JPH06277088A - Production and purification of recombinant protein - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To obtain a recombinant protein on an industrial scale by using a cellulose bond region of a cellulase of Trichoderma reesei as a tag for affinity purification. CONSTITUTION:The objective recombinant protein is produced as a fused protein, to which a tag for affinity purification is added, in a transformed host organism and purified from an extract of bacterial cells by affinity chromatography using cellulose as a carrier. A peptide chain (about 3-4KD molecular weight) consisting of about 30-40 amino acid residues constituting the cellulose bond region of a cellulase of Trichoderma reesei is used as the tag for affinity purification. Normal holding of the objective recombinant protein is not damaged.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子工学技術を用い
た組換えタンパク質の生産・精製方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for producing and purifying a recombinant protein using a genetic engineering technique.

【０００２】[0002]

【従来の技術】組換えＤＮＡ技術の出現により、遺伝子
発現における種の障害を超えて外来遺伝子を動植物、酵
母、細菌等の細胞中に導入し、異種タンパク質として発
現させることが可能になった。これにより、ヒト成長ホ
ルモンやインスリンを始めとする有用な組換えタンパク
質の工業生産に道が開かれるようになった。従来、この
ような組換えタンパク質生産に際しては、種々の理由か
らグラム陰性菌である大腸菌が宿主として広く用いられ
てきた。このような大腸菌を宿主に用いて組換えタンパ
ク質の生産を行う場合、通常は菌体を破砕した後、大量
に存在する細胞質タンパク質や菌体細胞壁などに由来す
る夾雑物から目的とする組換えタンパク質を分離、精製
する必要が生じる。従って、大腸菌を宿主とした組換え
タンパク質の工業生産においては、目的とする組換えタ
ンパク質の分離、精製を効率良く行うことが生産プロセ
スの経済性を左右する。2. Description of the Related Art With the advent of recombinant DNA technology, it has become possible to transfect foreign genes into cells of animals, plants, yeast, bacteria, etc., and to express them as heterologous proteins, beyond the obstacle of gene expression. This has opened the way for the industrial production of useful recombinant proteins such as human growth hormone and insulin. Conventionally, Escherichia coli, which is a gram-negative bacterium, has been widely used as a host for the production of such a recombinant protein for various reasons. When such E. coli is used as a host to produce a recombinant protein, the target recombinant protein is usually obtained by crushing the microbial cells and then extracting a large amount of contaminants derived from cytoplasmic proteins or microbial cell walls. Need to be separated and purified. Therefore, in industrial production of recombinant proteins using Escherichia coli as a host, economic efficiency of the production process depends on efficient isolation and purification of the target recombinant protein.

【０００３】この様な問題を解決するために開発された
のが、アフィニティーフュージョン法と呼ばれる組換え
ＤＮＡ技術である。この技術は、目的とするタンパク質
を、特定のリガンドに親和性を持ったタンパク質（アフ
ィニティー精製用タグ）との融合タンパク質として生産
することにより、該融合タンパク質を該リガンドを担体
に用いたアフィニティークロマトグラフィーにより効率
的に精製する方法である。また、目的とするタンパク質
と精製用タグとの間に特異的プロテアーゼにより認識さ
れ、切断を受けるアミノ酸配列を予め挿入しておくこと
により、該融合タンパク質を開裂させて目的タンパク質
のみを回収することが可能である。例えば、アフィニテ
ィー精製用タグとして、マルトース結合タンパク質（分
子量４３Ｋダルトン）やグルタチオンＳ−トランスフェ
ラーゼ（分子量２６Ｋダルトン）、プロテインＡ（分子
量５２Ｋダルトン）などを、また、ペプチド鎖の特異的
切断にファクターＸaやトロンビン、コラゲナーゼ等を
特異的プロテアーゼとして用いたものが代表的である
（Sassenfeld,H.M.TIBTECH8,88-93,1990）。A recombinant DNA technique called the affinity fusion method was developed to solve such problems. This technique produces an objective protein as a fusion protein with a protein having an affinity for a specific ligand (affinity purification tag), thereby performing the affinity chromatography using the fusion protein as a carrier. It is a method of purifying more efficiently. Further, by inserting an amino acid sequence that is recognized by a specific protease and undergoes cleavage between the target protein and the purification tag, the fusion protein can be cleaved to recover only the target protein. It is possible. For example, as an affinity purification tag, maltose binding protein (molecular weight 43 K dalton), glutathione S-transferase (molecular weight 26 K dalton), protein A (molecular weight 52 K dalton), etc., and factor Xa or thrombin for specific peptide chain cleavage. Representatively, collagenase or the like is used as a specific protease (Sassenfeld, HMTIBTECH8, 88-93, 1990).

【０００４】しかしながら、これまでに開発されたアフ
ィニティーフュージョン法の多くは、まだ以下のような
問題を残している。即ち、 １．融合タンパク質をアフィニティークロマトグラフィ
ーにより精製する際のカラムからの溶離条件が、目的タ
ンパク質の失活を招くような低いｐＨ（ｐＨ＜３）であ
ったり、グアニジン、エチレングリコール、還元剤など
の化学薬品の添加を必要とする場合が多い。However, most of the affinity fusion methods developed so far still have the following problems. That is, 1. When purifying the fusion protein by affinity chromatography, the elution conditions from the column are such that the pH is low (pH <3) that causes the inactivation of the target protein, or the chemicals such as guanidine, ethylene glycol, and a reducing agent are used. Often requires addition.

【０００５】２．アフィニティークロマトグラフィーの
担体に、ＩｇＧ抗体など非常に高価なリガンドを用いた
ものが多く、工業規模での適用に経済上の問題がある。2. There are many cases where very expensive ligands such as IgG antibody are used as a carrier for affinity chromatography, and there is an economical problem in application on an industrial scale.

【０００６】３．比較的失活し易いリガンドを用いたも
のが多く、担体の寿命が短い。また、雑菌汚染などが起
きた場合に薬液洗浄などによる汚染の除去が難しい。3. Many of them use a ligand that is relatively easily deactivated, and the carrier has a short life. In addition, it is difficult to remove the contamination by cleaning with a chemical solution when contamination of various bacteria occurs.

【０００７】４．アフィニティー精製用タグとして用い
られるマルトース結合タンパク質や、グルタチオンＳ−
トランスフェラーゼ、プロティンＡなどのタンパク質の
サイズは、分子量３万から５万前後と比較的大きいもの
が多く、融合タンパク質中で目的タンパク質の正常なフ
ォールディング（折たたみ）を妨げる場合がある。この
様な場合、目的タンパク質は本来の活性を有さない変性
タンパク質として菌体内に蓄積されてしまう。4. Maltose binding protein used as an affinity purification tag and glutathione S-
Proteins such as transferase and protein A often have a relatively large size with a molecular weight of about 30,000 to about 50,000, which may interfere with normal folding (folding) of the target protein in the fusion protein. In such a case, the target protein is accumulated in the cells as a denatured protein that does not have the original activity.

【０００８】５．発現した融合タンパク質の種類によっ
てはその立体障害のために、特異的プロテアーゼにより
開裂可能なアミノ酸配列が該プロテアーゼによる切断か
ら保護されることがあり、このような場合、融合タンパ
ク質を開裂させて目的とするタンパク質を回収すること
が不可能となる。5. Depending on the kind of the expressed fusion protein, due to its steric hindrance, an amino acid sequence cleavable by a specific protease may be protected from cleavage by the protease. It becomes impossible to recover the protein that does.

【０００９】トリコデルマリーゼイの産生するセルロー
ス分解酵素の内、セロビオハイドレースI（ＣＢＨI）、
セロビオハイドレースII（ＣＢＨII）、エンドグルカナ
ーゼI（ＥＧI）、エンドグルカナーゼIII（ＥＧIII）に
ついてはこれまでにその遺伝子がクローニングされ、塩
基配列が明らかになっている（Shoemaker,S.,Schweicka
rt,V.,Ladner,M.,Gelfand,D.,Kwok,S.Myambo,K.＆ Inni
s,M.BIO/TECHNOLOGY1,691-696,1983など）。これらＣＢ
ＨI、ＣＢＨII、ＥＧI、ＥＧIIIの塩基配列より推測さ
れるアミノ酸配列を比較することにより、ＥＧI、ＣＢ
ＨIはそのＣ末端に、またＥＧIII、ＣＢＨIIはそのＮ末
端に、それぞれ約３０のアミノ酸残基からなるセルロー
ス結合領域と考えられる相同性の高い領域（セルロース
分解酵素のセルロース結合領域を含むペプチド鎖）が存
在すること、さらにこれらの相同性の高い領域は、ヒド
ロキシルアミノ酸及びプロリンに富んだ約３０のアミノ
酸残基からなるリンカー領域を介して、触媒領域と考え
られる残りの領域と結合されていることが明らかになっ
ている（Teeri,T.T.,Lehtovaara,P.,Kauppinen,S.,＆ K
nowles,J.Gene 51,43-52,1987）。しかし、これらトリ
コデルマリーゼイのセルロース分解酵素に着目し、その
セルロース結合領域をアフィニティーフュージョン法に
おけるアフィニティー精製用タグとして用いることを検
討した例はなAmong cellulolytic enzymes produced by Trichoderma reesei, cellobiohydrate I (CBHI),
Regarding cellobiohydrate II (CBHII), endoglucanase I (EGI), and endoglucanase III (EGIII), their genes have been cloned so far, and their nucleotide sequences have been clarified (Shoemaker, S., Schweicka
rt, V., Ladner, M., Gelfand, D., Kwok, S.Myambo, K. & Inni
s, M.BIO / TECHNOLOGY1,691-696,1983 etc.). These CB
By comparing the amino acid sequences deduced from the nucleotide sequences of HI, CBHII, EGI and EGIII, EGI and CB
HI is at its C-terminal, and EGIII and CBHII are at its N-terminal, and each has a high homology region (a peptide chain containing a cellulose-binding region of a cellulolytic enzyme) that is considered to be a cellulose-binding region consisting of about 30 amino acid residues. And that these highly homologous regions are linked to the rest of the possible catalytic region via a linker region consisting of approximately 30 amino acid residues rich in hydroxyl amino acids and proline. Has been revealed (Teeri, TT, Lehtovaara, P., Kauppinen, S., & K
nowles, J. Gene 51, 43-52, 1987). However, there is no example in which attention was paid to the cellulolytic enzyme of these Trichoderma reesei, and the use of the cellulose binding region as a tag for affinity purification in the affinity fusion method was examined.

【００１０】い。Yes

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記アフィ
ニティーフュージョン法の有する課題を、トリコデルマ
リーゼイのセルロース分解酵素のセルロース結合領域を
アフィニティー精製用タグとして用いる融合タンパク質
発現ベクターを含む遺伝子工学的手法により解決し、効
率的かつ経済的に組換えタンパク質を生産する方法を提
供することにある。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention addresses the problems of the above-mentioned affinity fusion method by a genetic engineering method involving a fusion protein expression vector using the cellulose-binding domain of the cellulolytic enzyme of Trichoderma reesei as an affinity purification tag. And to provide a method for efficiently and economically producing a recombinant protein.

