JPH0646856A - Extraction on nucleic acid - Google Patents
Extraction on nucleic acidInfo
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- JPH0646856A JPH0646856A JP22073892A JP22073892A JPH0646856A JP H0646856 A JPH0646856 A JP H0646856A JP 22073892 A JP22073892 A JP 22073892A JP 22073892 A JP22073892 A JP 22073892A JP H0646856 A JPH0646856 A JP H0646856A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は血液、尿、髄液、痰、精
液、細胞、組織、生検標本や細菌、酵母等の微生物、ウ
イルス、培養細胞等の生物材料の核酸を簡単にかつ効率
よく抽出・精製を行う方法に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention can easily and easily obtain nucleic acids of blood, urine, cerebrospinal fluid, sputum, semen, cells, tissues, biopsy specimens, microorganisms such as bacteria and yeast, viruses, and biological materials such as cultured cells. The present invention relates to an efficient extraction / purification method.
【０００２】[0002]
【従来の技術】最近核酸プローブを用いた研究や診断が
急速に進歩し、検体処理の簡略化及び核酸以外の不純物
を取り除き高純度に核酸を精製することがますます重要
になってきた。2. Description of the Related Art Recently, research and diagnosis using nucleic acid probes have been rapidly advanced, and it has become more and more important to simplify sample processing and remove impurities other than nucleic acids to purify nucleic acids with high purity.
【０００３】たとえば、核酸ハイブリダイゼーションを
行う場合、ＤＮＡ試料の精製が不十分だとＤＮＡに蛋白
が結合したり、また炭水化物を含んでいると制限酵素に
よるＤＮＡの消化を阻害するため、制限酵素の塩基配列
を認識することができず、満足の行く成績を得ることが
できない。また、ＲＮＡ試料を用いた核酸ハイブリダイ
ゼーションを行う場合も、ＲＮＡ試料の精製が不十分で
あると核酸ハイブリダイゼーションで満足の行く成績を
得ることできない。核酸ハイブリダイゼーションを行う
場合または制限酵素によるＤＮＡの消化を行う場合に
は、あらかじめＤＮＡを充分に精製することが大切であ
る。For example, in the case of performing nucleic acid hybridization, if the DNA sample is not sufficiently purified, a protein binds to the DNA, and if it contains a carbohydrate, it inhibits the digestion of the DNA by the restriction enzyme, so that the restriction enzyme It cannot recognize the nucleotide sequence and cannot obtain satisfactory results. Further, even when nucleic acid hybridization is performed using an RNA sample, satisfactory results cannot be obtained in nucleic acid hybridization if the RNA sample is not sufficiently purified. When performing nucleic acid hybridization or digesting DNA with a restriction enzyme, it is important to sufficiently purify the DNA in advance.
【０００４】非放射性標識法によるプローブの検出の場
合、不純物が混入した試料を用いると試薬に用いた抗体
やアビジンが非特異的に不純物に結合してしまい判断を
誤ってしまうことがある。In the case of detecting a probe by a non-radioactive labeling method, if a sample containing impurities is used, the antibody or avidin used as a reagent may nonspecifically bind to the impurities, resulting in a wrong judgment.
【０００５】精製ＤＮＡまたはＲＮＡを調製するには通
常基本的に３つの操作を行う必要がある。すなわち、
細胞の溶解、除蛋白と脱炭水化物、濃縮の３つの操
作である。細胞の溶解にはリゾチーム、アクロモペプ
チダーゼなどの細胞壁溶解酵素やプロテインナーゼＫ等
の蛋白分解酵素を用いたり、アルカリやＳＤＳ等の界面
活性剤を用いて細胞を破壊する。Preparation of purified DNA or RNA usually requires three basic operations. That is,
The three operations are cell lysis, deproteinization and decarburization, and concentration. To lyse cells, cell wall lysing enzymes such as lysozyme and achromopeptidase and proteolytic enzymes such as proteinase K are used, or the cells are destroyed by using a surfactant such as alkali and SDS.
【０００６】また結核菌やぶどう球菌等強固な細胞壁を
持つ微生物の場合、ビーズや超音波を用いて物理的に破
壊させたりする。場合によってはこれに併用して細胞壁
溶解酵素や蛋白分解酵素を作用させたり、アルカリや界
面活性剤添加を組合わせて行う。Further, in the case of microorganisms having a strong cell wall such as Mycobacterium tuberculosis and Staphylococcus, they are physically destroyed by using beads or ultrasonic waves. In some cases, a cell wall lysing enzyme or a proteolytic enzyme may be used in combination with this, or an alkali or a surfactant may be added in combination.
【０００７】の除蛋白と脱炭水化物については従来よ
りフェノール・クロロホルム法による抽出が最も多く使
用されている。しかしこのフェノール・クロロホルム法
は毒性が強いうえ時間と手間がかかるため大変扱いにく
いという問題があった。For the deproteinization and decarburization of the above, extraction by the phenol / chloroform method has been most frequently used. However, the phenol / chloroform method has a problem that it is very difficult to handle because it is highly toxic and takes time and effort.
【０００８】即ち、このフェノール・クロロホルム法に
はおいては、ＤＮＡは水性液体層（上層）に、変性蛋白
質は水性液体層と有機液体層（下層）との中間層に綿状
の白い層をつくるので、その白い層を吸い込まないよう
にＤＮＡ層を注意深く口の広いピペットを用いて静かに
吸い取り、新しいマイクロチューブに移すというような
面倒な作業を必要とする。この操作には、時間がかかり
かつ熟練を必要とするからＤＮＡ回収の再現性が悪く、
しかも大量処理が困難であった。That is, in the phenol-chloroform method, DNA forms an aqueous liquid layer (upper layer), and denatured protein forms a cotton-like white layer as an intermediate layer between the aqueous liquid layer and the organic liquid layer (lower layer). Therefore, it is necessary to carefully suck the DNA layer gently with a wide-mouthed pipette so as not to suck the white layer, and transfer it to a new microtube. This operation is time-consuming and requires skill, so the reproducibility of DNA recovery is poor,
Moreover, mass processing was difficult.
【０００９】の後最後に濃縮で不純物を取り除いた
後、酢酸アンモニウムまたは酢酸ナトリウムを加えてエ
タノールで沈澱させてＤＮＡまたはＲＮＡを濃縮・精製
する。After the last step, the impurities are removed by concentration, and then ammonium acetate or sodium acetate is added and the mixture is precipitated with ethanol to concentrate and purify DNA or RNA.
【００１０】これまでに抽出法を簡便に効率よく行うた
めにフェノール・クロロホルム法の改良が試みられてい
るが、フェノールの危険性を避けるためにフェノール・
クロロホルムを用いない方法も開発されている。Up to now, attempts have been made to improve the phenol / chloroform method in order to carry out the extraction method simply and efficiently, but in order to avoid the danger of phenol,
Methods that do not use chloroform have also been developed.
【００１２】たとえば、リンパ球に感染するＨＩＶ−
１、ＥＢウイルスを検査するために、血液サンプルから
ＤＮＡを抽出する場合、ヘパリン採血した血液をトリト
ンＸー１００で処理、遠心後沈澱物にグアニジンイソチ
オシネートを加えた後イソプロパノールを加えＤＮＡを
析出、エタノール洗浄を行う方法があり、この方法では
２時間以内にＤＮＡを抽出することができる。For example, HIV- which infects lymphocytes
1. When DNA is extracted from a blood sample to test EB virus, heparin-collected blood is treated with Triton X-100, centrifuged, and guanidine isothiocyanate is added to the precipitate, followed by isopropanol to precipitate the DNA. Alternatively, there is a method of washing with ethanol. With this method, DNA can be extracted within 2 hours.
【００１３】この方法はたいへん簡単ではあるが、しか
し対象試料が血液に限られ必ずしも一般的ではない。This method is very simple, but it is not always general because the target sample is limited to blood.
【００１４】さらに、迅速に核酸を抽出分離するための
核酸抽出カラムを用いた方法もあるが、高価であるため
処理コストがかかるという問題があり、一般には使いに
くいという問題がある。Further, there is also a method using a nucleic acid extraction column for rapidly extracting and separating nucleic acid, but it is problematic in that it is expensive and therefore processing cost is high, and it is generally difficult to use.
【００１５】最近安価にかつ迅速に核酸を抽出する方法
としてＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）
等の陽イオン界活性剤のＤＮＡ結合性を利用した方法が
報告されている（特開平２−３１６９６号公報）。Recently, CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) has been used as an inexpensive and rapid method for extracting nucleic acids.
A method utilizing the DNA binding property of a cation field activator such as the above has been reported (JP-A-2-31696).
【００１６】この方法は細胞破壊の前処理後、ＣＴＡＢ
を加え有機溶剤中で核酸とＣＴＡＢの複合体を形成させ
た後、高塩濃度の水溶液に溶解してＤＮＡとＣＴＡＢを
解離し、エタノールまたはイソプロパノールでＤＮＡを
回収する方法である。この方法は危険性の高いフェノー
ルは使わないものの実際には遠心、洗浄も多く操作も面
倒である。In this method, CTAB is used after pretreatment for cell destruction.
