JPH06245789A - Human serum albumin and its production - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To obtain high-purity human serum albumin freed from impurities by treating human serum albumin obtained by gene manipulation with boric acid or a salt thereof. CONSTITUTION:Human serum albumin obtained by gene manipulation is treated with boric acid or a salt thereof (pref. calcium tetraborate) following conventional purification and decoloration process, and furthermore, preferably, treated with ultrafiltration membrane (pref. with a differential molecular weight of 100000). With this method, the objective human serum albumin obtained has the following characteristics: (1) content of the impurities with antigen nature of host origin: <0.1ng; (2) content of the free impurities of antigen nature detectable by phenol-sulfuric acid method: <=1mug; and (3) pyrogen content: <0.1 EU.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子操作により得ら
れる、新規な性状を有するヒト血清アルブミンおよびそ
のヒト血清アルブミンを得るための一手法であるヒト血
清アルブミンの製造方法に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to human serum albumin having novel properties obtained by genetic engineering and a method for producing human serum albumin, which is one method for obtaining the human serum albumin.

【０００２】[0002]

【従来の技術】アルブミン、特にヒト血清アルブミン
（以下、「ＨＳＡ」ともいう。）は血漿の主要な蛋白構
成成分である。この蛋白は肝臓中で作られ、主に血流中
で正常な浸透圧を維持する責を負う。また、種々の血清
分子のキャリアーとしての機能を持っている。2. Description of the Related Art Albumin, particularly human serum albumin (hereinafter also referred to as "HSA"), is a major protein constituent of plasma. This protein is made in the liver and is primarily responsible for maintaining normal osmotic pressure in the bloodstream. It also has a function as a carrier for various serum molecules.

【０００３】ＨＳＡは種々の臨床上の状況において投与
される。例えば、ショックや熱傷患者では血液量を元に
戻し、それにより外傷に関連するいくつかの症状を改善
させる。低蛋白血症や胎児性赤芽球症に罹っている患者
にもＨＳＡによる治療を必要とすることがある。HSA is administered in a variety of clinical situations. For example, in shock and burn patients it restores blood volume, thereby improving some trauma-related symptoms. Patients suffering from hypoproteinemia or erythroblastosis may also require treatment with HSA.

【０００４】したがって、ＨＳＡを投与する基本的な治
療上の意義は、外科手術、ショック、火傷、浮腫を起こ
す低蛋白血症におけるがごとく、血管からの液体の損失
がある様な状態を治療する点に存する。Therefore, the fundamental therapeutic significance of administering HSA is to treat conditions such as loss of fluid from blood vessels, as in hypoproteinemia which causes surgery, shock, burns and edema. To the point.

【０００５】現在、ＨＳＡは、主として採取した血液の
分画からの産物として製造されている。この製造法の欠
点は不経済であることと、血液の供給が困難であるとい
うことである。また、血液は肝炎ウイルスのように好ま
しくない物質を含んでいることがある。したがって、Ｈ
ＳＡの代替の原料を開発することが有益となろう。Presently, HSA is produced primarily as a product from a collected blood fraction. The drawbacks of this manufacturing method are that it is uneconomical and that the supply of blood is difficult. Blood may also contain undesired substances such as hepatitis virus. Therefore, H
It would be beneficial to develop alternative sources of SA.

【０００６】ところで、組換ＤＮＡ技術の出現によっ
て、微生物による多種のポリペプチドの生産が可能とな
った。ＨＳＡにおいても、遺伝子操作の技術によって大
量生産され、それを高度精製する技術が確立されつつあ
る。By the way, the advent of recombinant DNA technology has enabled the production of various polypeptides by microorganisms. HSA is also mass-produced by gene manipulation techniques, and techniques for highly purifying it are being established.

【０００７】[0007]

【発明が解決しようとする課題】しかしながら遺伝子操
作においては、産生宿主の培養時、ＨＳＡの精製時など
に、培地中の或種の成分、微生物の分泌・産生物などが
遊離状態または他の成分との結合状態で、ＨＳＡ含有画
分中に夾雑物質として存在することになる。これらの夾
雑物質は、従来の血漿由来ＨＳＡには夾雑してこなかっ
た成分であり、かかる成分の除去は遺伝子操作により得
られるＨＳＡに独特の課題であり、この課題を解決する
ための新たな精製手段が要求される。However, in gene manipulation, certain components in the medium, secreted / produced products of microorganisms, etc. are in a free state or other components in the culture medium during culturing of the production host, purification of HSA, etc. It will be present as a contaminant in the HSA-containing fraction in a bound state with. These contaminants are components that have not been contaminated with conventional plasma-derived HSA, and removal of such components is a unique problem for HSA obtained by genetic engineering, and a new purification method for solving this problem has been proposed. Means are required.

【０００８】したがって、本発明が解決すべき課題は、
遺伝子操作により得られ、かつ産生宿主関連あるいはそ
の他の夾雑物質を除去したＨＳＡを提供することにあ
る。本発明が解決すべき他の課題は、上記ＨＳＡの製造
方法を提供することにある。Therefore, the problems to be solved by the present invention are as follows.
It is intended to provide HSA obtained by genetic engineering and free from production host-related or other contaminants. Another problem to be solved by the present invention is to provide a method for producing the above HSA.

【０００９】[0009]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる実
情下に鋭意研究を進めた結果、遺伝子操作により得られ
るＨＳＡを回収するに際して、当該ＨＳＡの精製工程に
おいて、ヒト血清アルブミンをホウ酸またはその塩にて
処理することによって、さらに特定の分画分子量の限外
濾過膜を用いて処理することによって、夾雑物質が充分
に除去された高純度のＨＳＡを提供できることを見出
し、本発明を完成した。なお、本発明にかかる製造方法
によって得られる高純度のＨＳＡは新規物質である。ま
た、フェノール硫酸法で検出可能な非抗原性の遊離の夾
雑物質が充分に除去されることは、これら夾雑物質に起
因する各種副作用を回避し、安全なＨＳＡ製剤を提供す
ることに意義を有するものである。Means for Solving the Problems As a result of intensive studies conducted under the above circumstances, the present inventors have found that when recovering HSA obtained by genetic engineering, human serum albumin was converted to boric acid in the HSA purification step. Further, it was found that high-purity HSA in which contaminants are sufficiently removed can be provided by treating with an salt thereof or an ultrafiltration membrane having a specific molecular weight cutoff, and the present invention completed. The high-purity HSA obtained by the production method of the present invention is a novel substance. Further, the sufficient removal of non-antigenic free contaminants detectable by the phenol-sulfuric acid method is significant in avoiding various side effects due to these contaminants and providing a safe HSA preparation. It is a thing.

【００１０】すなわち、本発明にかかるヒト血清アルブ
ミンは、遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミン
であって、ヒト血清アルブミン２５０mg当たり、 宿主由来の抗原性を有する夾雑物質が０．１ng未満
であり、 フェノール硫酸法により検出可能な非抗原性の遊離
の夾雑物質が１μｇ以下であり、かつ パイロジェンが０．１ＥＵ未満であることを特徴と
する。That is, the human serum albumin according to the present invention is a human serum albumin obtained by genetic engineering, wherein the amount of contaminants having a host-derived antigenicity is less than 0.1 ng per 250 mg of human serum albumin. It is characterized in that the amount of non-antigenic free contaminants detectable by the sulfuric acid method is 1 μg or less and the amount of pyrogen is less than 0.1 EU.

