JPH06261775A - Production of red pigment by tissue culture of rosemary - Google Patents
Production of red pigment by tissue culture of rosemaryInfo
- Publication number
- JPH06261775A JPH06261775A JP5827793A JP5827793A JPH06261775A JP H06261775 A JPH06261775 A JP H06261775A JP 5827793 A JP5827793 A JP 5827793A JP 5827793 A JP5827793 A JP 5827793A JP H06261775 A JPH06261775 A JP H06261775A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- callus
- medium
- producing
- rosemary
- subculture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、ローズマリー（Rosmar
inus officinalis L.）の組織培養による赤色色素、特
に食品、化粧品などの着色に用いられるアントシアニン
系色素の生産方法に関する。本明細書で、「カルス」と
は植物体から切出された組織片を組織培養用の固体培地
において培養して得られた不定形細胞をいい、「アント
シアニン」とは植物の花又は果皮などの美しい色をもつ
部分に多く存在する赤、青、紫などを示す配糖体をい
う。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention
inus officinalis L.) and a method for producing a red pigment, particularly an anthocyanin pigment used for coloring foods, cosmetics, etc., by tissue culture. In the present specification, "callus" refers to an atypical cell obtained by culturing a tissue piece cut out from a plant in a solid medium for tissue culture, and "anthocyanin" refers to a plant flower or fruit skin, etc. Is a glycoside that shows red, blue, purple, etc., which are often found in the part with a beautiful color.
【０００２】[0002]
【従来の技術】食品、化粧品などの着色には、従来より
各種の合成色素及び天然色素が用いられているが、合成
色素は変異原性，発癌性等の問題があり、安全性の面か
ら天然物に由来する色素の使用が望まれている。しか
し、天然物からの抽出による色素の生産は、季節、気
候、温度等の自然環境の影響を受け易く、安定した供給
は困難である。そのため組織培養による天然色素の生産
が試みられている。組織培養法は、短時間で目的の色素
を生産でき、工業的規模で効率的に計画生産できるとい
う利点がある。2. Description of the Related Art Conventionally, various kinds of synthetic pigments and natural pigments have been used for coloring foods, cosmetics, etc. However, synthetic pigments have problems of mutagenicity, carcinogenicity, etc. It is desired to use pigments derived from natural products. However, the production of pigments by extraction from natural products is easily affected by the natural environment such as season, climate and temperature, and stable supply is difficult. Therefore, production of natural pigments by tissue culture has been attempted. The tissue culture method has an advantage that the target dye can be produced in a short time and the planned production can be efficiently performed on an industrial scale.
【０００３】植物体（カルス）の組織培養によって、ア
ントシアニン系色素を生産する方法として、これまでア
カメガシワのカルス（特開昭４９ー９４８９７）、ポリ
ゴナムに属するアイ植物のカルス（特開昭５３−８４０
２６）、デリスの葉から誘導したカルス（特開昭５４−
１１２８１）、ブドウ属植物のカルス（特開昭５５−１
１８３９２）、ユーホルピア属のハナキリン（特開昭５
７−２６９６）、ローゼルのカルス（特開昭６４−３０
５９４）などが知られている。また、シソの植物体の組
織培養において、波長１９０〜５００ｎｍの青色光照射
下に組織培養し、又は波長６００〜９００ｎｍの赤色光
照射下に組織培養して、それぞれ赤色色素生成カルスを
培養した後、培養物から赤色色素を生産する方法が提案
されている（特開昭６１−１９５６８８、特開昭６３−
１５６８６５）。上記シソの植物は、葉にアントシアニ
ン系色素を含む赤紫色の通常赤ジソと呼ばれるものであ
る。As a method for producing anthocyanin pigments by culturing tissue of a plant (callus), callus of Akamega wrinkle (Japanese Patent Application Laid-Open No. 49-94897) and callus of an eye plant belonging to Polygonum (Japanese Patent Application Laid-Open No. 53-840).
26), a callus derived from the leaves of Delis (JP-A-54-54).
11281), callus of a genus of grapes (Japanese Patent Laid-Open No. 55-1).
18392), a euphorpia hanakirin (Japanese Patent Laid-Open No. Sho 5)
7-2696), Roselle's callus (JP-A-64-30)
594) and the like are known. In addition, in tissue culture of perilla plants, after tissue culture under irradiation with blue light having a wavelength of 190 to 500 nm or tissue irradiation under irradiation with red light having a wavelength of 600 to 900 nm, after culturing red pigment-forming callus, respectively. , A method for producing a red pigment from a culture has been proposed (Japanese Patent Laid-Open Nos. 61-195688 and 63-63).
156865). The above-mentioned perilla plant is a red-purple ordinary red radish, whose leaves contain anthocyanin pigments.