Is added to form a complex of nucleic acid and CTAB in an organic solvent, and then dissolved in an aqueous solution having a high salt concentration to dissociate DNA and CTAB, and DNA is recovered with ethanol or isopropanol. This method does not use phenol, which is very dangerous, but in practice it is troublesome to operate because it involves centrifugation and washing.
【００１７】[0017]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した従
来技術の問題点に鑑みて発明されたもので、核酸を簡
便、迅速かつ高純度に抽出・精製する傾斜（デカンテー
ション）又は転倒分取可能な方法を提供することを目的
とするものである。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention has been invented in view of the above-mentioned problems of the prior art, and a gradient (decantation) or an inverted fraction for extracting and purifying nucleic acid simply, rapidly and with high purity. The purpose is to provide an accessible method.
【００１８】[0018]
【課題を解決するための手段】本発明は上記の課題を解
決するために、生物材料から核酸を溶出するための前処
理を行ったのち、この前処理した生物材料にチキソトロ
ピー性を有する増粘剤を含む非親水性の高比重有機液体
と水性液体を加えて混合し、遠心分離後、上層と下層の
境界面に非流動性の凝集層を形成し、上層の核酸を分離
抽出するようにしたものである。In order to solve the above-mentioned problems, the present invention performs a pretreatment for eluting nucleic acid from a biological material, and then the pretreated biological material has a thixotropic thickening property. A non-hydrophilic high specific gravity organic liquid containing an agent and an aqueous liquid are added and mixed, and after centrifugation, a non-fluid aggregation layer is formed at the interface between the upper layer and the lower layer, and the nucleic acid in the upper layer is separated and extracted. It was done.
【００１９】上記前処理は蛋白変性剤及び／又は膜溶解
剤を加えて行われる。また、分離抽出手段としては、遠
心分離後、傾斜（デカンテーション）又は転倒によって
分取することが好適である。The above-mentioned pretreatment is carried out by adding a protein denaturing agent and / or a membrane lysing agent. Further, as the separating / extracting means, it is preferable to perform separation by decantation or inversion after centrifugation.
【００２０】本発明の構成をさらに具体的にいえば、生
物材料を破壊し、生物材料中の核酸分解酵素を失活させ
ると同時に蛋白質を変性させて生物材料を溶解し、この
溶解した生物材料に、蛋白質等の汚染物質と結合して上
層と下層の境界面に非流動性の凝集層を形成するチキソ
トロピー性を有する増粘剤を含む高比重有機液体と核酸
を抽出するための水性液体を加えて混合し、相分配抽出
を行い、核酸を上層へ溶出させ、傾斜（デカンテーショ
ン）又は転倒によりこの上層を分離し、簡便に核酸を抽
出するようにしたものである。More specifically, the constitution of the present invention is as follows: the biological material is destroyed, the nucleic acid degrading enzyme in the biological material is inactivated, and at the same time the protein is denatured to dissolve the biological material, and the dissolved biological material is dissolved. In addition, a high specific gravity organic liquid containing a thixotropic thickener that binds to contaminants such as proteins and forms a non-fluidic aggregation layer at the interface between the upper and lower layers and an aqueous liquid for extracting nucleic acids In addition, the mixture is mixed and subjected to phase partition extraction to elute the nucleic acid to the upper layer, and the upper layer is separated by decantation or inversion to easily extract the nucleic acid.
【００２１】本発明でいう生物材料とは、血液、尿、髄
液、痰、***、細胞、組織、生検標本や細菌、酵母等の
微生物、ウイルス、培養細胞等を指称するものである。The biological material used in the present invention refers to blood, urine, spinal fluid, sputum, semen, cells, tissues, biopsy specimens, microorganisms such as bacteria and yeast, viruses, cultured cells and the like.
【００２２】[0022]
【作用】本発明の方法においては、生物材料から核酸を
溶出するための前処理は、生物材料をキレート剤を含む
緩衝液（ｐＨ５〜９）中で前処理した後、細胞膜または
細胞壁等を破壊するために通常は約０．１〜１０．０％
（Ｗ／Ｖ）の範囲の濃度の陰イオン界面活性剤や非イオ
ン性界面活性剤等の膜溶解剤と約１Ｍ〜６Ｍのグアニジ
ンチオシネートまたは約１Ｍ〜６Ｍの塩酸グアニジン等
の蛋白変性剤で処理することをいう。場合によっては細
胞膜や細胞壁等を破壊するための酵素によって処理して
もよい。In the method of the present invention, the pretreatment for eluting the nucleic acid from the biological material is performed by pretreating the biological material in a buffer solution (pH 5 to 9) containing a chelating agent, and then destroying the cell membrane or cell wall. Usually about 0.1-10.0%
Membrane-dissolving agents such as anionic surfactants and nonionic surfactants in a concentration range of (W / V) and protein denaturants such as about 1M to 6M guanidine thiocinate or about 1M to 6M guanidine hydrochloride. Processing. In some cases, it may be treated with an enzyme for destroying the cell membrane, cell wall and the like.
【００２３】上記したキレート剤として好適に用いられ
るものは、エチレンジアミン四酢酸、エチレングリコー
ルビス四酢酸、８−ヒドロキシ−２−メチルキノリン、
８−ヒドロキニリン−５−スルフォン酸、１，１０−フ
ェナントロリン、８−キノリノール，サリチル酸及びそ
れらの塩等があり、通常は処理液中に約０．００５から
０．３Ｍの範囲で用いられる。The above-mentioned chelating agent is preferably used as ethylenediaminetetraacetic acid, ethyleneglycolbistetraacetic acid, 8-hydroxy-2-methylquinoline,
8-Hydroquinillin-5-sulfonic acid, 1,10-phenanthroline, 8-quinolinol, salicylic acid and salts thereof are available, and they are usually used in the treatment liquid in an amount of about 0.005 to 0.3M.
【００２４】上記した膜溶解剤として好適な陰イオン界
面活性剤には、ラウリル硫酸ナトリウム，Ｎ−ラウロイ
ルサルコシンナトリウム，リン酸ラウリル，カプリレー
ト塩，コレート塩，スルフォン酸デカン塩，デオキシコ
レート塩，グリココレート塩，グリコデオキシコレート
塩，タウロコレート塩，タウロデオキシコレート塩等が
ある。Suitable anionic surfactants as the above-mentioned membrane-dissolving agent include sodium lauryl sulfate, sodium N-lauroylsarcosine sodium, lauryl phosphate, caprylate salt, cholate salt, decane sulfonate salt, deoxycholate salt and glycosyl. Examples include cholate salt, glycodeoxycholate salt, taurocholate salt, and taurodeoxycholate salt.
【００２５】上記した膜溶解剤として適切な非イオン性
界面活性剤には、Ｓｐａｎ２０，Ｓｐａｎ４０，Ｓｐａ
ｎ６０，Ｓｐａｎ６５，Ｓｐａｎ８０，Ｓｐａｎ８５等
のｄ−ソルビトールの脂肪酸エステル類、Ｔｗｅｅｎ２
０，Ｔｗｅｅｎ２１，Ｔｗｅｅｎ４０，Ｔｗｅｅｎ６
０，Ｔｗｅｅｎ６５，Ｔｗｅｅｎ８０，Ｔｗｅｅｎ８
１，Ｔｗｅｅｎ８５等のポリオキシエチレングリコール
ソルビタンアルキルエステル類、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１
００等のポリオキシエチレングリコールｐ−ｔ−オクチ
ルフェニルエーテル類等がある。Suitable nonionic surfactants as the above-mentioned membrane-dissolving agent include Span 20, Span 40, Spa.
n60, Span65, Span80, Span85 and other fatty acid esters of d-sorbitol, Tween2
0, Tween 21, Tween 40, Tween 6
0, Tween65, Tween80, Tween8
1, polyoxyethylene glycol sorbitan alkyl esters such as Tween 85, Triton X-1
00 and other polyoxyethylene glycol pt-octylphenyl ethers.
【００２６】上記した細胞膜や細胞壁等を破壊するため
の酵素として好適に用いられるものは、約１ｍｇ／ｍｌ
から５０ｍｇ／ｍｌの濃度のリゾチーム、アクロモペプ
チターゼ、リゾスタフィン、リチカーセ、ムタノリシン
等の膜溶解酵素によって、もしくは約１０μｇ／ｍｌか
ら２０ｍｇ／ｍｌの濃度の蛋白分解酵素、例えばプロテ
アーゼｋ、プロナーゼ、ペプシン、パパイン等がある。The enzyme preferably used for destroying the above-mentioned cell membrane, cell wall, etc. is about 1 mg / ml.
To 50 mg / ml of lysozyme, achromopeptidase, lysostaphin, lithicase, mutanolysin, etc., or a proteolytic enzyme at a concentration of about 10 μg / ml to 20 mg / ml, such as protease k, pronase, pepsin, There is papain, etc.
