JPH0622799A - 抗インフルエンザウイルス剤アッセイ法 - Google Patents
抗インフルエンザウイルス剤アッセイ法Info
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- JPH0622799A JPH0622799A JP18243292A JP18243292A JPH0622799A JP H0622799 A JPH0622799 A JP H0622799A JP 18243292 A JP18243292 A JP 18243292A JP 18243292 A JP18243292 A JP 18243292A JP H0622799 A JPH0622799 A JP H0622799A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 複数個のインフルエンザ感染性細胞培養物の
各々に検体を添加し、次いで当該複数個の培養物の一部
にインフルエンザウイルスを感染させた後、当該複数個
の培養物全体についてＭＴＴアッセイを行ない、当該検
体の抗インフルエンザウイルス作用及び細胞毒性を同時
に測定することを特徴とする抗インフルエンザウイルス
剤アッセイ法。 【効果】 抗インフルエンザウイルス剤のアッセイ及び
細胞毒性が簡便な操作で、迅速に再現性よく、かつ安価
にでき、アンチセンスＤＮＡ等の新しい抗ウイルス剤の
スクリーニングを容易かつ精度よくすることができる。
各々に検体を添加し、次いで当該複数個の培養物の一部
にインフルエンザウイルスを感染させた後、当該複数個
の培養物全体についてＭＴＴアッセイを行ない、当該検
体の抗インフルエンザウイルス作用及び細胞毒性を同時
に測定することを特徴とする抗インフルエンザウイルス
剤アッセイ法。 【効果】 抗インフルエンザウイルス剤のアッセイ及び
細胞毒性が簡便な操作で、迅速に再現性よく、かつ安価
にでき、アンチセンスＤＮＡ等の新しい抗ウイルス剤の
スクリーニングを容易かつ精度よくすることができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は抗インフルエンザウイル
ス剤のアッセイ法に関し、さらに詳細には簡便な操作で
迅速かつ正確に抗インフルエンザウイルス作用及び細胞
毒性を同時に測定する方法に関する。
ス剤のアッセイ法に関し、さらに詳細には簡便な操作で
迅速かつ正確に抗インフルエンザウイルス作用及び細胞
毒性を同時に測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】インフルエンザはその流行規模が極めて
大きいことから古くから最も広く知られている疾患の一
つである。このインフルエンザは社会にとって極めて重
要な伝染病であり、ヒト以外にもウマ、ブタ、ニワトリ
などその感染対象は多岐にわたる。特にインフルエンザ
のＲＮＡは各タンパク質ごとに独立した分節構造を有し
ているため、一つの細胞に２種類以上のウイルスが同時
に感染すると分節間の組替えがおこり、合いの子ウイル
スができる。このようにインフルエンザは抗原変異をお
こし易いために、ウイルスの過去の感染によって獲得し
た免疫が次の感染に有効に作用し得ず、またワクチンに
よる防御が非常に困難になっている。
大きいことから古くから最も広く知られている疾患の一
つである。このインフルエンザは社会にとって極めて重
要な伝染病であり、ヒト以外にもウマ、ブタ、ニワトリ
などその感染対象は多岐にわたる。特にインフルエンザ
のＲＮＡは各タンパク質ごとに独立した分節構造を有し
ているため、一つの細胞に２種類以上のウイルスが同時
に感染すると分節間の組替えがおこり、合いの子ウイル
スができる。このようにインフルエンザは抗原変異をお
こし易いために、ウイルスの過去の感染によって獲得し
た免疫が次の感染に有効に作用し得ず、またワクチンに
よる防御が非常に困難になっている。
【０００３】このようにワクチンによる防御が困難であ
ることから、最近、薬剤によるウイルス発現抑制が注目
され、ウイルス発現抑制を作用機序とする抗インフルエ
