JPH0638784A - シアル酸を構成要素とする糖鎖の製造方法 - Google Patents
シアル酸を構成要素とする糖鎖の製造方法Info
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- JPH0638784A JPH0638784A JP6731793A JP6731793A JPH0638784A JP H0638784 A JPH0638784 A JP H0638784A JP 6731793 A JP6731793 A JP 6731793A JP 6731793 A JP6731793 A JP 6731793A JP H0638784 A JPH0638784 A JP H0638784A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 本発明は、シアリル基供与体とシアリル基受
容体とをシアリダーゼの存在下で転移反応を行わせてシ
アル酸を構成要素とする糖鎖を製造する方法である。 【効果】 生体中と重要な役割を担っているシアル酸を
含む糖鎖の新規合成法を提供するものである。本発明に
よれば、α２−６結合したシアリルオリゴ糖及びα２−
３結合したシアリルオリゴ糖が安価な原料により効率的
に製造できる。
容体とをシアリダーゼの存在下で転移反応を行わせてシ
アル酸を構成要素とする糖鎖を製造する方法である。 【効果】 生体中と重要な役割を担っているシアル酸を
含む糖鎖の新規合成法を提供するものである。本発明に
よれば、α２−６結合したシアリルオリゴ糖及びα２−
３結合したシアリルオリゴ糖が安価な原料により効率的
に製造できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、シアル酸を構成要素と
する糖鎖の製造方法に関するものである。
する糖鎖の製造方法に関するものである。
【０００２】本発明は、シアル酸を構成要素とする糖鎖
の新規な製造方法を提供するもので、シアル酸及びこれ
を含む糖鎖の研究に大いに役立つものである。
の新規な製造方法を提供するもので、シアル酸及びこれ
を含む糖鎖の研究に大いに役立つものである。
【０００３】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】シアル
酸とはノイラミン酸のアシル誘導体の総称であって、種
々の糖蛋白質や糖脂質の構成成分として植物を除く生物
界に広く存在している。
酸とはノイラミン酸のアシル誘導体の総称であって、種
々の糖蛋白質や糖脂質の構成成分として植物を除く生物
界に広く存在している。
【０００４】シアル酸は天然には殆ど遊離の形では存在
せず、αグリコシド結合で結合しており、一般に糖蛋白
質やガングリオシドのヘテロオリゴ糖の非還元末端を占
めている。また、コロミン酸などの形でオリゴ糖又は多
糖としても天然界に存在している。シアル酸は、気道、
消化管、尿道、膣などの分泌液中の糖蛋白質に存在して
高い粘度を賦与している。また、シアル酸は、複合糖質
が分解酵素による分解を阻害することから、糖蛋白質の
生体内滞留時間に重要な役割を果たしていることが知ら
れている。このため、糖蛋白質の血中寿命を調節するに
は、目的の糖蛋白質糖鎖にシアル酸残基を自由に結合す
る技術が必要とされている。更に最近、炎症で刺激され
た血管内皮細胞の接着蛋白（セクレチン）と結合するリ
ンパ球側のリガンドは、シアリルルイスＸと呼ばれる糖
鎖であることが分かり、好中球の血管透過を抑制する物
質を求めて、シアル酸を含む糖鎖の合成が試みられてい
る。また糖脂質においては、細胞の認識に関与している
といわれており、やはりシアル酸を持たない糖脂質にシ
アル酸を結合する技術が要望されている。
せず、αグリコシド結合で結合しており、一般に糖蛋白
質やガングリオシドのヘテロオリゴ糖の非還元末端を占
めている。また、コロミン酸などの形でオリゴ糖又は多
糖としても天然界に存在している。シアル酸は、気道、
消化管、尿道、膣などの分泌液中の糖蛋白質に存在して
高い粘度を賦与している。また、シアル酸は、複合糖質
が分解酵素による分解を阻害することから、糖蛋白質の
生体内滞留時間に重要な役割を果たしていることが知ら
れている。このため、糖蛋白質の血中寿命を調節するに
は、目的の糖蛋白質糖鎖にシアル酸残基を自由に結合す
る技術が必要とされている。更に最近、炎症で刺激され
た血管内皮細胞の接着蛋白（セクレチン）と結合するリ
ンパ球側のリガンドは、シアリルルイスＸと呼ばれる糖
鎖であることが分かり、好中球の血管透過を抑制する物
質を求めて、シアル酸を含む糖鎖の合成が試みられてい
る。また糖脂質においては、細胞の認識に関与している
といわれており、やはりシアル酸を持たない糖脂質にシ
アル酸を結合する技術が要望されている。
【０００５】しかしながら、シアル酸を含む糖鎖の合成
は、一部のものが化学合成法あるいは酵素法によりなさ
れているに過ぎないのが現状である。
は、一部のものが化学合成法あるいは酵素法によりなさ
れているに過ぎないのが現状である。
【０００６】すなわち、まず化学合成法においては、シ
アル酸を他の糖鎖に結合する技術自体については報告さ
れているものの、シアリル基をα結合で他の糖に結合す
ることは困難であって、それには保護基の結合及び脱離
をくり返し行う必要があり、その結果、行程が極めて長
くなり、したがって、化学合成法は特に工業的な大量生
産には不利であり、既に、工業的な大量生産に結びつく
方法は未だに報告されていない。
アル酸を他の糖鎖に結合する技術自体については報告さ
れているものの、シアリル基をα結合で他の糖に結合す
ることは困難であって、それには保護基の結合及び脱離
をくり返し行う必要があり、その結果、行程が極めて長
くなり、したがって、化学合成法は特に工業的な大量生
産には不利であり、既に、工業的な大量生産に結びつく
方法は未だに報告されていない。
【０００７】一方、酵素を用いた合成法としては、２種
類の方法が知られている。一つは転移酵素を用いる方法
であって、ＣＭＰ−ノイラミン酸を基質として、シアル
酸転移酵素（シアリルトランスフェラーゼ）により、シ
アリル基を他の糖鎖に転移させる反応である。しかしな
がら、転移酵素は動物臓器に含まれているものであっ
て、これを大量に取得するには遺伝子工学的手法で微生
物あるいは動物細胞等で発現させる必要がある。また、