【００２７】上記したような前処理を行うと、生物材料
は上記したキレート剤、膜溶解剤、蛋白変性剤や、膜溶
解酵素、蛋白分解酵素等を含む水溶液に溶解し、この水
溶液中には核酸と各種の生物物質が可溶化する。When the above-mentioned pretreatment is carried out, the biological material is dissolved in an aqueous solution containing the above-mentioned chelating agent, membrane-dissolving agent, protein denaturing agent, membrane-dissolving enzyme, proteolytic enzyme and the like. Nucleic acid and various biological substances are solubilized.
【００２８】次に、この可溶化した生物材料中から核酸
が水性溶媒層に抽出されかつ傾斜（デカンテーション）
又は転倒により簡便に分離できるような相分配抽出（ph
ase-partition-extraction）を行う。Next, nucleic acids are extracted from this solubilized biological material into the aqueous solvent layer and decanted.
Alternatively, phase partition extraction (ph
ase-partition-extraction).
【００２９】まず、蛋白質等の汚染物質と結合しかつ相
分配抽出において、上層と下層の境界面で非流動性の凝
集層を形成して傾斜（デカンテーション）又は転倒分取
による核酸の分離を可能ならしめるために、チキソトロ
ピー性を有する増粘剤を含む高比重有機液体、または高
比重有機液体の混合物、もしくはこれらの高比重有機液
体とアルコールの混合物と核酸を上層に抽出するための
水性液体を可溶化した生物材料中に加えて混合したのち
遠心分離する。遠心分離後、上層と下層の境界面に非流
動性の凝集層が形成される。First, in the phase partitioning extraction, which binds to contaminants such as proteins and the like, a non-fluid aggregation layer is formed at the interface between the upper layer and the lower layer to separate nucleic acids by decantation or inversion fractionation. In order to make it possible, a high-density organic liquid containing a thickener having a thixotropic property, or a mixture of high-density organic liquids, or a mixture of these high-density organic liquids and alcohols and an aqueous liquid for extracting nucleic acids to the upper layer. Is added to the solubilized biological material, mixed and then centrifuged. After centrifugation, a non-fluidic cohesive layer is formed at the interface between the upper and lower layers.
【００３０】この非流動性の凝集層が形成される理由
は、蛋白質等の汚染物質と結合したチキソトロピー性を
有する増粘剤が遠心分離による遠心力と高比重有機液体
の浮力により、中間層（境界面）に集められる結果、チ
キソトロピー性を有する増粘剤の濃度が高くなることに
より増粘効果に伴った粘性の変化に起因するものと考え
られる。The reason why this non-fluidic aggregation layer is formed is that the thickening agent having a thixotropic property combined with a contaminant such as a protein is caused by the centrifugal force by centrifugation and the buoyancy of the high specific gravity organic liquid, so that the intermediate layer ( It is considered that, as a result of being collected at the boundary surface), the concentration of the thickener having thixotropic properties becomes high, which causes a change in viscosity accompanying the thickening effect.
【００３１】本発明でいう相分配抽出において、上層と
下層の境界面で非流動性の凝集層を形成させるチキソト
ロピー性を有する増粘剤としては、高比重有機液体に分
散性のある増粘剤が用いられ、さらに蛋白質等の汚染物
質と結合性のある増粘剤が好ましい。In the phase partition extraction of the present invention, a thixotropic thickener that forms a non-fluidic cohesive layer at the interface between the upper layer and the lower layer is a thickener that is dispersible in a high specific gravity organic liquid. Is used, and a thickener that is capable of binding to contaminants such as proteins is preferable.
【００３２】本発明で用いられるチキソトロピー性を有
する増粘剤としては、ベンナイト有機誘導体を用いるこ
とが好ましい。ベンナイト有機誘導体には、スメクタイ
ト粘土の有機誘導体、ヘクトライト粘土の有機誘導体、
モンモリナイト粘土の有機変性体、精製したスメクタイ
ト粘土、特殊処理スメクタイト粘土、精製有機鉱物粘土
等を用いることができる。As the thickener having thixotropy used in the present invention, it is preferable to use a bentonite organic derivative. Bennite organic derivatives include organic derivatives of smectite clay, organic derivatives of hectorite clay,
Organic modified montmorillonite clay, refined smectite clay, specially treated smectite clay, refined organic mineral clay and the like can be used.
【００３３】使用するチキソトロピー性を有する増粘剤
の濃度としては、０．１から１０％（Ｗ／Ｖ）の範囲が
好適である。The concentration of the thixotropic thickener used is preferably in the range of 0.1 to 10% (W / V).
【００３４】本発明のチキソトロピー性を有する増粘剤
として用いられるスメクタイト粘土の有機誘導体として
は、ＢＥＮＴＯＮＥ ２７（エヌ・エル・インダストリ
ィズ・インコーポレーテッド製、チクソトロープ及びゲ
ル化剤の商品名）、ＢＥＮＴＯＮＥ ３４（エヌ・エル
・インダストリィズ・インコーポレーテッド製、チクソ
トロープ及びゲル化剤の商品名）、ＢＥＮＴＯＮＥ ３
８（エヌ・エル・インダストリィズ・インコーポレーテ
ッド製、チクソトロープ及びゲル化剤の商品名）、ＢＥ
ＮＴＯＮＥ ＳＤ−１（エヌ・エル・インダストリィズ
・インコーポレーテッド製、チクソトロープ及びゲル化
剤の商品名）、ＢＥＮＴＯＮＥ ＳＤ−２（エヌ・エル
・インダストリィズ・インコーポレーテッド製、チクソ
トロープ及びゲル化剤の商品名）、ＢＥＮＴＯＮＥ Ｓ
Ｄ−３（エヌ・エル・インダストリィズ・インコーポレ
ーテッド製、チクソトロープ及びゲル化剤の商品名）等
を好適に挙げることができる。また、本発明のチキソト
ロピー性を有する増粘剤として用いられるモンモリナイ
ト粘土の有機変性体としてはＢＥＮＴＯＮＥ １２８
（エヌ・エル・インダストリィズ・インコーポレーテッ
ド製、チクソトロープ及びゲル化剤の商品名）、ＢＥＮ
ＴＯＮＥ ５００（エヌ・エル・インダストリィズ・イ
ンコーポレーテッド製、チクソトロープ及びゲル化剤の
商品名）、精製したスメクタイト粘土としはＭＡＣＡＬ
ＯＩＤ、特殊処理スメクタイト粘土としはＢＥＮＴＯＮ
Ｅ ＥＷ（エヌ・エル・インダストリィズ・インコーポ
レーテッド製、チクソトロープ及びゲル化剤の商品
名）、精製有機鉱物粘土としてはＢＥＮＴＯＮＥ ＬＴ
（エヌ・エル・インダストリィズ・インコーポレーテッ
ド製、チクソトロープ及びゲル化剤の商品名）等を好適
に挙げることができる。As the organic derivative of smectite clay used as a thickener having thixotropic property of the present invention, BENTONE 27 (trade name of thixotrope and gelling agent, manufactured by N. Industries Co., Ltd.), BENTONE 34 (Product name of thixotrope and gelling agent, manufactured by N. Industries, Inc.), BENTONE 3
8 (product name of thixtrope and gelling agent, manufactured by N. Industries Incorporated), BE
NTONE SD-1 (trade name of thixotrope and gelling agent, manufactured by N. Industries, Inc.), BENTONE SD-2 (trade name of thixotrope and gelling agent, manufactured by N. Industries, Inc.) ), BENTONE S
Preferable examples thereof include D-3 (trade name of thixotrope and gelling agent, manufactured by N. Industries, Inc.). Further, as an organic modified product of montmorillonite clay used as a thickener having thixotropic property of the present invention, BENTONE 128
(Product name of thixtrope and gelling agent, manufactured by N. Industries, Inc.), BEN
TONE 500 (trade name of thixotrope and gelling agent, manufactured by N. Industries, Inc.), MACAL for refined smectite clay
BENTON as OID and specially treated smectite clay
EW (trade name of thixotrope and gelling agent, manufactured by N. Industries, Inc.), BENTONE LT as a refined organic mineral clay
(Product name of thixotrope and gelling agent, manufactured by N. Industries, Inc.) and the like can be preferably mentioned.
【００３５】また、本発明のチキソトロピー性を有する
増粘剤として用いられるスメクタイトの有機誘導体とし
ては、ＢＥＮＴＯＮＥ ３４（エヌ・エル・インダスト
リィズ・インコ−ポレーテッド製、チクソトロープ及び
ゲル化剤の商品名）、ＢＥＮＴＯＮＥ ＳＤ−３（エヌ
・エル・インダストリィズ・インコ−ポレーテッド製、
チクソトロープ及びゲル化剤の商品名）、ＢＥＮＴＯＮ
Ｅ ＬＴ（エヌ・エル・インダストリィズ・インコ−ポ
レーテッド製、チクソトロープ及びゲル化剤の商品
名）、ＢＥＮＴＯＮＥ ＥＷ（エヌ・エル・インダスト
リィズ・インコ−ポレーテッド製、チクソトロープ及び
ゲル化剤の商品名）、ＭＡＣＡＬＯＩＤ等を好適に挙げ
ることができる。しかし、本発明で用いられるチキソト
ロピー性を有する増粘剤は、本発明における非流動性の
凝集層を形成するものであれば使用可能であり、上記し
た増粘剤に限定されるものではない。Further, as the organic derivative of smectite used as a thickener having thixotropy of the present invention, BENTONE 34 (trade name of thixotropic and gelling agent, manufactured by N. Industries Incorporated), BENTONE SD-3 (manufactured by NL Industries, Inc.,
Trade name of thixotrope and gelling agent), BENTON
ELT (product name of thixotropic and gelling agent, manufactured by N. Industries Inco-Polled), BENTONE EW (product name of thixotrope and gelling agent manufactured by N. L. Industries, Inc.), MACALOID etc. can be mentioned suitably. However, the thickener having thixotropy used in the present invention can be used as long as it forms the non-fluidic aggregation layer in the present invention, and is not limited to the above-mentioned thickeners.