ンザウイルス剤の開発が行なわれつつある。ここで問題
となるのが、抗インフルエンザウイルス剤のアッセイ法
である。
ることから、最近、薬剤によるウイルス発現抑制が注目
され、ウイルス発現抑制を作用機序とする抗インフルエ
ンザウイルス剤の開発が行なわれつつある。ここで問題
となるのが、抗インフルエンザウイルス剤のアッセイ法
である。
【０００４】従来、抗インフルエンザウイルス剤のアッ
セイ法としては、プラーク法〔北村敬，「ウイルス検査
のための組織培養技術」，ｐ１８８〜２１１，近代出版
（１９７６）〕が広く用いられている。
セイ法としては、プラーク法〔北村敬，「ウイルス検査
のための組織培養技術」，ｐ１８８〜２１１，近代出版
（１９７６）〕が広く用いられている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかし、プラーク法
は、検体が多量に必要であること、プラーク法を行なう
のに熟練が必要であり、判断に人為的要因が入ること等
から簡便性、迅速性、再現性、効率性、コストの面から
充分に満足できるものではなかった。また、抗ウイルス
剤のアッセイにあっては、抗ウイルス剤自体の細胞毒性
が問題となるが、プラーク法では活性のアッセイと細胞
毒性の測定とは別個にしなければならないという欠点が
あった。従って、インフルエンザウイルス感染性細胞に
ついて熟練を必要とせず、簡便な操作で迅速かつ正確に
抗インフルエンザウイルス作用及び細胞毒性を同時に測
定できる方法の開発が望まれていた。
は、検体が多量に必要であること、プラーク法を行なう
のに熟練が必要であり、判断に人為的要因が入ること等
から簡便性、迅速性、再現性、効率性、コストの面から
充分に満足できるものではなかった。また、抗ウイルス
剤のアッセイにあっては、抗ウイルス剤自体の細胞毒性
が問題となるが、プラーク法では活性のアッセイと細胞
毒性の測定とは別個にしなければならないという欠点が
あった。従って、インフルエンザウイルス感染性細胞に
ついて熟練を必要とせず、簡便な操作で迅速かつ正確に
抗インフルエンザウイルス作用及び細胞毒性を同時に測
定できる方法の開発が望まれていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】かかる実情において、本
発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、培
養細胞に検体を添加した後その一部にインフルエンザウ
イルスを感染させて３−（４，５−ジメチルチアゾール
−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロ
ミドを用いた光学的手法（以下、ＭＴＴ法と略す）を採
用すれば、簡便な操作で迅速かつ正確に抗インフルエン
ザウイルス作用及び細胞毒性を同時に測定できることを
見出し、本発明を完成した。
発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、培
養細胞に検体を添加した後その一部にインフルエンザウ
イルスを感染させて３−（４，５−ジメチルチアゾール
−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロ
ミドを用いた光学的手法（以下、ＭＴＴ法と略す）を採
用すれば、簡便な操作で迅速かつ正確に抗インフルエン
ザウイルス作用及び細胞毒性を同時に測定できることを
見出し、本発明を完成した。
【０００７】すなわち、本発明は、複数個のインフルエ
ンザ感染性細胞培養物の各々に検体を添加し、次いで当
該複数個の培養物の一部にインフルエンザウイルスを感
染させた後、当該複数個の培養物全体についてＭＴＴア
ッセイを行ない、当該検体の抗インフルエンザウイルス
作用及び細胞毒性を同時に測定することを特徴とする抗
インフルエンザウイルス剤アッセイ法を提供するもので
ある。
ンザ感染性細胞培養物の各々に検体を添加し、次いで当
該複数個の培養物の一部にインフルエンザウイルスを感
染させた後、当該複数個の培養物全体についてＭＴＴア