この反応における基質であるＣＭＰ−ノイラミン酸は、
化学合成法あるいは酵素合成法で製造されるが、いずれ
も容易な反応ではないために高価である。
類の方法が知られている。一つは転移酵素を用いる方法
であって、ＣＭＰ−ノイラミン酸を基質として、シアル
酸転移酵素（シアリルトランスフェラーゼ）により、シ
アリル基を他の糖鎖に転移させる反応である。しかしな
がら、転移酵素は動物臓器に含まれているものであっ
て、これを大量に取得するには遺伝子工学的手法で微生
物あるいは動物細胞等で発現させる必要がある。また、
この反応における基質であるＣＭＰ−ノイラミン酸は、
化学合成法あるいは酵素合成法で製造されるが、いずれ
も容易な反応ではないために高価である。
【０００８】また、酵素法のもう一つの反応とは、加水
分解酵素であるシアリダーゼの逆反応である脱水縮合反
応によってシアル酸含有糖鎖を合成しようとする試みで
あるが、現在発表されているシアル酸とラクトースの脱
水縮合反応によるシアリルラクトース合成の反応収率は
１％以下であり、実用化にはほど遠い。つまり、この方
法では、選択性が低いために、目的の結合の化合物以外
の物質が、しかも多量に副生してしまうからである。
分解酵素であるシアリダーゼの逆反応である脱水縮合反
応によってシアル酸含有糖鎖を合成しようとする試みで
あるが、現在発表されているシアル酸とラクトースの脱
水縮合反応によるシアリルラクトース合成の反応収率は
１％以下であり、実用化にはほど遠い。つまり、この方
法では、選択性が低いために、目的の結合の化合物以外
の物質が、しかも多量に副生してしまうからである。
【０００９】以上のように、生体内の糖蛋白質や糖脂質
中の糖鎖において、シアル酸残基は生理活性に重要な役
割を占めており、また糖鎖と生理活性の関連の研究のた
めに簡便な合成法が求められているにも拘らず、未だに
確立された方法がないのが現状である。
中の糖鎖において、シアル酸残基は生理活性に重要な役
割を占めており、また糖鎖と生理活性の関連の研究のた
めに簡便な合成法が求められているにも拘らず、未だに
確立された方法がないのが現状である。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らはこのような
現状に鑑みて鋭意研究を行った結果、加水分解酵素であ
るシアリダーゼの示す転移活性を利用して、シアル酸２
量体の非還元末端のシアル酸を他の糖鎖に転移させるこ
とにより、シアル酸が結合した糖鎖を合成することがで
きることを見い出し、この新知見に基づいて本発明を完
成させた。
現状に鑑みて鋭意研究を行った結果、加水分解酵素であ
るシアリダーゼの示す転移活性を利用して、シアル酸２
量体の非還元末端のシアル酸を他の糖鎖に転移させるこ
とにより、シアル酸が結合した糖鎖を合成することがで
きることを見い出し、この新知見に基づいて本発明を完
成させた。
【００１１】従来行われてきたシアリダーゼ加水分解の
逆反応である脱水縮合反応が、基質としてシアル酸
（Ｘ）とシアリル基受容体（Ｙ）とから、 Ｘ＋Ｙ→Ｘ−Ｙ＋Ｈ2Ｏ の形でシアル酸を有する糖鎖を生成するのに対して、本
発明ではシアリル基供与体（Ｘ−Ｚ）とシアリル基受容
体とからシアリダーゼの転移反応によって、すなわち、 Ｘ−Ｚ＋Ｙ→Ｘ−Ｙ＋Ｚ の形でシアル酸を有する糖鎖を生成するのであって、前
者とは全く異なる反応である。これから判るように、本
発明方法によるシアル酸を有する糖鎖の製造法は新規な
ものである。
逆反応である脱水縮合反応が、基質としてシアル酸
（Ｘ）とシアリル基受容体（Ｙ）とから、 Ｘ＋Ｙ→Ｘ−Ｙ＋Ｈ2Ｏ の形でシアル酸を有する糖鎖を生成するのに対して、本
発明ではシアリル基供与体（Ｘ−Ｚ）とシアリル基受容
体とからシアリダーゼの転移反応によって、すなわち、 Ｘ−Ｚ＋Ｙ→Ｘ−Ｙ＋Ｚ の形でシアル酸を有する糖鎖を生成するのであって、前
者とは全く異なる反応である。これから判るように、本
発明方法によるシアル酸を有する糖鎖の製造法は新規な
ものである。
【００１２】なお、シアル酸は１５種類以上のものが天
然に知られており、本発明においては、それらのうちで
最も広く生物界に見出されるＮ−アセチルノイラミン酸
を転移させる反応を記載しているが、シアリダーゼの基
質となるシアル酸であれば、Ｎ−アセチルノイラミン酸
以外のシアル酸も転移させることが可能である。
然に知られており、本発明においては、それらのうちで
最も広く生物界に見出されるＮ−アセチルノイラミン酸
を転移させる反応を記載しているが、シアリダーゼの基
質となるシアル酸であれば、Ｎ−アセチルノイラミン酸
以外のシアル酸も転移させることが可能である。
【００１３】シアリル基の供与体としては、シアル酸２
量体、シアル酸のポリマーであるコロミン酸、あるいは
その他合成基質等のシアル酸グリコシド、ノイラミン酸
誘導体が使用されるが、これらに限定されるものではな
く、他のもの例えば、ポリシアル酸の加水分解物あるい
はシアル酸を含有する他の糖鎖、例えば赤血球膜の糖脂
質であっても差し支えない。
量体、シアル酸のポリマーであるコロミン酸、あるいは
その他合成基質等のシアル酸グリコシド、ノイラミン酸
誘導体が使用されるが、これらに限定されるものではな
く、他のもの例えば、ポリシアル酸の加水分解物あるい
はシアル酸を含有する他の糖鎖、例えば赤血球膜の糖脂
質であっても差し支えない。
【００１４】また、シアリル基の受容体として実施例に
は、ラクトース、ガラクトースおよびＮ−アセチルラク
トサミンなどの、ガラクトースを非還元末端に有する糖
鎖が用いられているが、これは天然においてはシアル酸
は必ずガラクトースに結合しているからである。しかし
ながら、天然に存在しない糖鎖を合成するためには、ガ
ラクトースを非還元末端に有しない糖鎖もシアリル基の
受容体として用いることができる。
は、ラクトース、ガラクトースおよびＮ−アセチルラク
トサミンなどの、ガラクトースを非還元末端に有する糖
鎖が用いられているが、これは天然においてはシアル酸
は必ずガラクトースに結合しているからである。しかし
ながら、天然に存在しない糖鎖を合成するためには、ガ
ラクトースを非還元末端に有しない糖鎖もシアリル基の
受容体として用いることができる。
【００１５】更に、加水分解酵素であるシアリダーゼの
由来にも特に限定はない。本実施例に記載されているよ