【００１１】[0011]

【課題を解決するための手段】上記課題は、本発明のト
リコデルマリーゼイの産生するセルロース分解酵素のセ
ルロース結合領域をアフィニティー精製用タグとして用
い、セルロースを担体とするアフィニティークロマトグ
ラフィーを用いる方法において、該融合タンパク質を精
製し、精製された融合タンパク質を特異的プロテアーゼ
処理して該融合タンパク質からアフィニティー精製用タ
グとして用いた所定のセルロース結合領域を含むペプチ
ド鎖を分離して、目的とする組換えタンパク質のみを、
セルロースを担体とするアフィニティークロマトグラフ
ィーを用い選択的に回収する方法により解決できる。[Means for Solving the Problems] The above-mentioned object is to use a cellulose-binding domain of a cellulolytic enzyme produced by Trichoderma reesei as an affinity purification tag of the present invention, in a method using affinity chromatography with cellulose as a carrier, The fusion protein is purified, and the purified fusion protein is treated with a specific protease to separate a peptide chain containing a predetermined cellulose binding region used as an affinity purification tag from the fusion protein to obtain a target recombinant protein. Only
The problem can be solved by a method of selectively recovering using affinity chromatography using cellulose as a carrier.

【００１２】新規なアフィニティー精製用タグとして、
セルロース分解酵素中に含まれるセルロース結合領域、
さらに詳しくは真核微生物であるトリコデルマリーゼイ
の産生するセルロース分解酵素のセルロース結合領域を
含むペプチド鎖を用いることにより、目的とする組換え
タンパク質を効率よく生産し、精製することが可能とな
る。As a novel affinity purification tag,
A cellulose binding region contained in a cellulolytic enzyme,
More specifically, by using a peptide chain containing a cellulose-binding domain of a cellulolytic enzyme produced by Trichoderma reesei, which is a eukaryotic microorganism, it becomes possible to efficiently produce and purify a target recombinant protein.

【００１３】これら分子量の小さいトリコデルマリーゼ
イのセルロース分解酵素のセルロース結合領域を含むペ
プチド鎖は、目的とする他のタンパク質と融合タンパク
質を構成した場合においても、該融合タンパク質中にお
いてセルロースに対する親和性を保持し、かつ該目的タ
ンパク質の正常なフォールディングを妨げず、その目的
タンパク質の機能に影響を与えない。The peptide chain containing the cellulose-binding domain of the cellulose-degrading enzyme of Trichoderma reesei having a small molecular weight has an affinity for cellulose in the fusion protein even when the fusion protein is constituted with another protein of interest. It does not interfere with the normal folding of the target protein and does not affect the function of the target protein.

【００１４】また、発現した融合タンパク質の立体障害
によっては、本来特異的プロテアーゼにより開裂可能な
アミノ酸配列が該プロテアーゼによる切断から保護され
る場合もある。リンカー領域をコードする遺伝子を、セ
ルロース結合領域をコードする遺伝子と該プロテアーゼ
の認識アミノ酸配列をコードする遺伝子のサブ配列との
間に配置することによって、発現した融合タンパク質に
おける立体障害による該アミノ酸配列の保護が解除さ
れ、該プロテアーゼ処理による目的タンパク質の回収が
可能になる。これは、発現した融合タンパク質中でリン
カー領域がセルロース結合領域と目的タンパク質とを結
ぶフレキシブルなヒンジとして働くため、リンカー領域
にとなりあって配置されたプロテアーゼ認識アミノ酸配
列が融合タンパク質表面に露出するためと推察された。Further, depending on the steric hindrance of the expressed fusion protein, the amino acid sequence which is originally cleavable by a specific protease may be protected from cleavage by the protease. By placing the gene encoding the linker region between the gene encoding the cellulose binding region and the subsequence of the gene encoding the recognition amino acid sequence of the protease, the amino acid sequence of the amino acid sequence due to steric hindrance in the expressed fusion protein is The protection is released, and the target protein can be recovered by the protease treatment. This is because the linker region in the expressed fusion protein acts as a flexible hinge that connects the cellulose binding region and the protein of interest, and the protease recognition amino acid sequence located adjacent to the linker region is exposed on the surface of the fusion protein. Was inferred.

【００１５】即ち、本発明は、該目的タンパク質をコー
ドする遺伝子と特定のリガンドに親和性を持つアフィニ
ティー精製用タグをコードする遺伝子とから構成される
融合遺伝子を、組換えタンパク質生産に好適な発現ベク
ターを用いて宿主生物中で発現させ、培養させる段階と
宿主生物中で産生された融合タンパク質を宿主生物中か
ら抽出し精製する段階とを含んでいる。精製段階はセル
ロース分解酵素のセルロース結合領域を含むペプチド鎖
であるアフィニティー精製用タグのセルロースに対する
親和性が該融合タンパク質中で保持されるようになって
いるため、融合タンパク質を含む菌体抽出物をセルロー
ス担体に接触させる段階で融合タンパク質はセルロース
担体に吸着される。セルロース担体に吸着されない不純
物の分離後、該融合タンパク質を溶出して回収すること
ができる。That is, according to the present invention, a fusion gene composed of a gene encoding the target protein and a gene encoding an affinity purification tag having an affinity for a specific ligand is suitably expressed in recombinant protein production. The step of expressing and culturing in the host organism using the vector and the step of extracting and purifying the fusion protein produced in the host organism from the host organism are included. In the purification step, the affinity of the affinity purification tag, which is a peptide chain containing the cellulose-binding domain of the cellulolytic enzyme, to cellulose is retained in the fusion protein. The fusion protein is adsorbed on the cellulose carrier in the step of contacting the cellulose carrier. After separation of impurities that are not adsorbed on the cellulose carrier, the fusion protein can be eluted and recovered.

【００１６】本発明の方法はさらに、特異的プロテアー
ゼにより認識され選択的に開裂するアミノ酸配列を、融
合タンパク質中の目的タンパク質とセルロース結合領域
を含む所定のペプチド鎖との間に配列することにより、
上記方法により精製した該融合タンパク質から、目的と
する組換えタンパク質とセルロース分解酵素のセルロー
ス結合領域を含むペプチド鎖とを該プロテアーゼ処理に
より選択的に分離するので、セルロース担体に接触させ
ることで回収することができる。セルロース分解酵素の
セルロース結合領域を含むペプチド鎖は、セルロースに
対する親和性が保たれるのでセルロース担体に吸着さ
れ、目的とする組換えタンパク質は吸着されず溶出して
くるので容易に分離可能である。The method of the present invention further comprises arranging an amino acid sequence which is recognized and selectively cleaved by a specific protease between the target protein in the fusion protein and a predetermined peptide chain containing a cellulose binding region,
From the fusion protein purified by the above method, the target recombinant protein and the peptide chain containing the cellulose-binding domain of the cellulolytic enzyme are selectively separated by the protease treatment, and thus recovered by contacting with a cellulose carrier. be able to. The peptide chain containing the cellulose-binding domain of the cellulolytic enzyme retains its affinity for cellulose and is adsorbed on the cellulose carrier, and the target recombinant protein elutes without being adsorbed, so that it can be easily separated.

【００１７】さらに本発明の一態様として、セルロース
結合領域を含むペプチド鎖をコードするＤＮＡをアミノ
酸配列をもとに設計し、その設計に基づいて化学合成し
た人工遺伝子を利用することが可能である。このような
化学合成した人工遺伝子を構築することにより、使用す
る宿主生物中での最適コドンに基づいてＤＮＡを設計す
ることができる。また、遺伝子操作に都合のよい制限酵
素の認識部位や外来遺伝子をクローニングするためのマ
ルチクローニングサイト、特異的プロテアーゼにより認
識され、選択的に開裂するアミノ酸配列をコードするサ
ブ配列などを人工遺伝子中に自由に導入することができ
るなどの利点がある。さらに種々のセルロース領域やリ
ンカー領域、及びマルチクローニングサイトや特異的プ
ロテアーゼ認識部位などをコードするＤＮＡの塩基配列
をそれぞれ遺伝子カセットとして用意しておき、目的と
する組換えタンパク質生産に好適な組合せを持つ人工遺
伝子を得ることも容易である。Furthermore, as one aspect of the present invention, it is possible to utilize an artificial gene in which a DNA encoding a peptide chain containing a cellulose binding region is designed based on an amino acid sequence and chemically synthesized based on the design. . By constructing such a chemically synthesized artificial gene, DNA can be designed based on the optimal codon in the host organism to be used. In addition, a restriction enzyme recognition site convenient for genetic manipulation, a multi-cloning site for cloning foreign genes, a subsequence that encodes an amino acid sequence that is recognized by a specific protease and selectively cleaved, etc. It has the advantage that it can be introduced freely. Furthermore, various cellulose regions and linker regions, and DNA nucleotide sequences encoding multiple cloning sites, specific protease recognition sites, etc. are prepared as gene cassettes, respectively, and have a combination suitable for the production of the target recombinant protein. It is also easy to obtain artificial genes.

【００１８】目的とする組換えタンパク質が元来分泌性
のタンパク質である場合には、適当な分泌シグナルをコ
ードするサブ配列を、融合タンパク質をコードする遺伝
子の上流に配置することにより、融合タンパク質をペリ
プラズム中に分泌させることも組換えタンパク質生産に
有利な方法である。When the recombinant protein of interest is an originally secretory protein, the fusion protein can be prepared by placing a subsequence encoding an appropriate secretion signal upstream of the gene encoding the fusion protein. Secretion into the periplasm is also an advantageous method for recombinant protein production.

【００１９】さらに、本発明の一態様によれば、培地中
への所定の化合物の添加、または温度などの培養条件に
より制御可能なプロモーターを持つ適当な発現ベクター
のプロモーター下流に、上述の融合遺伝子を組み込んだ
組換えプラスミドを作成し、まず、第１段階として該プ
ラスミドで形質転換した宿主生物を発現の抑制される条
件で培養し、増殖せしめた後、所定の化合物の添加、ま
たは温度などの培養条件の変更により融合遺伝子を発現
させることも組換えタンパク質生産に好適な方法であ
る。Further, according to one aspect of the present invention, the fusion gene described above is provided downstream of the promoter of an appropriate expression vector having a promoter that can be controlled by the addition of a predetermined compound into the medium or the culture conditions such as temperature. First, as a first step, a host organism transformed with the plasmid is cultured under the condition that expression is suppressed and allowed to grow, and then a predetermined compound is added, or the temperature is changed. Expressing the fusion gene by changing the culture conditions is also a suitable method for recombinant protein production.

【００２０】このようにして生産した融合タンパク質を
アフィニティークロマトグラフィー精製する段階に先立
って、まず、宿主菌から超音波または機械的破砕による
前処理を行って、該融合タンパク質を含む菌体抽出物を
回収する。アフィニティークロマトグラフィーに用いる
セルロース担体としては、市販されている種々のクロマ
トグラフィー用セルロースを利用することができるが、
好適には結晶性セルロース、例えばアビセルが、該融合
タンパク質の吸収容量が大きく、また、カラムへの充填
が容易で圧力損失も比較的小さいなど、クロマトグラフ
ィー操作の点から望ましい。Prior to the step of purifying the fusion protein thus produced by affinity chromatography, first, a pretreatment by ultrasonication or mechanical disruption is performed from a host bacterium to obtain a bacterial cell extract containing the fusion protein. to recover. As the cellulose carrier used for affinity chromatography, various commercially available celluloses for chromatography can be used.
Crystalline cellulose, for example, Avicel is preferable from the viewpoint of chromatographic operation because it has a large absorption capacity for the fusion protein, is easily packed in a column, and has a relatively small pressure loss.

