JPH06197756A - 新規糖転移酵素及びそれをコードする遺伝子並びに該酵素の製造方法 - Google Patents
新規糖転移酵素及びそれをコードする遺伝子並びに該酵素の製造方法Info
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- JPH06197756A JPH06197756A JP5237118A JP23711893A JPH06197756A JP H06197756 A JPH06197756 A JP H06197756A JP 5237118 A JP5237118 A JP 5237118A JP 23711893 A JP23711893 A JP 23711893A JP H06197756 A JPH06197756 A JP H06197756A
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Abstract
グルコサミニルトランスフェラーゼを提供する。 【構成】 以下の酵素学的性質:作用;UDP−N−ア
セチルグルコサミンからN−アセチルグルコサミンをα
−6−D−マンノシドに転移する;分子量;約73,0
00(還元剤非存在下SDS−PAGEによる)並びに
約73,000及び約60,000(還元剤存在下SD
S−PAGEによる);を有するβ1, 6−N−アセチ
ルグルコサミニルトランスフェラーゼ。
Description
グルコサミンからN−アセチルグルコサミンを α−6
−D−マンノシドに転移する酵素(UDP−N−アセチ
ルグルコサミン:α−6−D−マンノシド, β1, 6−
N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、以下
GnT−Vと略称する)、それをコードする遺伝子系、
及びGnT−Vの製造方法に関する。
ギン型糖鎖(Asn型糖鎖)は、その構成糖および分岐
の型から高マンノース型、複合型および混合型の3タイ
プに分類される。これらAsn型糖鎖の生合成は、先
ず、粗面小胞体の内腔側で脂質中間体からその糖鎖部分
が、翻訳中のポリペプチド鎖のアスパラギンにひとまと
めに転移されることから始まる。
マンノースが除去されるが、一部の粗面小胞体局在性の
Asn 型糖鎖をもつ糖タンパク質はこのままとどまるた
め、高マンノース型糖鎖のままとなる。その他のオルガ
ネラ糖タンパク質、細胞表層糖タンパク質あるいは分泌
糖タンパク質は、ベシクル輸送によりゴルジ体に移り、
さらにマンノースが除去される。このゴルジ体では、ゴ
ルジ体酵素であるN−アセチルグルコサミニルトランス
フェラーゼ群の作用のよりN−アセチルグルコサミンが
導入され、分枝構造をとるようになる。この分枝構造の
形成により、高マンノース型糖鎖から混成型糖鎖および
複合型糖鎖への変換が始まり、フコースの導入、また、
トランスゴルジ領域でのガラクトースの導入を経て、最
後に、シアル酸が導入されてAsn型糖鎖の生合成が完
成する。
のステップで、種々の酵素が触媒として働いていること
がわかっている。そのうち、Asn型糖鎖の種々の分枝
構造の形成における、N−アセチルグルコサミンの転移
導入反応を触媒している酵素として、6種のN−アセチ
ルグルコサミニルトランスフェラーゼが知られている。
Schachterら(Brockhausen,
I.,Caarver,J.,and Schacht
er,H.,Biochem.Cell Biol.,
66,1134(1988))は、Manα1−3(M
anα1−6)Manβ1−4GlcNAcβ1−4G
lcNAcのトリマンノシル構造のコア構造に、N−ア
セチルグルコサミンを転移するこの6種の酵素をGnT
−IないしGnT−VIと命名した。
ranch構造(−[GlcNAc−β(1,6)Ma
n−α(1,6)Man]−)の形成に関わる酵素であ
る。β(1,6)branch構造は、細胞の形質転換
株や腫瘍形成性細胞に、顕著に増加している事が知られ
ている(Pierce,M.,Arango,J.,T
ahir,S.H.,and Hindsgaul,
O.,Biochem.Biophys.Res.Co
mmun.,146,679−684(1987)およ
びArango,J.,and Piercce,
M.,J.Cell.Biochem.,257,13
421−13427(1982))。
(1,6)branchの出現との間に関連があること
が示されている(Hiraizumi,S.,Taka
saki,S.,Shiroki,K.,Kochib
e,N.,and Kobata,A.,Arch.B
iochem.Biophys.280,9−19,
(1990))。ヒトでも、乳癌の生検例において、5
0%の例でβ(1,6)branchの発現が亢進して
いると報告されている(Dennis,J.W.,an
d Laferte,S.Cancer Res.4
9,945−950,(1989))。
ch構造の出現は、GnT−V活性の上昇をともなって
いることがわかっている。このように、GnT−Vは、
糖鎖生合成経路においてβ(1,6)branch構造
の形成を触媒する点で重要であるばかりでなく、癌細胞
の易転移能および悪性度と関連するという点において
も、重要な鍵となる酵素である。
ランスフェラーゼのうちGnT−Iについては、ヒトお
よびウサギのcDNA 構造が明かとなった(Kuma
r,R.,Yang,J.,Larsen,R.D.,
and Stanley,P.Proc.Natl.A
cad.Sci.U.S.A.87,9948−995
2,(1990)およびSarkar,M.,Hul
l,E.,Nishikawa,Y.,Simpso
n,R.J.,Moritz,R.L.,Dunn,
R.,and Schachter,H.,Proc.