【００１１】また、本発明にかかるヒト血清アルブミン
の製造方法は、遺伝子操作により得られるヒト血清アル
ブミンをホウ酸またはその塩にて処理することにより夾
雑物質を除去する工程を含むことを特徴とする。Further, the method for producing human serum albumin according to the present invention is characterized by including the step of removing contaminants by treating human serum albumin obtained by genetic engineering with boric acid or a salt thereof. .

【００１２】特に、夾雑物質を除去する工程を経た後、
分画分子量約１０万の限外濾過膜を用いて処理する工程
を含むことを特徴とする。In particular, after passing through the step of removing contaminants,
It is characterized by including a step of treating with an ultrafiltration membrane having a molecular weight cutoff of about 100,000.

【００１３】（１）遺伝子操作による得られるＨＳＡ 本発明において用いられる遺伝子操作により得られるＨ
ＳＡは、遺伝子操作によって得られるものであれば、そ
の由来に特に制限はない。したがって、当該ＨＳＡを産
生させるためのＨＳＡ産生宿主は、遺伝子操作を経て調
製されたものであれば特に限定されず、公知文献記載の
ものの他、今後開発されるものであっても適宜利用する
ことができる。当該宿主としては、具体的には遺伝子操
作を経てＨＳＡ産生性とされた菌（例えば、大腸菌、酵
母、枯草菌など）、動物細胞などが挙げられる。特に、
本発明においては、宿主として、酵母、就中サッカロマ
イセス属〔例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Sa
ccharomyces cerevisiae)〕、もしくはピキア属〔例え
ば、ピキア・パストリス（Pichia pastoris ）〕を使用
して得られたＨＳＡが好ましい。また、栄養要求性株や
抗生物質感受性株を使用して得られたＨＳＡであっても
よい。さらにまた、サッカロマイセス・セレビシエＡＨ
２２株（a, his 4, leu 2, can 1) 、ピキア・パストリ
スＧＴＳ１１５株 (his 4)などを使用して得られたＨＳ
Ａが好適に用いられる。(1) HSA obtained by genetic manipulation H obtained by genetic manipulation used in the present invention
The origin of SA is not particularly limited as long as it is obtained by genetic engineering. Therefore, the HSA-producing host for producing the HSA is not particularly limited as long as it has been prepared through genetic engineering, and other than those described in publicly known documents, those that will be developed in the future may be appropriately used. You can Specific examples of the host include bacteria (eg, Escherichia coli, yeast, Bacillus subtilis, etc.) that have been made HSA-producing through genetic manipulation, animal cells, and the like. In particular,
In the present invention, as a host, yeast, especially Saccharomyces (for example, Saccharomyces cerevisiae (Sa
ccharomyces cerevisiae)], or HSA obtained using the genus Pichia [eg Pichia pastoris]. It may also be HSA obtained using an auxotrophic strain or an antibiotic sensitive strain. Furthermore, Saccharomyces cerevisiae AH
HS obtained using 22 strains (a, his 4, leu 2, can 1), Pichia pastoris GTS115 strain (his 4), etc.
A is preferably used.

【００１４】本発明において、ＨＳＡ産生宿主の調製方
法およびその培養によるＨＳＡの生産方法、培養物から
のＨＳＡの分離採取方法はすべて公知ならびにそれに準
じた手法を採用することによって実施される。例えば、
ＨＳＡ産生宿主（またはＨＳＡ産生株）の調製方法とし
ては、例えば通常のヒト血清アルブミン遺伝子を用いる
方法（特開昭５８−５６６８４号、同５８−９０５１５
号、同５８−１５０５１７号の各公報）、新規なヒト血
清アルブミン遺伝子を用いる方法（特開昭６２−２９９
８５号、特開平１−９８４８６号の各公報）、合成シグ
ナル配列を用いる方法（特開平１−２４０１９１号公
報）、血清アルブミンシグナル配列を用いる方法（特開
平２−１６７０９５号公報）、組換えプラスミドを染色
体上に組込む方法（特開平３−７２８８９号公報）、宿
主同士を融合させる方法（特開平３−５３８７７号公
報）、メタノール含有培地中で変異を起こさせる方法、
変異型ＡＯＸ₂ プロモーターを用いる方法（特願平３−
６３５９８号、同３−６３５９９号の各公報）、枯草菌
によるＨＳＡの発現（特開昭６２−２５１３３号公
報）、酵母によるＨＳＡの発現（特開昭６０−４１４８
７号、同６３−３９５７６号、同６３−７４４９３号の
各公報）、ピキア酵母によるＨＳＡの発現（特開平２−
１０４２９０号公報）などが例示される。In the present invention, the method for preparing an HSA-producing host, the method for producing HSA by culturing the same, and the method for separating and collecting HSA from the culture are all carried out by adopting known methods and their modifications. For example,
The HSA-producing host (or HSA-producing strain) can be prepared, for example, by using a normal human serum albumin gene (JP-A-58-56684 and 58-90515).
No. 58-150517) and a method using a novel human serum albumin gene (JP-A-62-299).
No. 85, JP-A-1-98486), a method using a synthetic signal sequence (JP-A-1-240191), a method using a serum albumin signal sequence (JP-A-2-167095), a recombinant plasmid. , On the chromosome (JP-A-3-72889), a method of fusing hosts with each other (JP-A-3-53877), a method of causing mutation in a medium containing methanol,
Method Using Mutant AOX ₂ Promoter (Japanese Patent Application No. 3-
63598, 3-63599), expression of HSA by Bacillus subtilis (JP-A-62-25133), expression of HSA by yeast (JP-A-60-4148).
No. 7, 63-39576, and 63-74493), and the expression of HSA by Pichia yeast (JP-A-2-
No. 104290).

【００１５】このうち、メタノール含有培地中で変異を
起こさせる方法は、具体的には以下のようにして行われ
る。すなわち、まず適当な宿主、好ましくはピキア酵
母、具体的にはＧＴＳ１１５株（ＮＲＲＬ寄託番号Ｙ−
１５８５１）のＡＯＸ₁ 遺伝子領域に常法によりＡＯＸ
₁ プロモーター支配下にＨＳＡが発現する転写ユニット
を有するプラスミドを導入して形質転換体を得る（特開
平２−１０４２９０号公報を参照）。この形質転換体は
メタノール培地中での増殖能は弱い。そこで、この形質
転換体をメタノール含有培地中で培養して変異を起こさ
せ、生育可能な菌株のみを回収する。この際、メタノー
ル濃度としては、０．０００１〜５％程度が例示され
る。培地は人工培地、天然培地のいずれでもよい。培養
条件としては１５〜４０℃、１〜１０００時間程度が例
示される。Of these, the method for causing mutation in a medium containing methanol is specifically performed as follows. That is, first a suitable host, preferably Pichia yeast, specifically GTS115 strain (NRRL Deposit No. Y-
15851) to the AOX ₁ gene region by the conventional method.
_A transformant is obtained by introducing a plasmid having a transcription unit in which HSA is expressed under the control of _one promoter (see JP-A-2-104290). This transformant has weak growth ability in methanol medium. Therefore, this transformant is cultured in a medium containing methanol to cause a mutation, and only a viable strain is recovered. At this time, the methanol concentration is, for example, about 0.0001 to 5%. The medium may be an artificial medium or a natural medium. The culture conditions are, for example, 15 to 40 ° C. and about 1 to 1000 hours.