【００２１】アフィニティークロマトグラフィーによる
精製段階に際し、融合タンパク質を含む菌体抽出物は、
セルロース担体への吸着に適したバッファー条件、例え
ばＥＧIIIのセルロース結合領域を用いた場合には、好
ましくはｐＨ６から７の１００ｍＭリン酸カリウムバッ
ファーに調製した後、セルロース担体に接触させ該融合
タンパク質のみを吸着せしめる。吸着方法としてはバッ
チ吸着法もしくはセルロース担体を充填したカラムへの
通液によって行われるが、通常は担体に吸着しなかった
不純物の分離や担体からの該融合タンパク質の回収操作
などの点から後者の方法が好適である。During the purification step by affinity chromatography, the bacterial cell extract containing the fusion protein is
Buffer conditions suitable for adsorption to a cellulose carrier, for example, when the cellulose binding region of EGIII is used, it is preferably adjusted to 100 mM potassium phosphate buffer having a pH of 6 to 7 and then contacted with a cellulose carrier to give only the fusion protein. Adsorb. The adsorption method is carried out by a batch adsorption method or by passing it through a column packed with a cellulose carrier, but the latter method is usually used in terms of separation of impurities not adsorbed on the carrier and recovery of the fusion protein from the carrier. The method is preferred.

【００２２】カラムを用いた場合、融合タンパク質のセ
ルロース担体への吸着が平衡状態に到達するように、好
ましくはカラム単位断面積当り２ｍｌ／ｃｍ²・ｈ程度
の比較的ゆっくりとした速度で該融合タンパク質を含む
菌体抽出物をカラムに通液し、該融合タンパク質のみを
吸着せしめる。この時、該融合タンパク質以外の菌体由
来の不純物は、セルロース担体に吸着されずにカラムを
通過するため除去されるが、さらに吸着に用いたバッフ
ァーをカラム容積の５倍から１０倍容量通液することに
より、カラムに残存する不純物を完全に除去することが
できる。When a column is used, the fusion is preferably carried out at a relatively slow rate of about ² ml / cm ² · h per unit cross-sectional area of the column so that the adsorption of the fusion protein on the cellulose carrier reaches an equilibrium state. The bacterial cell extract containing the protein is passed through the column to adsorb only the fusion protein. At this time, impurities derived from cells other than the fusion protein are removed because they pass through the column without being adsorbed on the cellulose carrier, and the buffer used for adsorption is further passed through a column volume 5 to 10 times. By doing so, impurities remaining in the column can be completely removed.

【００２３】セルロース担体に吸着した融合タンパク質
の回収は好適には以下のように行われる。即ち、セルロ
ース担体に吸着した融合タンパク質のカラムからの溶出
はイオン強度を下げることにより、即ちバッファーを水
に置換してカラムに通液することによって達成される。
これは、セルロース分解酵素のセルロース結合領域のセ
ルロースに対する吸着操作に疎水結合が関与しているた
めと考えられるが、この操作により、セルロース担体に
吸着した融合タンパク質は効率的に、かつ本来の活性を
失うことのない穏和な条件下で精製される。また、セル
ロース担体からの融合タンパク質の溶出は、ｐＨグラジ
エント法により溶出に用いるバッファーのｐＨを連続的
に変化させることによっても行うことが可能であるが、
この場合目的とする組換えタンパク質が溶出に用いるｐ
Ｈ条件で失活しないことが必要である。The fusion protein adsorbed on the cellulose carrier is preferably recovered as follows. That is, elution of the fusion protein adsorbed on the cellulose carrier from the column is achieved by lowering the ionic strength, that is, by substituting water for the buffer and passing it through the column.
It is considered that this is because the hydrophobic bond is involved in the adsorption operation of the cellulolytic enzyme for cellulose in the cellulose binding region. By this operation, the fusion protein adsorbed on the cellulose carrier efficiently and exhibits its original activity. Purified under mild conditions that will not be lost. The fusion protein can be eluted from the cellulose carrier by continuously changing the pH of the buffer used for elution by the pH gradient method,
In this case, the recombinant protein of interest is used for elution
It is necessary not to deactivate under H condition.

【００２４】本発明のさらに別の一態様によれば、目的
とする組換えタンパク質とセルロース結合領域との間に
特異的プロテアーゼにより選択的に開裂可能なアミノ酸
配列が挿入された融合タンパク質を上記のように精製し
た後、該プロテアーゼによる処理を行って、目的とする
組換えタンパク質を開裂分離させる。該融合タンパク質
の該開裂生成物を再度セルロース担体に接触させること
により、精製用タグとして用いたセルロース結合領域を
含むペプチド鎖をセルロース担体に吸着させることによ
り、カラムを通過した目的の組換えタンパク質のみを回
収することができる。[0024] According to still another aspect of the present invention, a fusion protein in which an amino acid sequence that can be selectively cleaved by a specific protease is inserted between the recombinant protein of interest and the cellulose-binding domain is described above. After purification as described above, the recombinant protein of interest is cleaved and separated by treatment with the protease. By bringing the cleavage product of the fusion protein into contact with the cellulose carrier again to adsorb the peptide chain containing the cellulose binding region used as the purification tag to the cellulose carrier, only the recombinant protein of interest that has passed through the column. Can be recovered.

【００２５】特異的プロテアーゼとしては、周知の種々
のプロテアーゼを使用することができるが、アミノ酸配
列に対する選択性などの点から好適にはファクターＸ
a、コラゲナーゼ、エンテロキナーゼ、トロンビンの４
つの特異的プロテアーゼの使用が望ましい。特異的プロ
テアーゼによる融合タンパク質の処理条件については、
それぞれのプロテアーゼの最適反応条件等を考慮して決
定すればよい。自明のことであるが、目的とする組換え
タンパク質が該プロテアーゼによって認識され、切断さ
れるアミノ酸配列を含まないことが必要である。As the specific protease, various well-known proteases can be used, but Factor X is preferable from the viewpoint of selectivity for the amino acid sequence.
a, collagenase, enterokinase, thrombin 4
The use of three specific proteases is desirable. Regarding the processing conditions of the fusion protein with the specific protease,
It may be determined in consideration of the optimum reaction conditions of each protease. Obviously, it is necessary that the recombinant protein of interest does not contain an amino acid sequence that is recognized and cleaved by the protease.

【００２６】[0026]

【実施例】以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説
明するが、これらの実施例は本発明を限定するものでは
ない。なお、特にことわりのない限り、実施例の中で用
いている遺伝子操作方法は、Maniatis等,Molecular Clo
nig,A LABORATORY MANUALSECOND EDITION,Cold SpringH
abour Laboratory,1989.に従った。EXAMPLES The present invention will be specifically described below based on examples, but these examples do not limit the present invention. Unless otherwise specified, the gene manipulation methods used in the examples are those described in Maniatis et al., Molecular Clo
nig, A LABORATORY MANUALSECOND EDITION, Cold SpringH
Abour Laboratory, 1989.

【００２７】（実施例１） （ＥＧIIIのセルロース結合領域を含むペプチド鎖をコ
ードする人工遺伝子カセットの構築）本実施例では、ト
リコデルマリーゼイの産生するセルロース分解酵素の一
つであるエンドグルカナーゼIII（以下、ＥＧIIIと略記
する）のセルロース結合領域とファクターＸa認識アミ
ノ酸配列をコードし、その下流に外来遺伝子導入用のマ
ルチクローニングサイトを有する全長１５２塩基対（以
下、ｂｐと略記する）の人工遺伝子カセットを構築した
（図１参照）。Example 1 (Construction of Artificial Gene Cassette Encoding Peptide Chain Containing Cellulose Binding Region of EGIII) In this example, endoglucanase III (one of cellulolytic enzymes produced by Trichoderma reesei) (Hereinafter, abbreviated as EGIII)), an artificial gene cassette having a total length of 152 base pairs (hereinafter abbreviated as bp) that encodes a cellulose-binding region and a factor Xa recognition amino acid sequence, and has a multicloning site for introducing a foreign gene in the downstream thereof. Was constructed (see FIG. 1).

【００２８】本遺伝子カセットの設計に関しては、以下
に示すようにその使用コドンに留意して設計を行った
（ベクターＤＮＡ／榊 佳之著，講談社サイエンティフ
ィク）。ただし、図１においてＮ末端から３４番目（開
始コドン由来のＭｅｔから数えて３５番目）のＧｌｎの
コドンは、制限酵素ＥｃｏＴ２２Iの制限サイトを設け
るために最適コドンであるＣＡＧからＣＡＡに変更して
ある。また、発現ベクターのクローニングの関係上、
５’側にＥｃｏＲIサイト、３’側にＨｉｎｄIIIサイト
を導入した。Regarding the design of this gene cassette, the design was carried out by paying attention to the used codons as follows (Vector DNA / Yoshiyuki Sakaki, Kodansha Scientific). However, the Gln codon at the 34th position from the N-terminus (35th position from the start codon-derived Met) in FIG. 1 has been changed from CAG, which is the optimum codon, to CAA, in order to provide a restriction site for the restriction enzyme EcoT22I. . Also, due to the cloning of the expression vector,
An EcoRI site was introduced on the 5'side and a HindIII site was introduced on the 3'side.

【００２９】実際の構築手段としては、まず全長１５２
ｂｐからなる遺伝子をコーディング鎖、アンチコーディ
ング鎖、それぞれ上下３本づつ合計６本の約５０ｍｅｒ
前後のオリゴＤＮＡ断片に分割し、化学合成した。化学
合成は、受託ＤＮＡ合成会社（サワデーテクノロジー
（株））に委託し、合成したオリゴＤＮＡを逆相カート
リッジで簡易精製した凍結乾燥品として受領した。この
６本のオリゴＤＮＡそれぞれ５０μｇを８％−８Ｍ尿素
ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりさらに精製し
た。次に、構築する遺伝子の上下各ストランドの５’末
端に相当する２本のオリゴＤＮＡを、ライゲーション時
の自己再結合を防ぐために除いた、残り４本のオリゴＤ
ＮＡ５’末端をそれぞれリン酸化した。即ち、オリゴＤ
ＮＡ各１μｇにＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造
社製）１０単位を加え、酵素に添付されている反応用５
×バッファーを用いて３７℃で１時間反応させた。この
反応物を９０℃で３分間処理し、酵素を失活させた。次
に、上下各ストランドの５’末端に相当する２本のオリ
ゴＤＮＡと、リン酸化した４本のオリゴＤＮＡの合計６
本それぞれ１μｇを混合し、９５℃で５分熱処理した
後、２００ｍｌの温浴中で室温まで徐冷することにより
アニールした。アニールしたオリゴＤＮＡの混合液にＡ
ＴＰを１ｍＭとなるように加えた後、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを１２．５単位加えて４℃で１２時間インキュベート
した。次いで、反応混合物からフェノール／クロロホル
ム抽出、エタノール沈澱により目的物を含む成分を分取
した後、８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりこ
れを精製した。即ち、φＸ１７４のＨｉｎｃII消化断片
マーカーを目印に、目的遺伝子のサイズに相当するバン
ドを切り出した後、このバンドを含むゲル片より電気溶
出法によって１５２ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、フェノ
ール／クロロホルム抽出、エタノール沈澱により精製し
た。得られたＤＮＡペレットを２０μｌの１０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）バッファー
（以下、ＴＥと略記する）に溶解し、これを人工遺伝子
カセットＤＮＡ溶液とした。As an actual construction means, first, the total length 152
About 50 mer of 6 bp gene consisting of coding chain and anti-coding chain, 3 each in upper and lower parts
It was divided into front and rear oligo DNA fragments and chemically synthesized. The chemical synthesis was outsourced to a DNA synthesis company (Sawasde Technology Co., Ltd.), and the synthesized oligo DNA was received as a freeze-dried product simply purified by a reverse phase cartridge. 50 μg of each of the 6 oligo DNAs was further purified by 8% -8M urea polyacrylamide gel electrophoresis. Next, two oligo DNAs corresponding to the 5'ends of the upper and lower strands of the gene to be constructed were removed in order to prevent self-rejoining during ligation, and the remaining four oligo D
The NA5 'ends were phosphorylated. That is, oligo D
10 units of T4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo Co., Ltd.) was added to 1 μg of each NA, and 5 for reaction attached to the enzyme was added.
The reaction was carried out at 37 ° C. for 1 hour using a buffer. The reaction was treated at 90 ° C. for 3 minutes to inactivate the enzyme. Next, two oligo DNAs corresponding to the 5'ends of each of the upper and lower strands and four phosphorylated oligo DNAs for a total of 6
1 μg of each of these was mixed, heat-treated at 95 ° C. for 5 minutes, and then annealed by gradually cooling to room temperature in a 200 ml warm bath. A to the mixture of annealed oligo DNA
After adding TP to 1 mM, 12.5 units of T4 DNA ligase was added and incubated at 4 ° C. for 12 hours. Then, the reaction mixture was extracted with phenol / chloroform and precipitated with ethanol to separate a component containing the desired product, and then purified by 8% polyacrylamide gel electrophoresis. That is, a band corresponding to the size of the gene of interest was cut out using the HincII digested fragment marker of φX174 as a marker, and a 152 bp DNA fragment was recovered from the gel piece containing this band by electroelution and extracted with phenol / chloroform and ethanol. Purified by precipitation. The obtained DNA pellet was dissolved in 20 μl of 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 8) buffer (hereinafter abbreviated as TE), and this was used as an artificial gene cassette DNA solution.

