JPH0636739B2 - Alkaline cellulase, microorganism producing the same, and method for producing alkaline cellulase - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規なアルカリセルラーゼ及びこれを生産する
微生物に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel alkaline cellulase and a microorganism producing the same.

〔従来の技術〕[Conventional technology]

従来、繊維素分解酵素セルラーゼの開発は、バイオマス
資源（特にセルロース資源）の有効利用を一大目標とし
て、進められてきており、多くの場合、カビ類にその供
給源を求めてきている。セルラーゼ生産菌として分離さ
れて来た菌株は、多種類にわたり、アルペルギルス属、
ペニシリウム属、トリコデルマ属、フザリウム属、フミ
コーラ属、アクレモニウム属等の糸状菌（カビ）を中心
に、シュウドモナス属、セルロモナス属、ルミノコッカ
ス属、バチルス属等の細菌、更にストレプトマイセス
属、サーモアクチノマイセス属等の放線菌でも報告され
ている。Conventionally, the development of the fibrinolytic enzyme cellulase has been advanced with the major goal of effectively utilizing biomass resources (particularly cellulose resources), and in many cases, molds have been required to supply the sources. The strains that have been isolated as cellulase-producing bacteria are of various genus Alpergillus,
Mainly filamentous fungi (molds) such as Penicillium, Trichoderma, Fusarium, Humicola, Acremonium, etc., and bacteria such as Pseudomonas, Cellulomonas, Luminococcus, Bacillus, etc., further Streptomyces, Thermoactino It has also been reported in actinomycetes such as Myces.

一方、セルラーゼの新規な産業的用途として、衣料用洗
浄剤の配合成分としての利用が検討され注目を集めてい
る（特公昭59-49279号公報、特公昭60-23158号公報、特
公昭60-36240号公報）。しかし、自然界に於いて、微生
物の産生するセルラーゼのほとんどが、中性乃至酸性領
域に於いて最大且つ安定な酵素活性を示す、所謂中性若
しくは酸性セルラーゼに分類されるものであって、衣料
用洗浄剤組成物中に配合するための条件を有するセルラ
ーゼ、すなわち、アルカリ領域で最大活性を示すか、あ
るいはアルカリ耐性を有する、所謂アルカリセルラーゼ
及びアルカリ耐性セルラーゼの存在は極めて少ないのが
実情である。ここでアルカリセルラーゼとは、至適pHが
アルカリ領域にあるものを言う。On the other hand, as a new industrial use of cellulase, its use as a blending component of a detergent for clothes has been studied and attracted attention (Japanese Patent Publication No. 59-49279, Japanese Patent Publication No. 60-23158, and Japanese Patent Publication No. 60-158). No. 36240). However, in the natural world, most cellulases produced by microorganisms are classified as so-called neutral or acid cellulases that show the maximum and stable enzyme activity in the neutral to acidic region, and are used for clothing. The fact is that there are very few cellulases that have the conditions for inclusion in a detergent composition, that is, so-called alkali cellulases and alkali-tolerant cellulases that exhibit maximum activity in the alkaline region or that have alkali resistance. Here, the alkaline cellulase means that the optimum pH is in the alkaline region.

すなわち、従来、衣料用洗浄剤組成物において使用し得
るアルカリセルラーゼ及びアルカリ耐性セルラーゼの生
産方法としては、好アルカリ性バチルス属細菌の培養に
よりセルラーゼＡを採取する方法（特公昭50-28515号公
報）、セルロモナス属に属する好アルカリ性細菌を培養
してアルカリセルラーゼ301−Ａを生産する方法（特開
昭58-224686号公報）、好アルカリ性バチルスNo.1139を
培養してカルボキシメチルセルラーゼを生産する方法(F
ukumori,F.,Kudo,T.and Horikoshi,K.,J.Gen.Microbio
l.,131,3339,(1958))及びストレプトマイセス属の一種
を用いてアルカリセルラーゼを生産する方法（特開昭61
-19483号公報）が報告されているに過ぎず、しかもいず
れも工業的発酵生産に適うものでは無かった。That is, as a conventional method for producing an alkaline cellulase and an alkaline-tolerant cellulase that can be used in a detergent composition for clothes, a method of collecting cellulase A by culturing an alkalophilic Bacillus bacterium (Japanese Patent Publication No. 5028515). A method for producing alkaline cellulase 301-A by culturing an alkalophilic bacterium belonging to the genus Cellulomonas (JP-A-58-224686) and a method for culturing alkalophilic Bacillus No. 1139 to produce carboxymethylcellulase (F
ukumori, F., Kudo, T.and Horikoshi, K., J.Gen.Microbio
L., 131, 3339, (1958)) and a method of producing an alkaline cellulase using a Streptomyces sp.
However, none of them was suitable for industrial fermentative production.

ところが最近、本発明者らは好アルカリ性細菌の一種で
あるバチルス・エスピーKSM−635（Bacillus sp.KSM-63
5,FERM BP-1485,特開昭63-109771号公報）が衣料用洗浄
剤配合成分として適したアルカリセルラーゼＫ（特開昭
63-109776号公報）を収率良く生産すること及び更に培
養条件を選択することにより、より生産性が高まり、ア
ルカリセルラーゼの工業的発酵生産が可能となることを
見出した。更に好アルカリ性菌によらずとも、培養が容
易な中性細菌によってもアルカリセルラーゼ（特開昭63
-137677、240785、240777、240786号公報、特開昭64-37
285号公報，Ｓ．Kawai et al.,Agric.Biol.Chem.,５
２，1425(1988)）及びアルカリ耐性セルラーゼ（特開昭
63-141586、146786、273474、273475、279790号公報、
特開昭64-37286号公報）を生産し得ることも見出されて
いる。However, recently, the present inventors have found that Bacillus sp. KSM-635 (Bacillus sp. KSM-63), which is a kind of alkalophilic bacterium.
5, FERM BP-1485, Japanese Patent Laid-Open No. 63-109771), which is suitable as a blending component for detergents for clothes (Japanese Laid-Open Patent Publication No. Sho 63-109771).
63-109776), it was found that productivity can be further increased and industrial fermentative production of alkaline cellulase can be achieved by further selecting culture conditions. In addition, alkaline cellulases can be produced by neutral bacteria that are easy to culture, regardless of whether they are alkalophilic bacteria (JP-A-63
-137677, 240785, 240777, 240786, JP 64-3737
No. 285, S. Kawai et al. , Agric.Biol.Chem. , 5
2 , 1425 (1988)) and alkali-tolerant cellulase
63-141586, 146786, 273474, 273475, 279790 gazette,
It has also been found that Japanese Patent Application Laid-Open No. 64-37286) can be produced.

