JPH06335392A - Ｈｉｖ阻害性アンチセンスおよび他のヌクレオチド配列を含有する発現構成体、レトロウイルスのベクターおよびそれを含有する組換えレトロウイルス - Google Patents
Ｈｉｖ阻害性アンチセンスおよび他のヌクレオチド配列を含有する発現構成体、レトロウイルスのベクターおよびそれを含有する組換えレトロウイルスInfo
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 本発明は、アンチセンスおよび他のヌクレオ
チドの構成体の投与により、疾患の状態、ことに後天性
免疫欠損症候群（ＡＩＤＳ）を処置することに関する。
これらの構成体は、伝統的に製剤学的方法で、あるいは
組換えレトロウイルスのデリバリー系の使用により、患
者に投与される。後者のデリバリー系は、好ましくは特
定の細胞の型または標的とする他の成分をターゲッティ
ングする。このようなターゲッティングは、細胞の型ま
たは問題の他の成分上にそのためのレセプター（リガン
ド）が存在するリガンド（レセプター）の配列を含有す
るように、組換え的に生産された治療的レトロウイルス
のエンベロープを修飾することによって達成される。 【効果】 本発明の構成体の投与により、疾患の状態、
ことに後天性免疫欠損症候群（ＡＩＤＳ）を処置するこ
とができる。
チドの構成体の投与により、疾患の状態、ことに後天性
免疫欠損症候群（ＡＩＤＳ）を処置することに関する。
これらの構成体は、伝統的に製剤学的方法で、あるいは
組換えレトロウイルスのデリバリー系の使用により、患
者に投与される。後者のデリバリー系は、好ましくは特
定の細胞の型または標的とする他の成分をターゲッティ
ングする。このようなターゲッティングは、細胞の型ま
たは問題の他の成分上にそのためのレセプター（リガン
ド）が存在するリガンド（レセプター）の配列を含有す
るように、組換え的に生産された治療的レトロウイルス
のエンベロープを修飾することによって達成される。 【効果】 本発明の構成体の投与により、疾患の状態、
ことに後天性免疫欠損症候群（ＡＩＤＳ）を処置するこ
とができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、アンチセンスおよび他
のヌクレオチドの構成体の投与により、疾患の状態、こ
とに後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を処置すること
に関する。これらの構成体は、伝統的に製剤学的方法
で、あるいは組換えレトロウイルスのデリバリー系の使
用により患者に投与される。後者のデリバリー系は、好
ましくは特定の細胞の型または標的とする他の成分をタ
ーゲッティングする。このようなターゲッティングは、
細胞の型または問題の他の成分上にそのためのレセプタ
ー（リガンド）が存在するリガンド（レセプター）の配
列を含有するように、組換え的に生産された治療用レト
ロウイルスのエンベロープを修飾することによって達成
される。
のヌクレオチドの構成体の投与により、疾患の状態、こ
とに後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を処置すること
に関する。これらの構成体は、伝統的に製剤学的方法
で、あるいは組換えレトロウイルスのデリバリー系の使
用により患者に投与される。後者のデリバリー系は、好
ましくは特定の細胞の型または標的とする他の成分をタ
ーゲッティングする。このようなターゲッティングは、
細胞の型または問題の他の成分上にそのためのレセプタ
ー（リガンド）が存在するリガンド（レセプター）の配
列を含有するように、組換え的に生産された治療用レト
ロウイルスのエンベロープを修飾することによって達成
される。
【０００２】
【発明の背景】ウイルスの感染および他の疾患の状態を
処置するために、多数のアプローチが現在研究されてい
る。ウイルスの感染の処置における最も新しいアプロー
チの１つは、通常選択的、競争的、ハイブリダイゼーシ
ョンにより、アンチセンスのオリゴヌクレオチドを使用
して、ウイルスの複製、望ましくないタンパク質の生産
などをブロックすることである。例えば、Ｇｏｏｄｃｈ
ｉｌｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｖ
ｏｌ．８５、ｐｐ．５５０７−５５１１には、ヒトＨＩ
ＶのＲＮＡ内に２０の異なる標的部位に対してターゲッ
ティングされた、ある種のアンチセンスのオリゴヌクレ
オチドの使用によりＨＩＶの複製を阻害する研究につい
て報告されている。標的部位はウイルスの複製の間に機
能をブロックする潜在的能力に基づいて選択された。オ
リゴは約２０〜約１２塩基対の長さであった。オリゴの
いくつかは阻害作用を実証することができたが、これは
種々の構成体の間で大きく変化した。それらのいずれも
残部よりとくにすぐれておらずそして、事実、オリゴは
ウイルスの許容される阻害の達成に必要な区域のすべて
を効果的に阻害するためには小さ過ぎることがある。
処置するために、多数のアプローチが現在研究されてい
る。ウイルスの感染の処置における最も新しいアプロー
チの１つは、通常選択的、競争的、ハイブリダイゼーシ
ョンにより、アンチセンスのオリゴヌクレオチドを使用
して、ウイルスの複製、望ましくないタンパク質の生産
などをブロックすることである。例えば、Ｇｏｏｄｃｈ
ｉｌｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｖ
ｏｌ．８５、ｐｐ．５５０７−５５１１には、ヒトＨＩ
ＶのＲＮＡ内に２０の異なる標的部位に対してターゲッ
ティングされた、ある種のアンチセンスのオリゴヌクレ
オチドの使用によりＨＩＶの複製を阻害する研究につい
て報告されている。標的部位はウイルスの複製の間に機
能をブロックする潜在的能力に基づいて選択された。オ
リゴは約２０〜約１２塩基対の長さであった。オリゴの
いくつかは阻害作用を実証することができたが、これは
種々の構成体の間で大きく変化した。それらのいずれも
残部よりとくにすぐれておらずそして、事実、オリゴは
ウイルスの許容される阻害の達成に必要な区域のすべて
を効果的に阻害するためには小さ過ぎることがある。
【０００３】アンチセンスを包含する遺伝情報を送り出
すデリバリー系として使用するレトロウイルスのベクタ
ーは、非遺伝病ならびに遺伝病を処置するために提案さ
れた。Ｔｅｌｌｉｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１８：４１
４、１９８５は、ＨＩＶのＲＮＡに対して相補的なアン
チセンスＲＮＡを発現するゲノムを有する「欠陥のあ
る」ＨＩＶで幹細胞を感染させることによって、Ｔ細胞
のクローンを保護することを示唆した。しかしながら、
この組換えレトロウイルスの構成体は野生型ウイルスと
同様に実際に生殖しそして、それゆえ、「複製能欠損」
と考えることができないと思われる。Ｔｅｌｌｉｅｒの
技術を使用して、新しく構成されたレトロウイルスは他
の細胞を感染し、前以て存在するＨＩＶまたは他のヌク
レオチド配列との組換えの危険を増加させることがあっ
た。これは望ましくない新しい組換え配列のコントロー
ルの損失および可能な世代に導き、それらの組換え配列
の複製は患者を通して抑制されないで進行する。
すデリバリー系として使用するレトロウイルスのベクタ
ーは、非遺伝病ならびに遺伝病を処置するために提案さ
れた。Ｔｅｌｌｉｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１８：４１
４、１９８５は、ＨＩＶのＲＮＡに対して相補的なアン
チセンスＲＮＡを発現するゲノムを有する「欠陥のあ
る」ＨＩＶで幹細胞を感染させることによって、Ｔ細胞
のクローンを保護することを示唆した。しかしながら、
この組換えレトロウイルスの構成体は野生型ウイルスと
同様に実際に生殖しそして、それゆえ、「複製能欠損」
と考えることができないと思われる。Ｔｅｌｌｉｅｒの
技術を使用して、新しく構成されたレトロウイルスは他
の細胞を感染し、前以て存在するＨＩＶまたは他のヌク
レオチド配列との組換えの危険を増加させることがあっ
た。これは望ましくない新しい組換え配列のコントロー
ルの損失および可能な世代に導き、それらの組換え配列
の複製は患者を通して抑制されないで進行する。
【０００４】それゆえ、効率よく、安全な方法で問題の
標的に送り出すことができる、いっそう有効なヌクレオ
チド構成体を使用して、ウイルスの感染などを処置す
る、よりすぐれた治療および免疫化のプロトコルが必要
とされている。本発明は、下にいっそう詳しく説明する
ように、これに関していくつかの利点を提供する。本発
明の治療的ターゲッティングの態様は非常に効率よく、
したがって、比較的より低い力価の組換えレトロウイル
スが必要とされる。第２に、いくつかの態様において、
組換えウイルスは前以て選択した細胞の型に対してのみ
送り出され、こうして、ウイルスは標的細胞のみを感染
し、そして他の細胞の型を感染することができず、不必
要に広がる細胞の感染を排除する。アンチセンスのポリ
ヌクレオチド配列、例えば、ここにおいて提供されるも
のを本発明のレトロウイルスのベクターの態様の中に組
み込む利点は多数存在する。アンチセンスのオリゴヌク
レオチドを直接注入する先行技術の方法に従うと、必ず
修飾しなくてはならないオリゴを反復して外因的に供給
して、患者の中にいったん注入されたとき、それらの半
減期を延長することが必要である。対照的に、組換えレ
トロウイルスによる細胞の単一の感染は、感受性細胞の
内部で生産すべきアンチセンスＲＮＡの連続的供給を可
能とするであろう。これらのアンチセンス配列の長いス
トレッチをベクターの中にクローニングして、標的に対
して特異性の機会を増加する。対照的に、遊離オリゴの
長いストレッチは細胞の中に入ることができず、したが
って、より短いストレッチが一般に選択される。これは
この分野において新しい問題を発生させ、オリゴヌクレ
オチドのより短いストレッチは細胞のランダム集団の中
に自由に入る。これらの細胞の中へのランダムの進入に
固有の欠点は、ターゲッティングしようとする細胞がオ
リゴに暴露されることを保証するために、大量のこれら
のオリゴを必要とするすることである。これに加えて、
細胞のランダム集団が第１にこの方法において非特異的
に影響を受けることが望ましくないことがある。
標的に送り出すことができる、いっそう有効なヌクレオ
チド構成体を使用して、ウイルスの感染などを処置す
る、よりすぐれた治療および免疫化のプロトコルが必要
とされている。本発明は、下にいっそう詳しく説明する
ように、これに関していくつかの利点を提供する。本発
明の治療的ターゲッティングの態様は非常に効率よく、
したがって、比較的より低い力価の組換えレトロウイル
スが必要とされる。第２に、いくつかの態様において、
組換えウイルスは前以て選択した細胞の型に対してのみ
送り出され、こうして、ウイルスは標的細胞のみを感染
し、そして他の細胞の型を感染することができず、不必
要に広がる細胞の感染を排除する。アンチセンスのポリ
ヌクレオチド配列、例えば、ここにおいて提供されるも
のを本発明のレトロウイルスのベクターの態様の中に組
み込む利点は多数存在する。アンチセンスのオリゴヌク
レオチドを直接注入する先行技術の方法に従うと、必ず
修飾しなくてはならないオリゴを反復して外因的に供給
して、患者の中にいったん注入されたとき、それらの半
減期を延長することが必要である。対照的に、組換えレ
トロウイルスによる細胞の単一の感染は、感受性細胞の
内部で生産すべきアンチセンスＲＮＡの連続的供給を可
能とするであろう。これらのアンチセンス配列の長いス
トレッチをベクターの中にクローニングして、標的に対
して特異性の機会を増加する。対照的に、遊離オリゴの
長いストレッチは細胞の中に入ることができず、したが
って、より短いストレッチが一般に選択される。これは
この分野において新しい問題を発生させ、オリゴヌクレ
オチドのより短いストレッチは細胞のランダム集団の中
に自由に入る。これらの細胞の中へのランダムの進入に
固有の欠点は、ターゲッティングしようとする細胞がオ
リゴに暴露されることを保証するために、大量のこれら
のオリゴを必要とするすることである。これに加えて、
細胞のランダム集団が第１にこの方法において非特異的
に影響を受けることが望ましくないことがある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、特定の細胞の
型をターゲッティングして前記細胞を感染させ、そして
阻害性アンチセンス配列または発現しようとする他の配
列を供給する組換えレトロウイルスのデリバリー系（レ
トロウイルスのベクターおよび／またはアンチセンスの
オリゴヌクレオチド組換えレトロウイルス）と好ましく
は組み合わせて、アンチセンスおよび他のヌクレオチド
の発現構成体を提供する。好ましい態様において、組換
えレトロウイルスはそのように細胞の中で実質的に生殖
することができない。ここにおいていっそう完全に説明
するターゲッティングの典型的な例は次の通りである：
ベクターがＣＤ４＋細胞にターゲッティングすることが
できるように、エンベロープ上にｇｐ１２０をもつ組換
えレトロウイルス。逆に、ベクターがｇｐ１２０＋（Ｈ
ＩＶを収容する）細胞に送り出されることができるよう
に、エンベロープはＣＤ４を含有することができる。
型をターゲッティングして前記細胞を感染させ、そして
阻害性アンチセンス配列または発現しようとする他の配
列を供給する組換えレトロウイルスのデリバリー系（レ
トロウイルスのベクターおよび／またはアンチセンスの
オリゴヌクレオチド組換えレトロウイルス）と好ましく
は組み合わせて、アンチセンスおよび他のヌクレオチド
の発現構成体を提供する。好ましい態様において、組換
えレトロウイルスはそのように細胞の中で実質的に生殖
することができない。ここにおいていっそう完全に説明
するターゲッティングの典型的な例は次の通りである：
ベクターがＣＤ４＋細胞にターゲッティングすることが
できるように、エンベロープ上にｇｐ１２０をもつ組換
えレトロウイルス。逆に、ベクターがｇｐ１２０＋（Ｈ
ＩＶを収容する）細胞に送り出されることができるよう
に、エンベロープはＣＤ４を含有することができる。
【０００６】これらの好ましいレトロウイルスのデリバ
リー系の態様において、そして標的細胞の感染のとき、
問題の発現構成体を含有するレトロウイルスのベクター
は細胞の中に送り出される。発現構成体により供給され
るヌクレオチドの情報はＤＮＡの中にコピーされること
ができ、次いでその少なくとも一部分はＤＮＡのプロウ
イルスとして細胞のゲノムの中に組み込まれることがで
きる。ここでプロウイルスの形態の中に存在する（適当
なプロモーターのコントロール下に）発現構成体の転写
は、タンパク質に翻訳されることができるＲＮＡを生産
する。アンチセンスのポリヌクレオチド配列を発現する
発現構成体をレトロウイルスのベクターが含有する場
合、阻害しようとするウイルスのＲＮＡの部分に対して
アンチセンス（相補的）ＲＮＡが生産される。阻害され
るＲＮＡは感染した細胞により生産されるｍＲＮＡ、感
染した細胞により生産される全長のゲノムＲＮＡ、また
はヴィリオン粒子で感染したとき細胞に最初に供給され
るウイルスのゲノムＲＮＡの形態であることができる。
アンチセンスのＲＮＡは標的ＲＮＡに結合し、そしてそ
れを不活性化する。この方法において、「分子の免疫
性」を細胞に与えることができる。
リー系の態様において、そして標的細胞の感染のとき、
問題の発現構成体を含有するレトロウイルスのベクター
は細胞の中に送り出される。発現構成体により供給され
るヌクレオチドの情報はＤＮＡの中にコピーされること
ができ、次いでその少なくとも一部分はＤＮＡのプロウ
イルスとして細胞のゲノムの中に組み込まれることがで
きる。ここでプロウイルスの形態の中に存在する（適当
なプロモーターのコントロール下に）発現構成体の転写
は、タンパク質に翻訳されることができるＲＮＡを生産
する。アンチセンスのポリヌクレオチド配列を発現する
発現構成体をレトロウイルスのベクターが含有する場
合、阻害しようとするウイルスのＲＮＡの部分に対して
アンチセンス（相補的）ＲＮＡが生産される。阻害され
るＲＮＡは感染した細胞により生産されるｍＲＮＡ、感
染した細胞により生産される全長のゲノムＲＮＡ、また
はヴィリオン粒子で感染したとき細胞に最初に供給され
るウイルスのゲノムＲＮＡの形態であることができる。
アンチセンスのＲＮＡは標的ＲＮＡに結合し、そしてそ
れを不活性化する。この方法において、「分子の免疫
性」を細胞に与えることができる。
【０００７】好ましい態様において、遺伝的「共有物」
として作用する１または２以上のリボザイムのヌクレオ
チド配列はアンチセンス配列の中に散在することができ
る。その場合において、アンチセンスＲＮＡは標的ＲＮ
Ａを容易に認識し、それに結合し、そして１または２以
上のリボザイムはそれを切断するであろう。
として作用する１または２以上のリボザイムのヌクレオ
チド配列はアンチセンス配列の中に散在することができ
る。その場合において、アンチセンスＲＮＡは標的ＲＮ
Ａを容易に認識し、それに結合し、そして１または２以
上のリボザイムはそれを切断するであろう。
【０００８】レトロウイルスのベクターは、また、その
タンパク質生産物を標的細胞の中で発現しようとする遺
伝子またはその一部分を含有することができる。このよ
うなタンパク質は細胞の内側に拘束され、細胞表面上に
発現されるか、あるいは細胞の中から外に分泌されるこ
とができる。
タンパク質生産物を標的細胞の中で発現しようとする遺
伝子またはその一部分を含有することができる。このよ
うなタンパク質は細胞の内側に拘束され、細胞表面上に
発現されるか、あるいは細胞の中から外に分泌されるこ
とができる。
【０００９】本発明の他の面は本発明の発現構成体で形
質転換された細胞、およびことに組換えレトロウイルス
により供給されたレトロウイルスのベクターに関し、そ
の結果疾患の状態は軽減されるか、あるいはこのような
疾患の状態に対する耐性が与えられる。発現構成体、組
換えレトロウイルス、組換えレトロウイルス、生産体の
細胞、外来ＲＮＡまたは問題の他のヌクレオチド配列を
生産する方法、およびポリペプチドを一時的にまたは連
続的に生産する方法が、また、提供される。発現構成
体、レトロウイルスのベクターおよび組換えレトロウイ
ルスを使用する、免疫化法を包含する、治療的処置が、
また、ここにおいて提供される。
質転換された細胞、およびことに組換えレトロウイルス
により供給されたレトロウイルスのベクターに関し、そ
の結果疾患の状態は軽減されるか、あるいはこのような
疾患の状態に対する耐性が与えられる。発現構成体、組
換えレトロウイルス、組換えレトロウイルス、生産体の
細胞、外来ＲＮＡまたは問題の他のヌクレオチド配列を
生産する方法、およびポリペプチドを一時的にまたは連
続的に生産する方法が、また、提供される。発現構成
体、レトロウイルスのベクターおよび組換えレトロウイ
ルスを使用する、免疫化法を包含する、治療的処置が、
また、ここにおいて提供される。
【００１０】定義：ここにおいて使用するとき、「実質
的に相補的」は、標的ヌクレオチド配列の転写または翻
訳の活性が効果的に妨害または阻害されるような程度
に、標的ヌクレオチド配列へあるヌクレオチド配列のヌ
クレオチド塩基対の結合性を称する。ここにおいて使用
するとき、「ポリヌクレオチド」は、約２０００〜約２
００ヌクレオチド塩基を含有する小さい天然または合成
の核酸のポリマーを意味する。
的に相補的」は、標的ヌクレオチド配列の転写または翻
訳の活性が効果的に妨害または阻害されるような程度
に、標的ヌクレオチド配列へあるヌクレオチド配列のヌ
クレオチド塩基対の結合性を称する。ここにおいて使用
するとき、「ポリヌクレオチド」は、約２０００〜約２
００ヌクレオチド塩基を含有する小さい天然または合成
の核酸のポリマーを意味する。
【００１１】ここにおいて使用するとき、「形質転換」
は、本発明の発現構成体の中に含有される遺伝情報の導
入により、仲介された受容細胞の遺伝子型を変化する方
法を意味する。
は、本発明の発現構成体の中に含有される遺伝情報の導
入により、仲介された受容細胞の遺伝子型を変化する方
法を意味する。
【００１２】ここにおいて使用するとき、「ポリアデニ
ル化スプライシング（または付加）部位」は、遺伝子の
翻訳された領域から下流に位置し、アデニンのリボヌク
レオチドを付加してメッセンジャーＲＮＡの３’末端に
ポリアデニンヌクレオチドテイルを形成させるＤＮＡ配
列である。ポリアデニル化は、メッセンジャーＲＮＡの
レベルおよび生産物のタンパク質のレベルを減少する事
象である、細胞の中の分解に対するメッセンジャーＲＮ
Ａの安定化において重要である。それは時にはここにお
いて（Ａ）ｎと呼ぶ。
ル化スプライシング（または付加）部位」は、遺伝子の
翻訳された領域から下流に位置し、アデニンのリボヌク
レオチドを付加してメッセンジャーＲＮＡの３’末端に
ポリアデニンヌクレオチドテイルを形成させるＤＮＡ配
列である。ポリアデニル化は、メッセンジャーＲＮＡの
レベルおよび生産物のタンパク質のレベルを減少する事
象である、細胞の中の分解に対するメッセンジャーＲＮ
Ａの安定化において重要である。それは時にはここにお
いて（Ａ）ｎと呼ぶ。
【００１３】ここにおいて使用するとき、「ＬＴＲ」は
長い末端の反復配列を称し、これらの配列は、プロウイ
ルスの形態において、レトロウイルスが感染した細胞の
ゲノムＤＮＡにレトロウイルスのＲＮＡからコピーされ
たＤＮＡの組み込みを提供する構造的要素である。３’
ＬＴＲは配列の３’末端に位置するＬＴＲであり、５’
ＬＴＲは３’末端から上流のＬＴＲであり、そうでなけ
れば５’末端と呼ぶ。ここにおいて使用するとき、「プ
ロウイルス」はレトロウイルスの生活環における本質的
段階を含むレトロウイルスのゲノムの二本鎖の相対物を
意味する。
長い末端の反復配列を称し、これらの配列は、プロウイ
ルスの形態において、レトロウイルスが感染した細胞の
ゲノムＤＮＡにレトロウイルスのＲＮＡからコピーされ
たＤＮＡの組み込みを提供する構造的要素である。３’
ＬＴＲは配列の３’末端に位置するＬＴＲであり、５’
ＬＴＲは３’末端から上流のＬＴＲであり、そうでなけ
れば５’末端と呼ぶ。ここにおいて使用するとき、「プ
ロウイルス」はレトロウイルスの生活環における本質的
段階を含むレトロウイルスのゲノムの二本鎖の相対物を
意味する。
【００１４】ここにおいて使用するとき、「発現構成
体」は、ことにアンチセンスまたはエンドリボヌクレア
ーゼの形態、またはそれらの組み合わせの、問題のヌク
レオチド配列からなり、そして方向づけられたとき、そ
の少なくとも一部分は標的ＲＮＡ対して実質的に相補的
である、組換え集合体を意味し、前記集合体は前記標的
配列の転写または翻訳の活性を阻害するために有用であ
る。
体」は、ことにアンチセンスまたはエンドリボヌクレア
ーゼの形態、またはそれらの組み合わせの、問題のヌク
レオチド配列からなり、そして方向づけられたとき、そ
の少なくとも一部分は標的ＲＮＡ対して実質的に相補的
である、組換え集合体を意味し、前記集合体は前記標的
配列の転写または翻訳の活性を阻害するために有用であ
る。
【００１５】ここにおいて使用するとき、「レトロウイ
ルスのベクター」は、レトロウイルスのヌクレオチド配
列を含み、そして遺伝物質、例えば、本発明の発現構成