【００１６】また、ＨＳＡ産生宿主の培養方法（すなわ
ち、ＨＳＡの産生方法）としては、上記の各公報に記載
された方法の他に、フェッドバッチ培養により、高濃度
のグルコースを適度に少量づつ供給し、産生菌体に対す
る高濃度基質阻害を避けて高濃度の菌体と産生物を得る
方法（特願平１−２１９５６１号公報）、培地中に脂肪
酸を添加してＨＳＡの産生を増強する方法（特願平３−
８１７１９号公報）などが例示される。As a method for culturing the HSA producing host (that is, the method for producing HSA), in addition to the methods described in the above-mentioned publications, a high concentration of glucose is supplied in appropriate small amounts by fed batch culture. Then, a method for obtaining a high-concentration bacterial cell and a product by avoiding high-concentration substrate inhibition on the producing bacterial cell (Japanese Patent Application No. 1-219561), and a method for enhancing the production of HSA by adding a fatty acid to the medium (Patent application 3-
No. 81719).

【００１７】さらにＨＳＡの分離採取方法としては、上
記の各公報に記載された方法の他に加熱処理によるプロ
テアーゼの不活化（特開平３−１０３１８８号公報）、
陰イオン交換体、疎水性担体および活性炭からなる群よ
り選ばれた少なくとも一つを用いてＨＳＡと着色成分と
を分離することによる着色抑制方法（特開平４−５４１
９８号公報）などが例示される。Further, as a method for separating and collecting HSA, in addition to the methods described in the above-mentioned publications, inactivation of protease by heat treatment (JP-A-3-103188),
A method for suppressing coloration by separating HSA and a coloring component using at least one selected from the group consisting of an anion exchanger, a hydrophobic carrier and activated carbon (JP-A-4-541).
No. 98) is exemplified.

【００１８】形質転換宿主の培養に用いられる培地は、
通常この分野で既知の培地に炭素数１０〜２６の脂肪酸
またはその塩を添加したものが好適に使用され、培養条
件は一般的な常法に準じて実施される。培地は合成培
地、天然培地のいずれでもよく、液体培地が好ましい。
例えば、合成培地としては、一般に炭素源として各種糖
類、窒素源として尿素、アンモニウム塩、硝酸塩など、
微量栄養素として各種ビタミン、ヌクレオチドなどの
他、無機塩としてＭｇ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｎａ、Ｋ、Ｍｎ、
Ｃｏ、Ｃｕなどが使用される。ＹＮＢ液体培地〔０．７
％イーストナイトロジエンのベース（Difco 社製）、２
％グルコース〕などが挙げられる。また、天然培地とし
ては、ＹＰＤ液体培地〔１％イーストエキストラクト
（Difco 社製）、２％バクトペプトン（Difco 社製）、
２％グルコース〕が例示される。培地のｐＨは中性また
は弱塩基性、弱酸性でよい。また、メタノール資化性宿
主の場合は、メタノール含有培地を用いることができ
る。この場合メタノール濃度は０．０１〜５％程度であ
る。The medium used for culturing the transformed host is
Usually, a medium known in the art to which a fatty acid having 10 to 26 carbon atoms or a salt thereof is added is preferably used, and the culture condition is carried out according to a general conventional method. The medium may be a synthetic medium or a natural medium, and a liquid medium is preferable.
For example, as a synthetic medium, generally, various sugars as a carbon source, urea as a nitrogen source, ammonium salts, nitrates, etc.,
In addition to various vitamins and nucleotides as micronutrients, inorganic salts such as Mg, Ca, Fe, Na, K, Mn,
Co, Cu, etc. are used. YNB liquid medium [0.7
% East Knight Rojen's base (made by Difco), 2
% Glucose] and the like. As the natural medium, YPD liquid medium [1% yeast extract (manufactured by Difco), 2% bactopeptone (manufactured by Difco),
2% glucose] is exemplified. The pH of the medium may be neutral, weakly basic or weakly acidic. In the case of a methanol-assimilating host, a methanol-containing medium can be used. In this case, the methanol concentration is about 0.01-5%.

【００１９】培養温度は、１５〜４３℃（酵母は２０〜
３０℃、細菌は２０〜３７℃）が好ましい。培養時間は
１〜１０００時間程度であり、培養は静置または振盪、
攪拌、通気下に回分培養法や半回分培養法あるいは連続
培養法により実施される。The culturing temperature is 15 to 43 ° C. (yeast is 20 to 43 ° C.).
30 ° C., and bacteria preferably 20 to 37 ° C.). The culturing time is about 1 to 1000 hours, and the culturing is allowed to stand or shake,
It is carried out by a batch culture method, a semi-batch culture method or a continuous culture method under stirring and aeration.

【００２０】なお、当該培養に先立って前培養を行うこ
とが好ましい。この際の培地としては、例えばＹＮＢ液
体培地やＹＰＤ液体培地が使用される。前培養の培養条
件は次の通りである。すなわち、培養時間は１０〜１０
０時間、温度は酵母では３０℃、細菌では３７℃程度が
好ましい。培養終了後、ＨＳＡは培養濾液、菌体、細胞
などからそれぞれ公知の分離手段により採取される。It is preferable to carry out pre-culture prior to the culture. As the medium at this time, for example, YNB liquid medium or YPD liquid medium is used. The culture conditions of the preculture are as follows. That is, the culture time is 10 to 10
For 0 hours, the temperature is preferably 30 ° C. for yeast and 37 ° C. for bacteria. After completion of the culture, HSA is collected from the culture filtrate, cells, cells and the like by known separation means.

【００２１】（２）ＨＳＡの精製 ＨＳＡの精製工程としては、各種分画法、吸着クロマト
グラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ゲル濾
過、密度勾配遠心分離法、透析などの公知の方法が採用
される。(2) Purification of HSA In the purification step of HSA, known methods such as various fractionation methods, adsorption chromatography, affinity chromatography, gel filtration, density gradient centrifugation, dialysis and the like are adopted.

【００２２】当該精製工程としては、例えば以下の〜
を含む工程が好適に挙げられる。 ヒト血清アルブミンの産生宿主の培養上清を分画分
子量１０万〜５０万、および１０００〜５万の限外濾過
膜を用いて処理する。 ５０〜７０℃で３０分〜５時間加熱処理する。 ｐＨ３〜５で酸処理する。 分画分子量１０万〜５０万の限外濾過膜を用いて処
理する。 ｐＨ３〜５、塩濃度０．０１〜０．２Ｍの条件下で
陽イオン交換体に接触させた後に、ｐＨ８〜１０、塩濃
度０．２〜０．５Ｍの条件下で溶出する。 ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．５Ｍの条件下で
疎水性クロマト用担体に接触させて、非吸着画分を回収
する。そして ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．１Ｍの条件下で
陰イオン交換体に接触させて、非吸着画分を回収する。The purifying step is, for example,
A process including is preferable. The culture supernatant of the human serum albumin producing host is treated with ultrafiltration membranes having molecular weight cutoffs of 100,000 to 500,000 and 1,000 to 50,000. Heat treatment is performed at 50 to 70 ° C. for 30 minutes to 5 hours. Acid treatment at pH 3-5. Treatment is carried out using an ultrafiltration membrane having a molecular weight cutoff of 100,000 to 500,000. After contacting with a cation exchanger under conditions of pH 3 to 5 and salt concentration of 0.01 to 0.2M, elution is performed under conditions of pH 8 to 10 and salt concentration of 0.2 to 0.5M. The non-adsorbed fraction is recovered by bringing it into contact with the hydrophobic chromatography carrier under the conditions of pH 6 to 8 and salt concentration of 0.01 to 0.5M. Then, it is brought into contact with an anion exchanger under conditions of pH 6 to 8 and salt concentration of 0.01 to 0.1 M to collect the non-adsorbed fraction.