〔発明が解決しようとする課題〕[Problems to be Solved by the Invention]

しかしながら、工業的発酵生産に適うアルカリセルラー
ゼの例は現在までのところ上記の例のみであり、更に様
々な特色を有するアルカリセルラーゼ及びその生産菌の
開発が望まれていた。However, the examples of alkaline cellulases suitable for industrial fermentation production have been only the above examples so far, and further development of alkaline cellulases having various characteristics and bacteria producing them has been desired.

〔課題を解決するための手段〕[Means for Solving the Problems]

本発明は、アルカリセルラーゼを生産する微生物を自然
界に求め、鋭意探索を続けて来たが、今般、栃木県那須
群の土壌より採取したバチルス属に属する微生物が、衣
料用洗浄剤組成物の添加成分として有効な新規なアルカ
リセルラーゼを生産することを見出し、本発明を完成し
た。The present invention seeks microorganisms that produce alkaline cellulase in the natural world and has continued to search earnestly, but now, microorganisms belonging to the genus Bacillus collected from soil of Nasu group in Tochigi prefecture are added to the detergent composition for clothing. The present invention has been completed by finding out that a novel alkaline cellulase effective as a component is produced.

従って、本発明は新規なアルカリセルラーゼＫ−５２
０、これを生産する微生物（バチルス・エスピーＫＳＭ
−５２０）及び該アルカリセルラーゼの製造法を提供す
るものである。Therefore, the present invention provides a novel alkaline cellulase K-52.
0, microorganisms that produce this (Bacillus sp. KSM
-520) and a method for producing the alkaline cellulase.

本発明のアルカリセルラーゼを生産する微生物は次のよ
うな菌学的性質を示す。なお、以下において菌株の分類
に用いた培地は次の培地１〜２１の２１種類であり、こ
れらは何れも別途滅菌した炭酸ナトリウム(Na₂CO₃)を1.
0重量％（以下単に％で示す）を含有する。使用した培
地の組成（表示は、％）： 培地１．ニュートリエントブロス，0.8；バクト寒天，
1.5 培地２．ニュートリエントブロス，ニトロフェニル0.8 培地３．ニュートリエントブロス，0.8；バクトゼラチ
ン，20.0；バクト寒天，１．５ 培地４．バクトリトマスミルク，10.5 培地５．ニュートリエントブロス，0.8；KNO₃0.1 培地６．バクトペプトン，0.7；NaC，0.5；ブトウ
糖，0.5 培地７．SIM寒天培地，指示量 培地８．TSI寒天（栄研化学製），指示量 培地９．バクトペプトン，1.5；酵母エキス，0.5；可溶
性澱粉，2.0；K₂HPO₄,0.1；MgSO₄・7H₂O ,0.02；バクト
寒天，1.5 培地10．Koser培地，指示量 培地11．Christensen培地（栄研化学製），指示量 培地12．酵母エキス，0.05；NaSO₄，0.1；KH₂PO₄，0.
1；ブドウ糖，1.0 酵母エキス，0.05；Na₂SO₄，0.1；KH₂PO₄，0.1；ブド
ウ糖，1.0；CaC₂・2H₂O，0.05；MnSO₄・４〜6H₂O，0.
01，FeSO₄・7H₂O，0.001 MgSO₄・7H₂O，0.02 窒素源としては、硝酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、
塩化アンモニウム及びリン酸アンモニウムを総窒素含量
として0.0412N％となる様に上記及びの培地に加え
て用いた。The alkaline cellulase-producing microorganism of the present invention exhibits the following mycological properties. In addition, in the following, 21 kinds of culture media used for classification of strains are the following culture media 1 to 21, and all of these are separately sterilized sodium carbonate (Na ₂ CO ₃ ) 1.
It contains 0% by weight (hereinafter referred to simply as%). Composition of medium used (indication:%): Medium 1. Nutrient Broth, 0.8; Bacto Agar,
1.5 Medium 2. Nutrient Broth, Nitrophenyl 0.8 Medium 3. Nutrient broth, 0.8; Bact gelatin, 20.0; Bact agar, 1.5 medium 4. Bactolithomas milk, 10.5 medium 5. Nutrient Broth, 0.8; KNO ₃ 0.1 medium 6. Bactopeptone, 0.7; NaC, 0.5; butter sugar, 0.5 medium 7. SIM agar medium, indicated amount Medium 8. TSI agar (manufactured by Eiken Chemical), indicated amount of medium 9. Bacto peptone, 1.5; yeast extract, 0.5; soluble _{starch, 2.0; K 2 HPO 4,} 0.1; MgSO 4 · 7H 2 O, 0.02; Bacto agar, 1.5 Medium 10. Koser medium, indicated amount Medium 11. Christensen medium (manufactured by Eiken Chemical), indicated amount of medium 12. Yeast extract, 0.05; NaSO ₄ , 0.1; KH ₂ PO ₄ , 0.
1; glucose, 1.0 yeast _{extract, 0.05; Na 2 SO 4,} 0.1; KH 2 PO 4, 0.1; _{glucose, 1.0; CaC 2 · 2H 2} O, 0.05; MnSO 4 · 4~6H 2 O, 0.
_{01, FeSO 4 · 7H 2 O} , 0.001 MgSO 4 · 7H 2 O, as the 0.02 nitrogen source, sodium nitrate, sodium nitrite,
Ammonium chloride and ammonium phosphate were used by adding them to the above medium so that the total nitrogen content was 0.0412 N%.

