JPH06343451A - Apparatus for immobilization, method for immobilizing and culturing organism tissue using the same - Google Patents

Apparatus for immobilization, method for immobilizing and culturing organism tissue using the same

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JPH06343451A
JPH06343451A JP5163985A JP16398593A JPH06343451A JP H06343451 A JPH06343451 A JP H06343451A JP 5163985 A JP5163985 A JP 5163985A JP 16398593 A JP16398593 A JP 16398593A JP H06343451 A JPH06343451 A JP H06343451A
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M23/20—Material Coatings

Abstract

PURPOSE:To obtain an immobilization apparatus capable of preventing the mechanical damages of cells, etc., on their immobilization and of reducing the complexity of the immobilization process by disposing the layer of a specific polymeric compound having a sol-gel transition temperature on a support. CONSTITUTION:The apparatus for immobilization is characterized by disposing the layer 2 of a polymeric compound, the polymeric compound being a one (a polyalkylene oxide block copolymer, an etherified cellulose, a chitosan derivative, etc.,) which is composed from plural blocks having a clouding point and hydrophilic blocks and an aqueous solution of which exhibits a sol-gel transition temperature. The aqueous solution of the polymeric compound exhibits a reversible sol state at a temperature lower than the sol-gel transition temperature, and can immobilize cells (or microorganisms) on the gel polymer layer 2C, when the dispersion of the cells (or microorganisms) 4 is poured in a medium 5 in a coated dish 3. The sol-gel transition temperature is preferably 4-40 deg.C.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は動・植物細胞、微生物、
ウィルスなどの生物ないし生物組織の固定化、培養、回
収等に好適に用いることが可能な固定化（ないし培養）
用器具に関し、より具体的には、細胞、微生物等のクロ
ーニング、制癌剤等の薬物のスクリーニング、細胞のin
vitroでの形質転換の判別、細胞の分化機構および遺伝
学的解析、細胞の運動能の測定、細胞などへの外来遺伝
子の導入などに好適に用いることが可能な固定化（ない
し培養）用器具、並びにこれを用いる生物組織の固定化
方法および培養方法に関する。The present invention relates to animal / plant cells, microorganisms,
Immobilization (or culture) that can be suitably used for immobilization, culture, recovery, etc. of organisms or biological tissues such as viruses
More specifically, it relates to cloning of cells, microorganisms, screening of drugs such as anticancer agents,
Immobilization (or culture) device that can be suitably used for discrimination of transformation in vitro, cell differentiation mechanism and genetic analysis, measurement of cell motility, introduction of foreign gene into cells, etc. And a method for immobilizing and culturing biological tissue using the same.

【０００２】[0002]

【従来の技術】従来より、細胞、微生物などの培養に、
寒天をはじめとするゲル素材が多く利用されている。こ
れらの半固体状態にあるゲル素材を培養に利用する目的
は、細胞、微生物などが相互に接触することを阻止する
こと、基質ないし基材に接着しにくい細胞、微生物を一
定位置に固定化することなどである。2. Description of the Related Art Conventionally, for culturing cells, microorganisms, etc.
Many gel materials such as agar are used. The purpose of utilizing these gel materials in a semi-solid state for culturing is to prevent cells and microorganisms from contacting each other, and to immobilize cells and microorganisms that are difficult to adhere to a substrate or substrate to certain positions. That is the case.

【０００３】寒天を培養器材（素材）として用いた典型
的な例は、細胞、微生物のクローニング法である。従来
より、細胞、微生物を寒天ゲル内あるいは寒天ゲル上に
播種してコロニーを形成させ、クローニングする方法が
行われてきた。寒天は海藻が生産する多糖類であり、ゾ
ルーゲル転移温度を有していて、該転移温度より高い温
度ではゾル状態を示し、該転移温度よりも低い温度でゲ
ル状態に変化する性質を有している。A typical example of using agar as a culture device (material) is a cell or microorganism cloning method. Conventionally, a method has been performed in which cells and microorganisms are seeded in or on an agar gel to form colonies and then cloned. Agar is a polysaccharide produced by seaweed, has a sol-gel transition temperature, shows a sol state at a temperature higher than the transition temperature, and has the property of changing to a gel state at a temperature lower than the transition temperature. There is.

【０００４】寒天のこのような性質を利用して、上記ゾ
ルーゲル転移温度より高い温度のゾル状態で寒天を培養
器具中に流し込み、温度を該転移温度より低く下げるこ
とによりゲル化して、該ゲル上に細胞、微生物を播種し
たり、寒天がゾル状態の時に細胞、微生物を混合し、温
度を該転移温度より低い温度に下げることによって寒天
をゲル化させ、細胞、微生物を寒天ゲル内に包埋し培養
する方法が行われている。しかしながら、寒天には以下
に示すような重大な問題点がある。[0004] Utilizing such properties of agar, agar is poured into a culture instrument in a sol state having a temperature higher than the sol-gel transition temperature, and the temperature is lowered below the transition temperature to cause gelation and the gel Cells and microorganisms, or by mixing the cells and microorganisms when the agar is in the sol state and lowering the temperature to a temperature lower than the transition temperature to gelate the agar and embed the cells and microorganisms in the agar gel. A method of culturing is used. However, agar has the following serious problems.

【０００５】１）寒天ゲルのゾル化温度は非常に高く、
約９０°Ｃ近辺であるために、寒天ゾルを細胞、微生物
と混合する際に、該細胞等は熱的な損傷を受ける。また
培養した細胞、微生物を寒天ゲルから回収あるいは継代
するために、該ゲルをゾル状態に変える際にも、細胞、
微生物は高温にさらされ非常に大きな熱的損傷を受け
る。したがって、寒天ゲルからの細胞、微生物の回収
は、寒天ゲルの機械的な破砕により行わざるを得ず、該
破砕時に細胞、微生物は大きな機械的な損傷を受けるこ
とになる。1) The solization temperature of agar gel is very high,
Since the temperature is around 90 ° C, when the agar sol is mixed with cells and microorganisms, the cells are thermally damaged. Also, in order to recover or subculture cultured cells and microorganisms from the agar gel, when changing the gel to a sol state, cells,
Microorganisms are exposed to high temperatures and suffer great thermal damage. Therefore, the cells and microorganisms must be recovered from the agar gel by mechanical crushing of the agar gel, and the cells and microorganisms are greatly mechanically damaged during the crushing.

【０００６】２）寒天は天然高分子であるため、その物
性、特に細胞、微生物に対する毒性がロットによって非
常にバラツキが大きい。2) Since agar is a natural polymer, its physical properties, particularly toxicity to cells and microorganisms, vary greatly from lot to lot.

【０００７】３）寒天を細胞、微生物の培養用基材とし
て用いる場合には、上述したように、寒天を培地に添加
し、１００°Ｃ以上の高温に於て該寒天を溶解させて得
られた混合物を培養容器中に注入した後、冷却してゲル
化させ培養用基材とする。この工程は非常に煩雑である
と同時に、冷却によるゲル化工程は長時間を必要とす
る。細胞、微生物培養に先立って行われる上記した寒天
培地の調製工程は、操作の迅速性を著しく害すると同時
に汚染（コンタミネーション）の危険性を増大させる。
更に、蛋白由来の生理活性物質などの熱的に不安定な物
質を寒天培地に添加する場合には、ゾル状態の寒天温度
の調整が困難であり、該生理活性物質の添加途中に度々
寒天がゲル化し易く混合が不均一になり易い。上記した
寒天培地調製工程の煩雑さを軽減するために、あらかじ
め所定の培地成分が添加され、滅菌され、かつ培養容器
中に封入された寒天ゲルが生培地と称して市販されてい
るが、このものは高価格であると同時に要冷蔵で、しか
も保存期間が短いという問題点を有する。3) When agar is used as a substrate for culturing cells or microorganisms, it is obtained by adding agar to a medium and dissolving the agar at a high temperature of 100 ° C. or higher as described above. After pouring the mixture into a culture vessel, it is cooled to gel and used as a culture substrate. This step is very complicated, and at the same time, the gelation step by cooling requires a long time. The above-described agar medium preparation step, which is carried out prior to culturing cells or microorganisms, significantly impairs the speed of the operation, and at the same time increases the risk of contamination.
Furthermore, when a thermally unstable substance such as a protein-derived physiologically active substance is added to the agar medium, it is difficult to adjust the agar temperature in the sol state, and agar is often added during the addition of the physiologically active substance. It is easy to gel and the mixture is not uniform. In order to reduce the complexity of the agar medium preparation step described above, predetermined medium components are added in advance, sterilized, and the agar gel enclosed in the culture container is commercially available as a live medium, but There is a problem that the products are expensive and require refrigeration, and the storage period is short.

【０００８】上記した寒天培地の問題点は、細胞、微生
物のクローニングの場合のみならず、制癌剤等の薬物の
スクリーニング、細胞のin vitroでの形質転換の判別、
細胞の分化機構および遺伝学的解析、細胞の運動能の測
定の場合においても共通である。The problems of the above-mentioned agar medium are not limited to the case of cloning cells and microorganisms, but also the screening of drugs such as anticancer agents, the determination of transformation of cells in vitro,
It is common in the case of cell differentiation mechanism and genetic analysis, and measurement of cell motility.

【０００９】一方、寒天などのゲル素材を用いずに細胞
を固定化、培養する方法も行われている。最も典型的な
例は、遺伝子工学、細胞工学、発生工学等の分野におけ
る細胞内注入および吸引などの操作である。特に、培養
基材への接着の弱い卵母細胞などへの外来遺伝子の注入
操作は、トランスジェニック（transgenic）動物による
産業動物の育種、有用物質の生産、病態モデル動物の開
発の分野に於て、その重要性を増しつつある。[0009] On the other hand, a method of fixing and culturing cells without using a gel material such as agar is also practiced. The most typical examples are operations such as intracellular injection and suction in the fields of genetic engineering, cell engineering, developmental engineering and the like. In particular, the operation of injecting a foreign gene into an oocyte or the like, which has weak adhesion to a culture substrate, has been performed in the fields of breeding industrial animals with transgenic animals, producing useful substances, and developing pathological model animals. , Its importance is increasing.

【００１０】従来、卵母細胞などの非接着性細胞内に遺
伝子などを注入する工程はマイクロインジェクション法
と呼ばれ、先端が直径５０〜１００μｍのガラス製ピペ
ットの先を上記細胞の細胞膜に接着させて、ピペット内
を若干陰圧にすることにより該細胞をピペットに物理的
に固定化した後、先端が１〜２μｍのガラス製マイクロ
キャピラリーピペットを用いて、細胞内に外来遺伝子溶
液を注入する方法である。この方法の問題点は、細胞を
１個づつ顕微鏡下でマイクロマニュピレーター（microm
anipulator）を用いてガラス製ピペットで固定化しなけ
ればならないため、熟練した技術を必要とするのみなら
ず、細胞を１個１個固定化するために非常に手間がかか
ることである。更に、ガラス製ピペットの先端で陰圧下
に細胞膜を吸引して固定化する際に、細胞膜に重大な物
理的障害を与えることも大きな問題点である。Conventionally, the step of injecting a gene or the like into a non-adhesive cell such as an oocyte is called a microinjection method, and the tip of a glass pipette having a diameter of 50 to 100 μm is attached to the cell membrane of the cell. A method of injecting a foreign gene solution into cells using a glass microcapillary pipette having a tip of 1 to 2 μm after physically immobilizing the cells on the pipette by slightly reducing the inside pressure of the pipette. Is. The problem with this method is that the cells are taken one by one under a microscope.
Since it has to be immobilized with a glass pipette using an anipulator), it not only requires a skilled technique, but it is very troublesome to immobilize cells one by one. Further, when the cell membrane is sucked and immobilized under a negative pressure with the tip of a glass pipette, a serious physical obstacle to the cell membrane is a serious problem.

【００１１】上述したように、細胞、微生物などの動・
植物組織を固定化、培養する際に、従来は寒天などのゲ
ル素材、あるいはガラス製ピペットを用いて物理的に固
定化する方法が行われてきたが、これらの方法において
は、上記した問題点が未解決のまま残されている。As described above, the movement of cells, microorganisms, etc.
When immobilizing and culturing plant tissues, conventionally, gel materials such as agar or methods of physically immobilizing using a glass pipette have been performed, but in these methods, the above-mentioned problems Is left unsolved.

【００１２】[0012]

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上述
したように細胞、微生物などを培養基材上に固定化、培
養、回収ないし継代する等の一連の操作に用いられる寒
天ゲル、あるいはピペットを用いる方法の煩雑さ、およ
び細胞、微生物に与える障害性の問題点を解決した固定
化ないし培養方法に好適に使用可能な固定化用器具を提
供することにある。The object of the present invention is, as described above, an agar gel used for a series of operations such as immobilizing cells, microorganisms, etc. on a culture substrate, culturing, collecting or subculturing, Another object of the present invention is to provide an immobilization instrument which can be suitably used for immobilization or culturing method, which solves the problems of the complexity of the method using a pipette and the damage to cells and microorganisms.

【００１３】本発明の他の目的は、上記固定化用器具を
用いた細胞、微生物などの固定化法を提供することにあ
る。Another object of the present invention is to provide a method for immobilizing cells, microorganisms, etc. using the immobilization instrument.

【００１４】本発明の更に他の目的は、上記固定化用器
具を用いた細胞、微生物などの培養、回収あるいは継代
法を提供することにある。Still another object of the present invention is to provide a method for culturing, recovering or subculturing cells, microorganisms and the like using the above-mentioned immobilization device.