体を細胞の中に導入し、かつレトロウイルスの方法で細
胞の合成的機構を使用するために意図するベヒクルを意
味する。
ルスのベクター」は、レトロウイルスのヌクレオチド配
列を含み、そして遺伝物質、例えば、本発明の発現構成
体を細胞の中に導入し、かつレトロウイルスの方法で細
胞の合成的機構を使用するために意図するベヒクルを意
味する。
【００１６】ここにおいて使用するとき、「組換えレト
ロウイルス」はパッケージング細胞系の中にレトロウイ
ルスのベクターを含有し、ヴィリオン粒子の方法で、細
胞を感染することができるヴィリオン粒子を遺伝子操作
された物質を供給する組換え集合体を意味し、ここで前
記組換え集合体は複製能欠損的であり、細胞から発芽し
かつ新しい細胞を感染する新しいヴィリオン粒子の中に
その操作したゲノム物質を実質的にパッケージングする
ことができない。
ロウイルス」はパッケージング細胞系の中にレトロウイ
ルスのベクターを含有し、ヴィリオン粒子の方法で、細
胞を感染することができるヴィリオン粒子を遺伝子操作
された物質を供給する組換え集合体を意味し、ここで前
記組換え集合体は複製能欠損的であり、細胞から発芽し
かつ新しい細胞を感染する新しいヴィリオン粒子の中に
その操作したゲノム物質を実質的にパッケージングする
ことができない。
【００１７】ここにおいて使用するとき、「生産体の細
胞」は、発現構成体、レトロウイルスのベクター、また
は組換えレトロウイルス（ヴィリオン粒子）を生産また
は発現する細胞または細胞系を意味する。
胞」は、発現構成体、レトロウイルスのベクター、また
は組換えレトロウイルス（ヴィリオン粒子）を生産また
は発現する細胞または細胞系を意味する。
【００１８】ここにおいて使用するとき、「安定に形質
転換された細胞」は、発現構成体および／またはレトロ
ウイルスのベクターおよび／または組換えレトロウイル
スが細胞の中に組み込まれ、そして外来ＲＮＡ、ＤＮ
Ａ、エンドリボヌクレアーゼ、問題の他のヌクレオチド
配列、またはタンパク質生産物を発現するように細胞を
誘発した、細胞を意味する。
転換された細胞」は、発現構成体および／またはレトロ
ウイルスのベクターおよび／または組換えレトロウイル
スが細胞の中に組み込まれ、そして外来ＲＮＡ、ＤＮ
Ａ、エンドリボヌクレアーゼ、問題の他のヌクレオチド
配列、またはタンパク質生産物を発現するように細胞を
誘発した、細胞を意味する。
【００１９】本発明の第１態様において、問題のヌクレ
オチド配列からなる、ある種の発現構成体が提供され
る。好ましい発現構成体の態様において、アンチセンス
発現構成体が提供され、この構成体は、細胞、およびさ
らにはＨＩＶ感染細胞の中に導入されたとき、ＨＩＶゲ
ノムの一部分をエンコードするＲＮＡに対して相補的な
ＲＮＡの転写を指令することができる。本発明者は理論
により拘束されたくないが、アンチセンス発現構成体
は、こうして、真核生物の宿主細胞の中の内因性ＨＩＶ
ウイルスまたはプラス鎖ＤＮＡのすべてまたは一部分あ
るいはＨＩＶプロウイルスのＤＮＡから転写されたｍＲ
ＮＡにハイブリダイゼーションすることができる「アン
チセンス」ＲＮＡの転写を指令すると考えられる。これ
は引き続いて、源が何であっても、ＨＩＶのＲＮＡの活
性、およびＨＩＶウイルスの有効な複製を防止または減
少（好ましくは有意に）する働きをすることができる。
１つの例において、ヴィリオン粒子により細胞に供給さ
れ、次いで発現構成体で前以て保護されたこれらの細胞
の中に入るウイルスのＲＮＡは、ＤＮＡへのその逆転写
を防止され、それゆえ、その宿主ゲノムの中に有効に組
込むことができない。他の例において、このゲノムのウ
イルスのＲＮＡから転写されたマイナス鎖ＤＮＡに対し
て相補的であるプラス鎖ＤＮＡは、また、発現構成体へ
の結合により阻害されることができる。なお他の例にお
いて、細胞によるＨＩＶゲノムのウイルスｍＲＮＡへの
転写およびＨＩＶウイルスのタンパク質へのｍＲＮＡの
翻訳のレベルは、大きく妨害され、そして完全に阻害さ
えされる。第４の例において、新しいヴィリオン粒子の
パッケージングについて意味する、新しいウイルスのゲ
ノムＲＮＡの生産および有効なパッケージングは効果的
に妨害される。全体の結果は次の通りである。すなわ
ち、細胞への進入を既に獲得したか、あるいは進入を獲
得するＨＩＶウイルスは、細胞の合成的機構を適切に採
用することができず、そして複製するのが実質的に低い
か、あるいはまったく複製することができない。より好
ましい態様において、このようなウイルスの生産の少な
くとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％の
阻害は、本発明のアンチセンス発現構成体で形質転換ま
たはトランスフェクションした細胞に与えられる。ある
種の他の好ましい態様において、１または２以上のリボ
ザイムの配列は本発明のアンチセンス配列の間に散在す
ることができる。アンチセンスが結合するとき、リボザ
イムは標的ＲＮＡを切断する働きをするようになる。こ
の作用はＨＩＶのＲＮＡの活性を実質的に阻害する可能
性を増大する。潜在的ＨＩＶプロウイルスを前以て収容
し、そしてプロウイルスがウイルスＲＮＡをつくるよう
に活性化されている細胞において、このようなウイルス
ＲＮＡの阻害は、細胞から発芽して他の細胞を感染する
ヴィリオン粒子の中へのＨＩＶウイルスのＲＮＡの有効
なパッケージングをブロックする。ＨＩＶのＲＮＡの阻
害は、また、細胞に分子の免疫性を与えることができ
る。ウイルスのゲノムがプロウイルスへの転写およびそ
の宿主のゲノムの中への組込みを妨害されるので、ＨＩ
Ｖ感染に対して感受性の非感染細胞は究極的なＨＩＶ感
染から保護されることができる。
オチド配列からなる、ある種の発現構成体が提供され
る。好ましい発現構成体の態様において、アンチセンス
発現構成体が提供され、この構成体は、細胞、およびさ
らにはＨＩＶ感染細胞の中に導入されたとき、ＨＩＶゲ
ノムの一部分をエンコードするＲＮＡに対して相補的な
ＲＮＡの転写を指令することができる。本発明者は理論
により拘束されたくないが、アンチセンス発現構成体
は、こうして、真核生物の宿主細胞の中の内因性ＨＩＶ
ウイルスまたはプラス鎖ＤＮＡのすべてまたは一部分あ
るいはＨＩＶプロウイルスのＤＮＡから転写されたｍＲ
ＮＡにハイブリダイゼーションすることができる「アン
チセンス」ＲＮＡの転写を指令すると考えられる。これ
は引き続いて、源が何であっても、ＨＩＶのＲＮＡの活
性、およびＨＩＶウイルスの有効な複製を防止または減
少（好ましくは有意に）する働きをすることができる。
１つの例において、ヴィリオン粒子により細胞に供給さ
れ、次いで発現構成体で前以て保護されたこれらの細胞
の中に入るウイルスのＲＮＡは、ＤＮＡへのその逆転写
を防止され、それゆえ、その宿主ゲノムの中に有効に組
込むことができない。他の例において、このゲノムのウ
イルスのＲＮＡから転写されたマイナス鎖ＤＮＡに対し
て相補的であるプラス鎖ＤＮＡは、また、発現構成体へ
の結合により阻害されることができる。なお他の例にお
いて、細胞によるＨＩＶゲノムのウイルスｍＲＮＡへの
転写およびＨＩＶウイルスのタンパク質へのｍＲＮＡの
翻訳のレベルは、大きく妨害され、そして完全に阻害さ
えされる。第４の例において、新しいヴィリオン粒子の
パッケージングについて意味する、新しいウイルスのゲ
ノムＲＮＡの生産および有効なパッケージングは効果的
に妨害される。全体の結果は次の通りである。すなわ
ち、細胞への進入を既に獲得したか、あるいは進入を獲
得するＨＩＶウイルスは、細胞の合成的機構を適切に採
用することができず、そして複製するのが実質的に低い
か、あるいはまったく複製することができない。より好
ましい態様において、このようなウイルスの生産の少な
くとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％の
阻害は、本発明のアンチセンス発現構成体で形質転換ま
たはトランスフェクションした細胞に与えられる。ある
種の他の好ましい態様において、１または２以上のリボ
ザイムの配列は本発明のアンチセンス配列の間に散在す
ることができる。アンチセンスが結合するとき、リボザ
イムは標的ＲＮＡを切断する働きをするようになる。こ
の作用はＨＩＶのＲＮＡの活性を実質的に阻害する可能
性を増大する。潜在的ＨＩＶプロウイルスを前以て収容
し、そしてプロウイルスがウイルスＲＮＡをつくるよう
に活性化されている細胞において、このようなウイルス
ＲＮＡの阻害は、細胞から発芽して他の細胞を感染する
ヴィリオン粒子の中へのＨＩＶウイルスのＲＮＡの有効
なパッケージングをブロックする。ＨＩＶのＲＮＡの阻
害は、また、細胞に分子の免疫性を与えることができ
る。ウイルスのゲノムがプロウイルスへの転写およびそ
の宿主のゲノムの中への組込みを妨害されるので、ＨＩ
Ｖ感染に対して感受性の非感染細胞は究極的なＨＩＶ感
染から保護されることができる。
【００２０】本発明をさらに例示するために、本発明を
ある種の好ましい発現構成体をいっそう詳細に説明す
る。実施例の節において例示するようにＨＩＶゲノムの
種々の構造的または他の部分に対して向けられたアンチ
センス構成体を、ゲノム断片の制限および結合、次いで
二本鎖ＤＮＡの合成によりアンチセンス鎖を得ることに
よって構成した。当業者は容易に理解するように、ＨＩ
Ｖゲノムの配列を発表する、ある種の参考文献は入手可
能である。この情報から、その中の教示に従いアンチセ
ンス構成体をつくる目的に有用なゲノムの区域を減少す
ることができる。本発明の好ましい構成体は、ＨＩＶゲ
ノムＲＮＡの種々の部分対して実質的に相補的なアンチ
センス配列からなる。断片化しようとするゲノムの区域
に依存して、種々の制限酵素、例えば、ＥｃｏＲＩ、Ｅ
ｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ＋ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ、Ｘ
ｂａＩ＋ＮｈｅＩなどを使用して、ＨＩＶゲノム断片を
得る。標準的組換え技術を使用して、すべての断片を得
るすることができ、そしてすべてのそれ以上の組換え構
成体を得ることができる。一般に、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉ
ｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９９０を
参照のこと。適当な候補の選択は、ＲＮＡ Ｔｕｍｏｒ
Ｖｉｒｕｓｅｓ、Ｖｏｌ．ＩＩ、Ｗｅｉｓｓら編、１
９８５−Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙおよびＲａｔｎｅｒら、Ｎａｔｕｒ
ｅ、３１３：２７７−２８４（１９８５）に記載されて
いる番号に従う。
ある種の好ましい発現構成体をいっそう詳細に説明す
る。実施例の節において例示するようにＨＩＶゲノムの
種々の構造的または他の部分に対して向けられたアンチ
センス構成体を、ゲノム断片の制限および結合、次いで
二本鎖ＤＮＡの合成によりアンチセンス鎖を得ることに
よって構成した。当業者は容易に理解するように、ＨＩ
Ｖゲノムの配列を発表する、ある種の参考文献は入手可
能である。この情報から、その中の教示に従いアンチセ
ンス構成体をつくる目的に有用なゲノムの区域を減少す
ることができる。本発明の好ましい構成体は、ＨＩＶゲ
ノムＲＮＡの種々の部分対して実質的に相補的なアンチ
センス配列からなる。断片化しようとするゲノムの区域
に依存して、種々の制限酵素、例えば、ＥｃｏＲＩ、Ｅ
ｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ＋ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ、Ｘ
ｂａＩ＋ＮｈｅＩなどを使用して、ＨＩＶゲノム断片を
得る。標準的組換え技術を使用して、すべての断片を得
るすることができ、そしてすべてのそれ以上の組換え構
成体を得ることができる。一般に、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉ
ｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９９０を
参照のこと。適当な候補の選択は、ＲＮＡ Ｔｕｍｏｒ
Ｖｉｒｕｓｅｓ、Ｖｏｌ．ＩＩ、Ｗｅｉｓｓら編、１
９８５−Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙおよびＲａｔｎｅｒら、Ｎａｔｕｒ
ｅ、３１３：２７７−２８４（１９８５）に記載されて
いる番号に従う。
【００２１】相補的配列を生産することができる、断片
の構成のために適当な出発物質は、プラスミドＳＰ６２
の中にクローニングされたＨＩＶプロウイルスの配列か
らなるプラスミドｐＨＸＢ２Ｄである。これはロバート
・ガロ（Ｒｏｂｅｒｔ Ｇａｌｌｏ’）の研究所（Ｎａ
ｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔ
ｈ、ベセスダ、マリイランド州、米国）から入手するこ
とができる。ｐＨＸＢ２ＤはＥｃｏＲＩ＋ＥｃｏＲＶで
切断して、種々の発現ベクターの中にアンチセンスの方
向に挿入できるゲノム断片を得ることができる。
の構成のために適当な出発物質は、プラスミドＳＰ６２
の中にクローニングされたＨＩＶプロウイルスの配列か
らなるプラスミドｐＨＸＢ２Ｄである。これはロバート
・ガロ（Ｒｏｂｅｒｔ Ｇａｌｌｏ’）の研究所（Ｎａ
ｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔ
ｈ、ベセスダ、マリイランド州、米国）から入手するこ
とができる。ｐＨＸＢ２ＤはＥｃｏＲＩ＋ＥｃｏＲＶで
切断して、種々の発現ベクターの中にアンチセンスの方
向に挿入できるゲノム断片を得ることができる。
【００２２】これらの技術は構成体の調製のために選択
されたが、当業者は理解するように、本発明の発現構成
体は、よく受け入れられている核酸のポリマーの合成技
術に従い、ここにおいて開示されている配列および関係
する情報を単に参照し、そして構成体の調製に有用な相
補的配列を推定することによって、新しく合成すること
ができる。ヌクレオチド合成の１つの適当な方法は、ア
プライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ）３８０Ａ型ＤＮＡ合成装置を使用し、
このような合成装置とともに推奨される標準的化学物質
を使用する亜リン酸トリエステル法である（Ｍａｔｔｅ
ｕｃｈｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓ
ｏｃ．１０３：３１８５−３３１９、１９８１）。粗製
のポリヌクレオチドの混合物をゲル電気泳動などにより
精製することができる。
されたが、当業者は理解するように、本発明の発現構成
体は、よく受け入れられている核酸のポリマーの合成技
術に従い、ここにおいて開示されている配列および関係
する情報を単に参照し、そして構成体の調製に有用な相
補的配列を推定することによって、新しく合成すること
ができる。ヌクレオチド合成の１つの適当な方法は、ア
プライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ）３８０Ａ型ＤＮＡ合成装置を使用し、
このような合成装置とともに推奨される標準的化学物質
を使用する亜リン酸トリエステル法である（Ｍａｔｔｅ
ｕｃｈｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓ
ｏｃ．１０３：３１８５−３３１９、１９８１）。粗製
のポリヌクレオチドの混合物をゲル電気泳動などにより
精製することができる。
【００２３】好ましい断片は図１に示されている。図１
に描写するように、有用なｃＤＮＡ断片はＨＩＶゲノム
のｅｎｖ領域の少なくとも一部分に相当し、この部分は
ＨＩＶウイルスゲノムの３’ＬＴＲから約３．４ｋｂに
ついて伸長する（ｎｔ５３２２−８６９４）。この断片
は、アンチセンスの向きで発現または合成されるとき、
発現構成体「ＨＸＢ１」と表示される。第２の有用な構
成体は、ｇａｇ区域において、ＨＩＶゲノムの５’ＬＴ
Ｒから約２．８ｋｂ下流の領域に相当する断片である
（ｎｔ−３４２−２５５６）。この発現構成体を「ＨＸ
Ｂ２」と表示する。とくに好ましい発現構成体は、ウイ
ルスのゲノムから下流で約２．８ｋｂから約４．５ｋｂ
に伸長するＨＩＶゲノムのｐｏｌ領域に対して相補的で
ある（ｎｔ２５５６−４２２７）。これを「ＨＸＢ３」
と表示する。ｐｏｌおよびｔａｔ領域におけるＨＩＶゲ
ノムＲＮＡの部分に対して実質的に相補的であり、約
１．１ｋｂの長さをもちかつＨＩＶゲノムの３’ＬＴＲ
から約４．５ｋｂ〜約３．４ｋｂ上流に位置するポリヌ
クレオチド配列からなる構成体はより好ましい（ｎｔ４
２２７−５３２２）。この発現構成体を「ＨＸＢ４」と
表示する。
に描写するように、有用なｃＤＮＡ断片はＨＩＶゲノム
のｅｎｖ領域の少なくとも一部分に相当し、この部分は
ＨＩＶウイルスゲノムの３’ＬＴＲから約３．４ｋｂに
ついて伸長する（ｎｔ５３２２−８６９４）。この断片
は、アンチセンスの向きで発現または合成されるとき、
発現構成体「ＨＸＢ１」と表示される。第２の有用な構
成体は、ｇａｇ区域において、ＨＩＶゲノムの５’ＬＴ
Ｒから約２．８ｋｂ下流の領域に相当する断片である
（ｎｔ−３４２−２５５６）。この発現構成体を「ＨＸ
Ｂ２」と表示する。とくに好ましい発現構成体は、ウイ
ルスのゲノムから下流で約２．８ｋｂから約４．５ｋｂ
に伸長するＨＩＶゲノムのｐｏｌ領域に対して相補的で
ある（ｎｔ２５５６−４２２７）。これを「ＨＸＢ３」
と表示する。ｐｏｌおよびｔａｔ領域におけるＨＩＶゲ
ノムＲＮＡの部分に対して実質的に相補的であり、約
１．１ｋｂの長さをもちかつＨＩＶゲノムの３’ＬＴＲ
から約４．５ｋｂ〜約３．４ｋｂ上流に位置するポリヌ
クレオチド配列からなる構成体はより好ましい（ｎｔ４
２２７−５３２２）。この発現構成体を「ＨＸＢ４」と
表示する。
【００２４】また、約５５０ｂｐ（ｎｔ７７−６２８）
に相当するとくに好ましい部分構成体（ｓｕｂｃｏｎｓ
ｔｒｕｃｔ）（配列は図２に記載されているか、あるい
はその変異型、配列は図１５に記載されている）をつく
り、そして「ＨＸＢ５」（配列番号：１）と表示する
か、あるいはＨＩＶ株に依存して、配列番号：４と表示
して示されているものである。この構成体がアンチセン
スの向きであるとき相補的であるＨＩＶゲノムの領域
は、ｇａｇのＲ、Ｕ５および５’部分をスパンする部分
である。重要な領域はリーダー配列、プライマー結合部
位（ＰＢＳ）、パッケージングシグナル、スプライスド
ナー（ＳＤ）およびｇａｇ開始コドンである。この構成
体はアンチセンスの向きで提供されているので、ＨＩＶ
ゲノムの前述の領域に対して実質的に相補的である。
に相当するとくに好ましい部分構成体（ｓｕｂｃｏｎｓ
ｔｒｕｃｔ）（配列は図２に記載されているか、あるい
はその変異型、配列は図１５に記載されている）をつく
り、そして「ＨＸＢ５」（配列番号：１）と表示する
か、あるいはＨＩＶ株に依存して、配列番号：４と表示
して示されているものである。この構成体がアンチセン
スの向きであるとき相補的であるＨＩＶゲノムの領域
は、ｇａｇのＲ、Ｕ５および５’部分をスパンする部分
である。重要な領域はリーダー配列、プライマー結合部
位（ＰＢＳ）、パッケージングシグナル、スプライスド
ナー（ＳＤ）およびｇａｇ開始コドンである。この構成
体はアンチセンスの向きで提供されているので、ＨＩＶ
ゲノムの前述の領域に対して実質的に相補的である。
【００２５】２またはそれ以上のヌクレオチド配列を含
有し、アンチセンスの向きで提供されたとき、ＨＩＶゲ
ノムの中の種々の場所に位置する非隣接セグメントに対
して相補的である、キメラの発現構成体は、また、とく
に好ましい。２またはそれ以上のアンチセンスのセグメ
ントは、他のヌクレオチド配列、例えば、リボザイム配
列、あるいはタンパク質の発現、ウイルスの複製、およ
び実行または阻害しようとする他の遺伝的発現の破壊ま
たは阻害の意図する結果を助けることができる問題のい
くつかの他のフランキングすることができる。このフラ
ンキングを反復することができ、こうして問題の１より
多い他の配列がアンチセンスのセグメントによりフラン
キングされるか、あるいは同一の効果が１または２以上
の回数で反復されることは、本発明の範囲内である。こ
れは、例えば、アンチセンス区域によりフランキングさ
れた、多数のリボザイム区域を有する構成体を生ずるこ
とができる。アンチセンスのセグメントは、例えば、ち
ょうど記載した方法で、組み合わせて使用するとき、遺
伝的組み合わせがセンス鎖を形成する可能性が減少する
ので、好ましくは約１ｋｂより小さい；約１ｋｂより小
さいセグメントは一般に発現が容易である；そして望ま
しくない構造領域の発現の可能性は最小となる。さら
に、アンチセンスのセグメントをＨＩＶゲノムの中の多
数の領域に組み合わせると、ＨＩＶの全体の阻害におい
て重要である領域のターゲッティングの正確さがよりよ
くなる。
有し、アンチセンスの向きで提供されたとき、ＨＩＶゲ
ノムの中の種々の場所に位置する非隣接セグメントに対
して相補的である、キメラの発現構成体は、また、とく
に好ましい。２またはそれ以上のアンチセンスのセグメ
ントは、他のヌクレオチド配列、例えば、リボザイム配
列、あるいはタンパク質の発現、ウイルスの複製、およ
び実行または阻害しようとする他の遺伝的発現の破壊ま
たは阻害の意図する結果を助けることができる問題のい
くつかの他のフランキングすることができる。このフラ
ンキングを反復することができ、こうして問題の１より
多い他の配列がアンチセンスのセグメントによりフラン
キングされるか、あるいは同一の効果が１または２以上
の回数で反復されることは、本発明の範囲内である。こ
れは、例えば、アンチセンス区域によりフランキングさ
れた、多数のリボザイム区域を有する構成体を生ずるこ
とができる。アンチセンスのセグメントは、例えば、ち
ょうど記載した方法で、組み合わせて使用するとき、遺
伝的組み合わせがセンス鎖を形成する可能性が減少する
ので、好ましくは約１ｋｂより小さい；約１ｋｂより小
さいセグメントは一般に発現が容易である；そして望ま
しくない構造領域の発現の可能性は最小となる。さら
に、アンチセンスのセグメントをＨＩＶゲノムの中の多
数の領域に組み合わせると、ＨＩＶの全体の阻害におい
て重要である領域のターゲッティングの正確さがよりよ
くなる。
【００２６】キメラ発現構成体の中に含めるために有用
な最も好ましいヌクレオチド配列の１つは、いわゆる
「リボザイム」である。これらは標的ヌクレオチド配列
にいったん結合すると、実際に特定の区域で標的配列を
切断することができ、これが究極的にその配列、および
適当ならば、タンパク質を発現するその能力の破壊、減
少または阻害を増強するので、有用である。当業者は理
解するように、多数のいわゆるリボザイム配列は今日知
られており、そしてそれらの例は次の通りである：「ヘ
パリン」、Ｏｊｗａｎｇ、Ｊ．Ｏ．ら、ＰＮＡＳ Ｕ．
Ｓ．Ａ．、Ｎｏｖ．１５、１９９２、Ｖｏｌ．８９、Ｎ
ｏ．２２、ｐｐ．１０８０１２−１０８０６、およびＨ
ａｍｐｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
