JPH06197797A

JPH06197797A - Method for amplification and detection of nucleic acid substance and device for use in said method

Info

Publication number: JPH06197797A
Application number: JP5264813A
Authority: JP
Inventors: Paul Hong Dze Chen; ホン−ゼチェンポール; John B Findlay; ブルースフィンドレイジョン; Susan Melissa Atwood; メリッサアトウッドスーザン; Lynn Bergmeyer; バーグメイヤーリン; John B Chemelli; ベンジャミンチメリジョン
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Eastman Kodak Co
Priority date: 1992-10-23
Filing date: 1993-10-22
Publication date: 1994-07-19
Anticipated expiration: 2021-07-12
Also published as: FI934669A; DE69317502D1; DE69317502T2; EP0594260A1; TW313588B; FI934669A0; JP3795540B2; DK0594260T3; EP0594260B1

Abstract

PURPOSE: To provide both a device for amplifying and detecting a nucleic acid material and a method therefor.

CONSTITUTION: This device 10 is capable of generating a detectable signal by using a label and a signaling material responsive to the label and the method comprises using the label and signaling material. A surprising result of the method and device 10 is that at least one of wash steps heretofore required is eliminated without substantially adversely affecting results.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、核酸物質を増幅及び検
出するのに使用される、反応パウチもしくはデバイス、
並びに方法に関する。This invention relates to reaction pouches or devices used to amplify and detect nucleic acid material,
And method.

【０００２】[0002]

【従来の技術】極微量の核酸物質のＰＣＲ増幅及び増幅
された物質の検出を、増幅された核酸が漏出しない単一
パウチですべて実施できる方法を用いたＤＮＡ検出は、
欧州特許出願 381,501号明細書に記載されている。６つ
の一時的にシールされたブリスター（また区画（compar
tment)と称される）は、検出区画の検出部位に対してそ
れらを連絡する通路に沿って提供される。ブリスター
は、順に、ＰＣＲ反応区画；第一洗浄区画；例えば、ス
トレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下本
明細書では、ＳＡ−ＨＲＰと称する）を含有する酵素標
識区画；第二洗浄区画；酵素に応答するシグナル発生性
物質を含有する区画；並びに停止溶液区画を提供する。
これらの各々が言及した順序で空になって内容物が検出
区画へ移動し、検出部位は、増幅された核酸物質を捕捉
しそして検出可能なシグナルを発生するために使用され
る。2. Description of the Related Art DNA detection using a method in which PCR amplification of a very small amount of nucleic acid substance and detection of the amplified substance can all be carried out with a single pouch in which the amplified nucleic acid does not leak,
It is described in European Patent Application 381,501. 6 temporary sealed blisters (also compar
tment)) are provided along the pathways that connect them to the detection sites of the detection compartment. The blister is in turn responsive to a PCR reaction compartment; a first wash compartment; an enzyme labeled compartment containing, for example, streptavidin horseradish peroxidase (hereinafter referred to herein as SA-HRP); a second wash compartment; an enzyme. A compartment containing a signal-generating substance; as well as a stop solution compartment are provided.
Each of these empties and the contents migrate to the detection compartment in the order mentioned and the detection sites are used to capture the amplified nucleic acid material and generate a detectable signal.

【０００３】２つの洗浄段階を提供するために２つの洗
浄区画を使用することは、核酸物質を検出する従来の試
みのすべてと一致する。例えば、J. Clin. Microbiol.
845〜853 (1992年４月）の第30巻は、Roche ( 846〜
847 ページ）により使用された方法を記載する。その方
法は、固体壁面に対してビオチニル化生成物をハイブリ
ダイゼーションし、続いて、「プレートを４回洗浄緩衝
剤Ｉで洗浄していずれかの未ハイブリダイゼーション生
成物を除去した」と記載されている。これら４回の洗浄
は、欧州特許出願 381,501号明細書のパウチの第１洗浄
ブリスターの第１洗浄段階に対応するものであり、そし
てまた、「ハイブリダイゼーションしていない」ＤＮＡ
もしくは核酸材料が検出部位へ洗い流される。その後、
Roche 方法では、「37℃で15分間アビジン−西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ接合体と」インキュベーションせしめ
た。当然それは、ほとんど同じ目的で、EPA パウチの酵
素ブリスターを空にすることに対応する。その後、Roch
e 方法では、「再びプレートを４回洗浄して」「未結合
接合体を除去した」。勿論これは、EPA 381,501のパウ
チ中の酵素ブリスターとシグナル発生性物質ブリスター
との間に配置された第２洗浄ブリスターにより提供され
る第２洗浄段階に対応する。The use of two wash compartments to provide two wash steps is consistent with all previous attempts at detecting nucleic acid material. For example, J. Clin. Microbiol.
Volume 30 of 845-853 (April 1992) is Roche (846-
The method used by (Page 847) is described. The method is described as hybridizing the biotinylated product to a solid wall followed by "washing the plate 4 times with wash buffer I to remove any unhybridized product." There is. These four washes correspond to the first wash step of the first wash blister of the pouch of European Patent Application 381,501, and also the "non-hybridized" DNA.
Alternatively, the nucleic acid material is washed away to the detection site. afterwards,
In the Roche method, incubation was carried out with avidin-horseradish peroxidase conjugate for 15 minutes at 37 ° C. Naturally, it corresponds to emptying the EPA pouch enzyme blister for almost the same purpose. Then Roch
In method e, "the plate was washed 4 times again" and "unbound conjugate was removed." Of course, this corresponds to a second wash step provided by a second wash blister located between the enzyme blister and the signal generator blister in the pouch of EPA 381,501.

【０００４】そのような方法は、すべて洗浄によって、
十分実施できるとはいえ、時間を浪費し、従って経費が
かかる。更に、洗浄は、パウチの製造を複雑にする。し
かしながら、それらは「非特異的シグナル」、即ち、標
的ではない未結合核酸物質の存在、及び／又は標的核酸
が存在しないために存在すべきではない未結合ＳＡ−Ｈ
ＲＰのどちらかによって発生するシグナルを排除するた
めに必須であると考えられている。[0004] All such methods are by washing.
Although well implemented, it is time consuming and therefore expensive. Furthermore, cleaning complicates pouch manufacturing. However, they are “non-specific signals”, ie unbound SA-H that should not be present due to the presence of unbound nucleic acid material that is not the target and / or the absence of target nucleic acid.
It is believed to be essential to eliminate the signal generated by either RP.

【０００５】[0005]

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、信頼できないシグナルを発生することで検出中に多
量のノイズを生じることなく、少なくとも１つの、好ま
しくは両方の、以前に必要とされた洗浄段階及び洗浄ブ
リスターを排除する検出順序を提供することである。SUMMARY OF THE INVENTION It is therefore an object of the present invention to have at least one, and preferably both, of the previous needs without producing a lot of noise during the detection by producing an unreliable signal. To provide a wash sequence and a detection sequence that eliminates wash blisters.

【０００６】[0006]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、EPA 38
1,501に記載された方法に使用されたパウチのフォーマ
ットが、１つもしくは両方の洗浄ブリスターを排除する
ことに役立ち、一方実質的に同じ結果を提供することを
発見した。これは、洗浄が必須段階であることを指図し
てきた実際の歴史に著しい驚きを与えた。[Means for Solving the Problems]
It has been discovered that the pouch format used in the method described in 1,501 helps eliminate one or both wash blisters while providing substantially the same results. This has given a remarkable surprise to the actual history of instructing that cleaning is an essential step.

【０００７】より詳細には、本発明の一態様に従えば、
本発明の目的は、少なくとも１つの固定化プローブを含
む検出部位に増幅された核酸物質をハイブリダイズせし
め、シグナル発生性物質であるか又はそれと相互作用し
てシグナルを生成する標識を該部位に持ってくることに
よりハイブリダイズして固定化せしめた核酸物質を標識
し、その後にシグナル発生性物質を該部位に添加して検
出可能なシグナルを生成することにより増幅された核酸
物質を検出する方法であって、標識段階が、ハイブリダ
イゼーション段階の後に、間に洗浄段階を必要とするこ
となく直接用いられるか、又は添加段階が、標識段階の
後に、間に洗浄段階を必要とすることなく直接用いられ
る方法により達成される。このような事情で使用される
「又は」が、非限定的使用であることは明らかである。More specifically, according to one aspect of the invention,
An object of the present invention is to hybridize an amplified nucleic acid substance to a detection site containing at least one immobilized probe, and have a label which is a signal-generating substance or interacts therewith to generate a signal. By labeling the nucleic acid substance which has been hybridized and immobilized by adding a signal-generating substance to the site to produce a detectable signal, thereby detecting the amplified nucleic acid substance. Thus, the labeling step is used directly after the hybridization step, without the need for an intervening wash step, or the addition step is used directly after the labeling step, without any intervening wash step. Is achieved by the method described. Obviously, "or" used in such circumstances is non-limiting use.