培地13．キングＡ培地“栄研”（栄研化学製），指示量 培地14．キングＢ培地“栄研”（栄研化学製），指示量 培地15．尿素培地“栄研”（栄研化学製），指示量 培地16．チトクローム・オキシダーゼ試験用濾紙（日水
製薬製） 培地17．３％過酸化水素水 培地18．バクトペプトン，0.5；酵母エキス，0.5；ブド
ウ糖，1.0；K₂HPO₄，0.1；MgSO₄・7H₂O，0.02 培地19．バクトペプトン，2.7；NaC， 5.5；ブドウ糖，0.5；K₂HPO₄， 0.3；ブロムチモール ブルー， 0.06；バクト寒天，1.5 培地20．(NH₄)₂HPO₄，0.1；KC，0.02；MgSO₄・7H₂O，
0.02；酵母エキス，0.05；糖，1.0 培地21．カゼイン，0.5；バクト寒天，1.5；酵母エキ
ス，0.5；ブドウ糖，1.0；K₂HPO₄，0.1；MgSO₄・7H₂O,
0.02 （菌学的性質） (a)顕微鏡的観察結果 菌体の大きさは0.5〜1.2μｍ×1.2〜5.0μｍの桿菌であ
り、菌体の準端に楕円形の内生胞子（0.7〜1.2μｍ×1.
2〜1.6μｍ）を作る。周鞭毛を有し運動性がある。グラ
ム染色は陽性。Medium 13. King A medium "Eiken" (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.), indicated amount of medium 14. King B medium "Eiken" (manufactured by Eiken Chemical), indicated amount of medium 15. Urea medium "Eiken" (manufactured by Eiken Chemical), indicated amount of medium 16. Filter paper for cytochrome oxidase test (manufactured by Nissui Pharmaceutical) Medium 17.3% hydrogen peroxide water Medium 18. Bacto peptone, 0.5; yeast extract, 0.5; _{glucose, 1.0; K 2 HPO 4,} 0.1; MgSO 4 · 7H 2 O, 0.02 Medium 19. Bactopeptone, 2.7; NaC, 5.5; glucose, 0.5; K ₂ HPO ₄ , 0.3; bromthymol blue, 0.06; bactoagar, 1.5 medium 20. _{(NH 4) 2 HPO 4,} 0.1; KC, 0.02; MgSO 4 · 7H 2 O,
0.02; yeast extract, 0.05; sugar, 1.0 medium 21. Casein, 0.5; Bacto agar, 1.5; yeast extract, 0.5; _{glucose, 1.0; K 2 HPO 4,} 0.1; MgSO 4 · 7H 2 O,
0.02 (Mycological properties) (a) Microscopic observation results The size of the microbial cells is a bacillus with a size of 0.5 to 1.2 μm × 1.2 to 5.0 μm, and an elliptical endospore (0.7 to 1.2 μm × 1.
2 to 1.6 μm). It has periflagellates and is motile. Gram stain is positive.

(b)各種培地に於ける生育状態 肉汁寒天平板培養（培地１） 生育状態は良好。集落の形状は不規則形であり、表面は
円滑、周縁は波状である。又集落の色調は乳白色で光沢
がある。(b) Growth condition in various media Meat agar plate culture (medium 1) Growth condition is good. The shape of the settlement is irregular, the surface is smooth and the periphery is wavy. The color tone of the village is milky white and glossy.

肉汁液体培養（培地２） 生育は、良好。Broth liquid culture (medium 2) Good growth.

肉汁ゼラチン穿刺培養（培地３） 生育は、良好。ゼラチンの液化が認められた。Meat broth gelatin stab culture (medium 3) Growth is good. Liquefaction of gelatin was observed.

リトマスミルク培地（培地４） ミルクの凝固、ペプトン化が認められた。リトマスの変
色は培地がアルカリのため、判定できない。Litmus milk medium (medium 4) Milk coagulation and peptone formation were observed. Discoloration of litmus cannot be determined because the medium is alkaline.

(c)生理学的性質 硝酸塩の還元及び脱窒反応（培地５） 硝酸塩の還元は陽性。脱窒反応は陰性。(c) Physiological properties Nitrate reduction and denitrification (medium 5) Nitrate reduction is positive. Denitrification reaction is negative.

ＭＲテスト（培地６） 陰性、陽性は判定できない。MR test (medium 6) Negative or positive cannot be determined.

ＶＰテスト（培地６） 陽性。VP test (medium 6) positive.

インドールの生成（培地７） 陰性。Formation of indole (medium 7) Negative.

硫化水素の生成（培地８） 陰性。Production of hydrogen sulfide (medium 8) Negative.

澱粉の加水分解（培地９） 陽性。Starch hydrolysis (medium 9) positive.

クエン酸の利用（培地１０，１１） コーサ培地で陽性。クリステンセン培地では、陽性か陰
性か判定きない。Utilization of citric acid (medium 10, 11) Positive in Qosa medium. In Christensen's medium, it cannot be determined whether positive or negative.

無機窒素源の利用（培地１２） 硝酸塩、アンモニウム塩ともに利用する。Use of inorganic nitrogen source (medium 12) Both nitrate and ammonium salts are used.

色素の生成（培地１３，１４） キングＢ培地で黄色色素を生成する。Production of pigment (Medium 13, 14) A yellow pigment is produced in King B medium.

ウレアーゼ（培地１５） 陰性。Urease (medium 15) negative.

オキシターゼ（培地１６） 陽性。Oxidase (medium 16) positive.

カタラーゼ（培地１７） 陽性。Catalase (medium 17) positive.

成育の範囲（培地１８） 生育の温度範囲は１５〜４０℃、生育最適温度範囲は３
０〜３７℃。生育のpH範囲はpH７〜１１、生育最適pHは
pH10.5であった。Growth range (medium 18) The growth temperature range is 15 to 40 ° C, and the optimum growth temperature range is 3
0-37 ° C. The pH range for growth is pH 7-11, and the optimum pH for growth is
The pH was 10.5.

酸素に対する態度 好気性。Attitude toward oxygen Aerobic.

Ｏ−Ｆテスト（培地１９） アルカリ性のため変色は判定できない。OF test (medium 19) Discoloration cannot be determined because of alkaline.

好気状態でのみ生育する。Only grows in aerobic conditions.

