JPH06194367A - Diagnosis method for rheumatic disease - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To provide an immunoassay for measuring the content of M-CSF conveniently at high sensitivity by removing inhibitors when the content of M-CSF (monocyte macrophage stimulating factor) in articular liquid is measured. CONSTITUTION:In the diagnosis method for rheumatic disease, hyaluronic acid is removed from human articular liquid and monocyte macrophage colony stimulating factor contained therein is reacted on an antibody reacting specifically on the monocyte macrophage colony stimulating factor and measured by immunoassay. This method allows quick and accurate determination of M-CSH in human articular liquid thus allowing correct diagnosis of rheumatic disease.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】この発明は、リウマチ疾患の診断
方法に関するものである。さらに詳しくは、この発明
は、免疫学的測定を用いたリウマチ疾患の簡便かつ高感
度の診断方法に関するものである。FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to a method for diagnosing rheumatic diseases. More specifically, the present invention relates to a simple and highly sensitive diagnostic method for rheumatic diseases using immunological measurement.

【０００２】[0002]

【従来の技術】日本における慢性関節リウマチ患者は、
人口１０００人当たり約３人の割合といわれており、特
に女性に多いことが知られている（検査と技術、第１１
巻、第４０２ペ−ジ、１９８３年）。この慢性関節リウ
マチは、自己免疫疾患の一つであるが、自己免疫疾患
は、生体の免疫機構のうち、自己に対する免疫寛容（im
munological torelance)が制御不能になった場合、産生
された自己抗体または自己反応性Ｔ細胞が関与して発症
する疾患であると定義されている（臨床検査、第３５
巻、第１４８ペ−ジ、１９９１年）。この自己免疫疾患
には、リウマチの他に全身性エリテマト−デス、橋本
病、甲状腺中毒症等が知られている。2. Description of the Related Art Rheumatoid arthritis patients in Japan
It is said that the ratio is about 3 people per 1000 people, and it is known that it is especially high among women (test and technology, No. 11).
Vol. 402, 1983). This rheumatoid arthritis is one of the autoimmune diseases, and the autoimmune disease is one of the immune mechanisms of the living body, which is the tolerance of immunity (im
It is defined as a disease that develops due to the involvement of autoantibodies or autoreactive T cells produced when munological to balance) becomes uncontrollable (Clinical Examination, No. 35).
Vol. 148, 1991). In addition to rheumatism, systemic lupus erythematosus, Hashimoto's disease, thyrotoxicosis, etc. are known as this autoimmune disease.

【０００３】リウマチの定義は、「骨、関節、筋肉、腱
などの運動器官に痛みとこわばりを訴える疾患」であ
り、特に慢性関節リウマチは、多発性関節炎を主症状と
するが、内臓にも広範に病変を惹起するため、全身性疾
患であるとされている（検査と技術、第１１巻、第４０
２ペ−ジ、１９８３年）。リウマチの診断には、アメリ
カリウマチ学会（ＡＲＡ）により、１９５８年に作成さ
れた１１項目の診断基準[ ブレティン・オン・ザ・リウ
マティック・ディジ−ジズ（Bulletin on the Rheumati
c Diseases）第９巻、第１７５ペ−ジ、１９５８年] が
使用されていたが、１９８７年に改訂され[ ア−スリテ
ィス・アンド・リウマティズム（Arthitis and Rheumat
ism)、別冊、第４５ペ−ジ、１９８７年] 、診断基準が
次の７項目に削減された。 １）少なくとも１時間以上持続する朝のこわばり（６週
以上持続） ２）３個以上の関節の腫脹（６週以上持続） ３）手（WRIST)、中手指関節（MCP)、近位指関節（PIP)
の腫脹（６週以上持続） ４）対称性関節腫脹 ５）手、指のＸ線像の変化 ６）皮下結節（リウマチ結節） ７）リウマトイド因子の存在 そして、これら７項目のうち少なくとも４項目の病変が
認められれば、リウマチであると診断される。The definition of rheumatism is "a disease that complains of pain and stiffness in motor organs such as bones, joints, muscles and tendons". Particularly, rheumatoid arthritis has polyarthritis as its main symptom, but also the internal organs. Since it causes a wide range of lesions, it is said to be a systemic disease (Tests and Techniques, Vol. 11, 40).
2 pages, 1983). For the diagnosis of rheumatism, 11 criteria of diagnostic criteria prepared by the American College of Rheumatology (ARA) in 1958 [Bulletin on the Rheumati]
C Diseases, Vol. 9, 175, 1958], but revised in 1987 [Arthitis and Rheumat].
ism), separate volume, page 45, 1987], the diagnostic criteria were reduced to the following 7 items. 1) Morning stiffness for at least 1 hour or more (6 weeks or more) 2) Swelling of 3 or more joints (6 weeks or more) 3) Hand (WRIST), metacarpophalangeal joint (MCP), proximal knuckle (PIP)
Swelling (lasting 6 weeks or more) 4) Symmetrical swelling 5) Changes in X-ray images of hands and fingers 6) Subcutaneous nodules (rheumatic nodules) 7) Presence of rheumatoid factor And at least 4 of these 7 items If there is a lesion, it is diagnosed as rheumatic.

【０００４】とくに、これらの規準のうち、リウマチの
客観的診断にはリウマトイド因子の測定を行うことが一
般的に行われているが、実際には、健常人でもリウマト
イド因子陽性の人が数〜１０％程度存在し、一方リウマ
チと診断された人でもリウマトイド因子の陽性率は４０
〜９０％である（検査と技術、第１６巻、第１４２２ペ
−ジ、１９８８年）。In particular, among these criteria, the rheumatoid factor is generally measured for the objective diagnosis of rheumatism. In practice, however, the number of healthy people who are positive for the rheumatoid factor is high. There is about 10%, while the positive rate of rheumatoid factor is 40 even in those diagnosed with rheumatism.
90% (Inspection and Technology, Volume 16, Page 1422, 1988).

【０００５】近年このリウマチの炎症性とサイトカイン
との関係が徐々に明らかになりつつある。特にインタ−
ロイキン１(IL-1)および腫瘍壊死因子（TNF)との関係に
ついては、その報告も多い[ ア−スリティス・アンド・
リウマティズム（Arthritisand Rheumatism）、第３０
巻、第５６２ペ−ジ、１９８７年、ア−スリティス・ア
ンド・リウマティズム（Arthritis and Rheumatism）、
第３１巻、第４８０ペ−ジ、１９８８年、日本整形外科
学会誌、第６３巻、第１３５３ペ−ジ、１９８９年、ブ
リティッシュ・ジャ−ナル・オブ・リウマトロジ−（Br
itish Journalof Rheumatology ）、第２８巻、第１０
４ペ−ジ、１９８９年およびアナルズ・オブ・ザ・リウ
マティック・ディジ−ズ（Annals of the Rheumatic Di
seases）、第４７巻、第７６８ペ−ジ、１９８８年] 。
これらの報告によれば、特にリウマチに関連してという
よりも、リウマチを炎症性の疾患の一つとしてとらえ、
局所炎症とサイトカインとの関係が論じられている。In recent years, the relationship between the inflammation of rheumatoid arthritis and cytokines has been gradually revealed. Especially the interface
There are many reports on the relationship between leukin 1 (IL-1) and tumor necrosis factor (TNF) [Athritis &
Arthritis and Rheumatism, No. 30
Vol. 562, 1987, Arthritis and Rheumatism,
31st volume, 480th page, 1988, Journal of Japan Orthopedic Society, 63rd volume, 1353th page, 1989, British Journal of Rheumatology (Br
itish Journalof Rheumatology), 28, 10
4 pages, 1989 and Annals of the Rheumatic Di
seases), Volume 47, Page 768, 1988].
According to these reports, rather than particularly relating to rheumatism, rheumatism is regarded as one of inflammatory diseases,
The relationship between local inflammation and cytokines has been discussed.

【０００６】また、インタ−ロイキン６（IL-6）および
顆粒球／単球マクロファ−ジ刺激因子との関連も明らか
になりつつある「医学のあゆみ、第１６１巻、第５８０
ペ−ジ、１９９２年] が、この報告も、どちらかといえ
ばリウマチに限らず、炎症性の疾患としての関係が論じ
られている。単球マクロファージ刺激因子（Macrophage
Colony Stimulating Factor：以下、Ｍ−ＣＳＦと略記
することがある）は、白血球の機能を促進するため感染
症の予防および治療効果を有すること[ ジャ−ナル・オ
ブ・イムノロジ−（Journalof Immunology)、第１３１
巻、第２９８３ペ−ジ、１９８３年、ジャ−ナル・オブ
・イムノロジ−（Journal of Immunology)、第１２２
巻、第１１３４ペ−ジ、１９７９年およびジャ−ナル・
オブ・イムノロジ−（Journal of Immunology)、第１３
０巻、第７９５ペ−ジ、１９８３年] 、およびその分化
誘導活性により、骨髄性白血病の治療に有効であること
[ インタ−ナショナル・ジャ−ナル・オブ・カンサ−
（International Journal OF Cancer)、第３０巻、第７
７３ペ−ジ、１９８２年] 等が知られているが、この他
にも、近年その多彩な役割が明らかになってきている。
例えば、破骨細胞が極めて少ない骨大理石病のモデル動
物であるop/op マウスがＭ−ＣＳＦ欠損動物であること
[ ネイチャ−（Nature）、第３４５巻、第４４２ペ−
ジ、１９９０年] 、この破骨細胞減少が、Ｍ−ＣＳＦ投
与により改善されたこと[ ジャ−ナル・オブ・ボ−ン・
アンド・ミネラル・リサ−チ（Journal of Bone and Mi
neral Research）、第５巻（別冊２、要約）、第５３４
ペ−ジ、１９９０年] により、Ｍ−ＣＳＦは、生体内で
も破骨細胞形成に重要な役割を果たしていることが、推
定されている。[0006] In addition, the relationship between interleukin 6 (IL-6) and granulocyte / monocyte macrophage stimulating factor is becoming clear "Ayumi of Medicine, Vol. 161, 580".
Page, 1992], but this report also discusses the relationship as an inflammatory disease, not limited to rheumatism. Monocyte Macrophage Stimulating Factor (Macrophage
Colony Stimulating Factor (hereinafter sometimes abbreviated as M-CSF) has a preventive and therapeutic effect on infectious diseases by promoting the function of leukocytes [Journal of Immunology, No. 131
Vol. 2983, 1983, Journal of Immunology, 122.
Volume, Page 1134, 1979 and Journal.
Journal of Immunology, 13th
0, No. 795, 1983], and its differentiation-inducing activity, are effective for the treatment of myeloid leukemia.
[International Journal of Kansas
(International Journal OF Cancer), Volume 30, Volume 7
73 page, 1982], etc., but in addition to these, various roles have been clarified in recent years.
For example, op / op mice, which are model animals for osteopetrosis with extremely few osteoclasts, are M-CSF deficient animals.
[Nature, Volume 345, Volume 442
J., 1990], this osteoclast reduction was ameliorated by administration of M-CSF [Journal of Bonn.
And Mineral Research (Journal of Bone and Mi
neral Research), Volume 5 (Annex 2, Abstract), 534
Page, 1990], it is estimated that M-CSF plays an important role in osteoclast formation in vivo.