【０００８】本発明の別の態様に従えば、増幅された核
酸物質を検出するための検出部位並びに標識及び共同し
て検出可能なシグナルを発生するのに有効であるシグナ
ル発生性物質を含有する保存区画を含む複数の区画、並
びに区画と部位を流動的に連絡するための通路を含んで
なる、鋳型として少なくとも１つの標的鎖を用いて核酸
物質を増幅及び検出するためのデバイスにより目的が達
成される。該デバイスは、更に、実質的に捕捉体、標識
及びシグナル発生性試薬を含まない洗浄液を含有する１
つ以下の洗浄区画、及び保存もしくは反応区画に使用さ
れるシグナル発生性試薬、並びに洗浄区画と検出部位を
連絡する１つ以下の通路を含み、そして、１つ以下の洗
浄段階が、区画の内容物を空にして検出部位へ移動せし
めることを含む一連の段階に使用されるように改良され
ている。According to another aspect of the invention, it contains a detection site for detecting the amplified nucleic acid material as well as a label and a signal-generating material which is effective in producing a co-detectable signal. Achieved by a device for amplifying and detecting nucleic acid material using at least one target strand as a template, comprising a plurality of compartments, including storage compartments, and a passageway for fluidly communicating the compartments and sites To be done. The device further comprises a wash solution that is substantially free of capture agents, labels and signal generating reagents. 1
No more than three wash compartments, and a signal-generating reagent used in the storage or reaction compartment, and no more than one passage connecting the wash compartment to the detection site, and no more than one wash step comprises the contents of the compartment. It has been modified for use in a series of steps involving emptying and moving the object to the detection site.

【０００９】[0009]

【具体的な態様】以下の本明細書の説明は、本発明を、
その好ましい態様について示すものであり、同一所有の
許可された米国特許出願番号第 673,053号明細書（1991
年３月21日にSchnipelsky 他により出願されたものであ
り、その内容は本明細書に特に組み入れられる）に教示
された手段で、柔軟なパウチもしくはデバイスが提供さ
れ使用される。（幾つかの開示はEPA 381,501 に記載の
ものと同様である。）更に、本発明は、１つ以下の洗浄
区画が、結果として１つ以下の介在する洗浄段階に含ま
れることを条件として、ＰＣＲが使用されるかどうかに
無関係に有用であり、且つそのパウチのすべての特徴の
存在に無関係に有用である。本明細書で用いられる「洗
液」もしくは「洗浄溶液」なる語は、別の区画、即ち標
識区画又はシグナル発生性物質区画のどちらかに使用さ
れる捕捉体、標識及びシグナル発生性試薬を実質的に含
まない溶液を意味する。Specific Embodiments The following description of the present specification describes the present invention.
The preferred embodiments thereof are shown in the same owned and licensed U.S. Patent Application No. 673,053 (1991).
A flexible pouch or device is provided and used by the means taught by Schnipelsky et al., Mar. 21, 2014, the contents of which are specifically incorporated herein. (Some disclosures are similar to those described in EPA 381,501.) Further, the present invention provides that no more than one wash compartment is included in no more than one intervening wash step. It is useful regardless of whether PCR is used and regardless of the presence of all features of the pouch. As used herein, the term "wash solution" or "wash solution" refers substantially to the capture agent, label and signal generating reagent used in another compartment, either the labeling compartment or the signal generating material compartment. It means a solution that does not contain water.

【００１０】前記米国特許出願番号第 673,053号明細書
の柔軟なパウチの、非特異的シグナルを著しく提供する
ことなく洗浄段階を排除する能力は、完全に理解されて
いるわけではない。しかしながら、「スラッグ」の前面
が、その前の「スラッグ」により残存する結合していな
い試薬を洗い出すように作用するというような、各々の
連続的な液体のスラッグを直線的に通過せしめるような
パウチの構成より得られると考えられる。このような
「前面」で生じるいずれかの相互作用は、固定化部位で
発生するシグナルに対してほとんど又は全く取るに足ら
ないものである。更に、すべての各スラッグの液体が、
検出部位を通過して効率を改良する。下記のように添加
できる任意の剪断減粘性ゲルは、この能力を増強し、ス
ラッグの前面の境界により除去される成分の後方移動を
遅らせるより粘稠なスラッグを創造することは明らかで
ある。The ability of the flexible pouches of US Pat. No. 673,053 to eliminate the wash step without significantly providing non-specific signals is not completely understood. However, a pouch that allows each successive liquid slug to pass linearly, such that the front surface of the "slug" acts to wash out any unbound reagent remaining by the preceding "slug". It is thought to be obtained from the configuration of. Any such interactions that occur on the "front side" are of little or no significance to the signal generated at the immobilization site. In addition, all the liquid in each slug
Pass the detection site to improve efficiency. It is clear that any shear thinning gel that can be added as described below enhances this ability, creating a more viscous slug that retards the backward migration of components removed by the front boundary of the slug.

【００１１】図１は、反応区画と標識区画の間の洗浄区
画及び洗浄段階を排除した、本発明の一様式を具体的に
示すものである。反応キュベットもしくはデバイス１０
は、患者の試料液を注入するための入口２２を含み、そ
の入口は通路２１を介してＰＣＲ反応区画２６に連絡す
る。シール４６は、区画２６の流出を一時的に遮断す
る。シール４６が破れると、液体は通路４４を通過し
て、好ましくは適所に定着せしめられたビーズから成る
部位４１を有する検出室４０に送られる。ビーズは、区
画２６から流れてきてそれらを通過するいずれかの標的
分析物と複合体を形成し、次いで別の試薬区画から来る
試薬と複合体を形成するであろう。それらの別の区画は
区画３０，３２，３４であり、これらの内容物は各々通
路４８及び５０を介して検出室４０に送られる。これら
の各通路は５６で一時的にシールされており、そしてこ
れらの区画は適当な試薬液を含有する。FIG. 1 illustrates one embodiment of the present invention which eliminates the wash compartment and wash steps between the reaction compartment and the labeling compartment. Reaction cuvette or device 10
Includes an inlet 22 for injecting a patient sample liquid, which inlet communicates with the PCR reaction compartment 26 via a passage 21. The seal 46 temporarily blocks the outflow of the compartment 26. When the seal 46 is broken, the liquid passes through the passage 44 and is delivered to the detection chamber 40, which has a site 41, which preferably consists of beads that are anchored in place. The beads will complex with any target analytes that flow from and pass through compartment 26 and then complex with reagents coming from another reagent compartment. The other compartments are compartments 30, 32, 34, the contents of which are delivered to the detection chamber 40 via passages 48 and 50, respectively. Each of these passages is temporarily sealed at 56, and these compartments contain the appropriate reagent solution.

【００１２】すべての区画及び部位４１に有用な化学物
質については、前記米国特許出願番号第 673,053号明細
書により詳細に説明されている。好ましくは、洗浄区画
が緩衝剤、界面活性剤、ＥＤＴＡ、NaCl及び別の塩類を
含む。The chemicals useful in all compartments and sites 41 are described in more detail in the aforementioned US patent application Ser. No. 673,053. Preferably, the wash compartment contains buffers, detergents, EDTA, NaCl and other salts.

【００１３】本発明に従えば、数多くの必須の区画が単
一化されている。従って：使用者により添加される患者
試料に加えて、好ましくはＰＣＲ増幅に必要なすべての
伝統的な試薬を含む区画２６は、場合によっては一時的
にシール２５により適所に維持される。（試薬は、予め
インキュベーションすることができ、又は患者試料を入
れるときにそれと共に添加できる。）試薬は、バインデ
ィングペアの１メンバーに結合したプライマーを含み、
その別のメンバーは下記区画３０に認められる。プライ
マーに付着したバインディングメンバーの有用な具体例
はビオチンである。（ここで、シール２５は試料を注入
することにより破裂する。）According to the invention, a number of the essential compartments are unified. Thus: In addition to the patient sample added by the user, the compartment 26, which preferably contains all the traditional reagents necessary for PCR amplification, is optionally temporarily kept in place by the seal 25. (The reagent can be pre-incubated or added with it when loading the patient sample.) The reagent comprises a primer bound to one member of a binding pair,
The other member is found in section 30 below. A useful specific example of a binding member attached to a primer is biotin. (Here, the seal 25 bursts by injecting the sample.)

【００１４】区画３０は、好ましくは、複合剤、例え
ば、アビジン、即ち、バインディングペアの一方のメン
バーに結合した酵素を初めとする標識を含み、そのペア
のもう一方のメンバーは上記反応区画２６で増幅中に標
的分析物の一部となるプライマーに結合している。よっ
て、区画３０中の有用な試薬は、ストレプトアビジン西
洋ワサビペルオキシダーゼ（以下本明細書では、ＳＡ−
ＨＲＰ）である。従って、そのバインディングペアのも
う一方のメンバーはビオチンである。Compartment 30 preferably contains a complexing agent, eg, avidin, a label, including an enzyme, attached to one member of the binding pair, the other member of the pair being in reaction compartment 26 above. It is bound to a primer that will be part of the target analyte during amplification. Thus, a useful reagent in compartment 30 is streptavidin horseradish peroxidase (hereinafter SA-
HRP). Therefore, the other member of the binding pair is biotin.

【００１５】また酵素以外の標識も有用である。例え
ば、蛍光標識、放射性標識及び化学ルミネセンス標識も
このような用途について周知である。また好ましくは、
化学ルミネセンス標識が、酵素標識について以下に検討
されている、シグナル発生性試薬を含有する区画３４に
使用される。好ましくは、区画３２は試薬として洗浄溶
液を含む。Labels other than enzymes are also useful. For example, fluorescent labels, radioactive labels and chemiluminescent labels are also well known for such applications. Also preferably,
A chemiluminescent label is used in compartment 34 containing the signal-generating reagent, which is discussed below for enzyme labeling. Preferably, compartment 32 contains a wash solution as a reagent.