【０００４】本発明者らはシソ科に属するものの上記赤
紫色の赤ジソと異なる常緑樹のローズマリーの未分化の
細胞群（カルス）を組織培養してその２次代謝産物であ
るアントシアニン系色素を得る方法を発明し、特許出願
した（特願平４−１００３５５）。この方法は、シソ科
植物のローズマリーの植物組織からカルスを誘導し、こ
のカルスからローズマリー色素生成細胞塊のカルスを選
抜し、選抜したカルスを固体培地に移植して培養した
後、この培養で得られたカルスを継代培養して２次代謝
産物としてアントシアニン系色素を得る方法である。The present inventors tissue-cultured an undifferentiated cell group (callus) of an evergreen rosemary, which belongs to the Labiatae family but is different from the above red-purple red radish, and tissue-cultured the anthocyanin pigment, which is its secondary metabolite. He invented a method for obtaining the same and applied for a patent (Japanese Patent Application No. 4-100355). This method induces callus from the plant tissue of rosemary of the Lamiaceae plant, selects the callus of the rosemary pigment-producing cell mass from this callus, transplants the selected callus to a solid medium and cultures this culture. This is a method of subculturing the callus obtained in step 1 to obtain anthocyanin dye as a secondary metabolite.
【０００５】[0005]
【発明が解決しようとする課題】しかし、上記方法は継
代培養において単一の培地を用いているに過ぎないた
め、カルスの増殖量と２次代謝産物であるアントシアニ
ン系色素の生産量はそれぞれ低く、アントシアニン系色
素を量産化して工業的に利用するには不十分であった。
本発明者らは更に検討を進め、継代培養した後に、特定
の関係にある２種類の液体培地で段階的に組織培養すれ
ば、未分化の細胞群から得られる２次代謝産物であるア
ントシアニン系色素の量が著しく増大することを見出し
本発明に到達した。However, since the above method uses only a single medium for subculture, the growth amount of callus and the production amount of anthocyanin pigment, which is a secondary metabolite, are both It was low, and it was insufficient to mass-produce the anthocyanin dye and industrially use it.
The present inventors further studied, and after subculture, if the tissue culture was carried out stepwise in two liquid media having a specific relationship, anthocyanin which is a secondary metabolite obtained from an undifferentiated cell group. The present invention has been accomplished by finding that the amount of the system dye is remarkably increased.
【０００６】本発明の目的は、アントシアニン系色素生
産能の高いローズマリー培養細胞を大量培養してアント
シアニン系色素を高い収率で経済的に、かつ工業的規模
で大量に生産する方法を提供することにある。An object of the present invention is to provide a method for mass-culturing rosemary cultured cells having a high ability to produce anthocyanin pigments in a large amount at a high yield economically and on an industrial scale. Especially.
【０００７】[0007]
【課題を解決するための手段】本発明は、シソ科植物の
ローズマリーの植物組織からカルスを誘導し、このカル
スからローズマリー色素生成細胞塊のカルスを選抜し、
選抜したカルスを別の培地に移植して培養した後、この
培養で得られたカルスを継代培養して２次代謝産物とし
てアントシアニン系色素を得るローズマリーの組織培養
による赤色色素の生産方法である。その特徴ある構成
は、上記継代培養した後に、その継代培地を改変した第
１液体培地で上記継代培養で得られたカルスを大量培養
する第１段階培養工程と、継代培地を改変した第２液体
培地で大量培養したカルスの培養を続けて２次代謝産物
であるアントシアニン系色素を生産する第２段階培養工
程とを含むことにある。Means for Solving the Problems The present invention induces callus from a plant tissue of rosemary of a Lamiaceae plant, and selects a callus of a rosemary pigment-producing cell mass from this callus,
After transplanting the selected callus into another medium and culturing, the callus obtained by this culture is subcultured to obtain anthocyanin pigment as a secondary metabolite is there. The characteristic constitution is that, after the subculture, the first-stage culturing step of mass-culturing the callus obtained by the subculture in the first liquid medium in which the subculture medium is modified, and the subculture medium are modified. The second step of culturing the callus, which has been cultivated in a large amount in the second liquid medium, to produce an anthocyanin dye as a secondary metabolite.
【０００８】以下、本発明について詳しく説明する。 (a) 植物材料 本発明において使用する植物材料は、シソ科植物のロー
ズマリーの葉、茎、花、根或いは種子その他の組織が挙
げられる。このようなローズマリーの植物体を次亜塩素
酸ナトリウム溶液のような通常使用される殺菌剤により
殺菌して無菌状態とする。The present invention will be described in detail below. (a) Plant Material Examples of the plant material used in the present invention include leaves, stems, flowers, roots, seeds and other tissues of the Lamiaceae plant. Such rosemary plants are sterilized by a commonly used bactericide such as a sodium hypochlorite solution to make them sterile.