【００３０】（実施例２） （ＥＧIIIのリンカー領域を含むペプチド鎖をコードす
る人工遺伝子カセットの構築）本実施例では、トリコデ
ルマリーゼイの産生するセルロース分解酵素の一つであ
るＥＧIIIのリンカー領域とファクターＸa認識アミノ酸
配列を含むペプチド鎖をコードする全長１２４ｂｐの人
工遺伝子カセットを構築した（図３参照）。Example 2 (Construction of Artificial Gene Cassette Encoding Peptide Chain Containing EGIII Linker Region) In this example, a linker region of EGIII, which is one of the cellulolytic enzymes produced by Trichoderma reesei, was used. A 124 bp full-length artificial gene cassette encoding a peptide chain containing the Factor Xa recognition amino acid sequence was constructed (see FIG. 3).

【００３１】後の組換えＤＮＡ実験において本遺伝子カ
セットを実施例１で構築した遺伝子カセットに挿入し、
図２に示されるＤＮＡの塩基配列を有する新たな遺伝子
カセットを構築するため、その５’末端側にＥｃｏＴ２
２Iサイト、３’末端側にＸｂａIサイトを導入してあ
る。本遺伝子カセットの設計に関しては、実施例１と同
様に基本的に大腸菌の最適コドンのみを使用している
が、図３のＮ末端のＰｒｏコドンについては、その後の
遺伝子操作に不都合な制限サイトを除去するために、最
適コドンであるＣＣＧからＣＣＡに変更してある。In the subsequent recombinant DNA experiment, this gene cassette was inserted into the gene cassette constructed in Example 1,
In order to construct a new gene cassette having the nucleotide sequence of DNA shown in FIG.
2I site, XbaI site is introduced at the 3'end side. Regarding the design of this gene cassette, basically only the optimal codon of E. coli is used as in Example 1, but the N-terminal Pro codon in FIG. 3 has a restriction site that is inconvenient for subsequent gene manipulation. The optimal codon, CCG, has been changed to CCA for removal.

【００３２】実際の構築方法は、実施例１とほぼ同様の
実験手順で行った。即ち、全長１２４ｂｐからなる遺伝
子をコーディング鎖３本、アンチコーディング鎖４本の
上下約３０ｍｅｒから４０ｍｅｒ前後の合計７本のオリ
ゴＤＮＡ断片に分割し、化学合成した。化学合成は、受
託ＤＮＡ合成会社（日本バイオサービス（株））に委託
し、合成したオリゴＤＮＡを高速液体クロマトグラフィ
ーにより高純度に精製した凍結乾燥品として受領した。
次に構築する上下各ストランドの５’末端に相当する２
本のオリゴＤＮＡをライゲーション時の自己再結合を防
ぐために、除いた残り５本のオリゴＤＮＡの１μｇを実
施例１と同様にリン酸化した。次に、上下各ストランド
の５’末端に相当する２本のオリゴＤＮＡと、リン酸化
した５本のオリゴＤＮＡの合計７本それぞれ１μｇを混
合し、９５℃で５分熱処理した後、２００ｍｌの温浴中
で室温まで徐冷することによりアニールした。アニール
したオリゴＤＮＡの混合溶液にＡＴＰを１ｍＭとなるよ
うに加えた後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１２．５単位加えて
４℃で１２時間インキュベートした。ついで、反応混合
物をフェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈澱に
より目的物を含む成分を分取し、８％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により精製した。精製は、実施例１と同
様に行い、１２４ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、フェノー
ル／クロロホルム抽出、エタノール沈澱を行った後、得
られたＤＮＡペレットを２０μｌのＴＥに溶解し、これ
を人工遺伝子カセットＤＮＡ溶液とした。The actual construction method was carried out in the same experimental procedure as in Example 1. That is, a gene having a total length of 124 bp was divided into a total of 7 oligo DNA fragments of about 30 mer to about 40 mer at the upper and lower sides of 3 coding chains and 4 anticoding chains, and chemically synthesized. Chemical synthesis was outsourced to a DNA synthesis company (Japan Bioservices Co., Ltd.), and the synthesized oligo DNA was received as a lyophilized product that was purified to high purity by high performance liquid chromatography.
2 corresponding to the 5'ends of the upper and lower strands to be constructed next
In order to prevent self-re-ligation of this oligo DNA during ligation, 1 μg of the remaining 5 oligo DNAs removed were phosphorylated in the same manner as in Example 1. Next, two oligo DNAs corresponding to the 5'end of each of the upper and lower strands and a total of seven phosphorylated five oligo DNAs, 1 μg each, were mixed, heat-treated at 95 ° C. for 5 minutes, and then heated in a 200 ml warm bath. Annealing was performed by slowly cooling to room temperature. ATP was added to the annealed mixed solution of oligo DNA so that the concentration was 1 mM, 12.5 units of T4 DNA ligase was added, and the mixture was incubated at 4 ° C. for 12 hours. Then, the reaction mixture was subjected to phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation to separate the components containing the desired product, and the components were purified by 8% polyacrylamide gel electrophoresis. Purification was carried out in the same manner as in Example 1, the 124 bp DNA fragment was recovered, phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation were carried out, and the obtained DNA pellet was dissolved in 20 μl of TE to prepare an artificial gene cassette DNA. It was a solution.

【００３３】（実施例３） （図４に発現ベクターｐＫＥ３０１の構築を図式的に示
す）本実施例では、実施例１で構築した人工遺伝子カセ
ットをｔａｃプロモーターを有する大腸菌用の高発現ベ
クターｐＫＫ２２３−３に組み込んだ、トリコデルマリ
ーゼイＥＧIIIのセルロース結合領域とのファクターＸa
認識アミノ酸配列をコードし、外来遺伝子導入用のマル
チクローニングサイトを有するアフィニティーフュージ
ョン用発現ベクターｐＫＥ３０１を構築した。Example 3 (The construction of the expression vector pKE301 is schematically shown in FIG. 4) In this example, the artificial gene cassette constructed in Example 1 was used as a high expression vector pKK223- for E. coli having a tac promoter. Factor Xa with the cellulose binding region of Trichoderma reesei EGIII
An expression vector pKE301 for affinity fusion, which encodes a recognition amino acid sequence and has a multi-cloning site for introducing a foreign gene, was constructed.

【００３４】構築は以下の手順に従って行った。まず、
ｐＫＫ２２３−３（ファルマシア社製）３μｇを常法に
従って、制限酵素ＥｃｏＲI及びＨｉｎｄIII（宝酒造社
製）によって３７℃で３時間消化した後、フェノール／
クロロホルム抽出を２回繰り返し、エタノール沈澱を行
って精製した後、得られたＤＮＡペレットを２０μｌの
ＴＥに溶解した。このように調製したベクタープラスミ
ド０．１μｇと、実施例１で構築し、精製した人工遺伝
子カセット０．１μｇとを混合し、市販のライゲーショ
ンキット（宝酒造社製）を用いて１２℃で４時間結合反
応を行った。この結合反応物を大腸菌ＪＭ１０９コンピ
テントセル（東洋紡社製）に形質転換し、バクトトリプ
トン（ディフコ社製）２％、酵母エキス（ディフコ社
製）０．５％、ＮａＣｌ １％、アンピシリン（ベーリ
ンガー社製）５０μｇ／ｍｌバクトアガー（ディフコ社
製）１．５％からなるＬＢ寒天プレート培地に塗抹し、
３７℃で１６時間培養した。出現した形質転換体のコロ
ニー１２株をランダムにピックアップし、４ｍｌのＬＢ
培地（アンピシリンを含む）に植菌し、３７℃で８時間
培養した後、遠心分離処理により菌体ペレットを回収し
た。回収した菌体ペレットからアルカリ溶菌法によりプ
ラスミドＤＮＡを抽出し、その一部をＥｃｏＴ１４I
（宝酒造社製）と、ＥｃｏＴ２２I（宝酒造社製）で消
化して、１％(W/V)アガロースゲル電気泳動で分析した
ところ、１２株の内、１０株が目的の組換えプラスミド
を持つ組換え体であった。この内の一株、＃９株を５０
０ｍｌのＬＢ培地（アンピシリンを含む）に植菌し、３
７℃で１６時間培養した後、遠心分離によって集菌した
ペレットからアルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを
抽出し、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈
澱を行った。次に、得られたＤＮＡペレットを１．５ｍ
ｌのＴＥに溶解し、１０ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡ（日
本ジーン社製）を１／１００容加えて３７℃で３０分間
インキュベートし、夾雑するＲＮＡを分解した後、さら
にバイオジェルＡ−５０（バイオラッド社製）を用いた
ゲル濾過法による精製を行った。これにより発現ベクタ
ー、ｐＫＥ３０１約６６０μｇを調製した。Construction was performed according to the following procedure. First,
3 μg of pKK223-3 (Pharmacia) was digested with restriction enzymes EcoRI and HindIII (Takara Shuzo) at 37 ° C. for 3 hours according to a conventional method, and then phenol /
Chloroform extraction was repeated twice, ethanol precipitation was performed for purification, and the obtained DNA pellet was dissolved in 20 μl of TE. 0.1 μg of the vector plasmid thus prepared was mixed with 0.1 μg of the artificial gene cassette constructed and purified in Example 1 and ligated at 12 ° C. for 4 hours using a commercially available ligation kit (Takara Shuzo). The reaction was carried out. The ligation reaction product was transformed into Escherichia coli JM109 competent cell (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), and 2% bactotryptone (manufactured by Difco), yeast extract (manufactured by Difco) 0.5%, NaCl 1%, ampicillin (Boehringer). Co., Ltd.) 50 μg / ml Bacto agar (manufactured by Difco) 1.5% on LB agar plate medium,
It was cultured at 37 ° C for 16 hours. Twelve transformant colonies that appeared were picked up randomly and 4 ml of LB
After inoculating the medium (containing ampicillin) and culturing at 37 ° C. for 8 hours, the cell pellet was collected by centrifugation. Plasmid DNA was extracted from the recovered cell pellet by the alkaline lysis method, and a part of it was EcoT14I.
Digested with (Takara Shuzo) and EcoT22I (Takara Shuzo) and analyzed by 1% (W / V) agarose gel electrophoresis, 10 out of 12 strains had the target recombinant plasmid. It was a substitute. One of these, # 9, 50
0 ml of LB medium (containing ampicillin) was inoculated and 3
After culturing at 7 ° C. for 16 hours, the plasmid DNA was extracted from the pellet collected by centrifugation by the alkaline lysis method, followed by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation. Next, the obtained DNA pellet is
After dissolving in TE of 1 and adding 1/100 volume of 10 mg / ml of RNase A (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) and incubating at 37 ° C. for 30 minutes to decompose contaminating RNA, Biogel A-50 (Bio-Rad) was further added. (Manufactured by the company) was purified by a gel filtration method. This prepared about 660 μg of an expression vector, pKE301.