【００１６】好ましくは、区画３４は、シグナル発生性
物質及び有用であるいずれかの色素安定剤を含む。従っ
て、例えば、区画３４中の有用な試薬溶液は、区画３０
の酵素の伝統的な基質であるロイコ色素の溶液である。
またH₂O₂及びいずれかの剪断減粘性ゲルも含まれる。区
画４２は、場合によって吸収体を含有する廃棄物収集区
画である。Preferably, compartment 34 contains a signal generating substance and any dye stabilizer that is useful. Thus, for example, a useful reagent solution in compartment 34 is
It is a solution of leuco dye, which is a traditional substrate for the enzyme.
Also included is H ₂ O ₂ and any shear thinning gel. Compartment 42 is a waste collection compartment that optionally contains an absorber.

【００１７】ローラー６０は、各区画を連続的に破裂せ
しめて、それぞれの区画の内容物を検出室４０に連続的
に進行させるために使用される外部加圧手段を例示する
ものである。処理中、すべての区画及び通路が封じられ
たままなので、デバイスから外部への漏出が生じること
は全くなく、そして繰越汚染も防止される。入口２２の
シーリングは、折り曲げ線７２でコーナー７０を折り曲
げて、孔７４を入口２２の上に嵌め、そして通路２１を
挟みつぶすことにより達成される。次いでクロージャー
キャップを用いてコーナー７０を折り曲げた状態に維持
する。The roller 60 exemplifies an external pressurizing means used to continuously rupture each compartment and continuously advance the contents of each compartment into the detection chamber 40. During processing, all compartments and aisles remain sealed, so there is no external leakage from the device and carry-over contamination is also prevented. Sealing of the inlet 22 is accomplished by folding the corner 70 at a fold line 72 to fit a hole 74 over the inlet 22 and pinch the passage 21. The closure cap is then used to keep the corner 70 folded.

【００１８】デバイス１０を処理するのに有用な処理装
置は、EPA 402,994 に示されている。そのような処理装
置を用いて、支持体表面上にデバイス１０をきちんと並
べて置き、そして加圧メンバー、例えば、ローラーを、
各キュベットを処理する位置に平行に乗せる。便宜上ロ
ーラーを数個から１つもしくは複数の車軸にジャーナル
せしめる。これらの車軸はギアを付けることにより更に
進歩する。好ましくは、支持体表面が水平であるか、又
は水平より約15°上向きに傾斜している。更にヒーター
は、所望により、固定状態であるか、あるいはローラー
と共に運ぶことができる。A processor useful for processing the device 10 is shown in EPA 402,994. Using such a treatment apparatus, the device 10 is placed neatly on the support surface and the pressure member, eg a roller,
Place each cuvette parallel to the processing location. For convenience, the rollers are journaled from several to one or more axles. These axles are further advanced by adding gears. Preferably, the support surface is horizontal or inclined at about 15 ° above horizontal. Further, the heater can be stationary or can be carried with rollers, if desired.

【００１９】従って、区画４０の部位４１でＳＡ−ＨＲ
Ｐをインキュベーションした後に洗浄段階を提供して、
いずれの未結合ＳＡ−ＨＲＰも除去するために、唯一の
洗浄区画３２が使用される。検出部位に向けられた各試
薬がそのステーションに入る次の試薬によりほとんど洗
い流されるので、増幅された核酸物質及びＳＡ−ＨＲＰ
の、部位４１へのそれぞれの連続的な移動の間に洗浄段
階もしくは洗浄液は全く必要とされないと考えられる。
各区画の少量の内容物がこれを行うのに十分であること
は、驚くべきことである。Therefore, at the portion 41 of the compartment 40, the SA-HR
Providing a wash step after incubating P,
A unique wash compartment 32 is used to remove any unbound SA-HRP. Amplified nucleic acid material and SA-HRP are obtained because each reagent directed to the detection site is mostly washed away by the next reagent entering that station.
It is believed that no cleaning step or solution is required during each successive transfer of the, to the site 41.
It is surprising that the small amount of content in each compartment is sufficient to do this.

【００２０】あるいは（図示せず）、洗浄液が区画３０
にのみ配置されており、ＳＡ−ＨＲＰがここで区画３２
に配置されているが、図１と全く同じ構造のものが有用
である。この配置では、方法は、部位４１でＳＡ−ＨＲ
Ｐをインキュベーションした直後に、洗浄段階を間に入
れることなく、区画３４のシグナル発生性物質を部位４
１と直接相互作用するように進行させる。これが実施で
きる理由は、先の態様について記載の通りである。Alternatively (not shown), the cleaning liquid is in the compartment 30.
The SA-HRP is located here in compartment 32.
However, the one having the same structure as that of FIG. 1 is useful. In this arrangement, the method is SA-HR at site 41.
Immediately after incubating P, the signal-generating substance in compartment 34 was added to site 4 without an intervening wash step.
Proceed to interact directly with 1. The reason why this can be done is as described for the previous aspect.

【００２１】どちらの態様においても、所望であれば更
なる洗浄液を備えた洗浄区画を補充できる。これを行う
便利な方法（図２）は、始めに第１洗浄区画を空にして
検出部位へ流し、次いで第２洗浄区画を空にして検出部
位へ流すために、第１洗浄区画に隣接した洗浄区画を加
えることである。これらの前記と同様の部分には、同様
の参照数字を付与し、区別するためにそれの末尾に
「Ａ」を付ける。In either embodiment, the wash compartment with additional wash liquid can be replenished if desired. A convenient way of doing this (FIG. 2) is to first empty the first wash compartment to flush to the detection site and then to empty the second wash compartment to flush to the detection site, adjacent to the first wash compartment. The addition of a wash compartment. These similar parts are provided with similar reference numerals and are suffixed with an "A" for distinction.

【００２２】従って、パウチ１０Ａは、更に一時的にシ
ールした洗浄液の区画３６を区画３２Ａと３４Ａの間に
置いたことを除いて、図１の態様におけるものと全く同
じ特徴を含む。通路５２は、区画３６のシール５６Ａが
破裂した後に、それを区画４０Ａに連絡するものであ
る。あるいは、大量の洗液を備えた単一洗浄区画が使用
できる。図３に示すように、結果としていかなる洗浄区
画又はいかなる洗浄段階の存在も必要ではない。これら
の前記と同様の部分には、同様の参照数字を付与し、区
別するためにそれの末尾に「Ｂ」を付ける。Accordingly, pouch 10A includes exactly the same features as in the embodiment of FIG. 1 except that a temporary sealed cleaning fluid compartment 36 is placed between compartments 32A and 34A. The passage 52 connects the seal 56A of the compartment 36 to the compartment 40A after it has ruptured. Alternatively, a single wash compartment with a large volume of wash solution can be used. As shown in FIG. 3, consequently, the presence of any washing compartment or washing step is not necessary. These similar parts are provided with the same reference numerals and have a "B" at the end to distinguish them.

【００２３】従って、図３のパウチ１０Ｂは、全く洗浄
区画が存在しないことを除いて、前記態様のすべての特
徴を含む。存在する区画は、サーマルサイクリング反応
区画２６Ｂ、標識含有区画３０Ｂ（例えば、ストレプト
アビジン西洋ワサビペルオキシダーゼを含む）、並びに
シグナル発生性物質、例えば、H₂O₂を含有し、すぐ後に
記載する剪断減粘性ゲル及び標識酵素と反応して色素を
生成するロイコ色素を任意に含有する区画３４Ｂのみで
ある。シール４６Ｂ及び５６Ｂは、ローラー６０Ｂによ
り連続的に破裂せしめられ、内容物はそれぞれ通路４４
Ｂ及び４８Ｂを介して検出部位４０Ｂに流れ、次いで廃
棄物区画４２Ｂに流れる。Accordingly, the pouch 10B of FIG. 3 includes all the features of the previous embodiment, except that there is no wash compartment. The compartments present include the thermal cycling reaction compartment 26B, the label-containing compartment 30B (including, for example, streptavidin horseradish peroxidase), as well as a signal-generating substance, such as H ₂ O _2, and the shear thinning viscosity described immediately below. Only compartment 34B, which optionally contains a leuco dye that reacts with the gel and the labeling enzyme to form a dye. The seals 46B and 56B are continuously ruptured by the roller 60B, so that the contents respectively pass the passage
Flow through B and 48B to detection site 40B and then to waste compartment 42B.

【００２４】すべての態様において、シグナル発生性物
質と共に含まれる任意の成分は、検出区画中の検出部位
での色生成を安定化するための約 0.5％のアガロース溶
液である。アガロースは、剪断速度１〜10²sec^-1の間の
この濃厚な液滴でその粘度が約27ポアズであり（その液
滴の60％を越える）、そして約40℃で測定した場合、一
方速度10²を越えると３ポアズのみであるという剪断減
粘性挙動を示す。同様の粘度挙動を示しそして低いパー
センテージ濃度を示す別の剪断減粘性ゲルが使用でき
る。In all embodiments, the optional ingredient included with the signal-generating substance is an agarose solution of about 0.5% to stabilize color production at the detection site in the detection compartment. Agarose has a viscosity of about 27 poise in this thick droplet (over 60% of that droplet) between ^{1 and} 10 ² sec ^-1 shear rate, and when measured at about 40 ° C, When the velocity exceeds 10 ² , it exhibits a shear thinning behavior of only 3 poises. Other shear thinning gels that exhibit similar viscosity behavior and exhibit low percentage concentrations can be used.