１８：２９９−３０４（１９９０）；ＲＮアーゼＰ、Ｍ
ｃＣｌａｉｎ Ｗ．Ｈ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：
５２７−５３０（１９８９）、およびＦｏｒｓｔｅｒ、
Ａ．およびＡｌｔｍａｎ、Ｓ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４
４：７８−７８６（１９９０）；肝炎デルタウイルスの
リボザイム、Ｔｈｉｌｌ、Ｇ．ら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．１９、Ｎｏ．２３、６５１９
−６５２５、およびＲｏｓｅｎｓｔｅｉｎ、Ｓ．Ｐ．お
よびＢｅｅｎ、Ｍ．Ｄ．、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．１９：５４０９−５４１６（１９９１）；「ハ
ンマーヘッド（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）」、Ｈａｓｅｌ
ｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、後掲；ＷＯ９２／０１７
８６；テトラヒメナ、Ｗｏｏｄｓｏｎ、Ｓ．Ａ．および
Ｃｅｃｈ、Ｔ．Ｒ．、Ｃｅｌｌ ５７：３３５−３４５
（１９８９）、Ｚａｕｇｈ、Ａ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ
３２４：４２９−４３３、および米国特許第５，０３
７，７４６号および米国特許第４，９８７，０７１号；
など、そしてこれらをここに記載する技術に従い発現構
成体の中に挿入してその構成体をキメラとすることがで
きるであろう。
な最も好ましいヌクレオチド配列の１つは、いわゆる
「リボザイム」である。これらは標的ヌクレオチド配列
にいったん結合すると、実際に特定の区域で標的配列を
切断することができ、これが究極的にその配列、および
適当ならば、タンパク質を発現するその能力の破壊、減
少または阻害を増強するので、有用である。当業者は理
解するように、多数のいわゆるリボザイム配列は今日知
られており、そしてそれらの例は次の通りである：「ヘ
パリン」、Ｏｊｗａｎｇ、Ｊ．Ｏ．ら、ＰＮＡＳ Ｕ．
Ｓ．Ａ．、Ｎｏｖ．１５、１９９２、Ｖｏｌ．８９、Ｎ
ｏ．２２、ｐｐ．１０８０１２−１０８０６、およびＨ
ａｍｐｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
１８：２９９−３０４（１９９０）；ＲＮアーゼＰ、Ｍ
ｃＣｌａｉｎ Ｗ．Ｈ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：
５２７−５３０（１９８９）、およびＦｏｒｓｔｅｒ、
Ａ．およびＡｌｔｍａｎ、Ｓ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４
４：７８−７８６（１９９０）；肝炎デルタウイルスの
リボザイム、Ｔｈｉｌｌ、Ｇ．ら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．１９、Ｎｏ．２３、６５１９
−６５２５、およびＲｏｓｅｎｓｔｅｉｎ、Ｓ．Ｐ．お
よびＢｅｅｎ、Ｍ．Ｄ．、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．１９：５４０９−５４１６（１９９１）；「ハ
ンマーヘッド（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）」、Ｈａｓｅｌ
ｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、後掲；ＷＯ９２／０１７
８６；テトラヒメナ、Ｗｏｏｄｓｏｎ、Ｓ．Ａ．および
Ｃｅｃｈ、Ｔ．Ｒ．、Ｃｅｌｌ ５７：３３５−３４５
（１９８９）、Ｚａｕｇｈ、Ａ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ
３２４：４２９−４３３、および米国特許第５，０３
７，７４６号および米国特許第４，９８７，０７１号；
など、そしてこれらをここに記載する技術に従い発現構
成体の中に挿入してその構成体をキメラとすることがで
きるであろう。
【００２７】最も早く発見されかつ最も顕著なリボザイ
ムは、ヘイセロッフ（Ｈａｓｅｌｏｆｆ）およびゲルラ
チ（Ｇｅｒｌａｃｈ）により発見されそしてＮａｔｕｒ
ｅ３３４：５８５−５９１、１９８８およびＧｅｎｅ
８２：４３−５２（１９８９）に報告されている、「ハ
ンマーヘッド（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）」の配列であ
る。これらのリボザイムは、高度に特異的であり、２２
塩基の触媒配列が１６塩基の基質結合性配列によりフラ
ンキングされている（図５に概略的に示されている）と
いう事実のために、ここにおける使用のために好まし
い。リボザイムのＲＮＡは相補的ＲＮＡに結合し、そし
てトリプレットＧＵＣ、ＧＵＡ、ＧＵＵ、ＣＵＣ、ＡＵ
ＣまたはＵＵＣの直ぐ後でそれを切断することができ
る。リボザイムを前述したようにアンチセンス配列の長
いストレッチの中にまたはそれに隣接して配置すると、
標的ＲＮＡへのその結合、および有効な切断が促進され
る。好ましいハイブリッド構成体は、これらの領域の中
において２つの制限酵素部位の１つにリボザイム認識配
列、ＧＵＣ、が存在するために、このリボザイムおよび
ＨＩＶのエンベロープ領域の部分に対して相補的なアン
チセンスセグメントを含有する。１つのこのような好ま
しいハイブリッドが調製され（その配列は図３に記載さ
れているか、あるいはその変異型の配列は図１６に示さ
れている）ここで下線の部分はリボザイム部分のための
ヌクレオチド配列を表しそして「ＲＺｅｎｖ１」と表示
されている（配列番号：２、あるいは株に依存して、配
列番号：５）。
ムは、ヘイセロッフ（Ｈａｓｅｌｏｆｆ）およびゲルラ
チ（Ｇｅｒｌａｃｈ）により発見されそしてＮａｔｕｒ
ｅ３３４：５８５−５９１、１９８８およびＧｅｎｅ
８２：４３−５２（１９８９）に報告されている、「ハ
ンマーヘッド（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）」の配列であ
る。これらのリボザイムは、高度に特異的であり、２２
塩基の触媒配列が１６塩基の基質結合性配列によりフラ
ンキングされている（図５に概略的に示されている）と
いう事実のために、ここにおける使用のために好まし
い。リボザイムのＲＮＡは相補的ＲＮＡに結合し、そし
てトリプレットＧＵＣ、ＧＵＡ、ＧＵＵ、ＣＵＣ、ＡＵ
ＣまたはＵＵＣの直ぐ後でそれを切断することができ
る。リボザイムを前述したようにアンチセンス配列の長
いストレッチの中にまたはそれに隣接して配置すると、
標的ＲＮＡへのその結合、および有効な切断が促進され
る。好ましいハイブリッド構成体は、これらの領域の中
において２つの制限酵素部位の１つにリボザイム認識配
列、ＧＵＣ、が存在するために、このリボザイムおよび
ＨＩＶのエンベロープ領域の部分に対して相補的なアン
チセンスセグメントを含有する。１つのこのような好ま
しいハイブリッドが調製され（その配列は図３に記載さ
れているか、あるいはその変異型の配列は図１６に示さ
れている）ここで下線の部分はリボザイム部分のための
ヌクレオチド配列を表しそして「ＲＺｅｎｖ１」と表示
されている（配列番号：２、あるいは株に依存して、配
列番号：５）。
【００２８】この構成体はＨＩＶｅｎｖの５００ｂｐの
断片（ｎｔ５３２０−５５３４および６８９１−７１９
７）を含有し、この断片はＴＡＴエクソン２に対してア
ンチセンスに向いており、開始コドンを含む。さらに、
この構成体は、アンチセンスの向きにクローニングされ
る２つのｅｎｖ配列の中にセンスの向きでクローニング
されたｅｎｖ領域のｎｔ６８９１に対するリボザイムを
含有する。他の好ましいキメラ発現構成体は、ＲＺｅｎ
ｖ１（配列番号：２または配列番号：５）に対して直列
のＨＸＢ５（配列番号：１または配列番号：４）を含
む。これらの構成体はしずれかの順序で互いに対して直
列であることができるが、好ましい態様において、ＨＸ
Ｂ５（配列番号：１または配列番号：４）は、ＨＩＶ株
に依存して、図４または図１７に描写するように、ＲＺ
ｅｎｖ１配列の下流（３’）の発現ベクターの中に挿入
されるであろう（再び下線のリボザイム部分）（株に依
存して、配列番号：３または配列番号：５）。
断片（ｎｔ５３２０−５５３４および６８９１−７１９
７）を含有し、この断片はＴＡＴエクソン２に対してア
ンチセンスに向いており、開始コドンを含む。さらに、
この構成体は、アンチセンスの向きにクローニングされ
る２つのｅｎｖ配列の中にセンスの向きでクローニング
されたｅｎｖ領域のｎｔ６８９１に対するリボザイムを
含有する。他の好ましいキメラ発現構成体は、ＲＺｅｎ
ｖ１（配列番号：２または配列番号：５）に対して直列
のＨＸＢ５（配列番号：１または配列番号：４）を含
む。これらの構成体はしずれかの順序で互いに対して直
列であることができるが、好ましい態様において、ＨＸ
Ｂ５（配列番号：１または配列番号：４）は、ＨＩＶ株
に依存して、図４または図１７に描写するように、ＲＺ
ｅｎｖ１配列の下流（３’）の発現ベクターの中に挿入
されるであろう（再び下線のリボザイム部分）（株に依
存して、配列番号：３または配列番号：５）。
【００２９】また、リボザイム部分がアンチセンスの向
きに維持されている、これらのリボザイム含有構成体に
対する対照を構成する。この方法において、構成体のリ
ボザイム部分が、アンチセンスのみを含有する構成体と
比較して、ウイルスの全体の阻害に寄与する程度を判定
することができる。
きに維持されている、これらのリボザイム含有構成体に
対する対照を構成する。この方法において、構成体のリ
ボザイム部分が、アンチセンスのみを含有する構成体と
比較して、ウイルスの全体の阻害に寄与する程度を判定
することができる。
【００３０】ここに記載する構成体に関するサブクロー
ン、突然変異、および追加の配列、例えば、クローニン
グ部位の配列、フランキング配列、プライマー配列など
は、また、本発明の範囲内に含まれ、そして本発明の発
現構成体の中に含めることができる。構成体がその標的
に結合し、次いでＨＩＶウイルスの実質的な妨害または
阻害を実行する基本的能力が大きく減少しないかぎり、
このような変化は本発明の範囲内である。発現構成体の
組み合わせの使用は、また、本発明の範囲内である。
「組み合わせ」とは、構成体がデリバリーベヒクルまた
はある他のデリバリー系、例えば、レトロウイルスのデ
リバリー系の中で順次または同時の方式で標的と接触す
ることを意味する。後者の場合において、構成体はある
レトロウイルスの発現ベクター上に、あるいは別のベク
ター上に存在し、宿主細胞または他の標的に別々に直列
または同時の方式で送り出されることができる。とくに
好ましい組み合わせは、ＨＸＢ５（配列番号：１または
配列番号：４）とＲＺｅｎｖ１（配列番号：２または配
列番号：５、株に依存する）（配列番号：３または配列
番号：６、それぞれの株に依存する）との組み合わせを
含む。リボザイム配列はそれに結合するＨＩＶゲノムの
中の区域を切断するが、構成体の他の部分はＨＩＶのＲ
ＮＡの種々の他の領域に結合し、その活性を阻害する。
ン、突然変異、および追加の配列、例えば、クローニン
グ部位の配列、フランキング配列、プライマー配列など
は、また、本発明の範囲内に含まれ、そして本発明の発
現構成体の中に含めることができる。構成体がその標的
に結合し、次いでＨＩＶウイルスの実質的な妨害または
阻害を実行する基本的能力が大きく減少しないかぎり、
このような変化は本発明の範囲内である。発現構成体の
組み合わせの使用は、また、本発明の範囲内である。
「組み合わせ」とは、構成体がデリバリーベヒクルまた
はある他のデリバリー系、例えば、レトロウイルスのデ
リバリー系の中で順次または同時の方式で標的と接触す
ることを意味する。後者の場合において、構成体はある
レトロウイルスの発現ベクター上に、あるいは別のベク
ター上に存在し、宿主細胞または他の標的に別々に直列
または同時の方式で送り出されることができる。とくに
好ましい組み合わせは、ＨＸＢ５（配列番号：１または
配列番号：４）とＲＺｅｎｖ１（配列番号：２または配
列番号：５、株に依存する）（配列番号：３または配列
番号：６、それぞれの株に依存する）との組み合わせを
含む。リボザイム配列はそれに結合するＨＩＶゲノムの
中の区域を切断するが、構成体の他の部分はＨＩＶのＲ
ＮＡの種々の他の領域に結合し、その活性を阻害する。
【００３１】本発明に従い作られた発現構成体の効能
は、この分野において知られている種々のアッセイにお
いて試験することができる。例えば、ＨＩＶ−１のｐ２
４抗原の発現は、ＨＩＶの複製および発現の阻害をマー
クする受け入れられている技術である。ＨＩＶウイルス
が細胞に感染し、そして生殖してより多くのヴィリオン
粒子を生産するとき、ｐ２４は検出可能である。したが
って、ｐ２４の阻害は、ウイルスの複製プロセスが阻害
され、そして「分子の免疫性」が与えられたことを示
す。本発明のある種の好ましい構成体は、実施例におい
てさらに説明するようにｐ２４の発現の延長された阻
害、およびシンシチウム形成の妨害を実証した。本発明
に従い作られたＣＡＴの阻害能力を試験するとき利用で
きる他の有用なアッセイは、ＨＩＶのＲＮＡのレベルを
検出するアッセイ、逆転写酵素のアッセイなどである。
は、この分野において知られている種々のアッセイにお
いて試験することができる。例えば、ＨＩＶ−１のｐ２
４抗原の発現は、ＨＩＶの複製および発現の阻害をマー
クする受け入れられている技術である。ＨＩＶウイルス
が細胞に感染し、そして生殖してより多くのヴィリオン
粒子を生産するとき、ｐ２４は検出可能である。したが
って、ｐ２４の阻害は、ウイルスの複製プロセスが阻害
され、そして「分子の免疫性」が与えられたことを示
す。本発明のある種の好ましい構成体は、実施例におい
てさらに説明するようにｐ２４の発現の延長された阻
害、およびシンシチウム形成の妨害を実証した。本発明
に従い作られたＣＡＴの阻害能力を試験するとき利用で
きる他の有用なアッセイは、ＨＩＶのＲＮＡのレベルを
検出するアッセイ、逆転写酵素のアッセイなどである。
【００３２】本発明の発現構成体のあるものの有用性
は、ポリヌクレオチドの構成体を化学的に修飾してそれ
らの半減期を増大することによって増強することができ
る。これらの下記のもの（これらをここに引用によって
加える）を包含する：末端のブロッキング基の技術：Ｚ
ａｍｅｃｋｎｉｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．７５、２８−２８４；Ｚａｍｅｃｋｎｉｋら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３、４１４
３−４１４６；インターヌクレオシドメチルホスホネー
ト類：Ｍｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ６７、７
６９−７７６、１９８５；Ａｇｒｉｓら、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ２５、６２６８−６２７５、１９８６；
Ｓｍｉｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．８３、２７８７−２７９１、１９８６；ホスホチオ
エート類：Ｍａｔｓｕｋｕｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４、７７０６−７７１０（１
９８７）；ポリシンの共有結合付加：Ｌｅｍａｉｔｒｅ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４、６
４８−６５２（１９８７）；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、Ｎｕ
ｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ６、３
１１−３１５（１９８７）；挿入剤：Ｚｅｒｉａｌら、
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５、９９０９
−９９１９（１９８７）；Ｇｅｎｅｘへの欧州特許（Ｅ
Ｐ）第１３８，４３７号（Ｅｎｚｏｎ Ｌａｂｓ，Ｉｎ
ｃ．）；Ｔｕｎｇら、ＢｉｏｃｏｎｊｕｇＣｈｅｍ．、
Ｎｏｖ．−Ｄｅｃ．、１９９１、Ｖｏｌ．２（６）、ｐ
ｐ．４６４−４６５など。
は、ポリヌクレオチドの構成体を化学的に修飾してそれ
らの半減期を増大することによって増強することができ
る。これらの下記のもの（これらをここに引用によって
加える）を包含する：末端のブロッキング基の技術：Ｚ
ａｍｅｃｋｎｉｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．７５、２８−２８４；Ｚａｍｅｃｋｎｉｋら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３、４１４
３−４１４６；インターヌクレオシドメチルホスホネー
ト類：Ｍｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ６７、７
６９−７７６、１９８５；Ａｇｒｉｓら、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ２５、６２６８−６２７５、１９８６；
Ｓｍｉｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．８３、２７８７−２７９１、１９８６；ホスホチオ
エート類：Ｍａｔｓｕｋｕｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４、７７０６−７７１０（１
９８７）；ポリシンの共有結合付加：Ｌｅｍａｉｔｒｅ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４、６
４８−６５２（１９８７）；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、Ｎｕ
ｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ６、３
１１−３１５（１９８７）；挿入剤：Ｚｅｒｉａｌら、
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５、９９０９
−９９１９（１９８７）；Ｇｅｎｅｘへの欧州特許（Ｅ
Ｐ）第１３８，４３７号（Ｅｎｚｏｎ Ｌａｂｓ，Ｉｎ
ｃ．）；Ｔｕｎｇら、ＢｉｏｃｏｎｊｕｇＣｈｅｍ．、
Ｎｏｖ．−Ｄｅｃ．、１９９１、Ｖｏｌ．２（６）、ｐ
ｐ．４６４−４６５など。
【００３３】標的細胞への発現構成体のデリバリーは、
当業者によく知られているように、そして本発明の治療
用組成物の態様について後述するように、普通の方法で
実施することができる。しかしながら、発現構成体の好
ましいデリバリー法は、レトロウイルスを、好ましくは
パッケージング細胞と組み合わせて、使用して、細胞を
ターゲッティングしかつ感染することができる組換えレ
トロウイルスを生産することによる。
当業者によく知られているように、そして本発明の治療
用組成物の態様について後述するように、普通の方法で
実施することができる。しかしながら、発現構成体の好
ましいデリバリー法は、レトロウイルスを、好ましくは
パッケージング細胞と組み合わせて、使用して、細胞を
ターゲッティングしかつ感染することができる組換えレ
トロウイルスを生産することによる。
【００３４】レトロウイルスの転移は、レトロウイルス
が高くかつ効率よい発現のレベル、標的細胞を大きい比
率で生産する能力、広い宿主範囲および特定の細胞をタ
ーゲッティングする能力をもつために、有望な治療的技
術である。レトロウイルスの転移は本発明の機能的発現
構成体を細胞の中に１コピー／細胞で、受容細胞の増殖
能力に影響を与えないで、導入することができる。入手
可能なレトロウイルスおよびそれらの使用に関する追加
の詳細は、欧州特許出願公開第０ １７８ ２２０号、
米国特許第４，４０５，７１２号、欧州特許出願公開第
０ ３３４ ３０１号、国際公開第８９／１１５３９
号、同９１／１０７２８号、同９２／０７９４３号（遺
伝的に修飾された細胞を検出するための選択本発明マー
カーが不必要であることにおいて、「患者の細胞」のｉ
ｎ ｖｉｖｏ遺伝的操作にことに有用である）などの中
に見いだすことができる。前述の刊行物の教示をここに
引用によって加える。
が高くかつ効率よい発現のレベル、標的細胞を大きい比
率で生産する能力、広い宿主範囲および特定の細胞をタ
ーゲッティングする能力をもつために、有望な治療的技
術である。レトロウイルスの転移は本発明の機能的発現
構成体を細胞の中に１コピー／細胞で、受容細胞の増殖
能力に影響を与えないで、導入することができる。入手
可能なレトロウイルスおよびそれらの使用に関する追加
の詳細は、欧州特許出願公開第０ １７８ ２２０号、
米国特許第４，４０５，７１２号、欧州特許出願公開第
０ ３３４ ３０１号、国際公開第８９／１１５３９
号、同９１／１０７２８号、同９２／０７９４３号（遺
伝的に修飾された細胞を検出するための選択本発明マー
カーが不必要であることにおいて、「患者の細胞」のｉ
ｎ ｖｉｖｏ遺伝的操作にことに有用である）などの中
に見いだすことができる。前述の刊行物の教示をここに
引用によって加える。
【００３５】問題のヌクレオチド配列を有するレトロウ
イルスのベクター（組換えレトロウイルスの生産のため
にパッケージング細胞系と組み合わせるか否かにかかわ
らず）の使用は、レトロウイルスのベクターの背景およ
び特別の性質を概観することによってよりよく理解され
る。天然に見いだされるレトロウイルスはある種の規定
された特性を共有する。複製能欠損的でないレトロウイ
ルスのベクターは、転写の方向（５’−−−３’）に、
Ｒとして知られている同一の短い配列（２１〜８０塩
基）を各末端に有するＲＮＡ分子から構成されている。
これ引き続いて、順番に、Ｕ５として知られている単一
の配列（７０〜８０塩基）、ｔＲＮＡ結合部位（ＰＢ
Ｓ、ほぼ２０塩基）、および非コーディング配列（リー
ダー配列）が存在する。ＲＮＡ分子に３つの遺伝子、ウ
イルスの複製のために必須でありかつｇａｇ（ヴィリオ
ン構造タンパク質）、ｐｏｌ（逆ポリメラーゼ）および
ｅｎｖ（エンベロープ）であるである翻訳生産物をコー
ドする領域が続く。ゲノムは次の順序で終結する：非コ
ーディング配列、プリンに富んだ配列（ＯＰＵ）、Ｕ３
として知られている単一の配列（２００〜４５０塩
基）、および最後にＲ配列。レトロウイルスに独特の反
復する末端配列（Ｒ）または単一の配列（Ｕ５およびＵ
３）は、ウイルスのグループの中でむしろよく保存され
るように思われ、そしてウイルスのゲノムの発現のコン
トロールに関係するシグナルを含有する。 レトロウイ
ルスによる感染のサイクルは、細胞の表面上のヴィリオ
ンの吸着および引き続く細胞質の中への侵入で開始す
る。細胞の細胞質において、一本鎖のウイルスＲＮＡは
ヴィリオンの中に存在する逆ポリメラーゼにより、二本
鎖ＤＮＡの線状のコピーに転写される。この逆転写から
生ずるＤＮＡのコピーは、そのための鋳型として作用し