【００３５】（実施例４） （図４に発現ベクターｐＫＥ３１１の構築を図式的に示
す）本実施例では、実施例３で構築したアフィニティー
フュージョン用発現ベクターｐＫＥ３０１に実施例２で
構築した人工遺伝子カセットを組み込んだ、トリコデル
マリーゼイＥＧIIIのセルロース結合領域とリンカー領
域、ファクターＸa認識アミノ酸配列をコードし、外来
遺伝子導入用のマルチクローニングサイトを有するアフ
ィニティーフュージョン用発現ベクターｐＫＥ３１１を
構築した。Example 4 (The construction of the expression vector pKE311 is schematically shown in FIG. 4) In this example, the artificial gene cassette constructed in Example 2 was added to the expression vector pKE301 for affinity fusion constructed in Example 3. Was constructed to encode the cellulose binding region and linker region of Trichoderma reesei EGIII, the amino acid sequence recognizing Factor Xa, and the expression vector pKE311 for affinity fusion having a multiple cloning site for introducing a foreign gene was constructed.

【００３６】構築の手順を以下に述べる。まず、３μｇ
のｐＫＥ３０１をＥｃｏＴ２２IとＸｂａIで３７℃で３
時間消化した後、フェノール／クロロホルム抽出を２回
繰り返し、エタノール沈澱を行って精製した後、得られ
たＤＮＡペレットを２０μｌのＴＥに溶解した。このよ
うにして調製したベクタープラスミド０．１μｇと、実
施例２で調製したリンカー領域を含むペプチド鎖をコー
ドする遺伝子カセット０．１μｇとを混合し、ライゲー
ションキット（宝酒造社製）を用いて４℃で１７時間、
結合反応を行った。この結合反応物を実施例３と同様に
大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（東洋紡社製）に形
質転換したところ、目的の組換えプラスミドを持つ８株
の組換え体が得られた。この内の一株＃２株を５００ｍ
ｌのＬＢ培地（アンピシリンを含む）に植菌し３７℃で
１８時間培養した後、遠心分離によって集菌したペレッ
トからアルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを抽出
し、実施例３と同様に精製を行った。これにより発現ベ
クター、ｐＫＥ３１１約５４０μｇを調製した。The procedure of construction will be described below. First, 3 μg
PKE301 of 3 with EcoT22I and XbaI at 37 ° C
After digestion for an hour, phenol / chloroform extraction was repeated twice, ethanol precipitation was performed for purification, and the obtained DNA pellet was dissolved in 20 μl of TE. 0.1 µg of the vector plasmid thus prepared was mixed with 0.1 µg of the gene cassette encoding the peptide chain containing the linker region prepared in Example 2, and the mixture was ligated at 4 ° C using a ligation kit (Takara Shuzo). 17 hours,
The binding reaction was performed. When this ligation reaction product was transformed into Escherichia coli JM109 competent cell (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) in the same manner as in Example 3, eight recombinants having the target recombinant plasmid were obtained. One of these, # 2, 500m
1 LB medium (containing ampicillin) was inoculated and cultured at 37 ° C. for 18 hours, and then the plasmid DNA was extracted from the pellet collected by centrifugation by the alkaline lysis method and purified in the same manner as in Example 3. . This prepared about 540 μg of an expression vector, pKE311.

【００３７】（実施例５） （図５にβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質発現用プ
ラスミドｐＫＥ３０１−ｌａｃＺの構築を図式的に示
す）本実施例では、実施例３で構築したアフィニティー
フュージョン用発現ベクターｐＫＥ３０１のマルチクロ
ーニングサイトにβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃ
Ｚ）をクローニングしたβ−ガラクトシダーゼ融合タン
パク質発現用プラスミド、ｐＫＥ３０１−ｌａｃＺを構
築した。(Example 5) (Fig. 5 schematically shows the construction of the plasmid pKE301-lacZ for expressing β-galactosidase fusion protein) In this example, the multiplicity of the expression vector pKE301 for affinity fusion constructed in Example 3 was used. The β-galactosidase gene (lac
Z) was cloned to construct a plasmid for expressing β-galactosidase fusion protein, pKE301-lacZ.

【００３８】β−ガラクトシダーゼは、乳糖をガラクト
ースとグルコースに分解する酵素で、分子量１１６Ｋダ
ルトンのサブユニットからなる４量体を形成する大腸菌
のタンパク質であり、約３．１ｋｂの大きさのｌａｃＺ
遺伝子にコードされている。本実施例で構築したプラス
ミド、ｐＫＥ３０１−ｌａｃＺは、β−ガラクトシダー
ゼをファクターＸaの認識アミノ酸配列を介して、トリ
コデルマリーゼイＥＧIIIのセルロース結合領域との融
合タンパク質として発現させるためのプラスミドであ
る。Β-galactosidase is an enzyme that decomposes lactose into galactose and glucose, is a protein of Escherichia coli that forms a tetramer composed of subunits having a molecular weight of 116 KDa, and has a size of about 3.1 kb, lacZ.
It is encoded by the gene. The plasmid constructed in this Example, pKE301-lacZ, is a plasmid for expressing β-galactosidase as a fusion protein with the cellulose-binding domain of Trichoderma reesei EGIII via the recognition amino acid sequence of factor Xa.

【００３９】構築の手順を以下に述べる。まず、３μｇ
のｐＫＥ３０１をＨｉｎｄIIIで３７℃で３時間消化し
た後、アルカリフォスファターゼ（Calf Intestine Alk
aline Phosphatase、宝酒造社製）２７単位と、該酵素
に添付の反応用１０×バッファーを１／１０容加えて３
７℃で１時間インキュベートし、ベクターの５’末端を
脱リン酸化した。さらに、フェノール／クロロホルム抽
出を２回繰り返し、エタノール沈澱を行って精製した
後、得られたＤＮＡペレットを２０μｌのＴＥに溶解し
た。The procedure of construction will be described below. First, 3 μg
PKE301 was digested with HindIII at 37 ° C for 3 hours, and then alkaline phosphatase (Calf Intestine Alk
aline Phosphatase (Takara Shuzo Co., Ltd.) 27 units and 1/10 volume of the reaction-use 10 × buffer attached to the enzyme to give 3
After incubating at 7 ° C for 1 hour, the 5'end of the vector was dephosphorylated. Further, phenol / chloroform extraction was repeated twice, ethanol precipitation was performed for purification, and the obtained DNA pellet was dissolved in 20 μl of TE.

【００４０】次に、ｌａｃＺ断片の調製について述べ
る。まず、ｐＭＣ１８７１（ファルマシア社製）２０μ
ｇをＢａｍＨIとＥｃｏＴ２２Iにより３７℃で３時間消
化した後、１％(W/V)アガロース電気泳動により、約
３．１ｋｂの大きさのｌａｃＺ断片を回収し、フェノー
ル／クロロホルム抽出、エタノール沈澱により精製し
た。得られたＤＮＡペレットを２０μｌの滅菌水に溶解
した後、ＢａｍＨI消化で生じた５’突出末端を埋め戻
して平滑末端とするためにクレノー酵素（日本ジーン社
製）による処理を行った。即ち、該酵素に添付の反応用
１０×バッファーを１／１０容と４種類のｄＮＴＰｓそ
れぞれ０．２５ｍＭを加えて３７℃で１０分間保温した
後、４単位の該酵素を加えて室温で３０分放置した。７
０℃で５分間処理することによりクレノー酵素を失活さ
せた後、エタノール沈澱を行ってＤＮＡペレットを得
た。得られたＤＮＡペレットを２０μｌの滅菌水に溶解
した後、このｌａｃＺ断片を先に調製したＨｉｎｄIII
消化したベクタープラスミド、ｐＫＥ３０１にクローニ
ングするために５’末端がリン酸化されたｐＨｉｎｄII
IリンカーＤＮＡ（宝酒造社製） ｄ（ｐＣＡＡＧＣＴＴＧ） を、ｌａｃＺ断片の平滑化した両末端に平滑末端ライゲ
ーションにより結合した。反応はライゲーションキット
（宝酒造社製）を用いて行い、４℃で１５時間反応後、
６５℃で２０分間処理して反応混合物中のＤＮＡリガー
ゼを失活させた後、ＨｉｎｄIII消化した。消化物を１
％(W/V)アガロースゲル電気泳動にかけることにより、
未反応のリンカーＤＮＡ等を分離して、両端にそれぞれ
１分子づつのリンカーＤＮＡの付加したｌａｃＺ断片を
回収した。このようにして調製したｌａｃＺ・ｐＨｉｎ
ｄIII断片０．１μｇと、先に調製したＨｉｎｄIII消化
したベクタープラスミド、ｐＫＥ３０１−０．１μｇと
を混合し、ライゲーションキット（宝酒造社製）を用い
て結合反応を１２℃で４時間行った。この結合反応物を
実施例３と同様に大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル
（東洋紡社製）に形質転換したところ、目的の組換えプ
ラスミドを持つ４株の組換え体が得られ、このうちの一
株、＃６株を組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＥ３０１−
ｌａｃＺ株と命名した。Next, the preparation of the lacZ fragment will be described. First, pMC1871 (Pharmacia) 20μ
g was digested with BamHI and EcoT22I at 37 ° C. for 3 hours, and the lacZ fragment having a size of about 3.1 kb was recovered by 1% (W / V) agarose electrophoresis, and purified by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation. did. The obtained DNA pellet was dissolved in 20 μl of sterilized water, and then treated with Klenow enzyme (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) to backfill the 5 ′ protruding end generated by BamHI digestion to make a blunt end. That is, 1/10 volume of 10 × buffer for reaction attached to the enzyme and 0.25 mM of each of the 4 kinds of dNTPs were added and incubated at 37 ° C. for 10 minutes, and then 4 units of the enzyme was added and kept at room temperature for 30 minutes. I left it. 7
The Klenow enzyme was inactivated by treatment at 0 ° C. for 5 minutes, and then ethanol precipitation was performed to obtain a DNA pellet. The obtained DNA pellet was dissolved in 20 μl of sterilized water, and this lacZ fragment was prepared using HindIII.
Digested vector plasmid, pHindII phosphorylated at the 5'end for cloning into pKE301
I linker DNA (Takara Shuzo) d (pCAAGCTTG) was ligated to both blunt ends of the lacZ fragment by blunt end ligation. The reaction was performed using a ligation kit (manufactured by Takara Shuzo), after reacting at 4 ° C for 15 hours,
After treatment at 65 ° C for 20 minutes to inactivate the DNA ligase in the reaction mixture, it was digested with HindIII. 1 digest
% (W / V) by agarose gel electrophoresis,
Unreacted linker DNA and the like were separated, and a lacZ fragment having one molecule of linker DNA added to each end was recovered. LacZ.pHin thus prepared
0.1 µg of the dIII fragment was mixed with the previously prepared HindIII-digested vector plasmid, pKE301-0.1 µg, and the ligation reaction was carried out at 12 ° C for 4 hours using a ligation kit (Takara Shuzo). When this ligation reaction product was transformed into Escherichia coli JM109 competent cell (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) in the same manner as in Example 3, 4 recombinants having the desired recombinant plasmid were obtained. # 6 strain was used as recombinant E. coli JM109 / pKE301-
It was named lacZ strain.