ッセイを行ない、当該検体の抗インフルエンザウイルス
作用及び細胞毒性を同時に測定することを特徴とする抗
インフルエンザウイルス剤アッセイ法を提供するもので
ある。
【０００８】本発明に用いられるＭＴＴ法そのものは細
胞生存率、細胞増殖能を測定する方法としてすでに知ら
れているものであるが、抗インフルエンザウイルス剤の
アッセイに適用した例は報告されていない。
胞生存率、細胞増殖能を測定する方法としてすでに知ら
れているものであるが、抗インフルエンザウイルス剤の
アッセイに適用した例は報告されていない。
【０００９】本発明方法に用いられるインフルエンザウ
イルス感染性細胞としては、哺乳類由来であり、インフ
ルエンザウイルスが感染し得る細胞であれば特に制限さ
れないが、犬腎臓上皮性細胞（以下、ＭＤＣＫ細胞とい
う）が好ましい。ＭＤＣＫ細胞は単層細胞であるため、
抗ＨＩＶ剤アッセイに用いられるＭＴ−４細胞とはその
特性を著しく異にする。アッセイを行なうに際しては、
ＭＤＣＫ細胞はフラスコに単層を形成させ、これをトリ
プシン等のプロテアーゼを用いてフラスコより剥離し、
液体培地中に懸濁して、細胞浮遊液（細胞培養物）とす
る。用いる液体培地としては、１０％牛胎児血清（ＦＣ
Ｓ）を含む細胞増殖用１×イーグル培地等が挙げられ
る。当該細胞浮遊液の濃度は、１×１０5 個／ml程度に
調整するのが好ましい。
イルス感染性細胞としては、哺乳類由来であり、インフ
ルエンザウイルスが感染し得る細胞であれば特に制限さ
れないが、犬腎臓上皮性細胞（以下、ＭＤＣＫ細胞とい
う）が好ましい。ＭＤＣＫ細胞は単層細胞であるため、
抗ＨＩＶ剤アッセイに用いられるＭＴ−４細胞とはその
特性を著しく異にする。アッセイを行なうに際しては、
ＭＤＣＫ細胞はフラスコに単層を形成させ、これをトリ
プシン等のプロテアーゼを用いてフラスコより剥離し、
液体培地中に懸濁して、細胞浮遊液（細胞培養物）とす
る。用いる液体培地としては、１０％牛胎児血清（ＦＣ
Ｓ）を含む細胞増殖用１×イーグル培地等が挙げられ
る。当該細胞浮遊液の濃度は、１×１０5 個／ml程度に
調整するのが好ましい。
【００１０】ＭＤＣＫ細胞浮遊液は、９６穴プレート等
の多穴プレートのウエル中に１×１０4 個／ウエルとな
るように分注するのが好ましい。なお、細胞浮遊液濃度
が１×１０5 個／mlの場合には１００μｌ程度分注すれ
ばよい。その後約３７℃で２４時間程度インキュベート
し、細胞を増殖させれば、各ウエルの細胞は飽和に達す
る。ウエル中の細胞濃度が低すぎると当該培養で飽和に
達せず、また濃度が高すぎると不必要な増殖が生起し、
吸光度にノイズが生じる。
の多穴プレートのウエル中に１×１０4 個／ウエルとな
るように分注するのが好ましい。なお、細胞浮遊液濃度
が１×１０5 個／mlの場合には１００μｌ程度分注すれ
ばよい。その後約３７℃で２４時間程度インキュベート
し、細胞を増殖させれば、各ウエルの細胞は飽和に達す
る。ウエル中の細胞濃度が低すぎると当該培養で飽和に
達せず、また濃度が高すぎると不必要な増殖が生起し、
吸光度にノイズが生じる。
【００１１】この複数個のインフルエンザ感染性細胞培
養物、すなわち各ウエルに添加される検体、例えば、抗
インフルエンザウイルス剤は、１０γ−アセチルトリプ
シン−細胞維持培養用１×イーグル培地、１０γ−アセ
チルトリプシン−細胞増殖用１×イーグル培地等の液体
培地で種々の濃度に希釈して用いるのが好ましい。な
お、この検体としてはアンチセンスＤＮＡが好ましい。
養物、すなわち各ウエルに添加される検体、例えば、抗
インフルエンザウイルス剤は、１０γ−アセチルトリプ
シン−細胞維持培養用１×イーグル培地、１０γ−アセ
チルトリプシン−細胞増殖用１×イーグル培地等の液体
培地で種々の濃度に希釈して用いるのが好ましい。な
お、この検体としてはアンチセンスＤＮＡが好ましい。
【００１２】次に、検体が添加された培養物の一部、す
なわち、上記細胞含有ウエルの一部にインフルエンザウ
イルスを添加して、当該一部の培養物を感染させる。感
染されなかった培養物は細胞毒性検定に用いられる。
