JPH0623758B2 - Ｂリンパ球分離材、分離方法および分離器 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、Ｂリンパ球分離材、分離方法および分離器に
関するものである。詳しく述べると、本発明は末梢血あ
るいは生体組織から得られるリンパ球分画を浮遊させた
細胞懸濁液あるいは白血球分画などのＢリンパ球含有液
からＢリンパ球を処理液中の細胞成分の機能的損傷を最
小限にとどめ、簡便かつ安価に高収率、高純度で分離す
るＢリンパ球分離材、分離方法および分離器を示すもの
である。

リンパ球は、血球系の幹細胞から分化した免疫機能を担
う細胞であり、機能あるいは細胞膜形質等の点からいく
つかの亜群に分けられる。それらは、抗体を産生し体液
性免疫を担うＢリンパ球、免疫調節性リンホカインや炎
症性リンホカイン等を産生し細胞生免疫を担うＴリンパ
球、およびヌル細胞等のリンパ球サブクラスであり、さ
らに、Ｔ，Ｂリンパ球には、機能的に異なるサブセット
が存在する。近年、このような免疫学的特性の異なる
Ｔ，Ｂリンパ球等のサブクラスを、機能的損傷を最小限
にとどめ純粋に分離、精製、濃縮する技術が、広範囲に
わたる社会的分野で強く望まれている。例えば細胞学、
免疫学などの基礎研究においては生体内免疫系の生体外
（in vitro）での解析において、少なくともＴ，Ｂリン
パ球群までの分離が必要であり、臨床医学にける診断、
治療等では、機能低下あるいは昴進した特定分画の移入
あるいは除去が必要であり、またリンパ系の生理活性物
質の取得においては、産生細胞分画の分離、濃縮が重要
である。

（従来の技術） Ｔリンパ球とＢリンパ球の分離方法としては、まずソデ
ィウムメトリゾエイトフィコール混液などの高密度等張
液を用いた比重遠心法により末梢血あるいは生体組織等
からリンパ球分画を得、続いてこれを分離処理してＴリ
ンパ球とＢリンパ球に分離するのが従来一般的である。
この後続する分離処理方法としては、大きく（１）細胞
膜表面の特異抗原、レセプター、免疫グロブリンを指標
とするもの、（２）物理的細胞分離および（３）吸着ク
ロマトグラフィーの３つに分けられる。

（１）の方法としては、ロゼット形成法、（抗体や免疫
複合体を結合させた）アフィニティークロマトグラフィ
ー、抗体、補体による細胞融解法、マイトジェン活性化
リンパ球の除去、フルオレセインアクチベイテッドセル
ソーター（Ｆ．Ａ．Ｃ．Ｓ．）などが知られているが、
これらの方法では、生物学的に特異性の高い強固な結合
や刺激を受けるため、インタクトな状態でＴリンパ球も
しくはＢリンパ球を回収するのが難しく、かつ大量処理
に向かない手法も多い。また、（２）の方法としては、
密度勾配遠心法、細胞電気泳動法などが知られている
が、Ｔリンパ球とＢリンパ球との間に比重、密度等の物
理的諸物性に際だった差がないため、分離回収された細
胞の収率あるいは純度に高い精度が要求できない。さら
に（３）の方法としては、ナイロン、テトロン、綿繊維
等の異物に対するＴリンパ球とＢリンパ球の非特異的接
着能力の差を利用するものが知られているが、高精度に
分離細胞を得るためには、吸着担体の牛胎児血清（ＦＣ
Ｓ）等による処理が必要であることや流速などの実施条
件の設定が難しく、マクロファージ等の不純物の混入も
多い。加えて、これらの従来の方法は、全般に、繁雑な
操作、あるいは準備がともない、分離操作を行う場合の
経験的技術的習熟が必須であるという大きな課題も存在
しているものであった。

（発明が解決しようとする問題点） 従って、本発明は、新規なＢリンパ球分離材、分離方法
および分離器を提供することを目的とする。本発明はま
た、細胞の諸活性に影響を与えることなく、簡便かつ安
価に高収率、高純度で分離するＢリンパ球分離材、分離
方法および分離器を示すものである。本発明はさらに、
大量処理に適したＢリンパ球分離材、分離方法および分
離器を提供することを目的とする。

（問題点を解決するための手段） 上記諸目的はさらに、水不溶性固体物質表面にスペーサ
ーを介して、ジペプチドおよびスルファチアゾールより
なる群から選ばれた少なくとも１種の免疫グロブリンと
高い親分性を有する有機合成されたリガンドが固定化さ
れていることを特徴とするＢリンパ球分離材によって達
成される。

本発明はまた、スペーサーが少なくとも２個以上の炭素
原子を有する炭化水素鎖ないしは特性基を含む炭化水素
鎖を骨格とするものであるＢリンパ球分離材を示すもの
である。本発明はさらに、スペーサーのメチレンの繰返
しが４個以上の直鎖アルキルを骨格とするものであるＢ
リンパ球分離材を示すものである。本発明はまた、スペ
ーサーが重合度１〜５０のエチレンオキサイド骨格を有
するものであるＢリンパ球分離材を示すものである。本
発明はまた、水不溶性固体物質が、合成有機高分子、天
然有機高分子または無機物からなる粒子体であるＢリン
パ球分離材を示すものである。本発明はまた、水不溶性
固体物質が、平均粒径０．０５〜５mmの粒子体であるＢ
リンパ球分離材を示すものである。

上記諸目的はまた、不水溶性固体物質表面にスペーサー
を介して、ジペプチドおよびスルファチゾールよりなる
群から選ばれた少なくとも１種の免疫グロブリンと高い
親和性を有する有機合成されたリガンドを固定化してな
る分離材に、Ｂリンパ球分有液を接触させ、膜表面に免
疫グロブリン分子（Ｓ−Ｉｇ）を有するＢリンパ球を選
択的に捕捉せしめることを特徴とするＢリンパ球の分離
方法により達成される。

本発明はまた分離材におけるスペーサーが少なくとも２
個以上の炭素原子を有する炭化水素鎖ないしは特性基を
含む炭化水素鎖を骨格とするものであるＢリンパ球の分
離方法を示すものである。本発明はさらに分離材におけ
るスペーサーのメチレンの繰返しが４個以上の直鎖アル
キル骨格とするものであるＢリンパ球の分離方法を示す
ものである。本発明はまた、分離材におけるスペーサー
が重合度１〜５０のエチレンオキサイド骨格を有するも
のであるＢリンパ球の分離方法を示すものである。本発
明はさらに、水不溶性固体物質が、合成有機高分子、天
然有機高分子または無機物からなるものであるＢリンパ
球の分離方法を示すものである。本発明はまた洗浄液と
して等張緩衝液を用いるものであるＢリンパ球の分離方
法を示すものである。

上記諸目的はさらに、粒子状の水不溶性固体物質表面に
スペーサーを介して、ジペプチドおよびスルファチアゾ
ールよりなる群から選ばれた少なくとも１種の免疫グロ
ブリンと高い親和性を有する有機合成されたリガンドを
固定してなる分離材を充填したカラムを有するＢリンパ
球の分離器により達成される。

本発明はまたカラムがポリプロピレンまたはポリカーボ
ネートからなるものであるＢリンパ球の分離器を示すも
のである。本発明はさらにカラムの出入口と分離材層と
の間には、Ｂリンパ球含有液中の細胞成分は通過するが
分離材は通過できない網目を有するフィルターを備えて
なるものであるＢリンパ球の分離器を示すものである。
本発明はさらにフィルターがポリエステルまたはポリア
ミドからなるものであるＢリンパ球の分離器を示すもの
である。なお、本明細書において「リガンド」とは蛋白
質に特異的に結合する物質をいう。

（作用） 公知のごとくＢリンパ球の細胞膜表面には、その分化の
度合などにより、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡなどそのクラ
スは異なるが、いずれも免疫グロブリンが存在してお
り、一方Ｔリンパ球の細胞膜表面には、実質的にこのよ
うな免疫グロブリンが存在しないことが知られている。

しかして、本発明に係るＢリンパ球分離材は、水不溶性
固体物質表面に、免疫グロブリンと高い親和性を有する
有機合成されたリガンドを固定化したことを特徴とする
ものであるので、該Ｂリンパ球分離材を例えばリンパ球
懸濁液等のＢリンパ球含有液と接触させた際、細胞膜表
面に免疫グロブリンを有するＢリンパ球と極めて高い親
和力を示し、Ｂリンパ球はＢリンパ球分離材に極めて高
い確率で捕捉される。一方、細胞膜表面に免疫グロブリ
ンを有しないＴリンパ球に対しては、親和力を示さず、
Ｔリンパ球はＢリンパ球分離材に捕捉されない。従っ
て、分離材吸着分画と分離材非吸着分画とを分離するこ
とによってＢリンパ球とＴリンパ球を高純度、高収率で
得ることができるものである。