うに、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎ
ｓ由来及びＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃ
ｉｅｎｓ由来の酵素を用いた場合には、シアリル基が受
容体の糖残基の６位にα２−６結合で結合するが、他の
生物由来のシアリダーゼを適宜選択して用いることによ
り、シアリル基が受容体の糖残基の３位にα２−３結合
した糖鎖を合成することも可能である。
由来にも特に限定はない。本実施例に記載されているよ
うに、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎ
ｓ由来及びＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃ
ｉｅｎｓ由来の酵素を用いた場合には、シアリル基が受
容体の糖残基の６位にα２−６結合で結合するが、他の
生物由来のシアリダーゼを適宜選択して用いることによ
り、シアリル基が受容体の糖残基の３位にα２−３結合
した糖鎖を合成することも可能である。
【００１６】すなわち、例えばウイルス由来のシアリダ
ーゼ（具体例としては、ニューキャッスル病ウイルス由
来のシアリダーゼが挙げられる）を用いて酵素反応を行
うと、α２−３結合したシアリルオリゴ糖を位置選択的
に得ることができる。しかもその際、上記したシアリル
基の供与体としてどのようなものを使用しても、α２−
３結合の位置選択性が損われることはない。
ーゼ（具体例としては、ニューキャッスル病ウイルス由
来のシアリダーゼが挙げられる）を用いて酵素反応を行
うと、α２−３結合したシアリルオリゴ糖を位置選択的
に得ることができる。しかもその際、上記したシアリル
基の供与体としてどのようなものを使用しても、α２−
３結合の位置選択性が損われることはない。
【００１７】したがって、本発明によれば、使用酵素を
変えるだけで、α２−６結合の糖鎖及びα２−３結合の
糖鎖を位置選択的に自由に且つ効率的に合成することが
可能となる。すなわち、本発明によれば、上記したよう
に、例えば細菌起源の酵素を用いることによって、天然
に存在し有用な生理的性質を有するシアル酸を含む糖鎖
の内、α２−６結合の糖鎖を位置選択的に自由に合成す
ることが可能となった。しかしながら、天然にはα２−
６結合のほかにα２−３結合で結合するシアル酸含有糖
鎖もあり、そのようなシアル酸を含有する糖蛋白質ある
いは糖脂質も、生体内では重要な役割をしていることが
知られている。このため、α２−６結合のシアリルオリ
ゴ糖のみでなくα２−３結合したシアリルオリゴ糖の選
択的合成法の確立も同様に望まれていたが、この点も、
上記したように可能となった。
変えるだけで、α２−６結合の糖鎖及びα２−３結合の
糖鎖を位置選択的に自由に且つ効率的に合成することが
可能となる。すなわち、本発明によれば、上記したよう
に、例えば細菌起源の酵素を用いることによって、天然
に存在し有用な生理的性質を有するシアル酸を含む糖鎖
の内、α２−６結合の糖鎖を位置選択的に自由に合成す
ることが可能となった。しかしながら、天然にはα２−
６結合のほかにα２−３結合で結合するシアル酸含有糖
鎖もあり、そのようなシアル酸を含有する糖蛋白質ある
いは糖脂質も、生体内では重要な役割をしていることが
知られている。このため、α２−６結合のシアリルオリ
ゴ糖のみでなくα２−３結合したシアリルオリゴ糖の選
択的合成法の確立も同様に望まれていたが、この点も、
上記したように可能となった。
【００１８】したがって、本発明によれば、α２−３結
合したシアリルオリゴ糖とα２−６結合したシアリルオ
リゴ糖を自由に合成することができる。しかも本発明に
よれば、安価な加水分解酵素であるシアリダーゼと同じ
く安価なシアリル基供与体であるシアル酸２量体からシ
アル酸含有オリゴ糖を各種合成することができ、その工
程の簡素性と相まって、本発明に係る方法は工業的方法
として好適である。
合したシアリルオリゴ糖とα２−６結合したシアリルオ
リゴ糖を自由に合成することができる。しかも本発明に
よれば、安価な加水分解酵素であるシアリダーゼと同じ
く安価なシアリル基供与体であるシアル酸２量体からシ
アル酸含有オリゴ糖を各種合成することができ、その工
程の簡素性と相まって、本発明に係る方法は工業的方法
として好適である。
【００１９】転移反応は、使用するシアリダーゼの至適
温度及び至適ｐＨの下で、反応液の成分をＨＰＬＣ等で
モニターしながら行い、目的とする反応生成物の量が最
大に達した時点で加熱等により反応を停止させる。反応
停止後に酵素を除去し、ＨＰＬＣ等により目的物質を分
取する。
温度及び至適ｐＨの下で、反応液の成分をＨＰＬＣ等で
モニターしながら行い、目的とする反応生成物の量が最
大に達した時点で加熱等により反応を停止させる。反応
停止後に酵素を除去し、ＨＰＬＣ等により目的物質を分
取する。
【００２０】なお、反応溶液にジメチルホルムアミドや
アセトニトリル等の有機溶剤を混合すると収率が向上す
るため、有機溶剤の添加が好ましいが、本発明の必須要
件ではない。
アセトニトリル等の有機溶剤を混合すると収率が向上す
るため、有機溶剤の添加が好ましいが、本発明の必須要
件ではない。
【００２１】以下に本発明の実施例を記載する。
【００２２】
【実施例１】 Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉ
ｎｇｅｎｓ由来のシアリダーゼによるシアリルラクトー
スの合成 シアリル基受容体としてラクトース１水和物３６ｍｇ
を、３０％のジメチルホルムアミドを含む０．２Ｍ酢酸
緩衝液（ｐＨ５．０）１００μｌに溶解した。この溶液
にシアリル基供与体として１０ｍｇのシアル酸２量体お
よびシアリダーゼ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆ
ｒｉｎｇｅｎｓ由来、シグマ社製）１０ｍｇ（３ｕｎｉ
ｔ）を加えて３７℃で１時間混合した。１時間後に反応
液を１００℃に加熱してシアリダーゼを失活させて反応
を停止した。変性した酵素を濾過により除去した後、反
応液をＭｏｎｏ Ｑカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）
を接続したＨＰＬＣで分画した。結果を図１に示す。
ｎｇｅｎｓ由来のシアリダーゼによるシアリルラクトー