【０００７】炎症には、患部血管およびその隣接組織に
おける複雑な一連の細胞学的および組織学的反応が関与
しており、組織部分には血漿、蛋白質、およびマクロフ
ァ−ジ細胞の流入が惹起される。そのため、マクロファ
−ジを活性化する因子の存在は容易に推定され、またリ
ウマチによる炎症ではその初期において骨粗鬆様の症状
を呈することからも、IL-1およびTNF のみならず、Ｍ−
ＣＳＦの存在が当然のことながら予想される。ところ
が、リウマチとＭ−ＣＳＦの関係についての報告はほと
んどなく、次の２例が知られている。第１に、リウマチ
患者の関節液中にはインタ−ロイキン２（IL-2）および
インタ−ロイキン３（IL-3）が存在せず、Ｍ−ＣＳＦが
存在したという報告がある[ ジャ−ナル・オブ・エクス
ペリメンタル・メディスン（Journal of Experimental
Medicine）第１６８巻、第１５７３ペ−ジ、１９８８
年] 。この論文中で著者らは、リウマチ患者より得た関
節液をゲルろ過クロマトグラフィ−にかけた後、マウス
骨髄を用いて軟寒天コロニ−形成法にてコロニ−を検出
し、そのゲルろ過における分子量の位置および形成され
たコロニ−からここに見られる因子がＭ−ＣＳＦである
ことを推定している。すなわち著者らは、検出される因
子がＭ−ＣＳＦであることを証明するために放射性免疫
測定法により試験し、この因子がＭ−ＣＳＦに特異的な
抗体を使用しても検出できることを示している。しかし
ながら、この方法は、前処理に操作が繁雑なゲル濾過を
行ったサンプルを測定しており、Ｍ−ＣＳＦがリウマチ
患者に存在することを推定したのみであり、この存在が
健常人にもあてはまるか否かは明らかでなく、また変形
性関節炎においても明らかにされていない。[0007] Inflammation involves a complex series of cytological and histological reactions in affected blood vessels and adjacent tissues, inducing an influx of plasma, protein, and macrophage cells in the tissue area. It Therefore, the presence of a factor that activates macrophages is easily presumed, and since inflammation due to rheumatism exhibits osteoporosis-like symptoms at the early stage, not only IL-1 and TNF but also M-
The existence of CSF is naturally expected. However, there are almost no reports on the relationship between rheumatism and M-CSF, and the following two cases are known. First, there is a report that interleukin 2 (IL-2) and interleukin 3 (IL-3) were not present in the synovial fluid of patients with rheumatism, and M-CSF was present [Journal] Of Experimental Medicine (Journal of Experimental
Medicine) Volume 168, 1573, 1988
Year] . In this paper, the authors investigated the location of the molecular weight in gel filtration by subjecting joint fluid obtained from rheumatoid patients to gel filtration chromatography, and then detecting colonies by soft agar colony formation method using mouse bone marrow. And from the colonies formed, it is inferred that the factor found here is M-CSF. That is, the authors tested by radioimmunoassay to prove that the detected factor is M-CSF and showed that this factor can also be detected using an antibody specific for M-CSF. There is. However, this method measures a sample subjected to gel filtration, which is a complicated procedure for pretreatment, and only estimates that M-CSF is present in patients with rheumatism, and this presence also applies to healthy subjects. It is not clear whether this is the case or in osteoarthritis.

【０００８】第２に、種々の関節液中のＭ−ＣＳＦを前
述のマウス骨髄を用いた軟寒天コロニ−形成法にて測定
し、リウマチ患者の関節液ではＭ−ＣＳＦレベルが、変
形性関節炎患者の関節液よりは高いことを推定した報告
[ リュ−マトロジ−・インタ−ナショナル（Rheumatolo
gy International）、第１０巻、第１３１ペ−ジ、１９
９０年] があるが、ここで使用している方法は、測定に
５〜１０日も要するマウス骨髄を用いた軟寒天コロニ−
形成法であり、例えば日常的な検査に応用することはで
きない。Secondly, M-CSF in various synovial fluids was measured by the soft agar colony formation method using the above-mentioned mouse bone marrow, and in the synovial fluid of rheumatic patients, the M-CSF level was osteoarthritis. Reported to be higher than the patient's synovial fluid
[Rheumatolo International (Rheumatolo
gy International), Volume 10, Pages 131, 19
90 years], the method used here is a soft agar colony using mouse bone marrow that requires 5 to 10 days for measurement.
It is a forming method and cannot be applied to, for example, routine inspection.

【０００９】以上のようにＭ−ＣＳＦに関する報告例が
少ないのは、関節液中のＭ−ＣＳＦ含量を測定する場
合、従来使用されている感度の低い生物活性の測定では
検出できないか、または検出が難しいこと、さらに生物
活性の測定方法が繁雑で日数と手間が掛かることによる
ものである。また、免疫学的測定を行う場合は、関節液
に存在するいずれかの物質によりその測定が阻害される
ため、例えば前記のゲル濾過等の繁雑な前処理を行わな
ければならないことによる。[0009] As described above, there are few reports on M-CSF. The reason for this is that when measuring the M-CSF content in synovial fluid, it cannot be detected or detected by the conventional low-sensitivity bioactivity measurement. Is difficult, and the method for measuring biological activity is complicated and requires many days and labor. In addition, when performing an immunological measurement, the measurement is inhibited by any substance present in the synovial fluid, so that it is necessary to perform a complicated pretreatment such as gel filtration described above.

【００１０】[0010]

【発明が解決しようとする課題】前記のように、Ｍ−Ｃ
ＳＦはリウマチ患者の関節液に存在することが軟寒天コ
ロニ−形成法により明かにされてはいるが、免疫学的な
考察はほとんど行われていない。この免疫学的な考察が
行われていない原因は、関節液中に存在する物質により
その測定が阻害されるため、関節液を事前にクロマトグ
ラフィ−にかけるなどの前処理が必要であるが、このよ
うな操作は、一度に一検体しか処理できず、また多くの
解析に使用されている軟寒天骨髄培養法は熟練を要し、
さらに５〜10日程度の日数を要するという不利な条件が
多く重なったことによる。DISCLOSURE OF THE INVENTION Problems to be Solved by the Invention As described above, MC
Although it has been revealed by the soft agar colony formation method that SF is present in the synovial fluid of patients with rheumatism, little immunological consideration has been made. The reason why this immunological consideration has not been carried out is that the measurement is inhibited by the substances present in the synovial fluid, and therefore pretreatment such as subjecting the synovial fluid to chromatography in advance is necessary. Such an operation can process only one sample at a time, and the soft agar bone marrow culture method used for many analyzes requires skill,
This is because there are many disadvantageous conditions that require 5 to 10 days.

【００１１】この発明は、以上のとおりの状況に鑑みて
なされたものであり、特に関節液のＭ−ＣＳＦ含量を測
定する際、その阻害物質を除去し、迅速、簡便、かつ高
感度にＭ−ＣＳＦの含量を免疫学的に測定する方法を提
供することを目的としている。さらにこの発明は、関節
液のＭ−ＣＳＦ含量を定量することにより、他の関節炎
［例えば変形性関節炎（O.A.）］患者とリウマチ患者と
を明確に識別する診断方法を提供することを目的として
もいる。The present invention has been made in view of the above situation, and in particular, when measuring the M-CSF content of synovial fluid, its inhibitor is removed, and the M-CSF is rapidly, simply and highly sensitively detected. -It aims at providing the method of measuring the content of CSF immunologically. Further, the present invention also aims to provide a diagnostic method for clearly distinguishing between patients with other arthritis [for example, osteoarthritis (OA)] and patients with rheumatism by quantifying the M-CSF content of synovial fluid. There is.

【００１２】[0012]

【課題を解決するための手段】この発明は、上記の課題
を解決するものとして、ヒアルロン酸を除去したヒト関
節液に含まれる単球マクロファージコロニー刺激因子
を、単球マクロファージコロニー刺激因子に特異的に反
応する抗体と反応させて免疫学的に測定するリウマチ疾
患の診断方法を提供する。Means for Solving the Problems The present invention, in order to solve the above-mentioned problems, provides a method for specifically modifying a monocyte macrophage colony stimulating factor contained in human synovial fluid from which hyaluronic acid has been removed, into a monocyte macrophage colony stimulating factor. The present invention provides a method for diagnosing rheumatic diseases, which comprises immunologically measuring by reacting with an antibody which reacts with

【００１３】また、この発明は、上記単球マクロファー
ジコロニー刺激因子に特異的に反応する抗体が、ハイブ
リドーマMO9106（微工研条寄第3662号）の産生するモノ
クロ−ナル抗体であること、およびヒアルロン酸の除去
が、ヒアルロニダーゼによる消化であることを望ましい
態様としてもいる。この発明の発明者等は、先にヒトＭ
−ＣＳＦβ型ダイマーに特異的に反応し、ヒトＭ−ＣＳ
Ｆβ型モノマー、ヒトＭ−ＣＳＦα型ダイマーおよびヒ
トＭ−ＣＳＦα型モノマーのいずれにも反応しないモノ
クローナル抗体、この抗体を産生するハイブリドーマ、
およびこの抗体の利用に関する発明を行い、特許出願し
た（特願平３−３３３６０７号。以下先願と記載す
る）。Further, according to the present invention, the antibody specifically reacting with the monocyte macrophage colony stimulating factor is a monoclonal antibody produced by hybridoma MO9106 (Microtech Lab. No. 3662), and hyaluronic acid. It is also desirable that the acid removal is digestion with hyaluronidase. The inventors of the present invention previously reported that human M
-Specifically reacting with CSF β-type dimer, human M-CS
A monoclonal antibody that does not react with any of Fβ-type monomer, human M-CSFα-type dimer and human M-CSFα-type monomer, a hybridoma producing this antibody,
And, an invention relating to the use of this antibody was made and a patent application has been filed (Japanese Patent Application No. 3-333607, hereinafter referred to as a prior application).