さらに、本発明に係る別のリンパ球分離材は、水不溶性
固体物質表面にスペーサーを介して、免疫グロブリンと
高い親和性を有する有機合成されたリガンドを固定化し
たことを特徴とするものであるので、該Ｂリンパ球分離
材を例えばリンパ球懸濁液と接触させた際、Ｂリンパ球
分離材は細胞膜表面に免疫グロブリンを有するＢリンパ
球に対して極めて高い親和力を示し、Ｂリンパ球はＢリ
ンパ球分離材に極めて高い確率で捕捉される。一方、細
胞膜表面に免疫グロブリンを有しないＴリンパ球に対し
ては、Ｂリンパ球分離材は親和力を示さず、さらに水不
溶性固体物質表面と免疫グロブリンと高い親和性を有す
る有機合成されたリガンドとの間に介在するスペーサー
が、その流動性や排除体積効果によって細胞が分離材表
面に接近して相互作用することを妨げるために、上記の
ようにＢリンパ球分離材との相互作用力の弱いＴリンパ
球の非特異的接着を抑制するために、Ｔリンパ球はＢリ
ンパ球分離材に実質的に捕捉されない。従って、分離材
吸着分画と分離材非吸着分画とを分離することによって
Ｂリンパ球とＴリンパ球をより高純度、高収率で得るこ
とができるものである。

このため、例えば該Ｂリンパ球分離材を充填した液の出
入口を有するカラムにリンパ球懸濁液を一定速度で注入
し、直ちに等張緩衝液などの洗浄液によってカラム内の
非吸着分画を洗い流すことでＴリンパ球が簡便、迅速か
つ大量に高純度、高収率で得ることができる。このよう
に本発明は、一種の吸着クロマトグラフィー的手法を適
用するものであるが、本発明のＢリンパ球分離材の場
合、従来のアフィニティークロマトグラフィーのごと
く、担体に抗体や免疫複合体を固定化した場合とは異な
り、Ｂリンパ球に対しては明確な親和性を有するが、生
物学的に特異性の高い刺激等はいっさい与えないという
特性を有するため、分離されたＴリンパ球およびＢリン
パ球はインタクトな状態を保持しているものである。さ
らに、本発明のＢリンパ球分離材のこの様な親和性は、
動物種の由来に影響しないことも確められ、分離操作も
数分で完了し、また、リンパ球懸濁液の組成も単純等張
塩溶液でよくウシ胎児血清等の異種動物由来の濃厚血清
も必要がないというように、応用上における利点を数多
く有するものである。以下、本発明を実施態様に基づき
より詳細に説明する。

本発明のＢリンパ球分離材は、水不溶性固体物質表面
に、免疫グロブリンと高い親和性を有する有機合成され
たリガンドを固定化したことを特徴とするものである。
このように免疫グロブリンと高い親和性を有するリガン
ドとしては、ジペプチド、スルファチアゾールなどが挙
げられ、これらはリガンドとして単独であるいは複数組
合せて用いられる。

本発明のＢリンパ球分離材において、免疫グロブリンと
高い親和性を有するリガンドとして好適に用いられるス
ルファチアゾールのヘテロ原子は孤立電子対を有し、プ
ロトンアクセプターとして働く。また解離基の少ない複
素環は疎水水を示す。さらにサルファ剤のスルフォンア
ミド部分、 2−チオウラシルのチオール基あるいは水酸
基、イソニコチン酸ヒドラジドの酸アミド部分、ルミノ
ールのカルボニル基とイミノ基は水素結合性を有してい
る。この様に、Ｂリンパ球細胞膜表面の免疫グロブリン
と該化合物との相互作用において、該化合物の主要部分
の疎水性、ヘテロ原子による静電特性、主要部分付近の
水素結合性が、免疫グロブリン分子鎖中の吸着サイトの
アミノ酸残基とそれぞれ相互作用力を発揮し、加えて、
該化合物の立体構造が細胞膜表面の免疫グロブリン分子
内ポケットに適度に当てはまったために、非抗原／抗体
系の高い親和性が得られたものと考えられる。

また、本発明において用いられるジペプチドは、２個の
アミノ酸がペプチド結合を介して得られる合成化合物で
あり、これらのジペプチドの中でも、免疫グロブリン分
子と特異的な結合性を有するプロテインＡ等の公知の天
然物質のアフィニティーサイトを模倣したものが好まし
く、特にリジン、チロシンによるジペプチド、あるいは
アスパルチルフェニルアラニンメチルエステルなどのア
スパルチルフェニルアラニンアルキルエステル等の化合
物が極めて良好な結果を与える。

これらのジペプチドに関しても、免疫グロブリン分子鎖
中の特定な疎水性サイトや荷電サイトとの相互作用によ
って非抗原／抗体系の高い親和性が得られたものと考え
られる。

また本発明においては、ジペプチドに対してアミノ酸類
を併用することができ、これらのアミノ酸類は、単種の
アミノ酸、あるいは２種以上のアミノ酸を同時に用いた
ものであり、疎水性のバリン、ロイシン、チロシン、フ
ェニルアラニン、イソロイシン、トリプトファンや、塩
基性のリジン、アルギニン、あるいは酸性のプロリンお
よびアスパラギン酸およびその誘導体を単独あるいは複
数組合せて用いたものが特に良好な結果を与える。なお
これらの物質のＤ，Ｌ体の如何は問われない。

これらのアミノ酸類に関しても、先に述べたジペプチド
と同時に、免疫グロブリン分子鎖中の特定な疎水性サイ
トや荷電サイトとの相互作用によって、免疫グロブリン
を有するＢリンパ球と非抗原／抗体系の高い親和性が得
られたものと考えられる。

さらに、以上述べたような有機合成されたリガンドは、
単独で用いてもＢリンパ球に対する親和性を十分に発揮
できるが、特に、アルギニン、アスパラギン酸、フェニ
ルアラニン、プロリン等のアミノ酸と複素環式化合物で
あるスルファチアゾールを同時にリガンドとして用いた
場合には、極めて良好な結果が得られる。また、上記に
列記したこのようなリガンドは、ヒト、ウシ、ラット由
来の免疫グロブリンに対して高い親和性を持つことか
ら、対象とする細胞の動物種の如何を問わないものであ
る可能性が高いものとなる。

本発明のＢリンパ球分離材において、このような有機合
成されたリガンドを固定化させる担体としての水不溶性
固体物質としては、アガロース系、デキストラン系、セ
ルロース系、ポリアクリルアミド系、ポリビニルアルコ
ール系、ポリビニルピロリドン系、ポリアクリロニトリ
ル系、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、ポリスチ
レン系、アクリル酸エステル系、メタクリル酸エステル
系、ポリエチレン系、ポリプロピレン系、ポリ 4−フッ
化エチレン系、エチレン−鎖酸ビニル共重合体系、ポリ
アミド系、ポリカーボネート系、ポリフッ化ビニリデン
系、ポリビニルホルマール系、ポリアリレート系、ポリ
エーテルスルフォン系などの有機高分子、ガラス系、ア
ルミナ系、チタン系、活性炭系、セラミックス系などの
無機物などが挙げられるが、特に細胞接着性の高すぎな
いもの、すなわち、細胞−担体間の相互作用が比較的穏
やかなものが好まれ、特に好ましくはアクリル酸エステ
ル系などが用いられる。また、生体由来の天然有機高分
子であるコラーゲン、キトサン等も用いられ得る。この
ような水不溶性固体物質の形態としては、特に限定され
ず、平板上のものも用いることができるが、好ましく
は、粒子状、特に平均粒径が０．０５〜５mmの粒子状の
ものが望ましい。なお平均粒径はＪＩＳ−７−８８０１
に規定されるフルイを用いて分級した後、各級の上限粒
径と下限粒径の中間値を各級の粒径とし、その重量平均
として算出したものである。さらに粒子形状は細胞に物
理的な損傷を与えにくいことや均一な粒子を得やすい等
の点から球形のものが好ましい。

本発明のＢリンパ球分離材において、上記のごとき水不
溶性固体物質表面に有機合成されたリガンドを固定化す
る方法としては、共有結合、イオン結合、物理的吸着、
包埋あるいは担体表面への沈澱不溶化などあらゆる公知
の方法用いることができるが、固定化されたリガンドの
溶出性からみて、共有結合により固定、不溶化して用い
るのが好ましい。そのため一般に、固定化酵素、アフィ
ニティークロマトグラフィーの分野で用いられる公知の
不溶性担体の活性化法およびリガンドの固定化方法が、
好ましく用いられ得る。