Natl.Acad.Sci.U.S.A.88,23
4−238,(1991))。
らその存在が推定されており、生体内の各組織から精製
することが試みられているが、本酵素を可溶化する際、
極度に不安定な性質のために精製することが極めて困難
であった(Nishikawa,A.,Gu,J.,F
ujii,S.,およびTaniguchi,N.Bi
ochim.Biophys.Acta1035巻,3
13−318,(1990))。しかし最近、ラット腎
よりGnT−Vが単離、精製された例が報告されている
(Shoreibah,M.,G.,Hindgau
l,O.,andPierce,M.,J.Biol.
Chem.267,2920−2927,(199
2))。
からは、当該酵素の遺伝子に関する詳細な情報は得られ
ていない。さらに、ヒトGnT−Vについては、その酵
素学的性質を含め、何らの情報も得られていない。Gn
T−Vは、癌化した細胞の悪性度のマーカーとして診断
上非常に有用であるばかりでなく、本酵素を用いて本酵
素の特異的阻害剤のスクリーニング系を確立することに
より癌転移防止剤を設計することが初めて可能となるの
で、ヒト由来のGnT−Vの単離、精製及び遺伝子を含
むその構造解析や大量生産の方法が望まれている。
鑑みてなされたものであり、その目的はヒト由来のGn
T−Vを提供するものである。さらに、本発明は当該酵
素に係る遺伝子を単離し、当該遺伝子を用いて当該酵素
を大量に生産する方法を開発するとともに、遺伝子操作
による有用物質生産における糖鎖の均一生産をも可能に
することを目的とするものである。
精製するための出発材料として、癌細胞の培養上清に着
目した。しかしながら、本発明者らは、ウシ血清等を添
加しなければ増殖できないような癌細胞の培養上清で
は、精製が困難であると考えた。そこで、各種癌細胞を
無タンパク質培地に馴化するべく鋭意検討を重ね、数十
種の無タンパク質培地に馴化した癌細胞を樹立すること
に成功した。そのうち、ヒト肺癌(小細胞癌)由来のQ
G細胞の無タンパク質培地の培養上清中に本酵素活性を
認め、本酵素を精製することに成功した。
−アセチルグルコサミンをα−6−D−マンノシドに転
移する; (2)基質特異性;GnGn−bi−PAを受容体とし
た時を100とした場合、GnGnF−bi−PAで約
78%、GnGnGn−tri−PAで約125%、G
nM−PAで約66%の反応性を示す; (3)至適pH;6.2−6.3; (4)阻害、活性化及び安定化;活性の発現にMn2+を
必要とせず、また、20mMEDTA存在下においても活
性は阻害されない;
存在下SDS−PAGEによる)並びに約73,000
及び約60,000(還元剤存在下SDS−PAGEに
よる); (6)Km値;受容体GnGn−bi−PA及び供与体
UDP−GlcNAcに対するKm値は、各々133μ
M、3.5mMである;並びに (7)以下のペプチドフラグメントを有する: (1)Thr-Pro-Trp-Gly-Lys (2)Asn-Ile-Pro-Ser-Tyr-Val (3)Val-Leu-Asp-Ser-Phe-Gly-Thr-Glu-Pro-Glu-Phe-
Asn-His-Ala-Asn-Tyr-Ala (4)Asp-Leu-Gln-Phe-Leu-Leu 、 (5)Asn-Thr-Asp-Phe-Phe-Ile-Gly を有するβ1, 6−N−アセチルグルコサミニルトラン
スフェラーゼを提供する。
ミニルトランスフェラーゼは、例えば少なくとも配列番
号:8に示すアミノ酸配列を含んで成るアミノ酸配列、
又は該アミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸が修
飾されているアミノ酸配列を有する。ここでアミノ酸の
修飾とは、アミノ酸が付加、除去及び/又は置換されて
いることを意味する。本発明はさらにヒト肺癌由来のQ
G細胞又はヒト大腸癌細胞CL0201細胞を培養し、
該培養物から該酵素を採取することを特徴とする前記酵
素の製造方法を提供する。
チルグルコサミニルトランスフェラーゼ酵素の製造方法
において、該酵素をコードするDNAを含んで成る発現
ベクターにより形質転換された宿主を培養又は飼育し、
該宿主から前記酵素を採取することを特徴とする方法を
提供する。本発明はさらに、前記酵素をコードする遺伝
子系、すなわちDNA、発現ベクター、及び形質転換さ
れた宿主に関する。
は、動物細胞の培養に常用されている任意の方法により
培養することができる。また、タンパク質を全く含まな
い培地を用いて静置培養することも可能である。具体的
な一例を実施例1に記載する。なお、当該ヒト肺癌(小
細胞癌)由来のQG細胞は、Human lung c
arcinoma SBM331と命名され、1992
年8月18日付けで工業技術院微生物工業技術研究所に
受託番号微工研条寄第3967号(FERM BP−3
967)としてブダペスト条約に基づき国際寄託されて
いる。
元素あるいは、蛍光物質により標識した後、当該酵素を
反応させ、反応生成物をHPLCで分離することにより
容易に測定することができる。具体的には、谷口等の既
報の方法(Tanigichi,N.,Nishika
wa,A.,Fujii,S.,and Gu,J.,
Methods Enzymol.179,397−4
08(1989);Nishikawa,A.,Gu,
J.,Fujii,S.,and Tanigich
i,N.Biochim.Biophys.Acta
1035,313−318(1990))に従うことが
できる。
dine(GnGn−biPA)を受容体、UDP−G
lcNAc(Sigma)を供与体として、GnT−V
の酵素活性を測定することができる。活性強度は転移さ
れたN−アセチルグルコサミン/時間/mgタンパク質
で表わされる。なお、タンパク質量は既報(Redin
baugh,M,G.,and Turley,R.