【０００９】(b) 植物組織からのカルスの誘導 次に、殺菌した植物材料を滅菌メスで適当な大きさの小
片に切断し、この切断片を培地に置床する。置床後、２
０〜３０℃、好ましくは２４〜２６℃の一定温度条件下
において植物組織からカルスを誘導する。この植物体の
カルスを誘導するための培地としては、通常の組織培養
用の無機合成寒天培地を利用する。例えば、ムラシゲ−
スクーグ（Murashige-Skoog）培地，ガンボーグ−Ｂ５
（Gamborg-B5）培地，ホワイト（White）培地，ヘラー
（Heller）培地及びこれらの改変培地などが用いられ
る。このような培地に、炭素源、窒素源、無機塩類、有
機物、植物ホルモンなどを含有してもよい。(B) Induction of Callus from Plant Tissue Next, the sterilized plant material is cut into small pieces of appropriate size with a sterile scalpel, and the cut pieces are placed on a medium. After bed placement, 2
Callus is induced from plant tissue under constant temperature conditions of 0 to 30 ° C, preferably 24 to 26 ° C. As a medium for inducing the callus of the plant body, an ordinary inorganic synthetic agar medium for tissue culture is used. For example, Murashige
Murashige-Skoog Medium, Gamboug-B5
(Gamborg-B5) medium, White medium, Heller medium and modified mediums thereof are used. Such a medium may contain a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, organic substances, plant hormones and the like.
【００１０】炭素源としては、ショ糖、グルコース、マ
ルトース、フルクトースなどの糖類、デンプンなどが用
いられる。窒素源としては、硝酸塩、アンモニウム塩、
グリシン、尿素などが用いられる。無機塩類としては、
リン、カリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガ
ン、銅、亜鉛、モリブデン、硼素、鉄、コバルトなどの
元素を含有するものが用いられる。有機物としては、イ
ノシトール、ニコチン酸、塩酸ピリドキシン、塩酸チア
ミン、パントテン酸カルシウム、ｐ−アミノ安息香酸、
葉酸、ビオチン、リボフラビン、アスコルビン酸、クエ
ン酸、リンゴ酸、ココナッツミルク、酵母エキスなどが
用いられる。As the carbon source, sugars such as sucrose, glucose, maltose and fructose, starch and the like are used. As the nitrogen source, nitrates, ammonium salts,
Glycine, urea, etc. are used. As inorganic salts,
Those containing elements such as phosphorus, potassium, calcium, magnesium, manganese, copper, zinc, molybdenum, boron, iron and cobalt are used. Organic substances include inositol, nicotinic acid, pyridoxine hydrochloride, thiamine hydrochloride, calcium pantothenate, p-aminobenzoic acid,
Folic acid, biotin, riboflavin, ascorbic acid, citric acid, malic acid, coconut milk, yeast extract and the like are used.
【００１１】植物ホルモンとしては、２，４−ジクロロ
フェノキシ酢酸(以下、２，４−Ｄと略称する）、α−
ナフタレン酢酸（以下、ＮＡＡと略称する）、インドー
ル酢酸（以下、ＩＡＡと略称する）、インドール酪酸
（以下、ＩＢＡと略称する）などのオーキシン類や、Ｎ
6−フルフリルアミノプリン（以下、カイネチンと略称
する）、Ｎ6−ベンジルアデニン（以下、ＢＡと略称す
る）などのサイトカイニン類などを使用することができ
る。オーキシンの使用濃度は１０-7〜１０-4Ｍ、好まし
くは１０-5〜５×１０-5Ｍであり、サイトカイニンの使
用濃度は１０-7〜１０-5Ｍ、好ましくは１０-6〜５×１
０-6Ｍである。オーキシン又はサイトカイニンの使用濃
度が上記範囲を越えると、カルス化（カルスの誘導）が
起こらない恐れがあるので好ましくない。上記培養条件
で約２〜４週間の培養期間を経過すると、各切断片から
カルスが誘導される。As plant hormones, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (hereinafter abbreviated as 2,4-D), α-
Auxins such as naphthalene acetic acid (hereinafter abbreviated as NAA), indole acetic acid (hereinafter abbreviated as IAA), indole butyric acid (hereinafter abbreviated as IBA), and N
Cytokinins such as 6 -furfurylaminopurine (hereinafter abbreviated as kinetin), N 6 -benzyladenine (hereinafter abbreviated as BA) and the like can be used. The use concentration of auxin is 10 −7 to 10 −4 M, preferably 10 −5 to 5 × 10 −5 M, and the use concentration of cytokinin is 10 −7 to 10 −5 M, preferably 10 −6 to 5 M. × 1
It is 0 -6 M. If the concentration of auxin or cytokinin used exceeds the above range, callus formation (induction of callus) may not occur, which is not preferable. After a culture period of about 2 to 4 weeks under the above culture conditions, callus is induced from each cut piece.