本発明の別のＢリンパ球分離材は、水不溶性固体物質表
面にスペーサーを介して、免疫グロブリンと高い親和性
を有する有機合成されたリガンドが固定化されているこ
とを特徴とするものである。このＢリンパ球において用
いられる免疫グロブリンと高い親和性を有するリガンド
としては、上記に挙げたものと同様なものが用いられ、
その作用も同様であり、またこのような有機合成された
リガンドを固定化させる担体としての水不溶性固体物質
としても、上記に挙げたもの同様なものが用いられる。

本発明のこの別のＢリンパ球分離材において用いられる
スペーサーとは、分子状をなし、水不溶性固体物質表面
とリガンドとの間に介在して任意の長さを設けることが
できるものであればよく、水不溶性固体物質表面とリガ
ンドとの結合を立体的に阻害しない限り、どのような骨
格構造をもつものでもよい。水不溶性固体物質表面とリ
ガンドとの間にこのようなスペーサーが介在している
と、スペーサーの流動性や排除体積効果によって、細胞
が分離材表面に接近して相互作用することが妨げられ、
この結果、分離材との相互作用力の弱いＴリンパ球の接
着が優先的に抑制されるものと考えられ、Ｔリンパ球の
非特異的接着を抑制する効果が生まれる。

このようなスペーサーは、少なくとも２個以上の炭素原
子を有する、疎水性の炭化水素鎖ないしは分子鎖に水酸
基、カルボキシル基等やエーテル酸素などの特性基を含
む親水性の炭化水素鎖を骨格とするものであり、またそ
の分子鎖の両端に有していたエポキシ基やイソチオシア
ネート基等の公知の反応性官能基を、水不溶性物質表面
およびリガンドのアミノ基やカルボキシル基にそれぞれ
反応させて分子鎖の一端において水不溶性物質表面に、
他端においてリガンドに共有結合しているものである。

スペーサー骨格としての疎水性の炭化水素鎖としては、
単純なメチレンの繰返しからなるアルキル鎖、このアル
キル鎖中に一部炭素二重結合やベンゼン環等の種々の環
式置換基が含まれるもの、さらにはこのような分子鎖に
分岐があるものなどがあるが、好ましくはメチレンの繰
返しが４個以上、より好ましくはメチレンの繰返しが４
〜１０個の直鎖アルキル鎖が特にＴリンパ球の非特異的
接着を抑制するスペーサーとしての効果の高いものであ
る。またスペーサー骨格としての特性基を含む親水性の
炭化水素鎖としては、上記のアルキル鎖中に水酸基、カ
ルボキシル基、あるいはアミノ基等の解離性の官能基を
有するものや、エーテル酸素を有するものなどがあり、
同様に炭素二重結合や環式置換基あるいは分子鎖の分岐
があっても構わないが、好ましくは重合度１〜５０、よ
り好ましくは重合度４〜３０のエチレンオキサイド骨格
が、特にＴリンパ球の非特異的接着を抑制するスペーサ
ーとしての効果の高いものである。

なお水不溶性固体物質表面およびリガンドに共有結合し
て本発明のＢリンパ球分離材におけるスペーサーとなり
得る化合物の好ましい例としては、次に示すような構造
を有するものがあるが、もちろんこれらに限定されるも
のではない。

［式中Ｒ^１は炭素数２〜２０個、好ましくはメチレンの
繰返しが４〜１０個の直鎖アルキルである。］ ［式中、Ｒ^２，Ｒ^３はそれぞれ水素または炭素数１〜４
個のアルキル基であり、またｎは０〜４９、より好まし
くは３〜２９の数である。］ 本発明のこの別のＢリンパ球分離材を得るには、例え
ば、固定化酵素、アフィニティークロマトグラフィーの
分野で用いられる公知の方法に基づき、上記構造式
（Ｉ）または（II）で表わされるビスエポキシドのよう
な両端に反応性官能基を有し、スペーサーとして適度な
鎖長の分子骨格を有する化合物の該反応性官能基を、そ
れぞれ水不溶性固体物質表面およびリガンドのアミノ基
やカルボキシル基に反応させて共有結合させればよく、
免疫グロブリンに高い親和性を有するリガンドはスペー
サーを介して水不溶性固体物質表面に共有結合により強
固に結合されることとなる。

本発明のＢリンパ球の分離方法は、上記のごとき水不溶
性固体物質表面に免疫グロブリンＧと高い親和性を有す
る有機合成されたリガンドを固定化してなる分離材、ま
たは上記のごとき水不溶性固体物質表面にスペーサーを
介して免疫グロブリンと高い親和性を有する有機合成さ
せたリガンドを固定してなる分離材に、Ｂリンパ球含有
液を接触させ、膜表面に免疫グロブリン分子（Ｓ−Ｉ
ｇ）を有するＢリンパ球を選択的に捕捉せしめることに
より、Ｂリンパ球を効率よく分離するものである。

本発明のＢリンパ球の分離方法において処理対象として
用いられるＢリンパ球含有液としては、全血、全血を遠
心処理する等により得られた白血球分画、およびリンパ
球懸濁液などが含まれる。リンパ球懸濁液は、末梢血あ
るいは組織液などのリンパ球を含む細胞浮遊液から、血
漿分離器あるいは遠心分離装置等を用いてリンパ球分画
を他の血球成分から精製し、このリンパ球分画を適当な
溶液中に浮遊させることにより調製される。リンパ球分
画を浮遊させる溶液は、単純な等張塩溶液であっても、
また自己血清等を含むものであっても構わない。

本発明のＢリンパ球の分離方法において、リンパ球懸濁
液等のＢリンパ球含有液とのＢリンパ球分離材との接触
は、平板状のＢリンパ球分離材にＢリンパ球含有液を接
触させて行なうことも可能であるが、水不溶性固体物質
表面上の有機合成されたリガンドの絶対量や十分な細胞
吸着スペースを獲得するという点から、粒子状のＢリン
パ球分離材を充填してなるカラムを有するＢリンパ球分
離器を用い、これにＢリンパ球含有液を通液することに
より好適に行なわれる。

この粒子状のＢリンパ球分離材を充填してなるカラムを
有するＢリンパ球分離器において、カラム容器を構成す
る材質としては、ポリプロピレン、ポリカーボネート、
ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等の合成樹
脂、ガラスおよびステンレス等の金属などが使用できる
が、オートクレーブ滅菌が可能で取り扱いやすいポリプ
ロピレンやポリカーボネート等が特に好ましい。またこ
のＢリンパ球分離器のカラムの出入口とＢリンパ球分離
材を充填した分離材層との間には、Ｂリンパ球含有液の
細胞成分は通過するが分離材は通過できない網目を有す
るフィルターを備えていることが好ましく、このフィル
ターを構成する材質としては、生理学的に不活性で強度
の高いものであればよいが、特にポリエステル、ポリア
ミドであることが好まれる。

第１図は、本発明に係るＢリンパ球分離器の一実施例の
使用態様を示す模式図である。第１図に示すようにＢリ
ンパ球含有液としてのリンパ球を浮遊させたリンパ球懸
濁液１はＢリンパ球分離器の導入口９から、Ｂリンパ球
分離材５を充填されたカラム６内にポンプによって注入
される。なおＢリンパ球分離材５は、フィルター４ａ，
４ｂによりカラム６内に保持されている。リンパ球懸濁
液１を注入後、洗浄液８をポンプ３でカラム６内に注入
し、カラム内に残留している非捕捉細胞をリンスし、導
出口１０より流出してくる処理液７を回収する。この処
理液７は、分離材非吸着分画であり、高純度、高収率で
Ｔリンパ球を含むものである。

Ｂリンパ球分離材５に捕捉された細胞（Ｂリンパ球）を
遊離することなく、捕捉されなかった細胞（Ｔリンパ
球）を洗い落とすために用いられる洗浄液８としては、
等張緩衝液、細胞培養液等が用いられ、好ましくは２価
カチオンフリーの等張緩衝液、特に好ましくはハンクス
緩衝液（Ｈａｎｋｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓ
ｏｌｔｉｏｎ ：ＨＢＳＳ）などが用いられる。また
リンパ球懸濁液１の通液方法は、必要に応じて連続ある
いは非連続にしてもよく、さらには一定時間のインキュ
ベーションを加えても構わない。

さらにＢリンパ球分離材５に捕捉された細胞を回収する
場合には、洗浄液８により非捕捉細胞を洗浄除去した
後、Ｂリンパ球分離材５に捕捉された細胞とＢリンパ球
分離材５表面のリガンドとの結合力を適当な手段で弱め
てやればよく、例えば、アミノ酸、糖類あるいはアルブ
ミンを含む等張緩衝液等を溶離剤として用い、さらにカ
ラム６に物理的振動を与えるなどして溶離剤を流し捕捉
細胞を溶離回収すればよい。

また、本発明のＢリンパ球の分離方法において、Ｂリン
パ球分離材に対するＴリンパ球の非特異的付着性を低下
させ、収率を低下させるために、公知のごとく、分離材
にウシ血清アルブミン等により処理を行なった後、Ｂリ
ンパ球分離操作を行なうことも可能である。