【００２３】また、前記工程の代わりに、ｐＨ６〜
８、塩濃度１〜３Ｍの条件下で疎水性クロマト用担体に
接触させた後に、ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．５
Ｍの条件下で溶出する工程、または前記工程の代わり
に、ｐＨ６〜８、塩濃度０．００１〜０．０５Ｍの条件
下で陰イオン交換体に接触させた後に、ｐＨ６〜８、塩
濃度０．０５〜１Ｍの条件下で溶出する工程、さらには
前記工程との間、との間、またはの後に、ｐ
Ｈ３〜５、塩濃度０．５〜３Ｍの条件下で塩析処理し、
沈澱画分を回収する工程をさらに含むものであってもよ
い。Further, instead of the above step, a pH of 6 to
8. After contacting the carrier for hydrophobic chromatography under the condition of salt concentration of 1 to 3 M, pH 6 to 8 and salt concentration of 0.01 to 0.5
The step of eluting under the condition of M, or instead of the above step, after contacting with an anion exchanger under the conditions of pH 6-8, salt concentration 0.001-0.05M, pH 6-8, salt concentration 0 The step of eluting under the condition of 0.05-1M, and further between, and after the step, p
Salting out under the conditions of H3-5 and salt concentration 0.5-3M,
It may further include a step of collecting the precipitated fraction.

【００２４】（３）ＨＳＡの脱色 ＨＳＡの脱色工程は、上記精製工程において、特に好ま
しくはその最後に組み込まれ、特定のリガンド部を有す
るキレート樹脂とＨＳＡとを接触させることにより行わ
れる。キレート樹脂の担体部分は疎水性を有する担体で
あることが好ましく、例えばスチレンとジビニルベンゼ
ンの共重合体、アクリル酸とメタクリル酸の共重合体な
どが挙げられる。(3) Decolorization of HSA The decolorization step of HSA is preferably carried out by bringing the chelating resin having a specific ligand portion, which is incorporated at the end of the purification step, into contact with HSA. The carrier portion of the chelate resin is preferably a carrier having hydrophobicity, and examples thereof include a copolymer of styrene and divinylbenzene and a copolymer of acrylic acid and methacrylic acid.

【００２５】一方、リガンド部は、Ｎ−メチルグルカミ
ン基などのポリオール基、イミノ基、アミノ基、エチレ
ンイミノ基などを分子内に複数個有するポリアミン基
（この中にはポリエチレンポリアミンなどのポリアルキ
レンポリアミン基も含まれる）、およびチオ尿素基が挙
げられる。上記担体部分とリガンド部を有するキレート
樹脂の市販品としては、担体部分がいずれもスチレンと
ジビニルベンゼンの共重合体であるDIAION CRB02（リガ
ンド部；Ｎ−メチルグルカミン基、三菱化成製）、DIAI
ON CR20 （リガンド部；−ＮＨ(CH ₂ CH ₂ NH)_n Ｈ、三
菱化成製）、LEWATIT TP214 （リガンド部；−ＮＨＣＳ
ＮＨ₂ 、バイエル製）、アンバライトＣＧ４０００など
が好適に使用される。On the other hand, the ligand portion is a polyamine group having a plurality of polyol groups such as N-methylglucamine group, imino group, amino group, ethyleneimino group, etc. in the molecule (polyalkylene groups such as polyethylene polyamine). Polyamine groups are also included), and thiourea groups. Commercially available chelating resins having the above-mentioned carrier portion and ligand portion include DIAION CRB02 (ligand portion; N-methylglucamine group, manufactured by Mitsubishi Kasei) whose carrier portion is a copolymer of styrene and divinylbenzene.
ON CR20 (ligand _{moiety; -NH (CH 2 CH 2 NH} ) n H, manufactured by Mitsubishi Kasei), LEWATIT TP214 (ligand moiety; -NHCS
NH ₂ , manufactured by Bayer), Amberlite CG4000 and the like are preferably used.

【００２６】当該キレート樹脂による処理条件は、好適
には次の通りである。 ｐＨ条件：酸性または中性（ｐＨ３〜９、好ましくはｐ
Ｈ４〜７) 時間：１時間以上、好ましくは６時間以上 イオン強度：５０ｍｍｈｏ以下、好ましくは１〜１０ｍ
ｍｈｏ 混合比：ＨＳＡ２５０ｍｇに対して樹脂０．１〜１００
ｇ、好ましくは１〜１０ｇ（湿重量）The treatment conditions with the chelate resin are preferably as follows. pH conditions: acidic or neutral (pH 3-9, preferably p
H4-7) Time: 1 hour or more, preferably 6 hours or more Ionic strength: 50 mmho or less, preferably 1-10 m
mho mixing ratio: 0.1 to 100 of resin for 250 mg of HSA
g, preferably 1-10 g (wet weight)

【００２７】（４）ホウ酸またはその塩による処理 上記工程（〜およびキレート樹脂処理を含む）を経
て得られたＨＳＡにおいては、フェノール硫酸法で検出
可能な非抗原性の夾雑物質が充分に除去されていない。(4) Treatment with boric acid or its salt In the HSA obtained through the above steps (including treatment with a chelating resin), non-antigenic contaminants detectable by the phenol-sulfuric acid method are sufficiently removed. It has not been.

【００２８】そこで、これらの処理終了後に得られるＨ
ＳＡを、ホウ酸またはその塩で処理することによって、
宿主由来の抗原性を有する夾雑物質、フェノール硫酸法
により検出可能な非抗原性の遊離の夾雑物質、およびパ
イロジェン（発熱性物質）を除去することができる。Therefore, H obtained after completion of these processes
By treating SA with boric acid or a salt thereof,
It is possible to remove host-derived contaminants having antigenicity, non-antigenic free contaminants detectable by the phenol sulfate method, and pyrogens (pyrogenic substances).

【００２９】使用されるホウ酸としては、例えばオルト
ホウ酸、メタホウ酸、四ホウ酸などが例示される。また
その塩としては、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリ
ウム塩など）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩な
ど）などが例示される。好ましくは、四ホウ酸カルシウ
ムを用いる。ホウ酸またはその塩の添加量は、終濃度で
０．０１〜１Ｍ程度、好ましくは０．０５〜０．２Ｍ程
度である。処理ｐＨは８〜１１程度、好ましくはｐＨ９
〜１０程度が例示される。また処理時間は１〜１０時間
程度が例示される。処理時の電導度は低電導度であるこ
とが好ましい。具体的には１ｍＳ以下が例示される。さ
らに、ＨＳＡ濃度は低濃度であることが好ましく、具体
的には５％以下、好ましくは０．１〜３％程度が例示さ
れる。Examples of the boric acid used include orthoboric acid, metaboric acid, tetraboric acid and the like. Examples of the salts include alkali metal salts (sodium salt, potassium salt, etc.), alkaline earth metal salts (calcium salt, etc.), and the like. Preferably, calcium tetraborate is used. The addition amount of boric acid or its salt is about 0.01 to 1 M, preferably about 0.05 to 0.2 M at the final concentration. The treatment pH is about 8 to 11, preferably pH 9
An example is about 10 to 10. The processing time is, for example, about 1 to 10 hours. The electric conductivity during the treatment is preferably low. Specifically, 1 mS or less is exemplified. Further, the HSA concentration is preferably low, and specifically 5% or less, preferably about 0.1 to 3%.