B.Anal.Biochem.153,267−27
1(1986))に従い、BCAキット(Pierce
Chemical Company,Rockfor
d,IL)にてウシアルブミンを標準として測定するこ
とができる。
ンパク質の精製に常用されている複数の方法を組み合わ
せることにより行なうことができる。また、本酵素の有
用な精製方法として、受容体および供与体に対する親和
性を利用することが可能である。本発明においては、無
タンパク質培養上清を、先ず限外濾過法により濃縮し、
次に、Phenyl−Sepharoseを用いる疎水
性クロマトグラフィーにより活性画分を得る。
よる吸着後、活性画分を溶出させ、受容体カラムクロマ
トグラフィー(UDP−hexanolamine−A
garose)および供与体カラムクロマトグラフィー
(GnGn−Asn−Sepharose)の2つのア
フィニティクロマトグラフィーを行い、還元剤非存在下
ドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミド電気泳動
を行うことにより単一バンドを示すポリペプチドが得ら
れる。これらの単離精製操作の具体例を実施例2に記載
する。
はヒト肺癌(小細胞癌)由来QG細胞の無タンパク質培
養上清の濃縮液から4段階の精製操作により約20,0
00倍濃縮純化してGnT−Vを単離、精製することに
成功し、さらに当該酵素の部分アミノ酸配列をも明らか
にした。本発明に係る酵素は常用のタンパク質の単離、
精製方法を特定の組み合わせにより選択し、それを特定
の条件下で行うことにより初めて得られたものである。
物質的、構造的性質が解明されれば、それらの性質を指
標として、常用のタンパク質の分離、精製方法を任意に
組み合わせて、本明細書に記載するものとは異なる種々
の方法により純化することができる。また、本発明によ
り開示された酵素の部分アミノ酸配列に基づいて適当な
合成プローブを作製し、鳥類、両生類、哺乳類等、由来
の染色体ライブラリーやcDNAライブラリーから常法
により遺伝子を単離し、さらに単離された遺伝子を組換
えDNA技術により大量に製造することは所謂当業者に
とって容易になしえるものである。
性質を有する。 1.作用;UDP−N−アセチルグルコサミンからN−
アセチルグルコサミンをα−6−D−マンノシドに転移
する。 2.基質特異性;GnGn−bi−PAを受容体とした
時を100とすると、GnGnF−bi−PAで約78
%、GnGnGn−tri−PAで約125%、GnM
−PAで約66%の反応性を示す。 3.至適pH;6.2−6.3 4.阻害、活性化及び安定化;活性の発現にMn2+を必要
としない。また、20mM EDTA 存在下においても活性は
阻害されない。
リアクリルアミド(SDS)電気泳動分析の結果、非還
元条件下において分子量が約73,000の単一バンド
を示し、還元条件下では、前述のバンドに加えて約6
0,000の分子量の小さいバンドが認められる。ま
た、単離、精製した該酵素を、ネイティブポリアクリル
アミド電気泳動した後、ゲルより当該バンドを切り出し
て本酵素活性を測定した場合、該当するバンドの濃さに
応じて該酵素活性が認められる。以上のことから単離、
精製されたタンパク質が目的とするGnT−Vであるこ
とが確認された。具体例を実施例3に記載する。
ミド電気泳動における二つのバンドの各々をSDSポリ
アクリルアミド電気泳動ゲルより切り出し、トリプシン
消化後、逆相高速液体クロマトグラフィーによるペプチ
ドマッピングを試みたところ、60kDaおよび73k
Daの溶出パターンについては同様のパターンが得られ
た。この結果より両タンパク質は一部酵素的切断を受け
ている可能性があるものの、同一タンパク質由来と結論
づけられた。具体例を実施例4に記載する。
と供与体UDP−GlcNAcに対するKm値は、各々
133μM、3.5mMである。 7.ペプチドフラグメント;トリプシン消化ポリペプチ
ド断片を用いてアミノ酸配列を同定したところ、以下に
示す部分アミノ酸配列が得られた。 (1)Thr-Pro-Trp-Gly-Lys (2)Asn-Ile-Pro-Ser-Tyr-Val (3)Val-Leu-Asp-Ser-Phe-Gly-Thr-Glu-Pro-Glu-Phe-
Asn-His-Ala-Asn-Tyr-Ala (4)Asp-Leu-Gln-Phe-Leu-Leu (5)Asn-Thr-Asp-Phe-Phe-Ile-Gly
いて予想されるオリゴヌクレオチドを作製し、当該オリ
ゴヌクレオチドをプローブとして染色体ライブラリーや
cDNAライブラリーを常法によりスクリーニングする
ことにより、本発明に係るGnT−Vをコードする遺伝
子を得ることができる。
A、化学合成DNAのいずれであってもよい。cDNA
は、例えば、前記のようにしてヒト細胞、例えばヒト肺
癌由来のQG細胞から精製したGnT−Vの、実施例5
に示すような部分アミノ酸配列に基いて設計したDNA
(ヌクレオチド)プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖
反応法(PCR)によりクローニングすることができ
る。クローニングの具体的な1例を実施例8に示す。
を有する蛋白をコードし、配列番号:8のヌクレオチド
配列とハイブリダイズするDNAも含まれる。実施例8
においてクローニングされた、本発明のGnT−Vをコ
ードするDNAのヌクレオチド配列及び該ヌクレオチド
配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号:8に示
す。