（実施例） 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。

実施例１ 水不溶性固体物質として、オキシラン基を有するアクリ
ルビーズ（オイパーキッドＣ（ＥＣ），レーム ファル
マ［Ｒｈｍ Ｐｈａｒｍａ ］社製］（平均粒径０．
１５mm）を用い、リガンドとして複素環式化合物のスル
ファチアゾール（ＳＴ）を固定化したＢリンパ球選択捕
捉型分離材を作成した。

まず、０．２Ｍの炭酸緩衝液（ｐＨ１０）とジメチルホ
ルムアミドの混合液（容量比２：３）１００ml中に、濃
度０．１Ｍとなるようにスルファチアゾールを溶解し
た。該溶液中にオキシラン−アクリルビーズ（架橋性モ
ノマーの比率３０重量％）を０．１〜０．２mg／mlの割
合で投入し脱気した。これを８０℃の水浴中で３時間加
温した後に、ブラッドミキサー（萓垣医理科工業製，Ｂ
Ｍ−１０１）を使用して室温で一晩攪拌した。次いで、
未反応のオキシラン基を除去するために１Ｍ（ｐＨ８）
のエタノールアミン溶液を添加し一晩攪拌した。その
後、蒸留水、塩化ナトリウム０．５Ｍを含有する０．０
２Ｍ（ｐＨ４）の酢酸緩衝液、０．２Ｍ（ｐＨ１０）の
炭酸緩衝液、で順次洗浄しスルファチアゾール固定化ア
クリルビーズ（ＥＣ−ＳＴ）を得た。

このようにして得られた分離材を、内径３mm、外径４mm
のテフロンチューブからなるカラムに充填し、該チュー
ブの両端にポリエステル製フィルター（１５０メッシ
ュ）を有する端子を接続し、カラム内に吸着材を保持さ
せた。この吸着剤を充填したカラム内をハンクス緩衝液
（ＨＢＳＳ；ｐＨ７．２，Ｃａ²⁺，Ｍｇ²⁺フリー）で置
換し、続くＴ，Ｂリンパ球分離操作に供した。

一方リンパ球懸濁液は、ウィスター系ラットの腸間膜リ
ンパ節から単離されたリンパ球分画を、ＨＢＳＳを用い
て８００×１０^４細胞／mlに懸濁・希釈することによっ
て調製され、このリンパ球懸濁液は氷冷下で保存され、
希釈後１時間以内に使用された。

上記のごとき調製されたリンパ球懸濁液１mlをディスポ
ーサブルシリンジとシリンジポンプ（ともにテルモ株式
会社製）によって、１〜３ml／分の流速で、分離材を充
填した上記カラムに注入し、直ちにＨＢＢＳを用いて２
ml／分の流速で同様にカラムに注入してカラム内を洗浄
し、分離操作を完了した。回収した処理液は自動血球係
数数装置（オルソ インスツルメンツ［ORTHO INSTRUME
NTS］社製，ＥＬＴ−８）を用いて細胞密度を計測さ
れ、続いて処理液中のＢリンパ球のみをラットＩｇＧに
対する抗体を結合させたＦＩＴＣ（マイルズ［MILES 社
製）を用いて蛍光染色し、蛍光顕微鏡によって処理液中
のＢリンパ球をカウントし、処理液中のＴ，Ｂリンパ球
比を算出した。以上の操作によって、処理液中のＴリン
パ球の収率（ｙ）と純度（ｐ）、およびＢリンパ球に対
する特異性を表す指標として捕捉性（ＳＲ）を得た。結
果を第１表に示す。

実施例２ 水不溶性固体物質として、オキシラン基を有するアクリ
ルビーズ（オイパーキッドＣ，レームファルマ社製］に
スルファチアゾールとアルギニン，アスパラギン酸、フ
ェニルアラニン、プロリンを１６：１：１：１の割合で
混合した混合液を用いて、実施例１と同様にして、スル
ファチアゾール、アルギニン、アスパラギン酸、フェニ
ルアラニン、プロリン固定化アクリルビーズ（ＥＣ−Ｓ
ＴＡ）を作成した。

このＥＣ−ＳＴＡを用いて実施例１と同様にしてＴ，Ｂ
リンパ球分離操作を行なった。収率（ｙ）と純度
（ｐ）、および捕捉性（ＳＲ）に関して得られた結果を
第１表に示す。

実施例３ 水不溶性固体物質として架橋タイプのキトサンビーズ
（chitopearl（ＣＨ），富士紡績(株)製）（平均粒径
０．２５mm）を用いてスルファチアゾールを固定化した
Ｂリンパ球選択捕捉型分離材を作成した。

まず、水酸化ナトリウムでｐＨ７．０に調整した５w/v
％グルタルアルデヒド（ＧＡ）水溶液にキトサンビーズ
を浸して脱気した後、ブラッドミキサー（萓垣医理科工
業製，ＢＭ−１０１）を用いて室温で一晩攪拌した。蒸
溜水で洗浄したこの反応物を、ジメチルホルムアミドと
１０ｍＭ塩化カルシウム溶液（ｐＨ８）の混液（容量比
２：３）に溶解させた０．１Ｍスルファチアゾール溶液
に加えて脱気し、ブラッドミキサーで一晩撹拌した後、
ジメチルホルムアミドおよび蒸溜水でキトサンビーズを
洗浄した。次に、未反応のアルデヒド基をブロッキング
するために、１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８）溶液中で
脱気した後、ブラッドミキサーで一晩攪拌した。これを
再び蒸留水で洗浄し、１w/v ％の水素化ホウ素ナトリウ
ムを含む１０ｍＭ塩化カルシウム溶液（ｐＨ８）に加え
て４℃で反応させ、グルタルアルデヒドのアルデヒド基
とキトサンおよびスルファチアゾールのアミノ基との反
応によって生じたアゾメチンを還元させて安定化した。
最後に蒸留水、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含有する０．
０２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４）、および０．２Ｍ炭酸緩衝
液（ｐＨ１０）で数回洗浄して、スルフアチゾール固定
化キトサンビーズ（ＣＨ−ＧＡＳＴ）を得た。

このＣＨ−ＧＡＳＴを用いて、実施例１と同様にして
Ｔ，Ｂリンパ球分離操作を行なった。収率（ｙ）と純度
（ｐ）、および捕捉性（ＳＲ）に関して得られた結果を
第１表に示す。

比較例１ 比較のためにリガンドを結合させていないアクリルビー
ズ（ＥＣ）を用いて、実施例１の手順に従い、Ｔ，Ｂリ
ンパ球分離操作を行なった。結果を第１表に示す。

比較例２ 比較のためにリガンドを結合させていないキトサンビー
ズ（ＣＨ）を用いて、実施例１の手順に従い、Ｔ，Ｂリ
ンパ球分離操作を行なった。結果を第１表に示す。

これらの結果から明らかなように、免疫グロブリンに高
い親和性を有するリガンドを導入することによってＢリ
ンパ球の捕捉性が著しく向上すること、それにともない
回収された細胞懸濁液中のＴリンパ球濃度が高まること
が確認された。

実施例４ 実施例１と同様にして得られたスルファチアゾール固定
化アクリルビーズをカラム内に充填した後、カラム内に
０．５％ウシ血清アルブミンを注入し、１６時間放置
後、カラム内の遊離アルブミンを除去した、このように
してウシ血清アルブミンで処理したスルファチアゾール
固定化アクリルビーズ（ＡＥＣ−ＳＴ）を用いて、実施
例１の手順に従いＴ，Ｂリンパ球分離操作を行なった。
収率（ｙ）、純度（ｐ）および捕捉性（ＳＲ）に関して
得られた結果を第１表に示す。

第１表に示す結果から明らかように、アルブミン処理を
施さなかったＥＣ−ＳＴ（実施例１）と比較して、分離
効率において純度を低下させることなく２０％以上の収
率の向上が観察された。このことは吸着したアルブミン
がＢリンパ球−リガンド間の親和性を低下させることな
く、Ｔリンパ球の非特異的付着性を抑制する海面活性材
的効果を発揮したためと考えられる。

なお、収率（ｙ）、純度（ｐ）および捕捉性（ＳＲ）は
以下のようにして算出された。

さらに、本発明に係るＴ，Ｂリンパ球分離材（実施例１
〜４）においては、分離材１ｇ当り少なくとも１．０×
１０^７〜６．０×１０^７個程度のリンパ球を処理するこ
とが可能で、それに要する処理時間が約２分／カラムで
あり、しかも生存性、接着形態の面からみても際だった
細胞損傷も一切ないものであった。

実施例５ ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水で調製した５w/v ％
グルタルアルデヒド溶液を用いる以外は、実施例３と同
様にして架橋タイプのキトサンビーズにスルファチアゾ
ールをグルタルアルデヒドを用いて結合・固体化したス
ルファチアゾール固定化キトサンビーズ（ＣＨ−ＧＡＳ
Ｔ）を得た。