【００３０】ここにフェノール硫酸法とは、一般的には
糖質の比色定量法の一つであり、検体である糖水溶液に
フェノール水溶液を添加し、次いで濃硫酸を添加して振
盪することにより生ずる溶解熱を利用して糖から形成さ
れるフルフラール誘導体とフェノールとの反応呈色物を
比色測定する方法である。また、フェノール硫酸法で検
出可能な非抗原性の夾雑物質としては、例えば中性糖
（ペントース、ヘキソースなど）、単糖グリコシド（オ
リゴ糖、複合糖質、ウロン酸など）、メチル化糖などが
例示され、産生宿主由来成分に対する抗体とは抗原抗体
反応を起こさない夾雑物質を言う。Here, the phenol-sulfuric acid method is generally one of the colorimetric determination methods for sugars, in which a phenol aqueous solution is added to a sugar aqueous solution as a sample, and then concentrated sulfuric acid is added and shaken. Is a method for colorimetrically measuring a reaction color product of a furfural derivative formed from a sugar and phenol by utilizing the heat of dissolution generated by. Examples of non-antigenic contaminants that can be detected by the phenol-sulfuric acid method include neutral sugars (pentose, hexose, etc.), monosaccharide glycosides (oligosaccharides, glycoconjugates, uronic acid, etc.), methylated sugars, etc. As an example, an antibody against a component derived from a production host refers to a contaminant that does not cause an antigen-antibody reaction.

【００３１】ホウ酸またはその塩による処理終了後、例
えば遠心分離、濾過などにより沈殿を除去し、上清を回
収して濃縮脱塩する。After the treatment with boric acid or its salt is completed, the precipitate is removed by, for example, centrifugation or filtration, and the supernatant is recovered and concentrated and desalted.

【００３２】（５）限外濾過処理 本発明にかかるヒト血清アルブミンの製造方法において
は、回収されたＨＳＡを限外濾過処理することが望まし
く、分画分子量約１０万の限外濾過膜が好適に使用され
る。(5) Ultrafiltration Treatment In the method for producing human serum albumin according to the present invention, it is desirable to subject the recovered HSA to ultrafiltration treatment, and an ultrafiltration membrane having a molecular weight cutoff of about 100,000 is suitable. Used for.

【００３３】 （６）精製された遺伝子操作由来のＨＳＡの性状 本発明にかかるＨＳＡは、分子量約６万７千、等電点
４．６〜５．０の単一物質である。当該ＨＳＡは、単量
体のみからなり、二量体、重合体または分解物を実質的
に含まない。具体的には、二量体、重合体および分解物
の全含有量は０．０１％以下程度である。また、産生宿
主に由来する夾雑成分（例えば、蛋白質、多糖成分な
ど）を実質的に含まない。より詳細には（正確には）産
生宿主由来の夾雑成分のうち、抗原性を有するものを実
質的に含まない。具体的には、本発明のＨＳＡとして
は、ＨＳＡ２５％溶液の場合で、夾雑成分が１ｎｇ／ｍ
ｌ以下、好ましくは０．１ｎｇ／ｍｌ以下のものが例示
される。また、本発明にかかるＨＳＡとしては、多糖成
分が１ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは０．１ｎｇ／ｍｌ以
下のものが例示される。結果的にＨＳＡの純度としては
９９．９９９９９９％以上、好ましくは９９．９９９９
９９９％以上のものが例示される。当該ＨＳＡの着色度
としてはＨＳＡ２５％溶液の場合でＡ₃₅₀ ／Ａ₂₈₀ が
０．０１〜０．０５、Ａ₄₅₀ ／Ａ₂₈₀ が０．００１〜
０．０２、Ａ₅₀₀ ／Ａ₂₈₀ が０．００１〜０．００５程
度が例示される。また、ＨＳＡに結合している脂肪酸量
がＨＳＡ１分子当たり１分子以下、好ましくは０．１分
子以下のものが例示される。(6) Properties of purified genetically engineered HSA HSA according to the present invention is a single substance having a molecular weight of about 67,000 and an isoelectric point of 4.6 to 5.0. The HSA is composed of only a monomer and does not substantially contain a dimer, a polymer or a decomposed product. Specifically, the total content of dimers, polymers and decomposed products is about 0.01% or less. In addition, it is substantially free of contaminant components (eg, proteins, polysaccharide components, etc.) derived from the production host. More specifically, (accurately), the contaminant components derived from the production host are substantially free of antigenic components. Specifically, as the HSA of the present invention, in the case of a 25% HSA solution, a contaminant component is 1 ng / m 2.
One or less, preferably 0.1 ng / ml or less is exemplified. In addition, the HSA according to the present invention is exemplified by one having a polysaccharide component of 1 ng / ml or less, preferably 0.1 ng / ml or less. As a result, the purity of HSA is 99.999999% or more, preferably 99.9999.
Those of 999% or more are exemplified. As a coloring degree of the HSA, A ₃₅₀ / A ₂₈₀ is 0.01 to 0.05 and A ₄₅₀ / A ₂₈₀ is 0.001 in the case of a 25% HSA solution.
0.02 and A ₅₀₀ / A ₂₈₀ are about 0.001 to 0.005, for example. Further, the amount of fatty acid bound to HSA is 1 molecule or less, preferably 0.1 molecule or less per 1 molecule of HSA.

【００３４】特に本発明にかかるＨＳＡは、ヒト血清ア
ルブミン２５０mg当たり、 宿主由来の抗原性を有する夾雑物質が０．１ng未満
であり、 フェノール硫酸法により検出可能な非抗原性の遊離
の夾雑物質が１μｇ以下であり、かつ パイロジェンが０．１ＥＵ未満であることを特徴と
する。Particularly, the HSA according to the present invention has less than 0.1 ng of host-derived antigenic contaminants per 250 mg of human serum albumin, and non-antigenic free contaminants detectable by the phenol sulfate method. It is characterized in that it is 1 μg or less and the pyrogen is less than 0.1 EU.

【００３５】[0035]

【発明の効果】本発明にかかるＨＳＡは、上記夾雑物質
などに由来する各種副作用を回避することができる。し
たがって、安全なＨＳＡ製剤を提供することができる。
また、本発明にかかるヒト血清アルブミンの製造方法に
よれば、遺伝子操作により得られるＨＳＡにおいて、培
地中の或種の夾雑物質、微生物（産生宿主）が含有また
は分泌する物質などのＨＳＡ含有画分中に存在する夾雑
物質、特に宿主由来の抗原性を有する夾雑物質、フェノ
ール硫酸法により検出可能な非抗原性の遊離の夾雑物
質、およびパイロジェン（発熱性物質）を充分に除去す
ることができる。したがって、本発明方法により得られ
るＨＳＡは極めて高純度であり、特に本発明にかかるＨ
ＳＡを得ることができるという効果を奏する。EFFECT OF THE INVENTION The HSA of the present invention can avoid various side effects derived from the above contaminants and the like. Therefore, a safe HSA preparation can be provided.
Further, according to the method for producing human serum albumin of the present invention, in HSA obtained by genetic engineering, HSA-containing fractions such as a contaminant contained in a medium, a substance contained or secreted by a microorganism (production host), etc. It is possible to sufficiently remove contaminants present therein, especially contaminants having host-derived antigenicity, non-antigenic free contaminants detectable by the phenol sulfate method, and pyrogens (pyrogenic substances). Therefore, the HSA obtained by the method of the present invention has an extremely high purity, and especially HSA according to the present invention
The effect that SA can be obtained is produced.

【００３６】[0036]

【実施例】本発明をより詳細に説明するために実施例お
よび実験例を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限
定されるものではない。EXAMPLES Examples and experimental examples will be given to explain the present invention in more detail, but the present invention is not limited thereto.

