JPH0623143B2 - Arginine separation and purification method - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、アルギニンの分離精製法に関し、更に詳しく
は、少なくともリジン、オルニチン、チトルリン、ヒス
チジン、硫酸根、塩素イオン及び色素の１または２以上
を主体とする不純物を含有するアルギニン水溶液を強酸
性カチオン交換樹脂を用いるイオン排除クロマトグラフ
ィーに付して、そのようなアルギニン水溶液からそのよ
うな不純物を除去して高純度のアルギニンを高収率で分
離精製する方法に関するものである。Description: TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for separating and purifying arginine, and more specifically, containing at least lysine, ornithine, citrulline, histidine, sulfate, chloride ion and an impurity mainly containing one or more of dyes. A method for separating and purifying highly pure arginine in high yield by subjecting the aqueous arginine solution to ion exclusion chromatography using a strongly acidic cation exchange resin to remove such impurities from the aqueous solution of arginine. is there.

アルギニンは通常発酵法により製造されるが、その一方
法としてグルコースを主原料とする発酵法がある。この
方法で得られるアルギニン発酵液は数種の副生アミノ酸
を含んでいるが、その中でもアルギニンと挙動が類似し
ているリジン、オルニチン、チトルリン、ヒスチジンは
除去しにくいアミノ酸である。又、その他にも硫酸根、
塩素イオン、色素等の不純物を含んでいる。このような
発酵液は、後述のように、本発明で処理されるべきアル
ギニン水溶液の典型例である。なお、その他の方法によ
り得られるアルギニンについても同様のことが云える。Arginine is usually produced by a fermentation method, and one of them is a fermentation method using glucose as a main raw material. The arginine fermentation broth obtained by this method contains several kinds of by-produced amino acids, and among them, lysine, ornithine, citrulline, and histidine, which behave similarly to arginine, are amino acids that are difficult to remove. In addition, sulfate,
It contains impurities such as chlorine ions and pigments. Such a fermented liquor is a typical example of an arginine aqueous solution to be treated in the present invention, as described later. The same applies to arginine obtained by other methods.

アルギニン発酵液中のアルギニンの分離精製方法として
は、アンモニウム型の強酸性陽イオン交換樹脂と接触さ
せてアルギニンを吸着させた後これをアンモニアと塩化
アンモニウムの混合水溶液を使用して溶離させる方法
（特開昭50-6778）がある。この場合、菌体及び色素の
一部は吸着工程で貫流する。しかしイオン交換を主体と
した樹脂法の場合、pHの変動によりアルギニンが樹脂と
イオン交換せずに貫流したりして、収率低下をひきおこ
す点、樹脂の再生のためにアンモニアと塩化アンモニウ
ムを使用する点、及び操作が複雑である点で問題があ
る。また、この方法では、リジン、オルニチン、チトル
リン、ヒスチジンはアルギニンと挙動を共にするため、
アルギニンを分離することはできない。As a method for separating and purifying arginine in the arginine fermentation broth, a method of adsorbing arginine by contacting it with an ammonium-type strongly acidic cation exchange resin and then eluting it with a mixed aqueous solution of ammonia and ammonium chloride (special There is Kaisho 50-6778). In this case, some of the bacterial cells and pigments flow through in the adsorption step. However, in the case of the resin method mainly based on ion exchange, arginine flows through the resin without ion exchange due to pH fluctuations, which causes a decrease in yield, and ammonia and ammonium chloride are used to regenerate the resin. However, there is a problem in that the operation is complicated and the operation is complicated. Also, in this method, lysine, ornithine, citrulline, and histidine behave together with arginine,
Arginine cannot be separated.