【００２５】以前は洗浄段階が検出部位への増幅された
物質もしくは標識のどちらかの添加と次の試薬の添加の
間に必須であると考えられていたので、上記のように、
驚くべきことにどのようにしてパウチを用いて洗浄段階
を排除することが許容されるのか、完全に理解されてい
るわけではない。図４Ａ〜４Ｃは、例えば、図３の態様
を用いて仮定したメカニズムを具体的に説明する際の補
助として含めた。しかしながら、同様の原理がすべての
態様に作用していると信じられている。Since a wash step was previously thought to be essential between the addition of either the amplified substance or the label to the detection site and the addition of the next reagent, as described above,
Surprisingly, it is not fully understood how it is acceptable to use a pouch to eliminate the wash step. 4A-4C are included as an aid in illustrating the mechanism hypothesized using, for example, the embodiment of FIG. However, it is believed that similar principles work in all aspects.

【００２６】示されているものは、前記EPA 381,051 に
記載のような固定化ビーズを含む、拡大した検出部位４
１Ｂである。図４Ａに示される段階では、ビオチン尾部
を有する増幅された標的核酸物質を「〜〜〜Ｂ」と示
す。そのような物質は既にビーズにハイブリダイズせし
められている。更に、標識ＳＡ−ＨＲＰを含有する区画
が空になりその部位へ流れてくる。（ＳＡ−ＨＲＰは、
標識アビジンとして「Ａ ^*」と示す。）そのＳＡ−ＨＲ
Ｐの幾つかは、既に標的のビオチンに結合しているが、
しかし幾つかはビーズ上に及び区画４０Ｂの表面上に結
合していないもの又は「遊離しているもの」として示
す。What is shown is in the aforementioned EPA 381,051.
Expanded detection site 4 containing immobilized beads as described
It is 1B. At the stage shown in FIG. 4A, the biotin tail
Amplified target nucleic acid material with is indicated as "~~~ B"
You Such substances have already been hybridized to beads.
It is Further, a compartment containing labeled SA-HRP
Becomes empty and flows to that part. (SA-HRP is
As labeled avidin, "A ^*". ) The SA-HR
Some of P are already bound to the target biotin,
But some bind on the beads and on the surface of compartment 40B.
Shown as unmatched or "free"
You

【００２７】シグナル発生性物質、例えば、ロイコ色素
（「Ｌ．Ｄ．」と示す）を含有する次の区画が破裂する
と、ロイコ色素は「スラッグ」１００，図４Ｂ，として
前進する。その先導メニスカス１０２は、それが移動す
ることにより（矢印１０４）、部位４１Ｂに接近する。
「スラッグ」１００が図４Ｃの部位４１Ｂを通過すると
き、それはメニスカス１０２で結合していない前の試薬
（Ａ^*）を運び去り、結合した標識のみを残してスラッ
グ１００の後ろに引きずる部分で反応し、部位４１Ｂで
色素を生成する。それは読み取られるか又は検出される
領域１１０であるので、下流（メニスカス１０２）で生
成されたいずれかの余分な色素は無関係である。このよ
うな検出部位への余分な色素の後方への移動は、所望に
より前記剪断減粘性ゲルを使用することにより更に遅く
なる。Upon rupture of the next compartment containing a signal-generating substance, eg, a leuco dye (designated "LD"), the leuco dye advances as a "slug" 100, FIG. 4B. The leading meniscus 102 approaches the part 41B as it moves (arrow 104).
As the "slug" 100 passes through site 41B in Figure 4C, it carries away the unbound previous reagent (A ^* ) at the meniscus 102 and reacts in the trailing part of the slug 100 leaving only the bound label. Then, the dye is generated at the portion 41B. Any extra dye produced downstream (meniscus 102) is irrelevant because it is the area 110 that is read or detected. The posterior migration of excess dye to such detection sites is further slowed by using the shear thinning gel, if desired.

【００２８】[0028]

【実施例】以下の例示的な実施例は、本発明を説明する
際に役立つであろう。すべての実施例及び比較例は、特
に断らない限り、以下のように調製された試薬を用い
た。EXAMPLES The following illustrative examples will help in explaining the present invention. All examples and comparative examples used the reagents prepared as follows unless otherwise specified.

【００２９】Ａ．評価するためのＨＵＴ／ＨＩＶ分析物の調製細胞１つ当たりＨＩＶのコピーを１つ含有するＨＵＴ／
ＡＡＶ／７８細胞を標準フェノール・クロロホルム抽出
方法で処理してＤＮＡを単離し、そして得られたＤＮＡ
の量を分光光度計で定量した。以下に同定される各プラ
イマー（各々１マイクロモル（μＭ））、緩衝剤〔塩化
マグネシウム10ミリモル（mM）、トリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）50mM、塩化カリウム50
mM、及びゼラチン 0.1mg/mL 〕、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、
ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰデオキシヌクレオチド三リン酸
各々 1.5mM、並びにサーマス・アクアティクス（Thermu
saquaticus ）より得られるＤＮＡポリメラーゼ 40単
位、を含有するカクテル中で、回収したＤＮＡ（ＨＩＶ
100,000コピー）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に
より増幅した。 A. Preparation of HUT / HIV Analytes for Evaluation HUT / containing one copy of HIV per cell
DNA was isolated by treating AAV / 78 cells with a standard phenol-chloroform extraction method and the resulting DNA
Was quantified with a spectrophotometer. Each primer (1 micromol (μM) each) identified below, buffer [magnesium chloride 10 mmol (mM), tris (hydroxymethyl) aminomethane (TRIS) 50 mM, potassium chloride 50
mM and gelatin 0.1 mg / mL], dATP, dCTP,
dGTP and dTTP deoxynucleotide triphosphate
1.5mM each, and Thermus Aquatics ( Thermu
saquaticus ) in a cocktail containing 40 units of DNA polymerase (HIV).
100,000 copies) were amplified by polymerase chain reaction (PCR).

【００３０】二組のプライマーを使用した。一組はＥＮ
Ｖ領域に相補的であり、そしてもう一組はＨＵＴ／ＨＩ
ＶＤＮＡのＧＡＧ領域に相補的であり、それらは多重
に使用されることが知られている。各組の１つのプライ
マーが検出を促進するためにビオチニル化された。米国
特許第 4,914,210号明細書の教示に従って、２つのテト
ラエチレングリコールスペーサー基をオリゴヌクレオチ
ドに付着させた。Two sets of primers were used. One set is EN
Complementary to the V region, and the other set is HUT / HI
It is known to be complementary to the GAG region of V DNA and they are used in multiplex. One primer in each set was biotinylated to facilitate detection. Two tetraethylene glycol spacer groups were attached to the oligonucleotide according to the teachings of US Pat. No. 4,914,210.

【００３１】ＰＣＲプロトコールを、P. N. Schnipelsk
y 他，EPA 381,051 及び1991年３月21日に出願された
（現在は許可された）米国特許出願番号第 673,053号明
細書に記載のタイプのＰＣＲ分析要素のＰＣＲ反応ブリ
スター中で前記カクテル 250μＬを用いて実施した。よ
り詳細には、図７のパウチ１０Ｃを使用した。これらの
前記と同様の部分には、同様の参照数字を付与し、区別
するためにそれの末尾に「Ｃ」を付ける。従って、配置
又は以下本明細書に記載することを除いて、区画２６
Ｃ、３０Ｃ、３２Ｃ、３６Ｃ及び３４Ｃ；通路４４Ｃ、
４８Ｃ、５０Ｃ及び５２Ｃ；検出部位４０Ｃ並びに廃棄
物区画４２Ｃを前記のように使用した。１つは、ＰＣＲ
増幅を試験パウチ１０Ｃとは別個のパウチで行ったこと
であり、すべての反復試験、例えば、実施例１では３２
回における結果が矛盾しないように、増幅した物質をプ
ールし、次いで区画２６Ｃに注入した。PCR protocol was applied to PN Schnipelsk
y et al., 250 μL of the cocktail in a PCR reaction blister of a PCR analytical element of the type described in EPA 381,051 and US Patent Application No. 673,053 filed (now licensed) on Mar. 21, 1991. It carried out using. More specifically, the pouch 10C of FIG. 7 was used. These similar parts are provided with the same reference numerals and have a "C" at the end to distinguish them. Accordingly, the compartments 26 may be arranged or otherwise except as described herein below.
C, 30C, 32C, 36C and 34C; passage 44C,
48C, 50C and 52C; detection site 40C and waste compartment 42C were used as described above. One is PCR
The amplification was carried out in a pouch separate from the test pouch 10C, and in all replicates, eg 32 in Example 1.
The amplified material was pooled and then injected into compartment 26C so that the results in rounds were consistent.

【００３２】EPA 402,994 に記載のタイプのサーマルサ
イクリング処理装置を使用した。標的ＤＮＡを予め90℃
で10秒間加熱し、次いで96℃で30秒間変性し、そして70
℃まで60秒間かけて冷却してプライマーをアニールし、
そしてプライマー伸長生成物を生成した。後者の２つの
段階（96℃で加熱し、次いで70℃にする）は、計40サイ
クル繰り返した。このＰＣＲプロセスを64回反復し、そ
して新たに生成したＰＣＲ生成物を含有する流体を64個
のＰＣＲブリスターから共通の容器に写してＰＣＲ生成
物のプールを調製した。このプール由来の試料を前記Ｐ
ＣＲ緩衝剤で１：20に希釈して、以下本明細書に記載さ
れる試験に使用した。A thermal cycling processor of the type described in EPA 402,994 was used. Target DNA in advance at 90 ℃
Heat for 10 seconds at 90 ° C, then denature at 96 ° C for 30 seconds, and
Anneal the primer by cooling to ℃ for 60 seconds,
And a primer extension product was generated. The latter two steps (heating at 96 ° C and then 70 ° C) were repeated for a total of 40 cycles. This PCR process was repeated 64 times, and the fluid containing the newly generated PCR product was transferred from 64 PCR blisters into a common container to prepare a pool of PCR products. Samples from this pool are
It was diluted 1:20 with CR buffer and used in the tests described herein below.