【００１２】(c) ローズマリー色素生成細胞塊のカルス
の選抜とこのカルスの培養 この誘導したカルスから赤紫色の濃いローズマリー色素
生成細胞塊であるカルスを選抜する。これを適当な組成
の別の新しい培地上に移植し、２０〜３０℃、好ましく
は２４〜２６℃の一定温度下において培養を続ける。こ
の別の培地としては上述した寒天培地のような固体培地
以外に、寒天を含まない液体培地を用いてもよい。この
カルスを固体培地又は液体培地で継代培養したものを次
の大量培養用のカルスとする。(C) Selection of Callus of Rosemary Pigment-Producing Cell Mass and Culture of this Callus From this induced callus, a callus, which is a red-purple dark rosemary pigment-producing cell mass, is selected. This is transplanted onto another fresh medium having an appropriate composition, and the culture is continued at a constant temperature of 20 to 30 ° C, preferably 24 to 26 ° C. As this other medium, besides the solid medium such as the agar medium described above, a liquid medium containing no agar may be used. A subculture of this callus in a solid medium or a liquid medium is used as a callus for the next large-scale culture.
【００１３】(d) 第１段階培養 本発明の特徴ある第１段階培養で使用される第１液体培
地は、大量培養用カルスの育成増殖促進に適するように
その培地成分の組成割合を改変し、かつ液化するために
寒天を含まない以外は、上記(b)の植物組織からカルス
を誘導するときの培地と基本的に同様である。具体的に
は、第１液体培地は窒素源又は有機成分のうち少なくと
も１成分を上記(c)の継代培養時のカルスの継代培地中
の同種の成分より多く含むように改変される。窒素源を
増加させるには硝酸イオン濃度又はアンモニウムイオン
濃度のいずれか一方又は双方を高濃度にすることが望ま
しく、また有機成分を増加させるにはイノシトールを高
濃度にすることが望ましい。第１液体培地のカルス初期
濃度は広範囲で変更が可能であるが、液体培地１リット
ルに対してカルスを新鮮重量で約１ｇ〜約２００ｇ添加
することが望ましい。(D) First Stage Culture The first liquid medium used in the characteristic first stage culture of the present invention is such that the composition ratio of the medium components is modified so as to be suitable for promoting the growth and proliferation of callus for mass culture. The medium is basically the same as the medium for inducing callus from the plant tissue of (b) above, except that agar is not included for liquefaction. Specifically, the first liquid medium is modified so as to contain at least one component of the nitrogen source or the organic component in an amount larger than that of the same component in the subculture medium of the callus at the subculture of (c) above. To increase the nitrogen source, it is desirable to increase the concentration of either or both of the nitrate ion concentration and the ammonium ion concentration, and to increase the organic component, it is desirable to increase the concentration of inositol. The initial callus concentration of the first liquid medium can be changed over a wide range, but it is desirable to add about 1 g to about 200 g of fresh callus to 1 liter of the liquid medium.
【００１４】(e) 第２段階培養 本発明の特徴ある第２段階培養で使用される第２液体培
地も、増殖した大量培養用カルスが２次代謝産物のアン
トシアニン系色素を生産するのに適するようにその培地
成分の組成割合を改変し、かつ液化するために寒天を含
まない以外は、上記(a)の植物組織からカルスを誘導す
るときの培地と基本的に同様である。具体的には、第２
液体培地は窒素源又はリン酸イオンのうち少なくとも１
成分を継代培地中の同種の成分より少なく含むか、或い
は鉄イオン、有機成分又は炭素源のうち少なくとも１成
分を継代培地中の同種の成分より多く含むように改変さ
れる。(E) Second Stage Culture The second liquid medium used in the characteristic second stage culture of the present invention is also suitable for the grown large-scale callus to produce the anthocyanin pigment of the secondary metabolite. As described above, the medium is basically the same as the medium for inducing callus from the plant tissue of (a) above, except that the composition ratio of the medium component is modified and agar is not included for liquefaction. Specifically, the second
Liquid medium contains at least one of nitrogen source or phosphate ion
It is modified to contain less than the same component in the passage medium, or at least one component of iron ion, organic component or carbon source more than the same component in the passage medium.
【００１５】窒素源を減少させるには硝酸イオン濃度又
はアンモニウムイオン濃度のいずれか一方又は双方を低
濃度にすることが望ましく、アンモニウムイオン濃度は
第２液体培地中の全窒素量の１／１０以下にすることが
特に望ましい。またリン酸イオンを減少させるには継代
培地における濃度の１／２以下にすることが望ましい。
鉄イオンを増加させるには継代培地における濃度の２倍
以上にすることが望ましく、有機成分を増加させるには
チアミン又はイノシトールのいずれか一方又は双方を高
濃度にすることが望ましい。更に炭素源を増加させるに
はショ糖、グルコース、マルトースなどの糖類を高濃度
にすることが望ましい。In order to reduce the nitrogen source, it is desirable that either one or both of the nitrate ion concentration and the ammonium ion concentration be low, and the ammonium ion concentration is 1/10 or less of the total nitrogen amount in the second liquid medium. Is particularly desirable. Further, in order to reduce phosphate ions, it is desirable that the concentration is 1/2 or less of the concentration in the passage medium.