たウイルスＲＮＡ分子よりわずかに大きい。この差は
５’末端におけるＵ３配列および３’末端におけるＵ５
配列の付加の結果である。Ｕ３−Ｒ−Ｕ５配列の順序の
組み合わせは、前にＬＴＲ（長い末端の反復）と記載し
た、ＤＮＡ分子の両端における反復配列を構成する。１
つまたは２つのＬＴＲ配列を含有するウイルスＤＮＡの
コピーは核に運ばれ、ここでそれらは環状の分子に変換
される。次いで、これらの分子は細胞のゲノムＤＮＡの
中に組み込まれる。ウイルスＤＮＡは各末端におけるＬ
ＴＲにより取り囲まれる方法で細胞のＤＮＡの中に組み
込まれ、次いでプロウイルスＤＮＡまたは「プロウイル
ス」の名称をもつ。プロウイルスはウイルスＲＮＡ分子
の転写のための鋳型として作用する。この転写は左のＬ
ＴＲのＲ配列で開始され、そして右のＬＴＲのＵ３また
はＲ配列により運ばれるポリアデニル化シグナルを越え
て終結する。プロウイルスの転写後に得られるＲＮＡ分
子は、真核生物の細胞のｍＲＮＡの反映であり、５’末
端における末端の７ｍＧ残基により「キャップ」され、
そしてウイルスのタンパク質のエンベロープの中にエン
カプスレーションされる。ウイルス粒子は７０Ｓで沈降
する集合体を形成する。それらはそれらを生産する細胞
の外側に射出され、そして進行して近傍の細胞を感染す
る。ウイルス粒子のこの解放は細胞の死を伴う。
イルスのベクター（組換えレトロウイルスの生産のため
にパッケージング細胞系と組み合わせるか否かにかかわ
らず）の使用は、レトロウイルスのベクターの背景およ
び特別の性質を概観することによってよりよく理解され
る。天然に見いだされるレトロウイルスはある種の規定
された特性を共有する。複製能欠損的でないレトロウイ
ルスのベクターは、転写の方向（５’−−−３’）に、
Ｒとして知られている同一の短い配列（２１〜８０塩
基）を各末端に有するＲＮＡ分子から構成されている。
これ引き続いて、順番に、Ｕ５として知られている単一
の配列（７０〜８０塩基）、ｔＲＮＡ結合部位（ＰＢ
Ｓ、ほぼ２０塩基）、および非コーディング配列（リー
ダー配列）が存在する。ＲＮＡ分子に３つの遺伝子、ウ
イルスの複製のために必須でありかつｇａｇ（ヴィリオ
ン構造タンパク質）、ｐｏｌ（逆ポリメラーゼ）および
ｅｎｖ（エンベロープ）であるである翻訳生産物をコー
ドする領域が続く。ゲノムは次の順序で終結する：非コ
ーディング配列、プリンに富んだ配列（ＯＰＵ）、Ｕ３
として知られている単一の配列（２００〜４５０塩
基）、および最後にＲ配列。レトロウイルスに独特の反
復する末端配列（Ｒ）または単一の配列（Ｕ５およびＵ
３）は、ウイルスのグループの中でむしろよく保存され
るように思われ、そしてウイルスのゲノムの発現のコン
トロールに関係するシグナルを含有する。 レトロウイ
ルスによる感染のサイクルは、細胞の表面上のヴィリオ
ンの吸着および引き続く細胞質の中への侵入で開始す
る。細胞の細胞質において、一本鎖のウイルスＲＮＡは
ヴィリオンの中に存在する逆ポリメラーゼにより、二本
鎖ＤＮＡの線状のコピーに転写される。この逆転写から
生ずるＤＮＡのコピーは、そのための鋳型として作用し
たウイルスＲＮＡ分子よりわずかに大きい。この差は
５’末端におけるＵ３配列および３’末端におけるＵ５
配列の付加の結果である。Ｕ３−Ｒ−Ｕ５配列の順序の
組み合わせは、前にＬＴＲ（長い末端の反復）と記載し
た、ＤＮＡ分子の両端における反復配列を構成する。１
つまたは２つのＬＴＲ配列を含有するウイルスＤＮＡの
コピーは核に運ばれ、ここでそれらは環状の分子に変換
される。次いで、これらの分子は細胞のゲノムＤＮＡの
中に組み込まれる。ウイルスＤＮＡは各末端におけるＬ
ＴＲにより取り囲まれる方法で細胞のＤＮＡの中に組み
込まれ、次いでプロウイルスＤＮＡまたは「プロウイル
ス」の名称をもつ。プロウイルスはウイルスＲＮＡ分子
の転写のための鋳型として作用する。この転写は左のＬ
ＴＲのＲ配列で開始され、そして右のＬＴＲのＵ３また
はＲ配列により運ばれるポリアデニル化シグナルを越え
て終結する。プロウイルスの転写後に得られるＲＮＡ分
子は、真核生物の細胞のｍＲＮＡの反映であり、５’末
端における末端の７ｍＧ残基により「キャップ」され、
そしてウイルスのタンパク質のエンベロープの中にエン
カプスレーションされる。ウイルス粒子は７０Ｓで沈降
する集合体を形成する。それらはそれらを生産する細胞
の外側に射出され、そして進行して近傍の細胞を感染す
る。ウイルス粒子のこの解放は細胞の死を伴う。
【００３６】当業者は理解するように、本発明の組換え
レトロウイルスのベクターの構成を開始するために、選
択すべきある数の出発レトロウイルスが存在する。これ
らの内で、鳥類のレトロウイルス、例えば、鳥類の赤芽
球症ウイルス、鳥類の肉腫ウイルス、ネズミの肉腫ウイ
ルス、例えば、ネズミのラウス肉腫ウイルス、および白
血病ウイルス、例えば、マウスのモロネイ（Ｍｏｌｏｎ
ｅｙ）白血病ウイルスを述べることのできる。ある種の
出発レトロウイルスのベクターのプラスミドは商業的に
入手可能であり、例えば、ｐＸＴ１（ストラタジーン、
ラジョラ、カリフォルニア州、から入手可能である）。
１つのこのようなレトロウイルスのベクターのプラスミ
ドは図６に「ｐＬＮＨＬ」として示されており、ここで
ウイルスのタンパク質（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）
コーディング配列は、優性の薬物耐性マーカー遺伝子お
よびプロモーターで置換されている。ここにおける使用
に適当なクローニング部位、ネオマイシン耐性遺伝子
（ＮＥＯ）、内部のプロモーター、ヒトサイトメガロウ
イルス（ＨＣＭＶ）、およびネズミ白血病ウイルス（Ｍ
ＬＶ）配列（５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲをフランキン
グし、ベクターをクローニングのためにいっそう便利と
する）を含有する。本発明の種々の発現構成体は、これ
らのようなベクターのプラスミドの中に便利にクローニ
ングすることができる。
レトロウイルスのベクターの構成を開始するために、選
択すべきある数の出発レトロウイルスが存在する。これ
らの内で、鳥類のレトロウイルス、例えば、鳥類の赤芽
球症ウイルス、鳥類の肉腫ウイルス、ネズミの肉腫ウイ
ルス、例えば、ネズミのラウス肉腫ウイルス、および白
血病ウイルス、例えば、マウスのモロネイ（Ｍｏｌｏｎ
ｅｙ）白血病ウイルスを述べることのできる。ある種の
出発レトロウイルスのベクターのプラスミドは商業的に
入手可能であり、例えば、ｐＸＴ１（ストラタジーン、
ラジョラ、カリフォルニア州、から入手可能である）。
１つのこのようなレトロウイルスのベクターのプラスミ
ドは図６に「ｐＬＮＨＬ」として示されており、ここで
ウイルスのタンパク質（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）
コーディング配列は、優性の薬物耐性マーカー遺伝子お
よびプロモーターで置換されている。ここにおける使用
に適当なクローニング部位、ネオマイシン耐性遺伝子
（ＮＥＯ）、内部のプロモーター、ヒトサイトメガロウ
イルス（ＨＣＭＶ）、およびネズミ白血病ウイルス（Ｍ
ＬＶ）配列（５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲをフランキン
グし、ベクターをクローニングのためにいっそう便利と
する）を含有する。本発明の種々の発現構成体は、これ
らのようなベクターのプラスミドの中に便利にクローニ
ングすることができる。
【００３７】ここに記載する組換えベクターは、発現構
成体と操作的に関連する他の有用なヌクレオチド配列、
例えば、エンハンサー配列を含むことができる。エンハ
ンサー配列は転写比、およびある種の細胞特異的活動に
影響を与える働きをする。哺乳動物細胞とともに使用す
るために好ましいエンハンサーは、マウスのクレアチン
キナーゼから得られ、Ｔ細胞受容からのエンハンサー、
ＩＬ−２エンハンサーなどである。
成体と操作的に関連する他の有用なヌクレオチド配列、
例えば、エンハンサー配列を含むことができる。エンハ
ンサー配列は転写比、およびある種の細胞特異的活動に
影響を与える働きをする。哺乳動物細胞とともに使用す
るために好ましいエンハンサーは、マウスのクレアチン
キナーゼから得られ、Ｔ細胞受容からのエンハンサー、
ＩＬ−２エンハンサーなどである。
【００３８】本発明の組換えベクターの構成体の中に存
在することができる他の要素は、ポリアデニル化部位で
ある。真核生物のポリアデニル化部位はよく知られてお
りそして、それゆえ、発表された報告と合致したＤＮＡ
配列を得ることができる。例示のポリアデニル化配列は
マウスのベータ−グロブリン、サルのウイルス４０の後
期または前期の領域の遺伝子から得ることができるが、
ウイルスのポリアデニル化部位は好ましい。これらの配
列は既知であり、そして普通の方式でベクターに結合す
ることができる。
在することができる他の要素は、ポリアデニル化部位で
ある。真核生物のポリアデニル化部位はよく知られてお
りそして、それゆえ、発表された報告と合致したＤＮＡ
配列を得ることができる。例示のポリアデニル化配列は
マウスのベータ−グロブリン、サルのウイルス４０の後
期または前期の領域の遺伝子から得ることができるが、
ウイルスのポリアデニル化部位は好ましい。これらの配
列は既知であり、そして普通の方式でベクターに結合す
ることができる。
【００３９】適当なマーカーを組換えベクターの構成体
の中に含めることができる。種々のマーカー遺伝子の配
列はこの分野において知られており、そしてここにおけ
る目的のために選択することができる。しかしながら、
被験細胞または二次被験細胞の中で発現されるマーカー
は、好ましくは、下記のものから選択されるタンパク質
をエンコードする遺伝配列である：（ｉ）酵素、（ｉ
ｉ）被験細胞または二次被験細胞をそれらがそうでなけ
れば成長しない培地、例えば、そうでなければ毒性であ
る薬物の存在下に、あるいは細胞の成長に要求されるあ
る種の主要な因子を欠如する選択培地の中で成長させる
ことができるタンパク質、および（ｉｉｉ）抗原、およ
び、とくに、細胞表面上で発現される抗原。例は次のも
のを包含する：Ｇ４１８の阻害により選択されるアミノ
グルコシド−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）、ジ
ヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦＲ）：メトトレキセー
ト耐性変異型、ヒグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフ
ェラーゼ（ＨＰＨ）、通常タンパク質の合成を阻害する
ヒグロマイシンーＢの阻害により選択される、チロシン
キナーゼ（ＴＫ）、通常新規のプリンおよびチミジレー
トの合成を阻害する薬物アミノプテリンの使用により選
択される（ＴＫはチミジレートを合成する）、キサンチ
ン−グアニンホスオリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧ
ＰＲＴ）、通常新規のＧＭＰの合成を阻害するマイコフ
ェノール酸の使用により選択される（ＸＧＰＲＴはキサ
ンチンからＧＭＰを合成する）、およびＤＮＡを損傷す
る化合物の付加不活性化するアデノシンデアミナーゼ
（ＡＤＡ）。優性な選択マーカー、例えば、ネオマイシ
ン、ＧＰＴ、およびＨＧＰＲＴは、発現のために突然変
異の細胞系必要としないので、ここにおける使用のため
に好ましい。
の中に含めることができる。種々のマーカー遺伝子の配
列はこの分野において知られており、そしてここにおけ
る目的のために選択することができる。しかしながら、
被験細胞または二次被験細胞の中で発現されるマーカー
は、好ましくは、下記のものから選択されるタンパク質
をエンコードする遺伝配列である：（ｉ）酵素、（ｉ
ｉ）被験細胞または二次被験細胞をそれらがそうでなけ
れば成長しない培地、例えば、そうでなければ毒性であ
る薬物の存在下に、あるいは細胞の成長に要求されるあ
る種の主要な因子を欠如する選択培地の中で成長させる
ことができるタンパク質、および（ｉｉｉ）抗原、およ
び、とくに、細胞表面上で発現される抗原。例は次のも
のを包含する：Ｇ４１８の阻害により選択されるアミノ
グルコシド−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）、ジ
ヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦＲ）：メトトレキセー
ト耐性変異型、ヒグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフ
ェラーゼ（ＨＰＨ）、通常タンパク質の合成を阻害する
ヒグロマイシンーＢの阻害により選択される、チロシン
キナーゼ（ＴＫ）、通常新規のプリンおよびチミジレー
トの合成を阻害する薬物アミノプテリンの使用により選
択される（ＴＫはチミジレートを合成する）、キサンチ
ン−グアニンホスオリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧ
ＰＲＴ）、通常新規のＧＭＰの合成を阻害するマイコフ
ェノール酸の使用により選択される（ＸＧＰＲＴはキサ
ンチンからＧＭＰを合成する）、およびＤＮＡを損傷す
る化合物の付加不活性化するアデノシンデアミナーゼ
（ＡＤＡ）。優性な選択マーカー、例えば、ネオマイシ
ン、ＧＰＴ、およびＨＧＰＲＴは、発現のために突然変
異の細胞系必要としないので、ここにおける使用のため
に好ましい。
【００４０】適当なプロモーターは種々の細胞の中で機
能するものを包含する。これらの例は、ＳＶ４０、ＲＳ
Ｖ、ネズミ白血病ウイルス、ホスファチジルキナーゼ
（ＰＧＫ）、ＨＣＭＶ、ＴＫプロモーターなどである。
ＨＣＭＶは種々の細胞の型の中で操作することができる
強いプロモーターであるので、ここにおける使用のため
に好ましい。また、外部で調節可能なプロモーターを含
めることは有用であることがある。
能するものを包含する。これらの例は、ＳＶ４０、ＲＳ
Ｖ、ネズミ白血病ウイルス、ホスファチジルキナーゼ
（ＰＧＫ）、ＨＣＭＶ、ＴＫプロモーターなどである。
ＨＣＭＶは種々の細胞の型の中で操作することができる
強いプロモーターであるので、ここにおける使用のため
に好ましい。また、外部で調節可能なプロモーターを含
めることは有用であることがある。
【００４１】本発明のレトロウイルスのベクターは問題
の他の構成体を含むことができる。例えば、とくに好ま
しい態様において、可溶性ＣＤ４抗原を発現するヌクレ
オチド配列をレトロウイルスのベクターの中に含めるこ
とができる。ＣＤ４分子は、効率よいＴ細胞−標的細胞
の相互作用の仲介に関係した、いくつかの非多形性Ｔリ
ンパ球の表面タンパク質のうちの１つである。可溶性Ｃ
Ｄ４タンパク質はその生物学的および免疫学的性質によ
り特性決定され、そしてＨＩＶ感染の防止および処置に
おいて価値を有すると考えられてきている。研究におい
て、このタンパク質はウイルスの細胞外および細胞対細
胞の広がりのインヒビターとして作用することができ
る。可溶性ＣＤ４は培養においてＣＤ４陽性標的細胞へ
結合するウイルスをブロックすることが示されたので、
感染した人へのこのタンパク質の投与はウイルスの細胞
外の広がりを阻害する作用をするであろうと信じられ
る。したがって、それは感染した人における疾患の状態
の処置において予防剤および治療剤の両者において価値
を有する。予防剤として、ＣＤ４はウイルスに対する抗
体の存在によりＨＩＶへの暴露を示す個体に投与するこ
とができる。疾患の初期の段階または前または開始にお
いて有効量のこのタンパク質の投与は、ＨＩＶによるＣ
Ｄ４陽性のリンパ球の感染を阻害する作用をする。治療
剤として、ＨＩＶで感染した人へのこのタンパク質の投
与はウイルスの細胞外の広がりを阻害する作用をする。
ＨＩＶ感染細胞と他のＣＤ４陽性リンパ球との間の融合
は、また、ウイルスの広がりのルートであるように思わ
れる。また、融合はＣＤ４リンパ球の機能の障害の原因
となり、そして究極的に感染した個体におけるＣＤ４陽
性リンパ球の消耗の原因となることがある。
の他の構成体を含むことができる。例えば、とくに好ま
しい態様において、可溶性ＣＤ４抗原を発現するヌクレ
オチド配列をレトロウイルスのベクターの中に含めるこ
とができる。ＣＤ４分子は、効率よいＴ細胞−標的細胞
の相互作用の仲介に関係した、いくつかの非多形性Ｔリ
ンパ球の表面タンパク質のうちの１つである。可溶性Ｃ
Ｄ４タンパク質はその生物学的および免疫学的性質によ
り特性決定され、そしてＨＩＶ感染の防止および処置に
おいて価値を有すると考えられてきている。研究におい
て、このタンパク質はウイルスの細胞外および細胞対細
胞の広がりのインヒビターとして作用することができ
る。可溶性ＣＤ４は培養においてＣＤ４陽性標的細胞へ
結合するウイルスをブロックすることが示されたので、
感染した人へのこのタンパク質の投与はウイルスの細胞
外の広がりを阻害する作用をするであろうと信じられ
る。したがって、それは感染した人における疾患の状態
の処置において予防剤および治療剤の両者において価値
を有する。予防剤として、ＣＤ４はウイルスに対する抗
体の存在によりＨＩＶへの暴露を示す個体に投与するこ
とができる。疾患の初期の段階または前または開始にお
いて有効量のこのタンパク質の投与は、ＨＩＶによるＣ
Ｄ４陽性のリンパ球の感染を阻害する作用をする。治療
剤として、ＨＩＶで感染した人へのこのタンパク質の投
与はウイルスの細胞外の広がりを阻害する作用をする。
ＨＩＶ感染細胞と他のＣＤ４陽性リンパ球との間の融合
は、また、ウイルスの広がりのルートであるように思わ
れる。また、融合はＣＤ４リンパ球の機能の障害の原因
となり、そして究極的に感染した個体におけるＣＤ４陽
性リンパ球の消耗の原因となることがある。
【００４２】こうして、本発明のある種の組み合わせの
態様において、レトロウイルスのベクターは標的細胞に
送り出され、ここで構成体のアンチセンス部分はウイル
スの感染を阻害するように働くことができるが、可溶性
ＣＤ４は細胞により比較的構成的方法で有利に生産さ
れ、そして血流の中に分泌されて、血流の中で自由であ
るウイルス（ウイルス粒子上のｇｐ１２０）に結合す
る。これはＨＩＶウイルスの感染への２またの攻撃であ
る。本発明によれば、種々のキメラ発現構成体は、本発
明のレトロウイルスのベクターの中に、可溶性ＣＤ４ま
たはそのより小さい機能的サブセットと組み合わせて提
供される。可溶性ＣＤ４のためのｃＤＮＡ配列からなる
プラスミドをｐＴ４Ｂと表示し、そしてアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）
（ＡＴＣＣ）米国マリイランド州ロックビレ）から入手
することができる。可溶性ＣＤ４についての追加の情報
は、欧州特許（ＥＰ）第０ ３１３ ３７７号および米
国特許第５，１２６，４３３号（Ｍａｄｄｏｎら）（こ
こにおいて引用によって加える）に記載されている。こ
のようなインサートの位置は、実施例においていっそう
詳しく説明するように、出発ベクターのＬＴＲの間でク
ローニングすることができる。時にはＬＴＲは非機能的
となるので、内部のプロモーターの次にアンチセンスを
配置することが望ましいことがある。選択マーカーは
５’ＬＴＲの下流または任意の他の便利なクローニング
部位に配置することができる。追加の構成体を付加する
とき、ベクター上のそれらの位置は好ましくはプロモー
ターの中の転写開始部位の間の開始コドンの前、あるい
はＡＴＧの前のプロモーターに密接する。可溶性ＣＤ４
の遺伝子の特定の場合において、その遺伝子またはその
断片は好ましくは３’ＬＴＲのＵ３とＵ５との間に挿入
される。次いでこの操作したＬＴＲは出発レトロウイル
スのベクターの３’ＬＴＲと置換される。これはアンチ
センスおよび種々の散在する開始コドンの下流のＣＤ４
の挿入を回避する。
態様において、レトロウイルスのベクターは標的細胞に
送り出され、ここで構成体のアンチセンス部分はウイル
スの感染を阻害するように働くことができるが、可溶性
ＣＤ４は細胞により比較的構成的方法で有利に生産さ
れ、そして血流の中に分泌されて、血流の中で自由であ
るウイルス（ウイルス粒子上のｇｐ１２０）に結合す
る。これはＨＩＶウイルスの感染への２またの攻撃であ
る。本発明によれば、種々のキメラ発現構成体は、本発
明のレトロウイルスのベクターの中に、可溶性ＣＤ４ま
たはそのより小さい機能的サブセットと組み合わせて提
供される。可溶性ＣＤ４のためのｃＤＮＡ配列からなる
プラスミドをｐＴ４Ｂと表示し、そしてアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）
（ＡＴＣＣ）米国マリイランド州ロックビレ）から入手
することができる。可溶性ＣＤ４についての追加の情報
は、欧州特許（ＥＰ）第０ ３１３ ３７７号および米
国特許第５，１２６，４３３号（Ｍａｄｄｏｎら）（こ
こにおいて引用によって加える）に記載されている。こ
のようなインサートの位置は、実施例においていっそう
詳しく説明するように、出発ベクターのＬＴＲの間でク
ローニングすることができる。時にはＬＴＲは非機能的
となるので、内部のプロモーターの次にアンチセンスを
配置することが望ましいことがある。選択マーカーは
５’ＬＴＲの下流または任意の他の便利なクローニング
部位に配置することができる。追加の構成体を付加する
とき、ベクター上のそれらの位置は好ましくはプロモー
ターの中の転写開始部位の間の開始コドンの前、あるい
はＡＴＧの前のプロモーターに密接する。可溶性ＣＤ４
の遺伝子の特定の場合において、その遺伝子またはその
断片は好ましくは３’ＬＴＲのＵ３とＵ５との間に挿入
される。次いでこの操作したＬＴＲは出発レトロウイル
スのベクターの３’ＬＴＲと置換される。これはアンチ
センスおよび種々の散在する開始コドンの下流のＣＤ４
の挿入を回避する。
【００４３】本発明の好ましいレトロウイルスのベクタ
ーは、レトロウイルスのベクターの中に挿入された１ま
たは２以上の前述の発現構成体（図６）、とくにＨＸＢ
４およびｐＲＲＺｅｎｖ１を含み、これらの完全なレト
ロウイルスのベクターの態様を以後「ＲＡＳＨ４」およ
び「ＲＲＺｅｎｖ」と呼ぶ。また、アンチセンス発現構
成体の単独またはそれと問題の他の構成体との組み合わ
せを含有する組換えレトロウイルスのベクターは、ここ
における使用のために好ましい。これに関して、ＨＸＢ
５（配列番号：１または配列番号：４）、ＲＺｅｎｖ１
（配列番号：２または配列番号：５）、および可溶性Ｃ
Ｄ４（ＲＡＳＨ８）はとくに好ましい。これらの好まし
い態様において、選択するプロモーターはＣＭＶ、ＳＶ
４０、ＲＳＶ、およびｐＧＫを包含し、そして好ましい
選択マーカーはＮｅｏ、ＧＰＴおよびＨＧＰＲＴであ
る。
ーは、レトロウイルスのベクターの中に挿入された１ま
たは２以上の前述の発現構成体（図６）、とくにＨＸＢ
４およびｐＲＲＺｅｎｖ１を含み、これらの完全なレト
ロウイルスのベクターの態様を以後「ＲＡＳＨ４」およ
び「ＲＲＺｅｎｖ」と呼ぶ。また、アンチセンス発現構
成体の単独またはそれと問題の他の構成体との組み合わ
せを含有する組換えレトロウイルスのベクターは、ここ
における使用のために好ましい。これに関して、ＨＸＢ
５（配列番号：１または配列番号：４）、ＲＺｅｎｖ１
（配列番号：２または配列番号：５）、および可溶性Ｃ