糖の利用性（培地２０，＋：生育する−：生育せず） １．Ｌ−アラビノース＋ ２．Ｄ−キシロース＋ ３．Ｄ−グルコース＋ ４．Ｄ−マンノース＋ ５．Ｄ−フラクトース＋ ６．Ｄ−ガラクトース＋ ７．麦芽糖＋ ８．ショ糖＋ ９．乳糖＋ 10．トレハロース＋ 11．Ｄ−ソルビット＋ 12．Ｄ−マンニット＋ 13．イノシット− 14グリセリン＋ 15デンプン＋ 食塩含有培地に於ける生育（培地１を改変） 食塩濃度が７％で生育し、１０％で生育しない。Utilization of sugar (medium 20, +: grows −: does not grow) 1. L-arabinose + 2. D-xylose + 3. D-glucose + 4. D-mannose + 5. D-fructose + 6. D-galactose + 7. Maltose + 8. Sucrose + 9. Lactose + 10. Trehalose + 11. D-Sorbit + 12. D-Mannit + 13. Growth in inosit-14 glycerin + 15 starch + salt-containing medium (modified medium 1) Grows at a salt concentration of 7% and does not grow at 10%.

カゼインの分解（培地２１） 陽性。Casein degradation (medium 21) Positive.

Ｇ＋Ｃ含量（Tm法） 本発明にかかる菌のＤＮＡのＧ＋Ｃ含量は、約37.6mo
％である。G + C content (Tm method) The G + C content of the DNA of the bacterium of the present invention is about 37.6 mo.
%.

以上の菌学的性質に関する検討に基づき、バージーズ・
マニュアル・オブ・システィマティック・バクテリオロ
ジー（Bergey’s Mannual of Systematic Bacteriolog
y）第２巻およびザ・ジーナス・バチルス（“The Genus
Bacillus”Ruth，Ｅ．Gorodon,Agriculture Handbook
No.427,Agricultural Research Service,Ｕ．Ｓ．Depar
tment of Agriculture WashingtonＤ．Ｃ．，(1973)）
を参照し、比較検索した結果、本菌株は有胞子桿菌であ
るバチルス（(Bacillus）属の一種であると認められ
る。しかし、本菌株は中性領域では生育できず、専らア
ルカリ領域で良好な生育を示すことから、最近、Horiko
siとAkiba（“Alkalophilic Microorganism”，Japan S
cientific Society Press (Tokyo),1982年刊）の主張し
ている、所謂好アルカリ性（Alkalophilic）細菌に属
し、従来の中性で生育するバチルス属細菌と区別され
る。Based on the above studies on mycological properties,
Bergey's Mannual of Systematic Bacteriolog
y) Volume 2 and The Genus Bacillus
Bacillus ”Ruth, E. Gorodon, Agriculture Handbook
No.427, Agricultural Research Service, U. S. Depar
tment of Agriculture Washington D. C. ， (1973)）
As a result of a comparative search, it is recognized that this strain is a member of the genus Bacillus ((Bacillus)), which is a spore bacillus. Since it shows growth, Horiko recently
si and Akiba (“Alkalophilic Microorganism”, Japan S
cientific Society Press (Tokyo), published in 1982) and belongs to so-called alkalophilic bacteria, which is distinguished from conventional neutral-growing Bacillus bacteria.

そして、本菌株の上記菌学的性質は、公知の好アルカリ
性バチルスのいずれとも一致しないので、これを新規菌
株と判断して、バチルス・エスピーKSM−５２０と命名
し、工業技術院微生物工業技術研究所に、微工研菌寄第
10483号（FERM P-10483）として寄託した。Since the above-mentioned mycological properties of this strain do not match any of the well-known alkalophilic Bacillus, it was determined as a new strain and named Bacillus sp. KSM-520. In addition to the
Deposited as No. 10483 (FERM P-10483).

本発明のアルカリセルラーゼは、例えば、上記の好アル
カリ性バチルス・エスピーKSM−５２０（FERM P-1048
3）及びこれより誘導された高力価の当該酵素生産性を
有する各種突然変異株を用いる発酵法により製造するこ
とができる。The alkaline cellulase of the present invention is, for example, the above-mentioned alkalophilic Bacillus sp. KSM-520 (FERM P-1048).
It can be produced by a fermentation method using 3) and various mutant strains having high titer of the enzyme productivity derived therefrom.

上記の菌株を用いて本発明のアルカリセルラーゼを得る
には、適当な培地に該菌株を接種し、常法に従って培養
すれば良い。培養培地としては、資化し得る窒素源と炭
素源を適宜組み合わせて含有せしめたものが使用され
る。この炭素源及び窒素源については、特に制限はな
い。例えば、窒素源としては、硝安、硫安、塩安、リン
酸アンモニウム、硝酸ソーダ、コーングルテンミール、
大豆粉、コーンスチープリカー、カザミノ酸、酵母エキ
ス、フォーマメディア、イワシミール、肉エキス、ペプ
トン、ハイプロ、アジパワー、コーンソイビーンミー
ル、コーヒー粕、綿実油粕、カルチベーター、アジプロ
ン、ゼストなどが；また、炭素源としては、籾殻、麸、
濾紙、一般紙類、おが屑等の植物繊維質、廃糖蜜、転化
糖、CMC、アビセル、セルロース綿、キシラン、ペクチ
ン、リボース、アラビノース、キシロース、グルコー
ス、マンノース、フラクトース、ガラクトース、麦芽
糖、庶糖、乳糖、トレハロース、マンニット、ソルビッ
ト、グリセリン、澱粉、酢酸、クエン酸などが挙げられ
る。その他に、リン酸、Mg²⁺、Ca²⁺，Mn²⁺、Zn²⁺，C
o²⁺，Na⁺，K⁺などの無機塩や、必要であれば、無機、有
機微量栄養源を添加することもできる。In order to obtain the alkaline cellulase of the present invention using the above strain, the strain may be inoculated into a suitable medium and cultured according to a conventional method. As the culture medium, a medium containing a combination of an assimilable nitrogen source and a carbon source is used. The carbon source and the nitrogen source are not particularly limited. For example, as the nitrogen source, ammonium nitrate, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, sodium nitrate, corn gluten meal,
Soybean flour, corn steep liquor, casamino acid, yeast extract, foramedia, sardine meal, meat extract, peptone, hypro, ajpower, corn soybean meal, coffee meal, cottonseed oil meal, cultivator, adipron, zest; and carbon. The sources include rice husk, rice,
Filter paper, general paper, vegetable fiber such as sawdust, molasses, invert sugar, CMC, Avicel, cellulose cotton, xylan, pectin, ribose, arabinose, xylose, glucose, mannose, fructose, galactose, maltose, sucrose, lactose, Examples thereof include trehalose, mannitol, sorbit, glycerin, starch, acetic acid, citric acid and the like. In addition, phosphoric acid, Mg ²⁺ , Ca ²⁺ , Mn ²⁺ , Zn ²⁺ , C
Inorganic salts such as o ²⁺ , Na ⁺ , K ⁺ , and if necessary, inorganic and organic micronutrient sources can be added.