In order to increase the iron ion, it is desirable to make the concentration twice or more the concentration in the subculture medium, and to increase the organic component, it is desirable to increase the concentration of either or both of thiamine and inositol. In order to further increase the carbon source, it is desirable to increase the concentration of sugars such as sucrose, glucose and maltose.
【００１６】上記(d)の第１段階培養の第１液体培地で
組織培養されたカルスは、第２段階培養の第２液体培地
で培養が続行される。第２液体培地のカルス初期濃度は
第１液体培地と同様に広範囲で変更が可能であるが、液
体培地１リットルに対してカルスを新鮮重量で約１ｇ〜
約２００ｇ添加することが望ましい。第２段階培養で
は、カルスの増殖速度は第１段階培養と比較すると低下
するが、２次代謝産物であるアントシアニン系色素の生
産量は著しく増大する。この際、光を照射することが望
ましい。光の照射は、好ましくは１００ルックス以上、
更に好ましくは３，０００〜１００，０００ルックスの
昼光色光を照射することにより行われる。光源として
は、太陽光、蛍光灯、白熱電灯、水銀灯などを用いるこ
とができる。The callus tissue-cultured in the first liquid medium of the first stage culture of (d) above is continued to be cultured in the second liquid medium of the second stage culture. The initial concentration of callus of the second liquid medium can be changed over a wide range like the first liquid medium, but about 1 g of fresh callus per 1 liter of liquid medium is added.
It is desirable to add about 200 g. In the second-stage culture, the growth rate of callus is lower than that in the first-stage culture, but the production amount of the anthocyanin pigment, which is a secondary metabolite, is significantly increased. At this time, it is desirable to irradiate with light. The light irradiation is preferably 100 lux or more,
More preferably, it is performed by irradiating daylight color light of 3,000 to 100,000 lux. As the light source, sunlight, fluorescent lamp, incandescent lamp, mercury lamp and the like can be used.
【００１７】(f) 赤色色素の抽出 第２段階培養を終了した後、抽出溶媒として０．１〜
１．０重量％の塩酸酸性メタノールを用いて色素を抽出
した後、溶媒を濾過などにより除去すると、アントシア
ニン系の赤色色素が得られる。(F) Extraction of red pigment After completion of the second stage culture, 0.1 to 0.1% of the extraction solvent is used as an extraction solvent.
The anthocyanin red dye is obtained by extracting the dye with 1.0% by weight hydrochloric acid-methanol and then removing the solvent by filtration or the like.
【００１８】[0018]
【発明の効果】以上述べたように、本発明によれば、シ
ソ科植物のローズマリーの植物組織から誘導したカルス
を特定の関係にある２種類の液体培地で段階的に組織培
養することにより、従来の固体培地と比べてタンク培養
器を用いることができ、食品や化粧品などの着色剤とし
て好適な天然赤色色素であるアントシアニン系色素を純
粋な形でしかも工業的規模で大量に生産することができ
る。この結果、天然植物から製造する場合に比較して極
めて収率よく経済的に生産できる。INDUSTRIAL APPLICABILITY As described above, according to the present invention, callus derived from the plant tissue of rosemary of the Lamiaceae plant is subjected to stepwise tissue culture in two liquid media having a specific relationship. To be able to use a tank incubator as compared with a conventional solid medium, and to produce a large amount of anthocyanin pigment, which is a natural red pigment suitable as a colorant for foods and cosmetics, in a pure form and on an industrial scale. You can As a result, it can be economically produced with extremely high yield as compared with the case of producing from a natural plant.
【００１９】[0019]
【実施例】以下、本発明の実施例を説明する。本発明は
以下の実施例に限定されるものでない。 ＜ローズマリーからのカルスの誘導＞先ず、ローズマリ
ーの葉を流水で洗浄し、７０％エチルアルコールに３０
秒間浸漬した後、次亜塩素酸ナトリウム水溶液（有効塩
素濃度１．５％）に１５分間浸漬することにより滅菌を
行い、その後滅菌水で３回洗浄した。このように殺菌し
た無菌葉を滅菌メスを用いて１ｃｍ2程度の面積の小片
に切断した。この切断片を２，４−Ｄが２ｐｐｍ、カイ
ネチンが０．２ｐｐｍ、ショ糖が３％，寒天が０．８％
含まれるｐＨを５．８に調整したムラシゲ−スクーグ
（Murashige-Skoog）培地に置床した。置床後、２５℃
で３，０００ルックスの蛍光灯による白色光照射下で培
養した。置床して３週間後、各切断片からカルス組織が
誘導され、その組織中に赤紫色を呈する部分（ローズマ
リー色素生成細胞塊）が確認された。EXAMPLES Examples of the present invention will be described below. The present invention is not limited to the examples below. <Callus induction from rosemary> First, the leaves of rosemary were washed with running water, and then washed with 70% ethyl alcohol.