スの合成 シアリル基受容体としてラクトース１水和物３６ｍｇ
を、３０％のジメチルホルムアミドを含む０．２Ｍ酢酸
緩衝液（ｐＨ５．０）１００μｌに溶解した。この溶液
にシアリル基供与体として１０ｍｇのシアル酸２量体お
よびシアリダーゼ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆ
ｒｉｎｇｅｎｓ由来、シグマ社製）１０ｍｇ（３ｕｎｉ
ｔ）を加えて３７℃で１時間混合した。１時間後に反応
液を１００℃に加熱してシアリダーゼを失活させて反応
を停止した。変性した酵素を濾過により除去した後、反
応液をＭｏｎｏ Ｑカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）
を接続したＨＰＬＣで分画した。結果を図１に示す。
【００２３】α２−６シアリルラクトースの標品と同じ
保持時間（８．８２分）に溶出されるフラクション（ピ
ークＡ）を集めて濃縮したところ、３．１ｍｇの固形物
が得られた。この物質は、サルモネラ菌由来のシアリダ
ーゼ（シグマ社製）により加水分解されて、シアル酸と
ラクトースを遊離することから、シアル酸がラクトース
にαグリコシド結合していることが判明した。更に、こ
の物質の４００ＭＨｚ1Ｈ ＮＭＲスペクトルを測定し
（図２）、α２−６シアリルラクトースの標品の４００
ＭＨｚ 1Ｈ ＮＭＲスペクトルと比較したところ、一
致した。以上の結果から、本発明方法で得られた本物質
はα２−６結合したシアリルラクトースであることが同
定された。
保持時間（８．８２分）に溶出されるフラクション（ピ
ークＡ）を集めて濃縮したところ、３．１ｍｇの固形物
が得られた。この物質は、サルモネラ菌由来のシアリダ
ーゼ（シグマ社製）により加水分解されて、シアル酸と
ラクトースを遊離することから、シアル酸がラクトース
にαグリコシド結合していることが判明した。更に、こ
の物質の４００ＭＨｚ1Ｈ ＮＭＲスペクトルを測定し
（図２）、α２−６シアリルラクトースの標品の４００
ＭＨｚ 1Ｈ ＮＭＲスペクトルと比較したところ、一
致した。以上の結果から、本発明方法で得られた本物質
はα２−６結合したシアリルラクトースであることが同
定された。
【００２４】なお、1Ｈ ＮＭＲスペクトルは、重水に
溶解したサンプルについて、バリアン社製のＸＬ−４０
０ ＮＭＲスペクトロメーターを用いて測定したもので
ある。
溶解したサンプルについて、バリアン社製のＸＬ−４０
０ ＮＭＲスペクトロメーターを用いて測定したもので
ある。
【００２５】
【実施例２】 Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆ
ａｃｉｅｎｓ由来のシアリダーゼによるシアリルラクト
ースの合成 シアリル基受容体としてラクトース３６ｍｇを、３０％
のアセトニトリルを含む０．２Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．
０）１００μｌに溶解した。この溶液にシアリル基供与
体として１０ｍｇのシアル酸２量体およびシアリダーゼ
（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ
由来、シグマ社製）０．１ｍｌ（１ｕｎｉｔ）を加えて
３７℃で混合した。３時間後に反応液を１００℃に加熱
してシアリダーゼを失活させて反応を停止した。反応液
をＭｏｎｏ Ｑカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を接
続したＨＰＬＣを測定したところ、α２−６シアリルラ
クトース標品と同じ溶出位置（ピークＡ；５．５４分）
に、フリーのシアル酸のピーク（ピークＢ；９．０５
分）の面積の約３％の面積を有する生成物のピークが観
測された（図３）。この結果から、シアル酸がラクトー
スにαグリコシド結合したα２−６シアリルラクトース
が合成されたことが判明した。
ａｃｉｅｎｓ由来のシアリダーゼによるシアリルラクト
ースの合成 シアリル基受容体としてラクトース３６ｍｇを、３０％
のアセトニトリルを含む０．２Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．
０）１００μｌに溶解した。この溶液にシアリル基供与
体として１０ｍｇのシアル酸２量体およびシアリダーゼ
（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ
由来、シグマ社製）０．１ｍｌ（１ｕｎｉｔ）を加えて
３７℃で混合した。３時間後に反応液を１００℃に加熱
してシアリダーゼを失活させて反応を停止した。反応液
をＭｏｎｏ Ｑカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を接
続したＨＰＬＣを測定したところ、α２−６シアリルラ
クトース標品と同じ溶出位置（ピークＡ；５．５４分）
に、フリーのシアル酸のピーク（ピークＢ；９．０５
分）の面積の約３％の面積を有する生成物のピークが観
測された（図３）。この結果から、シアル酸がラクトー
スにαグリコシド結合したα２−６シアリルラクトース
が合成されたことが判明した。
【００２６】
【実施例３】 シアリルガラクトースの合成 シアリル基受容体として７２ｍｇのガラクトースと、シ
アリル基供与体として１０ｍｇのシアル酸２量体を、７
０μｌの０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解し、
これに３０μｌのアセトニトリルを添加した。この溶液
にシアリダーゼ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒ
ｉｎｇｅｎｓ由来、シグマ社製）７ｍｇを加えて３７℃
で２時間反応させた。反応終了後に反応液を１００℃に
加熱してシアリダーゼを失活させて反応を停止し、変性
した酵素を濾過により除去した。その後反応液をＭｏｎ
ｏ Ｑカラムを接続したＨＰＬＣで分画したところ、シ
アル酸２量体の面積強度の２．１％の面積強度に相当す
る生成物のピークが見られた。このピークに相当する画
分を取り、濃縮して得られた固形物の４００ＭＨｚ1Ｈ
ＮＭＲスペクトルを測定したところ（図４；測定条件
及び機器は実施例１と同じ）、α２−６結合に特有のピ
ークが現れた。この結果から、α２−６結合したシアリ