斯くして得られた培養物からの目的物質であるアルカリ
セルラーゼの採取及び精製は、一般の酵素の採取及び精
製の手段に準じて行うことができる。即ち、遠心分離又
は濾過等の通常の固液分離手段により菌体を培養物から
除去して粗酵素液を得ることができる。この粗酵素液
は、そのまま使用することもできるが、必要に応じて塩
析法、沈殿法、限外濾過法等の分離手段により粗酵素を
得、さらに公知の方法により精製結晶化して、精製酵素
として使用することも可能である。Collection and purification of the target substance, alkaline cellulase, from the thus obtained culture can be carried out according to a general enzyme collection and purification means. That is, the crude enzyme solution can be obtained by removing the bacterial cells from the culture by a usual solid-liquid separation means such as centrifugation or filtration. This crude enzyme solution can be used as it is, but if necessary, a crude enzyme is obtained by a separation means such as a salting-out method, a precipitation method and an ultrafiltration method, and further purified and crystallized by a known method, and purified. It is also possible to use it as an enzyme.

次に、斯くして得られる本発明の提供する新規酵素、ア
ルカリセルラーゼＫ−５２０の酵素学的性質について説
明する。Next, the enzymatic properties of the thus-obtained novel enzyme of the present invention, alkaline cellulase K-520, will be described.

なお酵素活性の測定は、以下の方法に従って行った。The enzyme activity was measured according to the following method.

(1)CMCアーゼ活性 2.5％CMC（サンローズAO1L．山陽国策パルプ社製）0.4m
、５００mMグリシン緩衝液（pH９）0.2m、及び脱イ
オン水0.3mからなる基質溶液に酵素液0.1mを加え、
３０℃で２０分間反応させた。反応後、３，５−ジニト
ロ−サリチル酸（３，５−dinitro-salicylic acid(DN
S)）法にて、還元糖の定量を行った。即ち、反応液1.0m
にDNS試薬1.0mを加え、５分間、１００℃で加熱発
色させ、冷却後4.0mの脱イオン水を加えて希釈し、波
長５３５nmで比色定量した。酵素の力価は、１分間に１
μmoのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量
を１単位とした。(1) CMCase activity 2.5% CMC (Sunrose AO1L. Sanyo Kokusaku Pulp Co., Ltd.) 0.4m
0.1m of enzyme solution was added to a substrate solution consisting of 0.2m of 500mM glycine buffer (pH 9) and 0.3m of deionized water,
The reaction was carried out at 30 ° C for 20 minutes. After the reaction, 3,5-dinitro-salicylic acid (DN
The reducing sugar was quantified by the S)) method. That is, the reaction solution 1.0m
DNS reagent (1.0 m) was added to the mixture, and color was developed by heating at 100 ° C. for 5 minutes. After cooling, 4.0 m of deionized water was added to dilute, and colorimetric determination was performed at a wavelength of 535 nm. Enzyme titer is 1 per minute
The amount of enzyme that produces a reducing sugar corresponding to μmo glucose was defined as 1 unit.

尚、用いた緩衝液は、次の通りである。The buffer solutions used are as follows.

pH３〜８ マクイルバイン緩衝液 pH８〜１１ グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液 pH１２〜１３ 塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液 (2)ｐ−ニトロフェニルグリコシド及びｐ−ニトロフェ
ニルセロビオシド分解活性 0.8μmoｐ−ニトロフェニルセロビオシド（シグマ社
製）又はｐ−ニトロフェニルグルコシド（シグマ社製）
と５０μmoリン酸緩衝液（pH7.0）又は、１００μmo
グリシン緩衝液（pH９）とを含有する反応液1.0m中
に適当量の酵素液を３０℃で作用させた後、１ＭNa₂CO₃
を0.4m加え、遊離するｐ−ニトロフェノールを４１０
nmで比色定量した。酵素力価は、１分間に１μmoのｐ
−ニトロフェノールを遊離させる酵素量を１単位とし
た。pH3-8 McIlvain buffer pH8-11 Glycine-sodium hydroxide buffer pH12-13 Potassium chloride-sodium hydroxide buffer (2) p-nitrophenyl glycoside and p-nitrophenyl cellobioside degrading activity 0.8 μmop-nitro Phenyl cellobioside (manufactured by Sigma) or p-nitrophenyl glucoside (manufactured by Sigma)
And 50 μmo phosphate buffer (pH 7.0) or 100 μmo
After reacting 1.0 m of a reaction solution containing glycine buffer (pH 9) with an appropriate amount of enzyme solution at 30 ° C., 1 M Na ₂ CO ₃
0.4m was added, and the released p-nitrophenol was added to 410m.
Colorimetric determination in nm. The enzyme titer is p of 1 μmo per minute.
-The amount of enzyme that releases nitrophenol was 1 unit.