本発明者は、鋭意研究の結果、リジン、オルニチン、チ
トルリン、ヒスジン、硫酸根、塩素イオン及び色素の１
または２以上を主体とする不純物が夾雑するアルギニン
発酵液から純度の極めて高いアルギニンを分離精製する
方法において、その一工程として、強酸性カチオン交換
樹脂を用いるイオン排除クロマトグラフィーで処理する
ことにより極めて簡単な操作で、収率よく高純度のアル
ギニンを取得しうることを見いだし本発明を完成した。
もっとも本発明の適用は、後述のように、そのようなア
ルギニン発酵液の処理に限定されるものではない。As a result of earnest research, the present inventor has found that one of lysine, ornithine, citrulline, histidine, sulfate, chloride ion and pigment
Alternatively, in a method for separating and purifying extremely high-purity arginine from an arginine fermentation liquor mainly containing two or more impurities, as a step, it is extremely easy to perform by ion-exclusion chromatography using a strongly acidic cation exchange resin. It was found that arginine with high yield and high purity can be obtained by various operations, and the present invention was completed.
However, the application of the present invention is not limited to the treatment of such an arginine fermentation broth, as described later.

一般に非電解質あるいは弱電解質の化合物は強電解質の
化合物からイオン排除クロマトグラフィーによって分離
することができる。これは電荷を有するイオン交換基の
ために強電解質の化合物はドナン電位によって排除され
るので、イオン交換樹脂の内部へは浸透できないが、非
電解質あるいは弱電解質の化合物は自由に浸透できるか
らである。本発明はこの法則に基づく。In general, non-electrolyte or weakly electrolyte compounds can be separated from strong electrolyte compounds by ion exclusion chromatography. This is because the strong electrolyte compound is excluded by the Donnan potential due to the charged ion-exchange group, so that it cannot penetrate into the ion-exchange resin, but the non-electrolyte or weak-electrolyte compound can freely penetrate. . The present invention is based on this law.

以下、本発明を更に詳しく説明する。Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

本発明に云う少なくともリジン、オルニチン、チトルリ
ン、ヒスチジン、硫酸根、塩素イオン及び色素の１また
は２以上を主体とする不純物を含有するアルギニン水溶
液とは、除菌したまたは除菌しないアルギニン発酵液、
その発酵液より取得したアルギニン粗結晶の溶解液、ア
ルギニン晶析母液などを挙げることができる。この他に
もリジン、オルニチン、チトルリン、ヒスチジン、硫酸
根、塩素イオン及び色素の１または２以上を主体とする
不純物が夾雑したアルギニンを含む水溶液であれば、い
かなるものでも本発明を適用できる。このような水溶液
のアルギニン濃度に特に制限はなく、アルギニンが溶解
している状態であれば良い。The arginine aqueous solution containing at least lysine, ornithine, citrulline, histidine, sulfate, chloride ion, and impurities mainly composed of one or more of dyes according to the present invention is an arginine fermented solution sterilized or not sterilized,
Examples include a solution of crude arginine crystals obtained from the fermentation broth and an arginine crystallization mother liquor. In addition to this, the present invention can be applied to any aqueous solution containing arginine contaminated with impurities mainly containing one or more of lysine, ornithine, citrulline, histidine, sulfate, chloride ion and dye. There is no particular limitation on the concentration of arginine in such an aqueous solution, as long as arginine is dissolved.

不純物を含有するアルギニン水溶液をイオン排除クロマ
トグラフィーに付するに際し、先ずアルギニン水溶液を
アルギニンの等電点（pH＝11.15）又はその近傍のpHに
調整することによりアルギニンの大部分を非電荷の状態
とする。リジン、オルニチン、チトルリン、ヒスチジ
ン、硫酸根及び塩素イオンはそのpHではアニオンとして
存在する。When subjecting an arginine aqueous solution containing impurities to ion exclusion chromatography, first, the arginine aqueous solution is adjusted to the isoelectric point of arginine (pH = 11.15) or a pH in the vicinity thereof to bring most of the arginine into an uncharged state. To do. Lysine, ornithine, citrulline, histidine, sulfate and chloride ions exist as anions at that pH.

一方、強酸性カチオン交換樹脂は、そのようなアニオン
の対イオンとなっているカチオンの型にする。On the other hand, the strongly acidic cation exchange resin is in the form of a cation that is a counterion of such anion.