ルガラクトースが生成されたことが確認した。
アリル基供与体として１０ｍｇのシアル酸２量体を、７
０μｌの０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解し、
これに３０μｌのアセトニトリルを添加した。この溶液
にシアリダーゼ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒ
ｉｎｇｅｎｓ由来、シグマ社製）７ｍｇを加えて３７℃
で２時間反応させた。反応終了後に反応液を１００℃に
加熱してシアリダーゼを失活させて反応を停止し、変性
した酵素を濾過により除去した。その後反応液をＭｏｎ
ｏ Ｑカラムを接続したＨＰＬＣで分画したところ、シ
アル酸２量体の面積強度の２．１％の面積強度に相当す
る生成物のピークが見られた。このピークに相当する画
分を取り、濃縮して得られた固形物の４００ＭＨｚ1Ｈ
ＮＭＲスペクトルを測定したところ（図４；測定条件
及び機器は実施例１と同じ）、α２−６結合に特有のピ
ークが現れた。この結果から、α２−６結合したシアリ
ルガラクトースが生成されたことが確認した。
【００２７】
【実施例４】 シアリルＮ−アセチルラクトサミンの合
成 シアリル基受容体とし１１０ｍｇのＮ−アセチルラクト
サミンと、シアリル基供与体として５０ｍｇのシアル酸
２量体を、１５０μｌの０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．
０）に溶解し、これに５０μｌのアセトニトリルを添加
した。この溶液にシアリダーゼ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕ
ｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ由来、シグマ社製）２０ｍ
ｇを加えて３７℃で２時間反応させた。反応終了後に反
応液を１００℃に加熱してシアリダーゼを失活させて反
応を停止し、変性した酵素を濾過により除去した。その
後反応液をＭｏｎｏ Ｑカラムを接続したＨＰＬＣで分
画したところ、シアル酸２量体の面積強度の７．７％の
面積強度に相当する生成物のピークが見られた。このピ
ークに相当する画分を取り、濃縮して得られた固形物の
４００ＭＨｚ 1Ｈ ＮＭＲスペクトルを測定したとこ
ろ（図５；測定条件及び機器は実施例１と同じ）、α２
−６結合に特有のピークが現れた。この結果から、α２
−６結合したシアリルＮ−アセチルラクトサミンが生成
されたことが確認された。
成 シアリル基受容体とし１１０ｍｇのＮ−アセチルラクト
サミンと、シアリル基供与体として５０ｍｇのシアル酸
２量体を、１５０μｌの０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．
０）に溶解し、これに５０μｌのアセトニトリルを添加
した。この溶液にシアリダーゼ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕ
ｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ由来、シグマ社製）２０ｍ
ｇを加えて３７℃で２時間反応させた。反応終了後に反
応液を１００℃に加熱してシアリダーゼを失活させて反
応を停止し、変性した酵素を濾過により除去した。その
後反応液をＭｏｎｏ Ｑカラムを接続したＨＰＬＣで分
画したところ、シアル酸２量体の面積強度の７．７％の
面積強度に相当する生成物のピークが見られた。このピ
ークに相当する画分を取り、濃縮して得られた固形物の
４００ＭＨｚ 1Ｈ ＮＭＲスペクトルを測定したとこ
ろ（図５；測定条件及び機器は実施例１と同じ）、α２
−６結合に特有のピークが現れた。この結果から、α２
−６結合したシアリルＮ−アセチルラクトサミンが生成
されたことが確認された。
【００２８】
【実施例５】 ラクトースを受容体としたα２−３結合
したシアリルラクトースの合成 シアル酸２量体１００ｍｇとラクトース２５０ｍｇを、
５００μｌの０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解
し、この溶液にニューキャッスル病ウィルス由来のシア
リダーゼ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｇｌｙｃｏ Ｓｙｓｔｅｍ
社）０．１ユニットを加えて３７℃で回転混合して３日
間反応を行った。反応液を沸騰水中に５分間置き酵素を
失活させたのち、４５μｍのメンブランをとおして濾過
し、ＨｉＬｏａｄ Ｑカラム（ファルマシア社）を接続
したＨＰＬＣにより分取して目的物を得た。ＨＰＬＣの
条件は０から２０ｍＭの食塩水を２４０分の直線グラデ
ィエントで流した。α２−３結合シアリルラクトース
は、１２５〜１３５分の部分に溶出した。得られた３糖
成分をゲル濾過により脱塩したのち凍結乾燥して重量を
測定したところ、１．５ｍｇであった。これは、反応し
たシアル酸２量体をもとにして計算した理論収率の９％
であった。本化合物の５００ＭＨｚ 1Ｈ ＮＭＲスペ
クトルを図６に示す。
したシアリルラクトースの合成 シアル酸２量体１００ｍｇとラクトース２５０ｍｇを、
５００μｌの０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解
し、この溶液にニューキャッスル病ウィルス由来のシア
リダーゼ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｇｌｙｃｏ Ｓｙｓｔｅｍ
社）０．１ユニットを加えて３７℃で回転混合して３日
間反応を行った。反応液を沸騰水中に５分間置き酵素を
失活させたのち、４５μｍのメンブランをとおして濾過
し、ＨｉＬｏａｄ Ｑカラム（ファルマシア社）を接続
したＨＰＬＣにより分取して目的物を得た。ＨＰＬＣの
条件は０から２０ｍＭの食塩水を２４０分の直線グラデ
ィエントで流した。α２−３結合シアリルラクトース
は、１２５〜１３５分の部分に溶出した。得られた３糖
成分をゲル濾過により脱塩したのち凍結乾燥して重量を
測定したところ、１．５ｍｇであった。これは、反応し
たシアル酸２量体をもとにして計算した理論収率の９％
であった。本化合物の５００ＭＨｚ 1Ｈ ＮＭＲスペ
クトルを図６に示す。
【００２９】
【実施例６】 Ｎ−アセチルラクトサミンを受容体とし