ば、この天然アミノ酸配列に1〜複数のアミノ酸が付加
されておりなおGnT−V活性を維持しているポリペプ
チド、前記天然アミノ酸配列から1〜複数個のアミノ酸
が除去されておりなおGnT−V活性を維持しているポ
リペプチド、前記天然アミノ酸配列中の1〜複数個のア
ミノ酸が他のアミノ酸により置き換えられておりなおG
nT−V活性を維持しているポリペプチド、さらには、
上記のアミノ酸付加修飾、アミノ酸除去修飾及びアミノ
酸置換修飾が組合わされた修飾を有しなおGnT−V活
性を維持しているポリペプチドなど、種々の修飾型Gn
T−Vを設計し、それを製造することができる。
飾におけるアミノ酸の数は、特に限定されないが、付加
については、例えば、本発明のGnT−Vとのハイブリ
ッド蛋白に用いられる機能性蛋白のアミノ酸の数(例え
ば、マルト−スバインディングプロテイン(malto
se−binding protein)等の公知の抽
出精製もしくは安定化用蛋白または各種生理活性蛋白、
例えばIL−3,IL−11のようなサイトカイン)や
本因子に付加されたシグナルペプチドのそれに依存し、
すなわち、当該修飾の目的に依存して決定される。例え
ば、1〜30、好ましくは、1〜10の付加があげられ
る。
酸の数は、GnT−V活性が維持されるように設計、決
定され、例えば、1〜30、好ましくは1〜20、ま
た、本因子の活性領域以外の領域のアミノ酸の数があげ
られる。さらに、置換については、置換されるアミノ酸
の数は、GnT−Vが維持されるように設計、決定さ
れ、例えば、1〜10、好ましくは、1〜5があげられ
る。
る遺伝子のヌクレオチド配列として配列番号:8に示す
ヌクレオチド配列を開示するが、本発明のGnT−Vの
遺伝子はこれに限定されない。一旦、天然GnT−Vの
アミノ酸配列が決定され、又は修飾型GnT−Vのアミ
ノ酸配列が設計されれば、コドンの縮重に基き、同じア
ミノ酸配列をコードする種々のヌクレオチド配列を設計
し、それを調製することができる。この場合、使用すべ
き宿主により高頻度で用いられるコドンを使用するのが
好ましい。
子を得るには、実施例8に記載する様にしてcDNAを
得ることができるが、これに限定されない。すなわち、
天然GnT−Vのアミノ酸配列をコードする1つのヌク
レオチド配列が決定されれば天然GnT−Vをコードす
る遺伝子は、本発明に具体的に開示するストラテジーと
は異なるストラテジーによりcDNAとしてクローニン
グすることができ、さらにはそれを生産する細胞のゲノ
ムからクローニングすることもできる。
8において使用した種々のプライマーヌクレオチド又は
プローブヌクレオチドを、ゲノムDNA断片の選択のた
めプローブとして使用することができる。また、配列番
号:8に記載するヌクレオチド配列に基いて設計された
他のプローブを用いることもできる。ゲノムから目的と
するDNAをクローニングするための一般的方法は当業
界においてよく知られている(Current Protocols In M
olecular Biology, John Wiley & Sons 社、第5章及び
第6章)。
子はまた、化学合成によっても調製することができる。
DNAの化学合成は当業界において自動DNA合成機、
例えばアプライドバイオシステム社396DNA/RN
A合成機など採用して容易である。従って、当業者は、
配列番号:8に示されるヌクレオチド配列のDNAを容
易に合成することができる。
とは異なるコドンによりコードする遺伝子、及び修飾型
GnT−Vをコードする遺伝子は、前記のごとく化学合
成により調製することもでき、また配列番号:8に示す
ヌクレオチド配列を有するDNA又はRNAを鋳型とし
て変異誘発プライマーと共に用いる部位特定変異誘発法
(site−directed mutngenesi
s)等常法に従って得ることもできる(例えば、Curren
t Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Son
s 社、第8章を参照のこと)。
伝子が得られると、これを用いて、常用の遺伝子組換え
法により組換えGnT−Vを製造することができる。す
なわち、本発明のGnT−VをコードするDNAを適当
な発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを適当な宿主
細胞に導入し、該宿主細胞を培養し、そして得られた培
養物(細胞又は培地)から目的とするGnT−Vを採取
する。
ることができる。原核生物としては細菌、特に大腸菌
(Escherichia coli)、バシルス属
(Bacillus)細菌、例えばバシルス・ズブチリ
ス(B.subtilis)等を用いることができる。
真核生物としては酵母、例えばサッカロミセス(Sac
charomyces)属酵母、例えばサッカロミセス
・セレビシエー(S.serevisiae)、等の真
核性微生物、昆虫細胞、例えば、ヨガ細胞(Spodo
ptera frugiperda)、キャベツルーパ
ー細胞(Trichoplusia ni)、カイコ細
胞(Bombyx mori)、動物細胞、例えばヒト
細胞、サル細胞、マウス細胞等を使用することができ
る。本発明においてはさらに、生物体それ自体、例えば
昆虫、例えばカイコ、キャベツルーパー等を用いること
もできる。
ージ、ファージミド、ウィルス(バキュロ(昆虫)、ワ
クチニア(動物細胞))等が使用できる。発現ベクター
中のプロモーターは宿主細菌に依存して選択され、例え
ば細菌用プロモーターとしてはlacプロモーター、t
rpプロモーター等が使用され、酵母用プロモーターと