【００１４】先願出願後、この発明の発明者等は、先願
の発明で得られたモノクローナル抗体の診断薬としての
利用について鋭意研究を行い、このモノクローナル抗体
がリウマチ疾患の診断に利用しうることを見出し、この
発明を完成した。以下、この発明についてさらに詳しく
説明する。関節液のＭ−ＣＳＦ含量を測定する際の阻害
物質として、関節液の粘凋性に関与している多量のヒア
ルロン酸がある。ヒアルロン酸を除去するためには、分
子量分画を行うことが最も簡便な方法であるが、ヒアル
ロン酸とＭ−ＣＳＦが複雑に絡まり合っている場合、ヒ
アルロン酸を除去する際にＭ−ＣＳＦも除去してしまう
可能性がある。そこで、例えばヒアルロン酸をヒアルロ
ニダ−ゼ（EC 4.2.2.1）で消化し、最終的にオリゴ糖に
分解することにより、関節液の粘凋性を低下させ、Ｍ−
ＣＳＦ含量の測定における阻害物質を除去することが可
能である。After the application for the prior application, the inventors of the present invention have conducted extensive studies on the use of the monoclonal antibody obtained in the invention for the prior application as a diagnostic agent, and this monoclonal antibody can be used for the diagnosis of rheumatic diseases. It was found that the present invention was completed. Hereinafter, the present invention will be described in more detail. As an inhibitor when measuring the M-CSF content of synovial fluid, there is a large amount of hyaluronic acid involved in the viscous properties of synovial fluid. The most convenient method for removing hyaluronic acid is to perform molecular weight fractionation. However, when hyaluronic acid and M-CSF are intricately entangled with each other, M-CSF is also removed when hyaluronic acid is removed. May be removed. Therefore, for example, by digesting hyaluronic acid with hyaluronidase (EC 4.2.2.1) and finally decomposing it into oligosaccharides, the viscous properties of synovial fluid are reduced, and M-
It is possible to remove inhibitors in the measurement of CSF content.

【００１５】この発明の発明者らは、その可能性を検討
し、この方法により、阻害物質が除去されることを確認
した。この発明の方法において、ヒアルロン酸を除去す
る方法は、前記のヒアルロニダ−ゼ消化に限定されるも
のではなく、Ｍ−ＣＳＦに影響を与えずにヒアルロン酸
のみを消化、または除去する方法であれば、その他の方
法も利用することができる。The inventors of the present invention examined the possibility and confirmed that the inhibitor removes by this method. In the method of the present invention, the method for removing hyaluronic acid is not limited to the above-mentioned hyaluronidase digestion, but it is a method for digesting or removing only hyaluronic acid without affecting M-CSF. , Other methods can also be used.

【００１６】この発明に使用する抗体の製造および免疫
学的測定方法は、先願の方法を採用できるが、特にこれ
に限定されるものではなく、同程度の感度を有する測定
法であれば、利用することが可能である。この発明に使
用する抗体の製造法を例示すれば、次のとおりである。 （１）ハイブリドーマの作出 この発明のハイブリド−マの作出は、免疫、細胞融合、
融合細胞選択、アッセイおよびクロ−ニングの各工程よ
りなる公知の方法［ネイチャー(Nature)、第２５６巻、
第４９５ページ、１９７５年］により次のようにして行
われる。 1)免疫 精製β型ダイマ−を抗原として用い、完全フロインドま
たは不完全フロインドのアジュバントと混和し、１週間
〜数か月の間隔でラットまたはマウス等に１〜４回注射
し、動物を感作する。なお、精製β型ダイマ−は、例え
ば特開昭64-22899号公報記載の方法により健康な人の尿
から分離、精製される。 2)細胞融合 前記の操作により免疫された動物から常法により摘出し
た脾臓細胞またはリンパ球Ｂ細胞と、骨髄腫細胞とを融
合し、融合細胞を得る。使用する骨髄腫細胞は、公知の
HGPRT(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transfer
ase)欠損マウスまたはラット骨髄腫細胞であり、ケーラ
ーおよびミルスタインの方法［ネイチャー(Nature)、第
２５６巻、第４９５ページ、１９７５年］により容易に
入手し得る。融合方法としてはHJV 法（センダイウイル
スを用いる方法）、ポリエチレングリコ−ル法（PEG
法）、電気融合法等の公知の方法が例示できる。 3)融合細胞の選択 次いで融合細胞のみが生育できる適当な選択培地中で２
〜４日毎に新鮮な選択培地と交換しながら10〜20日間培
養し、所望の融合細胞のみを選別する。HGPRT欠損骨髄
腫細胞を融合親細胞として用いた場合、選択培地として
はHAT(Hypoxanthine, Aminopterin, Thymidine）培地、
HAz(Hypoxanthine, Azaserine)培地等を例示することが
できる。 4)アッセイ アッセイ工程は、融合細胞の中から、目的とする特異抗
体産生細胞を選別する工程である。通常、選別は、培養
上清に含まれる抗体活性を固相または液相放射性同位元
素免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素結合免疫化学測定法（Ｅ
ＩＡ）、凝集法、蛍光抗体法等の公知の方法で行われ
る。 5)クロ−ニング クロ−ニング工程は、目的の特異抗体産生細胞を一つの
クロ−ンから由来した均一な細胞集団とする工程であ
る。公知の限外希釈法等によってモノクロ−ナルな細胞
から由来し、安定してＭ−ＣＳＦと反応する抗体を産生
する細胞株、いわゆるハイブリド−マを得る。As the method for producing the antibody and the immunological measuring method used in the present invention, the method of the prior application can be adopted, but the method is not particularly limited to this, and any measuring method having the same sensitivity can be used. It is possible to use. The method for producing the antibody used in the present invention is illustrated below. (1) Production of hybridoma The production of the hybridoma of the present invention includes immunization, cell fusion,
A known method comprising the steps of fused cell selection, assay and cloning [Nature, vol. 256,
P. 495, 1975] as follows. 1) Immunization Using purified β-type dimer as an antigen, mixing it with complete Freund's or incomplete Freund's adjuvant, and injecting it into rats or mice 1 to 4 times at intervals of 1 week to several months, and sensitizing the animals. To do. The purified β-type dimer is separated and purified from the urine of a healthy person, for example, by the method described in JP-A-64-22899. 2) Cell fusion Spleen cells or lymphocyte B cells extracted by a conventional method from the immunized animal by the above procedure and myeloma cells are fused to obtain fused cells. The myeloma cells used are known
HGPRT (hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transfer
ase) -deficient mouse or rat myeloma cells and are readily available by the method of Koehler and Milstein [Nature, 256, 495, 1975]. As the fusion method, HJV method (method using Sendai virus), polyethylene glycol method (PEG
Method), an electric fusion method and the like. 3) Selection of fused cells Then, in a suitable selection medium in which only the fused cells can grow, 2
Culture for 10-20 days with replacement of fresh selection medium every ~ 4 days to select only the desired fused cells. When HGPRT-deficient myeloma cells are used as fusion parent cells, HAT (Hypoxanthine, Aminopterin, Thymidine) medium is used as a selective medium,
Examples include HAz (Hypoxanthine, Azaserine) medium and the like. 4) Assay The assay step is a step of selecting a target specific antibody-producing cell from the fused cells. Usually, the screening is performed by solid phase or liquid phase radioisotope immunoassay (RIA), enzyme-linked immunochemical assay (E
It is carried out by a known method such as IA), agglutination method and fluorescent antibody method. 5) Cloning The cloning step is a step of forming the specific antibody-producing cells of interest into a uniform cell population derived from one clone. A cell line, so-called hybridoma, which is derived from a monoclonal cell and produces an antibody that stably reacts with M-CSF, is obtained by a known limiting dilution method or the like.

【００１７】以上の方法により得られたハイブリドーマ
は、Ｍ−ＣＳＦに特異的に反応するモノクロ−ナル抗体
を産生するという機能的特徴を有している。その代表的
な例としてラットのリンパ球Ｂ細胞とラットのミエロー
マ細胞とを融合して得たハイブリドーマを、ハイブリド
ーマMO9106と命名し、既に通商産業省工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託し、微工研条寄第3662号(FERM BP
-3662)なる受託番号が付されている。The hybridoma obtained by the above method has a functional feature of producing a monoclonal antibody which specifically reacts with M-CSF. As a typical example, a hybridoma obtained by fusing rat lymphocyte B cells and rat myeloma cells was designated as hybridoma MO9106, and was already deposited at the Institute of Microbial Technology, Ministry of International Trade and Industry. Kokenjoyori No. 3662 (FERM BP
-3662) is attached.

【００１８】このハイブリドーマMO9106は、次の性質を
有している。 ａ）由 来：ラット脾細胞（Lou ラット；実験動物
中央研究所より入手）とラットミエロ−マ細胞（Y3Ag1.
2.3 ）［ネイチャ−(Nature)、第２７７巻、第１３１ペ
−ジ、１９７９年］) との融合細胞であるハイブリド−
マ ｂ）形 態：非紡錘形であり、ほぼ球形を呈する ｃ）継代培養 ：可能 ｄ）機能的特徴：Ｍ−ＣＳＦβ型ダイマ−に特異的に反
応するモノクロ−ナル抗体の産生 ｅ）細胞増殖性：附着および浮遊の両者において良好 ｆ）保存条件 ：10%DMSO,90%FCS中にて−８０℃以下で
保存する ｇ）血清要求性：通常、10%FCS添加培地にて培養する （２）モノクロ−ナル抗体の取得 この発明の抗体は、前記ハイブリド−マを組織培養用フ
ラスコに接種し、公知の無血清培地、血清を含む公知の
動物細胞用培地等で培養し、得られた培養上清から、ま
たはプリスタン（2,6,10,14-Tetramethyl pentadecane)
を前投与したマウス等の動物にこのハイブリド−マを接
種し、生体内培養して得た生体浸出液から、公知の方法
により精製される。すなわち、得られた培養上清または
生体浸出液を通常の蛋白精製に用いられる生化学的方
法、例えば硫酸アンモニウムによる塩沈法、カラムクロ
マトグラフィ−等により精製される。得られたモノクロ
−ナル抗体はβ型ダイマ−と特異的に結合し、単一クロ
−ンに由来する均一な抗体であり、ラットまたはマウス
由来であることを特徴としている。This hybridoma MO9106 has the following properties. a) From: Rat splenocytes (Lou rat; obtained from Central Research Institute of Experimental Animals) and rat myeloma cells (Y3Ag1.
2.3) Hybrid, which is a fused cell with [Nature, vol. 277, p. 131, 1979].
B) Morphology: Non-spindle type, almost spherical shape c) Subculture: Possible d) Functional characteristics: Production of monoclonal antibody specifically reacting with M-CSFβ type dimer e) Cell proliferation Properties: Good both in attachment and suspension f) Storage conditions: Store in 10% DMSO, 90% FCS at -80 ° C or lower g) Serum requirement: Usually, culture in 10% FCS-supplemented medium (2 ) Acquisition of Monoclonal Antibody The antibody of the present invention is obtained by inoculating the hybridoma into a tissue culture flask and culturing in a known serum-free medium, a known animal cell medium containing serum, etc. From supernatant or pristane (2,6,10,14-Tetramethyl pentadecane)
The hybridoma is inoculated into an animal such as a mouse pre-administered with, and the infusion solution obtained by in vivo culture is purified by a known method. That is, the obtained culture supernatant or biological exudate is purified by a biochemical method used for ordinary protein purification, for example, a salt precipitation method using ammonium sulfate, column chromatography and the like. The obtained monoclonal antibody is a uniform antibody that specifically binds to β-type dimer and is derived from a single clone, and is characterized by being derived from rat or mouse.

