）無機塩、特に硝酸塩、確酸塩、シアン化物、確化物及び燐酸塩、及び （ｂ）有機化合物、特に脂肪族又は芳香族炭化水素、ハロゲン化炭化水素。ホス ホ有機化合物、アルコール、ケトン、フェノール及び洗剤 からなる群から選択される物質を反応させる、請求の範囲第１項から第１２項ま でのいずれか１項記載の方法。 １４．硝酸塩を水溶液中で反応させる、請求の範囲第１３項記載の方法。 １５．メタノールを水溶液中で反応させる、請求の範囲第１３項記載の方法。 １６．ハロゲン化炭化水素を水溶液中で反応させる、請求の範囲第１３項記載の 方法。 １７．還元性又は酸化性物質を飲料水又は廃水中で反応させる、請求の範囲第１ 項から第１６項までのいずれか１項記載の方法。 １８．水溶液中で反応させるべき物質の濃度が約０．０１ｍｍｏｌ／１〜約１０ ｍｍｏｌ／１である、請求の範囲第１項から第１７項までのいずれか１項記載の 方法。 １９．水溶液中で還元性又は酸化性物質を反応させるポテンシオメトリックセル において、電極体及び固定化オキシドレダクターゼ並びに場合に共固定化電子伝 達体を収容することを特徴とする、水溶液中で還元性又は酸化性物質を反応させ るポテンシオメトリックセル。 ２０．オキシドレダクターゼ及び場合により電子伝達体が直接、交差結合により 又はスペーサを介してエポキシ、シアンブロミド、ジイソシアネート、カルボジ イミド、グルタルジアルデヒド、ＥＤＣ、ＦＭＰもしくはその他の化合物で固定 化されている、請求の範囲第１９項記載のセル。 ２１．オキシドレダクターゼ及び場合により電子伝達体が保持体の表面に固定化 されている、請求の範囲第１９項又は第２０項記載のセル。 ２２．固体の保持体が、プラスチック、ポリサッカリド、珪酸塩、黒鉛並びにそ れらの誘導体及び混合物からなる、請求の範囲第２１項記載のセル。 ２３．固体の保持体が徴細分形に形成されている、請求の範囲第２１項又は第２ ２項記載のセル。 ２４．電極体が保持体中に埋め込まれている、請求の範囲第２３項記載のセル。 ２５．保持体が電子伝達体の孔又は穴内に存在する、請求の範囲第２３項記載の セル。 ２６．オキシドレダクターゼ並びに場合により電子伝達体が電極体の表面に固定 化されている、請求の範囲第１９項又は第２０項記載のセル。 ２７．貫流セルである、請求の範囲第１９項から第２６項までのいずれか１項記 載のセル。 ２８．無毒性染料、特に食品用染料を電子電極体として含有する、請求の範囲第 １９項から第２７項までのいずれか１項記載のセル。 ２９．飲料水又は廃水中での還元性又は酸化性物質の反応のための請求の範囲第 １８項から第２８項までのいずれか１項記載のポテンシオメトリックセルの使用 。 ３０．硝酸塩の反応のための請求の範囲第２９項記載の使用。 ３１．メタノールの反応のための請求の範囲第２９項記載の使用。 ３２．ハロゲン化された炭化水素の反応のための請求の範囲第２９項記載の使用 。