【００３６】本発明でいう非親水性の高比重有機液体と
は、水に難溶性又は不溶性の密度（ｇ／ｃｍ3 ）として
１．０５以上の有機液体が適当である。The non-hydrophilic, high specific gravity organic liquid used in the present invention is preferably an organic liquid having a density (g / cm 3 ) of sparingly soluble or insoluble in water of 1.05 or more.
【００３７】本発明における非親水性の高比重有機液体
として好適に用いられるものには、四塩化炭素、クロロ
ホルム、１，２−ジクロロエタン、１，２−ジブロモエ
タン、トリクロロエチレン、テトラクロロエチレン、ク
ロロベンゼン、ブロモベンゼン、ｏ−ジクロロベンゼン
等のハロゲン化合物、２，２，２−トリフルオロエタノ
ール、フェノール、フルフラール等のアルデヒド、ニト
ロメタン、ニトロベンゼン等のニトロ化合物、スルホラ
ン等の硫黄化合物がある。これらの高比重有機液体は、
単独で用いてもよいし混合して用いることもできる。Those which are preferably used as the non-hydrophilic high-density organic liquid in the present invention include carbon tetrachloride, chloroform, 1,2-dichloroethane, 1,2-dibromoethane, trichloroethylene, tetrachloroethylene, chlorobenzene and bromobenzene. , Halogen compounds such as o-dichlorobenzene, aldehydes such as 2,2,2-trifluoroethanol, phenol and furfural, nitro compounds such as nitromethane and nitrobenzene, and sulfur compounds such as sulfolane. These high specific gravity organic liquids
They may be used alone or in combination.
【００３８】上記高比重有機液体の安定剤として添加す
る適当なアルコールとしては、メタノール、エタノー
ル、１−プロパノール、２−プロパノール、イソアミル
アルコール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブ
チルアルコール、シクロヘキサノール、エチレングリコ
ール、２−メトキシエタノール、２−エトキシエタノー
ル等を挙げることができる。これらのアルコールも、単
独で用いてもよいし混合して用いることもできる。Suitable alcohols added as stabilizers for the high specific gravity organic liquids include methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, isoamyl alcohol, 1-butanol, 2-butanol, isobutyl alcohol, cyclohexanol, ethylene. Glycol, 2-methoxyethanol, 2-ethoxyethanol and the like can be mentioned. These alcohols may be used alone or in a mixture.
【００３９】核酸を上層に抽出するための水性溶媒とし
ては、水または塩化ナトリウム，塩化カリウム，塩化カ
ルシウム，塩化マグネシウム，酢酸ナトリウム，塩化ア
ンモニウム，酢酸アンモニウム，硫酸アンモニウム等の
無機塩および塩酸ジメチルアミン，塩酸トリメチルアミ
ン等の有機塩を水溶液として用い、通常、１０ｍＭ〜１
Ｍの範囲の濃度で使用するのが好ましい。このとき、核
酸の回収率を高くするために、この水溶液に０．０１〜
１０％の適当な陰イオン界面活性剤または非イオン性界
面活性剤を加えてもよい。As the aqueous solvent for extracting the nucleic acid into the upper layer, water or an inorganic salt such as sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, magnesium chloride, sodium acetate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium sulfate, etc. and dimethylamine hydrochloride, hydrochloric acid Using an organic salt such as trimethylamine as an aqueous solution, usually 10 mM to 1
It is preferably used at a concentration in the range of M. At this time, in order to increase the recovery rate of nucleic acid, 0.01 to
10% of a suitable anionic or nonionic surfactant may be added.
【００４０】高比重有機液体層と水性液体層との比（Ｖ
／Ｖ）は約１：５から５：１が好適であり、これらの層
は混和されたのち遠心分離によって形成された境界面の
非流動性の凝集層によって、下層の高比重有機液体層と
上層の水性液体層とに分配させられ、傾斜（デカンテー
ション）又は転倒によって水性溶媒層（上層）が取り出
される。Ratio of high specific gravity organic liquid layer to aqueous liquid layer (V
/ V) is preferably about 1: 5 to 5: 1, and these layers are mixed with each other, and the non-fluid cohesive layer at the interface formed by centrifugation is used to form a high-density organic liquid layer as a lower layer. It is distributed to the upper aqueous liquid layer and the aqueous solvent layer (upper layer) is taken out by decantation or inversion.
【００４１】取り出された水性溶媒層（上層）から核酸
を分離・濃縮するために、水性液体層の１／１０量に相
当する１〜５Ｍの酢酸ナトリウム等を加えたのち等量の
イソプロパノール、または２倍量のエタノールを加えて
核酸を沈澱させる。沈澱した核酸は適当な溶剤に溶かさ
れる。In order to separate and concentrate the nucleic acid from the extracted aqueous solvent layer (upper layer), 1 to 5 M sodium acetate or the like corresponding to 1/10 the amount of the aqueous liquid layer is added, and then an equal amount of isopropanol, or Nucleic acid is precipitated by adding 2 volumes of ethanol. The precipitated nucleic acid is dissolved in a suitable solvent.
【００４２】沈澱した核酸を溶解する適当な水溶液に
は、Ｔ．Ｅ緩衝液（一般的に５０ｍＭのトリスヒドロキ
シメチルアミノエタン−塩酸緩衝液ｐＨ８．０・２０ｍ
ＭのＥＤＴＡ）等の緩衝液や塩化ナトリウム，塩化カリ
ウム，塩化カルシウム，塩化マグネシウム，酢酸ナトリ
ウム，塩化アンモニウム，酢酸アンモニウム，硫酸アン
モニウム等の無機塩およびその混合物があり、通常、約
０．１から１０．０Ｍの範囲の濃度で使用する。A suitable aqueous solution for dissolving the precipitated nucleic acid is T. E buffer (generally 50 mM trishydroxymethylaminoethane-hydrochloric acid buffer pH 8.0.20 m
M EDTA) and the like, and inorganic salts such as sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, magnesium chloride, sodium acetate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium sulfate and mixtures thereof, and usually about 0.1 to 10. Used at a concentration in the range of 0M.
【００４３】[0043]
【実施例】以下に、本発明の実施例を挙げて説明する
が、本発明がこれらの実施例に限定されるものでないこ
とは勿論である。EXAMPLES The present invention will be described below with reference to examples, but it goes without saying that the present invention is not limited to these examples.
【００４４】実施例１ 一夜培養した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を滅菌生理食塩水
等で１．２×１０10ｃｅｌｌｓ／ミリリットルに調製
し、被験菌液とした。この被験菌液１ミリリットルをマ
イクロチューブ（１．５ミリリットル〜２．０ミリリッ
トル）に移し１２０００回転、３０秒〜１分間の遠心で
上清を除去して、菌体を５０ｍＭのグルコース、１０ｍ
ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、２５ｍＭのトリスー塩酸
（ｐＨ８．０）の溶液１００μリットルに懸濁し、５分
間室温に放置した。Example 1 Escherichia coli (E. coli) that had been cultured overnight was adjusted to 1.2 × 10 10 cells / ml with sterile physiological saline or the like, and used as a test bacterial solution. 1 milliliter of this test bacterial solution was transferred to a microtube (1.5 milliliter to 2.0 milliliter), and the supernatant was removed by centrifugation at 12,000 rpm for 30 seconds to 1 minute.
The suspension was suspended in 100 μl of a solution of M EDTA (pH 8.0) and 25 mM Tris-hydrochloric acid (pH 8.0) and left at room temperature for 5 minutes.
【００４５】放置後、菌体を溶解するために５Ｍのグア
ニジンチオシネート、５％のラウロイル・サルコシン・
ナトリウム、２５ｍＭのクエン酸ナトリウムの溶液を１
００μリットル加えた。次に、２．７％（Ｗ／Ｖ）のＢ
ＥＮＴＯＮＥ ＳＤ−３を含む四塩化炭素：イソアミル
アルコール（２４：１）７００μリットルと０．５Ｍの
酢酸ナトリウム４００μリットルを加え激しく振とうし
た後、１２０００ＲＰＭ（１１０００×ｇ）１０〜１５
分間遠心分離する。遠心分離後、上層（水性液体層）と
下層（高比重有機液体層）の境界面に非流動性凝集層が
形成されるので、マイクロチューブを傾斜（デカンテー
ション）させて上層のＤＮＡを含む水性液体層を新しい
マイクロチューブに移した。After standing, 5M guanidine thiocinate, 5% lauroyl sarcosine
1 solution of sodium, 25 mM sodium citrate
00 μl was added. Next, 2.7% (W / V) B
After adding 700 μl of carbon tetrachloride: isoamyl alcohol (24: 1) containing ENTONE SD-3 and 400 μl of 0.5 M sodium acetate and shaking vigorously, 12000 RPM (11000 × g) 10-15
Centrifuge for minutes. After centrifugation, a non-fluid aggregation layer is formed at the interface between the upper layer (aqueous liquid layer) and the lower layer (high specific gravity organic liquid layer), so the microtube is tilted (decantation) and the aqueous layer containing the upper layer DNA is added. The liquid layer was transferred to a new microtube.