【００４１】（実施例６） （図５にβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質発現用プ
ラスミドｐＫＥ３１１−ｌａｃＺの構築を図式的に示
す）本実施例では、実施例４で構築したアフィニティー
フュージョン用発現ベクターｐＫＥ３１１のマルチクロ
ーニングサイトにβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃ
Ｚ）をクローニングしたβ−ガラクトシダーゼ融合タン
パク質発現用プラスミド、ｐＫＥ３１１−ｌａｃＺを構
築した。(Example 6) (Fig. 5 schematically shows the construction of the plasmid pKE311-lacZ for expressing β-galactosidase fusion protein) In this example, the multiplicity of the expression vector pKE311 for affinity fusion constructed in Example 4 was used. The β-galactosidase gene (lac
Z) was cloned to construct a β-galactosidase fusion protein expression plasmid, pKE311-lacZ.

【００４２】本実施例で構築したプラスミド、ｐＫＥ３
１１−ｌａｃＺは、β−ガラクトシダーゼをファクター
Ｘaの認識アミノ酸配列を介して、トリコデルマリーゼ
イＥＧIIIのリンカー領域を含むセルロース結合領域と
の融合タンパク質として発現させるためのプラスミドで
ある。The plasmid, pKE3, constructed in this example.
11-lacZ is a plasmid for expressing β-galactosidase as a fusion protein with the cellulose binding region containing the linker region of Trichoderma reesei EGIII via the recognition amino acid sequence of Factor Xa.

【００４３】以下に示す手順に従って本プラスミドの構
築を行った。まず、３μｇのｐＫＥ３１１を実施例５と
同様にＨｉｎｄIIIで３７℃で３時間消化した後、アル
カリフォスファターゼ処理を行って５’末端を脱リン酸
化し、ＨｉｎｄIII消化したベクタープラスミド、ｐＫ
３１１を調製する。このベクタープラスミドに実施例５
で調製したｌａｃＺ・ｐＨｉｎｄIII断片をクローニン
グした。実施例５と同様に大腸菌ＪＭ１０９コンピテン
トセルに形質転換したところ、目的の組換えプラスミド
を持つ５株の組換え体が得られ、このうちの一株、＃１
１株を組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＥ３１１−ｌａｃ
Ｚ株と命名した。This plasmid was constructed according to the procedure shown below. First, 3 μg of pKE311 was digested with HindIII at 37 ° C. for 3 hours in the same manner as in Example 5, then treated with alkaline phosphatase to dephosphorylate the 5 ′ end, and HindIII-digested vector plasmid, pK.
Prepare 311. Example 5 was added to this vector plasmid.
The lacZ.pHindIII fragment prepared in 1. was cloned. When E. coli JM109 competent cells were transformed in the same manner as in Example 5, 5 recombinants having the desired recombinant plasmid were obtained, one of which, # 1.
1 strain of recombinant E. coli JM109 / pKE311-lac
It was named Z strain.

【００４４】（実施例７） （組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＥ３０１−ｌａｃＺ株
の培養によるβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の生
産）本実施例では、組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＥ３
０１−ｌａｃＺ株の培養によるβ−ガラクトシダーゼ融
合タンパク質の生産について検討を行った。(Example 7) (Production of β-galactosidase fusion protein by culturing recombinant E. coli JM109 / pKE301-lacZ strain) In this example, recombinant E. coli JM109 / pKE3 was produced.
The production of β-galactosidase fusion protein by culturing the 01-lacZ strain was examined.

【００４５】実験は以下のように行った。まず、組換え
大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＥ３０１−ｌａｃＺ株をＬＢ培
地３０ｍｌに植菌し、３７℃で終夜培養を行った後、５
００ｍｌのＬＢ培地（アンピシリンを含む）の入ったバ
ッフル付き２０００ｍｌ三角フラスコに１％の菌液を接
種し、３７℃で振とう培養を行った。組換えプラスミド
ｐＫＥ３０１−ｌａｃＺはｔａｃプロモーターの制御下
におかれるため、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰ
ＴＧ）の非存在下で遺伝子の発現は完全に抑制される。
約３時間後、菌体が十分に増殖し、菌体濃度の指標とな
る波長６６０ｎｍにおける培養液の濁度（ＯＤ₆₆₀）が
約２となった時点でＩＰＴＧ（宝酒造社製）１ｍＭを培
養液に加えて、ｔａｃプロモーターを誘導し、さらに４
時間培養を継続した。本実施例では、β−ガラクトシダ
ーゼは、ファクターＸaの認識アミノ酸配列を介してト
リコデルマリーゼイＥＧIIIのセルロース結合領域と結
合した融合タンパク質として発現され、組換え大腸菌の
細胞質に蓄積される。培養終了後、遠心分離により菌体
を回収し、β−ガラクトシダーゼ活性を測定したとこ
ろ、培養液１ｍｌ当たり約３７００ユニットに達してい
た。β−ガラクトシダーゼ活性の測定はBittner等の方
法（Bittner,M.,＆ Vapnek,d.Gene 15,319-329,1981）
を用いて行い、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシド（ＯＮＰＧ：シグマ社製）を基質として、温
度３０℃、ｐＨ７において１分間に１ｎｍｏｌのＯＮＰ
Ｇを加水分解する酵素量を１ユニットとした。本実験結
果から、トリコデルマリーゼイＥＧIIIのセルロース結
合領域をβ−ガラクトシダーゼに融合させて発現させた
場合、該領域が該融合タンパク質中においてβ−ガラク
トシダーゼの活性に影響を及ぼさないことが明らかとな
った。さらに、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、菌体試料を分析したとこ
ろ、ＤＮＡの塩基配列から予想される分子量約１２０Ｋ
ダルトンの位置に該融合タンパク質のバンドが認められ
た。次に、回収した菌体試料を５０ｍＭリン酸カリウム
バッファー（ｐＨ７）で１回洗浄した後、菌体由来のプ
ロテアーゼによる分解を防ぐために、１ｍＭのフェニル
メタンスルホニルフルオライド（Phenylmethanesulfony
lfluoride：ＰＭＳＦ：ベーリンガー社製）と、５ｍＭ
のＥＤＴＡを含む１００ｍＭリン酸カリウムバッファー
（ｐＨ７）５０ｍｌに懸濁し、超音波ホモジナイザー
（ブランソン社製モデル２５０）を用いてｏｕｔｐｕｔ
１０，ｄｕｔｙ５０％で１０分間破砕した。高速遠心分
離機（日立製作所社製ＳＣＲ２０ＢＡ）により２度の遠
心分離処理を行って、破砕物から不溶物を沈澱として取
り除き、清澄化した。この操作により、β−ガラクトシ
ダーゼ融合タンパク質は可溶性画分として上清中に回収
された。次に、この溶液を１００ｍＭリン酸カリウムバ
ッファー（ｐＨ７）で全量を１５０ｍｌに希釈した。こ
の希釈液を、４℃に制御されたクロマトチャンバー（日
本フリーザー社製ＮＣ−１６）中に設置されたアビセル
（旭化成社製）約４０ｇを充填した直径２．５ｃｍ，高
さ３０ｃｍのガラス製カラム（バイオラッド社製エコノ
カラム）に１０ｍｌ／ｈｒの流速で通液し、β−ガラク
トシダーゼ融合タンパク質をアビセルに吸着させた。カ
ラムに吸着しなかった不純物を除くために、１Ｍ Ｎａ
Ｃｌを含む１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ
７）７５０ｍｌでカラムを洗浄した後、グラジエント溶
出法により、カラム液を１００ｍＭリン酸カリウムバッ
ファー（ｐＨ７）から水に連続的に置換してβ−ガラク
トシダーゼ融合タンパク質の溶出を行った。グラジエン
ト溶出は、手製の２連ビーカー式グラジエント作製装置
（タンパク質精製法／ロバート Ｋ．スコープス著，塚
田欣司監訳，シュプリンガー・フェアラーク東京）を用
いて以下のように行った。まず、５０ｍｌの１００ｍＭ
リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７）とスターラーバー
の入ったビーカーＡと１０００ｍｌの水の入ったビーカ
ーＢを連結した。次に、ビーカーＡをマグネチックスタ
ーラーで攪拌しながらチューブポンプ（ギルソン社製ミ
ニパルス３）を用いてビーカーＡよりカラムへ所定の流
量で通液することにより、サイホン現象を利用してビー
カーＢからビーカーＡに水を供給して徐々にカラム溶出
液を水に置換した。以上の方法によりグラジエント溶出
を行った。溶出は４０ｍｌ／ｈｒの速度で行い、溶離液
５ｍｌごとに、フラクションを集めて波長２８０ｎｍに
おける吸光度（Ａ₂₈₀）と、β−ガラクトシダーゼ活性
を測定した（図６参照）。β−ガラクトシダーゼ活性の
ピークを示すフラクションを１つにまとめて、タンパク
質濃度とβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。タンパ
ク質濃度の測定は、牛のガンマグロブリンを標準タンパ
ク質として、ブラッドフォード法によるプロティンアッ
セイキット（バイオラッド社製）を用いて行った。ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ電気泳動−銀染色法によりピークフラクシ
ョンを分析した結果、ほぼ単一タンパク質にまで精製さ
れていることが分かった。また、本融合タンパク質の比
活性は、標品として用いた大腸菌のネイティブなβ−ガ
ラクトシダーゼ（ベーリンガー社製）の比活性とほぼ同
等のタンパク質１ｍｇあたり約９万５千ユニットであっ
た。次に、精製したβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク
質をファクターＸaで処理することにより、本融合タン
パク質中に挿入されているファクターＸa認識アミノ酸
配列を開裂してβ−ガラクトシダーゼを回収できるか検
討を行った。ファクターＸaによる処理は以下のように
行った。即ち、精製したβ−ガラクトシダーゼ融合タン
パク質１ｍｇを２０ｍＭトリス−ＨＣｌ，１００ｍＭ
ＮａＣｌ（ｐＨ８）バッファーに溶解した後、ファクタ
ーＸa（宝酒造社製）０．０１ｍｇを加えて室温で６時
間放置し反応させた。このうちの１部をＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ電気泳動で分析することにより、ファクターＸa処理
の前後におけるβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の
分子量変化について調べた。その結果、ファクターＸa
による処理の前後で該融合タンパク質の分子量に変化は
認められず、ファクターＸa認識アミノ酸配列に開裂が
生じていないことが明らかとなった。これは、β−ガラ
クトシダーゼが分子量約１１６Ｋダルトンの大きなタン
パク質であるために立体障害が生じ、ファクターＸaに
よる切断から該アミノ酸配列が保護され、開裂が阻害さ
れたためと推察された。The experiment was conducted as follows. First, the recombinant Escherichia coli JM109 / pKE301-lacZ strain was inoculated in 30 ml of LB medium and cultured at 37 ° C. overnight, and then 5
A baffled 2000 ml Erlenmeyer flask containing 00 ml of LB medium (containing ampicillin) was inoculated with 1% of the bacterial solution, and cultured at 37 ° C. with shaking. Since the recombinant plasmid pKE301-lacZ is under the control of the tac promoter, isopropylthiogalactoside (IP
In the absence of TG) gene expression is completely suppressed.
Approximately 3 hours later, the cells were sufficiently grown, and when the turbidity (OD ₆₆₀ ) of the culture solution at a wavelength of 660 nm, which is an index of the cell concentration, became about 2, IPTG (Takara Shuzo) 1 mM was added to the culture solution. In addition to inducing the tac promoter,
The culture was continued for an hour. In this example, β-galactosidase is expressed as a fusion protein linked to the cellulose-binding domain of Trichoderma reesei EGIII via the recognition amino acid sequence of Factor Xa and accumulated in the cytoplasm of recombinant Escherichia coli. After the completion of the culture, the cells were collected by centrifugation and the β-galactosidase activity was measured, and it was found that the amount reached about 3700 units per 1 ml of the culture solution. The β-galactosidase activity is measured by the method of Bittner et al. (Bittner, M., & Vapnek, d. Gene 15,319-329, 1981).
And using o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG: Sigma) as a substrate at a temperature of 30 ° C. and pH 7 of 1 nmol of ONP for 1 minute.
The amount of the enzyme that hydrolyzes G was 1 unit. From the results of this experiment, it was revealed that when the cellulose-binding domain of Trichoderma reesei EGIII was fused to β-galactosidase and expressed, the domain did not affect the activity of β-galactosidase in the fusion protein. . Furthermore, when the bacterial cell sample was analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), the molecular weight expected from the DNA base sequence was about 120K.
A band of the fusion protein was observed at the position of Dalton. Next, the collected bacterial cell sample was washed once with 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7), and then in order to prevent decomposition by a protease derived from bacterial cells, 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoride (Phenylmethanesulfony
lfluoride: PMSF: Boehringer) and 5 mM
Suspended in 50 ml of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7) containing EDTA, and output using an ultrasonic homogenizer (Branson model 250).
It was crushed for 10 minutes at 10, duty 50%. A high-speed centrifuge (SCR20BA manufactured by Hitachi, Ltd.) was used to perform centrifugal separation treatment twice to remove insoluble matters from the crushed material as a precipitate and clarify it. By this operation, the β-galactosidase fusion protein was recovered in the supernatant as a soluble fraction. Next, the total amount of this solution was diluted to 150 ml with 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7). A glass column with a diameter of 2.5 cm and a height of 30 cm filled with about 40 g of Avicel (manufactured by Asahi Kasei Co., Ltd.) installed in a chromatographic chamber (NC-16 manufactured by Nippon Freezer Co., Ltd.) controlled at 4 ° C. (Econo column manufactured by Bio-Rad) was passed through at a flow rate of 10 ml / hr to adsorb the β-galactosidase fusion protein on Avicel. To remove impurities not adsorbed on the column, 1M Na
100 mM potassium phosphate buffer containing Cl (pH
7) After washing the column with 750 ml, the column solution was continuously replaced with water from 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7) by a gradient elution method to elute the β-galactosidase fusion protein. The gradient elution was performed as follows using a hand-made double beaker type gradient preparation device (Protein Purification Method / Robert K. Scopes, translated by Kinji Tsukada, Springer-Fairark Tokyo). First, 50 ml of 100 mM
A beaker A containing a potassium phosphate buffer (pH 7) and a stirrer bar and a beaker B containing 1000 ml of water were connected. Next, while stirring the beaker A with a magnetic stirrer, a tube pump (Mini pulse 3 manufactured by Gilson Co., Ltd.) was used to pass the liquid from the beaker A to the column at a predetermined flow rate, so that the beaker B was beaked from the beaker B using the siphon phenomenon. Water was supplied to A to gradually replace the column eluate with water. Gradient elution was performed by the above method. Elution was performed at a rate of 40 ml / hr, and the fractions were collected every 5 ml of the eluent to measure the absorbance (A ₂₈₀ ) at a wavelength of 280 nm and the β-galactosidase activity (see FIG. 6). The fractions showing the peak of β-galactosidase activity were combined into one, and the protein concentration and β-galactosidase activity were measured. The protein concentration was measured using a protein assay kit (manufactured by Bio-Rad) by the Bradford method using bovine gamma globulin as a standard protein. SD
As a result of analyzing the peak fractions by S-PAGE electrophoresis-silver staining, it was found that the protein was purified to almost a single protein. The specific activity of this fusion protein was about 95,000 units per mg of protein, which was almost the same as the specific activity of the native β-galactosidase of E. coli (Boehringer) used as a standard. Next, it was examined whether the purified β-galactosidase fusion protein was treated with Factor Xa to cleave the Factor Xa-recognizing amino acid sequence inserted in this fusion protein to recover β-galactosidase. The treatment with Factor Xa was performed as follows. That is, 1 mg of purified β-galactosidase fusion protein was added to 20 mM Tris-HCl, 100 mM
After dissolving in NaCl (pH 8) buffer, 0.01 mg of Factor Xa (manufactured by Takara Shuzo) was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 6 hours for reaction. Part of this is SDS-PAG
The change in the molecular weight of the β-galactosidase fusion protein before and after the Factor Xa treatment was examined by analysis by E electrophoresis. As a result, Factor Xa
No change was observed in the molecular weight of the fusion protein before and after the treatment with, and it was revealed that the factor Xa recognition amino acid sequence was not cleaved. It is speculated that this is because β-galactosidase is a large protein having a molecular weight of about 116 K daltons, which causes steric hindrance, protects the amino acid sequence from cleavage by Factor Xa, and inhibits cleavage.