【００３３】Ｂ．洗浄溶液の調製（ここで使用した）リン酸ナトリウム10ミリモル、塩化ナトリウム 150ミリ
モル及びエチエンジアミン四酢酸１ミリモルを含有する
リン酸緩衝溶液中にデシル硫酸ナトリウム１％を含み、
pH 7.4となるように洗浄溶液を調製した。 B. Preparation of Washing Solution 1% sodium decyl sulphate in a phosphate buffer solution containing 10 mmol sodium phosphate (as used herein) , 150 mmol sodium chloride and 1 mmol ethienediaminetetraacetic acid,
The wash solution was prepared to have a pH of 7.4.

【００３４】Ｃ．ストレプトアビジン／西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ）接合体溶液の調製 Zymed Labs (San Francisco, CA)より入手したストレプ
トアビジン及び西洋ワサビペルオキシダーゼの接合体
を、チメロサール防腐剤（0.01％）を含有するリン酸緩
衝溶液（pH 7.3）中にカゼイン（ 0.5％）を含む溶液で
１：8000に希釈した。 C. Streptavidin / horseradish
Preparation of oxidase (SA-HRP) conjugate solution A conjugate of streptavidin and horseradish peroxidase obtained from Zymed Labs (San Francisco, CA) was added to a phosphate buffer solution (pH: 0.01%) containing a thimerosal preservative. It was diluted 1: 8000 with a solution of casein (0.5%) in 7.3).

【００３５】Ｄ．ロイコ色素組成物の調製水 100mL中にポリビニルピロリドン25ｇを含む溶液を、
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１mL中に４，５−ビス
（４−ジメチルアミノフェニル）−２−（４−ヒドロキ
シ−３，５−ジメトキシフェニル）イミダゾールブルー
生成性ロイコ色素0.20ｇを含む溶液と混合し、そして１
時間攪拌した。次いでこれを、水1900mLに溶解したリン
酸一ナトリウム一水和物2.76ｇ、ジエチレントリアミン
五酢酸溶液（ 0.1Ｍ） 0.2mL及び４′−ヒドロキシアセ
トアニリド1.51ｇを混合し、そして50％水酸化ナトリウ
ム溶液でpH6.82に調整することにより調製した溶液に添
加した。次いで30％過酸化水素２mLを添加し、そして混
合物を攪拌して色素分散物を生成せしめた。最終的に、
得られた色素分散物 24.75mLを水性25μＭジメドン0.25
mL及びアガロース 0.125ｇと混合して 0.5％アガロース
を含有する色素生成性組成物を生成した。アガロースが
溶解するまで組成物全体を80℃で加熱攪拌し、次いで室
温まで冷却した。 D. Preparation of Leuco Dye Composition A solution containing 25 g of polyvinylpyrrolidone in 100 mL of water,
Mixed with a solution containing 0.20 g of 4,5-bis (4-dimethylaminophenyl) -2- (4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl) imidazole blue-forming leuco dye in 1 mL of N, N-dimethylformamide. , And 1
Stir for hours. It was then mixed with 2.76 g of monosodium phosphate monohydrate dissolved in 1900 mL of water, 0.2 mL of diethylenetriaminepentaacetic acid solution (0.1 M) and 1.51 g of 4'-hydroxyacetanilide and with 50% sodium hydroxide solution. It was added to the solution prepared by adjusting the pH to 6.82. Then 2 mL of 30% hydrogen peroxide was added and the mixture was stirred to form a pigment dispersion. Finally,
24.75 mL of the obtained dye dispersion was added to an aqueous 25 μM dimedone 0.25
Mixing with mL and 0.125 g agarose produced a chromogenic composition containing 0.5% agarose. The entire composition was heated with stirring at 80 ° C. until the agarose had dissolved, then cooled to room temperature.

【００３６】Ｅ．プローブ試薬の調製米国特許出願番号第 654,112号明細書（Ponticello他に
より1991年 2月12日出願）及びSutton他によるEPA 462,
644 に記載の方法を用いて、ポリ〔スチレン−コ−３−
（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロピオン酸〕（モル比9
7.6:2.4, 重量比95:5，平均直径１μｍ）水性ポリマー
粒子分散物を調製し、そして以下本明細書に記載される
オリゴヌクレオチドをポリマー粒子の一部分に共有結合
せしめ、そして別のオリゴヌクレオチドをポリマー粒子
の別の部分に共有結合せしめた。オリゴヌクレオチドを
２つのテトラエチレングリコールスペーサー、３−アミ
ノ−１，２−プロパンジオール部分及びチミン塩基を介
してポリマー粒子に連結させた。米国特許第 4,962,029
号明細書の方法により、各オリゴヌクレオチドを３−ア
ミノ−１，２−プロパンジオール部分のアミノ基を介し
てポリマー粒子に付着せしめて試薬を生成した。 E. Preparation of Probe Reagents US Patent Application No. 654,112 (filed February 12, 1991 by Ponticello et al.) And EPA 462, by Sutton et al.
Using the method described in 644, poly [styrene-co-3-
(P-Vinylbenzylthio) propionic acid] (molar ratio 9
7.6: 2.4, weight ratio 95: 5, average diameter 1 μm) An aqueous polymer particle dispersion was prepared and the oligonucleotides described herein were covalently attached to a portion of the polymer particles and another oligonucleotide was added. Covalently attached to another part of the polymer particles. The oligonucleotide was linked to the polymer particle via two tetraethylene glycol spacers, a 3-amino-1,2-propanediol moiety and a thymine base. U.S. Pat.No. 4,962,029
Each oligonucleotide was attached to the polymer particles via the amino group of the 3-amino-1,2-propanediol moiety to produce the reagent by the method of the specification.

【００３７】ポリマー／オリゴヌクレオチド粒子プロー
ブを、ポリ（メチルアクリレート−コ−ナトリウム２
−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホネート−
コ−２−アセトアセトキシエチルメタクリレート）（重
量比90:4:6）のラテックス接着剤と、粒子対接着ポリマ
ーの乾燥重量比約4/0.1 （接着剤 2.5％）で混合した。
水性分散物は固体含有量約４％であった。The polymer / oligonucleotide particle probe was applied to poly (methyl acrylate-co-sodium 2
-Acrylamido-2-methylpropane sulfonate-
A latex adhesive of co-2-acetoacetoxyethylmethacrylate) (90: 4: 6 weight ratio) was mixed at a dry weight ratio of particles to adhesive polymer of about 4 / 0.1 (2.5% adhesive).
The aqueous dispersion had a solids content of about 4%.

【００３８】これらの試薬製剤を用いて、ＨＵＴ／ＨＩ
Ｖについてのアッセイ用に捕捉プローブとして試薬を含
有する一連の分析デバイスを製造した。対照試薬オリゴ
ヌクレオチド配列は、ＨＩＶゲノム由来の配列であり、
そしてナンセンス配列として使用した。このナンセンス
プローブはいかなるＨＵＴ／ＨＩＶ分析物配列も捕捉す
べきではなく、従って、対照試薬では色素の出現が全く
起こらないはずである。別のプローブ試薬配列は、ＨＵ
Ｔ／ＨＩＶＤＮＡのＥＮＶ領域の配列に相補的であっ
た。Using these reagent formulations, HUT / HI
A series of analytical devices containing reagents as capture probes for the assay for V were manufactured. The control reagent oligonucleotide sequence is a sequence derived from the HIV genome,
And used as a nonsense sequence. The nonsense probe should not capture any HUT / HIV analyte sequence and therefore no dye appearance should occur with the control reagent. Another probe reagent sequence is HU
It was complementary to the sequence of the ENV region of T / HIV DNA.