【００１９】以上のようにして得られたモノクロ−ナル
抗体は、次に示す理化学的性質を有している。 ラット由来のγグロブリンのIgG に属する。 IgG のIgG₁ サブクラスに属する。 Ｌ鎖として、κ鎖を有する。The monoclonal antibody obtained as described above has the following physicochemical properties. It belongs to rat gamma globulin IgG. It belongs to the IgG ₁ subclass of IgG. It has a κ chain as an L chain.

【００２０】以上のようにして調製されたモノクロ−ナ
ル抗体はＭ−ＣＳＦβ型ダイマ−に特異的に反応する
が、この発明においてはβ型ダイマ−以外のＭ−ＣＳＦ
に反応する抗体を使用することもできる。この発明の方
法に使用する診断薬を例示すれば、次のとおりである。
この発明の方法に使用する診断薬としては、ＥＩＡ(Enz
yme-Immuno Assay）試薬が望ましく、各試薬を一組のセ
ット（いわゆるキット）とするのが使用上便利であるた
め、以下キット化された試薬を例示して説明する。The monoclonal antibody prepared as described above specifically reacts with M-CSF β-type dimer, but in the present invention, M-CSF other than β-type dimer is used.
It is also possible to use an antibody that reacts with. Examples of the diagnostic agent used in the method of the present invention are as follows.
The diagnostic agent used in the method of the present invention includes EIA (Enz
yme-Immuno Assay) reagents are preferable, and it is convenient to use each reagent as a set (so-called kit). Therefore, the kitized reagents will be described below as an example.

【００２１】この発明の方法に使用する診断薬は、固定
化抗Ｍ−ＣＳＦ抗体（１次抗体）、抗Ｍ−ＣＳＦ抗体
（２次抗体）、酵素標識抗体（３次抗体）、活性測定用
基質、反応停止剤、検量線作成用標準品、および緩衝液
の７種の試薬から構成される。 固定化抗Ｍ−ＣＳＦ抗体 固定化抗Ｍ−ＣＳＦ抗体は、１次抗体として用いられる
抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を不溶性担体に固定化したものであ
る。不溶性担体としては、ビ−ズ、マイクロプレ−ト、
繊維等が例示できるが、マイクロプレ−トが望ましく、
特にポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン等の
透明な合成樹脂製の酵素免疫測定法用マイクロタイトレ
−ションプレ−トが好適である。The diagnostic agents used in the method of the present invention are immobilized anti-M-CSF antibody (primary antibody), anti-M-CSF antibody (secondary antibody), enzyme-labeled antibody (tertiary antibody), and for activity measurement. It consists of seven reagents: substrate, reaction terminator, standard for calibration curve, and buffer. Immobilized anti-M-CSF antibody The immobilized anti-M-CSF antibody is obtained by immobilizing an anti-M-CSF antibody used as a primary antibody on an insoluble carrier. Insoluble carriers include beads, microplates,
Although fibers and the like can be exemplified, a microplate is desirable,
In particular, a microtitration plate for enzyme immunoassay, which is made of a transparent synthetic resin such as polystyrene, polyethylene or polypropylene, is suitable.

【００２２】抗Ｍ−ＣＳＦ抗体（１次抗体）としては、
前記モノクロ−ナル抗体または公知の方法で得られたポ
リクロ−ナル抗体が使用できるが、ウサギ由来抗Ｍ−Ｃ
ＳＦ抗体が望ましい。公知の方法で得られるポリクロ−
ナル抗体は、具体的には精製Ｍ−ＣＳＦを適当な動物
（例えば、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、モルモット
等）に免疫して得た抗血清から、通常の蛋白の精製法に
より精製される。As the anti-M-CSF antibody (primary antibody),
The monoclonal antibody or the polyclonal antibody obtained by a known method can be used, but rabbit-derived anti-MC
SF antibody is preferred. Polychlorine obtained by a known method
The null antibody is specifically purified from an antiserum obtained by immunizing an appropriate animal (eg, horse, sheep, goat, rabbit, guinea pig, etc.) with purified M-CSF by a conventional protein purification method. .

【００２３】固定化は次のようにして行われる。波長28
0nm で測定した吸光度により表わされる蛋白濃度が0.00
1 〜0.005 の範囲に抗体を溶解し、この溶液の適量、例
えば50〜100 μｌを容器に入れ、例えば０〜37℃で１〜
24時間静置し、希釈液を除去する。適量の洗浄液、例え
ば200 〜300 μｌを用い、望ましくは１〜３回洗浄す
る。洗浄液としては、蒸留水、生理食塩液、およびこれ
らに0.01〜1.0%のアルブミン、Tween-20を添加溶解した
液が使用できる。 抗Ｍ−ＣＳＦ抗体（２次抗体） ２次抗体として用いられる抗Ｍ−ＣＳＦ抗体は、１次抗
体が前記のモノクロ−ナル抗体であれば、公知の方法に
より得られるポリクロ−ナル抗体であり、１次抗体が公
知の方法により得られるポリクロ−ナル抗体であれば、
そのモノクロ−ナル抗体を用いることができるが、前記
のモノクロ−ナル抗体を用いるのが望ましい。 酵素標識抗体 酵素標識抗体は３次抗体として用いられる抗体に酵素を
標識したものである。標識用酵素はＥＩＡ試薬で通常用
いられる酵素、例えばパ−オキシダ−ゼ、アルカリフォ
スファタ−ゼ、β−Ｄ−ガラクトシダ−ゼ等が使用でき
るが、パ−オキシダ−ゼを用いるのが望ましい。３次抗
体は、２次抗体である抗Ｍ−ＣＳＦ抗体に対する抗体と
しての役割を有している。具体的には２次抗体と同種動
物に由来するイムノグロブリンに対する抗体であり、例
えば、２次抗体が前記のモノクロ−ナル抗体である場
合、３次抗体はラット由来イムノグロブリンに対する抗
体（抗ラット由来イムノグロブリン抗体）である。この
３次抗体は、公知の方法により次のようにして調製され
る。２次抗体と同種動物由来のイムノグロブリンを適当
な動物（例えば、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、モルモ
ット等。ただし、２次抗体とは由来が異なることが望ま
しい）に免疫し、得られた抗血清から精製されるが、ヤ
ギ由来のウサギイムノグロブリンに対する抗体を用いる
のが望ましい。標識方法は公知の方法であり、例えば、
Ｎ−サクシンイミジル３−（２´−ピリジルジチオ）プ
ロピオネ−トを用いる方法、グルタルアルデヒドを用い
る方法、Ｎ，Ｎ´−ο−フェニレンジマレイミドを用い
る方法等を例示することができる。 活性測定用基質 酵素活性測定用基質は、使用する標識用酵素の種類によ
って異なるが、当該酵素に適当した基質の粉末、錠剤ま
たは溶液であり、例えばパ−オキシダ−ゼにはＡＢＴＳ
と過酸化水素、ο−フェニレンジアミンと過酸化水素の
組合せ等、またアルカリフォスファタ−ゼにはフェニル
リン酸と４−アミノアンチピリンの組合せ等を例示する
ことができる。 反応停止剤 反応停止剤も使用する標識用酵素の種類により異なる
が、使用する酵素に適当した公知の反応停止剤を用いる
ことができる。 検量線作成用標準品 この発明の試薬に用いられる標準品は後述する検量線を
作成するために用いられるものであり、溶液または凍結
乾燥品からなっている。標準品は緩衝液に溶解して使用
し、測定する物質の濃度に合わせて４〜６段階の濃度に
小分けして検量線の作成に使用される。 緩衝液 この発明の試薬キットに使用される緩衝液は、抗原抗体
反応用、および標識用酵素の酵素活性測定用の２種類で
ある。抗原抗体反応用緩衝液は、特にｐＨが６〜９、塩
濃度が０. ０１〜０. ２Ｍ程度のものが好ましく、例え
ば０. １Ｍリン酸塩緩衝化生理食塩液、ｐＨ７. ０を例
示することができる。酵素活性測定用緩衝液は、標識用
酵素の種類により異なるが、通常前記の抗原抗体反応用
緩衝液を共用できる。標識用酵素の活性測定条件が、前
記の抗原抗体反応緩衝液の塩濃度、ｐＨと異なる場合に
限り、酵素活性測定用緩衝液を作成する。 ブロッキング剤 この発明の試薬キットには他にブロッキング剤として前
記の抗原抗体反応用緩衝液に０．２〜０．５％のＢＳ
Ａ等の蛋白質を溶解したものを用いる。ここにいう蛋白
質は、ＢＳＡ、ゼラチン等であり、特にＢＳＡに限定さ
れるものではない。Immobilization is performed as follows. Wavelength 28
The protein concentration expressed by the absorbance measured at 0 nm is 0.00
The antibody is dissolved in the range of 1 to 0.005, and an appropriate amount of this solution, for example, 50 to 100 μl, is placed in a container and, for example, 1 to 0 to 37 ° C.
Let stand for 24 hours and remove the diluent. An appropriate amount of washing solution, for example, 200 to 300 μl is used, and washing is preferably performed 1 to 3 times. As the washing solution, distilled water, physiological saline, and a solution obtained by adding 0.01 to 1.0% albumin and Tween-20 thereto and dissolving them can be used. Anti-M-CSF antibody (secondary antibody) The anti-M-CSF antibody used as the secondary antibody is a polyclonal antibody obtained by a known method if the primary antibody is the above-mentioned monoclonal antibody, If the primary antibody is a polyclonal antibody obtained by a known method,
Although the monoclonal antibody can be used, it is preferable to use the above-mentioned monoclonal antibody. Enzyme-labeled antibody The enzyme-labeled antibody is an antibody used as a tertiary antibody and labeled with an enzyme. As the labeling enzyme, an enzyme usually used in EIA reagents such as peroxidase, alkaline phosphatase, β-D-galactosidase and the like can be used, but peroxidase is preferably used. The tertiary antibody has a role as an antibody against the anti-M-CSF antibody which is the secondary antibody. Specifically, it is an antibody against immunoglobulin derived from the same species as the secondary antibody, for example, when the secondary antibody is the above-mentioned monoclonal antibody, the tertiary antibody is an antibody against immunoglobulin derived from rat (anti-rat-derived immunoglobulin). Immunoglobulin antibody). This tertiary antibody is prepared by a known method as follows. Antibodies obtained by immunizing a suitable animal (eg, horse, sheep, goat, rabbit, guinea pig, etc., preferably of different origin from the secondary antibody) with immunoglobulin derived from the same species as the secondary antibody Although purified from serum, it is preferable to use an antibody against rabbit immunoglobulin derived from goat. The labeling method is a known method, for example,
Examples thereof include a method using N-succinimidyl 3- (2'-pyridyldithio) propionate, a method using glutaraldehyde, and a method using N, N'-o-phenylenedimaleimide. Substrate for measuring activity The substrate for measuring enzyme activity varies depending on the type of labeling enzyme used, but is a powder, tablet or solution of a substrate suitable for the enzyme. For example, ABTS for peroxidase is used.
And hydrogen peroxide, the combination of o-phenylenediamine and hydrogen peroxide, and the alkaline phosphatase, for example, the combination of phenylphosphoric acid and 4-aminoantipyrine. Reaction Terminator Although a reaction terminator also varies depending on the type of labeling enzyme used, a known reaction terminator suitable for the enzyme used can be used. Standard product for preparing a calibration curve The standard product used for the reagent of the present invention is used for preparing a calibration curve described later, and is composed of a solution or a lyophilized product. The standard product is used by dissolving it in a buffer solution, and is divided into 4 to 6 levels of concentration according to the concentration of the substance to be measured and used for preparing a calibration curve. Buffer Solution The buffer solution used in the reagent kit of the present invention is of two types, one for the antigen-antibody reaction and the other for measuring the enzyme activity of the labeling enzyme. The antigen-antibody reaction buffer is preferably one having a pH of 6 to 9 and a salt concentration of about 0.01 to 0.2 M, for example, 0.1 M phosphate buffered saline, pH 7.0. be able to. The buffer solution for measuring enzyme activity varies depending on the type of the labeling enzyme, but usually the buffer solution for antigen-antibody reaction can be shared. The enzyme activity measurement buffer is prepared only when the labeling enzyme activity measurement conditions are different from the salt concentration and pH of the antigen-antibody reaction buffer. Blocking Agent In the reagent kit of the present invention, 0.2 to 0.5% of BS is added to the above-mentioned buffer solution for antigen-antibody reaction as a blocking agent.
A solution in which a protein such as A is dissolved is used. The protein referred to here is BSA, gelatin or the like, and is not particularly limited to BSA.