しては、例えば、adhlプロモーター、pqkプロモ
ーター等が使用される。また、昆虫用プロモーターとし
てはバキュロウィルスポリヘドリンプロモーター等、動
物細胞としてはSimian Virus40のear
lyまたはlateプロモーター等があげられる。
業界においてよく知られている常法により行うことがで
き、これらの方法は例えば、Current Protocols in Mol
ecular Biology, John Wiley & Sons 社、に記載されて
いる。形質転換体の培養も常法に従って行うことができ
る。培養物からのGnT−Vの精製は、タンパク質を単
離・精製するための常法に従って、例えば、限外濾過、
各種カラムクロマトグラフィー、例えばセフアロースを
用いるクロマトグラフィー等により行うことができる。
る。実施例1 .GnT−V産生細胞の培養と培養上清の調製 ヒト肺癌(小細胞癌)由来のQG細胞(微工研条寄第3
967号)をオプチセル5300(Charles R
iver Inc.,Wilmington,MA)に
て培養した。多孔性のセラミック成育チャンバー(有効
表面積>32,000cm2 )に2X109 細胞を植え、
5%子牛血清(GIBCO)含有Ham,sF−12培
養液(Flow)を用いて、コンフルエントになるまで
培養した。
nite含有タンパク質無添加Ham,s F−12
培養液を連続的に添加することにより、血清量を逓減さ
せた。2週間の培養後、140Lの培養上清が得られ
た。この培養上清をUF−メンブレン(Milipor
e,Bedford,MA)を濾過膜とする超濾過装置
を用いて約100倍濃縮した。濃縮した培養上清1.4
リットルを精製材料に供した。
の精製 (1)UDP−ヘキサノルアミンアガロースとGlcN
Acβ1−2Manα1−3−(GlcNAcβ1−2
Manα1−6)Manβ1−4GlcNAcβ1−4
GlcNAc−アスパラギン(GnGn−Asn)セフ
ァロースの調製 UDP−ヘキサノルアミンアガロースは、Sigma社
(St.Louis,MO)より購入した。GnGn−
Asnはヒトトランスフェリンから調製した。先ず、ヒ
トトランスフェリンを0.1Mホウ酸緩衝液(pH8.
0)中37℃でプロナーゼ(Boehringer M
annheim社)で12時間、2回繰り返し消化した
後、10mM酢酸緩衝液(pH6.0)で予め平衡化し
たゲル濾過カラム(Toyoperl HW−40、
2.6x100cm、Tosoh、Tokyo)によ
り、糖ペプチドを分離した。
(Arthrobacter ureafacienc
e、Nacalai Tesque、Kyoto)及び
β−ガラクトシダーゼ(jack bean、Seik
agaku Co、Japan)で酵素消化することに
よりGnGn−Asnを得た。GnGn−Asnセファ
ロースは100μmolのGnGn−Asnに10ml
の活性化CH−セファロース(Pharmacia)を
反応させることにより結合させて得た。
マトグラフィー 4.5 x 18 cm のカラムに280mlのフェニル−セフ
ァロースを充填し、1.5Lの20mMリン酸カリウム
緩衝液(pH6.8,40%飽和硫安含有)で平衡化さ
せた。実施例1で調製した濃縮細胞培養上清1.3リッ
トルを硫安40%飽和にし、3000gで30分間の遠
心操作後、遠心上清を当該カラムに吸着させた。
カリウム緩衝液(pH6.8)を用いて、硫安濃度を0
%まで下げるリニアグラジエントで行なった。その時の
流速は、3ml/分とした。溶出画分の280nmの吸
光度とGnT−V酵素活性を測定した。図1に示したご
とく、GnT−V酵素活性のピークは、280nmの吸
収ピークより後半に溶出された。
マトグラフィー フェニル−セファロースカラムクロマトグラフィーより
溶出させたGnT−V酵素活性画分を集め、さらに、A
miconYM−30メンブランを用いて濃縮と同時
に、20mM リン酸カリウム緩衝液(pH6.8)と
の溶媒交換を行なった。これを、300mlの20mM
リン酸カリウム緩衝液(pH6.8)で予め平衡化した
55mlのハイドロキシルアパタイトに吸着させた。溶
出は、3ml/分で50mM−300mMのリン酸カリ
ウム緩衝液(pH6.8)のリニアグラジエントにより
行なった。ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー
の溶出パターンを図2に示す。GnT−V酵素活性ピー
クは、他の大部分の蛋白質から分離して溶出された。
ース−カラムクロマトグラフフィー 次に、ハイドロキシアパタイトカラムからの活性画分を
集め、AmiconYM−30メンブランを用いて、1
0mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.25)に溶媒を
変換したものを、100mlの10mMリン酸カリウム
緩衝液(pH6.25)で予め平衡化した20mlのU
DP−ヘキサノールアミンアガロース−カラムに吸着さ
せた。酵素は、0.3MNaCl含有10mMリン酸カ
リウム緩衝液(pH6.25)を流速15ml/時間で
流して溶出した。この溶出パターンを図3に示す。
ラムクロマトグラフィー 最後に、GnGn−Asnセファロース−カラムクロマ
トグラフィーを実施した。UDP−ヘキサノールアミン
アガロース−カラムからの活性画分を20mlの0.3
MNaCl含有10mMリン酸カリウム緩衝液(pH
6.25)で平衡化した4mlのGnGn−Asnセフ
ァロースに吸着させ、同じ緩衝液で洗った後に、0.3
MNaCl含有30mMTris−HCl(pH9.