(3)アビセル、セルロース粉末、リン酸膨潤セルロー
ス、アルカリ膨潤セルロース及び濾紙分解活性 １０mgアビセル（メルク社製）及び、１００μmoグリ
シン緩衝液（pH９）を含有する反応液1.0m中に適当量
の酵素を加え、３０℃で２８０rpmで振盪しながら反応
させた。反応後、DNS法にて還元糖の定量を行った。酵
素力価は、１分間に１μmoのグルコースに相当する還
元糖を生成する酵素量を１単位とした。(3) Avicel, cellulose powder, phosphoric acid swelling cellulose, alkali swelling cellulose and filter paper degrading activity 10 mg Avicel (manufactured by Merck) and 100 μmo glycine buffer (pH 9) in a reaction solution 1.0m containing an appropriate amount of enzyme In addition, the reaction was carried out at 30 ° C. with shaking at 280 rpm. After the reaction, the reducing sugar was quantified by the DNS method. The enzyme titer was defined as 1 unit of the amount of enzyme that produced a reducing sugar corresponding to 1 μmo of glucose per minute.

その他の活性も、上記の方法に準じて行った。基質とし
ては、東洋濾紙社製のセルロース粉末、セルラーゼ活性
検定用濾紙（東洋No.５１−特）及び、富田等の方法Tom
ita,Y.et al.,：J.Ferment.Technol.,５２，235,1974）
に従って処理したアルカリ膨潤セルロース、リン酸膨潤
セルロースを使用した。Other activities were also performed according to the above method. As the substrate, cellulose powder manufactured by Toyo Roshi Kaisha, Cellulase activity assay filter paper (Toyo No. 51-special) and Tomita's method Tom
ita, Y.et al.,: J.Ferment.Technol ., 52 , 235, 1974)
Alkali swollen cellulose and phosphoric acid swollen cellulose treated according to

(4)β−１，３−；１，４−グルカナーゼ、β−１，３
−グルカナーゼ活性 β−１，３−；１，４−グルカナーゼ、β−１，３−グ
ルカナーゼ活性は、基質としてリケナン（from Usnera
barubata，シグマ社製）及びラミナリン（from Laminar
ia digitata，シグマ社製）を用いて、(3)に準じて活性
を測定した。(4) β-1,3-; 1,4-glucanase, β-1,3
-Glucanase activity β-1,3-; 1,4-glucanase and β-1,3-glucanase activity are lichenan (from Usnera) as a substrate.
barubata , made by Sigma) and Laminarin (from Laminar
The activity was measured according to (3) using ia digitata (manufactured by Sigma).

（酵素学的性質） (1)作用 CMC、セルロース粉末、アビセル等の繊維素によく作用
し、これらを溶解せしめ、還元糖を生成する。(Enzymatic properties) (1) Action It acts well on CMC, cellulose powder, Avicel and other fibrin, and dissolves them to produce reducing sugar.

(2)基質特異性 本酵素の基質特異性の一例を第１表に示した。本酵素
は、CMCの他にも、ラミナリン、リケナン、濾紙、ｐ−
ニトロフェニルグルコシド及びｐ−ニトロフェニルセロ
ビオシドに対して若干の活性を有していた。(2) Substrate specificity An example of the substrate specificity of this enzyme is shown in Table 1. This enzyme is used in addition to CMC, laminarin, lichenan, filter paper, p-
It had some activity towards nitrophenyl glucoside and p-nitrophenyl cellobioside.

(3)作用pH及び至適pH CMCに対する作用pH範囲は、３〜13.0と広範囲であり、
至適作用pHは、8.5〜9.5である。また、7.0〜11.0の範
囲に於いても至適pHに於ける活性の５０％以上の相対活
性を有する（第１図）。 (3) Working pH and optimum pH The working pH range for CMC is as wide as 3 to 13.0,
The optimum working pH is 8.5-9.5. Further, it has a relative activity of 50% or more of the activity at the optimum pH even in the range of 7.0 to 11.0 (Fig. 1).

(4)pH安定性 それぞれのpHで３０℃、１時間保持した後の残存活性を
測定し、pH安定性を調べた。その結果、pH6.0〜11.0の
範囲で極めて安定であり、pH5.0〜11.5に於いても約５
０％以上の活性を維持する（第２図）。(4) pH stability The pH stability was investigated by measuring the residual activity after holding at 30 ° C for 1 hour at each pH. As a result, it is extremely stable in the range of pH 6.0 to 11.0 and about 5 in the range of pH 5.0 to 11.5.
It maintains an activity of 0% or more (Fig. 2).

(5)作用温度及び至適温度 本酵素は、１０〜７５℃の広範囲で作用し、その至適温
度は、５０℃である。又、３５〜６０℃の範囲に於いて
も至適温度での活性の５０％以上を有する（第３図）。(5) Action temperature and optimum temperature The present enzyme acts in a wide range of 10 to 75 ° C, and the optimum temperature is 50 ° C. Further, it has 50% or more of the activity at the optimum temperature even in the range of 35 to 60 ° C (Fig. 3).

(6)温度安定性 グリシン−NaOH緩衝液（pH9.0）中、各温度で１０分間
加熱処理後の残存活性を測定した結果、本酵素は、４０
℃でもほとんど失活せず、５０℃に於いても約５０％の
残存活性を有していた（第４図）。(6) Temperature stability In the glycine-NaOH buffer solution (pH 9.0), the residual activity after heat treatment at each temperature for 10 minutes was measured.
Almost no inactivation even at 0 ° C and about 50% residual activity at 50 ° C (Fig. 4).

(7)分子量 本酵素は、バイオゲルAO,5m（バイオラッド社製）を用
いたゲル濾過法によれば、約１７±１万及び8.0±0.2万
にピークを有する。(7) Molecular Weight This enzyme has peaks at about 17 ± 10,000 and 8.0 ± 20,000 according to the gel filtration method using Biogel AO, 5m (manufactured by Bio-Rad).

(8)金属イオンの影響 各種金属イオン（Na⁺，K⁺，Ca²⁺，Cu²⁺，Co²⁺，Cd²⁺，M
n²⁺，Mg²⁺，Ba²⁺，Ni²⁺，Hg²⁺，Fe²⁺，Pb²⁺，Zn²⁺，Al
³⁺，Fe³⁺，）を活性測定時に共存させてその影響を検討
した結果、Hg²⁺、Cd²⁺、Pb²⁺（各１mM）の添加は、阻害
効果を与え、Co²⁺、Mn²⁺（１mM）の添加は、活性化効果
を与えた。(8) Effects of metal ions Various metal ions (Na ⁺ , K ⁺ , Ca ²⁺ , Cu ²⁺ , Co ²⁺ , Cd ²⁺ , M
n ²⁺ , Mg ²⁺ , Ba ²⁺ , Ni ²⁺ , Hg ²⁺ , Fe ²⁺ , Pb ²⁺ , Zn ²⁺ , Al
³⁺ , Fe ³⁺ ,) coexisted during the activity measurement, and the effect was examined. As a result, the addition of Hg ²⁺ , Cd ²⁺ , Pb ²⁺ (1 mM each) gave an inhibitory effect and Co ²⁺ , Addition of Mn ²⁺ (1 mM) gave an activating effect.