【００１５】[0015]

【課題を解決するための手段】本発明者は鋭意研究の結
果、従来のゲル素材とは全く異なった性質、すなわちそ
の水溶液がゾル−ゲル転移温度を有し、該転移温度より
低い温度で可逆的にゾル状態を示すような高分子化合物
からなる層（例えばコーティング層）を支持体上に設け
た固定化用器具を用いて細胞、微生物の固定化ないし培
養を行うことが、上述した寒天ゲルあるいはピペットを
用いる方法の問題点を解消するのみならず、該固定化用
器具により固定化ないし培養されるべき細胞、微生物へ
の障害性を著しく軽減することを見い出した。As a result of earnest research, the present inventor has found that the properties of the gel material are completely different from those of conventional gel materials, that is, the aqueous solution thereof has a sol-gel transition temperature and is reversible at a temperature lower than the transition temperature. The agar gel described above can be used for immobilizing or culturing cells and microorganisms using an immobilization device in which a layer (for example, a coating layer) made of a polymer compound that exhibits a sol state is provided on a support. It has also been found that not only the problems of the method using a pipette are solved but also the damage to cells and microorganisms to be immobilized or cultured by the immobilizing instrument is significantly reduced.

【００１６】本発明の固定化用器具は上記の知見に基づ
くものであり、より詳しくは、支持体と、該支持体上に
配置された高分子化合物の層からなる固定化用器具であ
って；該高分子化合物が、曇点を有する複数のブロック
と親水性のブロックとが結合してなり、その水溶液がゾ
ルーゲル転移温度を有し、且つ該水溶液が上記ゾルーゲ
ル転移温度より低い温度で可逆的に液体状態（ゾル状
態）を示す高分子化合物であることを特徴とするもので
ある。The immobilizing instrument of the present invention is based on the above findings, and more specifically, it is an immobilizing instrument comprising a support and a layer of a polymer compound arranged on the support. The polymer compound is formed by combining a plurality of blocks having a cloud point and a hydrophilic block, the aqueous solution thereof has a sol-gel transition temperature, and the aqueous solution is reversible at a temperature lower than the sol-gel transition temperature. It is a polymer compound showing a liquid state (sol state).

【００１７】本発明によれば、更に、支持体と、該支持
体上に配置された高分子化合物の層からなる固定化用器
具であって；該高分子化合物が、曇点を有する複数のブ
ロックと親水性のブロックとが結合してなり、その水溶
液がゾルーゲル転移温度を有し、且つ該水溶液が上記ゾ
ルーゲル転移温度より低い温度で可逆的に液体状態（ゾ
ル状態）を示す高分子化合物である固定化用器具の上記
高分子化合物の層に、ゾルーゲル転移温度より高い温度
で、生物組織を接触させ、上記固定化用器具の温度をゾ
ルーゲル転移温度より低い温度に下げることにより上記
高分子化合物の少なくとも一部を溶解させて、上記生物
組織の一部または全部を液体状態の高分子化合物中に包
埋した後、直ちに上記固定化用器具の温度をゾルーゲル
転移温度以上に高めて、液体状態の高分子化合物をゲル
化させることにより、該ゲル中に上記生物組織の一部又
は全部を包埋して該生物組織を固定化用器具上に固定す
ることを特徴とする生物組織の固定化法が提供される。According to the present invention, there is further provided an immobilization device comprising a support and a layer of the polymer compound disposed on the support; the polymer compound having a plurality of cloud points. A polymer compound comprising a block and a hydrophilic block bonded to each other, an aqueous solution thereof having a sol-gel transition temperature, and the aqueous solution reversibly showing a liquid state (sol state) at a temperature lower than the sol-gel transition temperature. A layer of the polymer compound of a certain immobilization device, at a temperature higher than the sol-gel transition temperature, contact biological tissue, by lowering the temperature of the immobilization device to a temperature lower than the sol-gel transition temperature At least a part of the biological tissue is dissolved, and a part or all of the biological tissue is embedded in the polymer compound in a liquid state, and immediately after that, the temperature of the immobilization device is raised to a temperature higher than the sol-gel transition temperature. And a gel of a polymer compound in a liquid state to embed a part or all of the biological tissue in the gel to fix the biological tissue on an immobilization device. A method of tissue immobilization is provided.

【００１８】本発明によれば、更に、支持体と、該支持
体上に配置された高分子化合物の層からなる固定化用器
具であって；該高分子化合物が、曇点を有する複数のブ
ロックと親水性のブロックとが結合してなり、その水溶
液がゾルーゲル転移温度を有し、且つ該水溶液が上記ゾ
ルーゲル転移温度より低い温度で可逆的に液体状態（ゾ
ル状態）を示す高分子化合物である固定化用器具の上記
高分子化合物の層に、ゾルーゲル転移温度より高い温度
で、生物組織を接触させ、上記固定化用器具の温度をゾ
ルーゲル転移温度より低い温度に下げることにより上記
高分子化合物の少なくとも一部を溶解させて、上記生物
組織の一部または全部を液体状態の高分子化合物中に包
埋した後、直ちに上記固定化用器具の温度をゾルーゲル
転移温度以上に高めて、液体状態の高分子化合物をゲル
化させることにより、該ゲル中に上記生物組織の一部又
は全部を包埋して該生物組織を固定化用器具上に固定
し、上記生物組織を培養することを特徴とする生物組織
の培養法が提供される。According to the present invention, there is further provided an immobilization device comprising a support and a layer of the polymer compound arranged on the support; the polymer compound having a plurality of cloud points. A polymer compound comprising a block and a hydrophilic block bonded to each other, an aqueous solution thereof having a sol-gel transition temperature, and the aqueous solution reversibly showing a liquid state (sol state) at a temperature lower than the sol-gel transition temperature. A layer of the polymer compound of a certain immobilization device, at a temperature higher than the sol-gel transition temperature, contact biological tissue, by lowering the temperature of the immobilization device to a temperature lower than the sol-gel transition temperature At least a part of the biological tissue is dissolved, and a part or all of the biological tissue is embedded in the polymer compound in a liquid state, and immediately after that, the temperature of the immobilization device is raised to a temperature higher than the sol-gel transition temperature. Then, by gelling the polymer compound in a liquid state, a part or all of the biological tissue is embedded in the gel and the biological tissue is fixed on an immobilization device, and the biological tissue is cultured. A method for culturing a biological tissue is provided.

【００１９】上述した本発明において、上記高分子化合
物の親水性のブロックは、ゾル−ゲル転移温度より低い
温度で該高分子化合物が水溶性になるために必要であ
り、また曇点を有する複数のブロックは、高分子化合物
がゾル−ゲル転移温度より高い温度でゲル状態に変化す
るために必要である。換言すれば、曇点を有するブロッ
クは該曇点より低い温度では水に溶解し、該曇点より高
い温度では水に不溶性に変化するために、曇点より高い
温度で該ブロックはゲルを形成するための架橋点として
の役割を果たす。In the present invention described above, the hydrophilic block of the polymer compound is necessary for the polymer compound to become water-soluble at a temperature lower than the sol-gel transition temperature, and a plurality of blocks having a cloud point are required. The block of is necessary for the polymer compound to change into a gel state at a temperature higher than the sol-gel transition temperature. In other words, a block having a cloud point dissolves in water below the cloud point and becomes insoluble in water above the cloud point so that the block forms a gel above the cloud point. To act as a cross-linking point.

【００２０】すなわち、疎水性結合に由来する曇点が、
上記高分子化合物のゾル−ゲル転移温度に対応する。た
だし、該曇点とゾル−ゲル転移温度とは必ずしも一致し
なくてもよい。これは、上記した「曇点を有するブロッ
ク」の曇点は、一般に、該ブロックと親水性ブロックと
の結合によって影響を受けるためである。That is, the cloud point derived from the hydrophobic bond is
It corresponds to the sol-gel transition temperature of the polymer compound. However, the cloud point and the sol-gel transition temperature do not necessarily match. This is because the cloud point of the “block having a cloud point” described above is generally affected by the bond between the block and the hydrophilic block.

【００２１】本発明に用いる高分子化合物は、疎水性結
合が温度の上昇と共に強くなると同時にその変化が温度
に対して可逆的であるという性質を利用したものであ
る。また、該高分子化合物が「曇点を有するブロック」
を複数個有するということは、１分子内に複数個の架橋
点が形成され、安定性に優れたゲルが形成されるために
必須である。The polymer compound used in the present invention utilizes the property that the hydrophobic bond becomes stronger as the temperature rises and at the same time the change is reversible with respect to temperature. In addition, the polymer compound is a “block having a cloud point”
Having a plurality of C is essential for forming a gel having excellent stability because a plurality of crosslinking points are formed in one molecule.

【００２２】一方、上記高分子化合物中の親水性ブロッ
クは、前述したように、該高分子化合物がゾル−ゲル転
移温度よりも低い温度で水溶性に変化するために必要で
あると同時に、上記転移温度より高い温度で疎水性結合
力が増大しすぎて上記高分子化合物が凝集沈澱してしま
うことを防止しつつ、含水ゲルの状態を形成するために
必要である。On the other hand, the hydrophilic block in the polymer compound is, as described above, necessary for the polymer compound to become water-soluble at a temperature lower than the sol-gel transition temperature, and at the same time, It is necessary in order to form a hydrous gel state while preventing the polymer compound from coagulating and precipitating due to excessive increase in hydrophobic binding force at a temperature higher than the transition temperature.

【００２３】以下、必要に応じて図面を参照しつつ、本
発明を更に詳細に説明する。Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the drawings as necessary.

【００２４】（ゾルーゲル転移温度）本発明において
「ゾル状態」、「ゲル状態」および「ゾルーゲル転移温
度」は以下のように定義される。この定義については文
献（Polymer Journal.１８（５），４１１−４１６（１
９８６））を参照することができる。(Sol-Gel Transition Temperature) In the present invention, “sol state”, “gel state” and “sol-gel transition temperature” are defined as follows. Regarding this definition, see (Polymer Journal. 18 (5), 411-416 (1
986)).

【００２５】高分子溶液１ｍＬを内径１ｃｍの試験管に
入れ、所定の温度（一定温度）とした水浴中で１２時間
保持する。この後、試験管の上下を逆にした場合に、溶
液／空気の界面（メニスカス）が溶液の自重で変形した
場合（溶液が流出した場合を含む）には、上記所定温度
において高分子溶液は「ゾル状態」であると定義する。
一方、上記試験管の上下を逆にしても、上記した溶液／
空気の界面（メニスカス）が溶液の自重で変形しない場
合には、該溶液は、上記所定温度において「ゲル状態」
であると定義する。1 mL of the polymer solution is placed in a test tube having an inner diameter of 1 cm and kept in a water bath at a predetermined temperature (constant temperature) for 12 hours. After that, when the test tube is turned upside down and the solution / air interface (meniscus) is deformed by its own weight (including the case where the solution flows out), the polymer solution is Defined as "sol state".
On the other hand, even if the test tube is turned upside down,
When the air interface (meniscus) is not deformed by the weight of the solution, the solution is in a "gel state" at the above-mentioned predetermined temperature.
Is defined as

【００２６】一方、上記測定において、濃度が例えば約
３ｗｔ％の高分子溶液を用い、上記した「所定温度」を
徐々に（例えば１℃きざみで）上昇させて「ゾル状態」
が「ゲル状態」に転移する温度を求めた場合、これによ
って求められる転移温度を「ゾルーゲル転移温度」と定
義する（この際、「所定温度」を例えば１℃きざみで下
降させ、「ゲル状態」が「ゾル状態」に転移する温度を
求めてもよい）。On the other hand, in the above measurement, a polymer solution having a concentration of, for example, about 3 wt% is used, and the above-mentioned "predetermined temperature" is gradually increased (for example, in increments of 1 ° C) to obtain the "sol state".
When the temperature at which the transition to the "gel state" is determined, the transition temperature determined by this is defined as the "sol-gel transition temperature" (at this time, the "predetermined temperature" is lowered by, for example, 1 ° C, and the "gel state" is determined. The temperature at which the transition to the "sol state" may be determined).

【００２７】本発明においては、上記ゾルーゲル転移温
度は０℃より高く、４５℃以下であることが好ましく、
更には４℃以上４０℃以下であることが、動・植物組織
の熱的損傷を防ぐ点から好ましい。このように好適なゾ
ルーゲル転移温度を有する高分子化合物は、後述するよ
うな具体的な化合物の中から、上記したスクリーニング
方法（ゾルーゲル転移温度測定法）に従って容易に選択
することができる。In the present invention, the sol-gel transition temperature is higher than 0 ° C. and preferably 45 ° C. or lower,
Further, it is preferably 4 ° C. or higher and 40 ° C. or lower from the viewpoint of preventing thermal damage to animal and plant tissues. The polymer compound having such a suitable sol-gel transition temperature can be easily selected from the specific compounds described below according to the screening method (sol-gel transition temperature measuring method) described above.