【００３７】参考例１ (1) 使用菌株：Pichia pastoris GCP101株 特開平２−１０４２９０号公報に記載の方法により、ピ
キアパストリス（Pichia pastoris)ＧＴＳ１１５（ｈｉ
ｓ４）のＡＯＸ₁ 遺伝子領域に、ＡＯＸ₁ プロモーター
支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットを持つプラスミ
ドｐＰＧＰ１のＮｏｔ１で切断した断片を置換して、Ｐ
Ｃ４１３０が得られる。この株はＡＯＸ ₁ 遺伝子が存在
しないためにメタノールを炭素源とする培地での増殖能
が低くなっている（Ｍｕｔ−株）。Reference Example 1 (1) Strain used: Pichia pastoris GCP101 strain According to the method described in JP-A-2-104290,
Pichia pastoris GTS115 (hi
s4) AOX₁AOX in the gene region₁promoter
A plasmid with a transcriptional unit that expresses HSA under control
The fragment cleaved with Not1 of pPGP1 was replaced with P
C4130 is obtained. This strain is AOX ₁Gene present
Growth ability in a medium containing methanol as a carbon source
Is low (Mut- strain).

【００３８】ＰＣ４１３０をＹＰＤ培地（１％イースト
エキストラクト、２％バクトペプトン、２％グルコー
ス）３mlに植菌し、２４時間後に初期ＯＤ₅₄₀ ＝０．１
となるようにＹＰＤ培地５０mlに植菌した。３日間３０
℃で培養後に初期ＯＤ₅₄₀ ＝０．１となるようにＹＰＤ
培地５０mlに植菌した。さらに３日毎に同様の継代を繰
り返した。継代毎に菌体を１０⁷ cells/plate になるよ
うに滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ（メタノール）−Ｙ
ＮＢｗ／ｏａ．ａ．プレート（０．７％イーストナイト
ロジエンベースウイズアウトアミノアシッド、２％メタ
ノール、１．５％寒天末）に塗布し、３０℃５日間培養
してコロニーの有無を判断した。その結果、１２日間継
代後に塗布した２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．ａ．プ
レートから２０個のコロニーが生じた。このプレートで
はＭｕｔ−株はほとんど生育できず、Ｍｕｔ＋株は生育
できる。すなわち、このプレートではコロニーが生じる
ということはメタノールの資化性が上昇し、Ｍｕｔ＋に
変換した株が得られたことを示している。生じたコロニ
ーの内の１つを適当に滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−
ＹＮＢｗ／ｏａ．ａ．プレートに拡げ、シングルコロニ
ーに単離した。その１つをＧＣＰ１０１と名付けた。PC4130 was inoculated into 3 ml of YPD medium (1% yeast extract, 2% bactopeptone, 2% glucose), and after 24 hours, initial OD ₅₄₀ = 0.1.
To 50 ml of YPD medium. 3 days 30
YPD so that the initial OD ₅₄₀ = 0.1 after culturing at ℃
50 ml of medium was inoculated. The same passage was repeated every 3 days. For each passage, the cells were diluted with sterile water to 10 ⁷ cells / plate and diluted with 2% MeOH (methanol) -Y.
NBw / oa. a. It was applied to a plate (0.7% yeast nitriteene base without amino acid, 2% methanol, 1.5% agar powder) and cultured at 30 ° C. for 5 days to determine the presence or absence of colonies. As a result, 2% MeOH-YNBw / oa. a. The plate yielded 20 colonies. Mut-strains can hardly grow on this plate, while Mut + strains can grow. That is, the fact that colonies were formed on this plate indicates that the assimilation ability of methanol was increased and a strain converted to Mut + was obtained. One of the resulting colonies was appropriately diluted with sterile water and diluted with 2% MeOH-.
YNBw / oa. a. It was spread on a plate and isolated into a single colony. One of them was named GCP101.

【００３９】(2) 菌株の培養 （前々培養）グリセロール凍結ストック菌株１mlを２０
０mlのＹＰＤ培地（表１）を含むバッフル付１，０００
ml容三角フラスコに植菌、３０℃にて２４時間振盪培養
した。(2) Culture of strain (pre-preculture) 20 ml of 1 ml of glycerol frozen stock strain
Baffled 1,000 with 0 ml YPD medium (Table 1)
The cells were inoculated into an Erlenmeyer flask of ml volume and cultured at 30 ° C. for 24 hours with shaking.

【００４０】[0040]

【表１】 [Table 1]

【００４１】（前培養）ＹＰＤ培地５Ｌを含む１０Ｌ容
ジャーファーメンターに前々培養液を植菌し、２４時間
通気攪拌培養した。培養温度は３０℃、通気量は５Ｌ／
分とした。また、前培養においてはｐＨの制御は実施し
なかった。(Preculture) A pre-preculture solution was inoculated into a 10 L jar fermenter containing 5 L of YPD medium, and agitated and cultured for 24 hours. Culture temperature is 30 ℃, aeration rate is 5L /
Minutes Further, the pH was not controlled in the preculture.

【００４２】（本培養）バッチ培養用培地（表２）２５
０Ｌに前培養液を植菌し、１，２００Ｌ容ファーメンタ
ーを用いて通気攪拌培養した。槽内圧を０．５kg／c
m² 、最大通気量を８００Ｎ−L/min として溶存酸素濃
度が飽和溶存酸素濃度の５０％〜３０％程度を保持する
ように、攪拌速度を制御しながら回分培養を開始した。
回分培養において培地中のグリセロールが消費された時
点よりフィード培地（表３）の添加を開始した。このフ
ィード培地の添加にはコンピュータを使用し、培地中に
メタノールが蓄積しないように制御しながら高密度培養
を実施した。ｐＨは２８％アンモニア水を添加すること
により、ｐＨ５．８５に定値制御した。消泡は消泡剤
（Adecanol、旭電化工業製) を回分培養開始時に０．３
０ml／Ｌ添加しておき、その後は必要に応じて少量添加
することで実施した。(Main culture) Medium for batch culture (Table 2) 25
The preculture liquid was inoculated into 0 L and cultured with aeration and stirring using a 1,200 L volume fermenter. Tank pressure is 0.5 kg / c
Batch culture was started while controlling the stirring speed so that the dissolved oxygen concentration was maintained at about 50% to 30% of the saturated dissolved oxygen concentration with m ² and the maximum aeration amount set to 800 NL / min.
The addition of the feed medium (Table 3) was started when the glycerol in the medium was consumed in the batch culture. A computer was used to add this feed medium, and high-density culture was performed while controlling so that methanol did not accumulate in the medium. The pH was controlled to a fixed value of pH 5.85 by adding 28% ammonia water. For defoaming, add an antifoaming agent (Adecanol, manufactured by Asahi Denka Kogyo Co., Ltd.) to 0.3
It was carried out by adding 0 ml / L in advance and then adding a small amount as needed.

【００４３】[0043]

【表２】 [Table 2]

【００４４】[0044]

【表３】 [Table 3]

【００４５】参考例２ 参考例１のＧＣＰ１０１株から単離したＡＯＸ２プロモ
ーター [変異型、天然型ＡＯＸ２プロモーター（TEAST,
5, 167-177 (1988)またはMol. Cell, Biol.,9, 1316-1
323 (1989))中、開始コドン上流の２５５番目の塩基が
ＴからＣに変異したもの] を用いてＨＳＡ発現用プラス
ミドｐＭＭ０４２を構築し、ピキアパストリス(Pichia
pastoris) ＧＴＳ１１５株に導入し、形質転換体ＵＨＧ
４２−３株を得た（特願平３−６３５９９号公報）。参
考例１に準じてこのＵＨＧ４２−３株を培養し、ＨＳＡ
を産生させた。Reference Example 2 AOX2 promoter isolated from GCP101 strain of Reference Example 1 [mutant type, natural type AOX2 promoter (TEAST,
5, 167-177 (1988) or Mol. Cell, Biol., 9, 1316-1
323 (1989)), the HSA expression plasmid pMM042 was constructed by mutating the 255th base upstream of the start codon from T to C].
pastoris) introduced into GTS115 strain and transformed into UHG
42-3 strain was obtained (Japanese Patent Application No. 3-63599). This UHG42-3 strain was cultured according to Reference Example 1 to obtain HSA.
Was produced.