(9)界面活性の影響 本酵素は、0.05％の各種界面活性剤（例えば、LAS、A
S、ES、AOS、SAS、石鹸、ポリオキシエチレンカンダリ
ーアルキルエーテル）の酵素活性の阻害は認められなか
った。(9) Effect of surface activity This enzyme is 0.05% of various surface active agents (for example, LAS, A
No inhibition of enzyme activity of S, ES, AOS, SAS, soap, polyoxyethylene candary alkyl ether) was observed.

(10)プロテアーゼの影響 洗剤用プロテアーゼ、例えば、API−２１（昭和電
工）、マクサターゼ（IBIS）、サビナーゼ、アルカラー
ゼ、エスペラーゼ（ノボ）を活性測定時に共存（0.2AU/
）させ、その影響を調べたところ、何れのプロテアー
ゼに対しても強い耐性を有することが判った。(10) Effect of Protease Detergent protease, for example, API-21 (Showa Denko), Maxatase (IBIS), Savinase, Alcalase, Esperase (Novo) coexist during activity measurement (0.2 AU /
) And examined the effect, it was found to have strong resistance to any protease.

(11)キレート剤の影響 キレート剤であるEDTA、EGTA、トリポリリン酸ソーダ、
ゼオライト、クエン酸等を活性測定時に共存させ、その
影響を検討したが、阻害は認められなかった。(11) Effect of chelating agent Chelating agent EDTA, EGTA, sodium tripolyphosphate,
Zeolites, citric acid, etc. were made to coexist during the activity measurement, and the effect was examined, but no inhibition was observed.

〔発明の効果〕〔The invention's effect〕

本発明のセルラーゼは、アルカリ側に至適pHを有し、広
いpH範囲に於いて安定な新規のアルカリセルラーゼであ
る。更に、本酵素は、界面活性剤、プロテアーゼ、キレ
ート剤等の洗浄剤配合成分によっても殆ど阻害を受け
ず、洗浄剤組成物の配合成分として有利に使用すること
ができるものである。The cellulase of the present invention is a novel alkaline cellulase which has an optimum pH on the alkaline side and is stable in a wide pH range. Further, the present enzyme is hardly inhibited by detergent compounding ingredients such as surfactants, proteases and chelating agents, and can be advantageously used as a compounding ingredient of detergent compositions.

〔実施例〕〔Example〕

以下、実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.

実施例１ 栃木県那須群の土壌薬匙一杯（約0.5ｇ）を滅菌生理食
塩水に懸濁し、８０℃で１０分間熱処理した。この熱処
理液の上清を適当に希釈して、分離用寒天培地（培地
Ａ）に塗布した。次いで、これを３０℃にて３日間培養
し、集落を形成させた。集落の周囲にCMCの溶解に基づ
く透明帯を形成するものを選出し、CMCアーゼ生産菌を
取得した。更に、取得菌を培地Ｂの液体培地に接種し、
３０℃で３日間振盪培養した。培養後、遠心分離した上
清液について、CMCアーゼ活性をpH３〜１３にて測定
し、アルカリセルラーゼ生産菌を選択した。Example 1 A spoonful of soil medicine (about 0.5 g) of Nasu group in Tochigi prefecture was suspended in sterile physiological saline and heat-treated at 80 ° C. for 10 minutes. The supernatant of this heat treatment solution was appropriately diluted and applied to a separation agar medium (medium A). Then, this was cultured at 30 ° C. for 3 days to form a colony. CMCase-producing bacteria were obtained by selecting those that form a transparent zone due to the dissolution of CMC around the settlement. Furthermore, the obtained bacteria are inoculated into the liquid medium of the medium B,
The cells were cultured at 30 ° C. for 3 days with shaking. After culturing, the CMCase activity of the supernatant obtained by centrifugation was measured at pH 3 to 13, and an alkaline cellulase-producing bacterium was selected.

上述の方法により、本発明のKSM−５２０菌（FERM P-10
483）を取得することができた。By the method described above, the KSM-520 bacterium of the present invention (FERM P-10
483) was able to be obtained.

実施例２ 実施例１で得たバチルス・エスピーKSM−５２０菌を実
施例１の液体培地Ｂに接種し、３０℃で３日間振盪培養
した。培養後、菌体を遠心分離して除き、粗酵素液とし
た。更に、通常の方法に従って、エタノール乾燥粉末と
し、セルラーゼ酵素標品（第２表）を得ることが出来
た。 Example 2 The Bacillus sp. KSM-520 strain obtained in Example 1 was inoculated into the liquid medium B of Example 1 and cultured at 30 ° C. for 3 days with shaking. After culturing, bacterial cells were removed by centrifugation to obtain a crude enzyme solution. Furthermore, a cellulase enzyme preparation (Table 2) could be obtained by ethanol dry powder according to a usual method.