【００４６】この水性液体層の１／１０量に相当する３
Ｍの酢酸ナトリウムを加え、さらに同量のイソプロピル
アルコールを加え軽く撹拌した後、１２０００ＲＰＭ
（１１０００×ｇ）で１０〜１５分間遠心して核酸を沈
澱させ、デカンテーションで静かに上清を除去した後、
ペレットに７０％のエタノール１ミリリットルを静かに
加え１２０００ＲＰＭ（１１０００×ｇ）で５分間遠心
してデカンテーションで静かに上澄みを除去し、乾燥さ
せた後、０．１×ＳＳＣを加えて核酸を溶解した。この
ときに抽出・精製した核酸の回収率と純度は分光光度計
を使って、波長２６０ｎｍの吸光度を測定してＤＮＡ量
を計算（ＯＤ260 ＝１．０のとき、５０μｇ／ミリリッ
トルのＤＮＡ量に相当する）して求め、表１に示した。
また、純度試験として波長２８０ｎｍと波長２３４ｎｍ
の吸光度を測定し、表１に示した。ＯＤ260 ／ＯＤ280
の比率が１．６５以上であれば、蛋白質等の混在はほと
んどないものと判定し、ＯＤ234 ／ＯＤ260 の比率が
０．９以下であれば多糖類等の混在は少ないものと判定
した。3 corresponding to 1/10 amount of this aqueous liquid layer
M sodium acetate was added, the same amount of isopropyl alcohol was further added, and the mixture was stirred lightly, then 12000 RPM
After precipitating the nucleic acid by centrifugation at (11000 × g) for 10 to 15 minutes and gently removing the supernatant by decantation,
1 ml of 70% ethanol was gently added to the pellet and centrifuged at 12000 RPM (11000 × g) for 5 minutes, the supernatant was gently removed by decantation, and after drying, 0.1 × SSC was added to dissolve the nucleic acid. . At this time, the recovery rate and the purity of the extracted and purified nucleic acid were measured by measuring the absorbance at a wavelength of 260 nm using a spectrophotometer to calculate the DNA amount (when OD 260 = 1.0, the DNA amount was 50 μg / ml). (Corresponding) and determined and shown in Table 1.
Also, as a purity test, a wavelength of 280 nm and a wavelength of 234 nm
The absorbance was measured and is shown in Table 1. OD 260 / OD 280
If the ratio was 1.65 or more, it was determined that proteins and the like were hardly mixed, and if the ratio of OD 234 / OD 260 was 0.9 or less, the mixture of polysaccharides and the like was judged to be small.
【００４７】このとき抽出・精製した核酸の回収率と純
度は、比較例１のＳＤＳ−フェノール法と同等であっ
た。At this time, the recovery rate and the purity of the extracted / purified nucleic acid were similar to those of the SDS-phenol method of Comparative Example 1.
【００４８】比較例１ 上記実施例１と比較するために、以下に記した従来公知
のＳＤＳ−フェノール法を用いて実験を行った。Comparative Example 1 In order to compare with Example 1 described above, an experiment was carried out by using the conventionally known SDS-phenol method described below.
【００４９】一夜培養した大腸菌を５０ｍＭのＥＤＴＡ
緩衝液（ｐＨ８．０）で１×１０10ｃｅｌｌｓ／ミリリ
ットルに調製し、被験菌液とした。E. coli cultured overnight was treated with 50 mM EDTA.
It was adjusted to 1 × 10 10 cells / ml with a buffer solution (pH 8.0) and used as a test bacterial solution.
【００５０】この被験菌液１ミリリットルをマイクロチ
ューブ（１．５ミリリリットル〜２．０ミリリットル）
に移し、１２０００ＲＰＭ（１１０００×ｇ）で３０秒
〜１分間の遠心で上清を除去して、菌体を５ｍＭのＥＤ
ＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）２００μリットルに懸濁し
た。1 ml of this test bacterial solution was added to a microtube (1.5 ml to 2.0 ml).
The supernatant was removed by centrifugation at 12000 RPM (11000 × g) for 30 seconds to 1 minute, and the bacterial cells were added with 5 mM ED.
Suspended in 200 μl of TA buffer (pH 8.0).
【００５１】リゾチーム粉末を０．１５Ｍ ＮａＣ１，
０．１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶解液でとかし５
０μリットル加え室温で５分間放置後、２０％のＳＤＳ
（ラウリル硫酸ナトリウム）３０μリットル加え６０℃
で５分間加温して菌体を溶解した。次に、フェノール・
クロロホルム・イソアミルアルコール（２５：２４：
１，Ｖ／Ｖ）２００μリットル加え激しく振とうした
後、１２０００ＲＰＭ（１１０００×ｇ）で１０〜１５
分間遠心分離する。Lysozyme powder was added to 0.15M NaCl1,
Comb with a solution of 0.1 M EDTA (pH 8.0) 5
Add 0 μl and leave at room temperature for 5 minutes, then 20% SDS
(Sodium lauryl sulfate) 30μl addition 60 ℃
The cells were heated for 5 minutes to dissolve the cells. Next, phenol
Chloroform / isoamyl alcohol (25:24:
1, V / V) 200 μl and shake vigorously, then 10-15 at 12000 RPM (11000 × g)
Centrifuge for minutes.
【００５２】ＤＮＡは水性液体層（上層）に、変性蛋白
質は水性液体層と有機液体層（下層）との中間層に綿状
の白い層をつくるので、その白い層を吸い込まないよう
にＤＮＡ層を注意深く口の広いピペットを用いて静かに
吸い取り、新しいマイクロチューブに移した。この操作
には、時間がかかりかつ熟練を必要とするから大量処理
は困難である。Since DNA forms a cotton-like white layer in the aqueous liquid layer (upper layer) and denatured protein in the intermediate layer between the aqueous liquid layer and the organic liquid layer (lower layer), the DNA layer should be prevented from inhaling the white layer. Was gently aspirated with a wide-mouthed pipette and transferred to a new microtube. This operation is time-consuming and requires skill, so that mass processing is difficult.
【００５３】冷エタノール４００μリットルを加えよく
混合した後、１２０００ＲＰＭ（１１０００×ｇ）で１
０〜１５分間遠心して核酸を沈澱させ、デカンテーショ
ンで静かに上清を除去した後、ペレットに７０％のエタ
ノール１ミリリットルを静かに加え１２０００ＲＰＭ
（１１０００×ｇ）で５分間遠心してデカンテーション
で静かに上清を除去し、乾燥させた後、０．１×ＳＳＣ
（１５０ｍＭ ＮａＣｌと１５ｍＭクエン酸三ナトリウ
ム）を加えて核酸を溶解した。このときに抽出・精製し
た核酸の回収率と純度を実施例１と同様に測定し、表１
に示した。400 μl of cold ethanol was added and mixed well, and then 1 at 12000 RPM (11000 × g).
After centrifuging for 0 to 15 minutes to precipitate the nucleic acid and gently removing the supernatant by decantation, 1 ml of 70% ethanol was gently added to the pellet at 12000 RPM.
Centrifuge at (11000 × g) for 5 minutes, gently remove the supernatant by decantation, dry, then 0.1 × SSC
(150 mM NaCl and 15 mM trisodium citrate) was added to dissolve the nucleic acids. At this time, the recovery rate and the purity of the extracted and purified nucleic acid were measured in the same manner as in Example 1, and Table 1
It was shown to.
【００５４】[0054]
【表１】 [Table 1]
【００５５】実施例２ 一夜培養した緑膿菌（Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を
５０ｍＭのグルコース、１０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．
０）、２５ｍＭのトリスー塩酸（ｐＨ８．０）の溶解で
９．４×１０9 ｃｅｌｌｓ／ミリリットルに調製し、被
験菌液とした。Example 2 Pseudomonas aeruginosa cultured overnight was treated with 50 mM glucose, 10 mM EDTA (pH 8.
0), 25 mM Tris-hydrochloric acid (pH 8.0) was dissolved to prepare 9.4 × 10 9 cells / ml, which was used as a test bacterial solution.
【００５６】この被験菌液１ミリリットルをマイクロチ
ューブ（１．５ミリリットル〜２．０ミリリットル）に
移し、１２０００ＲＰＭ（１１０００×ｇ）で３０秒〜
１分間の遠心で上清を除去して、５分間室温に放置し
た。1 ml of this test bacterial solution was transferred to a microtube (1.5 ml to 2.0 ml), and 30 seconds to 12000 RPM (11000 × g).