【００２４】この発明の方法に使用するリウマチ診断薬
の他の例を示せば次のとおりである。 ａ）固定化抗Ｍ−ＣＳＦ抗体（１次抗体） 前記に準じて調製する。 ｂ）ビオチン化抗Ｍ−ＣＳＦ抗体（２次抗体） ２次抗体として用いる抗体は、１次抗体が前記のモノク
ローナル抗体である場合は公知の方法で得られるポリク
ロ−ナル抗体、または１次抗体が公知の方法で得られる
ポリクロ−ナル抗体である場合はそのモノクローナル抗
体であり、いずれの場合においても公知の方法でビオチ
ンを結合させる。具体的には、ＮＨＳ−ＬＣビオチン等
をＤＭＳＯ等を用いて反応させ、抗体に結合させる。 ｃ）酵素標識抗体 ビオチンと反応させるアビジンには、公知の方法で酵素
を標識する。標識する酵素は、パーオキシダーゼ、アル
カリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダ−ゼ等を
例示することができ、特にパーオキシダーゼが望まし
い。 ｄ）活性測定用基質 前記に準じて調製する。 ｅ）反応停止液 前記に準じて調製する。 ｆ）検量線作成用標準品 前記に準じて調製する。 ｇ）緩衝液 この場合の診断薬に用いられる緩衝液は、抗原抗体反応
用、ビオチン・アビジン反応用、および標識酵素の酵素
活性測定用の３種類である。抗原抗体反応用、および標
識酵素の酵素活性測定用の緩衝液は、前記に準じて調
製される。ビオチン・アビジン反応用の緩衝液は、アビ
ジンが非特異的にビオチンと結合するため０. ０１〜
０. １％の蛋白質を含むｐＨ６〜９、０. ０１〜０. ２
Ｍの塩濃度が望ましく、例えば０. ０２％ＢＳＡを含む
０. １Ｍリン酸塩緩衝化生理食塩液（ｐＨ７. ０）を例
示することができる。緩衝液の蛋白質は、ＢＳＡ、ゼラ
チン等であり、特にＢＳＡに限定されるものではない。 ｈ）ブロッキング剤 前記に準じて作成する。Other examples of the rheumatoid diagnostic agent used in the method of the present invention are as follows. a) Immobilized anti-M-CSF antibody (primary antibody) Prepared according to the above. b) Biotinylated anti-M-CSF antibody (secondary antibody) When the primary antibody is the above-mentioned monoclonal antibody, a polyclonal antibody obtained by a known method or a primary antibody is used as the secondary antibody. In the case of a polyclonal antibody obtained by a known method, the monoclonal antibody is used, and in any case, biotin is bound by a known method. Specifically, NHS-LC biotin or the like is reacted with DMSO or the like to bind to the antibody. c) Enzyme-labeled antibody Avidin to be reacted with biotin is labeled with an enzyme by a known method. Examples of the enzyme to be labeled include peroxidase, alkaline phosphatase, β-D-galactosidase and the like, and peroxidase is particularly preferable. d) Substrate for activity measurement Prepare according to the above. e) Reaction stop solution Prepared according to the above. f) Standard product for preparing calibration curve Prepare according to the above. g) Buffer Solution In this case, there are three buffer solutions used for the diagnostic agent, one for antigen-antibody reaction, one for biotin-avidin reaction, and one for measuring enzyme activity of labeling enzyme. The buffer solution for the antigen-antibody reaction and for measuring the enzyme activity of the labeling enzyme is prepared according to the above. The buffer solution for the biotin-avidin reaction is 0.01- because avidin binds to biotin nonspecifically.
PH 6-9 containing 0.01% protein, 0.01-0.2
A salt concentration of M is desirable, and a 0.1 M phosphate buffered physiological saline solution (pH 7.0) containing 0.02% BSA can be exemplified. The protein of the buffer solution is BSA, gelatin or the like, and is not particularly limited to BSA. h) Blocking agent Prepared according to the above.

【００２５】以上のようにしてこの発明の方法に使用す
る診断薬は調製され、次に記載するように試料に含まれ
るＭ−ＣＳＦの定量に使用される。この発明の方法を具
体的に例示すれば、次のとおりである。関節炎を起こし
ている患者の関節から採取された関節液を、遠心分離
（たとえば２０００ｒｐｍで１５分間）し、細胞画分を
沈殿させて除去する。この検体は、Ｍ−ＣＳＦ含量測定
時まで−７０℃で保存することも可能である。−７０℃
で凍結保存した場合は関節液を融解し、凍結保存しない
場合はそのまま、検体にヒアルロニダ−ゼ（EC 4.2.2.
1）等のヒアルロン酸を消化することのできる酵素を、
使用する酵素の最適条件で作用させる。ヒアルロン酸を
消化することのできる酵素は、他には例えばコンドロイ
チナ−ゼACII等を例示できる。また、ヒアルロン酸の除
去には酵素的方法ばかりではなく、物理的な方法、例え
ば分子量分画、ｐＨ分画等、ヒアルロン酸のみを除去す
ることが可能な方法を適用することもできる。ヒアルロ
ン酸を除去した検体を、−７０℃で保存することも可能
である。The diagnostic agent used in the method of the present invention is prepared as described above and used for the determination of M-CSF contained in the sample as described below. A concrete example of the method of the present invention is as follows. The synovial fluid collected from the joint of a patient with arthritis is centrifuged (for example, 15 minutes at 2000 rpm) to precipitate and remove the cell fraction. This sample can be stored at -70 ° C until the M-CSF content is measured. -70 ° C
If cryopreserved, the synovial fluid will be thawed.If not cryopreserved, the sample will be used as it is for hyaluronidase (EC 4.2.2.
1) etc., an enzyme that can digest hyaluronic acid,
It works under the optimum conditions of the enzyme used. Other examples of the enzyme capable of digesting hyaluronic acid include chondroitinase ACII and the like. Moreover, not only an enzymatic method but also a physical method such as a molecular weight fractionation or a pH fractionation, which can remove only hyaluronic acid, can be applied to remove hyaluronic acid. It is also possible to store the specimen from which hyaluronic acid has been removed at -70 ° C.

【００２６】以上の前処理を行った後、Ｍ−ＣＳＦ含量
を例えばＥＬＩＳＡ法等により次のようにして定量する
ことができる。抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を吸着させたプラスチ
ックプレ−トまたはプラスチックビ−ズに、ヒアルロン
酸を除去した検体を反応させる（１次反応）。ここで使
用する抗体は、Ｍ−ＣＳＦに特異的な抗体であれば、ポ
リクロ−ナル抗体でも、モノクロ−ナル抗体でもよい。After the above pretreatment, the M-CSF content can be quantified as follows by, for example, the ELISA method. A specimen from which hyaluronic acid has been removed is reacted with a plastic plate or plastic beads on which anti-M-CSF antibody has been adsorbed (first reaction). The antibody used here may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody as long as it is an antibody specific to M-CSF.