なわち、上記細胞含有ウエルの一部にインフルエンザウ
イルスを添加して、当該一部の培養物を感染させる。感
染されなかった培養物は細胞毒性検定に用いられる。
【００１３】ここで用いられるインフルエンザウイルス
としては感染性のあるインフルエンザウイルスであれば
特に制限されないが、Ａ型インフルエンザウイルスが特
に好ましい。。インフルエンザウイルスは、前記細胞維
持用１×イーグル培地、細胞増殖用１×イーグル培地等
で希釈し、浮遊細胞１個あたり２ＰＦＵ添加するのが好
ましい。ウイルス添加量が少なすぎると、ウイルス添加
後の培養時間が長期間必要となり培地の交換も必要とな
り、また測定誤差が大きくなる。一方、ウイルス添加量
が多すぎると、経済的でない。
としては感染性のあるインフルエンザウイルスであれば
特に制限されないが、Ａ型インフルエンザウイルスが特
に好ましい。。インフルエンザウイルスは、前記細胞維
持用１×イーグル培地、細胞増殖用１×イーグル培地等
で希釈し、浮遊細胞１個あたり２ＰＦＵ添加するのが好
ましい。ウイルス添加量が少なすぎると、ウイルス添加
後の培養時間が長期間必要となり培地の交換も必要とな
り、また測定誤差が大きくなる。一方、ウイルス添加量
が多すぎると、経済的でない。
【００１４】ウイルス添加後、約３４℃で７２時間程度
インキュベートする。これにより、コントロール細胞は
ほぼ死滅する。次いですべての培養物についてＭＴＴア
ッセイを行ない、感染細胞群及び非感染細胞群の細胞生
存率を測定することにより、検体の抗インフルエンザウ
イルス作用及び細胞毒性を同時に測定する。
インキュベートする。これにより、コントロール細胞は
ほぼ死滅する。次いですべての培養物についてＭＴＴア
ッセイを行ない、感染細胞群及び非感染細胞群の細胞生
存率を測定することにより、検体の抗インフルエンザウ
イルス作用及び細胞毒性を同時に測定する。
【００１５】ＭＴＴアッセイは、次の如くして行なうの
が好ましい。すなわち、ＭＴＴを例えば１５０μｇ／ウ
エル添加し、約３４℃で１時間インキュベートする。Ｍ
ＴＴは水溶性の黄色の色素で、これが生細胞中に取り込
まれるとミトコンドリアの酵素で還元され、青色の有機
溶媒溶解性のホルマザンを形成する。従って、このホル
マザンを細胞から溶出させて青色の吸光度を測定すれば
生細胞数、すなわち、抗インフルエンザウイルス剤の作
用及び細胞毒性が測定できる。ホルマザンを細胞から溶
出させるには、イソプロパノール−塩酸水溶液をウエル
に添加すればよい。より好ましくは、塩酸及びトリトン
×１００をイソプロパノールに溶かした溶液が用いられ
る。吸光度の測定は５４０nmにおける特異的吸光度及び
６９０nmにおける非特異的吸光度をマイクロプレートリ
ーダー等で行なうのがよい。
が好ましい。すなわち、ＭＴＴを例えば１５０μｇ／ウ
エル添加し、約３４℃で１時間インキュベートする。Ｍ
ＴＴは水溶性の黄色の色素で、これが生細胞中に取り込
まれるとミトコンドリアの酵素で還元され、青色の有機
溶媒溶解性のホルマザンを形成する。従って、このホル
マザンを細胞から溶出させて青色の吸光度を測定すれば
生細胞数、すなわち、抗インフルエンザウイルス剤の作
用及び細胞毒性が測定できる。ホルマザンを細胞から溶
出させるには、イソプロパノール−塩酸水溶液をウエル
に添加すればよい。より好ましくは、塩酸及びトリトン
×１００をイソプロパノールに溶かした溶液が用いられ
る。吸光度の測定は５４０nmにおける特異的吸光度及び
６９０nmにおける非特異的吸光度をマイクロプレートリ
ーダー等で行なうのがよい。
【００１６】得られた吸光度から検体の抗インフルエン
ザウイルス作用を求めるには、常法に従い、検体もウイ
ルスも加えないウエル、検体とウイルスを加えたウエル
及びウイルスのみを加えたウエルの３者の比較より算出
すればよい。また、検体の細胞毒性は、検体のみを加え
たウエル、ウイルスも検体も加えないウエル及び培地の
みのウエルの比較より算出すればよい。
ザウイルス作用を求めるには、常法に従い、検体もウイ
ルスも加えないウエル、検体とウイルスを加えたウエル
及びウイルスのみを加えたウエルの３者の比較より算出