【００２８】本発明の固定化用器具を用いて動・植物、
微生物等を播種し、固定化し、培養し、および／又は回
収するという一連の操作においては、上記したゾル−ゲ
ル転移温度（ａ°Ｃ）を播種あるいは培養時の温度（ｂ
°Ｃ）と、固定化あるいは回収するための冷却時の温度
（ｃ°Ｃ）との間に設定することが好ましい。すなわ
ち、上記した３種の温度ａ°Ｃ、ｂ°Ｃ、およびｃ°Ｃ
の間には、ｂ＞ａ＞ｃの関係があることが好ましい。よ
り具体的には、（ｂ−ａ）は１〜４０°Ｃ、更には２〜
３０°Ｃであることが好ましく、また（ａ−ｃ）は１〜
４０°Ｃ、更には２〜３０°Ｃであることが好ましい。Using the immobilization instrument of the present invention, animals and plants,
In a series of operations of seeding, immobilizing, culturing, and / or recovering microorganisms and the like, the above-mentioned sol-gel transition temperature (a ° C) is the temperature (b) at the time of seeding or culturing.
It is preferable to set it between the temperature (° C) and the temperature (c ° C) at the time of cooling for immobilization or recovery. That is, the above three temperatures a ° C, b ° C, and c ° C.
It is preferable that there is a relationship of b>a> c. More specifically, (ba) is 1 to 40 ° C, and further 2 to
30 ° C is preferable, and (ac) is 1 to
The temperature is preferably 40 ° C, more preferably 2 to 30 ° C.

【００２９】（高分子化合物）上述したような好適なゾ
ル−ゲル転移温度は、本発明に用いる高分子化合物中の
曇点を有する複数のブロックと親水性のブロックの曇
点、両ブロックの組成および両ブロックの疎水性度、親
水性度、および／又は分子量等をそれぞれ調整すること
によって達成することが可能である。(Polymer Compound) The suitable sol-gel transition temperature as described above has a plurality of blocks having cloud points in the polymer compound used in the present invention and cloud points of hydrophilic blocks, and composition of both blocks. It can be achieved by adjusting the hydrophobicity, hydrophilicity, and / or molecular weight of both blocks.

【００３０】その水溶液がゾル−ゲル転移温度を有し、
該転移温度より低い温度で可逆的にゾル状態を示す高分
子化合物の具体例としては、例えば、ポリプロピレンオ
キサイドとポリエチレンオキサイドとのブロック共重合
体などに代表されるポリアルキレンオキサイドブロック
共重合体；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセル
ロースなどのエーテル化セルロース；キトサン誘導体
（K.R.Holme.et al. Macromolecules, 24, 3828 (199
1)) などが知られている。The aqueous solution has a sol-gel transition temperature,
Specific examples of the polymer compound that reversibly exhibits a sol state at a temperature lower than the transition temperature include, for example, polyalkylene oxide block copolymers represented by block copolymers of polypropylene oxide and polyethylene oxide; methyl cellulose. , Etherified cellulose such as hydroxypropyl cellulose; chitosan derivative (KRHolme. Et al. Macromolecules, 24, 3828 (199
1)) is known.

【００３１】ポリアルキレンオキサイドブロック共重合
体として、ポリプロピレンオキサイドの両端にポリエチ
レンオキサイドが結合したプルロニック（Pluronic) Ｆ
−１２７（商品名、BASF Wyandotte Chemicals Co.製）
ゲルが開発されている。As a polyalkylene oxide block copolymer, Pluronic F in which polyethylene oxide is bonded to both ends of polypropylene oxide
-127 (trade name, manufactured by BASF Wyandotte Chemicals Co.)
Gels have been developed.

【００３２】このプルロニックＦ−１２７の高濃度水溶
液は、約２０°Ｃ以上でハイドロゲルとなり、これより
低い温度で水溶液となることが知られている。しかしな
がら、この材料の場合は約２０ｗｔ％以上の高濃度でし
かゲル状態にはならず、また約２０ｗｔ％以上の高濃度
でゲル化温度より高い温度に保持しても、さらに水を加
えるとゲルが溶解してしまう。したがって、プルロニッ
クＦ−１２７を支持体にコーティングすることによって
固定化用器具を作製した場合には、細胞、微生物をプル
ロニックＦ−１２７ゲルによって固定化して該ゾル−ゲ
ル転移点より高い温度で培養したとしても、プルロニッ
クＦ−１２７ゲルは添加した培地中に溶解してしまうた
め、細胞、微生物を該器具上に固定化することが困難に
なる。また、プルロニックＦ−１２７は分子量が比較的
小さく、約２０ｗｔ％以上の高濃度のゲル状態で非常に
高い浸透圧を示すと同時に細胞膜を容易に透過するの
で、細胞、微生物に悪影響を及ぼす可能性がある。It is known that the high-concentration aqueous solution of Pluronic F-127 becomes a hydrogel at about 20 ° C. or higher and becomes an aqueous solution at a lower temperature. However, in the case of this material, the gelled state occurs only at a high concentration of about 20 wt% or more, and even if it is kept at a temperature higher than the gelation temperature at a high concentration of about 20 wt% or more, gelation still occurs when water is added. Will dissolve. Therefore, when an immobilization device was prepared by coating Pluronic F-127 on a support, cells and microorganisms were immobilized by Pluronic F-127 gel and cultured at a temperature higher than the sol-gel transition point. However, since the Pluronic F-127 gel is dissolved in the added medium, it becomes difficult to immobilize cells and microorganisms on the device. In addition, Pluronic F-127 has a relatively small molecular weight, exhibits a very high osmotic pressure in a high-concentration gel state of about 20 wt% or more, and at the same time easily permeates cell membranes, which may adversely affect cells and microorganisms. There is.

【００３３】一方、メチルセルロース、ヒドロキシプロ
ピルセルロースなどに代表されるエーテル化セルロース
の場合は、ゾル−ゲル転移温度が高く約４５°Ｃ以上で
ある（N.Sarkar, J.Appl.Polym.Science, 24, 1073, 19
79) 。したがって、このようなエーテル化セルロースを
単に支持体にコーティングすることによって固定化用器
具を作製した場合には、動・植物細胞、微生物の培養は
ほとんど３７°Ｃ近辺あるいはそれ以下の温度で実施さ
れるため、上記エーテル化セルロースはゾル状態であり
細胞、微生物の固定化培養は不可能である。On the other hand, in the case of etherified cellulose typified by methyl cellulose and hydroxypropyl cellulose, the sol-gel transition temperature is high and is about 45 ° C or higher (N. Sarkar, J.Appl.Polym.Science, 24. , 1073, 19
79). Therefore, when an immobilization device is prepared by simply coating such a support on an etherified cellulose, culture of animal / plant cells and microorganisms is carried out at a temperature of around 37 ° C or lower. Therefore, the etherified cellulose is in a sol state, and cells and microorganisms cannot be immobilized and cultured.

【００３４】上記したように、その水溶液中がゾルーゲ
ル転移点を有し、且つ該転移温度より低い温度で可逆的
にゾル状態を示す従来の高分子化合物の問題点は、 １）ゾルーゲル転移温度より高い温度で一旦ゲル化して
も、さらに水を添加するとゲルが溶解してしまうこと、 ２）ゾルーゲル転移温度が培養温度（３７℃近辺又はそ
れ以下）よりも高く、培養温度ではゾル状態であるこ
と、 ３）ゲル化させるためには、水溶液の高分子化合物濃度
を非常に高くする必要があること、などである。As described above, the problems of the conventional polymer compound having a sol-gel transition point in its aqueous solution and exhibiting a sol state reversibly at a temperature lower than the transition temperature are as follows: 1) From the sol-gel transition temperature Even if it gels once at a high temperature, the gel will dissolve if more water is added. 2) The sol-gel transition temperature is higher than the culture temperature (around 37 ° C or lower) and it is in the sol state at the culture temperature. 3) In order to cause gelation, the concentration of the polymer compound in the aqueous solution needs to be extremely high.

【００３５】本発明者の検討によれば、曇点を有する複
数のブロックと親水性のブロックが結合してなり、その
水溶液がゾルーゲル転移温度を有し、且つ、ゾルーゲル
転移温度より低い温度で可逆的にゾル状態を示す高分子
化合物を用いて固定化ないし培養用器具を構成した場合
に、上記問題は解決されることが判明した。According to the study by the present inventor, a plurality of blocks having a cloud point and a hydrophilic block are bonded to each other, and an aqueous solution thereof has a sol-gel transition temperature and is reversible at a temperature lower than the sol-gel transition temperature. It has been found that the above problem can be solved when a device for immobilization or culture is constructed by using a polymer compound that exhibits a sol state.

【００３６】（曇点を有する複数のブロック）曇点を有
するブロックとしては、水に対する溶解度温度係数が負
を示す高分子化合物であることが好ましく、より具体的
には、ポリプロピレンオキサイド、プロピレンオキサイ
ドと他のアルキレンオキサイドとの共重合体、ポリＮ−
置換アクリルアミド誘導体、ポリＮ−置換メタアクリル
アミド誘導体、Ｎ−置換アクリルアミド誘導体とＮ−置
換メタアクリルアミド誘導体との共重合体、ポリビニル
メチルエーテル、ポリビニルアルコール部分酢化物から
なる群より選ばれる高分子化合物が好ましく用いられ
る。上記の高分子化合物（曇点を有するブロック）の曇
点が４℃より高く４０℃以下であることが、本発明に用
いる高分子化合物（曇点を有する複数のブロックと親水
性のブロックが結合した化合物）のゾルーゲル転移温度
を４℃より高く４０℃以下とする点から好ましい。(A plurality of blocks having a cloud point) The block having a cloud point is preferably a polymer compound having a negative temperature coefficient of solubility in water, and more specifically, polypropylene oxide and propylene oxide. Copolymer with other alkylene oxide, poly N-
A polymer compound selected from the group consisting of a substituted acrylamide derivative, a poly N-substituted methacrylamide derivative, a copolymer of an N-substituted acrylamide derivative and an N-substituted methacrylamide derivative, polyvinyl methyl ether, and a polyvinyl alcohol partial acetyl chloride is preferable. Used. The cloud point of the polymer compound (block having a cloud point) is higher than 4 ° C. and 40 ° C. or less, so that the polymer compound used in the present invention (a plurality of blocks having a cloud point and a hydrophilic block are bonded to each other). Compound) is preferable in that the sol-gel transition temperature of the compound is higher than 4 ° C and lower than 40 ° C.

【００３７】ここで曇点の測定は、例えば、上記の高分
子化合物（曇点を有するブロック）の約１ｗｔ％の水溶
液を冷却して透明な均一溶液とした後、除々に昇温（昇
温速度約１℃／ｍｉｎ）して、該溶液がはじめて白濁す
る点を曇点とすることによって行うことが可能である。Here, the cloud point is measured by, for example, cooling an approximately 1 wt% aqueous solution of the above-mentioned polymer compound (block having a cloud point) to form a transparent homogeneous solution, and then gradually increasing the temperature (increasing the temperature). It can be carried out at a speed of about 1 ° C./min) so that the point where the solution becomes cloudy for the first time becomes a cloud point.

【００３８】本発明に使用可能なポリＮ−置換アクリル
アミド誘導体、ポリＮ−置換メタアクリルアミド誘導体
の具体的な例を以下に列挙する。Specific examples of poly N-substituted acrylamide derivatives and poly N-substituted methacrylamide derivatives that can be used in the present invention are listed below.

【００３９】ポリ−Ｎ−アクロイルピペリジン；ポリ−
Ｎ−ｎ−プロピルメタアクリルアミド；ポリ−Ｎ−イソ
プロピルアクリルアミド；ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアク
リルアミド；ポリ−Ｎ−イソプロピルメタアクリルアミ
ド；ポリ−Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド；ポリ−
Ｎ−アクリロイルピロリジン；ポリ−Ｎ，Ｎ−エチルメ
チルアクリルアミド；ポリ−Ｎ−シクロプロピルメタア
クリルアミド；ポリ−Ｎ−エチルアクリルアミド 上記の高分子は単独重合体（ホモポリマー）であって
も、上記重合体を構成する単量体と他の単量体との共重
合体であってもよい。このような共重合体を構成する他
の単量体としては、親水性単量体、疎水性単量体のいず
れも用いることができる。一般的には、親水性単量体と
共重合すると生成物の曇点は上昇し、疎水性単量体と共
重合すると生成物の曇点は下降する。従って、これらの
共重合すべき単量体を選択することによっても、所望の
曇点（例えば４℃より高く４０℃以下の曇点）を有する
高分子化合物を得ることができる。Poly-N-acroylpiperidine; Poly-
N-n-propylmethacrylamide; poly-N-isopropylacrylamide; poly-N, N-diethylacrylamide; poly-N-isopropylmethacrylamide; poly-N-cyclopropylacrylamide; poly-
N-acryloylpyrrolidine; poly-N, N-ethylmethylacrylamide; poly-N-cyclopropylmethacrylamide; poly-N-ethylacrylamide Even if the above-mentioned polymer is a homopolymer (homopolymer), the above-mentioned polymer It may be a copolymer of the monomer constituting the above and another monomer. As the other monomer constituting such a copolymer, either a hydrophilic monomer or a hydrophobic monomer can be used. Generally, copolymerization with a hydrophilic monomer raises the cloud point of the product, and copolymerization with a hydrophobic monomer lowers the cloud point of the product. Therefore, a polymer compound having a desired cloud point (for example, a cloud point higher than 4 ° C. and lower than 40 ° C.) can be obtained by selecting these monomers to be copolymerized.

【００４０】上記親水性単量体としては、Ｎ−ビニルピ
ロリドン、ビニルピリジン、アクリルアミド、メタアク
リルアミド、Ｎ−メチルアクリルアミド、ヒドロキシエ
チルメタアクリレート、ヒドロキシエチルアクリレー
ト、ヒドロキシメチルメタアクリレート、ヒドロキシメ
チルアクリレート、酸性基を有するアクリル酸、メタア
クリル酸およびそれらの塩、ビニルスルホン酸、スチレ
ンスルホン酸など、並びに塩基性基を有するＮ，Ｎ−ジ
メチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチル
アミノエチルメタクリート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプ
ロピルアクリルアミドおよびそれらの塩などが挙げられ
るが、これらに限定されるものではない。Examples of the hydrophilic monomer include N-vinylpyrrolidone, vinylpyridine, acrylamide, methacrylamide, N-methylacrylamide, hydroxyethyl methacrylate, hydroxyethyl acrylate, hydroxymethyl methacrylate, hydroxymethyl acrylate and acidic groups. With acrylic acid, methacrylic acid and salts thereof, vinyl sulfonic acid, styrene sulfonic acid and the like, and N, N-dimethylaminoethyl methacrylate, N, N-diethylaminoethyl methacrylate, N, N- having a basic group. Examples thereof include, but are not limited to, dimethylaminopropyl acrylamide and salts thereof.