Ｄ４（ＲＡＳＨ８）はとくに好ましい。これらの好まし
い態様において、選択するプロモーターはＣＭＶ、ＳＶ
４０、ＲＳＶ、およびｐＧＫを包含し、そして好ましい
選択マーカーはＮｅｏ、ＧＰＴおよびＨＧＰＲＴであ
る。
【００４４】本発明のレトロウイルスのベクターは、治
療用組成物の態様について詳細に後述するように、適当
な媒質とともに直接投与により治療的に（ｉｎ ｖｉｖ
ｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ）投与することができるか、あ
るいはデリバリー系、例えば、リポソーム、またはウイ
ルス、例えば、バキュロウイルス、アデノウイルス、ワ
クシニアウイルス、無関係のレトロウイルスなどの中に
含有させることができる。これらのウイルスはその中に
提供された外因性遺伝子から比較的高いレベルのタンパ
ク質を発現することが知られている。ＤＮＡウイルスの
ベクターについて、ウイルスＤＮＡとレトロウイルスま
たはレトロウイルスのベクターの遺伝情報を有するプラ
スミドとの間の組織培養におけるｉｎ ｖｉｖｏ組換え
により、組換えＤＮＡウイルスを生産することができ
る。生ずるＤＮＡウイルのベクターは、スレトロウイル
スのタンパク質をコードする配列またはレトロウイルス
のベクターのＲＮＡをコードする配列を有し、高い力価
のストックに精製することができる。あるいは、構成体
をｉｎ ｖｉｔｒｏで構成し、引き続いてＤＮＡベクタ
ーから失われたトランス、ウイルスの機能を提供する細
胞の中にトランスフェクションすることができる。次い
で、感受性細胞を感染させることができ、その結果レト
ロウイルスのタンパク質またはＲＮＡレトロウイルスの
ベクターのゲノム、あるいは両者は適当に発現される。
この技術は、アデノウイルスまたは他の哺乳動物のベク
ターとともに使用するとき、組換えレトロウイルスのベ
クターを生産するために、発現に典型的に使用される細
胞の使用を可能とする。これに関してそれ以上の情報に
ついては、ＷＯ９１／０２８０５（ここに引用によって
加える）を参照のこと。
療用組成物の態様について詳細に後述するように、適当
な媒質とともに直接投与により治療的に（ｉｎ ｖｉｖ
ｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ）投与することができるか、あ
るいはデリバリー系、例えば、リポソーム、またはウイ
ルス、例えば、バキュロウイルス、アデノウイルス、ワ
クシニアウイルス、無関係のレトロウイルスなどの中に
含有させることができる。これらのウイルスはその中に
提供された外因性遺伝子から比較的高いレベルのタンパ
ク質を発現することが知られている。ＤＮＡウイルスの
ベクターについて、ウイルスＤＮＡとレトロウイルスま
たはレトロウイルスのベクターの遺伝情報を有するプラ
スミドとの間の組織培養におけるｉｎ ｖｉｖｏ組換え
により、組換えＤＮＡウイルスを生産することができ
る。生ずるＤＮＡウイルのベクターは、スレトロウイル
スのタンパク質をコードする配列またはレトロウイルス
のベクターのＲＮＡをコードする配列を有し、高い力価
のストックに精製することができる。あるいは、構成体
をｉｎ ｖｉｔｒｏで構成し、引き続いてＤＮＡベクタ
ーから失われたトランス、ウイルスの機能を提供する細
胞の中にトランスフェクションすることができる。次い
で、感受性細胞を感染させることができ、その結果レト
ロウイルスのタンパク質またはＲＮＡレトロウイルスの
ベクターのゲノム、あるいは両者は適当に発現される。
この技術は、アデノウイルスまたは他の哺乳動物のベク
ターとともに使用するとき、組換えレトロウイルスのベ
クターを生産するために、発現に典型的に使用される細
胞の使用を可能とする。これに関してそれ以上の情報に
ついては、ＷＯ９１／０２８０５（ここに引用によって
加える）を参照のこと。
【００４５】厳格にレトロウイルスの系を使用する態様
において、レトロウイルスのベクターは、パッケージン
グタンパク質をエンコードする配列を欠如する場合、構
成体でトランスフェクションされた細胞（同時にまたは
順次に）「ヘルパーのレトロウイルスのベクター」を導
入することによって、ターゲッティングした細胞からパ
ッケージングされたレトロウイルスとして「レスキュー
（ｒｅｓｃｕｅ）」することもできる。これらのヘルパ
ーのウイルスのベクターは、ウイルスの発現に必要な細
胞内でパッケージングタンパク質を発現する。ヘルパー
のウイルスは、構成体がエンコードするＲＮＡゲノムを
パッケージングするために必要なタンパク質を生産する
が、それ自体のゲノムをパッケージングしないように、
ヘルパーのウイルス自体のパッケージング配列を除去す
ることによってしばしば欠陥のあるものとされる。この
ようなヘルパーのウイルスは、治療的投与において使用
される場合、悪い作用を回避するように選択されるであ
ろう。
において、レトロウイルスのベクターは、パッケージン
グタンパク質をエンコードする配列を欠如する場合、構
成体でトランスフェクションされた細胞（同時にまたは
順次に）「ヘルパーのレトロウイルスのベクター」を導
入することによって、ターゲッティングした細胞からパ
ッケージングされたレトロウイルスとして「レスキュー
（ｒｅｓｃｕｅ）」することもできる。これらのヘルパ
ーのウイルスのベクターは、ウイルスの発現に必要な細
胞内でパッケージングタンパク質を発現する。ヘルパー
のウイルスは、構成体がエンコードするＲＮＡゲノムを
パッケージングするために必要なタンパク質を生産する
が、それ自体のゲノムをパッケージングしないように、
ヘルパーのウイルス自体のパッケージング配列を除去す
ることによってしばしば欠陥のあるものとされる。この
ようなヘルパーのウイルスは、治療的投与において使用
される場合、悪い作用を回避するように選択されるであ
ろう。
【００４６】本発明のレトロウイルスのベクターは、ま
た、いわゆる「パッケージング細胞」の中にパッケージ
ングして完全な機能的組換えレトロウイルスを生産し、
この組換えレトロウイルスは自然においてその同等体が
なすように細胞を感染するであろう。パッケージング細
胞系は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）商業的に入手可能で
あるか、あるいは種々の教示に従い作ることができる。
ムリガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ）およびダノス（Ｄａｎｏ
ｓ）はこのような有用な細胞系の１つをＷＯ９０／０２
８０６号に記載した。これらおよび関係する細胞系はＭ
ＩＴ（ケンブリッジ、マサチュセッツ州）から入手可能
である。他の有用な細胞系および教示は、次のものを包
含する：ＷＯ９０／０２７９７号に記載されているも
の、ノースカリナ州立大学から入手されるもの、および
ＷＯ８９／１１５３９号に記載されているもの、ソロア
ン−ケッターリング・インスチチュート・フォー・キャ
ンサー・リサーチ（Ｓｌｏａｎ−ＫｅｔｔｅｒｉｎｇＩ
ｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ）からのギルボア（Ｇｉｌｂｏａ）、ＷＯ８９
／０７１５０号に記載されているもの、コロンビア大学
からのアーサー・バンク（Ａｒｔｈｕｒ Ｂａｎｋ）、
およびＷＯ８６／００９２２号に記載されているもの、
ソーク・インスチチュート・フォー・バオロジカル・ス
タディーズ（Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｆｏｒ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ）からのベル
マ（Ｖｅｒｍａ）。前述の刊行物に記載されている説明
を引用することによつて本明細書の内容とする。
た、いわゆる「パッケージング細胞」の中にパッケージ
ングして完全な機能的組換えレトロウイルスを生産し、
この組換えレトロウイルスは自然においてその同等体が
なすように細胞を感染するであろう。パッケージング細
胞系は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）商業的に入手可能で
あるか、あるいは種々の教示に従い作ることができる。
ムリガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ）およびダノス（Ｄａｎｏ
ｓ）はこのような有用な細胞系の１つをＷＯ９０／０２
８０６号に記載した。これらおよび関係する細胞系はＭ
ＩＴ（ケンブリッジ、マサチュセッツ州）から入手可能
である。他の有用な細胞系および教示は、次のものを包
含する：ＷＯ９０／０２７９７号に記載されているも
の、ノースカリナ州立大学から入手されるもの、および
ＷＯ８９／１１５３９号に記載されているもの、ソロア
ン−ケッターリング・インスチチュート・フォー・キャ
ンサー・リサーチ（Ｓｌｏａｎ−ＫｅｔｔｅｒｉｎｇＩ
ｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ）からのギルボア（Ｇｉｌｂｏａ）、ＷＯ８９
／０７１５０号に記載されているもの、コロンビア大学
からのアーサー・バンク（Ａｒｔｈｕｒ Ｂａｎｋ）、
およびＷＯ８６／００９２２号に記載されているもの、
ソーク・インスチチュート・フォー・バオロジカル・ス
タディーズ（Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｆｏｒ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ）からのベル
マ（Ｖｅｒｍａ）。前述の刊行物に記載されている説明
を引用することによつて本明細書の内容とする。
【００４７】本発明のレトロウイルスのベクターの好ま
しいデリバリーは、前述の組換えレトロウイルスの使用
による。本発明の好ましい組換えレトロウイルスのゲノ
ムは「複製能欠損的」であり、これは、ここに記載する
ように、ウイルスのゲノムがエンカプスレーションした
細胞中のウイルス粒子（機能的ヴィリオン）をそれらが
感染する細胞の中で生殖することができないことを意味
する（しかしながら、それらは細胞から発芽する空のヴ
ィリオンを生産することができるであろう）。さらに、
それらは実質的なヘルパーウイルスを生じないか、ある
いはウイルスのパッケージング機能を子孫のウイルスに
実質的に転移しない。しかしながら、それらは宿主細胞
の正常の細胞の有糸***活性の間に宿主細胞のゲノムの
中で事実複製する。レトロウイルスの複製のために要求
される要素はシス作用およびトランス作用の因子に分割
することができる。トランス作用の因子は、ウイルスＲ
ＮＡのエンカプスレーション、細胞の中へのヴィリオン
の進入、ウイルスのゲノムの逆転写、およびウイルスの
ＤＮＡ形態の宿主ＤＮＡの中への組込みのために要求さ
れるウイルスのゲノムによりコードされるタンパク質を
包含する。シス作用の因子は、ウイルスの複製の間にこ
れらのタンパク質および他の因子と相互作用するウイル
スＲＮＡの中に存在するシグナルを包含する。米国特許
第４，８６１，７１９号は、複製能力ウイルスのゲノム
が系統的に修飾されたシス作用の要素を最高に妨害する
が、トランス作用の要素の生産を保存することにおい
て、複製能力ウイルスを発生する低い傾向を有するレト
ロウイルスのパッケージング細胞系を記載している。そ
の中に記載されている細胞系はウイルスを伝達せず、外
来遺伝子を運ぶようにデザインされたレトロウイルスの
ベクターを包含する、適切なシス作用の要素を含有する
他のＲＮＡを伝達するであろう。より安全な細胞系を構
成するより最近のアプローチの１つはヘルパーウイルス
の相補的部分の使用を含み、これらの部分は２つの別々
のプラスミドに分割されており、一方はｇａｇおよびｐ
ｏｌを含有し、そして他方はｅｎｖを含有する、Ｍａｒ
ｋｏｗｉｔｚら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６７：６００−
６０６、１９８８。この系の利点は、複製能力ゲノムの
発生に３つの組換え事象が要求されるということであ
る。ムリガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ）およびダノス（Ｄａ
ｎｏｓ）は、バンクス（Ｂａｎｋｓ）ＷＯ８９／０７１
５０（ここに引用によって加える）のように、順次のト
ランスフェクション技術（同時のトランスフェクション
よりむしろ）ＷＯ９０／０２０８０６に基づく、これお
よび他の有用な細胞系を記載している。ＷＯ８９／０７
１５０に記載されているパッケージング細胞系は好まし
い。なぜなら、これらを使用して野生型ヘルパー不含生
産体の細胞を作ることができるからである。一般に、パ
ッケージング配列および３’ＬＴＲは、また、バンクス
（Ｂａｎｋｓ）の細胞系におけるヘルパープラスミドの
各々において欠失される。生ずる組換えレトロウイルス
は両種性であり、広範な種類の細胞の型をターゲッティ
ングして問題の外来遺伝物質を送り出すことができる。
しいデリバリーは、前述の組換えレトロウイルスの使用
による。本発明の好ましい組換えレトロウイルスのゲノ
ムは「複製能欠損的」であり、これは、ここに記載する
ように、ウイルスのゲノムがエンカプスレーションした
細胞中のウイルス粒子（機能的ヴィリオン）をそれらが
感染する細胞の中で生殖することができないことを意味
する（しかしながら、それらは細胞から発芽する空のヴ
ィリオンを生産することができるであろう）。さらに、
それらは実質的なヘルパーウイルスを生じないか、ある
いはウイルスのパッケージング機能を子孫のウイルスに
実質的に転移しない。しかしながら、それらは宿主細胞
の正常の細胞の有糸***活性の間に宿主細胞のゲノムの
中で事実複製する。レトロウイルスの複製のために要求
される要素はシス作用およびトランス作用の因子に分割
することができる。トランス作用の因子は、ウイルスＲ
ＮＡのエンカプスレーション、細胞の中へのヴィリオン
の進入、ウイルスのゲノムの逆転写、およびウイルスの
ＤＮＡ形態の宿主ＤＮＡの中への組込みのために要求さ
れるウイルスのゲノムによりコードされるタンパク質を
包含する。シス作用の因子は、ウイルスの複製の間にこ
れらのタンパク質および他の因子と相互作用するウイル
スＲＮＡの中に存在するシグナルを包含する。米国特許
第４，８６１，７１９号は、複製能力ウイルスのゲノム
が系統的に修飾されたシス作用の要素を最高に妨害する
が、トランス作用の要素の生産を保存することにおい
て、複製能力ウイルスを発生する低い傾向を有するレト
ロウイルスのパッケージング細胞系を記載している。そ
の中に記載されている細胞系はウイルスを伝達せず、外
来遺伝子を運ぶようにデザインされたレトロウイルスの
ベクターを包含する、適切なシス作用の要素を含有する
他のＲＮＡを伝達するであろう。より安全な細胞系を構
成するより最近のアプローチの１つはヘルパーウイルス
の相補的部分の使用を含み、これらの部分は２つの別々
のプラスミドに分割されており、一方はｇａｇおよびｐ
ｏｌを含有し、そして他方はｅｎｖを含有する、Ｍａｒ
ｋｏｗｉｔｚら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６７：６００−
６０６、１９８８。この系の利点は、複製能力ゲノムの
発生に３つの組換え事象が要求されるということであ
る。ムリガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ）およびダノス（Ｄａ
ｎｏｓ）は、バンクス（Ｂａｎｋｓ）ＷＯ８９／０７１
５０（ここに引用によって加える）のように、順次のト
ランスフェクション技術（同時のトランスフェクション
よりむしろ）ＷＯ９０／０２０８０６に基づく、これお
よび他の有用な細胞系を記載している。ＷＯ８９／０７
１５０に記載されているパッケージング細胞系は好まし
い。なぜなら、これらを使用して野生型ヘルパー不含生
産体の細胞を作ることができるからである。一般に、パ
ッケージング配列および３’ＬＴＲは、また、バンクス
（Ｂａｎｋｓ）の細胞系におけるヘルパープラスミドの
各々において欠失される。生ずる組換えレトロウイルス
は両種性であり、広範な種類の細胞の型をターゲッティ
ングして問題の外来遺伝物質を送り出すことができる。
【００４８】本発明の他の面において、ある種の表面リ
ガンド（またはレセプター）を有する細胞を感染しかつ
レトロウイルスのベクターをこのような細胞に送り出す
ことができる組換えレトロウイルスが提供される。これ
らの態様において、組換えレトロウイルスは、組換えレ
トロウイルスのエンベロープ上に特定のリガンドを発現
することができる追加の遺伝的インサートを有する適当
なパッケージング細胞系の中に組み込まれた本発明の発
現構成体からなる。構成されたウイルスは選択した標的
細胞上のレセプターに結合するある数の表面リガンドを
表示し、これによりこのような細胞への進入を獲得し、
特定のレセプターを発現しない他の細胞を除外する。１
つの態様において、エリトロポイエチンは発現されたリ
ガンドであり、「ＥＰＯ」レセプターを発現する細胞、
例えば、赤血球前駆体細胞にベクター物質を送り出すこ
とができる。ある種の他の好ましい態様において、ＣＤ
４レセプターは組換えレトロウイルス粒子の表面上に発
現され、そしてＨＩＶｇｐ１２０タンパク質（換言する
と、ＨＩＶで感染された細胞）を表示するＴリンパ球ま
たは単球をターゲッティングする。そのように構成され
た組換えレトロウイルスは、高度に選択的な方法で、問
題の細胞に入ることができる。ｇｐ１２０タンパク質を
もたない細胞は感染されない。他の好ましい態様におい
て、組換えレトロウイルスはその表面上にｇｐ１２０を
表示し、そしてＣＤ４細胞をターゲッティングする。レ
トロウイルスの宿主細胞の範囲の特異性は一部分ｅｎｖ
遺伝子生産物により決定される。Ｃｏｆｆｉｎ、Ｊ．、
ＲＮＡ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ ２：２５−２
７、コールド・スプリング・ハーバー、１９８５には、
ネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）およびラウス肉腫ウイ
ルス（ＲＳＶ）からのタンパク質の細胞外成分が特定の
レセプターの結合に関係することが記載されている。エ
ンベロープタンパク質の細胞質ドメインは、他方におい
て、ヴィリオンの形成においてある役割を演ずると理解
される。したがって、細胞質領域と性質が同一タンパク
質分子の中に存在しない外因性結合領域とを有するｅｎ
ｖタンパク質からなるハイブリッドｅｎｖ生産物をつく
ることができる。この方法において、「注文通りの」標
的細胞に対する特異性をもつ組換えレトロウイルスがつ
くられる。実施例の中にこの方法が詳細に記載されてい
る。組換えレトロウイルスのための生産体の細胞とな
る、本発明の好ましいＣＤ４向性パッケージング細胞系
の構成が図７に概略的に描写されている。この細胞系
は、ｅｎｖをコードするベクターおよび問題のリガンド
（この場合においてｇｐ１２０またはＣＤ４）をｇａｇ
およびｐｏｌをエンコードできる細胞系の中にトランス
フェクションすることによって、調製することができ
る。ｅｎｖを含有するベクターはレトロウイルス以外の
ベクター、例えば、ｐＥＥ６（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ、英
国、商業的に入手可能である）であることができる（図
８および図９）。
ガンド（またはレセプター）を有する細胞を感染しかつ
レトロウイルスのベクターをこのような細胞に送り出す
ことができる組換えレトロウイルスが提供される。これ
らの態様において、組換えレトロウイルスは、組換えレ
トロウイルスのエンベロープ上に特定のリガンドを発現
することができる追加の遺伝的インサートを有する適当
なパッケージング細胞系の中に組み込まれた本発明の発
現構成体からなる。構成されたウイルスは選択した標的
細胞上のレセプターに結合するある数の表面リガンドを
表示し、これによりこのような細胞への進入を獲得し、
特定のレセプターを発現しない他の細胞を除外する。１
つの態様において、エリトロポイエチンは発現されたリ
ガンドであり、「ＥＰＯ」レセプターを発現する細胞、
例えば、赤血球前駆体細胞にベクター物質を送り出すこ
とができる。ある種の他の好ましい態様において、ＣＤ
４レセプターは組換えレトロウイルス粒子の表面上に発
現され、そしてＨＩＶｇｐ１２０タンパク質（換言する
と、ＨＩＶで感染された細胞）を表示するＴリンパ球ま
たは単球をターゲッティングする。そのように構成され
た組換えレトロウイルスは、高度に選択的な方法で、問
題の細胞に入ることができる。ｇｐ１２０タンパク質を
もたない細胞は感染されない。他の好ましい態様におい
て、組換えレトロウイルスはその表面上にｇｐ１２０を
表示し、そしてＣＤ４細胞をターゲッティングする。レ
トロウイルスの宿主細胞の範囲の特異性は一部分ｅｎｖ
遺伝子生産物により決定される。Ｃｏｆｆｉｎ、Ｊ．、
ＲＮＡ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ ２：２５−２
７、コールド・スプリング・ハーバー、１９８５には、
ネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）およびラウス肉腫ウイ
ルス（ＲＳＶ）からのタンパク質の細胞外成分が特定の
レセプターの結合に関係することが記載されている。エ
ンベロープタンパク質の細胞質ドメインは、他方におい
て、ヴィリオンの形成においてある役割を演ずると理解
される。したがって、細胞質領域と性質が同一タンパク
質分子の中に存在しない外因性結合領域とを有するｅｎ
ｖタンパク質からなるハイブリッドｅｎｖ生産物をつく
ることができる。この方法において、「注文通りの」標
的細胞に対する特異性をもつ組換えレトロウイルスがつ
くられる。実施例の中にこの方法が詳細に記載されてい
る。組換えレトロウイルスのための生産体の細胞とな
る、本発明の好ましいＣＤ４向性パッケージング細胞系
の構成が図７に概略的に描写されている。この細胞系
は、ｅｎｖをコードするベクターおよび問題のリガンド
（この場合においてｇｐ１２０またはＣＤ４）をｇａｇ
およびｐｏｌをエンコードできる細胞系の中にトランス
フェクションすることによって、調製することができ
る。ｅｎｖを含有するベクターはレトロウイルス以外の
ベクター、例えば、ｐＥＥ６（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ、英
国、商業的に入手可能である）であることができる（図
８および図９）。
【００４９】ここにおける教示に従い、組換えウイルス
を複製不能とさせるためにレトロウイルスの構造タンパ
ク質は別々に提供される。ｇａｇおよびｐｏｌのウイル
ス成分は第２ベクターの使用により提供され、この第２
ベクターはこのような成分を含有し、例えば、ムリガン
（Ｍｕｌｌｉｇａｎ）（ＭＩＴ）またはアーサー・バン
クス（Ａｒｔｈｕｒ Ｂａｎｋｓ）（コロンビア大学）
からのこれらの成分を含有する細胞系から得ることがで
きる。ＨＩＶゲノムのプラスミドを有する部分は、モン
タグニーア（Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒ）博士（Ｉｎｓｔｉ