すればよい。また、検体の細胞毒性は、検体のみを加え
たウエル、ウイルスも検体も加えないウエル及び培地の
みのウエルの比較より算出すればよい。
【００１７】
【発明の効果】本発明方法によれば、抗インフルエンザ
ウイルス剤のアッセイ及び細胞毒性が簡便な操作で、迅
速に再現性よく、かつ安価にでき、アンチセンスＤＮＡ
等の新しい抗ウイルス剤のスクリーニングを容易かつ精
度よくすることができる。また、検体として抗インフル
エンザ作用及び細胞毒性について既知である物質、例え
ばインフルエンザウイルスに対し特異的に反応する既知
の抗インフルエンザウイルス剤を用いることによりイン
フルエンザ感染性細胞の感染しているインフルエンザウ
イルスの種類あるいは、後から感染させるインフルエン
ザウイルスの種類を判定する方法に応用することができ
る。例えば、検体としてアンチセンスＤＮＡを用いた場
合、少なくともインフルエンザウイルスＡについてその
存在の有無を調べることができる。アンチセンスＤＮＡ
などのインフルエンザウイルスに対する特異性について
は今後の開発が期待される。
ウイルス剤のアッセイ及び細胞毒性が簡便な操作で、迅
速に再現性よく、かつ安価にでき、アンチセンスＤＮＡ
等の新しい抗ウイルス剤のスクリーニングを容易かつ精
度よくすることができる。また、検体として抗インフル
エンザ作用及び細胞毒性について既知である物質、例え
ばインフルエンザウイルスに対し特異的に反応する既知
の抗インフルエンザウイルス剤を用いることによりイン
フルエンザ感染性細胞の感染しているインフルエンザウ
イルスの種類あるいは、後から感染させるインフルエン
ザウイルスの種類を判定する方法に応用することができ
る。例えば、検体としてアンチセンスＤＮＡを用いた場
合、少なくともインフルエンザウイルスＡについてその
存在の有無を調べることができる。アンチセンスＤＮＡ
などのインフルエンザウイルスに対する特異性について
は今後の開発が期待される。
【００１８】
【実施例】次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明
するが、本発明はかかる実施例に限定されるものではな
い。
するが、本発明はかかる実施例に限定されるものではな
い。
【００１９】実施例１ コーニングフラスコに単層を形成させた犬腎臓上皮性細
胞（ＭＤＣＫ細胞）をトリプシン−ＥＤＴＡ溶液にて剥
離し、１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含む細胞増殖培養
用１×Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ*1) （以下、これをｇｒ
ｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕｍとする）を用いて１００，００
０ ｃｅｌｌｓ／mlの細胞浮遊液を調整する。その後、
その溶液をエッペンドルフピペットを用いて９６穴プレ
ート（図１）の内側のすべての穴に１００μｌ分注す
る。また外一回りの穴にはｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕｍ
のみを分注する。その後、３７℃、５％ＣＯ2 インキュ
ベーター中で２４時間インキュベーションする。２４時
間後それぞれ各穴の細胞が飽和に達していることを倒立
型顕微鏡にて確認する。確認後、検体を希釈する。希釈
溶媒は、１０γ−アセチルトリプシン−細胞維持培養用
１×Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ*2) （以下、ｍａｉｎｔｅｎａ
ｎｃｅｍｅｄｉｕｍとする）とする（又は、１０γ−ア
セチルトリプシン−ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕｍ）。こ
の際、アセチルトリプシンの添加量は、アセチルトリプ
シン検定にてあらかじめ最適添加量を決定しておき、最
適添加量の２倍量を希釈溶媒に添加する。これは、プレ