【００４１】一方、上記疎水性単量体としては、エチル
アクリレート、メチルメタクリレート、グリシジルメタ
クリレート等のアクリレート誘導体およびメタクリレー
ト誘導体、Ｎ−ｎ−ブチルメタアクリルアミドなどのＮ
−置換アルキルメタアクリルアミド誘導体、塩化ビニ
ル、アクリロニトリル、スチレン、酢酸ビニルなどが挙
げられるが、これらに限定されるものではない。On the other hand, examples of the hydrophobic monomer include acrylate and methacrylate derivatives such as ethyl acrylate, methyl methacrylate and glycidyl methacrylate, and N such as N-n-butyl methacrylamide.
-Substituted alkyl methacrylamide derivatives, vinyl chloride, acrylonitrile, styrene, vinyl acetate and the like are included, but are not limited thereto.

【００４２】（親水性のブロック）一方、上記した曇点
を有するブロックと結合すべき親水性のブロックとして
は、具体的には、メチルセルロース、デキストラン、ポ
リエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール、ポリＮ
−ビニルピロリドン、ポリビニルピリジン、ポリアクリ
ルアミド、ポリメタアクリルアミド、ポリＮ−メチルア
クリルアミド、ポリヒドロキシメチルアクリレート、ポ
リアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリビニルスルホン
酸、ポリスチレンスルホン酸およびそれらの塩；ポリ
Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、ポリ
Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレート、ポリ
Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドおよび
それらの塩などが挙げられる。(Hydrophilic block) On the other hand, specific examples of the hydrophilic block to be combined with the block having the cloud point include methyl cellulose, dextran, polyethylene oxide, polyvinyl alcohol, poly N.
-Vinylpyrrolidone, polyvinylpyridine, polyacrylamide, polymethacrylamide, polyN-methylacrylamide, polyhydroxymethylacrylate, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polyvinylsulfonic acid, polystyrenesulfonic acid and salts thereof; polyN, N- Examples thereof include dimethylaminoethyl methacrylate, poly N, N-diethylaminoethyl methacrylate, poly N, N-dimethylaminopropyl acrylamide and salts thereof.

【００４３】曇点を有するブロックと上記の親水性のブ
ロックとを結合する方法は特に制限されないが、例えば
上記いずれかのブロック中に重合性官能基（例えばアク
リロイル基）を導入し、他方のブロックを与える単量体
を共重合させることによって行うことができる。The method of bonding the block having a cloud point and the hydrophilic block is not particularly limited, but for example, a polymerizable functional group (eg, acryloyl group) is introduced into any of the above blocks and the other block is introduced. It can be carried out by copolymerizing a monomer that gives

【００４４】また、曇点を有するブロックと上記の親水
性のブロックとの結合物は、曇点を有するブロックを与
える単量体と、親水性のブロックを与える単量体とのブ
ロック共重合によって得ることも可能である。The combination of the block having a cloud point and the hydrophilic block is obtained by block copolymerization of a monomer giving a block having a cloud point and a monomer giving a hydrophilic block. It is also possible to obtain.

【００４５】また、曇点を有するブロックと親水性のブ
ロックとの結合は、予め両者に反応活性な官能基（例え
ば水酸基、アミノ基、カルボキシル基、イソシアネート
基など）を導入し、両者を化学反応により結合させるこ
とによって行うこともできる。この際、親水性のブロッ
ク中には通常、反応活性な官能基を複数導入する。For the bond between the block having a cloud point and the hydrophilic block, a reactive functional group (for example, a hydroxyl group, an amino group, a carboxyl group, an isocyanate group, etc.) is previously introduced into both of them to chemically react them. It can also be carried out by binding with. At this time, usually, a plurality of reactive functional groups are introduced into the hydrophilic block.

【００４６】また、曇点を有するポリプロピレンオキサ
イドと親水性のブロックとの結合は、例えば、アニオン
重合またはカチオン重合で、プロピレンオキサイドと
「他の親水性ブロック」を構成するモノマー（例えばエ
チレンオキサイド）とを繰り返し逐次重合させること
で、ポリプロピレンオキサイドと「親水性ブロック」
（例えばポリエチレンオキサイド）が結合したブロック
共重合体を得ることができる。このようなブロック共重
合体は、ポリプロピレンオキサイドの末端に重合性基
（例えばアクリロイル基）を導入後、親水性のブロック
を構成するモノマーを共重合させることによっても得る
ことができる。The bond between the polypropylene oxide having a cloud point and the hydrophilic block is, for example, by anionic polymerization or cationic polymerization, with propylene oxide and a monomer (for example, ethylene oxide) forming "another hydrophilic block". By repeating the sequential polymerization of polypropylene oxide and "hydrophilic block"
A block copolymer having (for example, polyethylene oxide) bound thereto can be obtained. Such a block copolymer can also be obtained by introducing a polymerizable group (for example, an acryloyl group) at the terminal of polypropylene oxide and then copolymerizing a monomer forming a hydrophilic block.

【００４７】更には、親水性のブロック中に、ポリプロ
ピレンオキサイド末端の官能基（例えば水酸基）と結合
反応し得る官能基を導入し、両者を反応させることによ
っても、本発明に用いる高分子化合物を得ることができ
る。また、ポリプロピレングリコールの両端にポリエチ
レングリコールが結合した、プルロニック Ｆ−１２７
（商品名、旭電化工業（株）製）のような材料を連結さ
せることによっても、本発明に用いる高分子化合物を得
ることができる。Further, by introducing into the hydrophilic block a functional group capable of undergoing a binding reaction with a functional group (eg, hydroxyl group) at the terminal of polypropylene oxide, and reacting both, the polymer compound used in the present invention can be obtained. Obtainable. In addition, Pluronic F-127 with polyethylene glycol bonded to both ends of polypropylene glycol
The polymer compound used in the present invention can also be obtained by connecting materials such as (trade name, manufactured by Asahi Denka Kogyo Co., Ltd.).

【００４８】本発明の高分子化合物は、曇点より低い温
度においては、分子内に存在する上記「曇点を有するブ
ロック」が親水性のブロックとともに水溶性であるの
で、完全に水に溶解し、ゾル状態を示す。The polymer compound of the present invention is completely soluble in water at a temperature lower than the cloud point, because the "block having a cloud point" existing in the molecule is water-soluble together with the hydrophilic block. , Shows the sol state.

【００４９】しかし、この高分子化合物の水溶液の温度
を上記曇点より高い温度に加温すると、分子内に存在す
る「曇点を有するブロック」が疎水性となり、疎水的相
互作用によって、別個の分子間で会合する。However, when the temperature of the aqueous solution of the polymer compound is heated to a temperature higher than the cloud point, the "block having a cloud point" existing in the molecule becomes hydrophobic, and the hydrophobic interaction causes a distinction. It associates between molecules.

【００５０】一方、親水性のブロックは、この時（曇点
より高い温度に加温された際）でも水溶性であるので、
本発明の高分子化合物は水中において、曇点を有するブ
ロック間の疎水性会合部を架橋点とした三次元網目構造
を持つハイドロゲルを生成する。このハイドロゲルの温
度を再び、分子内に存在する「曇点を有するブロック」
の曇点より低い温度に冷却すると、該曇点を有するブロ
ックが水溶性となり、疎水性会合による架橋点が解放さ
れ、ハイドロゲル構造が消失して、本発明の高分子化合
物は、再び完全な水溶液となる。このように、本発明の
高分子化合物のゾルーゲル転移は、分子内に存在する曇
点を有するブロックの該曇点における可逆的な親水性、
疎水性の変化に基づくものであるので、温度変化に対応
して、完全な可逆性を有する。On the other hand, since the hydrophilic block is water-soluble even at this time (when heated to a temperature higher than the cloud point),
In water, the polymer compound of the present invention forms a hydrogel having a three-dimensional network structure having a hydrophobic association portion between blocks having a cloud point as a crosslinking point. The temperature of this hydrogel is once again the "block with cloud point" that exists in the molecule.
When cooled to a temperature lower than the cloud point of 1, the block having the cloud point becomes water-soluble, the cross-linking point due to hydrophobic association is released, the hydrogel structure disappears, and the polymer compound of the present invention is completely regenerated. It becomes an aqueous solution. As described above, the sol-gel transition of the polymer compound of the present invention is the reversible hydrophilicity at the cloud point of the block having the cloud point existing in the molecule,
Since it is based on the change in hydrophobicity, it has complete reversibility in response to temperature changes.

【００５１】本発明者の知見によれば、本発明に用いる
高分子化合物をそのゾルーゲル転移温度より高い温度で
ゲル化させた後に更に多量（体積比で、ゲルの０．１〜
１００倍程度）の水を加えても、該ゲルは溶解すること
はない。このような本発明に用いる高分子化合物の性質
は、該高分子化合物内に曇点を有するブロックが２個以
上（複数個）存在することによって達成される。According to the knowledge of the present inventor, after polymerizing the polymer compound used in the present invention at a temperature higher than its sol-gel transition temperature, a larger amount (0.1 to 10% by volume of gel) is obtained.
The gel does not dissolve even when water (about 100 times) is added. The property of the polymer compound used in the present invention is achieved by the presence of two or more (plural) blocks having a cloud point in the polymer compound.

【００５２】（高分子層の厚さ）上述したような性質を
有する高分子の層の形状あるいは厚さは、該高分子層上
で生物組織の培養が可能である限り特に制限されない
が、高分子層形成の容易性ないしコストの点を考慮すれ
ば、通常、０．５μｍ〜１．０ｍｍであることが好まし
く、更には１μｍ〜１００μｍ（特に２μｍ〜５０μ
ｍ）であることが好ましい。(Thickness of Polymer Layer) The shape or thickness of the polymer layer having the above-mentioned properties is not particularly limited as long as the biological tissue can be cultured on the polymer layer, but it is not limited. Considering the ease and cost of forming the molecular layer, the thickness is usually preferably 0.5 μm to 1.0 mm, more preferably 1 μm to 100 μm (particularly 2 μm to 50 μm).
m) is preferred.

【００５３】（支持体）上記高分子の層をその上に設け
るべき支持体の材料、大きさ、ないし形状は、該支持体
上で生物組織の固定化ないし培養が可能である限り特に
制限されない。より具体的には例えば、上記支持体とし
て、従来、生物組織の固定化ないし培養に使用されてい
るディッシュ、シャーレ、マイクロテストプレート（複
数の凹部ないしウェルを表面に有するプレート）、フラ
スコ、培養管あるいは培養瓶などの固定化／培養器具の
培養面を好適に使用することが可能である。(Support) The material, size and shape of the support on which the polymer layer is to be provided are not particularly limited as long as the biological tissue can be immobilized or cultured on the support. . More specifically, for example, as the support, a dish, a petri dish, a microtest plate (a plate having a plurality of recesses or wells on the surface), a flask, a culture tube, which has been conventionally used for immobilizing or culturing biological tissues. Alternatively, the culture surface of an immobilization / culture device such as a culture bottle can be preferably used.

【００５４】また平滑なフィルムあるいはシート（好ま
しくは、厚さ１０μｍ〜１ｍｍ程度）を支持体として、
上記高分子化合物の層をコーティング等により設けて本
発明の固定化用器具とした後、上記したような従来の種
々の固定化／培養器具の固定化／培養面上に設置するこ
とも可能である。A smooth film or sheet (preferably having a thickness of about 10 μm to 1 mm) is used as a support.
It is also possible to provide the above-mentioned polymer compound layer by coating or the like to form the immobilization instrument of the present invention, and then install it on the immobilization / culture surface of various conventional immobilization / culture instruments as described above. is there.

【００５５】支持体の材料ないし材質としては、透明、
半透明又は不透明のいずれの材料を用いてもよいが、裏
面（上記高分子の層を設けた支持体面と反対側の面）か
らの観察ないし光学的測定が容易な点からは、透明性の
良好なガラス、プラスチック（ポリスチレン、ポリメチ
ルメタクリレート、ポリカーボネート等）などが支持体
として好適に用いられる。The material or materials of the support are transparent,
Either a semi-transparent material or an opaque material may be used, but in view of easy observation or optical measurement from the back surface (the surface opposite to the surface of the support provided with the polymer layer), the transparency is Good glass and plastic (polystyrene, polymethylmethacrylate, polycarbonate, etc.) are preferably used as the support.

【００５６】（生物組織）本発明において、「生物組
織」とは、動物、植物、微生物等の生物自体ないしその
組織をいい、組織、器官そのものから組織、器官の断
片、さらには組織、器官から分離した細胞ないしその集
合体を包含する意味で用いる。(Biological tissue) In the present invention, "biological tissue" refers to an organism itself such as an animal, a plant, a microorganism, or a tissue thereof, from a tissue or an organ itself to a tissue or a fragment of an organ, or from a tissue or an organ. Used to include isolated cells or aggregates thereof.