0)流速3ml/時間で溶出した。この結果を図4に示
す。以上、いままでの精製の収率を表1に示した。各ス
テップとも、70%以上の収率で、最終的に約20,0
00倍精製された。
泳動およびネイティブポリアクリルアミド電気泳動 SDSポリアクリルアミド電気泳動は、既報の方法(L
aemmli,U.K.,Nature,227,68
0−685,(1970))に従い、10−15%のグ
ラディエントポリアクリルアミドゲルを用いて還元なら
びに非還元条件下で行なった。α−Lactoalbu
min,Soybean trypsin inhib
itor,Carbonic anhydrase,O
valbumin,Bovine serum alb
umin,Phosphorylase b をそれぞ
れ分子量14,400、20,100、30,000、
43,000、67,000、94,000の分子量マ
ーカーとして用いた。
ントブルーで染色したこのゲルの写真を図5に示す。非
還元条件下でのSDSポリアクリルアミド電気泳動で
は、上述の分子量マーカーに基づいて、73kDaの単
一なバンドが確認された。一方、還元条件下でのSDS
ポリアクリルアミド電気泳動では、ゲル上に73kDa
以外に60kDaのバンドを確認した。また、ネイティ
ブポリアクリルアミド電気泳動のクマシ−ブリリアント
ブルーで染色したゲルの写真及びネイティブポリアクリ
ルアミド電気泳動ゲルから切り出した本酵素活性を図6
に示す。バンドの濃さに応じて本酵素活性が認められ
た。 以上のことより単離、精製されたタンパク質が目
的のGnT−Vであることが確認された。
い、そのゲルから60kDaおよび73kDaに該当す
るバンドを、それぞれ、切り出した。スライスしたゲル
片に0.5%SDSを含む30mM トリス塩酸緩衝液
(pH6.5)を加え、ボイルした後、手製の電気抽出
装置でタンパク質を抽出した。抽出後、50mMトリス
塩酸緩衝液(pH8.0)に溶解した200ngのトリ
プシン(Sigma,St Louis,MO)と37
℃で11時間反応させた。
ィーカラム(Chemcosorb3 ODS−H,O
saka,Japan,2.1×75mm)にかけ、酸
性条件下(0.1%TFA)0−60%のアセトニトリ
ルのグラジエントで溶出した。その時の溶出パターンを
図7に示す。60kDaおよび73kDaの溶出パター
ンは、同様のパターンを示し、このことから、両タンパ
ク質は、一部酵素的消化を受けている可能性もあるが、
大部分は共通のポリペプチドからなると結論づけられ
た。
製GnT−Vのペプチド断片をGas−phaseシー
クエンサー(Applied Biosystem I
nc.、Foster City、CA)にかけたとこ
ろ、以下に示すペプチドフラグメントが得られた。 (1)Thr-Pro-Trp-Gly-Lys (2)Asn-Ile-Pro-Ser-Tyr-Val (3)Val-Leu-Asp-Ser-Phe-Gly-Thr-Glu-Pro-Glu-Phe-
Asn-His-Ala-Asn-Tyr-Ala (4)Asp-Leu-Gln-Phe-Leu-Leu (5)Asn-Thr-Asp-Phe-Phe-Ile-Gly
性の測定法に従い基質特異性を測定した。
Gn(Gn)GnF−,Gn(Gn)Gn−,GG−,
GnGn−,MM−およびGnM−は、ウシIgGを無
水ヒドラジン処理した後、Haseらの方法(Has
e,s.,Ibuki,T.,and Ikehar
a,T.,J.Biochem.95,197−203
(1984))により蛍光標識した。精製したGnT−
VはPBS緩衝液にて最終濃度0.1mg蛋白質/ml
になるように希釈した後、各蛍光標識糖受容体との反応
を行なった。結果を表2に示した。
−PA及びGnGnGn−tri−PAの何れとも反応
することが判明した。
ン酸カリウム緩衝液に、最終濃度0.2M GlcNA
c,40mM EDTA,1% TritonX−10
0,40mM UDP−GlcNAcを含むアッセイ混液
を調製した。アッセイ混液25μlに対して被験サンプ
ル15μlおよび基質(GnGn−bi−PA)10μ
lを加え、37℃で4時間インキュベーションした。結
果を図8に示す。
定及び発現ベクターの作製 実施例5で得られた配列番号3で表されるアミノ酸配列
を基に配列表・配列番号6で表されるオリゴマーS18
を合成し、さらに配列表・配列番号5で表されるアミノ
酸配列を基に配列表・配列番号7で表されるオリゴマー
A21を合成した。
DNA Synthesis kit (Pharmacia社製) を用いて2本
鎖cDNAを合成した。次に、このcDNAを鋳型とし
てオリゴマーS18とA21を用いてAmpli-Taq (Taka
ra 社製)にてPCRを行った。その結果、GnT−V
cDNA断片である約500塩基対のDNA断片を得
た。
して、さらに、cDNAのクローニングを実施した。即
ち、このcDNAを鋳型にしてランダムプライマーラベ
リングキット(Amersham 社製) でα32P−CTPラベル
した。得られたプローブを用い、ヒト胎児肝cDNAラ
イブラリー(クローンテック社製)を常法によりスクリ
ーニングした。得られたクローンのうち、最も長いクロ
ーンをEcoRI で切り出し、pBluescript II ks (+) (S
trategene 社製)にサブクローニングした。インサート
内にEcoRI サイトがあるため、2つの断片が得られた。
2つの断片のそれぞれを、シークエンスした結果、約8
00bpのBフラグメント及び約1200bpのFフラ
グメントが得られた。
ークエンスをSequenase (USB 社製)で決定した結果を
配列表・配列番号8に示す。このDNA断片は、実施例
5で得られた5つのアミノ酸配列をコードする塩基配列
を全て含むことが確認された。なお、今回得られたGn
T−VcDNA断片は3’末端が終止コドンに達してい
ない。従って、3’末端に未決定の塩基対が存在するこ
とは明らかであるが、当該未決定の塩基対を決定するこ
とは、当業者にとって容易なことである。
で発現するために、発現ベクターに組み込んだ。即ち、
発現ベクターpSVK3(Pharmacia 社製)をEcoRI 及
びSmaIで酵素的に消化したのち、前述のFフラグメント
をEcoRI サイト及びインサート内のSmaIサイトで切り出
して挿入した(図9参照)。次いで、Fフラグメントを
挿入したベクターをEcoRI で切断したのち、Self-ligat
ion を防ぐためにCIP(Calf intestinal phosphatas
e )処理後、EcoRIサイトで切り出したBフラグメント
を挿入することにより、発現ベクターに組み込んだ。
DNAの発現及び発現した蛋白質の酵素活性 実施例8で作製した発現ベクターを用いて、GnT−V
cDNA断片を動物細胞に発現させ、発現した蛋白質に
GnT−V酵素活性があるか否か検討した。発現用動物
細胞としてCOS−1細胞を用い、エレクトロポレーシ
ョン法によりGnT−VcDNA断片を含む発現ベクタ