The supernatant was removed by centrifugation for 1 minute and left at room temperature for 5 minutes.
【００５７】放置後、実施例１と同様に操作をして核酸
をデカンテーションで分離したのち、１２０００ＲＰＭ
（１１０００×ｇ）で３０秒〜１分間の遠心で上清を除
去して、５分間室温に放置した。After leaving it to stand, the same operation as in Example 1 was performed to separate the nucleic acid by decantation.
The supernatant was removed by centrifugation at (11000 xg) for 30 seconds to 1 minute, and the mixture was left at room temperature for 5 minutes.
【００５８】放置後、実施例１と同様に菌体を処理して
核酸をデカンテーションで分離したのち、この分離した
水層の１／１０量に相当する量の３Ｍの酢酸ナトリウム
を加え、さらに同量のイソプロピルアルコールを加え軽
く攪拌した後、１２０００ＲＰＭ（１１０００×ｇ）で
１０〜１５分間遠心して核酸を沈澱させ、デカンテーシ
ョンで静かに上清を除去した後、ペレットに７０％のエ
タノール１ミリリットルを静かに加え１２０００ＲＰＭ
（１１０００×ｇ）で５分間遠心してデカンテーション
で静かに上清を除去し、０．１×ＳＳＣ（１５０ｍＭ
ＮａＣｌと１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）に溶解させ
た。After standing, the cells were treated in the same manner as in Example 1 to separate the nucleic acid by decantation, and then 3M sodium acetate was added in an amount corresponding to 1/10 of the separated aqueous layer. After adding the same amount of isopropyl alcohol and gently stirring, centrifuge at 12000 RPM (11000 xg) for 10 to 15 minutes to precipitate the nucleic acid, and gently decant the supernatant to remove the supernatant, and then add 1 ml of 70% ethanol to the pellet. Gently add 12000 RPM
Centrifuge at (11000 xg) for 5 minutes and gently remove the supernatant by decantation to obtain 0.1 x SSC (150 mM).
NaCl and 15 mM trisodium citrate).
【００５９】この時、抽出・精製した核酸の回収率と純
度を測定し、表２に示した。なお、分離・精製したＤＮ
Ａの純度はＡ234/260 とＡ260/280 の比率で測定した。At this time, the recoveries and purities of the extracted and purified nucleic acids were measured and are shown in Table 2. The separated and purified DN
The purity of A was measured by the ratio of A 234/260 and A 260/280 .
【００６０】このとき抽出・精製した核酸の回収率と純
度は、比較例２のＳＤＳ−フェノール法と同等であっ
た。At this time, the recovery rate and the purity of the extracted and purified nucleic acid were similar to those of the SDS-phenol method of Comparative Example 2.
【００６１】比較例２ 実施例２と比較するために、比較例１と同様に従来公知
のＳＤＳ−フェノール法を用いて実験した。このときに
抽出・精製した核酸の回収率と純度を実施例２と同様に
測定し、表２に示した。Comparative Example 2 In order to compare with Example 2, the same experiment as in Comparative Example 1 was carried out using the conventionally known SDS-phenol method. The recoveries and purities of the extracted and purified nucleic acids at this time were measured in the same manner as in Example 2 and are shown in Table 2.
【００６２】[0062]
【表２】 [Table 2]
【００６３】実施例３ 一夜培養した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を滅菌生理食塩水
等で１×１０10ｃｅｌｌｓ／ミリリットルに調製し、被
験菌液とした。この被験菌液１ミリリットルをマイクロ
チューブ（１．５ミリリットル〜２．０ミリリットル）
に移し１２０００ＲＰＭ（１１０００×ｇ）、３０秒〜
１分間の遠心で上清を除去して、菌体を５０ｍＭのグル
コース、１０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、２５ｍＭ
のトリスー塩酸（ｐＨ８．０）の溶液１５０μリットル
に懸濁し、５分間室温に放置した。Example 3 Escherichia coli (E. coli) cultured overnight was prepared at 1 × 10 10 cells / milliliter with a sterilized physiological saline solution and used as a test bacterial solution. 1 ml of this test bacterial solution was added to a microtube (1.5 ml to 2.0 ml).
12000 RPM (11000 xg), 30 seconds ~
The supernatant was removed by centrifugation for 1 minute, and the bacterial cells were treated with 50 mM glucose, 10 mM EDTA (pH 8.0), 25 mM.
Was suspended in 150 μl of a solution of Tris-hydrochloric acid (pH 8.0), and left at room temperature for 5 minutes.
【００６４】放置後、菌体を溶解するために５Ｍのグア
ニジンチオシネート、５％のラウロイル・サルコシン・
ナトリウム、２５ｍＭクエン酸ナトリウムの溶液を１５
０μリットル加えた。After standing, 5M guanidine thiocinate, 5% lauroyl sarcosine
Sodium, 25 mM sodium citrate solution 15
0 μl was added.
【００６５】次に、２．５％（Ｗ／Ｖ）のＢＥＮＴＯＮ
Ｅ ＬＴを含むフェノール・クロロホルム・イソアミル
アルコール（２５：２４：１，Ｖ／Ｖ）７００μリット
ルと０．１％（Ｗ／Ｖ）のＳＤＳを含む１．０Ｍのジメ
チルアミン４００μリットルを加え激しく振とうした
後、１２０００ＲＰＭ（１１０００×ｇ）で１０〜１５
分間遠心分離した。Next, 2.5% (W / V) BENTON
Add 700 μl of phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25: 24: 1, V / V) containing ELT and 400 μl of 1.0 M dimethylamine containing 0.1% (W / V) SDS and shake vigorously. After that, 10-15 at 12000 RPM (11000 × g)
Centrifuge for minutes.
【００６６】遠心分離後、上層（水性液体層）と下層
（高比重有機液体層）の境界面に非流動性凝集層が形成
されるので、マイクロチューブで傾斜（デカンテーショ
ン）させて上層のＤＮＡを含む水性液体層を新しいマイ
クロチューブに移した。After centrifugation, a non-fluidic aggregation layer is formed at the boundary between the upper layer (aqueous liquid layer) and the lower layer (high specific gravity organic liquid layer), so the DNA of the upper layer is decanted with a microtube. The aqueous liquid layer containing was transferred to a new microtube.
【００６７】水性液体層の１／１０量に相当する量の３
Ｍの酢酸ナトリウムを加え、さらに同量のイソプロピル
アルコールを加え軽く撹拌した後、１２０００ＲＰＭ
（１１０００×ｇ）で１０〜１５分間遠心して核酸を沈
澱させ、デカンテーションで静かに上清を除去した後、
ペレットに７０％のエタノール１ミリリットルを静かに
加え１２０００ＲＰＭ（１１０００×ｇ）で５分間遠心
してデカンテーションで静かに上清を除去し、乾燥させ
た後、０．１×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌと１５ｍ
Ｍクエン酸三ナトリウム）を加えて核酸を溶解した。An amount of 3 corresponding to 1/10 of the amount of the aqueous liquid layer.
M sodium acetate was added, the same amount of isopropyl alcohol was further added, and the mixture was stirred lightly, then 12000 RPM
After precipitating the nucleic acid by centrifugation at (11000 × g) for 10 to 15 minutes and gently removing the supernatant by decantation,
Gently add 1 ml of 70% ethanol to the pellet, centrifuge at 12000 RPM (11000 xg) for 5 minutes, gently remove the supernatant by decantation, and dry, then dry with 0.1 x SSC (150mM NaCl and 15mM).
M trisodium citrate) was added to dissolve the nucleic acid.
【００６８】なお、抽出・精製した核酸の回収率と純度
を測定し、表３に示した。分離・精製したＤＮＡの純度
はＡ234/260 とＡ260/280 の比率で測定した。このとき
抽出・精製した核酸の純度は、比較例３のＳＤＳ−フェ
ノール法と同等であった。The recoveries and purities of the extracted and purified nucleic acids were measured and are shown in Table 3. The purity of the separated and purified DNA was measured by the ratio of A 234/260 and A 260/280 . The purity of the nucleic acid extracted and purified at this time was equivalent to that of the SDS-phenol method of Comparative Example 3.
【００６９】比較例３ 実施例３と比較するために、比較例１と同様に従来公知
のＳＤＳ−フェノール法を用いて実験を行った。このと
きに抽出・精製した核酸の回収率と純度を実施例３と同
様に測定し、表３に示した。Comparative Example 3 In order to compare with Example 3, an experiment was conducted using the conventionally known SDS-phenol method as in Comparative Example 1. The recoveries and purities of the nucleic acids extracted and purified at this time were measured in the same manner as in Example 3 and are shown in Table 3.
【００７０】[0070]
【表３】 [Table 3]
【００７１】実施例４ 一夜培養した緑膿菌（Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を
５０ｍＭのグルコース、１０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．
０）、２５ｍＭのトリース塩酸（ｐＨ８．０）の溶液で
９．２×１０9 ｃｅｌｌｓ／ミリリットルに調製し、被
験菌液とした。Example 4 Pseudomonas aeruginosa cultured overnight was treated with 50 mM glucose, 10 mM EDTA (pH 8.