【００４６】（実施例８） （組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＥ３１１−ｌａｃＺ株
の培養によるβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の生
産）本実施例では、組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＥ３
１１−ｌａｃＺ株の培養によるβ−ガラクトシダーゼ融
合タンパク質の生産について実施例７との比較検討を行
った。(Example 8) (Production of β-galactosidase fusion protein by culturing recombinant E. coli JM109 / pKE311-lacZ strain) In this example, recombinant E. coli JM109 / pKE3 was used.
The production of β-galactosidase fusion protein by culturing the 11-lacZ strain was compared and examined with Example 7.

【００４７】実験は実施例７と同様に行った。まず、組
換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＥ３１１−ｌａｃＺ株を実
施例７と同様に培養したところ、培養液１ｍｌ当たり約
４１００ユニットのβ−ガラクトシダーゼ活性を持つ試
料が得られた。この試料をアビセルを担体に用いたアフ
ィニティークロマトグラフィーにより精製を試みたとこ
ろ、実施例７と同様のクロマトグラムが得られ、ほぼ単
一のタンパク質にまで精製することができた。この時、
本融合タンパク質のβ−ガラクトシダーゼ比活性は、実
施例７の場合とほぼ同様のタンパク質１ｍｇ当たり約９
万２千ユニットであった。そこで、精製したβ−ガラク
トシダーゼ融合タンパク質を用いて、ファクターＸa処
理による該融合タンパク質からのβ−ガラクトシダーゼ
の回収について実施例７と同じ処理条件を用いて検討し
たところ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動における融合タン
パク質の分子量変化の結果から、本実施例では融合タン
パク質中のファクターＸa認識アミノ酸配列が選択的に
開裂して、β−ガラクトシダーゼがリンカー領域を含む
セルロース結合領域から切り離されていることが明らか
となった。これは、セルロース結合領域とファクターＸ
a認識アミノ酸配列との間にリンカー領域を配置したこ
とにより、該アミノ酸配列が融合タンパク質の表面に露
出したことによって特異的プロテアーゼによる切断を受
けたためと推察された。The experiment was conducted in the same manner as in Example 7. First, when the recombinant Escherichia coli JM109 / pKE311-lacZ strain was cultured in the same manner as in Example 7, a sample having about 4100 units of β-galactosidase activity per 1 ml of the culture solution was obtained. When an attempt was made to purify this sample by affinity chromatography using Avicel as a carrier, a chromatogram similar to that in Example 7 was obtained, and it was possible to purify to almost a single protein. At this time,
The β-galactosidase specific activity of the present fusion protein is about 9 per 1 mg of the protein, which is almost the same as in Example 7.
It was 22,000 units. Therefore, the purified β-galactosidase fusion protein was used to examine recovery of β-galactosidase from the fusion protein by treatment with Factor Xa using the same treatment conditions as in Example 7, and the fusion protein in SDS-PAGE electrophoresis was examined. From the results of the change in the molecular weight, it was revealed that in this example, the Factor Xa recognition amino acid sequence in the fusion protein was selectively cleaved, and β-galactosidase was cleaved from the cellulose-binding domain containing the linker domain. . This is the cellulose binding region and factor X
It was speculated that the linker region was arranged between the a-recognized amino acid sequence and the amino acid sequence exposed on the surface of the fusion protein, and thus was cleaved by a specific protease.

【００４８】[0048]

【発明の効果】トリコデルマリーゼイのセルロース分解
酵素のセルロース結合領域を構成する約３０から４０の
アミノ酸残基からなる比較的小さなペプチド鎖（分子量
約３−４Ｋダルトン）をアフィニティーフュージョン用
発現ベクターの精製用タグとして用いることにより、以
下の効果がある。EFFECT OF THE INVENTION Purification of an expression vector for affinity fusion of a relatively small peptide chain (molecular weight of about 3-4 K daltons) consisting of about 30 to 40 amino acid residues constituting the cellulose-binding domain of Trichoderma reesei cellulolytic enzyme. The following effects are obtained by using it as a tag for use.

【００４９】１．アフィニティー精製用のタグペプチド
鎖が、目的とする組換えタンパク質の正常なフォールデ
ィングを妨げない。1. The tag peptide chain for affinity purification does not interfere with the normal folding of the target recombinant protein.

【００５０】２．従来法に比べて、融合タンパク質中に
占めるタグペプチド鎖の割合が小さいため、目的とする
組換えタンパク質生産に有利である。2. Compared with the conventional method, the ratio of the tag peptide chain in the fusion protein is smaller, which is advantageous for the production of the target recombinant protein.

【００５１】３．特異的プロテアーゼにより認識され、
開裂するアミノ酸配列がタグペプチド鎖の立体障害によ
って保護されることが少ない。3. Recognized by a specific protease,
The cleaved amino acid sequence is less often protected by steric hindrance of the tag peptide chain.