【００４６】参考例３ [i] 培養上清の分離〜膜分画（ＩＩ） 参考例１ないしは参考例２で得られた培養液約８００Ｌ
を圧搾することにより培養上清を分離した。培養上清を
分画分子量が３０万の限外濾過膜で処理した。次いで、
分画分子量が３万の限外濾過膜を用いて液量を約８０Ｌ
に濃縮した〔膜分画（Ｉ）〕。続いて、６０℃、３時間
の加熱処理を行った。加熱処理は５ｍＭカプリル酸ナト
リウム、１０ｍＭシステイン、１００ｍＭアミノグアニ
ジンの共存下にｐＨ７．５で行った。加熱処理液を急速
に約１５℃に冷却し、ｐＨ４．５に調整した後に、再度
分画分子量が３０万の限外濾過膜を用いて処理した〔膜
分画（ＩＩ）〕。次いで、分画分子量が３万の限外濾過
膜を用いてアルブミン溶液中の緩衝液を５０ｍＭ塩化ナ
トリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液，ｐＨ４．５に交換
した。Reference Example 3 [i] Separation of culture supernatant-membrane fraction (II) About 800 L of the culture solution obtained in Reference Example 1 or Reference Example 2
The culture supernatant was separated by pressing. The culture supernatant was treated with an ultrafiltration membrane having a molecular weight cut off of 300,000. Then
Approximately 80 liters of liquid using an ultrafiltration membrane with a molecular weight cut off of 30,000
Concentrated [membrane fraction (I)]. Subsequently, heat treatment was performed at 60 ° C. for 3 hours. The heat treatment was performed at pH 7.5 in the coexistence of 5 mM sodium caprylate, 10 mM cysteine, and 100 mM aminoguanidine. The heat-treated liquid was rapidly cooled to about 15 ° C., adjusted to pH 4.5, and then treated again with an ultrafiltration membrane having a cutoff molecular weight of 300,000 [membrane fraction (II)]. Next, the buffer solution in the albumin solution was replaced with a 50 mM acetate buffer solution containing 50 mM sodium chloride, pH 4.5, using an ultrafiltration membrane having a molecular weight cut off of 30,000.

【００４７】[ii] 陽イオン交換体処理 ５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液，ｐ
Ｈ４．５で平衡化したＳ−セファロース充填カラムにア
ルブミンを吸着させ、同緩衝液で十分洗浄したのち、
０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、
ｐＨ９でアルブミンの溶出を行った。[Ii] Cation exchanger treatment 50 mM acetate buffer containing 50 mM sodium chloride, p
After adsorbing albumin on an S-sepharose packed column equilibrated with H4.5 and thoroughly washing with the same buffer,
0.1M phosphate buffer containing 0.3M sodium chloride,
Elution of albumin was performed at pH 9.

【００４８】[iii] 疎水性クロマト処理 Ｓ−セファロース充填カラムから溶出されたアルブミン
溶液を０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸
緩衝液，ｐＨ６．８で平衡化したフェニルセルロファイ
ンを充填したカラムに添加した。この条件ではアルブミ
ンはフェニルセルロファインに吸着することなく、カラ
ムを通過した。カラムを通過したアルブミンは、分画分
子量３万の限外濾過膜を用いて液量を約５０Ｌに濃縮す
るとともに、アルブミン溶液中の緩衝液を５０ｍＭリン
酸緩衝液、ｐＨ６．８に交換した。[Iii] Hydrophobic Chromatography Treatment The albumin solution eluted from the column packed with S-Sepharose was loaded onto a column packed with phenylcellulofine equilibrated with 50 mM phosphate buffer containing 0.15 M sodium chloride, pH 6.8. Was added. Under this condition, albumin passed through the column without being adsorbed on phenylcellulofine. The albumin that passed through the column was concentrated to a volume of about 50 L using an ultrafiltration membrane having a molecular weight cut off of 30,000, and the buffer solution in the albumin solution was replaced with a 50 mM phosphate buffer solution, pH 6.8.

【００４９】[iv] 陰イオン交換体処理 疎水性クロマト処理後、濃縮及び緩衝液交換を行ったア
ルブミン溶液を５０ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ６．８で平
衡化したＤＥＡＥ−セファロースを充填したカラムに添
加した。この条件ではアルブミンはＤＥＡＥ−セファロ
ースに吸着することなく、カラムを通過した。[Iv] Treatment with anion exchanger After the hydrophobic chromatography, the concentrated and buffer-exchanged albumin solution was added to a column packed with DEAE-Sepharose equilibrated with 50 mM phosphate buffer, pH 6.8. did. Under these conditions, albumin passed through the column without being adsorbed on DEAE-Sepharose.

【００５０】[v] 脱色処理 ２５％濃度の精製ＨＳＡ１ｍｌにＤＩＡＩＯＮ ＣＲＢ
０２（担体部分はスチレン−ジビニルベンゼン共重合
体、リガンド部分はＮ−メチルグルカミン基からなるキ
レート樹脂，三菱化成製）１ｇを加え、ｐＨ６．８、イ
オン強度５ｍｍｈｏの条件下、室温で２４時間攪拌し
た。樹脂を蒸留水で洗浄し、非吸着画分をＨＳＡとして
回収した。[V] Decolorization treatment DIAION CRB was added to 1 ml of purified HSA having a concentration of 25%.
02 (carrier part is styrene-divinylbenzene copolymer, ligand part is chelating resin consisting of N-methylglucamine group, manufactured by Mitsubishi Kasei), 1 g is added, and pH is 6.8, ionic strength is 5 mmho, and room temperature is for 24 hours. It was stirred. The resin was washed with distilled water and the non-adsorbed fraction was collected as HSA.

【００５１】実施例１ 参考例１（または参考例２）および参考例３を経て調製
された酵母由来ＨＳＡ含有水溶液をＨＳＡ濃度２．５％
に調製し、溶液の電導度を１ｍＳ以下とした。四ホウ酸
カルシウムを終濃度が１００ｍＭになるように添加し、
ｐＨを９．５に維持した。１０時間程度放置した後に沈
殿を除去し、上清を回収して濃縮脱塩した。Example 1 A yeast-derived HSA-containing aqueous solution prepared through Reference Example 1 (or Reference Example 2) and Reference Example 3 was used to obtain an HSA concentration of 2.5%.
The conductivity of the solution was adjusted to 1 mS or less. Add calcium tetraborate to a final concentration of 100 mM,
The pH was maintained at 9.5. After standing for about 10 hours, the precipitate was removed, the supernatant was collected and concentrated and desalted.

【００５２】実施例２ 実施例１により回収されたＨＳＡ含有水溶液を、分画分
子量約１０万の限外濾過膜を用いて処理した。Example 2 The HSA-containing aqueous solution recovered in Example 1 was treated with an ultrafiltration membrane having a molecular weight cutoff of about 100,000.