ーをトランスフェクションした。即ち、予め用意したC
OS−1細胞約5×106 細胞をHEBS緩衝液(20 m
M Hepes, 137 mM NaCl, 5mM KCl, 0.7 mM Na2HPO4, 6mM
Dexrose, pH 7.05 )に浮遊させ、上述のプラスミド6
0μgを加え、終容量800μlをエレクトロポレータ
ー(Bio-Rad 社製)で250V、960mFの条件で実
施した。
ションしたCOS−1細胞の全量を直径6cmのシャーレ
にまき、37℃、5%CO2 存在下、48時間培養し
た。培養した細胞は、ラバーポリスマンで集め、50μ
lのPBS緩衝液に懸濁した後、ソニケーターで細胞を
破砕した。その後、遠心操作により上清を集め、そのう
ちの15μlにつき前述の方法により、酵素活性を測定
した。測定結果を図10に示す。以上の結果から、今回
クローニングしたGnT−VcDNA断片は、活性発現
に最低必要な長さを含むことが確認された。
無タンパク質培養上清から、UDP−N−アセチルグル
コサミン:α−6−D−マンノシド, β1, 6−N−ア
セチルグルコサミニルトランスフェラーゼを単離精製
し、その性質、部分アミノ酸構造を決定した。また、本
発明者らは、今回初めて精製した酵素を用いて、各種糖
受容体に対しての基質特異性を明らかにした。これらの
特異性を持った糖転移酵素は、生体内における糖鎖生合
成経路の調節を担う重要な酵素の一つである。また、細
胞の癌化あるいは悪性化に伴い、本酵素が糖鎖の修飾に
関与していることが明らかになりつつある。
た細胞の悪性度のマーカーとして診断上の有用性を有す
るばかりでなく、本酵素を用いて本酵素の特異的阻害剤
のスクリーニング系を確立することにより癌転移防止剤
を設計することが初めて可能となる。さらに、本酵素を
用いて例示した各種糖受容体にβ(1,6)branc
h構造を導入することができるため、反応生成物として
のβ(1,6)branch構造を持ったオリゴサッカ
ライドを工業的に製造できるようになった。また、糖鎖
工学上の観点から、本酵素を大量に生産することによ
り、遺伝子操作による有用物質の生産において糖鎖の均
一生産をも可能にすることができる。
ーの溶出パターンを示すグラフである。白丸実線はタン
パク質の溶出パターンを、黒丸実線はGnT−V活性を
示す。溶出は、40%から0%へ硫安濃度を下げること
により行なった。硫安濃度を点線で示す。
ィーの溶出パターンを示すグラフである。白丸実線はタ
ンパク質の溶出パターンを、黒丸実線はGnT−V活性
を示す。図中の矢印は、溶出バッファーの開始点を示
す。溶出は、50mMから300mMのリン酸緩衝液の
濃度勾配を形成させることにより行なった。リン酸緩衝
液の濃度を点線で示した。
ムクロマトグラフフィーの溶出パターンを示すグラフで
ある。白丸実線はタンパク質の溶出パターンを、黒丸実
線はGnT−V活性を示す。図中の矢印は、溶出バッフ
ァーの開始点を示す。溶出は、0.3MNaClを3m
l/時間流すことにより行なった。
トグラフィーの溶出パターンを示すグラフである。白丸
実線はタンパク質の溶出パターンを、黒丸実線はGnT
−V活性を示す。図中の矢印は、溶出バッファーの開始
点を示す。溶出は、0.3MNaClを3ml/時間流
すことにより行なった。
す図面に代る写真である。
を示す図面に代る写真である。
る。
ある。
−Vにより基質(GnGn−bi−PA)から生成物
(GnGnGn−tri′−PA)が生成したことを示
す高速液体クロマトグラフィーの溶出図である。
Claims (8)
- 【請求項1】 以下の酵素学的性質: (1)作用;UDP−N−アセチルグルコサミンからN
−アセチルグルコサミンをα−6−D−マンノシドに転
移する; (2)基質特異性;GnGn−bi−PAを受容体とし
た時を100とした場合、GnGnF−bi−PAで約
78%、GnGnGn−tri−PAで約125%、G
nM−PAで約66%の反応性を示す; (3)至適pH;6.2−6.3; (4)阻害、活性化及び安定化;活性の発現にMn2+を
必要とせず、また、20mMEDTA存在下においても活
性は阻害されない; (5)分子量;約73,000(還元剤非存在下SDS
−PAGEによる)並びに約73,000及び約60,
000(還元剤存在下SDS−PAGEによる); (6)Km値;受容体GnGn−bi−PA及び供与体
UDP−GlcNAcに対するKm値は、各々133μ
M、3.5mMである;並びに (7)以下のペプチドフラグメントを有する: (1)Thr-Pro-Trp-Gly-Lys (2)Asn-Ile-Pro-Ser-Tyr-Val (3)Val-Leu-Asp-Ser-Phe-Gly-Thr-Glu-Pro-Glu-Phe-
Asn-His-Ala-Asn-Tyr-Ala (4)Asp-Leu-Gln-Phe-Leu-Leu 、 (5)Asn-Thr-Asp-Phe-Phe-Ile-Gly を有するβ1, 6−N−アセチルグルコサミニルトラン
スフェラーゼ。 - 【請求項2】 少なくとも配列番号:8で示されるアミ
ノ酸配列を含んで成るアミノ酸配列、又はこのアミノ酸
配列において1又は複数のアミノ酸が修飾されているア
ミノ酸配列を有するβ1, 6−N−アセチルグルコサミ
ニルトランスフェラーゼ。 - 【請求項3】 請求項1又は2に記載のβ1, 6−N−
アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードす
るDNA。 - 【請求項4】 配列番号:8に示す塩基配列を有する請
求項3に記載のDNA。 - 【請求項5】 請求項3又は4に記載のDNAを含んで
成る発現ベクター。 - 【請求項6】 請求項5に記載の発現ベクターにより形
質転換された宿主。 - 【請求項7】 ヒト肺癌由来のQG細胞を培養し、該培
養物から該酵素を採取することを特徴とする請求項1記
載の酵素の製造方法。 - 【請求項8】 請求項1又は2に記載のβ1, 6−N−
アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ酵素の製造
方法において、該酵素をコードするDNAを含んで成る
発現ベクターにより形質転換された宿主を培養又は飼育
し、該宿主から前記酵素を採取することを特徴とする方
法。
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US5602003A (en) * | 1992-06-29 | 1997-02-11 | University Of Georgia Research Foundation | N-acetylglucosaminyltransferase V gene |
US5545553A (en) * | 1994-09-26 | 1996-08-13 | The Rockefeller University | Glycosyltransferases for biosynthesis of oligosaccharides, and genes encoding them |