【００５７】本発明においては、上記生物組織は、上記
した高分子化合物の層中にその一部又は全部が埋められ
る（embed ）ことにより固定化される。この固定化を行
う際に、該生物組織の少なくとも一部は上記高分子化合
物層に接触させられるが、このような接触は、生物組織
を直接高分子化合物層上に配置する（例えば、生物組織
を高分子化合物層上にふりかける）ことにより行っても
よく、また、生物組織を適当な液体（例えば、培地）中
に懸濁させた懸濁液を上記高分子化合物層上に乗せ、該
生物組織を高分子化合物層上に沈降させることにより行
ってもよい。生物組織の高分子化合物層上への均等な配
置が容易な点からは、後者の方法を用いることが好まし
い。In the present invention, the above-mentioned biological tissue is immobilized by embedding a part or all of the above-mentioned polymer compound layer. When performing this immobilization, at least a part of the biological tissue is brought into contact with the polymer compound layer, and such contact places the biological tissue directly on the polymer compound layer (for example, biological tissue). May be sprinkled on the polymer compound layer), or a suspension of biological tissue in a suitable liquid (for example, a medium) may be placed on the polymer compound layer, It may be performed by allowing the tissue to settle on the polymer compound layer. The latter method is preferably used because it is easy to evenly dispose the biological tissue on the polymer compound layer.

【００５８】（固定化用器具の製造方法）次に、本発明
の固定化用器具の製造方法の具体的な一例を示す。(Method for Manufacturing Fixing Device) Next, a specific example of the method for manufacturing the fixing device of the present invention will be described.

【００５９】例えば、本発明に用いる高分子化合物を有
機溶媒に溶解するか、該ゾル−ゲル転移温度よりも低い
温度で水に溶解するか、該ゾル−ゲル転移温度より高い
温度でもゲル化しないような低濃度で水に溶解し、該溶
液をソルベントキャスティング（Solvent Casting:溶液
流延）することによって、支持体の上にコーティングし
た後、該有機溶媒あるいは水を蒸散させることによっ
て、乾燥した上記高分子化合物のコーティング層を支持
体上に形成させる。For example, the polymer compound used in the present invention is dissolved in an organic solvent, dissolved in water at a temperature lower than the sol-gel transition temperature, or does not gel at a temperature higher than the sol-gel transition temperature. It is dissolved in water at such a low concentration, the solution is solvent-cast (Solvent Casting) to coat the support, and then the organic solvent or water is evaporated to dry the solution. A polymer compound coating layer is formed on a support.

【００６０】上記コーティング層の厚さは、乾燥状態で
通常０．５μｍ〜１．０ｍｍ、更には１μｍ〜１００μ
ｍ（特に２μｍ〜５０μｍ）であることが好ましい。コ
ーティング層の厚さは、コーティング溶液中の高分子化
合物の濃度、被コーティング支持体上にのせる溶液量等
を調整することによって、自由にコントロールすること
が可能である。The thickness of the coating layer is usually 0.5 μm to 1.0 mm, more preferably 1 μm to 100 μm in a dry state.
m (particularly 2 μm to 50 μm) is preferable. The thickness of the coating layer can be freely controlled by adjusting the concentration of the polymer compound in the coating solution, the amount of the solution placed on the substrate to be coated, and the like.

【００６１】（固定化用器具の使用方法）次に、本発明
の固定化用器具を実際に使用する際の使用方法（細胞又
は微生物の固定化ないし培養方法）の一例について、具
体的に説明する。(Method of Using Immobilization Device) Next, an example of a method of using the immobilization device of the present invention (immobilization or culturing method of cells or microorganisms) will be specifically described. To do.

【００６２】上記高分子化合物がコーティングされた固
定化用器具（本発明の固定化用器具）中に、上記高分子
化合物水溶液のゾル−ゲル転移温度より高い温度で、細
胞あるいは微生物の培地（液体培地が好ましい）懸濁液
を注入し、上記細胞あるいは微生物を該高分子化合物の
コーティング層上に沈降させて、該コーティング層に上
記細胞あるいは微生物を接触させた後、該固定化用器具
の温度をゾル−ゲル転移温度より低い温度に下げること
により、該コーティング高分子化合物の一部または全部
を溶解させ、該細胞あるいは微生物の一部または全部を
該コーティング高分子化合物の溶液中に埋没させた後、
直ちに固定化用器具の温度をゾル−ゲル転移温度より高
い温度に高めることにより、一旦溶解した上記コーティ
ング高分子化合物を再びゲル化させ、該ゲル中に上記細
胞あるいは微生物の一部または全部を包埋し該固定化用
器具上に固定することができる。In the immobilization instrument coated with the polymer compound (immobilization instrument of the present invention), at a temperature higher than the sol-gel transition temperature of the aqueous solution of the polymer compound, a cell or microorganism culture medium (liquid A medium is preferred) A suspension is injected, the cells or microorganisms are allowed to settle on the coating layer of the polymer compound, and the cells or microorganisms are brought into contact with the coating layer, and then the temperature of the immobilization instrument is adjusted. To a temperature lower than the sol-gel transition temperature to dissolve some or all of the coating polymer compound and to bury some or all of the cells or microorganisms in a solution of the coating polymer compound. rear,
Immediately by raising the temperature of the immobilization device to a temperature higher than the sol-gel transition temperature, the once dissolved coating polymer compound is gelated again, and a part or all of the cells or microorganisms are encapsulated in the gel. It can be embedded and fixed on the fixing device.

【００６３】このように固定した上記細胞あるいは微生
物は、培養操作のみならずマイクロインジェクション法
その他の処理、あるいはバイオリアクター等に好適に用
いることができる。The cells or microorganisms thus fixed can be suitably used not only for culturing operation but also for microinjection method and other treatments, bioreactors and the like.

【００６４】さらに上記の方法で固定化用器具上に固定
化（更には必要に応じて培養）した細胞あるいは微生物
に関しては、上記固定化用器具の温度を高分子化合物の
ゾル−ゲル転移温度より低い温度に下げることにより、
コーティング高分子化合物を再びゾル化して、上記細胞
あるいは微生物を固定化用器具上から分離することがで
きる。このようにして固定化ないし培養した上記細胞あ
るいは微生物を、これらに損傷を与えることなく回収あ
るいは継代することが可能である。Further, regarding cells or microorganisms immobilized on the immobilization instrument by the above-mentioned method (and further cultured if necessary), the temperature of the immobilization instrument is determined from the sol-gel transition temperature of the polymer compound. By lowering it to a lower temperature,
The coating polymer compound can be sol again to separate the cells or microorganisms from the immobilization device. The cells or microorganisms thus immobilized or cultured can be recovered or passaged without damaging them.

【００６５】上記の一連の操作（培養に用いる場合）を
模式的に図１（ａ）〜（ｆ）の断面図に示す。図１にお
ける各図の意味は以下の通りである。The above series of operations (when used for culturing) are schematically shown in the sectional views of FIGS. 1 (a) to 1 (f). The meaning of each figure in FIG. 1 is as follows.

【００６６】（ａ）：支持体たるディッシュ１上にコー
ティング用高分子化合物２をコートした本発明の固定化
器具（コートディッシュ）３を示す。(A): Shows the immobilizing instrument (coated dish) 3 of the present invention in which the polymeric compound 2 for coating is coated on the dish 1 which is a support.

【００６７】（ｂ）：上記高分子化合物のゾル−ゲル転
移温度より高い温度で、細胞（または微生物）４の培地
５への分散液を、上記コートディッシュ３に注入した状
態を示す。(B): Shows a state in which a dispersion liquid of cells (or microorganisms) 4 in the medium 5 is injected into the coated dish 3 at a temperature higher than the sol-gel transition temperature of the above-mentioned polymer compound.

【００６８】（ｃ）：上記ゾル−ゲル転移温度より高い
温度で、細胞（または微生物）４が沈降して、膨潤した
コート層２ａに接触するまで放置した状態を示す。(C): Shows a state in which cells (or microorganisms) 4 are settled at a temperature higher than the sol-gel transition temperature and contacted with the swollen coat layer 2a.

【００６９】（ｄ）：上記ゾル−ゲル転移温度より低い
温度で、膨潤した高分子化合物層２ａの一部２ｂを溶解
し、細胞（または微生物）４を、この溶解した高分子の
層２ｂの中に沈降させた状態を示す。(D): A part 2b of the swollen polymer compound layer 2a is dissolved at a temperature lower than the sol-gel transition temperature, and cells (or microorganisms) 4 are dissolved in the dissolved polymer layer 2b. Shown is the state of sedimentation.

【００７０】（ｅ）：上記ゾル−ゲル転移温度より高い
温度で、溶解した高分子化合物の層２ｂを再びゲル化さ
せ、細胞（または微生物）４をこのゲル化した高分子の
層２ｃ上に固定した状態を示す。(E): The layer 2b of the dissolved polymer compound is gelled again at a temperature higher than the sol-gel transition temperature, and the cells (or microorganisms) 4 are placed on the gelled polymer layer 2c. The fixed state is shown.

【００７１】（ｆ）：上記ゾル−ゲル転移温度より低い
温度で、上記ゲル化層２ｃをゾル化させ、固定していた
細胞（または微生物）４を培地５ａ中に再浮遊させた状
態（細胞等の回収が容易な状態）を示す。この（ｆ）の
状態においては、上記コーティング用高分子化合物は、
培地５ａ中に実質的に溶解ないし拡散している。(F): The gelled layer 2c is solized at a temperature lower than the sol-gel transition temperature, and the fixed cells (or microorganisms) 4 are resuspended in the medium 5a (cells It is easy to collect such items). In the state (f), the polymer compound for coating is
It is substantially dissolved or diffused in the medium 5a.

【００７２】本発明の固定化用器具を用いて細胞あるい
は微生物などのクローニングを行う場合には、上記した
高分子化合物コーティング層上でそれぞれ独立のコロニ
ーが形成可能な程度に濃度を希釈した細胞あるいは微生
物の培地懸濁液を、該コーティング層上に播種し、上記
の方法で播種した細胞あるいは微生物を該コーティング
高分子化合物ゲル上ないしゲル中に固定化した後、培養
し、それぞれのコロニーを形成させればよい。更に、こ
のようにして形成したコロニーは、上記した方法によっ
て容易にかつ該コロニーに何らの損傷を与えることな
く、回収あるいは継代することが可能である。When cells or microorganisms are cloned using the immobilization device of the present invention, cells or microorganisms whose concentration is diluted to the extent that independent colonies can be formed on the above-mentioned polymer compound coating layer or A culture medium suspension of a microorganism is seeded on the coating layer, and the cells or microorganisms seeded by the above method are immobilized on or in the coating polymer compound gel and then cultured to form each colony. You can do it. Furthermore, the colony thus formed can be easily recovered or subcultured by the method described above without damaging the colony.

【００７３】本発明の固定化用器具を用いて細胞又は微
生物を固定化すれば、該細胞等に対する薬剤のスクリー
ニングを効率よく行うことができる。例えば、癌細胞に
対する制癌剤のスクリーニング、あるいは微生物に対す
る抗生物質のスクリーニングなどを行う場合には、上記
した方法で癌細胞あるいは微生物の培地懸濁液を本発明
の固定化用器具上に播種、固定化した後、培養してそれ
ぞれのコロニーを形成させた後、各種の制癌剤あるいは
抗生物質を、種々の濃度、時間で液体培地に添加して、
上記コロニー上に配置することにより、上記細胞あるい
は微生物のそれぞのコロニーに対する薬理活性を評価す
ることが可能である。By immobilizing cells or microorganisms using the immobilization instrument of the present invention, it is possible to efficiently screen the cells or the like for a drug. For example, when screening an antitumor agent against cancer cells, or screening antibiotics against microorganisms, etc., seeding and immobilizing a culture medium suspension of cancer cells or microorganisms on the immobilization device of the present invention by the method described above. After that, after culturing to form each colony, various anticancer agents or antibiotics are added to the liquid medium at various concentrations and times,
By arranging on the above colony, it is possible to evaluate the pharmacological activity of the above-mentioned cells or microorganisms against each colony.

【００７４】本発明の固定化用器具を用いれば、温度コ
ントロールにより、細胞又は微生物を回数の制限なく容
易に固定化／回収できるため、液体培地中の薬剤の種
類、濃度および接触時間などを異ならせることにより、
異なる条件下での薬剤のスクリーニングを容易に行うこ
とができる。By using the immobilization instrument of the present invention, cells or microorganisms can be easily immobilized / recovered by controlling the temperature without limitation of the number of times, so that the type, concentration, contact time, etc. of the drug in the liquid medium can be varied. By letting
Screening of drugs under different conditions can be easily performed.

【００７５】これに対して、従来の寒天などのゲル培地
を用いた場合には、上記液体培地を用いた場合と異な
り、一度ゲル化させるとゲル中の薬剤の種類、濃度およ
び接触時間などを変えて測定することは困難である。On the other hand, when a conventional gel medium such as agar is used, unlike the case where the above liquid medium is used, once gelled, the kind, concentration and contact time of the drug in the gel are determined. It is difficult to change and measure.

【００７６】本発明の固定化用器具を用いて細胞のin v
itroでの形質転換の判別、細胞の分化機構および遺伝学
的解析、細胞の運動能の測定などを行う場合は、上記し
た方法で該固定化用器具上に細胞を固定化し、培養する
ことによって実施できる。Using the immobilization instrument of the present invention,
When iterative transformation is determined, cell differentiation mechanism and genetic analysis, and cell motility is measured, by immobilizing the cells on the immobilizing instrument by the method described above and culturing Can be implemented.