た反応例 シアル酸２量体１００ｍｇとＮ−アセチルラクトサミン
３５０ｍｇを、４００μｌの０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ
７．０）に溶解し、この溶液にニューキャッスル病ウィ
ルス由来のシアリダーゼ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｇｌｙｃｏ
Ｓｙｓｔｅｍ社）０．１ユニットを加えて３７℃で回転
混合して３日間反応を行った。反応液を沸騰水中に５分
間置き酵素を失活させたのち、４５μｍのメンブランを
とおして濾過し、ＨｉＬｏａｄ Ｑカラム（ファルマシ
ア社）を接続したＨＰＬＣにより分取して目的物を得
た。ＨＰＬＣの条件は０から２０ｍＭの食塩水を２４０
分の直線グラディエントで流した。α２−３結合シアリ
ルラクトースは、１３０〜１４０分の部分に溶出した。
得られた３糖成分をゲル濾過により脱塩したのち凍結乾
燥して重量を測定したところ、１．２ｍｇであった。こ
れは、反応したシアル酸２量体をもとにして計算した理
論収率の６％であった。本化合物の５００ＭＨｚ 1Ｈ
ＮＭＲスペクトルを図７に示す。
た反応例 シアル酸２量体１００ｍｇとＮ−アセチルラクトサミン
３５０ｍｇを、４００μｌの０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ
７．０）に溶解し、この溶液にニューキャッスル病ウィ
ルス由来のシアリダーゼ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｇｌｙｃｏ
Ｓｙｓｔｅｍ社）０．１ユニットを加えて３７℃で回転
混合して３日間反応を行った。反応液を沸騰水中に５分
間置き酵素を失活させたのち、４５μｍのメンブランを
とおして濾過し、ＨｉＬｏａｄ Ｑカラム（ファルマシ
ア社）を接続したＨＰＬＣにより分取して目的物を得
た。ＨＰＬＣの条件は０から２０ｍＭの食塩水を２４０
分の直線グラディエントで流した。α２−３結合シアリ
ルラクトースは、１３０〜１４０分の部分に溶出した。
得られた３糖成分をゲル濾過により脱塩したのち凍結乾
燥して重量を測定したところ、１．２ｍｇであった。こ
れは、反応したシアル酸２量体をもとにして計算した理
論収率の６％であった。本化合物の５００ＭＨｚ 1Ｈ
ＮＭＲスペクトルを図７に示す。
【００３０】
【実施例７】 コロミン酸を供与体とした反応例 コロミン酸２０ｍｇとラクトース５０ｍｇを、１００μ
ｌの０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、この
溶液にニューキャッスル病ウィルス由来のシアリダーゼ
（Ｏｘｆｏｒｄ Ｇｌｙｃｏ Ｓｙｓｔｅｍ社）２０ミ
リユニットを加えて３７℃で回転混合して３日間反応を
行った。反応液を沸騰水中に５分間置き酵素を失活させ
たのち、４５μｍのメンブランをとおして濾過し、Ｍｏ
ｎｏ Ｑカラム（ファルマシア社）を接続したＨＰＬＣ
により分析した。ＨＰＬＣの条件は０から２０ｍＭの食
塩水を２０分の直線グラディエントで流した。標品のα
２−３結合シアリルラクトースは７．０分のあたりに溶
出されるが、本反応液を測定した場合も同様に７．０分
にピークが検出された（図８）。加水分解されて生成し
たシアル酸の面積をもとにして計算した理論収率の３％
であった。
ｌの０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、この
溶液にニューキャッスル病ウィルス由来のシアリダーゼ
（Ｏｘｆｏｒｄ Ｇｌｙｃｏ Ｓｙｓｔｅｍ社）２０ミ
リユニットを加えて３７℃で回転混合して３日間反応を
行った。反応液を沸騰水中に５分間置き酵素を失活させ
たのち、４５μｍのメンブランをとおして濾過し、Ｍｏ
ｎｏ Ｑカラム（ファルマシア社）を接続したＨＰＬＣ
により分析した。ＨＰＬＣの条件は０から２０ｍＭの食
塩水を２０分の直線グラディエントで流した。標品のα
２−３結合シアリルラクトースは７．０分のあたりに溶
出されるが、本反応液を測定した場合も同様に７．０分
にピークが検出された（図８）。加水分解されて生成し
たシアル酸の面積をもとにして計算した理論収率の３％
であった。
【００３１】
【実施例８】 合成基質を供与体とした反応例 ２−Ｏ−（ｐ−ニトロフェニル）−Ｎ−アセチル−α−
Ｄ−ノイラミン酸ナトリウム塩（生化学工業（株）製）
１０ｍｇとＮ−アセチルラクトサミン３０ｍｇを、ジメ
チルスルホキシドと０．２Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ６．５）
の混合溶媒（２：８）１ｍｌに溶解し、この溶液にニュ
ーキャッスル病ウィルス由来のシアリダーゼ（Ｏｘｆｏ
ｒｄ Ｇｌｙｃｏ Ｓｙｓｔｅｍ社）４０ミリユニット
を加えて３７℃で回転混合して４８時間反応を行った。
反応液を沸騰水中に５分間置き酵素を失活させたのち、
４５μｍのメンブランをとおして濾過し、Ｍｏｎｏ Ｑ
カラム（ファルマシア社）を接続したＨＰＬＣにより分
析した。ＨＰＬＣの条件は０から１０ｍＭの食塩水を２
０分の直線グラディエントで流した。１０．６７分にピ
ークが検出され（図９）、このピークを分取して1Ｈ
ＮＭＲを測定することにより、α２−３結合シアリル
Ｎ−アセチルラクトサミンと同定された。加水分解され
て生成したシアル酸の面積をもとにして計算した理論収
率の５％であった。
Ｄ−ノイラミン酸ナトリウム塩（生化学工業（株）製）
１０ｍｇとＮ−アセチルラクトサミン３０ｍｇを、ジメ
チルスルホキシドと０．２Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ６．５）
の混合溶媒（２：８）１ｍｌに溶解し、この溶液にニュ
ーキャッスル病ウィルス由来のシアリダーゼ（Ｏｘｆｏ
ｒｄ Ｇｌｙｃｏ Ｓｙｓｔｅｍ社）４０ミリユニット
を加えて３７℃で回転混合して４８時間反応を行った。
反応液を沸騰水中に５分間置き酵素を失活させたのち、
４５μｍのメンブランをとおして濾過し、Ｍｏｎｏ Ｑ
カラム（ファルマシア社）を接続したＨＰＬＣにより分
析した。ＨＰＬＣの条件は０から１０ｍＭの食塩水を２
０分の直線グラディエントで流した。１０．６７分にピ
ークが検出され（図９）、このピークを分取して1Ｈ
ＮＭＲを測定することにより、α２−３結合シアリル