【００３９】上記試薬を用いて、各々試薬区画（それら
の１つは、試料分析物を最初に入れるＰＣＲ反応ブリス
ターである）、検出区画及び廃棄物貯蔵室を有する一連
の分析要素（パウチ）を生成した。分析デバイス（もし
くは要素）は、ポリ（エチレンテレフタレート）／ポリ
エチレンラミネート（SCOTCHPAK(商標)241, 3M Co.）の
シートを成形ステーション（もしくは型）で加熱してシ
ートの一方の側にきちんと配列された窪み（ブリスタ
ー）を形成し、そしてシートのもう一方の側の末端の近
くに、主溝が最終的に導かれる大きな窪みを形成し、第
１ブリスターから最後までの主溝を形成し、そして後で
カバーシートに積層する際に、得られたパウチが、Schn
ipelsky 他による前記米国特許出願番号第 673,053号明
細書に記載のデバイスに類似の窪みから主溝へ導く狭い
溝を有するように、各ブリスターから主溝までの支流溝
を形成した。各々主溝の末端の１つを除いて、各窪みを
適当な試薬組成物で満たした。カバーシートを積層して
窪み及び溝の上にカバーを形成し、そしてシールして各
窪みの間に破裂性シールを作り（最後の１つを除く）、
そしてそこから主溝へ導く溝を作った。しかしながら、
最初にカバーシートをコロナ放電で全体的に処理した。
次いで上記プローブ試薬製剤（Invention & Control)
を、各スポットが以下本明細書に記載されるように製剤
0.9〜1.1 μＬを有するように、直ちに処理表面上に４
つおきにスポットした。支持体の反対側を約95℃のアイ
ロンで加熱しながら、配置した製剤を約30秒間室温の気
流中で乾燥した。Using the reagents described above, a series of analytical elements (pouches) each having a reagent compartment (one of which is a PCR reaction blister that initially contains the sample analyte), a detection compartment and a waste reservoir is used. Generated. The analytical device (or element) was properly aligned on one side of the sheet by heating a sheet of poly (ethylene terephthalate) / polyethylene laminate (SCOTCHPAK ™ 241, 3M Co.) at a forming station (or mold). Forming a dimple (blister), and near the end on the other side of the sheet, a large dimple into which the main groove is finally guided, forming a main groove from the first blister to the end, and When laminated on the cover sheet with
A tributary groove from each blister to the main groove was formed to have a narrow groove leading from the recess to the main groove similar to the device described in US Pat. No. 673,053 to ipelsky et al. Each well was filled with the appropriate reagent composition except for one of the ends of each major groove. Stacking the cover sheets to form a cover over the depressions and grooves, and sealing to create a rupturable seal between each depression (except for the last one),
And I made a groove from there to the main groove. However,
First the cover sheet was totally treated with corona discharge.
Next, the above probe reagent formulation (Invention & Control)
Each spot is formulated as described herein below.
Immediately 4 on the treated surface to have 0.9-1.1 μL
I spotted every other spot. The placed formulation was dried in a stream of air at room temperature for about 30 seconds while heating the other side of the support with an iron at about 95 ° C.

【００４０】実施例１：標識区画とシグナル発生性物質
区画の間にのみ存在せしめた洗浄区画図２の態様を具体的に説明するために、16個の反復試験
片を製造した。上記の如く製造した16個の反復試験片の
各々のシートのブリスターを、以下のような実施例の試
験における試薬で満たした。 Example 1: Labeling compartment and signal generating substance
Wash Sections Present Only Between Compartments 16 replicates were prepared to illustrate the embodiment of FIG. A blister of each sheet of 16 replicates prepared as described above was filled with the reagents in the tests of the Examples as follows.

【００４１】[0041]

【表１】 [Table 1]

【００４２】（従って、余分な洗浄物質を供給したが、
ブリスター２からブリスター５を分離することのみに有
効であり、ブリスター１からブリスター２を分離するこ
とには有効ではなかった。）EPA 381,501 に示されるも
のに類似する比較例として（「停止溶液」区画が省略さ
れている，正確に読み取るためとしては、その段階は明
らかに不必要である）別の一組の16個の反復試験パウチ
を、第１洗液並びにブリスター２及び３中のＳＡ−ＨＲ
Ｐ接合体の位置、そして各々の量を逆にしたこと、即
ち、 350μＬの洗浄溶液及び 235μＬのＳＡ−ＨＲＰ溶
液を使用したことを除いて実施例１と同様に製造した。(Thus, although an extra cleaning substance was supplied,
It was effective only in separating the blister 5 from the blister 2, but not in separating the blister 2 from the blister 1. ) As a comparative example similar to that shown in EPA 381,501 (where the "stop solution" compartment is omitted, the step is obviously unnecessary for accurate reading) another set of 16 Repeat test pouches with SA-HR in the first wash and blisters 2 and 3
It was prepared as in Example 1 except that the position of the P-conjugate and each amount was reversed, i.e. 350 μL wash solution and 235 μL SA-HRP solution were used.

【００４３】次いでカバーシートを積層し、そして３段
階でシールした。最初に、サンドウイッチを、試薬溶液
を含有するブリスターの周囲及び廃棄物ブリスターの周
囲のみ加圧して約 149℃で加熱することによりシールし
た。破裂性シールを包含する試料受容ＰＣＲブリスター
及び溝の成形は、約 163℃で適当な造形加熱ジョーの間
で試験パックを加熱することにより完成した。第３段階
は、試験パックの周囲のシールの形成であり、そして上
部取付板の温度 199℃で、一方下部取付板の温度は周囲
温度のままですべてのブリスター周囲シールを再シール
した。完成した試験パック（もしくは要素）中に成形さ
れた溝及びブリスターは、試薬ブリスターを含有する要
素の部分を横切ってローラーが通過すると、ブリスター
のシールが連続的に破裂し、そして各ブリスターから出
口の溝へ試薬が押し出され、それに沿って主溝へ進み、
捕捉プローブを含有する領域に導かれるように配置し
た。捕捉プローブスポット（被覆物）を含有するカバー
シートが、主溝に適当に整列したプローブ被覆物を有す
る完成した要素の底となるように、完成した要素を逆に
して、検出ステーションを形成した。４つのプローブス
ポットを、幾つかの試料で主溝の異なる部位に配置し
た。The cover sheets were then laminated and sealed in three steps. Initially, the sandwich was sealed by heating only around the blister containing the reagent solution and around the waste blister and heating at about 149 ° C. Molding of the sample receiving PCR blister and groove, including the rupturable seal, was accomplished by heating the test pack between suitable shaping heating jaws at about 163 ° C. The third step was the formation of a seal around the test pack, and the upper mount plate temperature was 199 ° C., while the lower mount plate temperature remained at ambient temperature to reseal all blister perimeter seals. Grooves and blisters molded into the finished test pack (or element) are such that as the roller passes across the portion of the element that contains the reagent blisters, the blister seal continuously ruptures and exits from each blister. The reagent is extruded into the groove, advances along it to the main groove,
It was positioned so that it led to the area containing the capture probe. The finished element was inverted to form the detection station so that the cover sheet containing the capture probe spot (coating) was the bottom of the finished element with the probe coating properly aligned in the main groove. Four probe spots were placed in different parts of the main groove in some samples.

【００４４】実施例１及び比較例の両方とも、主溝の末
端に配置した最終洗浄区画は別のものよりも大きいもの
であり、且つ吸収剤と合わせて洗浄液用の貯蔵室とし
た。実施例１及び比較例の完成パウチを用いて、以下の
試薬製剤を評価した。各試験デバイス中のブリスターを
前記ＰＣＲ生成物の20倍（×）希釈物（ 190〜210 μ
Ｌ）で満たして以下のように処理した。In both Example 1 and Comparative Example, the final wash compartment located at the end of the main groove was larger than another and was combined with an absorbent to provide a reservoir for the wash solution. The following reagent formulations were evaluated using the finished pouches of Example 1 and Comparative Example. The blister in each test device was diluted 20-fold (x) with the PCR product (190-210 μ).
L) and processed as follows.

【００４５】実施例１分析物を予め95℃で 120秒間加熱し、そしてそのブリス
ターをローラーにかけてシールを破裂させ、溶液を検出
ステーション（プローブ被覆物）に向けて前進させた。
分析物及びプローブ試薬を検出ステーションで42℃で５
分間ハイブリダイズせしめ、一方第２ブリスター中のＳ
Ａ−ＨＲＰ接合体を予め65℃に加熱した。接合体ブリス
ターをローラーにかけ、シールを破裂させ、そして溶液
を検出領域に向けて分析物と置き換わるようにした。５
分後、予め55℃に加熱した第１洗浄溶液を含有する第３
のブリスターを破裂させ、そして洗液を検出ステーショ
ンに向け、そしてそこに５分間維持し、一方第２洗浄溶
液を予め55℃に加熱した。次いで第２洗浄溶液を含有す
るブリスターを破裂せしめ、そして洗浄液を検出ステー
ションに向けた。最終的に、予め加熱することなく色素
シグナル発生性組成物を含有するブリスターをローラー
にかけ、そしてシールを破裂せしめ、そして組成物を検
出ステーションに向け、そこで５分間インキュベーショ
ンした後に以下本明細書に記載する色チャートを用いて
色スコアを読み取った。色スコアを第Ｉ表に記録し、そ
して図５にグラフで示す。 Example 1 The analyte was preheated to 95 ° C. for 120 seconds and the blister was rollered to break the seal and the solution was advanced towards the detection station (probe coating).
Analyte and probe reagents at detection station 5 at 42 ° C
Hybridize for minutes, while S in the second blister
The A-HRP conjugate was preheated to 65 ° C. The conjugate blister was rollered, the seal ruptured, and the solution directed towards the detection area to displace the analyte. 5
After 3 minutes, the third containing the first wash solution preheated to 55 ° C.
The blister was ruptured and the wash was directed to the detection station and held there for 5 minutes, while the second wash solution was preheated to 55 ° C. The blister containing the second wash solution was then ruptured and the wash solution was directed to the detection station. Finally, the blister containing the dye signal-generating composition without prior heating was rollered and the seal ruptured, and the composition was directed to a detection station where it was incubated for 5 minutes before being described herein below. The color score was read using a color chart. Color scores are recorded in Table I and graphically shown in FIG.