実施例３ 実施例１の液体培地Ｂに於いて、CMCに代えてセロビオ
ースを１％、ポリペプトンに代えてCSLを５％添加した
培地に、KSM−５２０菌を接種し、３０℃で２乃至３日
間振盪培養した。遠心分離上清についてCMCアーゼ活性
を測定した結果、3542U/のCMCアーゼ活性が得られ
た。 Example 3 In liquid medium B of Example 1, KSM-520 was inoculated into a medium containing 1% of cellobiose in place of CMC and 5% of CSL in place of polypeptone, and the medium was inoculated with KSM-520 at 2 to 3 at 30 ° C. Culture was carried out with shaking for one day. As a result of measuring the CMCase activity of the centrifuged supernatant, a CMCase activity of 3542 U / was obtained.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

第１図は、本発明のアルカリセルラーゼのCMCに対する
反応pHと相対活性との関係を示す図面、第２図は、CMC
に対する処理pHと残存活性との関係を示す図面、第３図
は、本発明のアルカリセルラーゼの反応温度と相対活性
との関係を示す図面、第４図は、処理温度と残存活性と
の関係を示す図面である。FIG. 1 is a drawing showing the relationship between the reaction pH of the alkaline cellulase of the present invention for CMC and the relative activity, and FIG. 2 is the CMC.
Showing the relationship between the treatment pH and the residual activity, FIG. 3 shows the relationship between the reaction temperature and the relative activity of the alkaline cellulase of the present invention, and FIG. 4 shows the relationship between the treatment temperature and the residual activity. It is a drawing shown.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 川合 修次 栃木県宇都宮市竹林町308 (72)発明者 伊藤 進 栃木県宇都宮市東峰町3441―64─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁵ Identification number Reference number within the agency FI technical display location C12R 1:07) (72) Inventor Shuji Kawai 308 Takebayashi, Utsunomiya City, Tochigi Prefecture (72) Inventor Susumu Ito 3441-64 Higashiminecho, Utsunomiya City, Tochigi Prefecture

Claims (3)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】次の物理化学的性質を有するアルカリセル
ラーゼK-520。 (1)作用 カルボキシメチルセルロース(CMC)、セルロース、濾
紙、アビセル等の繊維素によく作用し、これらを溶解せ
しめ、還元糖を生成する。 (2)基質特異性 CMCの他にも、セルロース粉末、リン酸膨潤セルロー
ス、アルカリ膨潤セルロース、アビセル、濾紙、ｐ−ニ
トロフェニルグルコシド及びｐ−ニトロフェニルセロビ
オシドに対する活性を有する。 (3)作用pH及び至適pH CMCに対する作用pH範囲は３〜13.0である。至適pHは8.5
〜9.5であり、7.0〜11.0の範囲においても至適pHに於け
る活性の50％以上の相対活性を有する。 (4)pH安定性 CMCを基質とした場合、pH6.0〜11.0で極めて安定で失活
せず、pH5〜11.5においても、約50％以上の活性を維持
する。 (5)最適温度 CMCに対する作用温度は、10〜70℃の広範囲にわたり、
その至適温度は、50℃である。又、35〜60℃の範囲に於
いても、至適温度での活性の50％以上を有する。 (6)分子量 約17±１万及び8.0±0.2万（バイオゲルＡ0.5ｍを用い
たゲル濾過法による）。 (7)金属イオンの影響 CMCを基質とした場合、Hg²⁺、Cd²⁺、Pb²⁺、により阻害
され、Co²⁺、Mn²⁺により活性化される。 (8)界面活性剤の影響 CMCを基質とした場合、直鎖アルキルベンゼンスルホン
酸塩、アルキル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルス
ルホン酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、二級アルカ
ンスルホン酸塩、石鹸、ポリオキシエチレンセカンダリ
ーアルキルエーテルは活性を殆ど阻害しない。 (9)プロテアーゼの影響 CMCを基質とした場合、プロテアーゼに対して耐性を有
する。 (10)キレート剤の影響 CMCを基質とした場合、EDTA、EGTA、クエン酸、トリポ
リリン酸ソーダ、ゼオライトは活性を阻害しない。1. An alkaline cellulase K-520 having the following physicochemical properties. (1) Action It acts well on fibrils such as carboxymethyl cellulose (CMC), cellulose, filter paper, and Avicel, and dissolves them to produce reducing sugar. (2) Substrate specificity In addition to CMC, it has activity against cellulose powder, phosphoric acid swollen cellulose, alkali swollen cellulose, Avicel, filter paper, p-nitrophenyl glucoside and p-nitrophenyl cellobioside. (3) Working pH and optimum pH The working pH range for CMC is 3 to 13.0. Optimum pH is 8.5
It has a relative activity of 50% or more of the activity at the optimum pH even in the range of 7.0 to 11.0. (4) pH stability When CMC is used as a substrate, it is extremely stable at pH 6.0 to 11.0 and does not inactivate, and maintains an activity of about 50% or more even at pH 5 to 11.5. (5) Optimum temperature The working temperature for CMC is in a wide range from 10 to 70 ℃,
The optimum temperature is 50 ° C. Further, it has 50% or more of the activity at the optimum temperature even in the range of 35 to 60 ° C. (6) Molecular weight about 17 ± 10,000 and 8.0 ± 0.2000 (by gel filtration method using Biogel A 0.5 m). (7) Effects of metal ions When CMC is used as a substrate, it is inhibited by Hg ²⁺ , Cd ²⁺ , Pb ²⁺ and activated by Co ²⁺ , Mn ²⁺ . (8) Effect of surfactant When CMC is used as a substrate, linear alkylbenzene sulfonate, alkyl sulfate, polyoxyethylene alkyl sulfonate, α-olefin sulfonate, secondary alkane sulfonate, soap, Polyoxyethylene secondary alkyl ethers hardly inhibit the activity. (9) Effect of protease When CMC is used as a substrate, it has resistance to protease. (10) Effect of chelating agent When CMC is used as a substrate, EDTA, EGTA, citric acid, sodium tripolyphosphate, and zeolite do not inhibit the activity. 【請求項２】アルカリ培地で生育し、請求項１記載のア
ルカリセルラーゼＫ−５２０を生産する能力を有し、微
工研菌寄第10483号として寄託されたバチルス・エスピ
ー ＫＳＭ−５２０。2. Bacillus sp. KSM-520, which has been deposited as Microindustrial Research Institute No. 10483 and has the ability to grow alkaline cellulase K-520 according to claim 1 by growing in an alkaline medium. 【請求項３】バチルス属に属するアルカリセルラーゼＫ
−５２０生産菌を培養し、その培養物から請求項１記載
のアルカリセルラーゼＫ−５２０を取得することを特徴
とするアルカリセルラーゼＫ−５２０の製造法。3. Alkaline cellulase K belonging to the genus Bacillus
A method for producing alkaline cellulase K-520, which comprises culturing a -520-producing bacterium, and obtaining the alkaline cellulase K-520 according to claim 1 from the culture.