因みに、イオン排除クロマトグラフィーに付すべき水溶
液に含まれるカチオンが複数種の場合、分離性が低下す
る。そこで、分離性を低下させない為にあらかじめカチ
オン交換樹脂におけるイオン交換等の前処理を行ない夾
雑カチオンを除いておくとよい。イオン排除クロマトグ
ラフィーはアニオン交換樹脂を使用しても成り立つが、
本発明の対象たるアルギニンの場合、アルギニンの等電
点ではリジン、オルニチン、チトルリン、ヒスチジン、
硫酸根及び塩素イオンはアニオンの形で存在するので、
即ちアニオン種が多いので、分離性が低下し、実用的で
ない。Incidentally, when there are plural kinds of cations contained in the aqueous solution to be subjected to the ion exclusion chromatography, the separability is lowered. Therefore, in order not to lower the separability, it is preferable to remove the contaminating cations by performing a pretreatment such as ion exchange in the cation exchange resin in advance. Ion exclusion chromatography can be achieved using an anion exchange resin,
In the case of arginine which is the object of the present invention, the isoelectric point of arginine is lysine, ornithine, citrulline, histidine,
Since sulfate radicals and chloride ions exist in the form of anions,
That is, since there are many anion species, the separability is reduced and it is not practical.

本発明に用いる強酸性カチオン交換樹脂は、ダイヤイオ
ンSK-102,SK-104,SK-106,SK1B,SK-104S,SKIBS及びUBK-1
01L（三菱化成社製）、XFS-43279,XFS-43280,XFS-4328
1,HCR-W2及びTG8500A（ダウケミカル社製）、Ｃ−２
０，Ｃ−２５Ｄ，ES−２６及びＣ−３（デュオライト社
製）、Ｓ−１００，Ｓ−１０９，SP-１１２及びSP−１
２０（レバチット社製）並びにIR-116,IR-118,IR-120B,
IR-122,IR-124,IR-252,IR200C及びIR-200CT（アンバー
ライト社製）等の主にスチレン系の樹脂が利用できる。
これらの中でも特に架橋度４−８％の樹脂の分離性能が
最も良い。The strongly acidic cation exchange resin used in the present invention is Diaion SK-102, SK-104, SK-106, SK1B, SK-104S, SKIBS and UBK-1.
01L (Made by Mitsubishi Kasei), XFS-43279, XFS-43280, XFS-4328
1, HCR-W2 and TG8500A (made by Dow Chemical Company), C-2
0, C-25D, ES-26 and C-3 (manufactured by Duolite), S-100, S-109, SP-112 and SP-1.
20 (manufactured by Levatit) and IR-116, IR-118, IR-120B,
Mainly styrene resins such as IR-122, IR-124, IR-252, IR200C and IR-200CT (manufactured by Amberlite) can be used.
Among these, the separation performance of the resin having a cross-linking degree of 4-8% is the best.

使用する強酸性カチオン交換樹脂量は、アルギニン濃度
が１０％程度で、不純物濃度が１％程度の水溶液の場
合、その水溶液量の４−５倍量程度で充分である。水溶
液のアルギニン及び不純物全体の濃度が小さくなれば、
樹脂量は更に少なくて良い。適当な樹脂量は、当業者で
あれば事前実験により容易に定め得る。In the case of an aqueous solution having an arginine concentration of about 10% and an impurity concentration of about 1%, the amount of the strongly acidic cation exchange resin used is about 4-5 times the amount of the aqueous solution. If the concentration of arginine and impurities in the aqueous solution decreases,
The amount of resin may be smaller. A suitable amount of resin can be easily determined by those skilled in the art by preliminary experiments.

操作温度には特に制限はなく、強酸性カチオン交換樹脂
の耐熱温度内であればよい。温度を上げれば夾雑物とア
ルギニンとの分離速度は増すが、アルギニンの分解が促
進される為、その溶液に応じた最適の温度でおこなうと
よい。The operating temperature is not particularly limited as long as it is within the heat resistant temperature of the strongly acidic cation exchange resin. If the temperature is raised, the rate of separation of contaminants and arginine will increase, but the decomposition of arginine will be accelerated, so it is advisable to carry out at the optimum temperature according to the solution.