ートにまいた場合２倍に希釈されることによる。まず初
め、活性試験を行なう際の最高濃度溶液を作成する。調
整が終了した後、孔が０．２２μｍのメンブランフィル
ターを用い無菌ろ過をする。次に、その溶液を任意の割
合で９段階希釈した後プレートに分注する。基本的に、
マイクロプレートの一番外側を除き１０列６行を使用す
る。最高検体濃度を左から２列目縦８穴に加え、順次右
側へ同様に加える。第１行と８行は検体のバックグラウ
ンドとし、また第１１列目（右側より２列目）は検体を
含まないコントロールとし、第１列と第１２列と同様ｍ
ａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｍｅｄｉｕｍを加える。次にウ
イルスの希釈を行なう。希釈溶媒はｍａｉｎｔｅｎａｎ
ｃｅ ｍｅｄｉｕｍ（又はｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕ
ｍ）とする。ウイルスはあらかじめｔｉｔｒａｔｉｏｎ
しておく。ウイルス添加濃度は２ＰＦＵ／ｃｅｌｌとす
る。また各穴に５０μｌ接種するため基本的に細胞浮遊
液に対して４倍のウイルス希釈液を調整する。調整後第
１行から第４行第２列から第１１列までの全穴に接種す
る。また、第５行から第８行第２列から第１１列まで
と、第２列第１２列の前穴には希釈液を加える。その
後、３４℃、５％ＣＯ2 インキュベーター中で７２時間
培養する。７２時間培養後、ＭＴＴを２０μｌずつ全穴
に加える。その後、１時間３４℃、５％ＣＯ2 インキュ
ベーター中で培養する。１時間後全穴から培地を１５０
μｌ除去し、ホルマザン抽出溶媒（３ml濃塩酸と２５ml
トリトンＸ−１００にイソプロパノールを加え全量を５
００mlとしたもの）を１００μｌ加える。その後ミクロ
ミキサーにてよく攪拌し、ホルマザンを完全に溶解させ
る。溶解後、５４０nmの特異的吸光度と６９０nmの非特
異的吸光度をマイクロプレートリーダーで測定する。ウ
イルスコントロール（第１１列第２行〜第４行の平均）
を０％、細胞コントロール（第１１列第５行〜第８行の
吸光度の平均）を１００％とし、この吸光度の差の相対
パーセントを計算し、抗ウイルス効果を細胞生存率％と
して表す。また、検体の細胞毒性の方は、細胞コントロ
ール（第１１列第５行〜第８行の吸光度の平均）を１０
０％とし、第１２列第５行〜第８行の吸光度の平均値を
０％とし同様に求めた。更に、検体の５０％細胞毒性値
（ＣＣ５０）、５０％有効値（ＥＣ５０）、有効係数
（ＣＣ５０／ＥＣ５０＝ＳＩ）を求める。
胞（ＭＤＣＫ細胞）をトリプシン−ＥＤＴＡ溶液にて剥
離し、１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含む細胞増殖培養
用１×Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ*1) （以下、これをｇｒ
ｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕｍとする）を用いて１００，００
０ ｃｅｌｌｓ／mlの細胞浮遊液を調整する。その後、
その溶液をエッペンドルフピペットを用いて９６穴プレ
ート（図１）の内側のすべての穴に１００μｌ分注す
る。また外一回りの穴にはｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕｍ
のみを分注する。その後、３７℃、５％ＣＯ2 インキュ
ベーター中で２４時間インキュベーションする。２４時
間後それぞれ各穴の細胞が飽和に達していることを倒立
型顕微鏡にて確認する。確認後、検体を希釈する。希釈
溶媒は、１０γ−アセチルトリプシン−細胞維持培養用
１×Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ*2) （以下、ｍａｉｎｔｅｎａ
ｎｃｅｍｅｄｉｕｍとする）とする（又は、１０γ−ア
セチルトリプシン−ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕｍ）。こ