After immersing for 2 seconds, it was sterilized by immersing in an aqueous solution of sodium hypochlorite (effective chlorine concentration: 1.5%) for 15 minutes, and then washed 3 times with sterilized water. The sterile leaves sterilized in this way were cut into small pieces having an area of about 1 cm 2 using a sterile knife. 2,4-D is 2ppm, kinetin is 0.2ppm, sucrose is 3%, and agar is 0.8%.
The plate was placed on a Murashige-Skoog medium whose pH was adjusted to 5.8. After placing the bed, 25 ℃
The cells were cultured under white light irradiation with a fluorescent lamp of 3,000 lux. Three weeks after the placement, callus tissue was induced from each cut piece, and a reddish purple part (rosemary pigment-producing cell mass) was confirmed in the tissue.
【００２０】＜ローズマリー色素生成細胞塊（カルス）
の選抜と継代培養＞このローズマリー色素生成細胞塊の
うち、特に色の濃い部分を選抜し、表１に示す組成のｐ
Ｈ５．８の固体培地に移植し、２５℃で３，０００ル
ックスの蛍光灯による白色光照射下で３週間培養した。
この培養で得られたカルスを固体培地と同成分からな
る表１に示す継代培地で継代培養してローズマリーの
新鮮カルスとした。なおこの継代培地では寒天を含ま
ない場合もあった。<Rosemary pigment-producing cell mass (callus)
Selection and subculture> Of this rosemary pigment-producing cell mass, a particularly dark portion was selected, and p of the composition shown in Table 1 was selected.
It was transplanted to a solid medium of H5.8 and cultured at 25 ° C. for 3 weeks under irradiation of white light with a fluorescent lamp of 3,000 lux.
The callus obtained by this culture was subcultured in the subculture medium shown in Table 1 consisting of the same components as the solid medium to obtain a fresh callus of rosemary. Note that this passage medium may not contain agar in some cases.
【００２１】[0021]
【表１】 [Table 1]
【００２２】＜第１段階培養＞次にこの新鮮カルスを用
いて第１段階培養を行った。即ち、１００ｍｌのエルレ
ンマイヤーフラスコに上記継代培地を改変した表２に
示す組成の滅菌したガンボーグ−Ｂ５の第１液体培地
（ただし、ＮＡＡ２ｍｇ／ｌ、カイネチン０．２ｍｇ／
ｌ、ショ糖３０ｇ／ｌを含む。）２５ｍｌに上記ローズ
マリーの新鮮カルス０．４ｇを入れて２５℃で１４日間
ロータリーシェーカ上で１００ｒｐｍで旋回培養した。<First Stage Culture> Next, the first stage culture was performed using the fresh callus. That is, a sterilized Gamboug-B5 first liquid medium having the composition shown in Table 2 in which a 100 ml Erlenmeyer flask was modified from the above passage medium (however, NAA 2 mg / l, kinetin 0.2 mg /
1 and sucrose 30 g / l. ) 0.4 g of the above-mentioned rosemary callus was added to 25 ml, and cultivated at 25 ° C. for 14 days on a rotary shaker at 100 rpm.
【００２３】＜第２段階培養＞更に引き続き第２段階培
養を行った。即ち、上記継代培地を改変したアントシ
アニン系色素生産に適した表２に示す組成の第２液体培
地（ただしＮＡＡ２ｍｇ／ｌ、カイネチン０．２ｍｇ
／ｌ、ショ糖５０ｇ／ｌを含む。）２５ｍｌに第１段階
培養で得られたカルスを０．４ｇ入れ、３，０００ルッ
クスの蛍光灯による白色光照射下で第１段階培養と同様
の方法で旋回培養した。なお、表２には第１及び第２液
体培地の濃度として、容積濃度（mg/l）とモル濃度（mM
/l）の両方を示した。また第２液体培地では KNO3 の
減少によるカリウム成分を補うため、KCl を新たに加え
た。<Second-stage culture> Further, second-stage culture was carried out. That is, a second liquid medium having the composition shown in Table 2 which is suitable for the production of anthocyanin dyes obtained by modifying the above passage medium (however, NAA 2 mg / l, kinetin 0.2 mg).
/ L, sucrose 50 g / l. ) In 25 ml, 0.4 g of the callus obtained in the first stage culture was put, and cultivated by rotation in the same manner as in the first stage culture under the irradiation of white light with a fluorescent lamp of 3,000 lux. In Table 2, the concentrations of the first and second liquid culture media are the volume concentration (mg / l) and the molar concentration (mM).
/ l). In addition, KCl 3 was newly added in the second liquid medium to supplement the potassium component due to the decrease in KNO 3 .