被処理液に含まれるカチオンに応じた型にした強酸性カ
チオン交換樹脂をカラムに充填し、カラム上部に上述の
目安で被処理液を注入する。例えば、アルギニン発酵液
に含まれる夾雑物がナトリウム塩として存在する場合、
ナトリウム型の強酸性カチオン交換樹脂をカラムに充填
し、その上部にpHをアルギニンの等電点又はその近傍に
調整したアルギニン発酵液を適当量注入する。A column is filled with a strongly acidic cation exchange resin in a form corresponding to the cation contained in the liquid to be treated, and the liquid to be treated is injected into the upper part of the column according to the above-mentioned standard. For example, when the impurities contained in the arginine fermentation broth are present as sodium salts,
A sodium-type strongly acidic cation exchange resin is packed in a column, and an appropriate amount of an arginine fermentation broth whose pH is adjusted to or near the isoelectric point of arginine is injected into the column.

次いで溶離液として水を通液すると、まず前記の夾雑不
純物が溶離した後にアルギニンが溶離してくるが、アル
ギニン画分が溶出している間に、pHが低下したアルギニ
ンがわずかにカチオンとして存在する為実施例１に示し
たように、樹脂とイオン交換してしまう。そこで溶離液
としてNaOHでpHをアルギニンの等電点又はそれ以上に調
整した水を通液すると、まず前記の夾雑不純物が溶離し
た後アルギニンが溶離してくる。そこで本発明では、Na
OHでpH調整した溶離液を用いることによりアルギニンを
樹脂に吸着させることなくアルギニンをほぼ１００％回
収出来ることを見いだした（実施例２）。Next, when water is passed as an eluent, the above-mentioned contaminant impurities are eluted first, and then arginine is eluted, but during the elution of the arginine fraction, arginine with a lowered pH is slightly present as a cation. Therefore, as shown in Example 1, the resin is ion-exchanged. Therefore, when water whose pH is adjusted to the isoelectric point of arginine or higher with NaOH as an eluent is passed, first, the above-mentioned contaminant impurities are eluted and then arginine is eluted. Therefore, in the present invention, Na
It was found that almost 100% of arginine can be recovered without adsorbing arginine on the resin by using an eluent whose pH is adjusted with OH (Example 2).

因みに本発明のイオン排除クロマトグラフィーに付すべ
きアルギニン発酵液に菌体及び／又は色素が含まれてい
ても、これらはリジン、オルニチン、チトルリン、ヒス
チジン、硫酸根及び塩素イオンのナトリウム塩と挙動を
共にするので通常は問題とならないが、必要に応じて樹
脂層の閉塞を防止するため事前にアルギニン発酵液より
菌体を除去しておく。By the way, even if the arginine fermentation liquor to be subjected to the ion exclusion chromatography of the present invention contains cells and / or pigments, they both behave together with sodium salts of lysine, ornithine, citrulline, histidine, sulfate and chloride. Therefore, it is not a problem in general, but bacterial cells are removed from the arginine fermentation solution in advance in order to prevent clogging of the resin layer, if necessary.

水の通液速度(SV)については特に制限はなく、通常の0.
5−４程度であればよい。pH，屈折率などで溶離液の成
分の時間的変化を追跡して目的物の画分を得る。目的物
含有画分から目的物を単離するのは常法でよい。There is no particular limitation on the water flow rate (SV), which is normally 0.
It may be about 5-4. The change of the components of the eluent with time is tracked by pH, refractive index, etc. to obtain the target fraction. The desired product may be isolated from the desired product-containing fraction by a conventional method.

このように不純物を含むアルギニンの精製において、イ
オン排除クロマトグラフィーでは不純物を含むアルギニ
ン水溶液のpHを該アミノ酸の等電点付近に調整し、不純
物のアニオンと対イオンになっているカチオンの型の強
酸性陽イオン交換樹脂にフィードすれば、以後は樹脂の
カチオンと同一のカチオンを有する希アルカリ水のみの
処理でよいため、再生、洗浄等のための酸、アルカリの
使用が不要で経済性に優れ、操作製も極めて簡単なもの
となる。Thus, in the purification of arginine containing impurities, the pH of the aqueous arginine solution containing impurities is adjusted to near the isoelectric point of the amino acid by ion exclusion chromatography, and the anion of the impurity and the strong acid of the cation type that is the counterion are used. If it is fed to a water-soluble cation exchange resin, it is only necessary to treat diluted alkaline water having the same cation as the resin cation thereafter, so it is not necessary to use acid or alkali for regeneration, washing, etc. The operation is also extremely easy.