このようにして得られた分離材を、内径３mm、外径４mm
のテフロンチューブからなるカラムに充填し、該チュー
ブの両端にポリエステル製フィルター（１５０メッシ
ュ）を有する端子を接続し、カラム内に分離材を保持さ
せた。この分離材を充填したカラム内をハンクス緩衝液
（ＨＢＳＳ；ｐＨ７．２，ＣＡ²⁺，Ｍｇ²⁺フリー）で置
換し、続くＴ，Ｂリンパ球分離操作に供した。

一方、対象とするリンパ球を、ヒト末梢血からフィコー
ルパック（比重１．０７７、ファルマシア社製）を用い
た比重遠心分離によって採取し、ＨＢＢＳを用いて８０
０×１０^４細胞／mlに懸濁・希釈することによってリン
パ球懸濁液を調製した。

上記のごとく調製されたリンパ球懸濁液１mlをディスポ
ーサブルシリンジとシリンジポンプ（ともにテルモ株式
会社製）によって、第２表に示す一定流速で、分離材を
充填した上記カラムに注入し、直ちにＨＢＢＳを用いて
第２表に示す一定流速で同様にカラムに注入してカラム
内を洗浄し、分離操作を完了した。回収されたリンパ球
懸濁液の細胞数を自動血球係数装置（オルソ インスツ
ルメンツ［ORTHO INSTRUMENTS ］社製，ＥＬＴ−８）で
測定し、続いて回収液中のＢリンパ球のみを、ヒト免疫
グロブリンに対する抗体を結合させたＦＩＴＣ（マイル
ズ［ＭＩＬＥＳ］社製）で螢光染色を施し、螢光顕微鏡
によって回収液中のＦＩＴＣ陽性細胞をカウントし、Ｆ
ＩＴＣ染色細胞（ＦＩＴＣ（＋））とＦＩＴＣ非染色細
胞（ＦＩＴＣ（−））がカラム中に捕捉される割合を求
めた。結果を第２表に示す。

実施例６ 水不溶性担体としての架橋タイプのキトサンビーズ（Ｃ
Ｈ）にリガンドとしてアスパラギン酸とフェニルアラニ
ンからなるジペプチドであるα−Ｌ−アスパルチルフェ
ニルアラニンメチルエステル（ＡＴ、味の素（株）製）
をグルタルアルデヒドを用いて結合・固定化したＢリン
パ球分離材を作成した。なおこのＢリンパ球分離材はＣ
Ｈ−ＧＡＡＴと呼称した。

まず、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で
調製した５w/v ％グルタルアルデヒド溶液に、キトサン
ビーズを浸して脱気した後、ブラッドミキサー（萓垣医
理科工業製：ＢＭ−１０１）を用いて室温で攪拌した。
蒸留水で洗浄したこの反応物を、α−Ｌ−アスパチルフ
ェニルアラニンメチルエステルをリン酸緩衝生理食塩水
（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４に溶解させた０．１Ｍα−Ｌ−
アスパルチルフェニルアラニンメチルエステル溶液に加
えて脱気し、ブラッドミキサーで一晩撹拌した。

次に、このキトサンビーズを洗浄した後、未反応のアル
デヒド基をブロッキングするために、１Ｍエタノールア
ミン（ｐＨ８）溶液中で脱気した後、ブラッドミキサー
で一晩攪拌した。これを再び蒸留水で洗浄し、１w/v ％
の水素化ホウ素ナトリウムを含む１０m Ｍ塩化カルシウ
ム溶液に加えて４℃で反応させ、グルタルアルデヒドの
アルデヒド基とキトサンおよびα−Ｌ−アスパチルフェ
ニルアラニンメチルエステルのアミノ基との反応によっ
て生じたアゾメチン基を還元させて安定化した。最後
に、蒸留水、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２酢
酸緩衝液（ｐＨ４）、および０．２Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ
１０）で数回洗浄してα−Ｌ−アスパルチルフェニルア
ラニンメチルエステルを固定化したキトサンビーズ（Ｃ
Ｈ−ＧＡＡＴ）を得た。

このようにして得られた分離材ＣＨ−ＧＡＡＴを用いて
実施例５と同様にしてＴ，Ｂリンパ球分離操作を行なっ
た。結果を第２表に示す。

実施例７〜８ 不溶性担体としての架橋タイプのキトサンビース（Ｃ
Ｈ）にリガンドとしてスルファチアゾール（ＳＴ）また
はα−Ｌ−アスパチルフェニルアラニンメチルエステル
（ＡＴ）をエピクロルヒドリン（ＥＨ）を用いて結合・
固定化したＢリンパ球分離材を作成した。なおこのＢリ
ンパ球分離材はそれぞれＣＨ−ＥＨＳＴ（実施例７）お
よびＣＨ−ＥＨＡＴ（実施例８）と呼称した。

まず、２ＭのＮａＯＨとエピクロルヒドリンを４：１の
割合で混合し、蒸留水で５倍に希釈した溶液にキトサン
ビーズを加え、ブラッドミキサーを用いて４０〜４５℃
で２時間攪拌した。蒸留水で洗浄したこの反応物を、Ｄ
ＭＦと１０m Ｍ塩化カルシウム溶液の混液（２：３）に
溶解させた０．１Ｍスルファチアゾール溶液またはＰＢ
Ｓ（ｐＨ７．４）に溶解させた０．１Ｍα−Ｌ−アスパ
チルフェニルアラニンメチルエステル溶液に０．１〜
０．７ｇ／mlの割合で加えて脱気し、ブラッドミキサー
を用いて室温で一晩攪拌した。

次に、未反応のオキシラン基をブロッキングするために
濃度１Ｍ（ｐＨ８）のエタノールアミン溶液を添加し、
一晩攪拌した。その後、蒸留水、塩化ナトリウム０．５
Ｍを含む濃度０．０２Ｍ（ｐＨ４）の酢酸緩衝液、濃度
０．２Ｍ（ｐＨ１０）の炭酸緩衝液で順次洗浄しスルフ
ァチアゾール固定化キトサンビーズ（ＣＨ−ＥＨＳＴ）
およびα−Ｌ−アスパチルフェニルアラニンメチルエス
テル固体化キトサンビーズ（ＣＨ−ＥＨＡＴ）を得た。

このようにして得られた分離材ＣＨ−ＥＨＳＴおよびＣ
Ｈ−ＥＨＳＴを用いて、リンパ球懸濁液注入速度および
洗浄速度を第２表に示す以外は実施例５と同様にして
Ｔ，Ｂリンパ球分離操作を行なった。結果を第２表に示
す。

比較例３〜４ 比較のために架橋タイプのキトサンビーズ（ＣＨ）をそ
のまま分離材として用いて、第２表に示すリンパ球懸濁
液注入速度および洗浄速度にて実施例５と同様にして
Ｔ，Ｂリンパ球分離操作を行なった。結果を第２表に示
す。

第２表に示す結果から明らかなように、本発明に係るＢ
リンパ球分離材（実施例５〜８）は、第１表に示す結果
と同様にＢリンパ球を優先的に捕捉する分離材として有
効であることがわかった。また、実施例５〜８に係るＢ
リンパ球分離材においても、生存性、接着形態の面から
みても際だった細胞損傷の一切ないものであった。

実施例９ ポリエチレンオキサイド鎖を有するビスエポキシド（Ｅ
Ｇ２２，ナガセ化成工業(株)製）（エチレンオキサイド
繰返し度２２）をスペーサーとして用い、オキシラン基
を有するアクリルビーズ（オイパーギッドＣ（ＥＣ）、
レーム ファルマ［Ｒｈｍ Ｐｈａｒｍａ ］社製）
（平均粒径０．１５mm）にリガンドとして複素環式化合
物であるスルファチアゾール（ＳＴ）を結合・固定化し
てＢリンパ球分離材を作成した。なおこのＢリンパ球分
離材はＥＣ−ＥＧ２２ＳＴと呼称した。