【００７７】本発明の固定化用器具を用いて卵母細胞な
どの細胞に外来遺伝子を導入することも可能である。即
ち、上記した方法で卵母細胞などの細胞を該固定化器具
上に固定化することができるため、従来のマイクロイン
ジェクション法で用いられてきた固定用のガラス製ピペ
ットを使用する必要がない。したがって本発明の固定化
法によれば、固定化の際の細胞に対する機械的損傷が著
しく抑制されると同時に、操作の手間および煩雑性が著
しく軽減される。It is also possible to introduce a foreign gene into cells such as oocytes using the immobilization instrument of the present invention. That is, since cells such as oocytes can be immobilized on the immobilization instrument by the above-mentioned method, it is not necessary to use a glass pipette for fixation which has been used in the conventional microinjection method. Therefore, according to the immobilization method of the present invention, mechanical damage to cells during immobilization is significantly suppressed, and at the same time, labor and complexity of the operation are significantly reduced.

【００７８】[0078]

【実施例】以下に実施例を示し、本発明を更に具体的に
説明するが、本発明の範囲は特許請求の範囲により限定
されるものであり、以下の実施例によって限定されるも
のではない。EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the scope of the present invention is limited by the claims and is not limited by the following examples. .

【００７９】製造例１ （コーティング用高分子化合物Ｎｏ．１の合成）トリメ
チロールプロパン１モルに対し、エチレンオキサイド１
６０モルをカチオン重合により付加して、平均分子量約
７０００のポリエチレンオキサイドトリオールを得た。
このポリエチレンオキサイドトリオール１００ｇを蒸留
水１０００ｍｌに溶解した後、室温で過マンガン酸カリ
ウム１２ｇを徐徐に加えて、そのまま約１時間酸化反応
させた。固形物を濾過により除いた後、生成物をクロロ
ホルムで抽出し、溶媒（クロロホルム）を減圧留去して
ポリエチレンオキサイドトリカルボキシル体９０ｇを得
た。 Production Example 1 (Synthesis of Coating Polymer Compound No. 1) 1 mol of ethylene oxide was added to 1 mol of trimethylolpropane.
60 mol was added by cationic polymerization to obtain polyethylene oxide triol having an average molecular weight of about 7,000.
After dissolving 100 g of this polyethylene oxide triol in 1000 ml of distilled water, 12 g of potassium permanganate was gradually added at room temperature, and the oxidation reaction was continued for about 1 hour. After removing the solid matter by filtration, the product was extracted with chloroform, and the solvent (chloroform) was distilled off under reduced pressure to obtain 90 g of a polyethylene oxide tricarboxylate.

【００８０】このポリエチレンオキサイドトリカルボキ
シル体１０ｇと、ポリプロピレンオキサイドジアミノ体
（プロピレンオキサイド平均重合度約６５、米国ジェフ
ァーソンケミカル社製、商品名：ジェファーミンＤ−４
０００、曇点：約９℃）１０ｇとを四塩化炭素１０００
ｍｌに溶解し、ジシクロヘキシルカルボジイミド１．２
ｇを加えた後、沸点還流下に６時間反応させた。反応液
を冷却し、固形物を濾過により除いた後、溶媒（四塩化
炭素）を減圧留去し、残さを真空乾燥して、複数のポリ
プロピレンオキサイドとポリエチレンオキサイドとが結
合したコーティング用高分子化合物（高分子化合物Ｎ
ｏ．１）を得た。これを氷冷下、５ｗｔ％の濃度で蒸留
水に溶解し、そのゾル−ゲル転移温度を測定したとこ
ろ、約１６℃であった。10 g of this polyethylene oxide tricarboxylate and polypropylene oxide diamino (average propylene oxide degree of polymerization of about 65, manufactured by Jefferson Chemical Company, USA, trade name: Jeffamine D-4)
000, cloud point: about 9 ° C) 10 g and carbon tetrachloride 1000
Dissolve in ml and dicyclohexylcarbodiimide 1.2
After adding g, the mixture was reacted for 6 hours under reflux of boiling point. After cooling the reaction solution and removing the solid matter by filtration, the solvent (carbon tetrachloride) was distilled off under reduced pressure, the residue was vacuum dried, and a polymer compound for coating in which a plurality of polypropylene oxides and polyethylene oxides were bound (Polymer compound N
o. 1) was obtained. This was dissolved in distilled water at a concentration of 5 wt% under ice cooling, and the sol-gel transition temperature was measured and found to be about 16 ° C.

【００８１】製造例２ （コーティング用高分子化合物Ｎｏ．２の合成）Ｎ−イ
ソプロピルアクリルアミド（イーストマンコダック社
製）９６ｇ、Ｎ−アクリロキシスクシンイミド（国産化
学（株）製）１７ｇ、およびｎ−ブチルメタクリレート
（関東化学（株）製）７ｇをクロロホルム４０００ｍｌ
に溶解し、窒素置換後、Ｎ，Ｎ’−アゾビスイソブチロ
ニトリル１．５ｇを加え、６０℃で６時間重合させた。
反応液を濃縮した後、ジエチルエーテルに再沈（再沈
殿）した。濾過により固形物を回収した後、真空乾燥し
て、７８ｇのポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−
コ−Ｎ−アクリロキシスクシンイミド−コ−ｎ−ブチル
メタクリレート）を得た。 Production Example 2 (Synthesis of Polymer Compound No. 2 for Coating) 96 g of N-isopropylacrylamide (manufactured by Eastman Kodak Company), 17 g of N-acryloxysuccinimide (manufactured by Kokusan Kagaku Co., Ltd.), and n-butyl. 7 g of methacrylate (made by Kanto Chemical Co., Inc.) and 4000 ml of chloroform
Was dissolved in, and after nitrogen substitution, 1.5 g of N, N'-azobisisobutyronitrile was added, and polymerization was performed at 60 ° C for 6 hours.
The reaction solution was concentrated and then reprecipitated (reprecipitated) in diethyl ether. After collecting the solid by filtration, it was dried in vacuum to give 78 g of poly (N-isopropylacrylamide-
Co-N-acryloxysuccinimide-co-n-butylmethacrylate) was obtained.

【００８２】上記により得たポリ（Ｎ−イソプロピルア
クリルアミド−コ−Ｎ−アクリロキシスクシンイミド−
コ−ｎ−ブチルメタクリレート）に、過剰のイソプロピ
ルアミンを加えてポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミ
ド−コ−ｎ−ブチルメタクリレート）を得た。このポリ
（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−ｎ−ブチルメ
タクリレート）の水溶液の曇点は１９℃であった。The poly (N-isopropylacrylamide-co-N-acryloxysuccinimide-obtained above was obtained.
Co-n-butylmethacrylate) was added with excess isopropylamine to obtain poly (N-isopropylacrylamide-co-n-butylmethacrylate). The cloud point of this aqueous solution of poly (N-isopropylacrylamide-co-n-butylmethacrylate) was 19 ° C.

【００８３】前記のポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルア
ミド−コ−Ｎ−アクリロキシスクシンイミド−コ−ｎ−
ブチルメタクリレート）１０ｇ、および両末端アミノ化
ポリエチレンオキサイド（分子量６，０００、川研ファ
インケミカル（株）製）５ｇをクロロホルム１０００ｍ
ｌに溶解し、５０℃で３時間反応させた。室温まで冷却
後、イソプロピルアミン１ｇを加え、１時間放置した
後、反応液を濃縮し、残渣をジエチルエーテル中に沈澱
させた。濾過により固形物を回収した後、真空乾燥し
て、複数のポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ
−ｎ−ブチルメタクリレート）とポリエチレンオキサイ
ドとが結合したコーティング用高分子化合物（高分子化
合物Ｎｏ．２）を得た。このようにして得た高分子化合
物Ｎｏ．２を氷冷下、５ｗｔ％の濃度で蒸留水に溶解
し、そのゾル−ゲル転移温度を測定したところ、約２１
℃であった。The above poly (N-isopropylacrylamide-co-N-acryloxysuccinimide-co-n-
Butyl methacrylate) 10 g and both-end aminated polyethylene oxide (molecular weight 6,000, manufactured by Kawaken Fine Chemical Co., Ltd.) 5 g of chloroform 1000 m
It was dissolved in 1 and reacted at 50 ° C. for 3 hours. After cooling to room temperature, 1 g of isopropylamine was added and the mixture was allowed to stand for 1 hour, then the reaction solution was concentrated and the residue was precipitated in diethyl ether. After the solid matter is collected by filtration, the solid matter is vacuum dried and a plurality of poly (N-isopropylacrylamide-co-n-butylmethacrylate) and polyethylene oxide are bonded to the polymer compound for coating (polymer compound No. 2). Got The thus obtained polymer compound No. 2 was dissolved in distilled water at a concentration of 5 wt% under ice cooling, and its sol-gel transition temperature was measured.
It was ℃.

【００８４】製造例３ （コーティング用高分子化合物の滅菌方法）上記した製
造例１又は２により得たコーティング用高分子化合物
（高分子化合物Ｎｏ．１又はＮｏ．２）２．０ｇを、Ｅ
ＯＧ（エチレンオキサイドガス）滅菌バッグ（ホギメデ
ィカル社製、商品名：ハイブリッド滅菌バッグ）に入
れ、ＥＯＧ滅菌装置（イージーパック、井内盛栄堂製）
でＥＯＧをバッグに充填し、室温にて一昼夜放置した。
さらに４０℃で半日放置した後、ＥＯＧをバッグから抜
き、エアレーションを行った。バッグを真空乾燥器（４
０℃）に入れ、時々エアレーションしながら半日放置す
ることにより滅菌した。この滅菌操作により高分子化合
物のゾル−ゲル転移温度が変化しないことを別途確認し
た。 Production Example 3 (Method for sterilizing polymer compound for coating) 2.0 g of the polymer compound for coating (polymer compound No. 1 or No. 2) obtained in Production Example 1 or 2 above was mixed with E
Put it in an OG (ethylene oxide gas) sterilization bag (manufactured by Hogy Medical Co., Ltd., product name: hybrid sterilization bag), and EOG sterilizer (Easy Pack, Inei Seieido)
Then, the bag was filled with EOG and left at room temperature for 24 hours.
Further, after leaving it at 40 ° C. for half a day, EOG was taken out of the bag and aerated. Vacuum bag (4
It was sterilized by placing it at 0 ° C. and leaving it for half a day with occasional aeration. It was separately confirmed that this sterilization operation did not change the sol-gel transition temperature of the polymer compound.

【００８５】実施例１ （コートディッシュの作製）上記製造例３により滅菌し
た高分子化合物（高分子化合物Ｎｏ．１または２）２．
０ｇを１００ｍｌメジューム瓶（予め乾熱滅菌したも
の）に入れ、４０ｍｌの蒸留水（予めオートクレーブで
滅菌したもの）を加え、４℃の冷蔵庫中で一晩溶解し、
５％（ｗ／ｖ）の高分子水溶液を得た。この高分子水溶
液１ｍｌを市販の直径３５ｍｍφディッシュ（Ｆａｌｃ
ｏｎ ３００１，日本ベクトン製）に加え、素早くディ
ッシュ底面に均一に広げてキャストすることにより、該
ディッシュ上に上記高分子化合物の層を形成した。この
ディッシュを１０℃の乾燥チャンバーで一晩乾燥し、コ
ートディッシュ（本発明の固定化器具）を作製した。キ
ャストした上記高分子水溶液は、ディッシュの底面に密
着した透明なフィルムとなっていた。乾燥後のコート層
の厚みは約５０μｍであった。このコート層の厚みは、
上記高分子水溶液の濃度、またはキャストする該溶液の
量を調節することにより変えることができた。また、大
きなディッシュ（直径６０ｍｍ程度）を用いた場合に
も、同様の手順でコートディッシュを作製することがで
きた。以上の操作はすべて無菌的な環境下で行った。 Example 1 (Preparation of coated dish) Polymer compound sterilized by the above Production Example 3 (polymer compound No. 1 or 2) 2.
0 g was put in a 100 ml medium bottle (pre-sterilized by dry heat), 40 ml of distilled water (pre-sterilized by autoclave) was added, and the mixture was dissolved overnight in a refrigerator at 4 ° C.,
A 5% (w / v) polymer aqueous solution was obtained. 1 ml of this polymer aqueous solution is used as a commercially available 35 mmφ dish (Falc
on 3001, manufactured by Nippon Becton Co., Ltd.) and quickly spread evenly on the bottom of the dish and cast to form a layer of the polymer compound on the dish. This dish was dried overnight in a drying chamber at 10 ° C. to prepare a coated dish (immobilization device of the present invention). The cast polymer aqueous solution was a transparent film that adhered to the bottom surface of the dish. The thickness of the coat layer after drying was about 50 μm. The thickness of this coat layer is
It could be changed by adjusting the concentration of the polymer aqueous solution or the amount of the solution to be cast. Further, even when a large dish (diameter of about 60 mm) was used, a coated dish could be prepared by the same procedure. All of the above operations were performed in a sterile environment.

【００８６】実施例２ 上記実施例１の方法で作製したコートディッシュを細胞
固定実験に用いた。本実施例においては、高分子化合物
Ｎｏ．２（ゾル−ゲル転移温度２１℃）を用いて作製し
たコートディッシュを使用した。コートディッシュのコ
ート層の厚みは、１００μｍ、５０μｍ、２５μｍ、お
よび１０μｍの４種類とした。 Example 2 The coated dish prepared by the method of Example 1 was used in a cell fixing experiment. In this example, the polymer compound No. The coated dish prepared by using 2 (sol-gel transition temperature 21 ° C.) was used. The thickness of the coat layer of the coated dish was set to four types of 100 μm, 50 μm, 25 μm, and 10 μm.