【００４６】比較例各要素中に分析物を含有するブリスターを予め約95℃で
120秒間加熱し、次いでそのブリスターをローラーにか
けてシールを破裂させ、４つのプローブ試薬の固定化被
覆物を含有する領域、即ち、接着剤で付着せしめた２つ
の対照プローブ及び２つのＨＵＴ／ＨＩＶプローブに向
けて溶液を前進させた。分析物及びプローブ試薬を検出
ステーションで42℃で５分間ハイブリダイズせしめ、一
方洗浄溶液を含有するブリスターを予め55℃に加熱し
た。次いで洗浄溶液ブリスターをローラーにかけ、シー
ルを破裂させ、そして洗浄溶液を検出領域に向けて主溝
を一掃して未結合分析物を検出領域から除去した。次い
で、予め加熱することなく、ストレプトアビジン／西洋
ワサビペルオキシダーゼ接合体ブリスターをローラーに
かけ、シールを破裂させ、そして溶液を検出領域に向
け、ここで５分間に亘ってそれを固定化ビオチニル化分
析物と結合せしめた。この期間中に、第２洗浄溶液を予
め55℃に加熱し、次いでローラーを用いてブリスターの
シールを破裂せしめ、そして洗浄液を検出ステーション
に向け、そこでそれを未結合標識と置き換えた。最終的
に、ローラーを用いて最終ブリスター中の色素シグナル
発生性組成物のシールを破裂せしめ、そして流体を検出
ステーションに向け、そこでそれを第２洗浄溶液と置き
換えた。５分間プローブ被覆物上で色素生成を行ってか
ら、色濃度スコアを読み取った。各プローブ被覆物の色
を、０が濃度なしであり且つ10が最高濃度である色チャ
ートを用いて湿潤色素濃度の比較により評価した。色ス
コアを第II表に記録し、そして図６のグラフに図示す
る。（第Ｉ表及び第II表の「ＬＴＲ」及び「ＥＶＮ」の
語は、それぞれ、対照ナンセンスプローブ被覆物及び分
析物中のＨＩＶゲノムのＥＶＮ領域に相補的なプローブ
被覆物を表す。これらは、検出区画中の各々４つのビー
ズ部位を表す。左から右へ、以下の液体が出会う最初の
ビーズは「ＬＴＲ」である。第２のビーズは「ＥＮＶ」
であり、第３のビーズは「ＬＴＲ」であり、そして最後
は右手側の縦欄中の「ＥＮＶ」である。） Comparative Example A blister containing the analyte in each element was pre-heated at about 95 ° C.
Heat for 120 seconds, then roll the blister to rupture the seal to the area containing the immobilized coating of the four probe reagents, ie two control and two HUT / HIV probes attached with an adhesive. The solution was advanced toward. The analyte and probe reagents were hybridized at the detection station for 5 minutes at 42 ° C, while the blister containing wash solution was preheated to 55 ° C. The wash solution blisters were then rollered, the seal ruptured, and the wash solution directed toward the detection area and the main groove swept to remove unbound analyte from the detection area. The streptavidin / horseradish peroxidase conjugate blister was then rollered without preheating, the seal was ruptured, and the solution was directed to the detection area where it was allowed to react with the immobilized biotinylated analyte for 5 minutes. I combined them. During this period, the second wash solution was preheated to 55 ° C., then a roller was used to rupture the seal of the blister and the wash solution was directed to the detection station where it was replaced with unbound label. Finally, a roller was used to rupture the seal of the dye-signaling composition in the final blister and the fluid was directed to the detection station where it was replaced with the second wash solution. Dye generation was performed on the probe coating for 5 minutes before reading the color density score. The color of each probe coating was evaluated by comparison of wet dye densities using a color chart where 0 is no density and 10 is maximum density. Color scores are recorded in Table II and graphically depicted in the graph of FIG. (The terms "LTR" and "EVN" in Tables I and II refer to the control nonsense probe coating and the probe coating complementary to the EVN region of the HIV genome in the analyte, respectively. Represents four bead sites in the detection compartment, from left to right, the first bead encountered by the following liquids is the "LTR", the second bead is "ENV".
And the third bead is "LTR" and the last is "ENV" in the right hand column. )

【００４７】[0047]

【表２】 [Table 2]

【００４８】[0048]

【表３】 [Table 3]

【００４９】容易に認められるように、特に図５及び図
６の比較から、検出部位へ増幅された核酸物質をハイブ
リダイズした後の、及び標識試薬を添加する前の洗浄段
階の排除は、結果に害を及ぼさない。実際に、良い結果
が生じた。定量的には、これもまた、16個の反復試験片
すべてについての実施例１の第２及び第４のビーズ「Ｅ
ＮＶ」を平均して比較例のものと比較することにより認
めることができる。実施例１については、平均が 6.0及
び5.69であり、それに対して比較例については平均が両
方の場合について5.44であった。As can be readily seen, especially from the comparison of FIGS. 5 and 6, the elimination of the washing step after hybridizing the amplified nucleic acid material to the detection site and before adding the labeling reagent resulted in Does not harm In fact, good results have occurred. Quantitatively, this is also the second and fourth beads "E" of Example 1 for all 16 replicates.
It can be recognized by averaging “NV” and comparing with that of the comparative example. For Example 1, the averages were 6.0 and 5.69, whereas for Comparative Examples the average was 5.44 for both cases.

【００５０】上記結果は、特定のアッセイに限られる訳
ではない−またそれらは、例えば、ＣＭＶ（サイトメガ
ロウイルス）についてアッセイするときにも起こる。ど
のようなアッセイが１つ又は両方の洗浄段階を排除でき
ることを示すために使用されるかということは重要では
ないと信じられているので、オリゴヌクレオチド配列は
特に同定していない。The above results are not limited to a particular assay-they also occur when assaying for CMV (cytomegalovirus), for example. The oligonucleotide sequence is not specifically identified, as it is believed that it is not important what assay is used to show that one or both wash steps can be eliminated.

【００５１】図１に示したパウチを製造して、実施例１
のものと比較可能な結果が、第２洗浄区画を省略する場
合にも得られることを示している。即ち、そのようなパ
ウチでは、洗浄区画及び洗浄段階は、標識区画及び段階
（ＳＡ−ＨＲＰを用いる）とシグナル発生性物質区画及
び段階（ロイコ色素及びH₂O₂を用いる）との間にのみ存
在する。Example 1 was prepared by producing the pouch shown in FIG.
It is shown that comparable results to those obtained are also obtained when the second wash compartment is omitted. That is, in such a pouch, the wash compartment and wash step are only between the label compartment and step (using SA-HRP) and the signal-generating substance compartment and step (using leuco dye and H ₂ O ₂ ). Exists.

【００５２】同様に、そのような、唯一の洗浄区画を有
するがそれが核酸物質を増幅するために使用される反応
区画と標識区画との間に配置されている４−区画パウチ
が、各反応区画（ハイブリダイゼーション段階）及び標
識区画（標識段階）の後に洗浄区画（及び段階）を有す
る従来の構造と比較可能である結果を生じることが認め
られている。Similarly, such a 4-compartment pouch having only one wash compartment, but located between the reaction compartment and the labeling compartment in which it is used to amplify nucleic acid material, is used for each reaction. It has been found to produce results that are comparable to conventional constructions having a compartment (hybridization step) and a labeling compartment (labeling step) followed by a wash compartment (and step).

【００５３】実施例２：実施例１のパウチと洗浄溶液を
全く含有しないパウチとの比較以下のことを除いて実施例１の方法により二組のＰＣＲ
分析パウチを製造した。１．第３プローブ組成物を、ＨＵＴ／ＨＩＶＤＮＡの
ＧＡＧ領域由来の配列に相補的な配列を含めて実施例１
の方法により調製した。 Example 2: The pouch and cleaning solution of Example 1 were added.
Comparison with pouches that do not contain at all Two sets of PCR by the method of Example 1 with the following exceptions
An analytical pouch was manufactured. 1. The third probe composition was included in Example 1 including a sequence complementary to the sequence from the GAG region of HUT / HIV DNA.
It was prepared by the method of.

【００５４】２．各々３つのプローブの唯一のスポット
（被覆物）を、（１）上記ＧＡＧ領域由来の新規プロー
ブ、（２）実施例１の対照プローブ、そして（３）実施
例１の試薬プローブ、の順序で各要素に取り入れた。３．一組のパウチが、実施例１の逆洗浄フォーマットの
５−ブリスターパウチであり（第２ブリスター中にＳＡ
−ＨＲＰ接合体があり、且つ第３ブリスター中に洗浄液
がある）、そしてその組のパウチを実施例１に記載のよ
うに処理した。2. A unique spot (coating) for each of the three probes was provided in the order of (1) the novel probe derived from the GAG region, (2) the control probe of Example 1, and (3) the reagent probe of Example 1. Incorporated into the element. 3. One set of pouches was the backwash format 5-blister pouch of Example 1 (SA in the second blister).
-HRP conjugate and wash solution in the third blister), and the set of pouches was treated as described in Example 1.

【００５５】４．第２組のパウチは、図３に示されるよ
うに、３つの試薬区画のみを使用し、全く洗浄区画を使
用しなかった。それらは、プール由来の分析物組成物を
包含する同様の組成物、及び実施例１の第１組（従来の
洗浄フォーマットの組）の要素中の対応する組成物と同
じ量を含み、そしてブリスターは以下の順序であった。4. The second set of pouches used only three reagent compartments and no wash compartments, as shown in FIG. They included similar compositions, including pool-derived analyte compositions, and the same amounts as the corresponding compositions in the elements of Example 1, first set (conventional wash format set), and blister. Was in the following order:

【００５６】[0056]

【表４】残りのブリスターもしくは区画は空のままであった。[Table 4] The remaining blisters or compartments remained empty.