Ｎ−アセチルラクトサミンと同定された。加水分解され
て生成したシアル酸の面積をもとにして計算した理論収
率の５％であった。
【００３２】
【発明の効果】本発明は、加水分解酵素であるシアリダ
ーゼを用いて、シアリル基を含む基質のシアリル基を他
の糖鎖に転移させて、シアル酸含有糖鎖を合成すること
ができるものである。即ち、生体中の糖蛋白質や糖脂質
中の糖鎖において重要な役割を担っているシアル酸を含
むオリゴ糖の簡便な合成法が本発明により確立された。
ーゼを用いて、シアリル基を含む基質のシアリル基を他
の糖鎖に転移させて、シアル酸含有糖鎖を合成すること
ができるものである。即ち、生体中の糖蛋白質や糖脂質
中の糖鎖において重要な役割を担っているシアル酸を含
むオリゴ糖の簡便な合成法が本発明により確立された。
【００３３】本発明によれば、α２−６結合したシアリ
ルオリゴ糖はもとより、生体内でも重要な役割を果たし
ているといわれているα２−３結合したシアリルオリゴ
糖も、位置選択的にしかも他の方法に比較して簡便かつ
安価に合成することが工業的に可能となった。
ルオリゴ糖はもとより、生体内でも重要な役割を果たし
ているといわれているα２−３結合したシアリルオリゴ
糖も、位置選択的にしかも他の方法に比較して簡便かつ
安価に合成することが工業的に可能となった。
【図１】Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅ
ｎｓ由来のシアリダーゼを用いて反応を行った後の反応
生成物の、Ｍｏｎｏ ＱカラムによるＨＰＬＣチャート
を示す。測定条件は、０分から３分まではＮａＣｌ濃度
０ｍＭで、３分から１２分まではＮａＣｌ濃度１０ｍＭ
で、それ以後はＮａＣｌ濃度で溶出を行った。検出は２
２０ｎｍの吸光度で行った。ピークＡはα２−６シアリ
ルラクトースである。
ｎｓ由来のシアリダーゼを用いて反応を行った後の反応
生成物の、Ｍｏｎｏ ＱカラムによるＨＰＬＣチャート
を示す。測定条件は、０分から３分まではＮａＣｌ濃度
０ｍＭで、３分から１２分まではＮａＣｌ濃度１０ｍＭ
で、それ以後はＮａＣｌ濃度で溶出を行った。検出は２
２０ｎｍの吸光度で行った。ピークＡはα２−６シアリ
ルラクトースである。
【図２】Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅ
ｎｓ由来のシアリダーゼを用いて反応を行った後、Ｍｏ
ｎｏ ＱカラムによるＨＰＬＣでα２−６シアリルラク
トースの標品と同じ保持時間に溶出されるフラクション
を濃縮・固形化して得られた物質を４００ＭＨｚ 1Ｈ
ＮＭＲにかけた時のスペクトルを示す。試料は重水に
溶解して測定した。化学シフトは内部標準としてＴＳＰ
（Ｓｏｄｉｕｍ３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）
ｔｅｔｒａｄｅｕｔｅｒｏ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）を
用いて測定した。
ｎｓ由来のシアリダーゼを用いて反応を行った後、Ｍｏ
ｎｏ ＱカラムによるＨＰＬＣでα２−６シアリルラク
トースの標品と同じ保持時間に溶出されるフラクション
を濃縮・固形化して得られた物質を４００ＭＨｚ 1Ｈ
ＮＭＲにかけた時のスペクトルを示す。試料は重水に
溶解して測定した。化学シフトは内部標準としてＴＳＰ
（Ｓｏｄｉｕｍ３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）
ｔｅｔｒａｄｅｕｔｅｒｏ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）を
用いて測定した。
【図３】Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉ
ｅｎｓ由来シアリダーゼを用いて反応を行った後の反応
生成物のＨＰＬＣチャートを示す。０分から１８分まで
は８ｍＭ ＮａＣｌ濃度で、それ以後は５０ｍＭのＮａ
Ｃｌ濃度で溶出させた。検出方法は図１の場合と同じで
ある。ピークＡはα２−６シアリルラクトース、ピーク
Ｂはフリーのシアル酸である。
ｅｎｓ由来シアリダーゼを用いて反応を行った後の反応
生成物のＨＰＬＣチャートを示す。０分から１８分まで
は８ｍＭ ＮａＣｌ濃度で、それ以後は５０ｍＭのＮａ
Ｃｌ濃度で溶出させた。検出方法は図１の場合と同じで
ある。ピークＡはα２−６シアリルラクトース、ピーク
Ｂはフリーのシアル酸である。
【図４】シアリル基受容体としてガラクトースを、シア
リル基供与体としてシアル酸２量体を用いて反応を行っ
た後、Ｍｏｎｏ ＱカラムによるＨＰＬＣで溶出される
生成物の画分を濃縮・固形化して得られた物質を４００
ＭＨｚ 1Ｈ ＮＭＲにかけた時のスペクトルを示す。
リル基供与体としてシアル酸２量体を用いて反応を行っ
た後、Ｍｏｎｏ ＱカラムによるＨＰＬＣで溶出される
生成物の画分を濃縮・固形化して得られた物質を４００
ＭＨｚ 1Ｈ ＮＭＲにかけた時のスペクトルを示す。
【図５】シアリル基受容体としてＮ−アセチルラクトサ
ミンを、シアリル基供与体としてシアル酸２量体を用い
て反応を行った後、Ｍｏｎｏ ＱカラムによるＨＰＬＣ
で溶出される生成物の画分を濃縮・固形化して得られた
物質を４００ＭＨｚ 1Ｈ ＮＭＲにかけた時のスペク
トルを示す。
ミンを、シアリル基供与体としてシアル酸２量体を用い
て反応を行った後、Ｍｏｎｏ ＱカラムによるＨＰＬＣ
で溶出される生成物の画分を濃縮・固形化して得られた
物質を４００ＭＨｚ 1Ｈ ＮＭＲにかけた時のスペク
トルを示す。
【図６】標品（シグマ社製品、１０％程度のα２−６結
合シアリルラクトースを含む）（上）および酵素合成さ
れたα２−３シアリルラクトース（下）の５００ＭＨｚ
1Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。試料はそれぞれ重水に
溶解して測定した。化学シフトはＴＳＰ（Ｓｏｄｉｕｍ
３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）ｔｅｔｒａｄ
ｅｕｔｅｒｏ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）を基準とした。
次のピークはプレサチュレーション法により消去した。
合シアリルラクトースを含む）（上）および酵素合成さ