US8178090B2 (en) * | 1995-06-07 | 2012-05-15 | Danisco A/S | Recombinant hexose oxidase |
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US7214660B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-05-08 | Neose Technologies, Inc. | Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin |
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US7173003B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-02-06 | Neose Technologies, Inc. | Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF |
US7795210B2 (en) | 2001-10-10 | 2010-09-14 | Novo Nordisk A/S | Protein remodeling methods and proteins/peptides produced by the methods |
CA2472381C (en) | 2002-01-09 | 2014-04-29 | Suntory Limited | Glycosyltransferase gnt-v having neovascularization action |
CA2483436A1 (en) | 2002-04-23 | 2003-11-06 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | N-acetylglucosaminyltransferase vb coding sequence, recombinant cells and methods |
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CA2519092C (en) | 2003-03-14 | 2014-08-05 | Neose Technologies, Inc. | Branched water-soluble polymers and their conjugates |
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ATE540055T1 (de) | 2003-05-09 | 2012-01-15 | Biogenerix Ag | Zusammensetzungen und verfahren zur herstellung von glykosylierungsmutanten des menschlichen wachstumshormons |
US9005625B2 (en) | 2003-07-25 | 2015-04-14 | Novo Nordisk A/S | Antibody toxin conjugates |
US20080305992A1 (en) | 2003-11-24 | 2008-12-11 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated erythropoietin |
US8633157B2 (en) | 2003-11-24 | 2014-01-21 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated erythropoietin |
US7956032B2 (en) | 2003-12-03 | 2011-06-07 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor |
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WO2006121569A2 (en) | 2005-04-08 | 2006-11-16 | Neose Technologies, Inc. | Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants |
EP1888098A2 (en) | 2005-05-25 | 2008-02-20 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated erythropoietin formulations |
US20070105755A1 (en) | 2005-10-26 | 2007-05-10 | Neose Technologies, Inc. | One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides |
US20090048440A1 (en) | 2005-11-03 | 2009-02-19 | Neose Technologies, Inc. | Nucleotide Sugar Purification Using Membranes |
ES2516694T3 (es) | 2006-07-21 | 2014-10-31 | Ratiopharm Gmbh | Glicosilación de péptidos a través de secuencias de glicosilación con unión en O |
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US9493499B2 (en) | 2007-06-12 | 2016-11-15 | Novo Nordisk A/S | Process for the production of purified cytidinemonophosphate-sialic acid-polyalkylene oxide (CMP-SA-PEG) as modified nucleotide sugars via anion exchange chromatography |
US8207112B2 (en) | 2007-08-29 | 2012-06-26 | Biogenerix Ag | Liquid formulation of G-CSF conjugate |
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Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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