まず、炭酸緩衝液（ｐＨ１０）に溶解した０．２Ｍの1,
3 −プロパンジアミン溶液に、蒸溜水で予め洗浄したＥ
Ｃ ３０ｇを加えた脱気した後、８０℃の水浴中で３時
間反応させた。そしてブラッドミキサー（萓垣医理科工
業(株)製，ＢＭ−１０１）を用いて室温にて一晩攪拌
し、蒸留水で洗浄した。次に、このようにしてアミノ基
を導入したＥＣ１８ｇ（湿潤重量）を、炭酸緩衝液（ｐ
Ｈ１０）を用いて作成した１０％（w/v ）ＥＧ２２溶液
に加え、全量を１００mlとし、ブラッドミキサーで一晩
回転混合した後、８０℃の水浴中で１時間反応させ、蒸
留水で洗浄した。これを再び炭酸緩衝液（ｐＨ１０）と
ジメチルホルムアミドの混合液（容量比２：３）を用い
た０．１Ｍスルファチアゾール溶液１００ml中に加え、
80℃の水浴中で３時間反応させ、ブラッドミキサーで一
晩回転混合した。さらに、未反応のオキシラン基をブロ
ッキングするために、濃度１Ｍ（ｐＨ８）のエタノール
アミン１００mlを添加し、一晩攪拌した。その後、蒸留
水、塩化ナトリウム０．５Ｍを含む濃度０．０２Ｍ（ｐ
Ｈ４）の酢酸緩衝液、濃度０．２Ｍ（ｐＨ１０）の炭酸
緩衝液で順次洗浄し、ポリエチレンオキサイド鎖を介し
てスルファチアゾールを固定化したアクリルビーズ（Ｅ
Ｃ−ＥＧ２２ＳＴ）を得た。

このようにして得られた分離材を、内径３mm、外径４mm
のテフロンからなるカラムに充填し、該チューブの両端
にポリエステル製フィルター（１５０メッシュ）を有す
る端子を接続し、カラム内に分離材を保持させた。この
分離材を充填したカラム内をハンクス緩衝液（ＨＢＳ
Ｓ；ｐＨ７．２，Ｃａ²⁺，Ｍｇ²⁺フリー）で置換し、続
くＴ，Ｂリンパ球分離操作に供した。

一方、対象とするリンパ球を、ヒト末梢血からフィコー
ルパック（比重１．０７７、ファルマシア社製）を用い
た比重遠心分離によって採取し、ＨＢＢＳを用いて８０
０×１０^４細胞／mlに懸濁・希釈することによってリン
パ球懸濁液を調製した。

上記のごとく調製されたリンパ球懸濁液１mlをディスポ
ーサブルシリンジとシリンジポンプ（ともにテルモ株式
会社）によって、第３表に示す一定流速で、分離材を充
填した上記カラムに注入し、直ちにＨＢＢＳを用いて第
３表に示す一定流速で同様にカラムに注入してカラム内
を洗浄し、分離操作を完了した。回収されたリンパ球懸
濁液の細胞数を自動血球計数装置（オルソ イスツルメ
ンツ［ORTHO INSTRUMENTS ］社製，ＬＥＴ−８）で測定
し、続いて回収液中のＢリンパ球のみを、ヒト免疫グロ
ブリンに対する抗体を結合させたＦＩＴＣ（マイルズ
［ＭＩＬＥＳ］社製）で螢光染色を施し、螢光顕微鏡に
よって回収液中のＦＩＴＣ陽性細胞をカウントし、ＦＩ
ＴＣ染色細胞（ＦＩＴＣ（＋））とＦＩＴＣ非染色細胞
（ＦＩＴＣ（−））がカラム中に捕捉される割合を求め
た。結果を第３表に示す。

比較例５ 比較のために、オキシラン基を有するアクリルビーズ
（オイパーギットＣ（ＥＣ）、レーム ファルマ社製）
をそのまま分離材として用いて、実施例９の手順に従
い、Ｔ，Ｂリンパ球分離操作を行なった。結果を第３俵
に示す。

実施例１０ ポリエチレンオキサイド鎖を有するビスエポキシド（Ｅ
Ｇ２２，ナガセ化成工業(株)製）をスペーサーとして用
い、架橋タイプのキトサンビーズ（chitopearl（Ｃ
Ｈ）、富士紡績(株)社製）（平均粒径０．３mm）にリガ
ンドとしてスルファチアゾール（ＳＴ）を結合・固定化
してＢリンパ球分離材を作成した。なおこのＢリンパ球
分離材はＣＨ−ＥＧ２２ＳＴと呼称した。

まず、予め蒸留水で洗浄した３０ｇ（湿潤重量）のキト
サンビーズを、炭酸緩衝液（ｐＨ１０）を用いて調製し
た１０％（w/v ）ＥＧ２２溶液に加え、全量を１００ml
とし、ブラッドミキサーで一晩回転混合した後、８０℃
の水浴中で１時間反応させ、蒸留水で洗浄した。これを
再び炭酸緩衝液（ｐＨ１０）とジメチルホルムアミドの
混合液（容量比２：３）を用いた０．１Ｍスルファチア
ゾール溶液１００ml中に加え、８０℃の水浴中で３時間
反応させ、ブラッドミキサーで一晩回転混合した。さら
に、未反応のオキシラン基をブロッキングするために濃
度１Ｍ（ｐＨ８）のエタノールアミン１００mlを添加し
一晩攪拌した。その後、蒸留水、塩化ナトリウム０．５
Ｍを含む濃度０．０２Ｍ（ｐＨ４）の酢酸緩衝液、濃度
０．２Ｍ（ｐＨ１０）の炭酸緩衝液で順次洗浄し、スル
ファチアゾールを固定化したキトサンビーズ（ＣＨ−Ｅ
Ｇ２２ＳＴ）を得た。

このようにして得られた分離材ＣＨ−ＥＧ２２ＳＴを用
いて、実施例９と同様にしてＴ，Ｂリンパ球分離操作を
行なった。結果を第３表に示す。

比較例６ 比較のために架橋タイプのキトサンビーズ（chitopea
l，（ＣＨ）富士紡績(株)社製）のそのまま分離材とし
て用いて、実施例９の手順に従い、Ｔ，Ｂリンパ球分離
操作を行なった。結果を第３表に示す。

第３表に示す結果から明らかなように、各分離条件にお
いて、スペーサーを介してスルファチアゾールを結合し
た分離材（実施例９〜１０）は、リンパ球そのものの接
着性を著しく低下させるとともに、Ｂリンパ球に対する
高い親和性を損なうことなくＴリンパ球の非特異的接着
を抑制し、高精度なＴ，Ｂリンパ球選択性を有するもの
であった。さらにこのような高度の選択性の発現は、水
不溶性固体物質がアクリルビーズ（ＥＣ）である場合で
もキトサンビーズ（ＣＨ）である場合でも観察され、
Ｔ，Ｂリンパ球選択性は水不溶性固体物質の種類に依存
しないことが確認された。

実施例１１〜１２ スペーサーとしてエチレンオキシサイドの繰返し度が１
のエチレンオキサイド鎖を有するビスエポキシド（ＥＧ
１，ナガセ化成工業(株)製）（実施例１１）または繰返
し度が９のビスエポキシド（ＥＧ９，ナガセ化成工業
(株)製）（実施例１２）を用いる以外は実施例９と同様
にしてエチレンオキサイド鎖を介してスルファチアゾー
ルを固定化したアクリルビーズを作成した。なお得られ
たＢリンパ球分離材はそれぞれＥＣ−ＥＧ１ＳＴ（実施
例１１）、ＥＣ−ＥＧ９ＳＴ（実施例１２）と呼称し
た。この分離材ＥＣ−ＥＧ１ＳＴまたはＥＣ−ＥＧ９Ｓ
Ｔを用いてリンパ球懸濁液注入速度および洗浄速度を第
４表に示す速度とする以外は実施例９と同様にして、
Ｔ，Ｂリンパ球分離操作を行なった。結果を第４表に示
す。

実施例１３ 実施例９と同様にしてＥＣ−ＥＧ２２ＳＴを作成し、こ
の分離材を用いてリンパ球懸濁液注入速度および洗浄速
度を第４表に示す速度とする以外は実施例９と同様にし
て、Ｔ，Ｂリンパ球分離操作を行なった。結果を第４表
に示す。

実施例１４〜１５ スペーサーとしてメチレンの繰返し度が４の 1,4−ブタ
ンジオールジグリシジルエーテル（ＭＥ４，東京化成
(株)製）（実施例１４）またはメチレンの繰返し度がの
1,6−ヘキサンジオールジグリシジルエーテル（ＭＥ
６，東京化成(株)製）（実施例１５）を用い、その溶液
として炭酸緩衝液（ｐＨ１０）とジメチルホルムアミド
の混合液（容量比９：１）を用いて調製した１０（w/v
）％ＭＥ４溶液、炭酸緩衝液（ｐＨ１０）、ジメチル
ホルムアミドおよび蒸留水の混液（容量比２：２：１）
を用いて調製した１０（w/v ）％ＭＥ６溶液とする以外
は実施例９と同様にしてポリエチレン鎖を介してスルフ
ァチアゾールを固定化したアクリルビーズを作成した。
なお得られたＢリンパ球分離材はそれぞれＥＣ−ＭＥ４
ＳＴ（実施例１４）、ＥＣ−ＭＥ６ＳＴ（実施例１５）
と呼称した。

この分離材ＥＣ−ＭＥ４ＳＴまたはＥＣ−ＭＥ６ＳＴを
用いてリンパ球懸濁液注入速度および洗浄速度を第４表
に示す速度とする以外は実施例９と同様にして、Ｔ，Ｂ
リンパ球分離操作を行なった。結果を第４表に示す。