【００８７】一方、実験に用いる胆管癌細胞（ＭＥＣ）
は、予めトリプシン／ＥＤＴＡ溶液で処理して培養フラ
スコから回収し、遠心（２２０×Ｇ、５分）後、上澄み
を除去し、ＲＰＭＩ １６４０培地（日水製薬製、１０
％牛胎児血清含有）に懸濁した。細胞濃度は1 ×１０5
ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるようした。On the other hand, cholangiocarcinoma cells (MEC) used in the experiment
Was previously treated with a trypsin / EDTA solution, recovered from the culture flask, centrifuged (220 × G, 5 minutes), the supernatant was removed, and RPMI 1640 medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical, 10
% Fetal calf serum). Cell concentration is 1 × 10 5
cells / ml.

【００８８】上記により得た細胞懸濁液１ｍｌを３７℃
に暖めた後、実施例１の方法で作製したコートディッシ
ュ（日本ベクトン製Ｆａｌｃｏｎ３００１上に高分子化
合物Ｎｏ．２をコートしたもの）に分注し、直ちに３７
℃（上記高分子化合物のゾル−ゲル転移温度２１℃より
高い温度）のインキュベーター（５％炭酸ガス／９５％
空気）に入れ、５分間インキュベートした。この間に、
懸濁していた細胞はすべてディッシュ底面に沈降した。
ディッシュを４℃の冷蔵庫に移し５分間冷却することに
より、（播種した細胞を固定するために）ディッシュに
コートした高分子化合物の一部を一旦溶解した。その
後、該ディッシュを３７℃のインキュベーターに１０分
間入れ、上記により一部溶解した高分子化合物を再度ゲ
ル化させることにより、細胞の固定を行った。細胞の固
定状態は、目視及び倒立顕微鏡により観察した。1 ml of the cell suspension obtained above was placed at 37 ° C.
After warming to 0 ° C., it was dispensed into a coated dish prepared by the method of Example 1 (Falcon 3001 manufactured by Nippon Becton Co., Ltd., which was coated with polymer compound No. 2) and immediately 37
Incubator (5% carbon dioxide gas / 95%) (temperature higher than the sol-gel transition temperature of 21 ° C. of the polymer compound)
Air) and incubated for 5 minutes. During this time,
All the suspended cells settled on the bottom of the dish.
A part of the polymer compound coated on the dish (to fix the seeded cells) was once dissolved by transferring the dish to a refrigerator at 4 ° C. and cooling for 5 minutes. Then, the dish was placed in an incubator at 37 ° C. for 10 minutes, and the polymer compound partially dissolved as described above was gelled again to fix the cells. The fixed state of the cells was observed visually and by an inverted microscope.

【００８９】予め３７℃に保温しておいたプレート（マ
イクロウォームプレート、北里サプライ製）上に上記デ
ィッシュを移し、細胞の固定状態を確認した。ディッシ
ュを軽くゆらしても細胞は動かず、ディッシュ底面にし
っかりと固定されていた。一方、加えた培地（コートデ
ィッシュ上に配置したＲＰＭＩ １６４０培地）には何
等変化はなく、溶液の状態のままであった。この結果よ
り、ディッシュ上にコートした高分子化合物の一部が一
旦溶解した後、ゲル化して細胞を固定していることが確
認された。The above dish was transferred to a plate (microwarm plate, manufactured by Kitasato Supply Co., Ltd.) which had been kept warm at 37 ° C., and the fixed state of the cells was confirmed. Even when the dish was shaken lightly, the cells did not move and were firmly fixed to the bottom of the dish. On the other hand, the added medium (RPMI 1640 medium arranged on the coated dish) did not change at all and remained in the solution state. From this result, it was confirmed that a part of the polymer compound coated on the dish was once dissolved and then gelled to fix the cells.

【００９０】次に、上記によりディッシュに固定した細
胞を回収するために、上記ディッシュを４℃の冷蔵庫に
移し、１０分間放置した。冷蔵庫より取り出し顕微鏡下
観察したところ、細胞の再浮遊が確認された。ディッシ
ュを軽く揺らすと、細胞はすべて底面より浮遊して揺れ
動いていることが確認できた。Next, in order to collect the cells fixed on the dish as described above, the dish was transferred to a refrigerator at 4 ° C. and left for 10 minutes. When taken out from the refrigerator and observed under a microscope, resuspension of cells was confirmed. When the dish was shaken lightly, it was confirmed that all the cells were floating from the bottom surface and shaking.

【００９１】一方、上記細胞をディッシュに固定した状
態で、そのまま３７℃のインキュベーター内で培養する
ことも可能であった。３日間の培養後、上記ディッシュ
を４℃に冷却することにより、培養した細胞をディッシ
ュの底面から浮遊させ回収することができた。この際、
ディッシュ全体を冷却するのではなく、ピンセットを用
いてクローン採取用円筒（ダウコーニング製）を分離す
べき１個のコロニーを取り巻くように置き、この円筒の
中に４℃に冷却した培地をシリンジで加えることによ
り、分離すべき１個のコロニーを無傷で回収することも
できた。これら一連の結果は、高分子コート層の厚み
（１００μｍ、５０μｍ、２５μｍ、および１０μｍ）
に関係なく、どの場合も同様であった。On the other hand, it was possible to culture the cells fixed in a dish as they were in an incubator at 37 ° C. After culturing for 3 days, the cultured cells could be suspended from the bottom surface of the dish and collected by cooling the dish to 4 ° C. On this occasion,
Instead of cooling the entire dish, place a clone-collecting cylinder (made by Dow Corning) using tweezers so as to surround one colony to be separated, and in this cylinder, cool the medium cooled to 4 ° C with a syringe. The addition allowed the single colony to be separated to be recovered intact. These series of results show the thickness of the polymer coating layer (100 μm, 50 μm, 25 μm, and 10 μm)
The same was true in all cases.

【００９２】上述したように、本実施例においては、コ
ーティング用高分子化合物をコートしたディッシュ（本
発明の固定化器具）を使用することにより、培養細胞を
素早く固定し、その状態で培養することができ、更にデ
ィッシュを冷却することにより、培養した細胞を、何等
ダメージを与えること無く回収することが可能であっ
た。また、培養により形成された複数のコロニー中、分
離すべき１個のコロニーを無傷で回収することもでき
た。したがって、従来は非常に煩雑な操作が必要であっ
たクローニングを、このディッシュを用いて非常に簡便
に行うことが可能となった。As described above, in this example, by using the dish coated with the polymer compound for coating (immobilization device of the present invention), the cultured cells can be rapidly fixed and cultured in that state. By further cooling the dish, it was possible to recover the cultured cells without damaging them. In addition, one colony to be separated could be recovered intact from a plurality of colonies formed by culture. Therefore, it has become possible to perform cloning, which has conventionally required a very complicated operation, using this dish very easily.

【００９３】実施例３ 上記した実施例２の方法で作製したコートディッシュ
を、マイクロインジェクション実験に用いた。本実施例
においては、高分子化合物Ｎｏ．１（ゾル−ゲル転移温
度１６℃）を使用し、コート層の厚みは６０μｍとし
た。また、実験に用いる細胞としては、凍結ハムスター
未受精卵（日本農産工製）を使用した。 Example 3 The coated dish prepared by the method of Example 2 described above was used in a microinjection experiment. In this example, the polymer compound No. 1 (sol-gel transition temperature 16 ° C.) was used, and the thickness of the coat layer was 60 μm. As cells used in the experiment, frozen hamster unfertilized eggs (manufactured by Nippon Nosan Co., Ltd.) were used.

【００９４】３０個の凍結ハムスター未受精卵を液体窒
素保存容器より取り出し、室温にて解凍した。これを６
ｍｌのダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ、日水
製薬製）に懸濁し、直径９０ｍｍφコートディッシュ
（日本ベクトン製Ｆａｌｃｏｎ１００１に高分子化合物
Ｎｏ．１をコートしたもの）に分注し、室温（約２３
℃、高分子化合物Ｎｏ．１のゾル−ゲル転移温度１６℃
より高い温度）に放置して、未受精卵を沈降させた。Thirty frozen hamster unfertilized eggs were taken out from the liquid nitrogen storage container and thawed at room temperature. This is 6
The suspension was suspended in ml of Dulbecco's modified Eagle medium (D-MEM, manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), and the suspension was dispensed into a 90 mm diameter coated dish (Falcon 1001 manufactured by Nippon Becton Co., Ltd. coated with polymer compound No. 1), and the suspension was cooled to room temperature (about 23
° C, polymer compound No. 1 sol-gel transition temperature 16 ° C
The fertilized eggs were allowed to settle by leaving them at a higher temperature).

【００９５】次いで、上記ディッシュを４℃の冷蔵庫に
移し１０分間冷却し、播種した未受精卵を固定するため
にディッシュにコートされた高分子化合物の全部を一旦
溶解した。その後、ディッシュを室温に戻して１０分間
放置することにより、一旦溶解した高分子化合物を再度
ゲル化させ、上記未受精卵の固定を行った。上記培地
（Ｄ−ＭＥＭ）は完全にゲル化して、未受精卵はゲル中
にしっかりと固定されていた。この時のゲル中の高分子
の濃度は約６％であった。Then, the above dish was transferred to a refrigerator at 4 ° C. and cooled for 10 minutes, and all the polymer compound coated on the dish for fixing the seeded unfertilized egg was once dissolved. Then, the dish was returned to room temperature and left for 10 minutes to cause the once dissolved polymer compound to gel again to immobilize the unfertilized egg. The medium (D-MEM) was completely gelled, and unfertilized eggs were firmly fixed in the gel. At this time, the polymer concentration in the gel was about 6%.

【００９６】次にマイクロマニピュレーターを用いて、
ピペットの上記未受精卵への挿入を試みた。Next, using a micromanipulator,
An attempt was made to insert a pipette into the unfertilized egg.

【００９７】上記ディッシュを透過型実体顕微鏡（オリ
ンパス製）下にセットした。マイクロピペット作製器
（ＰＢ−７、ナリシゲ製）で作製したピペットを、マイ
クロマニピュレーター（ＭＯ−２０３、ナリシゲ製）に
セットし、上記したように固定されている未受精卵にピ
ペット挿入実験を行った。図２〜図５の写真に示すよう
に、未受精卵（写真中央部）はゲル内に固定されている
ために、他のピペット（ホールディングピペット）で固
定することなしに、非常に容易に上記ピペットを未受精
卵に刺し込むことができた。The dish was set under a transmission stereomicroscope (manufactured by Olympus). A pipette made with a micropipette maker (PB-7, made by Narishige) was set on a micromanipulator (MO-203, made by Narishige), and a pipette insertion experiment was conducted on the unfertilized eggs fixed as described above. . As shown in the photographs of FIGS. 2 to 5, since the unfertilized egg (the central portion of the photograph) is fixed in the gel, it is very easy to perform the above without fixing it with another pipette (holding pipette). It was possible to insert a pipette into an unfertilized egg.

【００９８】図２〜図５の写真は、上記ゲル中のハムス
ター未受精卵へのピペットの挿入操作を示す顕微鏡写真
（倍率：１７０倍）である。図２〜図５の各図は、以下
の状態を示す。また、図６は図２の像を模式的に示した
図である。The photographs in FIGS. 2 to 5 are micrographs (magnification: 170 times) showing the operation of inserting a pipette into the unfertilized hamster eggs in the gel. 2 to 5 show the following states. Further, FIG. 6 is a diagram schematically showing the image of FIG.

【００９９】図２（図６）：ピペット１１を上記ハムス
ター未受精卵１２へ挿入する直前の状態を示す。符号１
３は、上記ゲル内に固定されたエアー（空気）を示す。FIG. 2 (FIG. 6): A state immediately before the pipette 11 is inserted into the hamster unfertilized egg 12 is shown. Code 1
Reference numeral 3 represents air fixed in the gel.

【０１００】図３：ピペットを上記ハムスター未受精卵
へ挿入した直後の状態を示す。Figure 3: Shows the state immediately after inserting the pipette into the unfertilized hamster egg.

【０１０１】図４：上記ハムスター未受精卵へ、ピペッ
トを更に深く刺し込んだ状態を示す。 図５：上記ハム
スター未受精卵から、ピペットを抜いた直後の状態を示
す。FIG. 4: A state in which a pipette is inserted deeper into the unfertilized hamster egg. FIG. 5: shows the state immediately after removing the pipette from the unfertilized hamster egg.

【０１０２】上記写真（図２〜図５）に示されたエアー
１３（写真上方の半球状の像）と、未受精卵１２（写真
中央部の球形の像）との相対的位置から明らかなよう
に、ピペット１１を挿入したにも関わらず未受精卵１２
の位置はまったく変化していなかった。これにより、未
受精卵１２が上記ゲルにより確実に固定されているため
に、ピペット１１の未受精卵１２への挿入が非常に容易
であったことが確認された。また、上記ピペット１１を
適当に動かすことにより、未受精卵１２の一部を切りと
ることも可能であった。It is clear from the relative positions of the air 13 (hemispherical image in the upper part of the photo) and the unfertilized egg 12 (spherical image in the central part of the photo) shown in the above photos (FIGS. 2 to 5). As described above, the unfertilized egg 12 despite the insertion of the pipette 11
The position of had not changed at all. Thus, it was confirmed that the pipette 11 was very easily inserted into the unfertilized egg 12 because the unfertilized egg 12 was reliably fixed by the gel. It was also possible to cut off a part of the unfertilized egg 12 by appropriately moving the pipette 11.