【００２７】検体のＭ−ＣＳＦと抗体を十分に反応させ
た後、１次反応とは異なる抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を反応させ
る（２次反応）。ここで使用する抗体は、１次反応と同
様にＭ−ＣＳＦに特異的な抗体であれば、ポリクロ−ナ
ル抗体でもモノクロ−ナル抗体でもよい。次に、２次反
応で使用した抗体に対する標識抗体を反応させる。ここ
でいう標識抗体は、酵素標識、蛍光標識、放射性標識等
であり、２次反応で使用する抗体を直接標識することに
より、一層簡便な測定も可能である。最終的には、標識
を検出することにより、検体中のＭ−ＣＳＦを測定する
ことができる。たとえば標識が酵素であった場合は、そ
れに対応する基質を使用し、光学的に濃度を判定するこ
とが可能である。具体例を挙げれば、例えば標識酵素が
ホ−ス・ラディッシュ・ペルオキシダ−ゼ（Horse Radd
ish Peroxidase）であった場合は、この酵素に対する基
質としてオルト・フェニレン・ジアミン、２，２´−ア
ジノ・ビス−３−エチルベンズチアゾリン−６−サルフ
ォニック・アシッドを用いて発色させ、それぞれ492nm
および414nm の吸光値を測定することが可能である。After sufficiently reacting the sample M-CSF with the antibody, an anti-M-CSF antibody different from the primary reaction is reacted (secondary reaction). The antibody used here may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody as long as it is an antibody specific to M-CSF as in the first reaction. Next, a labeled antibody against the antibody used in the secondary reaction is reacted. The labeled antibody referred to here is an enzyme label, a fluorescent label, a radioactive label, or the like, and more direct measurement is possible by directly labeling the antibody used in the secondary reaction. Finally, by detecting the label, M-CSF in the sample can be measured. For example, when the label is an enzyme, it is possible to determine the concentration optically by using the corresponding substrate. As a specific example, for example, the labeling enzyme may be horse radish peroxidase (Horse Radd).
ish peroxidase), color was developed using ortho-phenylene diamine and 2,2'-azino bis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid as substrates for this enzyme, each at 492 nm.
And it is possible to measure the absorbance value at 414 nm.

【００２８】他の標識酵素を例示すれば、アルカリフォ
スファタ−ゼ、βガラクトシダ−ゼ等があるが、これら
に限定されるものではない。また、抗体をビオチン標識
し、のちに酵素を結合させたアビジンを反応させること
も可能である。この場合は、アビジン・ビオチンの複合
体のスケ−ルを大きくすることにより、感度をさらに上
昇させることが可能である。Examples of other labeling enzymes include, but are not limited to, alkaline phosphatase and β-galactosidase. It is also possible to label the antibody with biotin and then react with avidin to which an enzyme has been bound. In this case, the sensitivity can be further increased by increasing the scale of the avidin-biotin complex.

【００２９】また蛍光標識または放射性（同位元素）標
識の場合は、それに対応する機器を用いて、直接標識を
測定することが可能である。蛍光標識を例示すれば、フ
ルオレセイン・イソチオシアネ−ト（４９２ｎｍの吸収
極大と５２０ｎｍの蛍光発光）、テトラメチル・ロ−ダ
ミン・イソチオシアネ−ト（５５４ｎｍの吸収極大と５
７３ｎｍの蛍光発光）等があるが、これらに限定される
ものではない。放射性（同位元素）標識の例としては、
現在使用されているのは、ヨウ素（¹²⁵ Ｉ）が一般的で
あるが、水素（³ Ｈ）、炭素（¹⁴Ｃ）等を使用すること
も可能である。In the case of a fluorescent label or a radioactive (isotope) label, it is possible to directly measure the label by using a corresponding device. Examples of the fluorescent label include fluorescein isothiocyanate (absorption maximum at 492 nm and fluorescence emission at 520 nm), tetramethyl rhodamine isothiocyanate (absorption maximum at 554 nm and 5).
73 nm fluorescence emission) and the like, but are not limited thereto. Examples of radioactive (isotope) labeling include:
Currently, iodine ( ¹²⁵ I) is generally used, but hydrogen ( ³ H), carbon ( ¹⁴ C) and the like can also be used.

【００３０】免疫学的な定量方法は前記ＥＬＩＳＡ法に
限定されるものではなく、この他にも例えばラテック
ス、金コロイドを用いた半定量的な抗原抗体反応等が適
用可能であり、予めラテックス粒子または金コロイド試
薬を一定量のＭ−ＣＳＦと反応する量の抗体で感作し、
未知量のＭ−ＣＳＦの含まれる検体を作用させて、一定
量以上のＭ−ＣＳＦがその検体中に含まれるか否かを検
出することもできる。The immunological quantification method is not limited to the above-mentioned ELISA method, but other than this, for example, a semi-quantitative antigen-antibody reaction using latex or gold colloid can be applied, and latex particles can be used in advance. Alternatively, a gold colloid reagent is sensitized with an amount of antibody that reacts with a certain amount of M-CSF,
It is also possible to act on a sample containing an unknown amount of M-CSF to detect whether a certain amount or more of M-CSF is contained in the sample.

【００３１】次に試験例を示してこの発明の作用効果を
詳しく説明する。 試験例１ この試験は、ヒアルロニダ−ゼによる関節液の消化処理
の効果を調べるために行った。 １）試験方法 骨髄液中のヒアルロン酸の消化法（日本生化学会編、
「新生化学実験講座第３巻、糖質II：プロテオグリカン
とグリコサミノグリカン」、東京化学同人、第１７８ペ
−ジ、１９９１年）を参考として次のように関節液を処
理した。Next, the function and effect of the present invention will be described in detail with reference to test examples. Test Example 1 This test was conducted to examine the effect of digestive treatment of synovial fluid with hyaluronidase. 1) Test method Digestion method of hyaluronic acid in bone marrow fluid (ed.
The synovial fluid was treated as follows with reference to "Newborn Chemistry Experimental Course Volume 3, Carbohydrate II: Proteoglycans and Glycosaminoglycans", Tokyo Kagaku Dojin, p. 178, 1991).

【００３２】関節液５００μｌに５ＴＲＵのヒアルロニ
ダ−ゼ（生化学工業社製）を加え、ｐＨを調製するため
に酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５. ８２）２００μｌお
よび超純粋水２５０μｌ加え、被験試料の最終濃度を初
期濃度の１／２に調整し、５５℃で２時間反応させた。
ヒアルロニダ−ゼで消化した関節液を２分し（それぞれ
消化１および消化２と記載する）、人為的にヒトＭ−Ｃ
ＳＦ（森永乳業社製）０. ６３〜０. ５ｎｇ／ｍｌを添
加し、その液中のＭ−ＣＳＦをELISA 法を用いて定量し
た。なお、ヒアルロニダ−ゼ消化前の関節液も２分し
（それぞれ無処理１および無処理２と記載する）、同様
に定量し、ヒアルロニダ−ゼ消化による効果を試験し
た。 ２）結果 この試験の結果は表１に示したとおりである。この処理
により、肉眼的に関節液の粘凋性がほとんど認められな
くなった。さらに無処理１および無処理２の場合は、ヒ
トＭ−ＣＳＦの回収率が−２７〜２２％（重量。以下特
に断りのない限り同じ）であるのに対して、消化１およ
び消化２の場合には、その回収率は８３〜１１３％と顕
著に高い値を示した。従って、関節液のヒアルロニダ−
ゼ消化がＭ−ＣＳＦの定量に有効であることが判明し
た。5 TRU hyaluronidase (manufactured by Seikagaku Corporation) was added to 500 μl of synovial fluid, 200 μl of sodium acetate buffer (pH 5.82) and 250 μl of ultrapure water were added to adjust the pH, and the final concentration of the test sample was adjusted. Was adjusted to ½ of the initial concentration and reacted at 55 ° C. for 2 hours.
The joint fluid digested with hyaluronidase was divided into two parts (referred to as digestion 1 and digestion 2 respectively), and human MC
SF (Morinaga Milk Industry Co., Ltd.) 0.63 to 0.5 ng / ml was added, and M-CSF in the solution was quantified using an ELISA method. The synovial fluid before digestion with hyaluronidase was also divided into 2 parts (referred to as untreated 1 and untreated 2 respectively), quantified in the same manner, and the effect of digestion with hyaluronidase was tested. 2) Results The results of this test are shown in Table 1. By this treatment, the viscous nature of the synovial fluid was hardly recognized with the naked eye. Further, in the case of untreated 1 and untreated 2, the recovery rate of human M-CSF is -27 to 22% (weight, the same applies hereafter unless otherwise specified), whereas in the case of digested 1 and 2 The recovery rate was 83 to 113%, which was a remarkably high value. Therefore, the hyaluronida in the synovial fluid
Zea digestion was found to be effective in quantifying M-CSF.

【００３３】[0033]

【表１】 [Table 1]

【００３４】試験例２ この試験は、ヒアルロニダ−ゼによる消化がヒトＭ−Ｃ
ＳＦにあたえる影響を調べるために行った。酢酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ５. ８２）にヒトＭ−ＣＳＦ（森永乳
業社製）を添加し、試験例１と同一の方法によりヒアル
ロニダ−ゼで消化し、ゲル濾過クロマトグラフィ−を行
い、さらにそれを抗原抗体反応を用いた方法にて検出し
た。Test Example 2 In this test, human MC was digested with hyaluronidase.
It was done to investigate the influence given to SF. Human M-CSF (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd.) was added to a sodium acetate buffer (pH 5.82), digested with hyaluronidase in the same manner as in Test Example 1, gel filtration chromatography was performed, and the antigen was further analyzed. It was detected by a method using an antibody reaction.