0), a solution of 25 mM Trith hydrochloric acid (pH 8.0) was adjusted to 9.2 × 10 9 cells / ml to prepare a test bacterial solution.
【００７２】この被験菌液１ミリリットルをマイクロチ
ューブ（１．５ミリリットル〜２．０ミリリットル）に
移し、１２０００ＲＰＭ（１１０００×ｇ）で３０秒〜
１分間の遠心で上清を除去して、５分間室温に放置し
た。1 ml of this test bacterial solution was transferred to a microtube (1.5 ml to 2.0 ml), and 30 seconds to 12,000 RPM (11000 × g).
The supernatant was removed by centrifugation for 1 minute and left at room temperature for 5 minutes.
【００７３】放置後、実施例３と同様に操作をして核酸
を抽出・精製した後、０．１×ＳＳＣ（１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌと１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）に溶解させ
た。After leaving the mixture to stand, the nucleic acid was extracted and purified in the same manner as in Example 3, and then 0.1 × SSC (150 mM N
aCl and 15 mM trisodium citrate).
【００７４】このときに抽出・精製した核酸の回収率と
純度を測定し、表４に示した。なお、分離・精製したＤ
ＮＡの純度はＡ234/260 とＡ260/280 の比率で測定し
た。At this time, the recoveries and purities of the extracted and purified nucleic acids were measured and are shown in Table 4. The separated / purified D
The purity of NA was measured by the ratio of A 234/260 and A 260/280 .
【００７５】このとき抽出・精製した核酸の純度は、蛋
白質や多糖類の混在がほとんど認められず、比較例４の
ＳＤＳ−フェノール法と同等であった。At this time, the purity of the extracted and purified nucleic acid was almost the same as that of the SDS-phenol method of Comparative Example 4 with almost no inclusion of proteins and polysaccharides.
【００７６】比較例４ 実施例４と比較するために、比較例１と同様に従来公知
のＳＤＳ−フェノール法を用いて実験を行った。このと
きに抽出・精製した核酸の回収率と純度を実施例４と同
様に測定し、表４に示した。Comparative Example 4 In order to compare with Example 4, the same experiment as in Comparative Example 1 was conducted by using the conventionally known SDS-phenol method. The recoveries and purities of the extracted and purified nucleic acids at this time were measured in the same manner as in Example 4, and are shown in Table 4.
【００７７】[0077]
【表４】 [Table 4]
【００７８】実施例５ 培養したＣＨＯ ｃｅｌｌ（Carcinoma Hamster Ovary
）をＰＢＳ等で３．７×１０6 ｃｅｌｌｓ／ミリリッ
トルに調製し、被験菌液とした。Example 5 Cultured CHO cell (Carcinoma Hamster Ovary)
Was prepared at 3.7 × 10 6 cells / ml with PBS or the like, and used as a test bacterial solution.
【００７９】この被験菌液１ミリリットルをマイクロチ
ューブ（１．５ミリリットル〜２．０ミリリットル）に
移し、３０００ＲＰＭ、１分間〜５分間の遠心で上清を
除去して、細胞を５０ｍＭのグルコース、１０ｍＭのＥ
ＤＴＡ（ｐＨ８．０）、２５ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ
８．０）の溶液１００μリットルに懸濁し、５分間室温
に放置した。1 ml of this test bacterial solution was transferred to a microtube (1.5 ml to 2.0 ml), the supernatant was removed by centrifugation at 3000 RPM for 1 minute to 5 minutes, and the cells were mixed with 50 mM glucose and 10 mM. E
DTA (pH 8.0), 25 mM Tris-hydrochloric acid (pH
The solution of 8.0) was suspended in 100 μl and left at room temperature for 5 minutes.
【００８０】放置後、細胞を溶解するために５Ｍのグア
ニジンチオシネート、５％（Ｗ／Ｖ）のラウロイル・サ
ルコシン・ナトリウム、２５ｍＭのクエン酸ナトリウム
の溶液１５０μリットル加えた。After standing, 150 μl of a solution of 5 M guanidine thiocinate, 5% (W / V) lauroyl sarcosine sodium, 25 mM sodium citrate was added to lyse the cells.
【００８１】次に、３．６％（Ｗ／Ｖ）のＢＥＮＴＯＮ
Ｅ ＳＤ−３を含むクロロホルム：ｎ−ブチルアルコー
ル（２４：１，Ｖ／Ｖ）７００μリットルと滅菌蒸留水
４００μリットルを加え、激しく振とうした後、１２０
００ＲＰＭ（１１０００×ｇ）で１０〜１５分間遠心分
離した。遠心分離後、上層（水性液体層）と下層（高比
重有機液体層）の境界面に非流動清凝集層が形成される
ので、マイクロチューブを傾斜（デカンテーション）さ
せて上層のＤＮＡを含む水性液体層を新しいマイクロチ
ューブに移した。Next, 3.6% (W / V) BENTON
After adding 700 μl of chloroform: n-butyl alcohol (24: 1, V / V) containing ESD-3 and 400 μl of sterile distilled water and shaking vigorously, 120
Centrifuge at 00 RPM (11000 xg) for 10-15 minutes. After centrifugation, a non-fluidized clear flocculation layer is formed on the interface between the upper layer (aqueous liquid layer) and the lower layer (high specific gravity organic liquid layer), so the microtube is tilted (decantation) and the aqueous layer containing the DNA in the upper layer is added. The liquid layer was transferred to a new microtube.
【００８２】水層の１／１０量に相当する量の３Ｍの酢
酸ナトリウムを加え、さらに同量のイソプロピルアルコ
ールを加え軽く撹拌した後、１２０００ＲＰＭ（１１０
００×ｇ）で１０〜１５分間遠心して核酸を沈澱させ、
デカンテーションで静かに上清を除去した後、ペレット
に７０％のエタノール１ミリリットルを静かに加え１２
０００ＲＰＭ（１１０００×ｇ）で５分間遠心してデカ
ンテーションで静かに上清を除去し、乾燥させた後、
０．１×ＳＳＣを加えて核酸を溶解した。An amount of 3M sodium acetate corresponding to 1/10 of the amount of the aqueous layer was added, the same amount of isopropyl alcohol was further added, and the mixture was lightly stirred, and then 12000 RPM (110).
Centrifuge at 00 × g) for 10-15 minutes to precipitate the nucleic acid,
After gently removing the supernatant by decantation, gently add 1 ml of 70% ethanol to the pellet.
After centrifuging at 000 RPM (11000 × g) for 5 minutes, gently removing the supernatant by decantation and drying,
The nucleic acid was dissolved by adding 0.1 × SSC.
【００８３】なお、分離・精製したＤＮＡの純度はＡ
234/260 とＡ260/280 の比率で測定し、その結果を表５
に示した。このとき抽出・精製した核酸の回収率と純度
は、比較例５のSDS-フェノール法と同等であった。The purity of the separated and purified DNA is A
Measured at the ratio of 234/260 and A 260/280 , and the result is shown in Table 5.
It was shown to. At this time, the recovery rate and the purity of the extracted and purified nucleic acid were similar to those of the SDS-phenol method of Comparative Example 5.
【００８４】比較例５ 実施例５と比較するために、比較例１と同様に従来公知
のＳＤＳ−フェノール法を用いて比較実験を行った。こ
のときに抽出・精製した核酸の回収率と純度を実施例５
と同様に測定し、表５に示した。Comparative Example 5 In order to compare with Example 5, a comparative experiment was carried out using the conventionally known SDS-phenol method as in Comparative Example 1. At this time, the recovery rate and the purity of the extracted and purified nucleic acid were determined in Example 5.
The measurement was performed in the same manner as in, and shown in Table 5.
【００８５】[0085]
【表５】 [Table 5]
【００８６】続いて、添付図面に基づいて本発明方法の
操作を説明する。図１は、生物材料の破壊と同時に蛋白
質の汚染物質が変性して、核酸および核酸以外の不純物
が分散している水溶液体１１と、生物材料中の汚染物質
等と結合性がありかつ相分配抽出において上層と下層の
境界面で非流動性凝集層を形成して傾斜（デカンテーシ
ョン）又は転倒による核酸の分離を可能ならしめるため
のチキソトロピー性を有する増粘剤を含む高比重有機液
体、または高比重有機液体の混合物、もしくはこれらの
高比重有機液体とアルコールの混合物１２とをマイクロ
チューブＴ１に分離した状態を示す図面である。The operation of the method of the present invention will be described below with reference to the accompanying drawings. FIG. 1 shows an aqueous solution body 11 in which a contaminant of a protein is denatured at the same time that the biological material is destroyed and nucleic acids and impurities other than the nucleic acid are dispersed; In the extraction, a high-density organic liquid containing a thickener having a thixotropic property for forming a non-fluid aggregation layer at the boundary between the upper layer and the lower layer to enable separation of nucleic acids by decantation or inversion, or It is drawing which shows the state which separated the mixture 12 of these high specific gravity organic liquids or these high specific gravity organic liquids and alcohol into the microtube T1.