【０１０３】上記した一連の操作をした未受精卵を回収
するために、上記ディッシュを４℃の冷蔵庫に移し５分
間放置した。該ディッシュのゲルはゾル状態となり、上
記未受精卵はピペットで簡単に回収することができた。In order to collect the unfertilized eggs that underwent the series of operations described above, the dishes were transferred to a refrigerator at 4 ° C. and left for 5 minutes. The gel of the dish was in a sol state, and the unfertilized eggs could be easily recovered with a pipette.

【０１０４】上述したように、本実施例においては、コ
ーティング用高分子化合物をコートしたディッシュ（本
発明の固定化器具）を用いることにより、卵母細胞を素
早く固定し、ホールディングピペットを用いることな
く、容易にピペットを卵母細胞に挿入することができ
た。更には、上記ディッシュを冷却することにより、卵
母細胞を、何等ダメージを与えること無く回収すること
ができた。したがって、このディッシュを使用すれば、
従来は非常に熟練した技術が必要とされたマイクロイン
ジェクションを、簡単に実現することが可能となった。As described above, in this example, by using the dish coated with the polymer compound for coating (the immobilization instrument of the present invention), the oocytes were rapidly immobilized, and the holding pipette was not used. , Was able to easily insert the pipette into the oocyte. Furthermore, by cooling the dish, the oocytes could be recovered without any damage. So if you use this dish,
It has become possible to easily implement microinjection, which required highly skilled techniques in the past.

【０１０５】[0105]

【発明の効果】上述したように本発明によれば、支持体
と、該支持体上に配置された高分子化合物の層からなる
固定化用器具であって；該高分子化合物が、曇点を有す
る複数のブロックと親水性のブロックとが結合してな
り、その水溶液がゾルーゲル転移温度を有し、且つ該水
溶液が上記ゾルーゲル転移温度より低い温度で可逆的に
液体状態（ゾル状態）を示す高分子化合物であることを
特徴とする固定化用器具、並びにこれを用いた細胞、微
生物等の固定化法および培養方法が提供される。As described above, according to the present invention, there is provided an immobilization device comprising a support and a layer of a polymer compound arranged on the support; wherein the polymer compound has a cloud point. And a hydrophilic block are bonded to each other, the aqueous solution thereof has a sol-gel transition temperature, and the aqueous solution reversibly exhibits a liquid state (sol state) at a temperature lower than the sol-gel transition temperature. An immobilization device characterized by being a polymer compound, and an immobilization method and culture method for cells, microorganisms and the like using the immobilization instrument are provided.

【０１０６】本発明の固定化用器具を用いれば、細胞、
微生物などを培養基材上に固定化、培養、回収ないし継
代する等の一連の全部又は一部の操作において、従来の
寒天ゲルあるいはピペットを用いる方法の煩雑さのみな
らず、細胞、微生物に与える障害性の問題を解決するこ
とができる。Using the immobilization instrument of the present invention, cells,
In the whole or part of a series of operations such as immobilizing, culturing, recovering or substituting microorganisms on a culture substrate, not only the complexity of the conventional agar gel or pipette method but also the cells and microorganisms It can solve the problem of disability.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】図１（ａ）ないし（ｆ）は、本発明の固定化用
器具を用いた固定化／回収方法の一実施態様における一
連の操作を示す模式断面図である。1 (a) to 1 (f) are schematic cross-sectional views showing a series of operations in one embodiment of an immobilization / recovery method using the immobilization instrument of the present invention.

【図２】ゲル中のハムスター未受精卵に、ピペットを挿
入する直前の状態を示す顕微鏡写真（倍率：１７０倍）
である。FIG. 2 is a micrograph showing a state immediately before inserting a pipette into an unfertilized hamster egg in a gel (magnification: 170 times).
Is.

【図３】ゲル中のハムスター未受精卵に、ピペットを挿
入した直後の状態を示す顕微鏡写真（倍率：１７０倍）
である。FIG. 3 is a micrograph showing a state immediately after inserting a pipette into an unfertilized hamster egg in a gel (magnification: 170 times).
Is.

【図４】ゲル中のハムスター未受精卵に、ピペットを更
に深く刺し込んだ状態を示す顕微鏡写真（倍率：１７０
倍）である。FIG. 4 is a micrograph showing a state in which a pipette is inserted deeper into an unfertilized hamster egg in a gel (magnification: 170).
Times).

【図５】ゲル中のハムスター未受精卵から、ピペットを
抜いた直後の状態を示す顕微鏡写真（倍率：１７０倍）
である。FIG. 5 is a photomicrograph showing the state immediately after removing the pipette from the unfertilized hamster egg in the gel (magnification: 170 times).
Is.

【図６】図２の写真を模式的に示した図である。FIG. 6 is a diagram schematically showing the photograph of FIG.

【符号の説明】[Explanation of symbols]

１…支持体、２…コーティング用高分子化合物のコート
層、２ａ…膨潤したコート層、２ｂ…一部溶解したコー
ト層、２ｃ…再度ゲル化したコート層、３…コートディ
ッシュ（固定化用器具）、４…細胞または微生物、５…
培地、５ａ…培地（コートした高分子化合物が溶解・拡
散している）、１１…ピペット、１２…ゲル中のハムス
ター未受精卵、１３…ゲル中のエアー。DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Support, 2 ... Coat layer of coating polymer compound, 2a ... Swelled coat layer, 2b ... Partially dissolved coat layer, 2c ... Regelled coat layer, 3 ... Coat dish (immobilization device ), 4 ... cells or microorganisms, 5 ...
Medium, 5a ... Medium (coated polymer compound is dissolved / diffused), 11 ... Pipette, 12 ... Unfertilized hamster egg in gel, 13 ... Air in gel.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/00 8412−4Ｂ ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 5 Identification code Internal reference number FI technical display location C12N 5/00 8412-4B

Claims (10)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 支持体と、該支持体上に配置された高分
子化合物の層からなる固定化用器具であって；該高分子
化合物が、曇点を有する複数のブロックと親水性のブロ
ックとが結合してなり、その水溶液がゾルーゲル転移温
度を有し、且つ該水溶液が上記ゾルーゲル転移温度より
低い温度で可逆的に液体状態（ゾル状態）を示す高分子
化合物であることを特徴とする固定化用器具。1. An immobilization device comprising a support and a layer of a polymer compound disposed on the support; the polymer compound having a cloud point, a plurality of blocks, and a hydrophilic block. Are bonded to each other, the aqueous solution thereof has a sol-gel transition temperature, and the aqueous solution is a polymer compound which reversibly exhibits a liquid state (sol state) at a temperature lower than the sol-gel transition temperature. Fixation device. 【請求項２】 前記高分子化合物の層が、上記高分子を
支持体にコーティングすることにより形成されたコーテ
ィング層からなる請求項１記載の固定化用器具。2. The immobilizing device according to claim 1, wherein the layer of the polymer compound is a coating layer formed by coating the support with the polymer. 【請求項３】 前記ゾルーゲル転移温度が０°Ｃより高
く４５°Ｃ以下である請求項１記載の固定化用器具。3. The immobilization instrument according to claim 1, wherein the sol-gel transition temperature is higher than 0 ° C. and 45 ° C. or lower. 【請求項４】 前記コーティング層の厚さが０．５μｍ
以上でかつ１ｍｍ以下である請求項１記載の固定化用器
具。4. The thickness of the coating layer is 0.5 μm
The device for immobilization according to claim 1, which is not less than 1 mm and not more than 1 mm. 【請求項５】 支持体と、該支持体上に配置された高分
子化合物の層からなる固定化用器具であって；該高分子
化合物が、曇点を有する複数のブロックと親水性のブロ
ックとが結合してなり、その水溶液がゾルーゲル転移温
度を有し、且つ該水溶液が上記ゾルーゲル転移温度より
低い温度で可逆的に液体状態（ゾル状態）を示す高分子
化合物である固定化用器具の上記高分子化合物の層に、
ゾルーゲル転移温度より高い温度で生物組織を接触さ
せ、 上記固定化用器具の温度をゾルーゲル転移温度より低い
温度に下げることにより上記高分子化合物の少なくとも
一部を溶解させて、上記生物組織の一部または全部を液
体状態の高分子化合物中に埋めた後、 上記固定化用器具の温度をゾルーゲル転移温度以上に高
めて、液体状態の高分子化合物をゲル化させることによ
り、該ゲル中に上記生物組織の一部又は全部を埋めて該
生物組織を固定化用器具上に固定することを特徴とする
生物組織の固定化法。5. An immobilization device comprising a support and a layer of a polymer compound arranged on the support; wherein the polymer compound has a plurality of blocks having cloud points and a hydrophilic block. Of an immobilization device that is a polymer compound in which the aqueous solution has a sol-gel transition temperature and the aqueous solution reversibly exhibits a liquid state (sol state) at a temperature lower than the sol-gel transition temperature. In the layer of the polymer compound,
The biological tissue is contacted at a temperature higher than the sol-gel transition temperature, and at least a part of the polymer compound is dissolved by lowering the temperature of the immobilization device to a temperature lower than the sol-gel transition temperature, and a part of the biological tissue. Alternatively, after embedding the whole in a polymer compound in a liquid state, the temperature of the immobilization device is raised to a temperature higher than the sol-gel transition temperature to gelate the polymer compound in a liquid state, and thus the organism in the gel is obtained. A method for immobilizing a biological tissue, which comprises burying a part or all of the tissue and fixing the biological tissue on a device for immobilization. 【請求項６】 ゾルーゲル転移温度より高い温度で、前
記固定化用器具の高分子化合物の層上に上記生物組織を
含む懸濁液を配置し、該生物組織を上記高分子化合物の
層上に沈降させることにより、上記高分子化合物の層に
生物組織を接触させる請求項５記載の生物組織の固定化
法。6. A suspension containing the biological tissue is placed on a layer of the polymer compound of the immobilization device at a temperature higher than the sol-gel transition temperature, and the biological tissue is placed on the layer of the polymer compound. The method for immobilizing a biological tissue according to claim 5, wherein the biological tissue is brought into contact with the layer of the polymer compound by allowing it to settle. 【請求項７】 固定化した生物組織を含む前記ゲルの温
度をゾルーゲル転移温度より低い温度に下げることによ
って該ゲルを溶解し、該生物組織の回収を行う請求項６
記載の生物組織の固定化法。7. The gel is dissolved by lowering the temperature of the gel containing the immobilized biological tissue to a temperature lower than the sol-gel transition temperature, and the biological tissue is recovered.
The method for immobilizing the biological tissue described. 【請求項８】 支持体と、該支持体上に配置された高分
子化合物の層からなる固定化用器具であって；該高分子
化合物が、曇点を有する複数のブロックと親水性のブロ
ックとが結合してなり、その水溶液がゾルーゲル転移温
度を有し、且つ該水溶液が上記ゾルーゲル転移温度より
低い温度で可逆的に液体状態（ゾル状態）を示す高分子
化合物である固定化用器具の上記高分子化合物の層に、
ゾルーゲル転移温度より高い温度で生物組織を接触さ
せ、 上記固定化用器具の温度をゾルーゲル転移温度より低い
温度に下げることにより上記高分子化合物の少なくとも
一部を溶解させて、上記生物組織の一部または全部を液
体状態の高分子化合物中に埋めた後、 上記固定化用器具の温度をゾルーゲル転移温度以上に高
めて、液体状態の高分子化合物をゲル化させることによ
り、該ゲル中に上記生物組織の一部又は全部を埋めて該
生物組織を該固定化用器具上に固定し、 上記生物組織を培養することを特徴とする生物組織の培
養法。8. An immobilization device comprising a support and a layer of a polymer compound arranged on the support; wherein the polymer compound has a plurality of blocks having cloud points and a hydrophilic block. Of an immobilization device that is a polymer compound in which the aqueous solution has a sol-gel transition temperature and the aqueous solution reversibly exhibits a liquid state (sol state) at a temperature lower than the sol-gel transition temperature. In the layer of the polymer compound,
The biological tissue is contacted at a temperature higher than the sol-gel transition temperature, and at least a part of the polymer compound is dissolved by lowering the temperature of the immobilization device to a temperature lower than the sol-gel transition temperature, and a part of the biological tissue. Alternatively, after embedding the whole in a polymer compound in a liquid state, the temperature of the immobilization device is raised to a temperature higher than the sol-gel transition temperature to gelate the polymer compound in a liquid state, whereby the organism described above is contained in the gel. A method for culturing a biological tissue, which comprises burying a part or all of the tissue, fixing the biological tissue on the immobilization instrument, and culturing the biological tissue. 【請求項９】 ゾルーゲル転移温度より高い温度で、前
記固定化用器具の高分子化合物の層上に上記生物組織を
含む懸濁液を配置し、該生物組織を上記高分子化合物の
層上に沈降させることにより、上記高分子化合物の層に
生物組織を接触させる請求項８記載の生物組織の培養
法。9. A suspension containing the biological tissue is placed on a layer of the polymer compound of the immobilization device at a temperature higher than the sol-gel transition temperature, and the biological tissue is placed on the layer of the polymer compound. 9. The method for culturing biological tissue according to claim 8, wherein the biological tissue is brought into contact with the layer of the polymer compound by allowing it to settle. 【請求項１０】 培養した生物組織を含む前記ゲルの温
度をゾルーゲル転移温度より低い温度に下げることによ
って該ゲルを溶解し、該生物組織の回収および／又は継
代を行う請求項８記載の生物組織の培養法。10. The organism according to claim 8, wherein the temperature of the gel containing the cultured biological tissue is lowered to a temperature lower than the sol-gel transition temperature to dissolve the gel, and the biological tissue is recovered and / or passaged. Tissue culture method.
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