【００３５】その結果は図１に示したとおりである。図
１は、ヒアルロニダ−ゼで消化したヒトＭ−ＣＳＦのゲ
ル濾過クロマトグラフィ−による溶出曲線であり、図の
縦軸は吸光度、横軸はフラクション番号を示し、図中−
○−は、酵素処理を行ったＭ−ＣＳＦを、−●−は酵素
処理を行っていないＭ−ＣＳＦを示す。図１から明らか
なように、両曲線は実質的に一致しており、ヒアルロニ
ダ−ゼ消化がヒトＭ−ＣＳＦの分子量にも抗原性にも影
響を及ぼさないことが判明した。 試験例３ この試験は、ヒアルロニダ−ゼで消化した関節液の抗Ｍ
−ＣＳＦポリクロ−ナル抗体を利用したＭ−ＣＳＦ含量
の定量性を調べるために行った。 １）試料 リウマチ患者７例、変形性関節炎患者２例および健常人
１例の関節液を用いた。 ２）試験方法 関節液は、試験例１と同一の方法により処理した。家兎
に免疫して得られた抗Ｍ−ＣＳＦポリクロ−ナル抗体を
１μｇ／ｍｌの濃度に調整して抗原抗体反応用プラスチ
ックプレ−ト（ヌンク社製）に吸着させ、非特異反応を
避けるために０. ５％ゼラチン（バイオラッド社製）で
抗体が結合していない部分のプラスチック表面をコ−ト
した。次いで試験例１と同一の方法でヒアルロニダ−ゼ
消化した関節液を加え、第１次の抗原抗体反応を行っ
た。のちビオチンを標識した抗Ｍ−ＣＳＦポリクロ−ナ
ル抗体を加え、第２次の抗原抗体反応を行い、さらにホ
−ス・ラディッシュ・ペルオキシダ−ゼ（Horse Raddis
h Peroxidase）処理したストレプトアビジン（サイメド
社製）を反応させ、ホース・ラディッシ・ペルオキシダ
−ゼに対応する基質として２，２´−アジノ・ビス−３
−エチルベンズチアゾリン−６−サルフォニック・アシ
ッド（ケーピーエル社製）を加えて発色させ、その吸光
値をＥＩＡリ−ダ−（バイオ・ラッド社製。モデル２５
５０）を用いて測定した。The results are shown in FIG. FIG. 1 is an elution curve of human M-CSF digested with hyaluronidase by gel filtration chromatography, in which the vertical axis represents absorbance and the horizontal axis represents fraction number.
◯ -indicates M-CSF treated with the enzyme, and- ● -represents M-CSF not treated with the enzyme. As is clear from FIG. 1, both curves were substantially in agreement, and it was revealed that the hyaluronidase digestion did not affect the molecular weight or antigenicity of human M-CSF. Test Example 3 In this test, anti-M of synovial fluid digested with hyaluronidase was tested.
It was carried out in order to investigate the quantification of the M-CSF content using the -CSF polyclonal antibody. 1) Samples The synovial fluids of 7 rheumatoid arthritis patients, 2 osteoarthritis patients and 1 healthy subject were used. 2) Test method The synovial fluid was treated in the same manner as in Test Example 1. In order to avoid non-specific reaction, the anti-M-CSF polyclonal antibody obtained by immunizing a rabbit was adjusted to a concentration of 1 μg / ml and adsorbed on a plastic plate for antigen-antibody reaction (Nunc) Then, the surface of the plastic to which the antibody was not bound was coated with 0.5% gelatin (manufactured by Bio-Rad). Then, the same method as in Test Example 1 was used to add hyaluronidase-digested synovial fluid to carry out the first antigen-antibody reaction. After that, an anti-M-CSF polyclonal antibody labeled with biotin was added to carry out a second antigen-antibody reaction, and then horseradish peroxidase (Horse Raddis
h Peroxidase) treated streptavidin (manufactured by Cymed) is reacted, and 2,2'-azino bis-3 is used as a substrate corresponding to horse radissi peroxidase.
-Ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid (manufactured by KPL) was added for color development, and the absorption value was measured by EIA reader (manufactured by Bio-Rad. Model 25).
50).

【００３６】これとは別に種々の濃度に調整したヒトＭ
−ＣＳＦ（森永乳業社製）を用いて同様の方法により検
量線を作成した。各検体から得られた吸光値から検量線
を用いて、関節液に含まれるＭ−ＣＳＦ量を計算した。 ３）結果 この試験の結果、リウマチ患者の関節液のＭ−ＣＳＦ含
量の平均値は、１８５８ｐｇ／ｍｌであるのに対して、
変形性関節炎患者および健常人の関節液のＭ−ＣＳＦ含
量の平均値は、７８６ｐｇ／ｍｌであり、リウマチ患者
の関節液のＭ−ＣＳＦ含量は、変形性関節炎患者および
健常人の関節液のＭ−ＣＳＦ含量よりも顕著に高い値を
示した。従って、この発明の方法は、関節液のＭ−ＣＳ
Ｆ含量を正確、かつ迅速に定量することが可能であり、
リウマチ患者の診断に応用することができる。 試験例４ この試験は、ヒアルロニダ−ゼ消化した関節液の抗Ｍ−
ＣＳＦモノクロ−ナル抗体を利用したＭ−ＣＳＦ含量の
定量性を調べるために行った。 １）試料 試験例３とは別のリウマチ患者１０例、変形性関節炎患
者２例および健常人１例の関節液を用いた。 ２）試験方法 関節液は、試験例１と同一の方法により処理した。前記
先願と同一の抗Ｍ−ＣＳＦモノクロ−ナル抗体を１μｇ
／ｍｌの濃度に調整し、抗原抗体反応用プラスチックプ
レ−ト（ヌンク社製）に吸着させ、非特異反応を避ける
ために０. ５％ゼラチン（バイオラッド社製）で抗体が
結合していない部分のプラスチック表面をコ−トした。
次いで、ヒアルロニダ−ゼ処理した関節液を加え、第１
次の抗原抗体反応を行い、のち家兎から得た抗Ｍ−ＣＳ
Ｆポリクロ−ナル抗体を加え、第２次の抗原抗体反応を
行い、さらにホ−ス・ラディッシュ・ペルオキシダ−ゼ
（Horse Raddish Peroxidase）処理したポリクロ−ナル
抗体（生化学工業社製）に対する抗体を加え、ホ−ス・
ラディッシュ・ペルオキシダ−ゼに対応する基質として
Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラメチル・ベンチジン（ケー
ピーエル社製）を加えて発色させ、その吸光値をＥＩＡ
リ−ダ−（バイオ・ラッド社製。モデル２５５０）を用
いて測定した。Separately, human M adjusted to various concentrations
-A calibration curve was prepared by the same method using CSF (Morinaga Milk Industry Co., Ltd.). The amount of M-CSF contained in the synovial fluid was calculated from the absorption value obtained from each sample using a calibration curve. 3) Results As a result of this test, the mean value of M-CSF content in the synovial fluid of rheumatoid patients was 1858 pg / ml, whereas
The mean value of M-CSF content of synovial fluid of patients with osteoarthritis and healthy people was 786 pg / ml, and the M-CSF content of synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis was M of CSF of osteoarthritis patients and healthy people. It was significantly higher than the -CSF content. Therefore, the method of the present invention can be applied to synovial fluid M-CS.
It is possible to quantify F content accurately and quickly,
It can be applied to the diagnosis of rheumatic patients. Test Example 4 In this test, anti-M-of hyaluronidase-digested synovial fluid was used.
It was carried out to examine the quantitativeness of M-CSF content using CSF monoclonal antibody. 1) Samples The synovial fluids of 10 rheumatism patients, 2 osteoarthritis patients and 1 healthy subject different from those in Test Example 3 were used. 2) Test method The synovial fluid was treated in the same manner as in Test Example 1. 1 μg of the same anti-M-CSF monoclonal antibody as in the previous application
The concentration is adjusted to / ml and adsorbed on a plastic plate for antigen-antibody reaction (Nunc), and the antibody is not bound with 0.5% gelatin (Bio-Rad) to avoid nonspecific reaction. The plastic surface of the part was coated.
Then, hyaluronidase-treated synovial fluid is added to
Anti-M-CS obtained from a rabbit after performing the following antigen-antibody reaction
F Polyclonal antibody was added to carry out a second antigen-antibody reaction, and an antibody against a polyclonal antibody (manufactured by Seikagaku Corp.) which had been treated with horse radish peroxidase (Horse Raddish Peroxidase) was added. , Hose
N, N, N ', N'-tetramethyl benzidine (manufactured by KPL Co., Ltd.) was added as a substrate corresponding to radish peroxidase to develop color, and the absorption value thereof was measured by EIA.
It was measured using a reader (manufactured by Bio-Rad, model 2550).

【００３７】これとは別に種々の濃度に調整したヒトＭ
−ＣＳＦ（森永乳業社製）を用いて同様の方法により検
量線を作成した。各検体から得られた吸光値から検量線
を用いて、関節液に含まれるＭ−ＣＳＦ量を計算した。 ３）試験結果 この試験の結果は、図２に示したとおりである。図２は
ヒト関節液に含まれるＭ−ＣＳＦ含量の定量値の分布で
あり、縦軸および横軸はＭ−ＣＳＦ濃度および試料群を
示し、図中○および●は、各々、リウマチ患者由来の関
節液、および変形性関節炎患者および正常人由来の関節
液のＭ−ＣＳＦ含量を示す。Separately from this, human M adjusted to various concentrations
-A calibration curve was prepared by the same method using CSF (Morinaga Milk Industry Co., Ltd.). The amount of M-CSF contained in the synovial fluid was calculated from the absorption value obtained from each sample using a calibration curve. 3) Test result The result of this test is as shown in FIG. FIG. 2 is a distribution of quantitative values of M-CSF content contained in human synovial fluid, where the vertical and horizontal axes represent M-CSF concentration and sample group, and ○ and ● in the figure are derived from rheumatoid patients, respectively. 5 shows the M-CSF content of synovial fluid and synovial fluid from patients with osteoarthritis and normals.

【００３８】図２から明らかなようにリウマチ患者の関
節液のＭ−ＣＳＦ含量は、変形性関節炎患者および健常
人の関節のＭ−ＣＳＦ含量よりも顕著に高い値を示し
た。従って、この発明の方法は、関節液のＭ−ＣＳＦ含
量を正確、かつ迅速に定量することが可能であり、リウ
マチ患者の診断に応用することができる。次に実施例を
示してこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、
この発明は以下の実施例に限定されるものではない。As is clear from FIG. 2, the M-CSF content of the synovial fluid of rheumatoid patients was significantly higher than the M-CSF contents of the joints of osteoarthritis patients and healthy subjects. Therefore, the method of the present invention can accurately and rapidly quantify the M-CSF content of synovial fluid, and can be applied to the diagnosis of rheumatic patients. Next, the present invention will be described in more detail and specifically with reference to Examples.
The present invention is not limited to the examples below.

【００３９】[0039]

【実施例】【Example】

実施例１ 関節炎患者１４名および健常人１名の膝関節から採取さ
れた関節液を、遠心分離（２，０００ｒｐｍで１０分
間）して細胞画分を沈殿除去し、−７０℃で凍結保存し
て検体とした（なお、検体は番号のみを付して採取源が
分からないようにした）。凍結保存した各検体を室温で
融解し、その一部について関節液１容量に１／１０容量
のヒアルロニダ−ゼ（生化学工業社製）溶液（１００Ｔ
ＲＵ／ｍｌ）を加え、さらにｐＨ調整のための２／５容
量の酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．８２）および１／
２容量の超純水を加え、５５℃で２時間反応させ、のち
-70℃で保存した。Example 1 The synovial fluid collected from the knee joints of 14 arthritis patients and 1 healthy subject was centrifuged (2,000 rpm for 10 minutes) to precipitate and remove the cell fraction, and stored frozen at -70 ° C. The samples were designated as samples (note that the samples were numbered only so that the collection source was unknown). Each cryopreserved sample was thawed at room temperature, and a part thereof was mixed with 1 volume of synovial fluid by 1/10 volume of hyaluronidase (manufactured by Seikagaku Corporation) (100T).
RU / ml), and 2/5 volume of sodium acetate buffer (pH 5.82) and 1 /
Add 2 volumes of ultrapure water and react at 55 ° C for 2 hours.
Stored at -70 ° C.