の際、アセチルトリプシンの添加量は、アセチルトリプ
シン検定にてあらかじめ最適添加量を決定しておき、最
適添加量の２倍量を希釈溶媒に添加する。これは、プレ
ートにまいた場合２倍に希釈されることによる。まず初
め、活性試験を行なう際の最高濃度溶液を作成する。調
整が終了した後、孔が０．２２μｍのメンブランフィル
ターを用い無菌ろ過をする。次に、その溶液を任意の割
合で９段階希釈した後プレートに分注する。基本的に、
マイクロプレートの一番外側を除き１０列６行を使用す
る。最高検体濃度を左から２列目縦８穴に加え、順次右
側へ同様に加える。第１行と８行は検体のバックグラウ
ンドとし、また第１１列目（右側より２列目）は検体を
含まないコントロールとし、第１列と第１２列と同様ｍ
ａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｍｅｄｉｕｍを加える。次にウ
イルスの希釈を行なう。希釈溶媒はｍａｉｎｔｅｎａｎ
ｃｅ ｍｅｄｉｕｍ（又はｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕ
ｍ）とする。ウイルスはあらかじめｔｉｔｒａｔｉｏｎ
しておく。ウイルス添加濃度は２ＰＦＵ／ｃｅｌｌとす
る。また各穴に５０μｌ接種するため基本的に細胞浮遊
液に対して４倍のウイルス希釈液を調整する。調整後第
１行から第４行第２列から第１１列までの全穴に接種す
る。また、第５行から第８行第２列から第１１列まで
と、第２列第１２列の前穴には希釈液を加える。その
後、３４℃、５％ＣＯ2 インキュベーター中で７２時間
培養する。７２時間培養後、ＭＴＴを２０μｌずつ全穴
に加える。その後、１時間３４℃、５％ＣＯ2 インキュ
ベーター中で培養する。１時間後全穴から培地を１５０
μｌ除去し、ホルマザン抽出溶媒（３ml濃塩酸と２５ml
トリトンＸ−１００にイソプロパノールを加え全量を５
００mlとしたもの）を１００μｌ加える。その後ミクロ
ミキサーにてよく攪拌し、ホルマザンを完全に溶解させ
る。溶解後、５４０nmの特異的吸光度と６９０nmの非特
異的吸光度をマイクロプレートリーダーで測定する。ウ
イルスコントロール（第１１列第２行〜第４行の平均）
を０％、細胞コントロール（第１１列第５行〜第８行の
吸光度の平均）を１００％とし、この吸光度の差の相対
パーセントを計算し、抗ウイルス効果を細胞生存率％と
して表す。また、検体の細胞毒性の方は、細胞コントロ
ール（第１１列第５行〜第８行の吸光度の平均）を１０
０％とし、第１２列第５行〜第８行の吸光度の平均値を
０％とし同様に求めた。更に、検体の５０％細胞毒性値
（ＣＣ５０）、５０％有効値（ＥＣ５０）、有効係数
（ＣＣ５０／ＥＣ５０＝ＳＩ）を求める。
【００２０】
【表１】 *1：細胞増殖培養用１×Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ組成 １０×Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ １００（ml） ７．５％ＮａＨＣＯ3 １４ １mg／mlファンギゾン ２．５ 滅菌水 全量を１０００mlとする量 *2：細胞維持培養用２×Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ組成 １０×Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ ２００（ml） ７．５％ＮａＨＣＯ3 ４０ ＴＣビタミン ２．０ １mg／ml葉酸 ２．０ １mg／mlファンギゾン ２．０ ３５％牛血清アルブミン １１．４ 滅菌水 ７３７．６
【００２１】実施例２ 実施例１の試験方法において、検体として下記塩基配列
を有するアンチセンスＤＮＡ〔Ｋａｂａｎｏｖ，Ａ．
Ｖ．，Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｕｒｏｐｅａｎ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｔｙ，ｖｏｌ．２