【００５２】４．安価なセルロースをアフィニティーク
ロマトグラフィーの担体として用いることにより、工業
規模での組換えタンパク質生産を経済的に行うことがで
きる。また、化学的に安定で有機溶媒に耐性のあるセル
ロースを担体に用いることにより、エタノール等の薬液
によるカラム洗浄を行うことが可能となり、従来技術で
は困難であったアフィニティー精製工程の無菌化を実現
することができる。4. By using inexpensive cellulose as a carrier for affinity chromatography, it is possible to economically perform recombinant protein production on an industrial scale. In addition, by using cellulose that is chemically stable and resistant to organic solvents as a carrier, it is possible to perform column washing with a chemical solution such as ethanol, and realize the sterilization of the affinity purification step, which was difficult with conventional techniques. can do.

【００５３】５．アフィニティークロマトグラフィーに
よる精製段階において、目的とする組換えタンパク質を
失活させることのない穏和な条件で回収することができ
る。さらに、リンカー領域をセルロース結合領域と特異
的プロテアーゼ認識アミノ酸配列との間に配置すること
によって、融合タンパク質の立体障害を回避して目的と
する組換えタンパク質をセルロース結合領域を含むペプ
チド鎖から切り離し、選択的に回収できる。5. In the purification step by affinity chromatography, the target recombinant protein can be recovered under mild conditions that do not inactivate it. Furthermore, by arranging the linker region between the cellulose binding region and the specific protease recognition amino acid sequence, the steric hindrance of the fusion protein is avoided and the target recombinant protein is cleaved from the peptide chain containing the cellulose binding region, Can be selectively collected.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】請求項９及び実施例１に記載の人工遺伝子カセ
ットを示す図である。FIG. 1 is a view showing an artificial gene cassette according to claim 9 and Example 1.

【図２】請求項１０及び実施例４に記載の人工遺伝子カ
セットを示す図である。FIG. 2 is a view showing the artificial gene cassette according to claim 10 and Example 4.

【図３】実施例２に記載の人工遺伝子カセットを示す図
である。FIG. 3 shows the artificial gene cassette described in Example 2.

【図４】発現ベクターｐＫＥ３０１及びｐＫＥ３１１の
構築を図式的に示した図である。FIG. 4 is a diagram schematically showing the construction of expression vectors pKE301 and pKE311.

【図５】β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質発現用プ
ラスミドｐＫＥ３０１−ｌａｃＺ及びｐＫＥ３１１−ｌ
ａｃＺの構築を図式的に示した図である。FIG. 5: Plasmids pKE301-lacZ and pKE311-l for expressing β-galactosidase fusion protein
FIG. 3 is a diagram schematically showing the construction of acZ.

【図６】実施例７において、β−ガラクトシダーゼ融合
タンパク質をアフィニティークロマトグラフィー精製し
た際のクロマトグラムを示す図である。FIG. 6 is a diagram showing a chromatogram when the β-galactosidase fusion protein was purified by affinity chromatography in Example 7.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁵ Identification code Office reference number FI technical display location C12R 1:19) (C12N 1/21 C12R 1:19)

Claims (14)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 形質転換された宿主生物中で目的とする
組換えタンパク質をアフィニティー精製用タグを付加し
た融合タンパク質として生産し、該融合タンパク質を菌
体抽出物からアフィニティークロマトグラフィーを用い
て精製する方法において、 トリコデルマリーゼイの産生するセルロース分解酵素の
セルロース結合領域を含むペプチド鎖を上記アフィニテ
ィー精製用タグとして用い、セルロースを担体とするア
フィニティークロマトグラフィーを用いて上記融合タン
パク質を精製することを特徴とする組換えタンパク質の
生産・精製方法。1. A recombinant protein of interest is produced in a transformed host organism as a fusion protein to which an affinity purification tag has been added, and the fusion protein is purified from the bacterial cell extract using affinity chromatography. In the method, a peptide chain containing a cellulose-binding domain of a cellulolytic enzyme produced by Trichoderma reesei is used as the affinity purification tag, and the fusion protein is purified by affinity chromatography using cellulose as a carrier. Method for producing and purifying recombinant protein. 【請求項２】 請求項１記載の融合タンパク質を特異的
プロテアーゼ処理して、該融合タンパク質からアフィニ
ティー精製用タグとして用いた所定のセルロース結合領
域を含むペプチド鎖を分離して、目的とする組換えタン
パク質のみを選択的に回収することを特徴とする組換え
タンパク質の生産・精製方法。2. The fusion protein of claim 1 is treated with a specific protease to separate a peptide chain containing a predetermined cellulose-binding domain used as an affinity purification tag from the fusion protein, and the target recombination is performed. A method for producing and purifying a recombinant protein, which comprises selectively recovering only the protein. 【請求項３】 アフィニティー精製用タグが、トリコデ
ルマリーゼイの産生するセルロース分解酵素のうち、セ
ロビオハイドレースI（ＣＢＨI）、セロビオハイドレー
スII（ＣＢＨII）、エンドグルカナーゼI（ＥＧI）、エ
ンドグルカナーゼIII（ＥＧIII）のいずれかのセルロー
ス結合領域を含むペプチド鎖であることを特徴とする請
求項１または２記載の組換えタンパク質の生産・精製方
法。3. Affinity purification tag among cellulolytic enzymes produced by Trichoderma reesei, cellobiohydrate I (CBHI), cellobiohydrate II (CBHII), endoglucanase I (EGI), endoglucanase. The method for producing and purifying a recombinant protein according to claim 1 or 2, which is a peptide chain containing a cellulose binding domain of any one of III (EGIII). 【請求項４】 アフィニティー精製用タグが、トリコデ
ルマリーゼイの産生するセルロース分解酵素のうち、セ
ロビオハイドレースI（ＣＢＨI）、セロビオハイドレー
スII（ＣＢＨII）、エンドグルカナーゼI（ＥＧI）、エ
ンドグルカナーゼIII（ＥＧIII）のいずれかのセルロー
ス結合領域及びリンカー領域を含むペプチド鎖であるこ
とを特徴とする請求項１または２記載の組換えタンパク
質の生産・精製方法。4. A tag for affinity purification, among cellulolytic enzymes produced by Trichoderma reesei, cellobiohydrate I (CBHI), cellobiohydrate II (CBHII), endoglucanase I (EGI), endoglucanase. The method for producing and purifying a recombinant protein according to claim 1 or 2, which is a peptide chain containing a cellulose binding region and a linker region of any one of III (EGIII). 【請求項５】 特異的プロテアーゼが、ファクターＸ
a、コラゲナーゼ、エンテロキナーゼ、トロンビンのい
ずれかであることを特徴とする請求項１または２記載の
組換えタンパク質の生産・精製方法。5. The specific protease is Factor X.
The method for producing and purifying a recombinant protein according to claim 1 or 2, which is any one of a, collagenase, enterokinase and thrombin. 【請求項６】 目的とする組換えタンパク質をコードす
る遺伝子が、請求項３または４に記載のアフィニティー
精製用タグをコードする遺伝子の５’末端側または３’
末端側に同一の読み枠となるように配置された融合遺伝
子を構成することを特徴とする請求項１または２記載の
組換えタンパク質の生産・精製方法。6. The gene encoding the target recombinant protein is the 5′-terminal side or 3 ′ of the gene encoding the affinity purification tag according to claim 3 or 4.
The method for producing and purifying a recombinant protein according to claim 1 or 2, characterized in that a fusion gene is arranged on the terminal side so as to have the same reading frame. 【請求項７】 目的とする組換えタンパク質をコードす
る遺伝子と、請求項３または４に記載のアフィニティー
精製用タグをコードする遺伝子との間に、特異的プロテ
アーゼにより選択的に開裂可能なアミノ酸配列をコード
するサブ配列が、同一の読み枠となるように配置される
融合遺伝子を構成することを特徴とする請求項６記載の
組換えタンパク質の生産・精製方法。7. An amino acid sequence that can be selectively cleaved by a specific protease between the gene encoding the target recombinant protein and the gene encoding the affinity purification tag according to claim 3 or 4. 7. The method for producing and purifying a recombinant protein according to claim 6, wherein the sub-sequences encoding the above-mentioned genes constitute a fusion gene arranged so as to have the same reading frame. 【請求項８】 請求項６または７何れかに記載の融合遺
伝子を発現ベクターに組み込んだ組換えプラスミドまた
は該プラスミドにより形質転換された微生物。8. A recombinant plasmid in which the fusion gene according to claim 6 or 7 is incorporated into an expression vector, or a microorganism transformed with the plasmid. 【請求項９】 図１に示されるＤＮＡの塩基配列を有す
ることを特徴とするトリコデルマリーゼイ、エンドグル
カナーゼIII（ＥＧIII）のセルロース結合領域とファク
ターＸa認識アミノ酸配列をコードし、その下流にマル
チクローニングサイトを有する人工遺伝子カセット。9. A cellulose-binding region of Trichoderma reesei, endoglucanase III (EGIII), which has the nucleotide sequence of the DNA shown in FIG. 1, and an amino acid sequence recognizing factor Xa, and is multicloned downstream thereof. Artificial gene cassette with sites. 【請求項１０】 図２に示されるＤＮＡの塩基配列を有
することを特徴とするトリコデルマリーゼイ、エンドグ
ルカナーゼIII（ＥＧIII）のセルロース結合領域とリン
カー領域、ファクターＸa認識アミノ酸配列をコード
し、その下流にマルチクローニングサイトを有する人工
遺伝子カセット。10. The cellulose-binding region and linker region of Trichoderma reesei, endoglucanase III (EGIII), which has the nucleotide sequence of the DNA shown in FIG. 2, encodes the amino acid sequence recognizing Factor Xa, and the downstream thereof. An artificial gene cassette having a multi-cloning site in. 【請求項１１】 請求項９または１０に記載された人
工遺伝子カセットを有する発現ベクター。11. An expression vector comprising the artificial gene cassette according to claim 9 or 10. 【請求項１２】 請求項１１に記載の発現ベクターのマ
ルチクローニングサイトに、目的とする組換えタンパク
質をコードする遺伝子を同一の読み枠となるように組み
込んだ組換えプラスミド、及び該プラスミドで形質転換
された微生物を用いる請求項１または２記載の組換えタ
ンパク質の生産・精製方法。12. A recombinant plasmid in which a gene encoding a recombinant protein of interest is incorporated into the multicloning site of the expression vector according to claim 11 in the same reading frame, and transformation with the plasmid. The method for producing and purifying a recombinant protein according to claim 1 or 2, wherein the produced microorganism is used. 【請求項１３】 融合タンパク質の生産に使用される宿
主生物がグラム陰性菌、特に大腸菌であることを特徴と
する請求項１、２、３、４、５、６、７又は１２いずれ
かに記載の組換えタンパク質の生産・精製方法。13. The host organism used for the production of the fusion protein is a Gram-negative bacterium, in particular Escherichia coli, according to any one of claims 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 12. Method for producing and purifying recombinant protein of. 【請求項１４】 セルロース担体から融合タンパク質を
回収後、特異的プロテアーゼにより、溶液状態の融合タ
ンパク質を処理した後、該開裂生成物をセルロース担体
に再度接触させ、主に目的のタンパク質のみを選択的に
回収することを特徴とする請求項２、３、４、５、６、
７、１２又は１３いずれかに記載の組換えタンパク質の
生産・精製方法。14. A method for recovering a fusion protein from a cellulose carrier, treating the fusion protein in a solution state with a specific protease, and then contacting the cleavage product with the cellulose carrier again to mainly select only a target protein. It collect | recovers to 2,3,4,5,6,
A method for producing and purifying a recombinant protein according to any one of 7, 12, and 13.