第４表に示す結果から明らかなように、スペーサを介し
てスルファチアゾールを結合した分離材は、Ｂリンパ球
に対する高い親和性の損なうことなくＴリンパ球の非特
異的接着を抑制し、高精度なＴ，Ｂリンパ球分離能を維
持することがわかり、特にＥＧ９（実施例１２）、ＥＧ
２２（実施例１３）およびＭＥ４（実施例１４）をスペ
ーサとして用いたものは際だったＴ，Ｂ選択性を示し
た。

実施例１６ スペーサーとしてエチレンオキサイドの繰返し度が１の
エチレンオキサイド類を有するビスエポキシド（ＥＧ
１、ナガセ化学工業（株）製）用い、その溶液として炭
酸緩衝液（ｐＨ１０）とジメチルホルムアミドの混液
（容量比９：１）を用いて調製した１０（w/v ）％ＥＧ
１溶液とする以外は実施例１０と同様にして、エチレン
オキサイド鎖を介してスルファチアゾールを固定化した
キトサンビーズを作成した。なお得られたＢリンパ球分
離材はＣＨ−ＥＧ１ＳＴと呼称した。

この分離材ＣＨ−ＥＧ１ＳＴを用いてリンパ球懸濁液注
入速度および洗浄速度を第５表に示す速度とする以外は
実施例１０と同様にしてＴ，Ｂリンパ球分離操作を行な
った。結果を第５表に示す。

実施例１７ スペーサーとしてエチレンオキサイド鎖を３本有する３
官能性のトリエポキシド（ＥＧ３、ナガセ化成工業
（株）製）を用いる以外は、実施例１０と同様にしてエ
チレンオキサイド鎖を介してスルファチアゾールを固定
化したキトサンビーズを作成した。なお得られたＢリン
パ球分離材はＣＨ−ＥＧ３ＳＴと呼称した。

この分離材ＣＨ−ＥＧ３ＳＴを用いて、リンパ球懸濁液
注入速度および洗浄速度を第５表に示す速度とする以外
は実施例１０と同様にしてＴ，Ｂリンパ球分離操作を行
なつた。結果を第５表に示す。

実施例１８ スペーサーとしてエチレンオキサイドの繰返し度が９の
ポリエチレンオキサイド鎖を有するビスエポキシ（ＥＧ
９、ナガセ化成工業（株）製）を用いる以外は実施例１
０と同様にして、ポリエチレンオキサイド鎖を介してス
ルファチアゾールを固定化したキトサンビーズを作成し
た。なお得られたＢリンパ球分離材はＣＨ−ＥＧ９ＳＴ
と呼称した。

この分離材ＣＨ−ＥＧ９ＳＴを用いて、リンパ球懸濁液
入速度および洗浄速度を第５表に示す速度とする以外は
実施例１０と同様にして、Ｔ，Ｂリンパ球分離操作を行
なった。結果を第５表に示す。

実施例１９ 実施例１０と同様にしてＣＨ−ＥＧ２２ＳＴを作成し、
この分離材を用いて、リンパ球懸濁液注入速度および洗
浄速度を第５表に示す速度とする以外は実施例１０と同
様にしてＴ，Ｂリンパ球分離操作を行なった。結果を第
５表に示す。

実施例２０〜２１ スペーサとしてメチレンの繰返し度が４の 1,4−ブタン
ジオールジグリシジルエーテル（ＭＥ４、東京化成
（株）製）（実施例２０）またはメチレンの繰返し度が
６の 1,6−ヘキサンジオールジグリシジルエーテル（Ｍ
Ｅ６，東京化成（株）製）（実施例２１）を用い、その
溶液として炭酸緩衝液（ｐＨ１０）を用いて調製した１
０（w/v)％ＭＥ４溶液、炭酸緩衝液（ｐＨ１０）、ジメ
チルホルムアミドおよび蒸留水の混合液（容量比２：
２：１）を用いて調製した１０（w/v ）％ＭＥ６溶液と
する以外は実施例１０と同様にして、ポリメチレン鎖の
介してスルファチアゾールを固定化したキトサンビーズ
を作成した。なお得られたＢリンパ球分離材はそれぞれ
ＣＨ−ＭＨ４ＳＴ（実施例２０）、ＣＨ−ＭＥ６ＳＴ
（実施例２１）と呼称した。

この分離材ＣＨ−ＭＥ４ＳＴまたはＣＨ−ＭＥ６ＳＴを
用いて、リンパ球懸濁液注入速度および洗浄速度を第５
表に示す速度となる以外は実施例１０と同様にして、
Ｔ，Ｂリンパ球分離操作を行なった。結果を第５表に示
す。

第５表に示す結果から明らかなように、スペーサーを介
してスルファチアゾールを結合した分離材は、第５表に
示す結果と同様に、Ｂリンパ球に対する高い親和性を損
なうことなくＴリンパ球の非特異的接着を抑制し、高精
度なＴ，Ｂリンパ球分離能を維持することがわかり、特
にＥＧ２２（実施例１９）、ＭＥ４（実施例２０）およ
びＭＥ６（実施例２１）をスペーサとして用いたもの
は、１０％に満たないＦＩＴＣ（−）の捕捉率とＦＩＴ
Ｃ（＋）の捕捉率が８０％という際だった選択性を示し
た。

実施例２２〜２５ 比重遠心分離法によってヒト末消血より得られたリンパ
球分画には主としてＴリンパ球およびＢリンパ球の他、
単球あるいはヌル細胞等の不純物が存在することから、
これらの非Ｔ，Ｂリンパ球系細胞（Ｎ）の混入をペルオ
キシダーゼ染色法、イムノビーズ法によって評価した。
すなわち、実施例９と同様にして得られたＥＣ−ＥＧ２
２ＳＴ、実施例１０と同様にして得られたＣＨ−ＥＧ２
２ＳＴ、実施例２０と同様にして得られたＣＨ−ＭＥ４
ＳＴ、または実施例２１と同様にして得られたＣＨ−Ｍ
Ｅ６ＳＴを用いて、リンパ球懸濁液の注入速度および洗
浄速度を第６表に示す速度で行なう以外は実施例９と同
様にしてＴ，Ｂリンパ球分離操作を行ない、分離操作前
後をリンパ球懸濁液中の非Ｔ，Ｂリンパ球系細胞（Ｎ）
の混入の割合を上記方法により評価し、さらに分離操作
によって回収されたＴリンパ球の収率および純度を上記
の評価方法から算出し、正確な分離制度を得た。結果を
第６表に示す。

第６表に示す結果から明らかなように、本発明に係る
Ｔ，Ｂリンパ球分離材はいずれも極めて高いＴ，Ｂリン
パ球選択性を有し、Ｔリンパ球の収率、純度もそれぞれ
８０〜９５％、９０〜９５％という際だった値が示さ
れ、またこの様な分離能は非Ｔ，Ｂ系細胞の混入にも影
響されないことが同時に確認された。

実施例２６〜２８ まず実施例１６と同様にしてＣＨ−ＥＧ１ＳＴを、実施
例１８と同様にしてＣＨ−ＥＧ９ＳＴを、および実施例
１０と同様にしてＣＨ−ＥＧ２２ＳＴを作成した。

これらの分離材を用いて、第７表に示すリンパ球懸濁液
注入速度および洗浄速度にて実施例９における手順に従
い、ラット腸間膜リンパ節から調製されたリンパ球懸濁
液およびヒト末梢血リンパ球懸濁液に対してＴ，Ｂリン
パ球分離操作を行なった。なおラット由来のリンパ球の
蛍光染色にはラット免疫グロブリンＧに対する抗体を結
合させたＦＩＴＣを用いた。結果を第７表に示す。

第７表に示す結果から明らかなように、本発明に系る
Ｔ，Ｂリンパ球分離材はいずれもラットおよびヒト由来
のリンパ球に対して極めて高いＢリンパ球親和性を有す
ることが示された。このことから免疫グリブリンＧに対
して親和性を有するリガンドをスペーサを介して固定し
た本発明のＴ，Ｂリンパ球分離材は、分離するリンパ球
の動物種に影響されないＢリンパ球親和性を有するであ
ろうことが推定された。

さらに本発明に係るＴ，Ｂリンパ球分離材（実施例９〜
２８）においては、分離材１ｇ当り少なくとも１．０×
１０^７〜６．０×１０^７個程度のリンパ球を処理するこ
とが可能で、それに要する処理時間が１０分以内であ
り、しかも生存性、接着形態の面からみても際だった細
胞損傷も一切ないものであった。