５９，Ｎｏ．２，３２７〜３３０〕を用い、細胞生存率
及び細胞毒性をアッセイした。その結果、図２に示すよ
うに当該アンチセンスＤＮＡは優れた抗インフルエンザ
ウイルス作用を有し、かつ安全性も高かった。 アンチセンスＤＮＡ：ｄ３′−ＴＴＡＡＡＧＣＡＧＴＴ
−５′
を有するアンチセンスＤＮＡ〔Ｋａｂａｎｏｖ，Ａ．
Ｖ．，Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｕｒｏｐｅａｎ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｔｙ，ｖｏｌ．２
５９，Ｎｏ．２，３２７〜３３０〕を用い、細胞生存率
及び細胞毒性をアッセイした。その結果、図２に示すよ
うに当該アンチセンスＤＮＡは優れた抗インフルエンザ
ウイルス作用を有し、かつ安全性も高かった。 アンチセンスＤＮＡ：ｄ３′−ＴＴＡＡＡＧＣＡＧＴＴ
−５′
【図１】実施例１で使用した９６穴プレートを示す図で
ある。
ある。
【図２】アンチセンスＤＮＡの抗インフルエンザウイル
ス作用及び細胞毒性を示す図である。
ス作用及び細胞毒性を示す図である。
Claims (1)
- 【請求項１】 複数個のインフルエンザ感染性細胞培養
物の各々に検体を添加し、次いで当該複数個の培養物の
一部にインフルエンザウイルスを感染させた後、当該複
数個の培養物全体についてＭＴＴアッセイを行ない、当
該検体の抗インフルエンザウイルス作用及び細胞毒性を
同時に測定することを特徴とする抗インフルエンザウイ
ルス剤アッセイ法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18243292A JPH0622799A (ja) | 1992-07-09 | 1992-07-09 | 抗インフルエンザウイルス剤アッセイ法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18243292A JPH0622799A (ja) | 1992-07-09 | 1992-07-09 | 抗インフルエンザウイルス剤アッセイ法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0622799A true JPH0622799A (ja) | 1994-02-01 |
Family
ID=16118170
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18243292A Pending JPH0622799A (ja) | 1992-07-09 | 1992-07-09 | 抗インフルエンザウイルス剤アッセイ法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0622799A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997003356A1 (de) * | 1995-07-12 | 1997-01-30 | Christiane Lauk | Verfahren zur bestimmung der wirksamkeit und verträglichkeit eines xenogenen stoffes auf einen organismus |
-
1992
- 1992-07-09 JP JP18243292A patent/JPH0622799A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997003356A1 (de) * | 1995-07-12 | 1997-01-30 | Christiane Lauk | Verfahren zur bestimmung der wirksamkeit und verträglichkeit eines xenogenen stoffes auf einen organismus |
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