れたα２−３シアリルラクトース（下）の５００ＭＨｚ
1Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。試料はそれぞれ重水に
溶解して測定した。化学シフトはＴＳＰ（Ｓｏｄｉｕｍ
３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）ｔｅｔｒａｄ
ｅｕｔｅｒｏ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）を基準とした。
次のピークはプレサチュレーション法により消去した。
【図７】酵素合成されたα２−３結合のシアリルＮ−ア
セチルラクトサミンの５００ＭＨｚ 1Ｈ ＮＭＲスペ
クトルを示す。測定条件は、バリアン社製 ＵＮＩＴＹ
−５００ ＮＭＲ装置を用いた以外は、図１と同じであ
る。
セチルラクトサミンの５００ＭＨｚ 1Ｈ ＮＭＲスペ
クトルを示す。測定条件は、バリアン社製 ＵＮＩＴＹ
−５００ ＮＭＲ装置を用いた以外は、図１と同じであ
る。
【図８】コロミン酸とラクトースとの反応液のＭｏｎｏ
Ｑカラムを用いたＨＰＬＣチャートを示す。測定条件
は、０分から２０分まで食塩濃度を０から１０ｍＭまで
グラディエント変化させて行った。検出は２２０ｎｍの
吸光度で行った。７．００のピークが生成物、１０．３
５のピークがシアル酸である。
Ｑカラムを用いたＨＰＬＣチャートを示す。測定条件
は、０分から２０分まで食塩濃度を０から１０ｍＭまで
グラディエント変化させて行った。検出は２２０ｎｍの
吸光度で行った。７．００のピークが生成物、１０．３
５のピークがシアル酸である。
【図９】合成基質とＮ−アセチルラクトサミンとの反応
液のＨＰＬＣチャートを示す。測定条件は図３と同じ。
１０．６７のピークが生成物、１４．９６のピークがシ
アル酸である。
液のＨＰＬＣチャートを示す。測定条件は図３と同じ。
１０．６７のピークが生成物、１４．９６のピークがシ
アル酸である。
Claims (4)
- 【請求項１】 シアリル基供与体とシアリル基受容体と
をシアリダーゼの存在下で転移反応を行わせることを特
徴とするシアル酸を構成要素とする糖鎖の製造方法。 - 【請求項２】 シアリル基供与体が、シアル酸２量体、
コロミン酸、シアル酸グリコシド、及び／又はノイラミ
ン酸誘導体である、請求項１のシアル酸を構成要素とす
る糖鎖の製造方法。 - 【請求項３】 シアリダーゼが微生物又はウイルス由来
の酵素である、請求項１又は請求項２のシアル酸を構成
要素とする糖鎖の製造方法。 - 【請求項４】 該糖鎖がα２−６結合又はα２−３結合
したシアル酸を構成要素とする糖鎖である、請求項１〜
請求項３のいずれか１項に記載のシアル酸を構成要素と
する糖鎖の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6731793A JPH0638784A (ja) | 1992-03-30 | 1993-03-04 | シアル酸を構成要素とする糖鎖の製造方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4-102324 | 1992-03-30 | ||
| JP10232492 | 1992-03-30 | ||
| JP6731793A JPH0638784A (ja) | 1992-03-30 | 1993-03-04 | シアル酸を構成要素とする糖鎖の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0638784A true JPH0638784A (ja) | 1994-02-15 |
Family
ID=26408509
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6731793A Pending JPH0638784A (ja) | 1992-03-30 | 1993-03-04 | シアル酸を構成要素とする糖鎖の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0638784A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1165541A4 (en) * | 1999-03-12 | 2002-06-05 | Biota Scient Management | COMPOUNDS DIMERED AS NEURAMINIDASE INHIBITORS |
| JP2003522113A (ja) * | 1998-10-27 | 2003-07-22 | ユーエービー リサーチ ファンデイション | シアリダーゼの発色基質とその製造法および使用法 |
-
1993
- 1993-03-04 JP JP6731793A patent/JPH0638784A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003522113A (ja) * | 1998-10-27 | 2003-07-22 | ユーエービー リサーチ ファンデイション | シアリダーゼの発色基質とその製造法および使用法 |
| EP1165541A4 (en) * | 1999-03-12 | 2002-06-05 | Biota Scient Management | COMPOUNDS DIMERED AS NEURAMINIDASE INHIBITORS |
| JP2002539204A (ja) * | 1999-03-12 | 2002-11-19 | バイオタ、サイアンティフィック、マネージメント、プロプライエタリ、リミテッド | 二量体化合物およびニューラミニダーゼ阻害剤として |
| US6548476B1 (en) | 1999-03-12 | 2003-04-15 | Biota Scientific Management Pty. Ltd. | Dimeric inhibitors of influenza neuraminidase |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Effective date: 20040323 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 |