【００２４】＜比較例＞比較のため、第２段階培養を行
わずに第１液体培地をそのまま継続して培養した以外
は、実施例と同様にしてカルスを増殖し、アントシアニ
ン系色素を生産した（比較例１）。また別の比較のた
め、第１段階培養及び第２段階培養を行わずに継代培地
だけでカルスを増殖し、アントシアニン系色素を生産
した（比較例２）。<Comparative Example> For comparison, callus was grown in the same manner as in Example except that the first liquid medium was continuously cultured as it was without performing the second-stage culture to produce anthocyanin pigment. (Comparative example 1). For another comparison, callus was grown only in the subculture medium without performing the first-stage culture and the second-stage culture to produce anthocyanin pigment (Comparative Example 2).
【００２５】＜カルス増殖量の測定とアントシアニン系
色素の生産量の計算＞実施例及び比較例において培養し
た後のローズマリーの培養細胞（カルス）を吸引濾過に
よりそれぞれ採取し、その重量（新鮮重量）を測定し、
液体培地１リットル当りのカルスの増殖量を求めた。ま
た最終的に得られた実施例及び比較例のカルスを１％塩
酸酸性メタノールに５℃で２４時間それぞれ浸漬し、ア
ントシアニン系色素を抽出し、抽出液の５３０ｎｍにお
ける吸光度を測定し、液体培地１リットル当りの総アン
トシアニン生産量を計算した。これらの結果を表３に示
す。<Measurement of Callus Growth Amount and Calculation of Anthocyanin Dye Production Amount> Cultured cells (callus) of rosemary after culturing in Examples and Comparative Examples were collected by suction filtration, and their weight (fresh weight ) Is measured,
The amount of callus growth per liter of liquid medium was determined. Further, the finally obtained callus of Examples and Comparative Examples was immersed in 1% hydrochloric acid-acidic methanol at 5 ° C. for 24 hours to extract anthocyanin dye, and the absorbance of the extract at 530 nm was measured. The total anthocyanin production per liter was calculated. The results are shown in Table 3.
【００２６】[0026]
【表２】 [Table 2]
【００２７】[0027]
【表３】 [Table 3]
【００２８】表３から明らかなように、実施例における
アントシアニン系色素の生産量は比較例と比べて５倍程
度増加していた。As is apparent from Table 3, the production amount of the anthocyanin dye in the example was increased by about 5 times as compared with the comparative example.
Claims (6)
らカルスを誘導し、このカルスからローズマリー色素生
成細胞塊のカルスを選抜し、選抜したカルスを別の培地
に移植して培養した後、この培養で得られたカルスを継
代培養して２次代謝産物としてアントシアニン系色素を
得るローズマリーの組織培養による赤色色素の生産方法
であって、 前記継代培養した後に、その継代培地を改変した第１液
体培地で前記継代培養で得られたカルスを大量培養する
第１段階培養工程と、 前記継代培地を改変した第２液体培地で大量培養したカ
ルスの培養を続けて前記２次代謝産物であるアントシア
ニン系色素を生産する第２段階培養工程とを含み、 前記第１液体培地が窒素源又は有機成分のうち少なくと
も１成分を前記継代培地中の同種の成分より多く含み、 前記第２液体培地が窒素源又はリン酸イオンのうち少な
くとも１成分を前記継代培地中の同種の成分より少なく
含むか、或いは鉄イオン、有機成分又は炭素源のうち少
なくとも１成分を前記継代培地中の同種の成分より多く
含むことを特徴とするローズマリーの組織培養による赤
色色素の生産方法。1. A callus is induced from a plant tissue of a rosemary of a Lamiaceae plant, a callus of a rosemary pigment-producing cell mass is selected from this callus, and the selected callus is transplanted to another medium and cultured, A method for producing a red pigment by tissue culture of rosemary, wherein the callus obtained by this culture is subcultured to obtain an anthocyanin pigment as a secondary metabolite, wherein the subculture medium is used after the subculture. The first-step culturing step of mass-culturing the callus obtained by the subculture in the modified first liquid medium, and the callus mass-cultured in the modified second liquid medium of the subculture medium are continued to the above 2 And a second stage culture step for producing an anthocyanin-based pigment, which is a secondary metabolite, wherein the first liquid medium contains at least one component selected from a nitrogen source and an organic component from the same component in the subculture medium. A large amount, the second liquid medium contains at least one component of a nitrogen source or a phosphate ion in a smaller amount than the same component in the passage medium, or at least one component of an iron ion, an organic component or a carbon source. A method for producing a red pigment by tissue culture of rosemary, characterized in that it contains more than the same kind of component in the subculture medium.
第２液体培地における窒素源の減少は硝酸イオン濃度又
はアンモニウムイオン濃度のいずれか一方又は双方を高
濃度又は低濃度にする請求項１記載の赤色色素の生産方
法。2. The increase of the nitrogen source in the first liquid medium or the decrease of the nitrogen source in the second liquid medium increases either or both of the nitrate ion concentration and the ammonium ion concentration to a high concentration or a low concentration. Method for producing red pigment.
イノシトールを高濃度にする請求項１記載の赤色色素の
生産方法。3. The method for producing a red pigment according to claim 1, wherein the increase of the organic component in the first liquid medium increases the concentration of inositol.