ｔｕｔｅ Ｐａｓｔｅｒｕｒ、フランス国）から入手可
能であり、そしてプラスミドｐＨＸＢ２Ｂはガロ（Ｇａ
ｌｌｏ）から入手可能である。選択マーカーは２つのベ
クターのうちの１つ上に含めることができるか、あるい
は別のベクター上に準備し、そして共トランスフェクシ
ョンすることができる（図７および図１０）。本発明の
レトロウイルスのベクターはこのようなパッケージング
細胞系の中にトランスフェクションされ、これによりパ
ッケージングされる（図１３）。
を複製不能とさせるためにレトロウイルスの構造タンパ
ク質は別々に提供される。ｇａｇおよびｐｏｌのウイル
ス成分は第２ベクターの使用により提供され、この第２
ベクターはこのような成分を含有し、例えば、ムリガン
（Ｍｕｌｌｉｇａｎ）（ＭＩＴ）またはアーサー・バン
クス（Ａｒｔｈｕｒ Ｂａｎｋｓ）（コロンビア大学）
からのこれらの成分を含有する細胞系から得ることがで
きる。ＨＩＶゲノムのプラスミドを有する部分は、モン
タグニーア（Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒ）博士（Ｉｎｓｔｉ
ｔｕｔｅ Ｐａｓｔｅｒｕｒ、フランス国）から入手可
能であり、そしてプラスミドｐＨＸＢ２Ｂはガロ（Ｇａ
ｌｌｏ）から入手可能である。選択マーカーは２つのベ
クターのうちの１つ上に含めることができるか、あるい
は別のベクター上に準備し、そして共トランスフェクシ
ョンすることができる（図７および図１０）。本発明の
レトロウイルスのベクターはこのようなパッケージング
細胞系の中にトランスフェクションされ、これによりパ
ッケージングされる（図１３）。
【００５０】当業者は理解するように、このようなパッ
ケージング細胞系を構成するとき、適当な細胞をターゲ
ッティングするそれらの能力は、レセプターを発現する
細胞系の使用により、患者の外側で試験することができ
る。ｇｐ１２０の場合において、ＣＤ４＋細胞、例え
ば、ＣＥＭ、ＨｅＬａ ＣＤ４＋などを使用することが
できる（図１２）。ＣＤ４の場合において、ＨＩＶ感染
細胞またはＨｅＬａ ｇｐ１２０テスター細胞系（図１
２）を使用することができる。本発明の好ましいパッケ
ージング細胞系は実証されたよりすぐれたターゲッティ
ング性質を有する。
ケージング細胞系を構成するとき、適当な細胞をターゲ
ッティングするそれらの能力は、レセプターを発現する
細胞系の使用により、患者の外側で試験することができ
る。ｇｐ１２０の場合において、ＣＤ４＋細胞、例え
ば、ＣＥＭ、ＨｅＬａ ＣＤ４＋などを使用することが
できる（図１２）。ＣＤ４の場合において、ＨＩＶ感染
細胞またはＨｅＬａ ｇｐ１２０テスター細胞系（図１
２）を使用することができる。本発明の好ましいパッケ
ージング細胞系は実証されたよりすぐれたターゲッティ
ング性質を有する。
【００５１】他の面において、本発明は、本発明の発現
ベクターで形質転換され、その結果細胞のレトロウイル
スの感染に対する耐性が付与された細胞に関する。形質
導入された細胞は，幹細胞、白血球、赤血球前駆体など
を包含するある数の細胞の型の任意のものであることが
でき、そして１または２以上の本発明の発現構成体を含
み、前記発現構成体は前記細胞内のＲＮＡの転写を指令
し、前記ＲＮＡは少なくとも一部分、ポリヌクレオチド
配列を含有し、前記ポリヌクレオチド配列はゲノムＲＮ
ＡまたはゲノムＲＮＡのｍＲＮＡ転写体内の１または２
以上の領域に対して実質的に相補的または相同的であ
り、そして前記レトロウイルスの複製を実質的に阻害す
るために有効である。
ベクターで形質転換され、その結果細胞のレトロウイル
スの感染に対する耐性が付与された細胞に関する。形質
導入された細胞は，幹細胞、白血球、赤血球前駆体など
を包含するある数の細胞の型の任意のものであることが
でき、そして１または２以上の本発明の発現構成体を含
み、前記発現構成体は前記細胞内のＲＮＡの転写を指令
し、前記ＲＮＡは少なくとも一部分、ポリヌクレオチド
配列を含有し、前記ポリヌクレオチド配列はゲノムＲＮ
ＡまたはゲノムＲＮＡのｍＲＮＡ転写体内の１または２
以上の領域に対して実質的に相補的または相同的であ
り、そして前記レトロウイルスの複製を実質的に阻害す
るために有効である。
【００５２】本発明の他の面に従うと、本発明の発現構
成体からなるベクターをつくり、そしてこのようなベク
ターで細胞を感染することによって、外来核酸を細胞の
中に導入する方法が提供される。細胞は生きている生物
の一部分であることができる。
成体からなるベクターをつくり、そしてこのようなベク
ターで細胞を感染することによって、外来核酸を細胞の
中に導入する方法が提供される。細胞は生きている生物
の一部分であることができる。
【００５３】本発明は、また、そのように形質転換され
た前記細胞の子孫に関し、前記子孫は本発明の発現構成
体からの直系の配列を含有し、そしてまた前記レトロウ
イルスの複製の阻害に有効であり、その結果分子の免疫
性が細胞に付与されている。本発明の他の態様は、発現
構成体、レトロウイルスのベクターまたは組換えレトロ
ウイルスと、治療的投与ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖ
ｉｔｒｏのために適合性とすることができる貯蔵のため
の任意の媒質との組み合わせを含む治療用組成物を包含
する。
た前記細胞の子孫に関し、前記子孫は本発明の発現構成
体からの直系の配列を含有し、そしてまた前記レトロウ
イルスの複製の阻害に有効であり、その結果分子の免疫
性が細胞に付与されている。本発明の他の態様は、発現
構成体、レトロウイルスのベクターまたは組換えレトロ
ウイルスと、治療的投与ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖ
ｉｔｒｏのために適合性とすることができる貯蔵のため
の任意の媒質との組み合わせを含む治療用組成物を包含
する。
【００５４】本発明の治療用組成物は、凍結乾燥するこ
とができるか、あるいは溶液または懸濁液で提供するこ
とができ、そして凍結して、または室温において貯蔵す
ることができる。適当な懸濁媒質は、生理学的に適合性
の媒質、例えば、リン酸塩緩衝液、ダルベッコ変性イー
グル培地（ＤＭＥＭ）、ＭＥＭ、ギブコ培地、ピオゲン
不含蒸留水などを包含する。
とができるか、あるいは溶液または懸濁液で提供するこ
とができ、そして凍結して、または室温において貯蔵す
ることができる。適当な懸濁媒質は、生理学的に適合性
の媒質、例えば、リン酸塩緩衝液、ダルベッコ変性イー
グル培地（ＤＭＥＭ）、ＭＥＭ、ギブコ培地、ピオゲン
不含蒸留水などを包含する。
【００５５】本発明の調製物の投与のモードは、１また
は２以上の構成体を送り出すべき器官の中の部位および
／または細胞を決定することができる。本発明の組成物
は単独で投与することができるが、一般に、投与の意図
するルートおよび標準の製剤学的実施に関して選択され
た製剤学的担体または希釈剤と混合されるであろう。構
成体は任意の適当なモード、例えば、非経口的、皮下、
筋肉内、腹腔内、動脈などにより、カテーテルまたは他
の日常の投与ルートを使用して患者に直接投与すること
ができる。直接的投与の場合において、適当な細胞また
はターゲッティングしようとする他の終点を効率よくタ
ーゲッティングする発現構成体の能力に頼らなくてはな
らない。一般に、発現構成体は精製された形態で薬理学
的に適当な担体と一緒に利用されるであろう。典型的に
は、これらの担体は水性またはアルコール性／水性溶
液、乳濁液、または懸濁液、例えば、生理的食塩水およ
び緩衝化培地を包含する。非経口的賦形剤は、無菌の溶
液の形態で提供され、そして塩化ナトリウム溶液、リン
ゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリ
ウム溶液、および乳酸化リンゲルを包含し、そして他の
溶質、例えば、溶液を等張するために十分な塩類または
グルコースを包含する。必要に応じて複合体を懸濁して
保持するために適当な薬理学的に許容されるアジュバン
トは、増粘剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、
ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびアルギン酸塩か
ら選択することができる。静脈内の賦形剤は、流体およ
び栄養補充剤および電解質補充剤、例えば、リンゲルデ
キストロースに基づくものを包含する。防腐剤および他
の添加剤、例えば、抗微生物剤、酸化防止剤、キレート
剤および不活性ガスを存在させることもできる。
は２以上の構成体を送り出すべき器官の中の部位および
／または細胞を決定することができる。本発明の組成物
は単独で投与することができるが、一般に、投与の意図
するルートおよび標準の製剤学的実施に関して選択され
た製剤学的担体または希釈剤と混合されるであろう。構
成体は任意の適当なモード、例えば、非経口的、皮下、
筋肉内、腹腔内、動脈などにより、カテーテルまたは他
の日常の投与ルートを使用して患者に直接投与すること
ができる。直接的投与の場合において、適当な細胞また
はターゲッティングしようとする他の終点を効率よくタ
ーゲッティングする発現構成体の能力に頼らなくてはな
らない。一般に、発現構成体は精製された形態で薬理学
的に適当な担体と一緒に利用されるであろう。典型的に
は、これらの担体は水性またはアルコール性／水性溶
液、乳濁液、または懸濁液、例えば、生理的食塩水およ
び緩衝化培地を包含する。非経口的賦形剤は、無菌の溶
液の形態で提供され、そして塩化ナトリウム溶液、リン
ゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリ
ウム溶液、および乳酸化リンゲルを包含し、そして他の
溶質、例えば、溶液を等張するために十分な塩類または
グルコースを包含する。必要に応じて複合体を懸濁して
保持するために適当な薬理学的に許容されるアジュバン
トは、増粘剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、
ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびアルギン酸塩か
ら選択することができる。静脈内の賦形剤は、流体およ
び栄養補充剤および電解質補充剤、例えば、リンゲルデ
キストロースに基づくものを包含する。防腐剤および他
の添加剤、例えば、抗微生物剤、酸化防止剤、キレート
剤および不活性ガスを存在させることもできる。
【００５６】あるいは、治療用組成物は種々のルートで
細胞にｅｘ ｖｉｖｏ投与することができ、次いで形質
転換された細胞を移植または他の方法により患者の中に
移植される。遺伝的に処理した細胞を使用するある種の
移植技術は米国特許第４，９８０，２８６号（ここに引
用によって加える）の中に例示されている。詳しくは、
泳動技術により血液の処置は本発明の範囲内である。核
酸配列を細胞の中に導入する他の伝統的技術およびトラ
ンスフェクションのプロトコールは、発現構成体を問題
の標的に転移するために有用である。これらの技術はリ
ン酸カルシウム仲介技術、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介
トランスフェクション技術、リゾチーム融合または赤血
球融合、浸透圧ショック、こすり、または細胞によりそ
れらの環境からの吸収を包含する。これらの技術は細胞
を電流に暴露することによって増強することができる。
構成体は、また、いわゆる「遺伝子ガン」を使用して標
的区域の中に直接マイクロインジェクションすることが
できる。
細胞にｅｘ ｖｉｖｏ投与することができ、次いで形質
転換された細胞を移植または他の方法により患者の中に
移植される。遺伝的に処理した細胞を使用するある種の
移植技術は米国特許第４，９８０，２８６号（ここに引
用によって加える）の中に例示されている。詳しくは、
泳動技術により血液の処置は本発明の範囲内である。核
酸配列を細胞の中に導入する他の伝統的技術およびトラ
ンスフェクションのプロトコールは、発現構成体を問題
の標的に転移するために有用である。これらの技術はリ
ン酸カルシウム仲介技術、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介
トランスフェクション技術、リゾチーム融合または赤血
球融合、浸透圧ショック、こすり、または細胞によりそ
れらの環境からの吸収を包含する。これらの技術は細胞
を電流に暴露することによって増強することができる。
構成体は、また、いわゆる「遺伝子ガン」を使用して標
的区域の中に直接マイクロインジェクションすることが
できる。
【００５７】また、デリバリー系、例えば、リポソーム
は問題の標的への遺伝情報のデリバリーのために有用で
あるとして報告された（ＷＯ９１／０２８０５号）。一
般に、米国特許第４，８８０，６３５号（Ｊａｎｏｆｆ
ら）は、脱水したリポソームのための技術を記載してお
り、そして薬物のデリバリーのためのリポソーム調製物
を使用する一般分野における多数の技術を取り扱ってい
る。
は問題の標的への遺伝情報のデリバリーのために有用で
あるとして報告された（ＷＯ９１／０２８０５号）。一
般に、米国特許第４，８８０，６３５号（Ｊａｎｏｆｆ
ら）は、脱水したリポソームのための技術を記載してお
り、そして薬物のデリバリーのためのリポソーム調製物
を使用する一般分野における多数の技術を取り扱ってい
る。
【００５８】また、当業者は理解するように、これらの
最後に述べた技術のあるものは構成体のｉｎ ｖｉｖｏ
投与のために実際に有用であることがある。例えば、マ
イクロインジェクションは本発明の操作した物質を患者
の血流、または体の他のいっそう容易にアクセス可能な
部分に送り出すために非常に満足すべき技術であろう。
最後に述べた技術のあるものは構成体のｉｎ ｖｉｖｏ
投与のために実際に有用であることがある。例えば、マ
イクロインジェクションは本発明の操作した物質を患者
の血流、または体の他のいっそう容易にアクセス可能な
部分に送り出すために非常に満足すべき技術であろう。
【００５９】ある種の臨床的態様において、患者に本発
明のベクターを直接接種し、そしてＨＩＶウイルスまだ
収容していない患者のＴ細胞を発現構成体で感染させ、
アンチセンスのポリヌクレオチドまたは問題の他のヌク
レオチドを発現する安定に形質転換された細胞を生産す
る。次いで、これらの治療的に形質転換された細胞は病
原性レトロウイルスによる感染に対して耐性であろう。
この方法は疾患の進行を停止または遅延し、そして耐性
Ｔ細胞または他の幹細胞は患者の免疫系を再構成する働
きをするであろう。あるいは、Ｔ細胞に対する前駆体、
例えば、骨髄幹細胞、胎児胸腺などを患者またはドナー
から体外移植し、本発明のレトロウイルスのベクターの
ウイルスのストックにより高い多重度で感染させ、そし
て利用可能な移植技術を使用して患者に移植することが
できる。ベクターで有効に感染した細胞は、残留する病
原性ウイルスによる感染に対して耐性であるＴ細胞で患
者の免疫系を再構成するであろう。
明のベクターを直接接種し、そしてＨＩＶウイルスまだ
収容していない患者のＴ細胞を発現構成体で感染させ、
アンチセンスのポリヌクレオチドまたは問題の他のヌク
レオチドを発現する安定に形質転換された細胞を生産す
る。次いで、これらの治療的に形質転換された細胞は病
原性レトロウイルスによる感染に対して耐性であろう。
この方法は疾患の進行を停止または遅延し、そして耐性
Ｔ細胞または他の幹細胞は患者の免疫系を再構成する働
きをするであろう。あるいは、Ｔ細胞に対する前駆体、
例えば、骨髄幹細胞、胎児胸腺などを患者またはドナー
から体外移植し、本発明のレトロウイルスのベクターの
ウイルスのストックにより高い多重度で感染させ、そし
て利用可能な移植技術を使用して患者に移植することが
できる。ベクターで有効に感染した細胞は、残留する病
原性ウイルスによる感染に対して耐性であるＴ細胞で患
者の免疫系を再構成するであろう。
【００６０】このような治療に応答する疾患の状態の処
置においてヒトに投与するために、処方の医師は所定の
被検体のために適当な投与量を究極的に決定し、そして
この投与量は個体の体重、年令および応答ならびに患者
の疾患の性質および程度に従い変化することが期待され
る。
置においてヒトに投与するために、処方の医師は所定の
被検体のために適当な投与量を究極的に決定し、そして
この投与量は個体の体重、年令および応答ならびに患者
の疾患の性質および程度に従い変化することが期待され
る。
【００６１】材料および方法 アンチセンスＨＩＶ含有レトロウイルスの構成体の構成
体 ｐＲＡＳＨ−１、ｐＲＡＳＨ−２、ｐＲＡＳＨ−３、ｐ
ＲＡＳＨ−４ アンチセンスＨＩＶ配列源はＳＰ４６の中に含有されて
いるクローニングされたＨＩＶプロウイルスＤＮＡであ
り、そして構成体はｐＨＸＢ２Ｄと表示されそしてＮＩ
Ｈのロバート・ガロ（Ｒｏｂｅｒｔ Ｇａｌｌｏ）博士
から入手した。ｐＨＸＢ２ＤをＥｃｏＲＩ＋ＥｃｏＲＶ
で切断して、４つの大きいＨＩＶゲノム断片を得た： １．ＨＸＢ１、ｎｔ５３２２−８６９４からスパニング
しそしてｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、Ｕ３およびＲを含有
する３．４ｋｂの断片。
体 ｐＲＡＳＨ−１、ｐＲＡＳＨ−２、ｐＲＡＳＨ−３、ｐ
ＲＡＳＨ−４ アンチセンスＨＩＶ配列源はＳＰ４６の中に含有されて
いるクローニングされたＨＩＶプロウイルスＤＮＡであ
り、そして構成体はｐＨＸＢ２Ｄと表示されそしてＮＩ
Ｈのロバート・ガロ（Ｒｏｂｅｒｔ Ｇａｌｌｏ）博士
から入手した。ｐＨＸＢ２ＤをＥｃｏＲＩ＋ＥｃｏＲＶ
で切断して、４つの大きいＨＩＶゲノム断片を得た： １．ＨＸＢ１、ｎｔ５３２２−８６９４からスパニング
しそしてｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、Ｕ３およびＲを含有
する３．４ｋｂの断片。
【００６２】２．ＨＸＢ２、ｎｔ−３４２−２５５６を
カバーしそしてＲ、Ｕ５、ｇａｇおよびｐｏｌの５’部
分を含有する２．８ｋｂの断片。
カバーしそしてＲ、Ｕ５、ｇａｇおよびｐｏｌの５’部
分を含有する２．８ｋｂの断片。
【００６３】３．ＨＸＢ３、ｐｏｌの中央部分を含有す
る（ｎｔ２５５６−４２２７）を含有する１．７ｋｂの
断片。
る（ｎｔ２５５６−４２２７）を含有する１．７ｋｂの
断片。
【００６４】４．ＨＸＢ４、ｐｏｌ＋ｎｅｆの３’部分
を含有する１．１ｋｂ（ｎｔ４２２７−５３２２）断
片。
を含有する１．１ｋｂ（ｎｔ４２２７−５３２２）断
片。
【００６５】これらの断片の末端をＢａｍＨＩ末端に変
化させ、そしてレトロウイルスのベクターｐＬＮＨＬの
ＢａｍＨＩ部位の中にクローニングした。ＢａｍＨＩ部
位への変換の間に、ＨＸＢ１は内部のＢａｍＨＩ部位
（ｎｔ８０５１）のために、２．８ｋｂに減少したこと
を述べるべきである。生ずるレトロウイルスの構成体
を、それぞれ、ｐＲＡＳＨ−１、ｐＲＡＳＨ−２、ｐＲ
ＡＳＨ−３およびｐＲＡＳＨ−４と呼ぶ。（Ｒ＝レトロ
ウイルス、ＡＳ＝アンチセンス、Ｈ＝ＨＩＶ）。断片の
アンチセンスの向きはＳｃａＩ（ｐＲＡＳＨ−１）、Ｓ
ｐｈＩ（ｐＲＡＳＨ−２）、Ｘｍｎ１（ｐＲＡＳＨ−
３）およびＢｓｔＥＩＩ＋ＤｒａＩ（ｐＲＡＳＨ−
４）。
化させ、そしてレトロウイルスのベクターｐＬＮＨＬの
ＢａｍＨＩ部位の中にクローニングした。ＢａｍＨＩ部
位への変換の間に、ＨＸＢ１は内部のＢａｍＨＩ部位
（ｎｔ８０５１）のために、２．８ｋｂに減少したこと
を述べるべきである。生ずるレトロウイルスの構成体
を、それぞれ、ｐＲＡＳＨ−１、ｐＲＡＳＨ−２、ｐＲ
ＡＳＨ−３およびｐＲＡＳＨ−４と呼ぶ。（Ｒ＝レトロ
ウイルス、ＡＳ＝アンチセンス、Ｈ＝ＨＩＶ）。断片の
アンチセンスの向きはＳｃａＩ（ｐＲＡＳＨ−１）、Ｓ
ｐｈＩ（ｐＲＡＳＨ−２）、Ｘｍｎ１（ｐＲＡＳＨ−
３）およびＢｓｔＥＩＩ＋ＤｒａＩ（ｐＲＡＳＨ−
４）。
【００６６】ｐＲＡＳＨ−５ ｐＲＡＳＨ−２をＨｉｎｄＩＩＩ＋ＰｓｔＩで切断し
て、Ｒ、Ｕ５、ＰＤＳ、ＳＤ、Ψおよび５’ｇａｇ部分
をカバーする、ＨＩＶの５５０ｂｐの断片（ｎｔ７７−
６２８）を解放する。これはＨＩＶの生活環において重
要な領域である。この断片のＨｉｎｄＩＩＩ末端をＢａ
ｍＨＩ末端に変換し、そしてｐＬＮＨＬの中にクローニ
ングした。生ずる構成体をｐＲＡＳＨ−５と表示する。
アンチセンスの向きはＳｓｔＩで確証された。ＰｓｔＩ
をＨｉｎｄＩＩＩに加えて使用して、内部のＰｓｔＩ部
位（ｎｔ９５８）を有する同一サイズの隣接する断片
（ｎｔ６２８−１２５５）からこの断片を分離する。
て、Ｒ、Ｕ５、ＰＤＳ、ＳＤ、Ψおよび５’ｇａｇ部分
をカバーする、ＨＩＶの５５０ｂｐの断片（ｎｔ７７−
６２８）を解放する。これはＨＩＶの生活環において重
要な領域である。この断片のＨｉｎｄＩＩＩ末端をＢａ
ｍＨＩ末端に変換し、そしてｐＬＮＨＬの中にクローニ
ングした。生ずる構成体をｐＲＡＳＨ−５と表示する。
アンチセンスの向きはＳｓｔＩで確証された。ＰｓｔＩ
をＨｉｎｄＩＩＩに加えて使用して、内部のＰｓｔＩ部
位（ｎｔ９５８）を有する同一サイズの隣接する断片
（ｎｔ６２８−１２５５）からこの断片を分離する。
【００６７】ｐＲＡＳＨ７レトロウイルス構成体 ｐＲＡＳＨ７ ： ｐＲＡＳＨ１をＢａｍＨＩ＋ＢｇｌＩ
Ｉで切断し、そしてｔａｔ、ｒｅｃおよびｅｎｖの５’
部分およびそれらのスプライスシグナルを含有する１．
３ｋｂの断片（ｎｔ５３２２−６６１７）を単離した。
次いで、これをＢａｍＨＩ切断し、ホスファターゼ処理
し、そして精製したｐＬＮＨＬに結合した。このインサ
ートのアンチセンスの向きはＳｓｔＩで確証された。
Ｉで切断し、そしてｔａｔ、ｒｅｃおよびｅｎｖの５’
部分およびそれらのスプライスシグナルを含有する１．
３ｋｂの断片（ｎｔ５３２２−６６１７）を単離した。
次いで、これをＢａｍＨＩ切断し、ホスファターゼ処理
し、そして精製したｐＬＮＨＬに結合した。このインサ
ートのアンチセンスの向きはＳｓｔＩで確証された。
【００６８】ｐＲＡＳＨ８レトロウイルス構成体 ｐＲＡＳＨ８ ： ｐＲＡＳＨ２をＢｇｌＩＩで切断し、
そしてＲ、Ｕ５およびｇａｇを含有する１．６ｋｂの断
片（ｎｔ１９−１６３９）を単離した。これをＢａｍＨ
Ｉ切断し、ホスファターゼ処理し、そして精製したｐＲ
ＡＳＨ７に結合した。このインサートのアンチセンスの
向きはＳｓｔＩで確証された。それゆえ、この構成体は
アンチセンスの向きで２．９ｋｂのＨＩＶ配列を含有す
る。
そしてＲ、Ｕ５およびｇａｇを含有する１．６ｋｂの断
片（ｎｔ１９−１６３９）を単離した。これをＢａｍＨ
Ｉ切断し、ホスファターゼ処理し、そして精製したｐＲ
ＡＳＨ７に結合した。このインサートのアンチセンスの
向きはＳｓｔＩで確証された。それゆえ、この構成体は
アンチセンスの向きで２．９ｋｂのＨＩＶ配列を含有す
る。
【００６９】ｐＲＲＺｅｎｖ（この構成体はリボザイム
クローニングした中央のエンベロープ配列を含有する） ｐＲＡＳＨをＢａｍＨＩで切断して、２．８ｋｂのＨＩ
Ｖｅｎｖ配列を解放した。それをｐＢＲ３２２の中にサ
ブクローニングしてｐＢＲＨＸＢ１を得た。この構成体
をＢ５ｕ３６Ｉ（ＭｓｔＩＩ）で処置して、エンベロー
プ配列から１．３ｋｂの断片を切断した。リボザイムを
センスの向きで方向的にベクターｐＢＲＨＸＢ１△のＢ
ｓｕ３６Ｉ部位の中にクローニングして、ｐＢＲＨＸＢ
１△ＲＺを得た。これはＢａｍＨＩ＋ＢｇｌＩＩで切断