【００５７】第２組のパウチを以下のように処理した。
ＰＣＲブリスター中の分析物を予め95℃で 120秒間加熱
し、そしてそのブリスターをローラーにかけてシールを
破裂させ、分析物を検出ステーション中の３つのプロー
ブ被覆物に向けて前進させた。42℃で５分間ハイブリダ
イゼーションを行い、一方第２ブリスター中のＳＡ−Ｈ
ＲＰ溶液を予め65℃に加熱した。次いで第２ブリスター
をローラーにかけてシールを破裂させ、そして溝を介し
て溶液を検出ステーションに向けた。接合体を５分間検
出ステーションでインキュベーションし、次いで、予め
加熱することなく、色素生成性検出分散物を含有するブ
リスターをローラーにかけ、シールを破裂させ、そして
分散物を検出ステーションに向けてＳＡ−ＨＲＰと置き
換えた。検出ステーション中の色素分散物を５分間イン
キュベーションした後、実施例１のように色チャートを
用いて色スコアを読み取った。両組の要素の色スコアを
第IIＡ表及び第IIＢ表に記録し、そして図７及び図８に
それぞれグラフで示す。The second set of pouches was processed as follows.
The analyte in the PCR blister was preheated to 95 ° C for 120 seconds and the blister was rollered to break the seal and advance the analyte towards the three probe coatings in the detection station. Hybridization was carried out at 42 ° C for 5 minutes, while SA-H in the second blister
The RP solution was preheated to 65 ° C. A second blister was then placed on the roller to rupture the seal and the solution was directed through the groove to the detection station. The conjugate was incubated at the detection station for 5 minutes, then the blister containing the chromogenic detection dispersion was rollered, the seal was ruptured, and the dispersion was directed to the detection station SA-HRP without prior heating. Replaced with. After incubating the dye dispersion in the detection station for 5 minutes, the color score was read using the color chart as in Example 1. The color scores for both sets of elements are recorded in Tables IIA and IIB and are graphed in Figures 7 and 8 respectively.

【００５８】データは、３−ブリスターパウチ配置が５
−ブリスター（実施例１の洗浄パウチフォーマット）の
ものと比較可能な陽性シグナルを与えるが、しかしなが
ら、ナンセンス（対照）ビーズでわずかに高いシグナル
を与えることを示す。これは、大量の色素生成性検出分
散物を用いることにより３−ブリスター配置で低減又は
排除できる。３−ブリスター配置は少量の試薬の使用、
より低い単位製造経費、狭いパウチ保存スペース、短い
処理時間、並びにより小さくあまり複雑ではない処理装
置を許容する。The data shows that the 3-blister pouch arrangement is 5
-Provides a positive signal comparable to that of the blister (wash pouch format of Example 1), however, gives a slightly higher signal with the nonsense (control) beads. This can be reduced or eliminated in the 3-blister configuration by using large amounts of the chromogenic detection dispersion. 3-Blister configuration uses a small amount of reagents,
Allows lower unit manufacturing costs, narrow pouch storage space, short processing times, as well as smaller and less complex processing equipment.

【００５９】[0059]

【表５】 [Table 5]

【００６０】[0060]

【発明の効果】以前は所望の結果を得るために必要であ
ると考えられていた少なくとも１つの洗浄段階を回避す
る、核酸物質を増幅及び検出するための方法及びデバイ
スを提供することが、本発明の優れた技術効果である。It is an object of the present invention to provide a method and device for amplifying and detecting nucleic acid material which avoids at least one washing step previously thought to be necessary to obtain the desired result. This is an excellent technical effect of the invention.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】図１は、本発明に従って構成された反応デバイ
スの平面図である。FIG. 1 is a plan view of a reaction device constructed in accordance with the present invention.

【図２】図２は、図１のものと同様の平面図であるが、
本発明の別の様式を示すものである。2 is a plan view similar to that of FIG. 1, but FIG.
3 illustrates another mode of the present invention.

【図３】図３は、図１のものと同様の平面図であるが、
本発明の別の様式を示すものである。FIG. 3 is a plan view similar to that of FIG.
3 illustrates another mode of the present invention.

【図４】図４は、本発明について仮定されたメカニズム
を具体的に説明する部分断面図である。FIG. 4 is a partial cross-sectional view specifically explaining the mechanism assumed for the present invention.

【図５】図５は、本発明の実施中に達成された反復色ス
コアを示すグラフである。FIG. 5 is a graph showing repetitive color scores achieved during the practice of the present invention.

【図６】図６は、比較例の実施中に達成された反復色ス
コアを示すグラフである。FIG. 6 is a graph showing repetitive color scores achieved during the performance of the comparative example.

【図７】図７は、本発明の実施中に達成された反復色ス
コアを示すグラフである。FIG. 7 is a graph showing repetitive color scores achieved during the practice of the present invention.

【図８】図８は、本発明の実施中に達成された反復色ス
コアを示すグラフである。FIG. 8 is a graph showing repetitive color scores achieved during the practice of the present invention.

【図９】図９は、図２のものと同様の平面図であるが、
実施例に使用した変形パウチを示すものである。9 is a plan view similar to that of FIG. 2, but FIG.
It shows a modified pouch used in the examples.

【符号の説明】[Explanation of symbols]

１０…デバイス２１…通路２２…入口２５…シール２６…ＰＣＲ反応区画３０…区画３２…区画３４…区画３６…区画４０…検出室４１…検出部位４２…廃棄物収集区画４４…通路４８…通路５０…通路５２…通路５６…シール６０…ローラー７０…コーナー７２…折り曲げ線７４…孔１００…スラッグ１０２…メニスカス１０４…矢印１１０…読み取り領域又は検出領域 10 ... Device 21 ... Passage 22 ... Inlet 25 ... Seal 26 ... PCR reaction section 30 ... Section 32 ... Section 34 ... Section 36 ... Section 40 ... Detection chamber 41 ... Detection site 42 ... Waste collection section 44 ... Path 48 ... Path 50 ... passage 52 ... passage 56 ... seal 60 ... roller 70 ... corner 72 ... bending line 74 ... hole 100 ... slug 102 ... meniscus 104 ... arrow 110 ... reading area or detection area

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ジョンブルースフィンドレイアメリカ合衆国，ニューヨーク 14612, ロチェスター，クロスローズレーン 148 (72)発明者スーザンメリッサアトウッドアメリカ合衆国，ニューヨーク 14543, ラッシュ，ホネオイフォールズシックスロード 365 (72)発明者リンバーグメイヤーアメリカ合衆国，ニューヨーク 14616, ローチェスター，ロングリッジアベニュ 187 (72)発明者ジョンベンジャミンチメリアメリカ合衆国，ニューヨーク 14580, ウェブスター，ジョイレーンドライブ 922 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued Front Page (72) Inventor John Bruce Findlay USA, New York 14612, Rochester, Crossroads Lane 148 (72) Inventor Susan Melissa Atwood USA, New York 14543, Rush, Honeoy Falls Sixth Road 365 (72) Inventor Lynberg Mayer, New York, USA 14616, Rochester, Longridge Avenue 187 (72) Inventor John Benjamin Chimeri, USA, New York 14580, Webster, Joy Lane Drive 922

Claims

【特許請求の範囲】[Claims]

【請求項１】少なくとも１つの固定化プローブを含む
検出部位に増幅された核酸物質をハイブリダイズせし
め、シグナル発生性物質であるか又はそれを活性化して
シグナルを生成する標識を該部位に持ってくることによ
りハイブリダイズして固定化せしめた核酸物質を標識
し、その後にシグナル発生性物質を該部位に添加して検
出可能なシグナルを生成することにより増幅された核酸
物質を検出する方法であって、標識段階が、ハイブリダイゼーション段階の後に、間に
洗浄段階を必要とすることなく直接用いられるか、又は
添加段階が、標識段階の後に、間に洗浄段階を必要とす
ることなく直接用いられる方法。1. A detection site containing at least one immobilized probe is hybridized with an amplified nucleic acid substance, and a signal-generating substance or a label which activates it to generate a signal is provided at the site. A method of detecting an amplified nucleic acid substance by labeling a nucleic acid substance hybridized and immobilized by adding a signal-generating substance to the site and then generating a detectable signal. Thus, the labeling step is used directly after the hybridization step without the need for an intervening wash step, or the addition step is used directly after the labeling step without any intervening wash step. Method.

【請求項２】増幅された核酸物質を検出するための検
出部位並びに標識及び共同して検出可能なシグナルを発
生するのに有効であるシグナル発生性物質を含有する保
存区画を含む複数の区画、並びに区画と部位を流動的に
連絡するための通路を含んでなり、更に、実質的に捕捉体、標識及びシグナル発生性試薬を
含まない洗浄液を含有する１つ以下の洗浄区画、及び保
存もしくは反応区画に使用されるシグナル発生性試薬、
並びに洗浄区画と検出部位を連絡する１つ以下の通路を
含み、そして、１つ以下の洗浄段階が、区画の内容物を空にし
て検出部位へ移動せしめることを含む一連の段階に使用
される、鋳型として少なくとも１つの標的鎖を用いて核酸物質を
増幅及び検出するためのデバイス。2. A plurality of compartments, including a detection site for detecting amplified nucleic acid material and a storage compartment containing a label and a signal-generating material that is effective to co-produce a detectable signal, And a passage for fluidly communicating the compartment with the site, and further comprising one or more wash compartments containing a wash solution substantially free of capture agent, label and signal generating reagent, and storage or reaction. Signal-generating reagents used in the compartment,
And one or less passages connecting the wash compartment to the detection site, and one or less wash steps are used in a series of steps including emptying the contents of the compartment to the detection site. A device for amplifying and detecting a nucleic acid substance using at least one target strand as a template.