実施例１ Ｌ−アルギニン１００g/及びリジンナトリウム塩１０
g/を含むＬ−アルギニン水溶液４０ml（pH＝11.3）を
XFS-43279（架橋度４％）のNa型を２００ml充填したカ
ラム（φ3.2cm×Ｈ25cm）の上部に注入した。４５℃，S
V＝1.0の条件下で水を通液して溶離をおこなった。Example 1 L-arginine 100 g / and lysine sodium salt 10
40 ml of L-arginine aqueous solution containing g / (pH = 11.3)
XFS-43279 (4% cross-linking degree) Na type was injected into the upper part of a column (φ3.2 cm × H25 cm) packed with 200 ml. 45 ° C, S
Elution was performed by passing water under the condition of V = 1.0.

先にリジンナトリウム塩が溶出され、続いてL-アルギニ
ンが溶出された。溶出液量８０−３６０mlの分画部を採
取し、そのうち８０−１６０mlを副分画部、１７０−３
６０mlを主分画部とした。主分画部はＬ−アルギニンの
みであり、リジンナトリウム塩は１００％除去され、Ｌ
−アルギニンの回収率は７０％であった。副分画部には
リジンナトリウム塩が１００％回収されていた。pHの変
化を測定したところ、主分画部ではpHが下がる傾向がみ
られ、アルギニンがカチオンとして存在したため樹脂に
吸着したと考えられた。Lysine sodium salt was eluted first, followed by L-arginine. Fractions with an eluate volume of 80-360 ml were collected, of which 80-160 ml was used as a subfraction
60 ml was the main fractionation part. The main fraction is L-arginine only, lysine sodium salt is 100% removed, L
-Arginine recovery was 70%. 100% of lysine sodium salt was recovered in the subfractionation part. When the change in pH was measured, the pH tended to decrease in the main fractionation part, and it was considered that arginine was adsorbed on the resin because it was present as a cation.

因みに、この実施例から理解されるように、本発明の名
称はアルギニンの分離精製法となっているが、アルギニ
ンとリジンの相互分離法も本発明に含まれる。Incidentally, as understood from this Example, the name of the present invention is a method for separating and purifying arginine, but a mutual separation method for arginine and lysine is also included in the present invention.

実施例２ Ｌ−アルギニン１００g/及びリジンナトリウム塩１０
g/を含むＬ−アルギニン水溶液４０ml（pH＝12.0）を
XFS-43279のNa型を２００ml充填したカラム（φ3.2cm×
Ｈ25cm）の上部に注入した。４５℃，SV＝１の条件下で
NaOHによりpHを１３程度に調整した水を通液して溶離を
おこなった。Example 2 L-arginine 100 g / and lysine sodium salt 10
40 ml of L-arginine aqueous solution containing g / (pH = 12.0)
Column filled with 200 ml of Na type of XFS-43279 (φ3.2 cm ×
H25 cm). Under the condition of 45 ℃ and SV = 1
Elution was carried out by passing water whose pH was adjusted to about 13 with NaOH.

先にリジンナトリウム塩が溶出され、続いてL-アルギニ
ンが溶出された。溶出液量８０−３６０mlの分画部を採
取し、そのうち８０−１６０mlを副分画部、１７０−３
６０mlを主分画部とした。主分画部はＬ−アルギニンの
みであり、リジンナトリウム塩は１００％除去され、Ｌ
−アルギニンの回収率は９９％であった。Lysine sodium salt was eluted first, followed by L-arginine. Fractions with an eluate volume of 80-360 ml were collected, of which 80-160 ml was used as a subfraction
60 ml was the main fractionation part. The main fraction is L-arginine only, lysine sodium salt is 100% removed, L
-Arginine recovery was 99%.