して、リボザイムを含有する５５０ｂｐのＢａｍＨＩ＋
ＢｇｌＩＩ末端の断片を解放した。この断片をｐＬＮＨ
ＬのＢａｍＨＩ部位の中にクローニングし戻してｐＲＲ
Ｚｅｎｖ１を生じた。エンベロープ配列のアンチセンス
の向きはＳｓｔＩで確証された。
クローニングした中央のエンベロープ配列を含有する） ｐＲＡＳＨをＢａｍＨＩで切断して、２．８ｋｂのＨＩ
Ｖｅｎｖ配列を解放した。それをｐＢＲ３２２の中にサ
ブクローニングしてｐＢＲＨＸＢ１を得た。この構成体
をＢ５ｕ３６Ｉ（ＭｓｔＩＩ）で処置して、エンベロー
プ配列から１．３ｋｂの断片を切断した。リボザイムを
センスの向きで方向的にベクターｐＢＲＨＸＢ１△のＢ
ｓｕ３６Ｉ部位の中にクローニングして、ｐＢＲＨＸＢ
１△ＲＺを得た。これはＢａｍＨＩ＋ＢｇｌＩＩで切断
して、リボザイムを含有する５５０ｂｐのＢａｍＨＩ＋
ＢｇｌＩＩ末端の断片を解放した。この断片をｐＬＮＨ
ＬのＢａｍＨＩ部位の中にクローニングし戻してｐＲＲ
Ｚｅｎｖ１を生じた。エンベロープ配列のアンチセンス
の向きはＳｓｔＩで確証された。
【００７０】ｐＲＲＺｅｎｖ１Ｒ リボザイムが逆（ア
ンチセンス）向きである以外、ｐＲＲＺｅｎｖと同一で
ある。
ンチセンス）向きである以外、ｐＲＲＺｅｎｖと同一で
ある。
【００７１】ｐＲＲＺｅｎｖ１−ＡＳＨ５： ｐＲＡＳ
Ｈ５をＢａｍＨＩで切断して、ＢａｍＨＩ末端の５５０
ｂｐのＨＩＶ断片を得た。これをｐＲＲＺｅｎｖ１のＢ
ａｍＨＩ部位の中にクローニングした。５５０ｂｐの断
片のアンチセンスの向きはＳｓｔＩで確証された。この
断片はこの構成体においてアンチセンスＲＺｅｎｖイン
サートの下流（３’）に存在する。
Ｈ５をＢａｍＨＩで切断して、ＢａｍＨＩ末端の５５０
ｂｐのＨＩＶ断片を得た。これをｐＲＲＺｅｎｖ１のＢ
ａｍＨＩ部位の中にクローニングした。５５０ｂｐの断
片のアンチセンスの向きはＳｓｔＩで確証された。この
断片はこの構成体においてアンチセンスＲＺｅｎｖイン
サートの下流（３’）に存在する。
【００７２】ｐＲＲＺｅｎｖ１Ｒ−Ａ５Ｈ５：前述の５
５０ｂｐの断片を同様にｐＲＲＺｅｎｖ１Ｒの中にクロ
ーニングした。
５０ｂｐの断片を同様にｐＲＲＺｅｎｖ１Ｒの中にクロ
ーニングした。
【００７３】前述のＲＡＳＨおよびＲＲＺｅｎｖ構成体
を、対照を含めて、エコトロピックパッケージング細胞
系の中に別々に一時的にトランスフェクションした。こ
れらから培地を収獲し、そして両種性細胞系の感染に使
用した。感染した細胞系の一部分を凍結させ、そしてそ
れらの一部分をＧ４１８の選択の中に入れた。これらの
細胞からの培地は、それぞれのウイルスを含有し、ＨＩ
Ｖ標的細胞、例えば、ＣＥＭ−Ｔ４細胞（高いレベルの
ＣＤ４を発現する）を感染させるために使用した。
を、対照を含めて、エコトロピックパッケージング細胞
系の中に別々に一時的にトランスフェクションした。こ
れらから培地を収獲し、そして両種性細胞系の感染に使
用した。感染した細胞系の一部分を凍結させ、そしてそ
れらの一部分をＧ４１８の選択の中に入れた。これらの
細胞からの培地は、それぞれのウイルスを含有し、ＨＩ
Ｖ標的細胞、例えば、ＣＥＭ−Ｔ４細胞（高いレベルの
ＣＤ４を発現する）を感染させるために使用した。
【００７４】ｐＲＳＣＤ４： １．２ｋｂのＳＣＤ４を
ｐＥＥ６−ＳＣＤ４構成体からＥｃｏＲＩで切り出し
た。末端をＢａｍＨＩに変化させ、そしてｐＬＮＨＬの
ＢａｍＨＩ部位の中にクローニングした。
ｐＥＥ６−ＳＣＤ４構成体からＥｃｏＲＩで切り出し
た。末端をＢａｍＨＩに変化させ、そしてｐＬＮＨＬの
ＢａｍＨＩ部位の中にクローニングした。
【００７５】ｐ３’ＬＴＲ／ＮｈｅＩ−ＳＣＤ４： 構
成体ｐＲＳＣＤ４をＸｂａＩ＋ＮｈｅＩで切断して、機
能的ＳＣＤ４をコードするために十分な６００ｂｐのＳ
ＣＤ４配列を単離した。これをｐ３’ＬＴＲの中に含有
されるＭＬＶ３’ＬＴＲの中のＮｈｅＩ部位の中にクロ
ーニングした。センスの向きはＢａｍＨＩ＋ＥｃｏＲＩ
で確証された。ＳＣＤ４配列とインフレームでＮｈｅＩ
部位の直後に停止コドンが存在し、ＳＣＤ４断片の３’
末端に停止コドンを付加することは不必要であることに
注意すべきである。
成体ｐＲＳＣＤ４をＸｂａＩ＋ＮｈｅＩで切断して、機
能的ＳＣＤ４をコードするために十分な６００ｂｐのＳ
ＣＤ４配列を単離した。これをｐ３’ＬＴＲの中に含有
されるＭＬＶ３’ＬＴＲの中のＮｈｅＩ部位の中にクロ
ーニングした。センスの向きはＢａｍＨＩ＋ＥｃｏＲＩ
で確証された。ＳＣＤ４配列とインフレームでＮｈｅＩ
部位の直後に停止コドンが存在し、ＳＣＤ４断片の３’
末端に停止コドンを付加することは不必要であることに
注意すべきである。
【００７６】３’ＬＴＲ／ＸｂａＩ−ＳＣＤ４： ｐＲ
ＳＣＤ４からのＸｂａＩ＋ＮｈｅＩ末端の６００ｂｐの
ＳＣＤ４断片を、ｐ３’ＬＴＲにおいてＭＬＶ３’ＬＴ
Ｒの中のＸｂａＩ部位の中にクローニングした。再び、
センスの向きＢａｍＨＩ＋ＥｃｏＲＩで確証された。こ
の構成体において、ＳＣＤ４コーディング配列を終結前
にＬＴＲの中の配列によりコードされる１４アミノ酸で
伸長されている。
ＳＣＤ４からのＸｂａＩ＋ＮｈｅＩ末端の６００ｂｐの
ＳＣＤ４断片を、ｐ３’ＬＴＲにおいてＭＬＶ３’ＬＴ
Ｒの中のＸｂａＩ部位の中にクローニングした。再び、
センスの向きＢａｍＨＩ＋ＥｃｏＲＩで確証された。こ
の構成体において、ＳＣＤ４コーディング配列を終結前
にＬＴＲの中の配列によりコードされる１４アミノ酸で
伸長されている。
【００７７】ｐＲＡＳＨ５−ＳＣＤ４： レトロウイル
スの構成体ｐＲＡＳＨ５をＣｌａＩで切断し、そしてＭ
ＬＶ５’ＬＴＲ、Ｎｅｏ、ＨＣＭＶプロモーターおよび
ＡＳＨＩＶ５を含有する大きい断片を単離した。次い
で、これをＣｌａＩｃｕｔ３’ＬＴＲ／ＮｈｅＩ−ＳＣ
Ｄ４に結合した。
スの構成体ｐＲＡＳＨ５をＣｌａＩで切断し、そしてＭ
ＬＶ５’ＬＴＲ、Ｎｅｏ、ＨＣＭＶプロモーターおよび
ＡＳＨＩＶ５を含有する大きい断片を単離した。次い
で、これをＣｌａＩｃｕｔ３’ＬＴＲ／ＮｈｅＩ−ＳＣ
Ｄ４に結合した。
【００７８】ｐＲＲＺｅｎｖ１−ＳＣＤ４： レトロウ
イルスの構成体ｐＲＲＺｅｎｖ１をＣｌａＩで切断し、
そしてＭＬＶ５’ＬＴＲ、Ｎｅｏ、ＨＣＭＶプロモータ
ーおよびＲＺｅｎｖ１（配列番号：５）を含有する大き
い断片を単離した。これをＣｌａＩｃｕｔ３’ＬＴＲ／
ＮｈｅＩ−ＳＣＤ４に結合した。
イルスの構成体ｐＲＲＺｅｎｖ１をＣｌａＩで切断し、
そしてＭＬＶ５’ＬＴＲ、Ｎｅｏ、ＨＣＭＶプロモータ
ーおよびＲＺｅｎｖ１（配列番号：５）を含有する大き
い断片を単離した。これをＣｌａＩｃｕｔ３’ＬＴＲ／
ＮｈｅＩ−ＳＣＤ４に結合した。
【００７９】ｐＲＲＺｅｎｖ１Ｒ−ＳＣＤ４： ＭＬＶ
５’ＬＴＲ、Ｎｅｏ、ＨＣＭＶプロモーターおよびＲＺ
ｅｎｖ１Ｒを含有するＣｌａＩ末端の断片を、ＣｌａＩ
切断３’ＬＴＲ／ＮｈｅＩ−ＳＣＤ４に結合した。
５’ＬＴＲ、Ｎｅｏ、ＨＣＭＶプロモーターおよびＲＺ
ｅｎｖ１Ｒを含有するＣｌａＩ末端の断片を、ＣｌａＩ
切断３’ＬＴＲ／ＮｈｅＩ−ＳＣＤ４に結合した。
【００８０】ｐＲＲＺｅｎｖ１ＡＳＨ５−ＳＣＤ４：レ
トロウイルスの構成体ｐＲＲＺｅｎｖ１ＡＳＨ５をＣｌ
ａＩで切断した。ＭＬＶ５’ＬＴＲ、Ｎｅｏ、ＨＣＭＶ
プロモーターおよびＲＺｅｎｖ１（配列番号：２）ＡＳ
Ｈ５を含有する大きい断片を、ＣｌａＩ切断３’ＬＴＲ
／ＮｈｅＩ−ＳＣＤ４に結合した。
トロウイルスの構成体ｐＲＲＺｅｎｖ１ＡＳＨ５をＣｌ
ａＩで切断した。ＭＬＶ５’ＬＴＲ、Ｎｅｏ、ＨＣＭＶ
プロモーターおよびＲＺｅｎｖ１（配列番号：２）ＡＳ
Ｈ５を含有する大きい断片を、ＣｌａＩ切断３’ＬＴＲ
／ＮｈｅＩ−ＳＣＤ４に結合した。
【００８１】ｐＲＲＺｅｎｖ１ＲＡＳＨ５−ＳＣＤ４：
ＭＬＶ５’ＬＴＲ、Ｎｅｏ、ＨＣＭＶプロモーターおよ
びＲＺｅｎｖ１ＲＡＳＨ５を含有する大きい断片を、Ｃ
ｌａＩ切断３’ＬＴＲ／ＮｈｅＩ−ＳＣＤ４に結合し
た。
ＭＬＶ５’ＬＴＲ、Ｎｅｏ、ＨＣＭＶプロモーターおよ
びＲＺｅｎｖ１ＲＡＳＨ５を含有する大きい断片を、Ｃ
ｌａＩ切断３’ＬＴＲ／ＮｈｅＩ−ＳＣＤ４に結合し
た。
【００８２】非レトロウイルスの構成体の構成：ｐｅｎ
ｖ 120をＥｃｏＲＩ＋ＥｃｏＲＶで切断し、そしてＨＩ
Ｖエンベロープ遺伝子（ｇｐ１２０）、ｔａｔおよびｒ
ｅｖおよびスプライスシグナルを含む３．４ｋｂの断片
を単離した。末端をＥｃｏＲＩ末端に変換し、そして真
核生物の発現ベクターｐＥＥ６のＥｃｏＲＩ部位の中
に、ＨＣＭＶプロモーターの下流においてクローニング
した。
ｖ 120をＥｃｏＲＩ＋ＥｃｏＲＶで切断し、そしてＨＩ
Ｖエンベロープ遺伝子（ｇｐ１２０）、ｔａｔおよびｒ
ｅｖおよびスプライスシグナルを含む３．４ｋｂの断片
を単離した。末端をＥｃｏＲＩ末端に変換し、そして真
核生物の発現ベクターｐＥＥ６のＥｃｏＲＩ部位の中
に、ＨＣＭＶプロモーターの下流においてクローニング
した。
【００８３】ｐｅｎｖＨＩＶ： 前述のＥｃｏＲＩ末端
のエンベロープ断片を、ＥｃｏＲＩ切断ＭＬＶベクター
の中に５’ＬＴＲの下流においてクローニングした。こ
の構成体は３’ＬＴＲおよびパッケージングシグナルを
欠如したが、スプライスドナー部位を有する。
のエンベロープ断片を、ＥｃｏＲＩ切断ＭＬＶベクター
の中に５’ＬＴＲの下流においてクローニングした。こ
の構成体は３’ＬＴＲおよびパッケージングシグナルを
欠如したが、スプライスドナー部位を有する。
【００８４】ｐｅｎｖ CD4： レトロウイルスのベクタ
ーｐＬＮＨＬをＮｓｉＩ＋ＸｂａＩで切断し、そしてｇ
ｐ７０の３’部分およびトランスメンブレンおよび細胞
質テイルを含有する１．１ｋｂのＭＬＶエンベロープ領
域を単離した。末端をＢｓｕ３６Ｉ（ＭｓｔＩＩ）に変
換した。これをｐＥＥ６−ＳＣＤ４の中に含有されるＳ
ＣＤ４遺伝子の３’部分の中のＢｓｕ３６Ｉ部位の中に
インフレームで挿入した。ＨＩＶｅｎｖのＭＬＶトラン
スメンブレン細胞質配列は、ＳＣＤ４を組換えレトロウ
イルスの膜に定着させるであろう。図１４はこれを概略
的に証明する。ｐｅｎｖ EPO ： ｐｅｎｖCD4について前述した１．１ｋ
ｂのＭＬＶ断片のＮｓｉＩ＋ＸｂａＩ末端をＳｐｈＩ末
端に変換した。次いで、これをｐＥＰＯの中に含有され
るヒトＥＰＯ遺伝子配列の末端における独特ＳｐｈＩ部
位の中にインフレームで挿入して、ｐＥＰＯ−１５Ｅを
生成した。ＥＰＯ−１５Ｅ遺伝子をｐＥ生成した。ＥＰ
Ｏ−１５Ｅ遺伝子をＡｐａＩ＋ＢａｍＨＩでｐＥＰＯ−
１５Ｅから切り出した。ＥＰＯ−１５Ｅの末端をＥｃｏ
ＲＩ末端に変換し、そしてこの断片をｐＥＥ６のＥｃｏ
ＲＩのＨＣＭＶプロモーターの下流においてクローニン
グした。
ーｐＬＮＨＬをＮｓｉＩ＋ＸｂａＩで切断し、そしてｇ
ｐ７０の３’部分およびトランスメンブレンおよび細胞
質テイルを含有する１．１ｋｂのＭＬＶエンベロープ領
域を単離した。末端をＢｓｕ３６Ｉ（ＭｓｔＩＩ）に変
換した。これをｐＥＥ６−ＳＣＤ４の中に含有されるＳ
ＣＤ４遺伝子の３’部分の中のＢｓｕ３６Ｉ部位の中に
インフレームで挿入した。ＨＩＶｅｎｖのＭＬＶトラン
スメンブレン細胞質配列は、ＳＣＤ４を組換えレトロウ
イルスの膜に定着させるであろう。図１４はこれを概略
的に証明する。ｐｅｎｖ EPO ： ｐｅｎｖCD4について前述した１．１ｋ
ｂのＭＬＶ断片のＮｓｉＩ＋ＸｂａＩ末端をＳｐｈＩ末
端に変換した。次いで、これをｐＥＰＯの中に含有され
るヒトＥＰＯ遺伝子配列の末端における独特ＳｐｈＩ部
位の中にインフレームで挿入して、ｐＥＰＯ−１５Ｅを
生成した。ＥＰＯ−１５Ｅ遺伝子をｐＥ生成した。ＥＰ
Ｏ−１５Ｅ遺伝子をＡｐａＩ＋ＢａｍＨＩでｐＥＰＯ−
１５Ｅから切り出した。ＥＰＯ−１５Ｅの末端をＥｃｏ
ＲＩ末端に変換し、そしてこの断片をｐＥＥ６のＥｃｏ
ＲＩのＨＣＭＶプロモーターの下流においてクローニン
グした。
【００８５】追加のレトロウイルスの構成体：ｐ３’ＬＴＲ ＳＶ ＳＣＤ４ ： 構成体ｐＳＶｇｐｔ
をＰｖｕＩＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩで切断して、３２３ｂｐ
のＳＶ４０複製起点（ｏｒｉ）を単離した。末端をＢａ
ｍＨＩ末端に変換し、そしてｐ３’ＬＴＲ／ＮｈｅＩ−
ＳＣＤ４のＢａｍＨＩ部位の中にＳＣＤ４配列の下流に
おいてクローニングした。ｏｒｉの正しい向きはＡｖｒ
ＩＩ＋ＮｈｅＩで確証される。
をＰｖｕＩＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩで切断して、３２３ｂｐ
のＳＶ４０複製起点（ｏｒｉ）を単離した。末端をＢａ
ｍＨＩ末端に変換し、そしてｐ３’ＬＴＲ／ＮｈｅＩ−
ＳＣＤ４のＢａｍＨＩ部位の中にＳＣＤ４配列の下流に
おいてクローニングした。ｏｒｉの正しい向きはＡｖｒ
ＩＩ＋ＮｈｅＩで確証される。
【００８６】ｐＲＡＳＨ５−ＳＶ−ＳＣＤ４： レトロ
ウイルスの構成体ｐＲＡＳＨ５をＣｌａＩで切断し、そ
してＭＬＶ５’ＬＴＲ、Ｎｅｏ、ＨＣＭＶプロモーター
およびＡＳＨ５を含有する大きい断片を単離する。これ
をＣｌａＩ切断ｐ３’ＬＴＲＳＶ ＳＣＤ４に結合す
る。
ウイルスの構成体ｐＲＡＳＨ５をＣｌａＩで切断し、そ
してＭＬＶ５’ＬＴＲ、Ｎｅｏ、ＨＣＭＶプロモーター
およびＡＳＨ５を含有する大きい断片を単離する。これ
をＣｌａＩ切断ｐ３’ＬＴＲＳＶ ＳＣＤ４に結合す
る。
【００８７】ｐＲＲＺＥＮＶ１−ＳＶ−ＳＣＤＲ： ｐ
３’ＬＴＲ ＳＶ ＳＣＤＲをＣｌａＩで切断し、そし
てｐＲＲＺＥＮＶ１から誘導化されそしてＭＬＶ５’Ｌ
ＴＲ、Ｎｅｏ、ＨＣＭＶプロモーターおよびＲＲＺｅｎ
ｖ１を含有するＣｌａＩ末端の大きい断片に結合する。
３’ＬＴＲ ＳＶ ＳＣＤＲをＣｌａＩで切断し、そし
てｐＲＲＺＥＮＶ１から誘導化されそしてＭＬＶ５’Ｌ
ＴＲ、Ｎｅｏ、ＨＣＭＶプロモーターおよびＲＲＺｅｎ
ｖ１を含有するＣｌａＩ末端の大きい断片に結合する。
【００８８】ｐＲＲＺＥＮＶ１ ＡＳＨ−ＳＶ−ＳＣＤ
４： ＣｌａＩ切断したｐＲＲＺＥＮＶ１ ＳＶ ＳＣ
ＤＲをｐＲＲＺＥＮＶ１ ＡＳＨ５から誘導化されそし
てＭＬＶ５’ＬＴＲ、Ｎｅｏ、ＨＣＭＶプロモーター、
ＲＲＺｅｎｖ１およびＡＳＨ５を含有するＣｌａＩ末端
の大きい断片に結合する。
４： ＣｌａＩ切断したｐＲＲＺＥＮＶ１ ＳＶ ＳＣ
ＤＲをｐＲＲＺＥＮＶ１ ＡＳＨ５から誘導化されそし
てＭＬＶ５’ＬＴＲ、Ｎｅｏ、ＨＣＭＶプロモーター、
ＲＲＺｅｎｖ１およびＡＳＨ５を含有するＣｌａＩ末端
の大きい断片に結合する。
【００８９】ｐＲＲＺＥＮＶ１ＲＡＳＨ５−ＳＶ−ＳＣ
Ｄ４： ＣｌａＩ切断したｐＲＲＺＥＮＶ１ ＡＳＨ−
ＳＶ−ＳＣＤ４を、ＭＬＶ５’ＬＴＲ、Ｎｅｏ、ＨＣＭ
Ｖプロモーター、ＲＲＺｅｎｖ１ＲおよびＡＳＨ５を含
有するＣｌａＩ末端の大きい断片に結合する。
Ｄ４： ＣｌａＩ切断したｐＲＲＺＥＮＶ１ ＡＳＨ−
ＳＶ−ＳＣＤ４を、ＭＬＶ５’ＬＴＲ、Ｎｅｏ、ＨＣＭ
Ｖプロモーター、ＲＲＺｅｎｖ１ＲおよびＡＳＨ５を含
有するＣｌａＩ末端の大きい断片に結合する。
【００９０】レトロウイルスの構成体の試験（原理の証
拠） この技術の効能を証明する目的で、ＰＬＮＨＬ、ｐＲＡ
ＳＨ−３およびｐＲＡＳＨ−４を選択した。それらを両
種性パッケージング細胞系ＧＰ＋ＥＮＶamの中にトラン
スフェクションし、そしてＧ４１８耐性コロニーからの
ウイルス含有培地を使用してヒトＴリンパ芽球細胞系
（これはＨＩＶ感染に対して感受性である）。Ｇ４１８
耐性細胞を単離し、そしてＲＡＳＨ３およびＲＡＳＨ４
で感染したものはそれぞれのＲＮＡを発現することが示
された。次いで細胞をＨＩＶで対抗した。ＨＩＶ感染後
７日におけるｐ２４のＥＬＩＳＡおよびＲＴアッセイに
より示されるように、ＲＡＳＨ４はＨＩＶに対して８０
％の保護を与えたが、ＲＡＳＨ３は７５％の保護を与え
た。
拠） この技術の効能を証明する目的で、ＰＬＮＨＬ、ｐＲＡ
ＳＨ−３およびｐＲＡＳＨ−４を選択した。それらを両
種性パッケージング細胞系ＧＰ＋ＥＮＶamの中にトラン
スフェクションし、そしてＧ４１８耐性コロニーからの
ウイルス含有培地を使用してヒトＴリンパ芽球細胞系
（これはＨＩＶ感染に対して感受性である）。Ｇ４１８
耐性細胞を単離し、そしてＲＡＳＨ３およびＲＡＳＨ４
で感染したものはそれぞれのＲＮＡを発現することが示
された。次いで細胞をＨＩＶで対抗した。ＨＩＶ感染後
７日におけるｐ２４のＥＬＩＳＡおよびＲＴアッセイに
より示されるように、ＲＡＳＨ４はＨＩＶに対して８０
％の保護を与えたが、ＲＡＳＨ３は７５％の保護を与え
た。
【００９１】包括的レトロウイルスの構成体 これはＡＳＨ６ＲＺｅｎｖ１（配列番号：２または配列
番号：５、使用する変異型に依存する）、ＡＳＨ６（Ｐ
ＲＡＳＨ−４から誘導化された５００ｂｐの３’ｐｏｌ
断片）およびＨＣＭＶプロモーターにより推進されるＡ
ＳＨ５およびＳＣＤ４およびＳＶ４０により推進されか
つ３’ＬＴＲの中に位置するＲＺｔｒ（ｔａｔおよびｒ
ｅｖに対するリボザイム）を含有する。
番号：５、使用する変異型に依存する）、ＡＳＨ６（Ｐ
ＲＡＳＨ−４から誘導化された５００ｂｐの３’ｐｏｌ
断片）およびＨＣＭＶプロモーターにより推進されるＡ
ＳＨ５およびＳＣＤ４およびＳＶ４０により推進されか
つ３’ＬＴＲの中に位置するＲＺｔｒ（ｔａｔおよびｒ
ｅｖに対するリボザイム）を含有する。
【００９２】パッケージング細胞系の構成 ＧＰ＋ｅｎｖ120細胞系： １μｇのｐＳＶ２ｇｐｔ＋
１０μｇのｐｅｎｖ120をｅｎｖマイナス細胞系（この
細胞系はＭＬＶｇａｇおよびｐｏｌを作るが、エンベロ
ープを作らない）の中に共トランスフェクションし、そ
して細胞をＨＸＭ選択培地の中に入れた。１７の薬物耐
性コロニーを単離し、そして拡張した。
１０μｇのｐｅｎｖ120をｅｎｖマイナス細胞系（この
細胞系はＭＬＶｇａｇおよびｐｏｌを作るが、エンベロ
ープを作らない）の中に共トランスフェクションし、そ
して細胞をＨＸＭ選択培地の中に入れた。１７の薬物耐
性コロニーを単離し、そして拡張した。
【００９３】ＧＰ＋ｅｎｖCD4細胞系： １μｇのｐＳ
Ｖ２ｇｐｔ＋１０μｇのｐｅｎｖCD4をｅｎｖマイナス
細胞系の中に共トランスフェクションし、そして細胞を
ＨＸＭ選択した。３１の薬物耐性コロニーを単離し、そ
して拡張した。
Ｖ２ｇｐｔ＋１０μｇのｐｅｎｖCD4をｅｎｖマイナス
細胞系の中に共トランスフェクションし、そして細胞を
ＨＸＭ選択した。３１の薬物耐性コロニーを単離し、そ
して拡張した。
【００９４】ＧＰ＋ｅｎｖEPO細胞系： １μｇのｐＳ
Ｖ２ｇｐｔ＋１０μｇのｐｅｎｖEPOをｅｎｖマイナス
細胞系の中に共トランスフェクションした。２１のＨＸ
Ｍ耐性コロニーを単離し、そして拡張した。
Ｖ２ｇｐｔ＋１０μｇのｐｅｎｖEPOをｅｎｖマイナス
細胞系の中に共トランスフェクションした。２１のＨＸ
Ｍ耐性コロニーを単離し、そして拡張した。
【００９５】上の詳細な説明の中で述べたすべての刊行
物および特許をここに引用によって加える。前述の詳細
な説明は当業者が本発明を実施できるために十分である
と考えられるが、本発明を限定しない。事実、本発明の
範囲および精神から逸脱しないで種々の変化および変更
が可能である。
物および特許をここに引用によって加える。前述の詳細
な説明は当業者が本発明を実施できるために十分である
と考えられるが、本発明を限定しない。事実、本発明の
範囲および精神から逸脱しないで種々の変化および変更
が可能である。
【００９６】本発明の主な特徴および態様は、次の通り
である。
である。
【００９７】１．アンチセンスの形成において方向づけ
られたＨＩＶゲノム断片から誘導化され、そして前記ゲ
ノムＨＩＶのすべてまたは一部分に対して実質的に相補
的なのものから本質的に成る群より選択される少なくと
も１つのポリヌクレオチド配列： ｉ）ｅｎｖ領域において、ＨＩＶウイルスゲノムの３’
ＬＴＲから約３．４ｋｂについての伸長（約ｎｔ５３２
２−８６９４）、 ｉｉ）ｇａｇ領域において、ＨＩＶウイルスゲノムの
５’ＬＴＲから約２．８ｋｂ下流の伸長（約ｎｔ−３２
４−２５５６）、 ｉｉｉ）ｐｏｌ領域において、ＨＩＶウイルスゲノムの
５’ＬＴＲから約２．８ｋｂ〜約４．５ｋｂ下流の伸長
（約ｎｔ２５５６−４２２７）、 ｉｖ）ｐｏｌ領域において、ＨＩＶウイルスゲノムの
３’ＬＴＲから約４．５ｋｂ〜約３．４ｋｂ上流の伸長
（約ｎｔ４２２７−５３２２）、および ｖ）ｇａｇ領域において、約ｎｔ７８−６２８、を含ん
でなる発現構成体。
られたＨＩＶゲノム断片から誘導化され、そして前記ゲ
ノムＨＩＶのすべてまたは一部分に対して実質的に相補
的なのものから本質的に成る群より選択される少なくと
も１つのポリヌクレオチド配列： ｉ）ｅｎｖ領域において、ＨＩＶウイルスゲノムの３’
ＬＴＲから約３．４ｋｂについての伸長（約ｎｔ５３２
２−８６９４）、 ｉｉ）ｇａｇ領域において、ＨＩＶウイルスゲノムの
５’ＬＴＲから約２．８ｋｂ下流の伸長（約ｎｔ−３２
４−２５５６）、 ｉｉｉ）ｐｏｌ領域において、ＨＩＶウイルスゲノムの
５’ＬＴＲから約２．８ｋｂ〜約４．５ｋｂ下流の伸長
（約ｎｔ２５５６−４２２７）、 ｉｖ）ｐｏｌ領域において、ＨＩＶウイルスゲノムの
３’ＬＴＲから約４．５ｋｂ〜約３．４ｋｂ上流の伸長
（約ｎｔ４２２７−５３２２）、および ｖ）ｇａｇ領域において、約ｎｔ７８−６２８、を含ん
でなる発現構成体。
【００９８】２．エンドリボヌクレアーゼのヌクレオチ
ド配列をさらに含む上記第１項記載の発現構成体。
ド配列をさらに含む上記第１項記載の発現構成体。
【００９９】３．前記エンドリボヌクレアーゼがハンマ
ーヘッドの配列である上記第２項記載の発現構成体。
ーヘッドの配列である上記第２項記載の発現構成体。
【０１００】４．前記ＨＩＶゲノム断片が図２のポリヌ
クレオチド配列からなる上記第１項記載の発現構成体。
クレオチド配列からなる上記第１項記載の発現構成体。
【０１０１】５．前記ＨＩＶゲノム断片およびエンドリ
ボヌクレアーゼ配列が図３のポリヌクレオチド配列を含
んでなる上記第３項記載の発現構成体。
ボヌクレアーゼ配列が図３のポリヌクレオチド配列を含
んでなる上記第３項記載の発現構成体。
【０１０２】６．前記ＨＩＶゲノム断片およびエンドリ
ボヌクレアーゼ配列が図４のポリヌクレオチド配列を含
んでなる上記第３項記載の発現構成体。
ボヌクレアーゼ配列が図４のポリヌクレオチド配列を含
んでなる上記第３項記載の発現構成体。
【０１０３】７．上記第１項記載の少なくとも１つの発
現構成体および製剤学的に許容されうる担体または希釈
剤からなる薬剤組成物。
現構成体および製剤学的に許容されうる担体または希釈
剤からなる薬剤組成物。
【０１０４】８．上記第７項記載の薬剤組成物を患者に
非経口的に投与することからなる上記第７項記載の薬剤
組成物を投与する方法。
非経口的に投与することからなる上記第７項記載の薬剤
組成物を投与する方法。
【０１０５】９．上記第７項記載の薬剤組成物を患者に
静脈内に投与することからなる上記第７項記載の薬剤組
成物を投与する方法。
静脈内に投与することからなる上記第７項記載の薬剤組
成物を投与する方法。
【０１０６】１０．少なくとも１つの上記第１項記載の
発現構成体からなる安定に形質転換された細胞。
発現構成体からなる安定に形質転換された細胞。
【０１０７】１１．少なくとも１つの上記第１項記載の
発現構成体からなるレトロウイルスのベクター。
発現構成体からなるレトロウイルスのベクター。
【０１０８】１２．前記発現構成体がｐｏｌおよびｔａ
ｔ領域におけるＨＩＶゲノムＲＮＡの部分に対して実質
的に相補的であり、約１．１ｋｂの長さをもちかつＨＩ
Ｖゲノムの３’ＬＴＲから約４．５ｋｂ〜約３．４ｋｂ