【００８７】図２は、ＤＮＡを含む水性液体の上層１３
と、遠心分離による遠心力と高比重有機液体の浮力によ
り、蛋白質等と結合したチキソトロピー性を有する増粘
剤が中間層（境界面）に集められ、チキソトロピー性を
有する増粘剤の濃度が高くなり、その増粘効果に伴う粘
性の変化により形成された非流動性凝集層１４と、蛋白
質等の汚染物質を含む高比重有機液体、または高比重有
機液体の混合物、もしくはこれらの高比重有機液体とア
ルコールの混合物の下層１５とに分離した状態を示す図
面である。FIG. 2 shows an upper layer 13 of an aqueous liquid containing DNA.
By virtue of the centrifugal force of centrifugal separation and the buoyancy of the high-density organic liquid, the thixotropic thickener that binds to proteins, etc. is collected in the intermediate layer (boundary surface), and the concentration of the thixotropic thickener is high. And a non-fluidic aggregation layer 14 formed by a change in viscosity accompanying the thickening effect, a high specific gravity organic liquid containing a contaminant such as protein, or a mixture of high specific gravity organic liquids, or a high specific gravity organic liquid thereof. It is drawing which shows the state isolate | separated into the lower layer 15 of a mixture of alcohol and alcohol.
【００８８】図３はデカンテーションで新しいマイクロ
チューブＴ２にＤＮＡを含む水性液体の上層１３を移し
た状態を示す図面である。FIG. 3 is a diagram showing a state in which the upper layer 13 of the aqueous liquid containing DNA is transferred to a new microtube T2 by decantation.
【００８９】[0089]
【発明の効果】精製されたＤＮＡを調製するためには、
通常基本的に細胞の溶解、核酸以外の汚染物質の除
去、核酸の濃縮の３つの操作がある。Industrial Applicability In order to prepare purified DNA,
Generally, there are basically three operations: lysis of cells, removal of contaminants other than nucleic acids, and concentration of nucleic acids.
【００９０】一般的に用いられるＳＤＳ−フェノール法
などの抽出剤では、細胞の溶解にはリゾチームなどの
細胞壁溶解酵素やプロテインナーゼＫ等の蛋白分解酵素
を用いて細胞を破壊するが、本発明においてはこれらの
酵素を用いずに蛋白質等を変性させ細胞を破壊すること
ができるという利点がある。In the commonly used extractant such as the SDS-phenol method, cell wall lysing enzymes such as lysozyme and proteolytic enzymes such as proteinase K are used to lyse cells, but the cells are destroyed in the present invention. Has the advantage that it can denature proteins and destroy cells without using these enzymes.
【００９１】核酸以外の汚染物質の除去では、一般的
に用いられているＳＤＳ−フェノール法などの抽出剤
は、相分配抽出において上層と下層の境界面が不明瞭な
ため上層のＤＮＡを含む水溶液層の分解が困難であった
が、本発明においては上層と下層の境界面で非流動性凝
集層が形成されるため境界面が明瞭になり、なおかつ傾
斜（デカンテーション）によって上層の水溶液層を分離
できるという利点がある。この非流動性凝集層は常温で
形成されるため、特別な装置を必要とせず極めて簡便に
核酸抽出が行なえるものである。For removal of contaminants other than nucleic acids, commonly used extractants such as the SDS-phenol method are aqueous solutions containing upper layer DNA because the boundary between the upper and lower layers is unclear in phase partition extraction. Although it was difficult to decompose the layer, in the present invention, a non-fluid cohesive layer is formed at the boundary between the upper layer and the lower layer, so that the boundary becomes clear, and the upper aqueous solution layer is inclined by decantation. It has the advantage of being separable. Since this non-fluid aggregation layer is formed at room temperature, nucleic acid extraction can be performed very easily without requiring a special device.
【００９２】また、本発明方法は、血液、尿、髄液、
痰、***、細胞、組織、生検標本や細菌、酵母等の微生
物、ウイルス、培養細胞等の広範囲の生物材料に応用可
能で、その利用価値は極めて高いものである。The method of the present invention also comprises blood, urine, cerebrospinal fluid,
It can be applied to a wide range of biological materials such as sputum, semen, cells, tissues, biopsy specimens, microorganisms such as bacteria and yeast, viruses, and cultured cells, and its utility value is extremely high.
【図１】本発明による転倒分取においての核酸を含む水
性液体層の分離の手順を示すもので、マイクロチューブ
における上層と下層の分離状態を示す図面である。FIG. 1 shows a procedure for separating an aqueous liquid layer containing a nucleic acid in an inversion fractionation according to the present invention, and is a drawing showing a separated state of an upper layer and a lower layer in a microtube.
【図２】本発明による転倒分取によっての核酸を含む水
性液体層の分離の手順を示すもので、マイクロチューブ
における上層と下層との界面に非流動性の凝集層が形成
された状態を示す図面である。FIG. 2 shows a procedure for separating an aqueous liquid layer containing nucleic acid by inversion fractionation according to the present invention, showing a state in which a non-fluidic aggregation layer is formed at an interface between an upper layer and a lower layer in a microtube. It is a drawing.
【図３】本発明による転倒分取によっての核酸を含む水
性液体層の分離の手順を示すもので、転倒分取操作によ
って上層を新しいマイクロチューブに移す状態を示す図
面である。FIG. 3 shows a procedure for separating an aqueous liquid layer containing a nucleic acid by tipping and sorting according to the present invention, and is a drawing showing a state in which the upper layer is transferred to a new microtube by the tipping and sorting operation.
１１ 生物材料の破壊と同時に蛋白質の汚染物質が変性
して、核酸および核酸以外の不純物が分散している水性
液体 １２ 生物材料中の汚染物質等と結合性がありかつ相分
配抽出において上層と下層の境界面で非流動性凝集層を
形成して転倒分取による核酸の分離を可能ならしめるた
めのチキソトロピー性を有する増粘剤を含む高比重有機
液体、または高比重有機液体の混合物、もしくはこれら
の高比重有機液体とアルコールの混合物 １３ 核酸を含む水性液体の上層 １４ 遠心分離による遠心力と高比重有機液体の浮力に
より、蛋白質等と結合したチキソトロピー性を有する増
粘剤が中間層（境界面）に集められ、チキソトロピー性
を有する増粘剤の濃度が高くなり、その増粘効果に伴う
粘性の変化により形成された非流動性凝集層 １５ 蛋白質等の汚染物質を含む高比重有機液体、また
は高比重有機液体の混合物、もしくはこれらの高比重有
機液体とアルコールの混合物の下層 Ｔ１，Ｔ２ マイクロチューブ11 Aqueous liquid in which protein contaminants are denatured at the same time as biological material is destroyed, and nucleic acids and impurities other than nucleic acids are dispersed. 12 An upper liquid and a lower liquid that are capable of binding to contaminants in biological materials and in phase partition extraction. A high-density organic liquid or a mixture of high-density organic liquids containing a thickener having a thixotropic property for forming a non-fluid aggregation layer at the boundary surface of the liquid and enabling separation of nucleic acids by tipping separation. Mixture of high specific gravity organic liquid and alcohol 13 Upper layer of aqueous liquid containing nucleic acid 14 Due to centrifugal force due to centrifugation and buoyancy of high specific gravity organic liquid, a thickener having thixotropy that binds to protein etc. is formed in the intermediate layer (boundary surface). Non-fluid aggregation layer 15 formed by the increase in the concentration of the thickener having thixotropy and the change in viscosity associated with the thickening effect. Lower T1 of the high specific gravity organic liquid or a mixture of high specific gravity organic liquid, or a mixture of high specific gravity organic liquid and an alcohol of containing pollutants etc., T2 microtube
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｐ 7055−2Ｊ (72)発明者 杉村 芳文 神奈川県大和市つきみ野１−８−２─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 5 Identification number Internal reference number FI technical display location // G01N 33/50 P 7055-2J (72) Inventor Yoshifumi Sugimura 1-8 Tsukimino, Yamato City, Kanagawa Prefecture -2
Claims (2)
理を行ったのち、この前処理した生物材料にチキソトロ
ピー性を有する増粘剤を含む非親水性の高比重有機液体
と水性液体を加えて混合し、遠心分離後、上層と下層の
境界面に非流動性の凝集層を形成させることにより核酸
を含有する上層を容易に分離し、核酸を抽出することを
特徴とする核酸抽出方法。1. A pretreatment for eluting nucleic acids from a biological material is performed, and then a nonhydrophilic high-density organic liquid containing a thixotropic thickener and an aqueous liquid are added to the pretreated biological material. A method for extracting a nucleic acid, characterized in that the nucleic acid-containing upper layer is easily separated by forming a non-fluidic aggregation layer on the interface between the upper layer and the lower layer after the mixture is mixed and centrifuged, and the nucleic acid is extracted.
ベントナイト有機誘導体を用いる請求項１記載の方法。2. The method according to claim 1, wherein a bentonite organic derivative is used as a thickener having thixotropic properties.
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|---|---|---|---|
| JP4220738A JP2548494B2 (en) | 1992-07-27 | 1992-07-27 | Nucleic acid extraction method |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|
| JPH0646856A true JPH0646856A (en) | 1994-02-22 |
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|---|---|
| JP (1) | JP2548494B2 (en) |
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