実施例３ Ｌ−アルギニン８０g/、リジンナトリウム塩４g/、
オルニチンナトリウム塩３g/、チトルリンナトリウム
塩８g/、ヒスチジンナトリウム塩0.4g/、塩化ナト
リウム8.5g/及び硫酸ナトリウム0.3g/を含みpH＝1
1.32に調整した除菌Ｌ−アルギニン発酵液４０mlをXFS-
43279のNa型を２００ml充填したカラム（φ3.2cm×Ｈ25
cm）の上部に注入した。４５℃，SV＝１の条件下でNaOH
によりpHを１３程度に調整した水を通液して溶離をおこ
なった。Example 3 L-arginine 80 g /, lysine sodium salt 4 g /,
Ornithine sodium salt 3g /, citrulline sodium salt 8g /, histidine sodium salt 0.4g /, sodium chloride 8.5g / and sodium sulfate 0.3g / including pH = 1
40 ml of the disinfected L-arginine fermentation liquid adjusted to 1.32 was added to XFS-
Column packed with 200 ml of Na-type 43279 (φ3.2 cm x H25
cm). NaOH under the condition of 45 ℃ and SV = 1
Elution was carried out by passing water whose pH was adjusted to about 13 by.

先にリジンナトリウム塩、オルニチンナトリウム塩、チ
トルリンナトリウム塩、ヒスチジンナトリウム塩、塩化
ナトリウム及び硫酸ナトリウムが溶出され、続いてＬ−
アルギニンが溶出された。溶出液量８０−３５０mlの分
画部を採取し、そのうち８０−１５０mlを副分画部、１
６０−３５０mlを主分画部とした。主分画部はＬ−アル
ギニンが大部分でありリジンナトリウム塩、オルニチン
ナトリウム塩及びヒスチジンナトリウム塩、塩化ナトリ
ウム及び硫酸ナトリウムの除去率はそれぞれ９９％，９
８％，９８％，９７％，９８％，９９％であり、Ｌ−ア
ルギニンの回収率は１００％であった。尚、最初のアル
ギニン水溶液の着色度は1.42（分光光度計400nm）であ
ったが、主分画部のそれは平均で0.024であり色の除去
率は９２％であった。Lysine sodium salt, ornithine sodium salt, citrulline sodium salt, histidine sodium salt, sodium chloride and sodium sulfate were eluted first, followed by L-.
Arginine was eluted. Fractions with an eluate volume of 80-350 ml were collected, 80-150 ml of which was used as a subfraction
60-350 ml was used as the main fractionation part. The main fraction is mostly L-arginine, and the removal rates of lysine sodium salt, ornithine sodium salt and histidine sodium salt, sodium chloride and sodium sulfate are 99% and 9%, respectively.
It was 8%, 98%, 97%, 98%, 99%, and the recovery rate of L-arginine was 100%. The initial degree of coloring of the arginine aqueous solution was 1.42 (spectrophotometer 400 nm), but that of the main fractionated portion was 0.024 on average, and the color removal rate was 92%.

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】少なくともリジン、オルニチン、チトルリ
ン、ヒスチジン、硫酸根、塩素イオン及び色素の１また
は２以上を主体とする不純物を含有するアルギニン水溶
液のｐＨをアルギニンの等電点付近に調整し、不純物ア
ニオンの対イオンとなっているカチオンの型に調整した
強酸性陽イオン交換樹脂にフィードし、しかる後、強酸
性陽イオン交換樹脂と同一のカチオンを有するｐＨ１１
以上に調整された希アルカリ水で溶出することを特徴と
するイオン排除クロマトグラフィーによるアルギニンの
分離精製法。1. The pH of an arginine aqueous solution containing at least lysine, ornithine, citrulline, histidine, histidine, sulfate, chloride ion and impurities mainly containing one or more of dyes is adjusted to near the isoelectric point of arginine to obtain impurities. It is fed to a strongly acidic cation exchange resin adjusted to the type of cation which is the counterion of the anion, and then pH 11 having the same cation as the strongly acidic cation exchange resin.
A method for separating and purifying arginine by ion exclusion chromatography, which comprises eluting with diluted alkaline water prepared as described above.