上流に位置するポリヌクレオチド配列からなる、上記第
１１項記載のレトロウイルスのベクター。
ｔ領域におけるＨＩＶゲノムＲＮＡの部分に対して実質
的に相補的であり、約１．１ｋｂの長さをもちかつＨＩ
Ｖゲノムの３’ＬＴＲから約４．５ｋｂ〜約３．４ｋｂ
上流に位置するポリヌクレオチド配列からなる、上記第
１１項記載のレトロウイルスのベクター。
【０１０９】１３．前記ＨＩＶゲノム断片が図２または
図１５におけるポリヌクレオチド配列（配列番号：１ま
たは配列番号：４）である発現構成体からなる、上記第
１１項記載のレトロウイルスのベクター。
図１５におけるポリヌクレオチド配列（配列番号：１ま
たは配列番号：４）である発現構成体からなる、上記第
１１項記載のレトロウイルスのベクター。
【０１１０】１４．前記ＨＩＶゲノム断片およびエンド
リボヌクレアーゼ配列が図３または図１６におけるポリ
ヌクレオチド配列（配列番号：２または配列番号：５）
である、上記第１１項記載のレトロウイルスのベクタ
ー。
リボヌクレアーゼ配列が図３または図１６におけるポリ
ヌクレオチド配列（配列番号：２または配列番号：５）
である、上記第１１項記載のレトロウイルスのベクタ
ー。
【０１１１】１５．前記ＨＩＶゲノム断片およびエンド
リボヌクレアーゼ配列が図４または図１７におけるポリ
ヌクレオチド配列（配列番号：３または配列番号：６）
である発現構成体からなる、上記第１１項記載のレトロ
ウイルスのベクター。
リボヌクレアーゼ配列が図４または図１７におけるポリ
ヌクレオチド配列（配列番号：３または配列番号：６）
である発現構成体からなる、上記第１１項記載のレトロ
ウイルスのベクター。
【０１１２】１６．内部に操作的に位置しかつ可溶性Ｃ
Ｄ４をエンコードすることができる遺伝配列をさらに含
む、上記第１１項記載のレトロウイルスのベクター。
Ｄ４をエンコードすることができる遺伝配列をさらに含
む、上記第１１項記載のレトロウイルスのベクター。
【０１１３】１７．可溶性ＣＤ４をエンコードする前記
配列が前記レトロウイルスのベクターの３’ＬＴＲのＵ
３とＵ５との間に操作的に位置する、上記第１６項記載
のレトロウイルスのベクター。
配列が前記レトロウイルスのベクターの３’ＬＴＲのＵ
３とＵ５との間に操作的に位置する、上記第１６項記載
のレトロウイルスのベクター。
【０１１４】１８．前記発現構成体がＲＺｅｎｖ１であ
る、上記第１７項記載のレトロウイルスのベクター。
る、上記第１７項記載のレトロウイルスのベクター。
【０１１５】１９．前記発現構成体がＨＸＢ５（配列番
号：１または配列番号：４）である、上記第１７項記載
のレトロウイルスのベクター。
号：１または配列番号：４）である、上記第１７項記載
のレトロウイルスのベクター。
【０１１６】２０．前記発現構成体がＲＺｅｎｖ１（配
列番号：２または配列番号：５）とＨＸＢ５（配列番
号：１または配列番号：４）（配列番号：３または配列
番号：６）との組み合わせからなる、上記第１７項記載
のレトロウイルスのベクター。 ２１．選択可能なマーカーをエンコードする外来遺伝子
をさらに含む、上記第１７項記載のレトロウイルスのベ
クター。
列番号：２または配列番号：５）とＨＸＢ５（配列番
号：１または配列番号：４）（配列番号：３または配列
番号：６）との組み合わせからなる、上記第１７項記載
のレトロウイルスのベクター。 ２１．選択可能なマーカーをエンコードする外来遺伝子
をさらに含む、上記第１７項記載のレトロウイルスのベ
クター。
【０１１７】２２．前記外来遺伝子が細菌のネオマイシ
ン耐性遺伝子である、上記第２１項記載のレトロウイル
スのベクター。
ン耐性遺伝子である、上記第２１項記載のレトロウイル
スのベクター。
【０１１８】２３．高い効能の非レトロウイルスのプロ
モーターをさらに含む、上記第２２項記載のレトロウイ
ルスのベクター。
モーターをさらに含む、上記第２２項記載のレトロウイ
ルスのベクター。
【０１１９】２４．前記プロモーターがＨＣＭＶであ
る、上記第２３項記載のレトロウイルスのベクター。
る、上記第２３項記載のレトロウイルスのベクター。
【０１２０】２５．上記第１１項記載のレトロウイルス
のベクターおよび製剤学的に許容されうる担体または希
釈剤からなる薬剤組成物。
のベクターおよび製剤学的に許容されうる担体または希
釈剤からなる薬剤組成物。
【０１２１】２６．上記第１２項記載のレトロウイルス
のベクターおよび製剤学的に許容されうる担体または希
釈剤からなる薬剤組成物。
のベクターおよび製剤学的に許容されうる担体または希
釈剤からなる薬剤組成物。
【０１２２】２７．上記第２０項記載のレトロウイルス
のベクターおよび製剤学的に許容されうる担体または希
釈剤からなる薬剤組成物。
のベクターおよび製剤学的に許容されうる担体または希
釈剤からなる薬剤組成物。
【０１２３】２８．上記第２６項記載の薬剤組成物を処
置が必要な患者に静脈内に投与することからなる上記第
２６項記載の薬剤組成物を投与する方法。
置が必要な患者に静脈内に投与することからなる上記第
２６項記載の薬剤組成物を投与する方法。
【０１２４】２９．少なくとも１つの上記第１１項記載
のレトロウイルスのベクターからなる組換えレトロウイ
ルス。
のレトロウイルスのベクターからなる組換えレトロウイ
ルス。
【０１２５】３０．前記レトロウイルスのベクターが上
記第１２項記載のレトロウイルスのベクターである、上
記第２９項記載の組換えレトロウイルス。
記第１２項記載のレトロウイルスのベクターである、上
記第２９項記載の組換えレトロウイルス。
【０１２６】３１．前記レトロウイルスのベクターが上
記第１３項記載のレトロウイルスのベクターである、上
記第２９項記載の組換えレトロウイルス。
記第１３項記載のレトロウイルスのベクターである、上
記第２９項記載の組換えレトロウイルス。
【０１２７】３２．前記レトロウイルスのベクターが上
記第１４項記載のレトロウイルスのベクターである、上
記第２９項記載の組換えレトロウイルス。
記第１４項記載のレトロウイルスのベクターである、上
記第２９項記載の組換えレトロウイルス。
【０１２８】３３．前記レトロウイルスのベクターが上
記第１５項記載のレトロウイルスのベクターである、上
記第２９項記載の組換えレトロウイルス。
記第１５項記載のレトロウイルスのベクターである、上
記第２９項記載の組換えレトロウイルス。
【０１２９】３４．前記レトロウイルスのベクターが上
記第１６項記載のレトロウイルスのベクターである、上
記第２９項記載の組換えレトロウイルス。
記第１６項記載のレトロウイルスのベクターである、上
記第２９項記載の組換えレトロウイルス。
【０１３０】３５．前記レトロウイルスのベクターが上
記第１７項記載のレトロウイルスのベクターである、上
記第２９項記載の組換えレトロウイルス。
記第１７項記載のレトロウイルスのベクターである、上
記第２９項記載の組換えレトロウイルス。
【０１３１】３６．前記レトロウイルスのベクターが上
記第１８項記載のレトロウイルスのベクターである、上
記第２９項記載の組換えレトロウイルス。
記第１８項記載のレトロウイルスのベクターである、上
記第２９項記載の組換えレトロウイルス。
【０１３２】３７．前記レトロウイルスのベクターが上
記第１９項記載のレトロウイルスのベクターである、上
記第２９項記載の組換えレトロウイルス。
記第１９項記載のレトロウイルスのベクターである、上
記第２９項記載の組換えレトロウイルス。
【０１３３】３８．前記レトロウイルスのベクターが上
記第２０項記載のレトロウイルスのベクターである、上
記第２９項記載の組換えレトロウイルス。
記第２０項記載のレトロウイルスのベクターである、上
記第２９項記載の組換えレトロウイルス。
【０１３４】３９．前記レトロウイルスのベクターが上
記第２４項記載のレトロウイルスのベクターである、上
記第２９項記載の組換えレトロウイルス。
記第２４項記載のレトロウイルスのベクターである、上
記第２９項記載の組換えレトロウイルス。
【０１３５】４０．上記第１１項記載のレトロウイルス
のベクターおよび前記レトロウイルスのベクターの表面
上で選択したリガンドを発現することができる外因性遺
伝的インサートからなる、選択したリガンドのための表
面レセプターを発現する細胞をターゲッティングしかつ
感染することができる組換えレトロウイルス。
のベクターおよび前記レトロウイルスのベクターの表面
上で選択したリガンドを発現することができる外因性遺
伝的インサートからなる、選択したリガンドのための表
面レセプターを発現する細胞をターゲッティングしかつ
感染することができる組換えレトロウイルス。
【０１３６】４１．前記選択したリガンドがＣＤ４であ
る、上記第４０項記載の組換えレトロウイルス。
る、上記第４０項記載の組換えレトロウイルス。
【０１３７】４２．前記選択したリガンドがｇｐ１２０
である、上記第４０項記載の組換えレトロウイルス。
である、上記第４０項記載の組換えレトロウイルス。
【０１３８】４３．上記第２９項記載の組換えレトロウ
イルスおよび製剤学的に許容されうる担体または希釈剤
からなる薬剤組成物。
イルスおよび製剤学的に許容されうる担体または希釈剤
からなる薬剤組成物。
【０１３９】４４．上記第４０項記載の組換えレトロウ
イルスおよび製剤学的に許容されうる担体または希釈剤
からなる薬剤組成物。
イルスおよび製剤学的に許容されうる担体または希釈剤
からなる薬剤組成物。
【０１４０】４５．予防的に有効量の上記第１１項記載
のレトロウイルスのベクターおよび製剤学的に許容され
うる担体または希釈剤からなるＨＩＶ感染に対して患者
を免疫化するために有用なワクチン。
のレトロウイルスのベクターおよび製剤学的に許容され
うる担体または希釈剤からなるＨＩＶ感染に対して患者
を免疫化するために有用なワクチン。
【０１４１】４６．上記第１１項記載の組換えレトロウ
イルスと製剤学的に許容されうる担体または希釈剤との
混合物からなる治療組成物。
イルスと製剤学的に許容されうる担体または希釈剤との
混合物からなる治療組成物。
【０１４２】４７．工程： ｉ）真核生物の細胞を上記第９項記載の組換えレトロウ
イルスでトランスフェクションして前記細胞を前記組換
えレトロウイルスで安定に形質転換し、そして ｉｉ）生ずる安定に形質転換された細胞を転写可能なプ
ロウイルスのＤＮＡの転写を可能とする条件下に維持す
る、ことからなる、外来ＲＮＡを生産する方法。
イルスでトランスフェクションして前記細胞を前記組換
えレトロウイルスで安定に形質転換し、そして ｉｉ）生ずる安定に形質転換された細胞を転写可能なプ
ロウイルスのＤＮＡの転写を可能とする条件下に維持す
る、ことからなる、外来ＲＮＡを生産する方法。
【０１４３】４８．プロウイルスのＤＮＡのＲＮＡへの
転写およびＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を可能とする
条件下に、上記第４７項記載の安定に形質転換された細
胞を培養することからなる、ポリペプチドを生産する方
法。
転写およびＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を可能とする
条件下に、上記第４７項記載の安定に形質転換された細
胞を培養することからなる、ポリペプチドを生産する方
法。
【０１４４】４９．工程： ｉ）上記第１１項記載のレトロウイルスのベクターをパ
ッケージング細胞系の中にトランスフェクションし、 ｉｉ）そのようにトランスフェクションされた前記細胞
系を、前記レトロウイルスのベクターが組換えヴィリオ
ン粒子の中に運んだ遺伝物質の転写および翻訳を可能と
する条件下に、適当な培地中で培養し、そして ｉｉｉ）そのように形成した前記粒子を前記細胞系から
前記培地の中に発芽させる、からなる、生産体の細胞を
生産する方法。
ッケージング細胞系の中にトランスフェクションし、 ｉｉ）そのようにトランスフェクションされた前記細胞
系を、前記レトロウイルスのベクターが組換えヴィリオ
ン粒子の中に運んだ遺伝物質の転写および翻訳を可能と
する条件下に、適当な培地中で培養し、そして ｉｉｉ）そのように形成した前記粒子を前記細胞系から
前記培地の中に発芽させる、からなる、生産体の細胞を
生産する方法。
【０１４５】５０．後天性免疫不全症候群の処置を必要
とする患者に、治療的に有効量の上記第１１項記載のレ
トロウイルスのベクターおよび許容されうる製剤学的担
体または希釈剤を投与することからなる、後天性免疫不
全症候群を処置する方法。
とする患者に、治療的に有効量の上記第１１項記載のレ
トロウイルスのベクターおよび許容されうる製剤学的担
体または希釈剤を投与することからなる、後天性免疫不
全症候群を処置する方法。
【０１４６】５１．有効免疫化量の上記第４５項記載の
ワクチンを患者に投与することからなる、ＨＩＶ感染に
対して患者を免疫化する方法。
ワクチンを患者に投与することからなる、ＨＩＶ感染に
対して患者を免疫化する方法。
【０１４７】５２．工程： ａ）患者から細胞を取り出し、 ｂ）取り出した細胞を有効量の上記第１１項記載の組換
えレトロウイルスで感染させ、そして ｃ）前記レトロウイルスで感染した細胞を患者に注射す
る、からなる、ＨＩＶが感染した患者を処置する方法。
えレトロウイルスで感染させ、そして ｃ）前記レトロウイルスで感染した細胞を患者に注射す
る、からなる、ＨＩＶが感染した患者を処置する方法。
【０１４８】５３．前記細胞が幹細胞、Ｔ細胞および単
球から成る群より選択される、上記第５３項記載の方
法。
球から成る群より選択される、上記第５３項記載の方
法。
【０１４９】５４．後天性免疫不全症候群の処置を必要
とする患者に、製剤学的に有効量の上記第４０項記載の
組換えレトロウイルスおよび許容されうる製剤学的担体
または希釈剤を投与することからなる、後天性免疫不全
症候群を処置する方法。
とする患者に、製剤学的に有効量の上記第４０項記載の
組換えレトロウイルスおよび許容されうる製剤学的担体
または希釈剤を投与することからなる、後天性免疫不全
症候群を処置する方法。
【０１５０】５５．上記第４３項記載の薬剤組成物を投
与することからなる、上記第４３項記載の薬剤組成物を
投与する方法。
与することからなる、上記第４３項記載の薬剤組成物を
投与する方法。
【図１】ＨＩＶゲノムから誘導化された本発明のある種
の発現構成体の態様の概略的表示である。
の発現構成体の態様の概略的表示である。
【図２】発現構成体ＨＸＢ５（配列番号：１）に関する
ポリヌクレオチド配列である。
ポリヌクレオチド配列である。
【図３】発現構成体ＲＺｅｎｖ１（配列番号：２）に関
するポリヌクレオチド配列である。
するポリヌクレオチド配列である。
【図４】発現構成体ＨＸＢ５およびＲＺｅｎｖ１（配列
番号：３）に関するポリヌクレオチド配列である。
番号：３）に関するポリヌクレオチド配列である。
【図５】ハンマーヘッドのリボザイムのヌクレオチド配
列の概略的表示である。
列の概略的表示である。
【図６】レトロウイルスのベクターの中へのある種の発
現構成体の態様のクローニングの概略的表示である。
現構成体の態様のクローニングの概略的表示である。
【図７】パッケージング細胞系のエンベロープ部分がｇ
ｐ１２０を有し、ＣＤ４向性組換えレトロウイルスとす
る、パッケージング細胞系の構成の概略的表示である。
ｐ１２０を有し、ＣＤ４向性組換えレトロウイルスとす
る、パッケージング細胞系の構成の概略的表示である。
【図８】ｐＥＥ６発現ベクターの中のＨＩＶ（ｇｐ１２
０）のエンベロープ部分の発現の概略的表示である。
０）のエンベロープ部分の発現の概略的表示である。
【図９】ｐＥＥ６発現ベクターの中のＣＤ４の発現の概
略的表示である。
略的表示である。
【図１０】ＨＩＶウイルス（ｇｐ１２０を発現する）を
収容する細胞について選択性のパッケージング細胞系の
構成の概略的表示である。
収容する細胞について選択性のパッケージング細胞系の
構成の概略的表示である。
【図１１】ＣＤ４向性パッケージング細胞系試験細胞系
の概略的表示である。
の概略的表示である。
【図１２】ｇｐ１２０向性パッケージング細胞系試験細
胞系の概略的表示である。
胞系の概略的表示である。
【図１３】本発明のｇｐ１２０向性組換えレトロウイル
スの概略的表示である。
スの概略的表示である。
【図１４】ここにおける技術に従いｇｐ１２０向性パッ
ケージング細胞系の生産のためにベクターの中へのＣＤ
４リガンドの挿入の概略的表示である。
ケージング細胞系の生産のためにベクターの中へのＣＤ
４リガンドの挿入の概略的表示である。
【図１５】ＨＩＶの変異型株の発現構成体ＨＸＢ５に関
するポリヌクレオチド配列である（配列番号：４）。
するポリヌクレオチド配列である（配列番号：４）。
【図１６】ＨＩＶの変異型株の発現構成体ＲＺｅｎｖ１
に関するポリヌクレオチド配列である（配列番号：
５）。
に関するポリヌクレオチド配列である（配列番号：
５）。
【図１７】ＨＩＶの変異型株の発現構成体ＨＸＢ５およ
びＲＺｅｎｖ１に関するポリヌクレオチド配列である
（配列番号：６）。
びＲＺｅｎｖ１に関するポリヌクレオチド配列である
（配列番号：６）。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 7/01 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 7/00
Claims (12)
- 【請求項１】 アンチセンスの形成において方向づけら
れたＨＩＶゲノム断片から誘導され、そして前記ゲノム
ＨＩＶのすべてまたは一部分に対して実質的に相補的な
のものから本質的に成る群より選択される少なくとも１
つのポリヌクレオチド配列： ｉ）ｅｎｖ領域において、ＨＩＶウイルスゲノムの３’
ＬＴＲから約３．４ｋｂについての伸長（約ｎｔ５３２
２−８６９４）、 ｉｉ）ｇａｇ領域において、ＨＩＶウイルスゲノムの
５’ＬＴＲから約２．８ｋｂ下流の伸長（約ｎｔ−３２
４−２５５６）、 ｉｉｉ）ｐｏｌ領域において、ＨＩＶウイルスゲノムの
５’ＬＴＲから約２．８ｋｂ〜約４．５ｋｂ下流の伸長
（約ｎｔ２５５６−４２２７）、 ｉｖ）ｐｏｌ領域において、ＨＩＶウイルスゲノムの
３’ＬＴＲから約４．５ｋｂ〜約３．４ｋｂ上流の伸長
（約ｎｔ４２２７−５３２２）、および ｖ）ｇａｇ領域において、約ｎｔ７８−６２８、を有す
る発現構成体。 - 【請求項２】 請求項１の少なくとも１つの発現構成体
および製剤学的に許容されうる担体または希釈剤を含ん
でなる薬剤組成物。 - 【請求項３】 少なくとも１つの請求項１の発現構成体
を含んでなる安定に形質転換された細胞。 - 【請求項４】 少なくとも１つの請求項１の発現構成体
を含んでなるレトロウイルスのベクター。 - 【請求項５】 請求項４のレトロウイルスのベクターお
よび製剤学的に許容されうる担体または希釈剤を含んで
なる薬剤組成物。 - 【請求項６】 少なくとも１つの請求項４のレトロウイ
ルスのベクターを含んでなる組換えレトロウイルス。 - 【請求項７】 選択したリガンドのための表面レセプタ
ーを発現する細胞をターゲッティングしかつ感染するこ
とができる組換えレトロウイルスであって、請求項４の
レトロウイルスのベクターおよび前記組換えレトロウイ
ルスの表面上で前記選択したリガンドを発現することが
できる外因性遺伝的インサートを含んでなる組換えレト
ロウイルス。 - 【請求項８】 請求項６の組換えレトロウイルスおよび
製剤学的に許容されうる担体または希釈剤を含んでなる
薬剤組成物。 - 【請求項９】 予防的に有効量の請求項４のレトロウイ
ルスのベクターおよび製剤学的に許容されうる担体また
は希釈剤を含んでなるＨＩＶ感染に対して患者を免疫化
するために有用なワクチン。 - 【請求項１０】 請求項４の組換えレトロウイルスのベ
クターと製剤学的に許容されうる担体または希釈剤との
混合物を含んでなる治療組成物。 - 【請求項１１】 ｉ）真核生物の細胞を請求項４のレト
ロウイルスのベクターでトランスフェクションして前記
細胞を前記レトロウイルスのベクターで安定に形質転換
する工程、および ｉｉ）生ずる安定に形質転換された細胞を転写可能なプ
ロウイルスのＤＮＡの転写を可能とする条件下に維持す
る工程、を含んでなる外来ＲＮＡを生産する方法。 - 【請求項１２】 ｉ）請求項４のレトロウイルスのベク
ターをパッケージング細胞系の中にトランスフェクショ
ンする工程、 ｉｉ）そのようにトランスフェクションされた前記細胞
系を、前記レトロウイルスのベクターが組換えヴィリオ
ン粒子の中に運んだ遺伝物質の転写および翻訳を可能と
する条件下に、適当な培地中で培養する工程、ならびに ｉｉｉ）そのように形成した前記粒子を前記細胞系から
前記培地の中に発芽させる工程、を含んでなる生産体の
細胞を生産する方法。
Applications Claiming Priority (4)
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|---|---|---|---|
| US2193693A | 1993-02-25 | 1993-02-25 | |
| US021936 | 1993-02-25 | ||
| US19035094A | 1994-02-01 | 1994-02-01 | |
| US190350 | 1994-02-01 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06335392A true JPH06335392A (ja) | 1994-12-06 |
Family
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| JP (1) | JPH06335392A (ja) |
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| AU (1) | AU5639494A (ja) |
| FI (1) | FI940867A (ja) |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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-
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- 1994-02-21 IL IL10871994A patent/IL108719A0/xx unknown
- 1994-02-24 FI FI940867A patent/FI940867A/fi unknown
- 1994-02-24 AU AU56394/94A patent/AU5639494A/en not_active Abandoned
- 1994-02-24 EP EP94301315A patent/EP0612844A2/en not_active Withdrawn
- 1994-02-25 KR KR1019940003486A patent/KR940019314A/ko not_active Application Discontinuation
- 1994-02-25 JP JP6051115A patent/JPH06335392A/ja active Pending
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| AU5639494A (en) | 1994-09-01 |
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