（発明の効果） 以上述べたように、本発明は水不溶性固体物質表面にス
ペーサーを介して、ジペプチドおよびスルファチアゾー
ルよりなる群から選ばれた少なくとも１種の免疫グロブ
リンと高い親和性を有する有機合成されたリガンドが固
定化されていることを特徴とするＢリンパ球分離材であ
るから、Ｂリンパ球のみを選択的に捕捉分離でき、例え
ば末梢血あるいは生体組織から得られるリンパ球分画か
ら、Ｔリンパ球とＢリンパ球を簡便かつ迅速に極めて高
収率で高純度で分離することが可能であり、しかも分離
されたＴリンパ球およびＢリンパ球の機能的損傷も少な
いことから、免疫機能に関係した疾患の診断、治療やリ
ンパ球由来の生理活性物質を得るための基礎技術に応用
できるものである。さらに本発明のＢリンパ球分離材に
おいてスペーサーが少なくとも２個以上の炭素原子を有
する炭素水素鎖ないしは特性基を含む炭化水素鎖を骨格
とするもの、より好ましくはスペーサーのメチレンの繰
返しが４個以上の直鎖アルキルを骨格とするものまたは
重合度１〜５０のエチレンオキサイド骨格を有するもの
であると、Ｔリンパ球の非特異的吸着がさらに抑制され
て、分離精度はより高いものとなる。また有機合成され
たリガンドが、アルギニン、アスパラギン酸、フェニル
アラニン、プロリンとスルファチアゾールを組合せてな
るものである場合、より高純度、高収率で安全性高くＴ
リンパ球およびＢリンパ球を得ることができるものとな
り、さらに、水不溶性固体物質が平均粒径０．０５〜５
mmの粒子体であるとより安定して効率よくＢリンパ球を
分離することが可能となる。

また、本発明は、水不溶性固体物質表面にスペーサーを
介して、ジペプチドおよびスルファチアゾールよりなる
群から選ばれた少なくとも１種の免疫グロブリンと高い
親和性を有する有機合成されたリガンドを固定化してな
る分離材に、リンパ球含有液を接触させ、膜表面に免疫
グロブリン分子（Ｓ−Ｉｇ）を有するＢリンパ球を選択
的に捕捉せしめることを特徴とするＢリンパ球の分離方
法であるから、処理操作において異種生物由来の濃厚血
清や生理活性物質を用いることがいっさいなく簡便に精
度の高いＢリンパ球分離を行なうことができる。加え
て、本発明のＢリンパ球の分離方法において、分離材に
おけるスペーサーが少なくとも２個以上の炭素原子を有
する炭化水素鎖ないし特性基を含む炭化水素鎖を骨格と
するもの、より好ましくはスペーサーのメチレンの繰返
しが４個以上の直鎖アルキルを骨格とするものまたは重
合度１〜５０のエレレンオキサイド骨格を有するもので
あると、より高精度なＢリンパ球分離が期待できる。ま
た有機合成されたリガンドが、アルギニン、アスパラギ
ン酸、フェニルアラニン、プロリンとスルファチアゾー
ルを組合わせたものである場合、例えば、リンパ球分画
の分離に用いられた際より高純度、高収率で安全性高く
Ｔリンパ球およびＢリンパ球を分離することができるも
のであり、また洗浄液として等張緩衝液を用いるもので
あるとＴ，Ｂリンパ球の分離は容易にかつ好適に行なえ
るものとなり、より優れた効果が期待できるものであ
る。

本発明はさらに、粒子状の水不溶性固体物質表面にスペ
ーサーを介して、ジペプチドおよびスルファチアゾール
よりなる群から選ばれた少なくとも１種の免疫グリブリ
ンと高い親和性を有する有機合成されたリガンドを固定
化してなる分離材を充填したカラムを有することを特徴
とするＢリンパ球の分離器であるから、上記のごとく優
れた特性を有するＢリンパ球分離材とリンパ球懸濁液等
のＢリンパ球含有液との接触をより効率よく行なうこと
ができ、Ｂリンパ球の分離を短時間でかつ首尾よく実施
することが可能となり、さらにカラムがポリプロピレン
またはポリカーボネートからなるものであり、またカラ
ムの出入口と分離材層との間には、Ｂリンパ球含有液中
の細胞成分は通過するが分離材は通過できない網膜を有
するフィルターを備えてなり、さらに該フィルターがポ
リエステルまたはポリアミドからなるものであると、滅
菌処理等の操作も簡単でかつ通過するＢリンパ球含有液
中の細胞成分を損傷する虞れもなく、リンパ球分画の分
離に用いられた際にはより高純度、高収率でＴリンパ球
とＢリンパ球の分離を可能としたものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のＢリンパ球分離器の一実施例の使用態
様を示す模式図である。 １……リンパ球懸濁液、４ａ，４ｂ……フィルター、５
……Ｂリンパ球分離材、６……カラム、 ７……処理液、８……洗浄液、９……導入口、 １０……導出口。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭58−170717（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−9450（ＪＰ，Ａ) 特公 昭60−3367（ＪＰ，Ｂ２) 特公 昭59−36961（ＪＰ，Ｂ２)

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】水不溶性固体物質表面にスペーサーを介し
   て、ジペプチドおよびスルファチアゾールよりなる群か
   ら選ばれた少なくとも１種の免疫グロブリンと高い親和
   性を有する有機合成されたリガンドが固定化されている
   ことを特徴とするＢリンパ球分離材。
2. 【請求項２】スペーサーが少なくとも２個以上の炭素原
   子を有する炭化水素鎖ないしは特性基を含む炭化水素鎖
   を骨格とするものである特許請求の範囲第１項に記載の
   Ｂリンパ球分離材。
3. 【請求項３】スペーサーのメチレンの繰返しが４個以上
   の直鎖アルキルを骨格とするものである特許請求の範囲
   第２項に記載のＢリンパ球分離材。
4. 【請求項４】スペーサーが重合度１〜５０のエチレンオ
   キサイド骨格を有するものである特許請求の範囲第２項
   に記載のＢリンパ球分離材。
5. 【請求項５】水不溶性固体物質が、合成有機高分子、天
   然有機高分子または無機物からなる粒子体である特許請
   求の範囲第１項に記載のＢリンパ球分離材。
6. 【請求項６】水不溶性固体物質が、平均粒径０．０５〜
   ５mmの粒子体である特許請求の範囲第１項または第２項
   に記載のＢリンパ球分離材。
7. 【請求項７】水不溶性固体物質表面にスペーサーを介し
   てジペプチドおよびスルファチアゾールよりなる群から
   選ばれた少なくとも１種の免疫グロブリンと高い親和性
   を有する有機合成されたリガンドを固定化してなる分離
   材に、Ｂリンパ球含有液を接触させ、膜表面に免疫グロ
   ブリン分子（Ｓ−Ｉｇ）を有するＢリンパ球を選択的に
   捕捉せしめることを特徴とするＢリンパ球の分離方法。
8. 【請求項８】分離材におけるスペーサーが少なくとも２
   個以上の炭素原子を有する炭化水素鎖ないしは特性基を
   含む炭化水素鎖を骨格とするものである特許請求の範囲
   第７項に記載のＢリンパ球の分離方法。
9. 【請求項９】分離材におけるスペーサーのメチレンの繰
   返しが４個以上の直鎖アルキルを骨格とするものである
   特許請求の範囲第８項に記載のＢリンパ球の分離方法。
10. 【請求項１０】分離材におけるスペーサーが重合度１〜
    ５０のエチレンオキサイド骨格を有するものである特許
    請求の範囲第８項に記載のＢリンパ球の分離方法。
11. 【請求項１１】水不溶性固体物質が、合成有機高分子、
    天然有機高分子または無機物からなるものである特許請
    求の範囲第７項〜第１０項のいずれかに記載のＢリンパ
    球の分離方法。
12. 【請求項１２】洗浄液として等張緩衝液を用いるもので
    ある特許請求の範囲第７項に記載のＢリンパ球の分離方
    法。
13. 【請求項１３】粒子状の水不溶性固体物質表面にスペー
    サーを介してジペプチドおよびスルファチアゾールより
    なる群から選ばれた少なくとも１種の免疫グロブリンと
    高い親和性を有する有機合成されたリガンドを固定化し
    てなる分離材を充填したカラムを有することを特徴とす
    るＢリンパ球の分離器。
14. 【請求項１４】カラムがポリプロピンレンまたはポリカ
    ーボネートからなるものである特許請求の範囲第１３項
    に記載のＢリンパ球の分離器。
15. 【請求項１５】カラムの出入口と分離材層との間には、
    Ｂリンパ球含有液中の細胞成分は通過するが分離材は通
    過できない網目を有するフィルターを備えてなるもので
    ある特許請求の範囲第１３項または第１４項に記載のＢ
    リンパ球の分離器。
16. 【請求項１６】フィルターがポリエステルまたはポリア
    ミドからなるものである特許請求の範囲第１５項に記載
    のＢリンパ球の分離器。