【００５３】実施例３ 実施例１において、四ホウ酸カルシウムを終濃度が１０
０ｍＭになるように添加する代わりに、四ホウ酸ナトリ
ウムを終濃度が１００ｍＭになるように添加した後、さ
らに塩化カルシウムを終濃度が１００ｍＭになるように
添加する以外は、実施例１と同様にして処理した。Example 3 In Example 1, calcium tetraborate was used at a final concentration of 10
Instead of adding 0 mM, sodium tetraborate was added so that the final concentration was 100 mM, and then calcium chloride was further added so that the final concentration was 100 mM. Processed.

【００５４】実験例 参考例２および参考例３を経て調製された酵母由来ＨＳ
Ａ含有水溶液（検体１）をＨＳＡ濃度２５ｗ／ｖ％に調
製し、溶液の電導度を１ｍＳ以下とする。四ホウ酸カル
シウムを終濃度が１００ｍＭになるように添加し、ｐＨ
を９．５に維持した。１０時間程度放置した後に沈殿を
除去し、上清を回収して濃縮脱塩した（検体２）。さら
に分画分子量１０万の限外濾過膜を用いてＨＳＡ含有水
溶液を処理した（検体３）。各検体１〜３について下記
の項目の測定を行い、その結果を表４に記載した。Experimental Example Yeast-derived HS prepared through Reference Example 2 and Reference Example 3
An A-containing aqueous solution (specimen 1) is prepared to have an HSA concentration of 25 w / v% and the conductivity of the solution is 1 mS or less. Add calcium tetraborate to a final concentration of 100 mM and adjust the pH.
Was maintained at 9.5. After standing for about 10 hours, the precipitate was removed, the supernatant was collected, and concentrated and desalted (Sample 2). Further, the HSA-containing aqueous solution was treated with an ultrafiltration membrane having a cut-off molecular weight of 100,000 (Sample 3). The following items were measured for each of the samples 1 to 3, and the results are shown in Table 4.

【００５５】 ＨＳＡの回収率 ２８０ｎｍの吸光度測定またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳
動によりＨＳＡ量を測定し、回収率を算定した。Recovery rate of HSA The recovery rate was calculated by measuring the amount of HSA by measuring the absorbance at 280 nm or by SDS-PAGE electrophoresis.

【００５６】 ＥＩＡ法による夾雑物質量の測定 ＨＳＡ非産生酵母の培養上清を実施例２と同様の方法で
粗精製したものをウサギに免疫し、得られた抗血清を用
いて各検体１〜３の精製ＨＳＡ溶液中に存在する酵母由
来成分の検出を行った。測定は酵素免疫測定法（ＥＩ
Ａ）で行った。検体はＨＳＡ濃度として２５ｗ／ｖ％
（２５０mg／ml）に調整したものを用いて測定した。Measurement of amount of contaminants by EIA method Rabbits obtained by roughly purifying the culture supernatant of HSA-non-producing yeast in the same manner as in Example 2 were used to immunize rabbits, and the obtained antisera were used to The yeast-derived component present in the purified HSA solution of 3 was detected. The enzyme-linked immunosorbent assay (EI
A). The sample has an HSA concentration of 25 w / v%
It was measured using the one adjusted to (250 mg / ml).

【００５７】検体１では１０ng／mlであり、検体２およ
び３では０．１ng／mlの検出限界において酵母由来成分
は検出されなかった。The sample 1 had a concentration of 10 ng / ml, and the samples 2 and 3 had no detection of yeast-derived components at the detection limit of 0.1 ng / ml.

【００５８】 フェノール硫酸法による遊離の夾雑物質量の測定 各検体のＨＳＡ中の遊離の夾雑物質量を、公知の手法に
従ってフェノール硫酸法で測定した。まず、各ＨＳＡを
直接フェノール硫酸法で測定して、夾雑物質の総量（す
なわち、遊離状態のものおよび非遊離状態のものの合計
量）を算出した。一方、同じく各ＨＳＡをＣｏｎＡ−セ
ファロース（ファルマシア社製）で処理して、パス画分
であるＨＳＡをフェノール硫酸法で測定し、夾雑物質量
（非遊離状態のもの）を算出した。両者の測定量の差
が、遊離状態の夾雑物質量を意味する。標準曲線はマン
ナンを標準品として用いて作成した。以上の結果を表４
に示す。Measurement of Free Contaminant Substance Amount by Phenol Sulfuric Acid Method The amount of free contaminant substance in HSA of each sample was measured by the phenol sulfuric acid method according to a known method. First, each HSA was directly measured by the phenol-sulfuric acid method to calculate the total amount of contaminants (that is, the total amount of free substances and non-free substances). On the other hand, each HSA was similarly treated with ConA-Sepharose (manufactured by Pharmacia), HSA as a path fraction was measured by the phenol-sulfuric acid method, and the amount of contaminants (non-free state) was calculated. The difference between the measured amounts of the two means the amount of contaminants in the free state. The standard curve was prepared using mannan as a standard product. The above results are shown in Table 4.
Shown in.

【００５９】 パイロジェンの測定 生化学工業のエンドスペシーを用いて測定した。Measurement of Pyrogen It was measured using an end specie manufactured by Seikagaku Corporation.

【００６０】[0060]

【表４】 [Table 4]

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:84） (72)発明者 野田 宗宏 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 藤原 永年 大阪市都島区都島中通３丁目５番44号 株 式会社ミドリ十字都島工場内 (72)発明者 大村 孝男 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 横山 和正 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁵ Identification number Internal reference number FI technical display location // (C12P 21/02 C12R 1:84) (72) Inventor Munehiro Noda Osaka Prefecture Hirakata invitation Otani 2-chome, 25-1, Ltd., in the Midori Cross Central Research Institute (72) Inventor, Fujiwara, long-term, 3-5-44, Mitoshima Nakadori, Miyakojima-ku, Osaka City (72) Incorporated, Midori Cross, Miyajima Island Factory (72) Inventor Takao Omura Osaka 2-25-1, Otani Otani, Hirakata-shi, Fuchu, Central Research Laboratory, Midori Cross Co., Ltd. (72) Inventor, Kazumasa Yokoyama, 2- 25-1, Otani, Otani, Hirakata-shi, Osaka

Claims (3)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 遺伝子操作により得られるヒト血清アル
ブミンであって、ヒト血清アルブミン２５０mg当たり、 宿主由来の抗原性を有する夾雑物質が０．１ng未満
であり、 フェノール硫酸法により検出可能な非抗原性の遊離
の夾雑物質が１μｇ以下であり、かつ パイロジェンが０．１ＥＵ未満であることを特徴と
するヒト血清アルブミン。1. A human serum albumin obtained by genetic engineering, wherein a contaminant derived from a host having antigenicity is less than 0.1 ng per 250 mg of human serum albumin, and non-antigenicity detectable by the phenol sulfate method. The human serum albumin is characterized in that the amount of free contaminants is less than 1 μg and the pyrogen is less than 0.1 EU. 【請求項２】 遺伝子操作により得られるヒト血清アル
ブミンをホウ酸またはその塩にて処理することにより夾
雑物質を除去する工程を含むことを特徴とするヒト血清
アルブミンの製造方法。2. A method for producing human serum albumin, which comprises the step of removing contaminants by treating human serum albumin obtained by genetic engineering with boric acid or a salt thereof. 【請求項３】 夾雑物質を除去する工程を経た後、分画
分子量約１０万の限外濾過膜を用いて処理する工程を含
むことを特徴とする請求項１記載のヒト血清アルブミン
の製造方法。3. The method for producing human serum albumin according to claim 1, further comprising a step of treating with an ultrafiltration membrane having a cut-off molecular weight of about 100,000 after the step of removing contaminants. .