イノシトール又はチアミンのいずれか一方又は双方を高
濃度にする請求項１記載の赤色色素の生産方法。4. The method for producing a red pigment according to claim 1, wherein the increase of the organic component in the second liquid medium increases the concentration of either or both inositol and thiamine.
少は継代培地中のリン酸イオン濃度の１／２以下にする
請求項１記載の赤色色素の生産方法。5. The method for producing a red dye according to claim 1, wherein the reduction of phosphate ion in the second liquid medium is made to be 1/2 or less of the phosphate ion concentration in the passage medium.
地中の鉄イオン濃度の２倍以上にする請求項１記載の赤
色色素の生産方法。6. The method for producing a red pigment according to claim 1, wherein the iron ion concentration in the second liquid medium is increased to twice or more the iron ion concentration in the subculture medium.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5827793A JPH06261775A (en) | 1993-03-18 | 1993-03-18 | Production of red pigment by tissue culture of rosemary |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5827793A JPH06261775A (en) | 1993-03-18 | 1993-03-18 | Production of red pigment by tissue culture of rosemary |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06261775A true JPH06261775A (en) | 1994-09-20 |
Family
ID=13079697
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5827793A Pending JPH06261775A (en) | 1993-03-18 | 1993-03-18 | Production of red pigment by tissue culture of rosemary |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06261775A (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113913362A (en) * | 2021-10-18 | 2022-01-11 | 大连工业大学 | Sorbus commixta stem cell capable of increasing anthocyanin content, culture medium and culture method |
| CN115413580A (en) * | 2021-10-18 | 2022-12-02 | 大连工业大学 | Culture medium and culture method for promoting psammosilene tunicoides hairy root callus to generate anthocyanin |
-
1993
- 1993-03-18 JP JP5827793A patent/JPH06261775A/en active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113913362A (en) * | 2021-10-18 | 2022-01-11 | 大连工业大学 | Sorbus commixta stem cell capable of increasing anthocyanin content, culture medium and culture method |
| CN115413580A (en) * | 2021-10-18 | 2022-12-02 | 大连工业大学 | Culture medium and culture method for promoting psammosilene tunicoides hairy root callus to generate anthocyanin |
| CN113913362B (en) * | 2021-10-18 | 2023-11-17 | 大连工业大学 | Sorbus pohuashanensis stem cell for improving anthocyanin content, culture medium and culture method |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103843662B (en) | A kind of promote Herba Dendrobii tissue cultured seedling strong sprout and the method taken root | |
| CN113826550B (en) | Somatic embryogenesis and tissue culture method for camphor trees | |
| JPH08112045A (en) | Method for mass production of seed and seedling of plant of genus fritillaria | |
| CN107135948B (en) | A kind of method that Camellia nitidissima spray cultivates tissue-cultured seedling under sunlight conditions | |
| JPS6296088A (en) | Production of antitumor substance | |
| CN103416302A (en) | Method for culturing regeneration plant of somatic embryo of osmanthus fragrans Lour | |
| JPH06261775A (en) | Production of red pigment by tissue culture of rosemary | |
| Uranbey et al. | In vitro bulblet induction from bulb scales of endangered ornamental plant Muscari azureum | |
| CN114424749A (en) | Liriope spicata in-vitro rapid propagation method | |
| Shadang et al. | Effects of different culture media on seed germination and subsequent in vitro development of protocorms of Hygrochilus parishii (Veith & Rchb. f.) Pfitz (Orchidaceae) | |
| CN104904594B (en) | A kind of red palm pollen cultures method | |
| Tyagi et al. | Plant regeneration from tissue cultures initiated from immature inflorescences of a grass, Echinochloa colonum (L.) Link | |
| KR950004772B1 (en) | Preparation of anthocyan-type red pigment via tissue cultivation of rhaphanus sativus l. | |
| CN105706830A (en) | Advanced color changing method for leaves of Canadian sugar maple in autumn | |
| Fawusi | Germination of Talinum triangulare L. seeds as affected by various chemical and physical treatments | |
| JP3125007B2 (en) | Production method of red pigment by tissue culture of rosemary | |
| Bajaj | Some Indian Ornamental Trees: Cassia fistula Linn., Poinciana regia (Boj.) and Jacaranda acutifolia auct. | |
| GB2099851A (en) | Propagating foxglove from sterile seeds or shoot apices | |
| Varghese et al. | In vitro propagation of Albizzia lebbeck Benth | |
| US5212076A (en) | Production of quercetin glucuronide | |
| CN116210592B (en) | Large cherry stock Creams Ke 5 tissue culture rapid propagation method | |
| JPH05308982A (en) | Production of red pigment by tissue culture of gomphrena globosa l. | |
| JPH07203955A (en) | Method for tissue culture of rubiaceous plant | |
| CN113796314A (en) | Breeding method of colocasia esculenta | |
| JPH09285232A (en) | Production of bule of sandersonia |