【００４０】ＥＬＩＳＡ用プラスチック・プレ−ト（ヌ
ンク社製。442404）に前記先願の方法と同一の方法によ
り製造した抗Ｍ−ＣＳＦモノクロ−ナル抗体を１μｇ／
ｍｌの濃度に調整して吸着させ、４℃で一晩放置した。
次に、非特異反応を防ぐために０．５％の濃度のゼラチ
ンをプラスチック・プレ−トの抗体が吸着していない部
分に吸着させた。この状態で、37℃で1 時間放置した。
このプラスチック・プレ−ト上に、前記各検体を生理食
塩水にて希釈して添加し、３７℃で２時間放置した。そ
の後、家兎にヒトＭ−ＣＳＦを免疫して得られた抗Ｍ−
ＣＳＦポリクロ−ナル抗体を１μｇ／ｍｌに調整し、３
７℃で１時間放置し、ホ−ス・ラディッシュ・ペルオキ
シダ−ゼ（Horse Raddish Peroxidase）の結合した抗ウ
サギＩｇＧ（生化学工業社製）を適宜希釈して、３７℃
で１時間放置した。ホース・ラディッシュ・ペルオキシ
ダ−ゼに反応させる基質としては、Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´
−テトラメチル・ベンチジン（ケーピーエル社製）を室
温で３０分作用させ、吸光値をＥＩＡリーダー（バイオ
ラッド社製。モデル２５５０）を用いて測定した。An anti-M-CSF monoclonal antibody produced by the same method as that of the above-mentioned prior application was added to a plastic plate for ELISA (Nunc Co., Ltd. 442404) at 1 μg /
It was adjusted to a concentration of ml and adsorbed, and left at 4 ° C. overnight.
Next, in order to prevent non-specific reaction, gelatin at a concentration of 0.5% was adsorbed on the portion of the plastic plate where the antibody was not adsorbed. In this state, it was left at 37 ° C for 1 hour.
The samples were diluted with physiological saline and added to the plastic plate, and the mixture was left at 37 ° C. for 2 hours. After that, anti-M-obtained by immunizing rabbits with human M-CSF
Adjust the CSF polyclonal antibody to 1 μg / ml and
The mixture was allowed to stand at 7 ° C for 1 hour, diluted appropriately with anti-rabbit IgG (manufactured by Seikagaku Corporation) to which horse radish peroxidase (Horse Raddish Peroxidase) was bound, and then 37 ° C.
Left for 1 hour. Substrates to react with horse radish peroxidase include N, N, N ', N'
-Tetramethyl benzidine (manufactured by KPL) was allowed to act for 30 minutes at room temperature, and the absorbance value was measured using an EIA reader (manufactured by Bio-Rad, model 2550).

【００４１】これとは別に種々の濃度に調整したヒトＭ
−ＣＳＦ（森永乳業社製）を用いて同様の方法により検
量線を作成した。各検体から得られた吸光値から検量線
を用いて、関節液に含まれるＭ−ＣＳＦ量を計算した。
その結果、関節液に含まれるＭ−ＣＳＦ量は、１１検体
において８７２〜２９９２ｐｇ／ｍｌ、３検体において
５８３〜８４６ｐｇ／ｍｌ、１検体において５１５ｐｇ
／ｍｌであり、１１検体がリウマチ患者、３検体が変形
性関節炎患者、１検体が健常人から採取された関節液で
あると推定された。Separately from this, human M adjusted to various concentrations
-A calibration curve was prepared by the same method using CSF (Morinaga Milk Industry Co., Ltd.). The amount of M-CSF contained in the synovial fluid was calculated from the absorption value obtained from each sample using a calibration curve.
As a result, the amount of M-CSF contained in the synovial fluid was 872 to 2992 pg / ml in 11 samples, 583 to 846 pg / ml in 3 samples, and 515 pg in 1 sample.
It was estimated that 11 samples were rheumatoid arthritis patients, 3 samples were osteoarthritis patients, and 1 sample was synovial fluid collected from healthy people.

【００４２】この結果は、専門の医師による総合的診察
に基づく診断結果と一致していた。 実施例２ ＥＬＩＳＡ法による測定のためのプレートの調製後、実
施例１の残部の検体を用いて実施例１を反復した。その
結果、検体の前処理からＭ−ＣＳＦ含量の算出まで、１
５検体で約７時間を要し、迅速にＭ−ＣＳＦ含量を定量
することができた。 実施例３ ＥＬＩＳＡ法を次のように行ったことを除き、実施例１
と同一の方法により、実施例１とは別の１０検体のＭ−
ＣＳＦ含量を定量した。家兎に免疫して得られた抗Ｍ−
ＣＳＦポリクロ−ナル抗体を１μｇ／ｍｌの濃度に調整
して抗原抗体反応用プラスチックプレ−ト（ヌンク社
製）に吸着させ、非特異反応を避けるために０. ５％ゼ
ラチン（バイオラッド社製）で抗体が結合していない部
分のプラスチック表面をコ−トした。次いで試験例１と
同一の方法でヒアルロニダ−ゼ消化した関節液を加え、
第１次の抗原抗体反応を行った。のちビオチンを標識し
た抗Ｍ−ＣＳＦポリクロ−ナル抗体を加え、第２次の抗
原抗体反応を行い、さらにホ−ス・ラディッシュ・ペル
オキシダ−ゼ（Horse RaddishPeroxidase）処理したス
トレプトアビジン（サイメド社製）を反応させ、ホース
・ラディッシュ・ペルオキシダーゼに対応する基質とし
て２，２´−アジノ・ビス−３−エチルベンズチアゾリ
ン−６−サルフォニック・アシッド（ケーピーエル社
製）を加え、発色させた。This result was in agreement with the diagnostic result based on the comprehensive examination by a specialist doctor. Example 2 After the plate was prepared for measurement by the ELISA method, Example 1 was repeated using the remaining sample of Example 1. As a result, from sample pretreatment to calculation of M-CSF content, 1
It took about 7 hours with 5 samples, and the M-CSF content could be quantified rapidly. Example 3 Example 1 except that the ELISA method was performed as follows.
By the same method as in Example 1, 10 samples of M-
The CSF content was quantified. Anti-M-obtained by immunizing rabbits
The CSF polyclonal antibody was adjusted to a concentration of 1 μg / ml and adsorbed on an antigen-antibody reaction plastic plate (Nunc), and 0.5% gelatin (Bio-Rad) was used to avoid nonspecific reaction. The surface of the plastic not coated with the antibody was coated with. Then, in the same manner as in Test Example 1, hyaluronidase-digested synovial fluid was added,
The first antigen-antibody reaction was performed. After that, a biotin-labeled anti-M-CSF polyclonal antibody was added, a second antigen-antibody reaction was performed, and horseradish peroxidase (Horse Raddish Peroxidase) -treated streptavidin (manufactured by Cymed) was added. The reaction was carried out, and 2,2'-azino bis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid (manufactured by KPL Co.) was added as a substrate corresponding to horse radish peroxidase to develop color.

【００４３】その結果、関節液に含まれるＭ−ＣＳＦ量
は、７検体において１２６１〜３１８６ｐｇ／ｍｌ、３
検体において７０８〜１０２６ｐｇ／ｍｌであり、７検
体がリウマチ患者、３検体が変形性関節炎患者から採取
された関節液であると推定された。この結果は、専門の
医師による総合的診察に基づく診断結果と一致してい
た。As a result, the amount of M-CSF contained in the synovial fluid was determined to be 1263 to 1186 pg / ml and 3 in 7 samples.
It was estimated to be 708 to 1026 pg / ml in the sample, and 7 samples were synovial fluid collected from rheumatoid arthritis patients and 3 samples from osteoarthritis patients. This result was consistent with the diagnosis based on comprehensive examination by a specialist doctor.

【００４４】[0044]

【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この発明に
よって、ヒト関節液のＭ−ＣＳＦを迅速、正確、高感度
で定量することのできる免疫学的測定法が提供され、そ
の結果、リウマチ疾患を客観的かつ正確に診断すること
が可能となる。INDUSTRIAL APPLICABILITY As described above in detail, the present invention provides an immunological assay method capable of quantifying M-CSF in human joint fluid rapidly, accurately, and with high sensitivity. As a result, rheumatic diseases can be prevented. It is possible to make an objective and accurate diagnosis.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】ヒアルロニダ−ゼで消化したヒト関節液Ｍ−Ｃ
ＳＦのゲル濾過クロマトグラフィ−による溶出曲線であ
る。FIG. 1 Human synovial fluid M-C digested with hyaluronidase
It is an elution curve by SF gel filtration chromatography.

【図２】ヒト関節液に含まれるＭ−ＣＳＦ含量の定量値
の分布である。FIG. 2 is a distribution of quantitative values of M-CSF content contained in human joint fluid.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 素本 友紀 神奈川県横浜市旭区中希望ケ丘50 ウェル ストンビレッジ204 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (72) Inventor Yuki Motomoto 50 Well Stone Village 204, Nakagigaoka, Asahi-ku, Yokohama-shi, Kanagawa

Claims (3)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 ヒアルロン酸を除去したヒト関節液に含
まれる単球マクロファージコロニー刺激因子を、単球マ
クロファージコロニー刺激因子に特異的に反応する抗体
と反応させて免疫学的に測定するリウマチ疾患の診断方
法。1. A rheumatoid disease which is immunologically measured by reacting a monocyte-macrophage colony-stimulating factor contained in human synovial fluid from which hyaluronic acid has been removed with an antibody that specifically reacts with the monocyte-macrophage colony-stimulating factor. Diagnostic method. 【請求項２】 単球マクロファージコロニー刺激因子に
特異的に反応する抗体が、ハイブリドーマMO9106（微工
研条寄第3662号）の産生するモノクロ−ナル抗体である
請求項１のリウマチ疾患の診断方法。2. The method for diagnosing rheumatic disease according to claim 1, wherein the antibody specifically reacting with the monocyte macrophage colony stimulating factor is a monoclonal antibody produced by the hybridoma MO9106 (Microtech Lab. No. 3662). . 【請求項３】 ヒアルロン酸の除去が、ヒアルロニダー
ゼによる消化である請求項１のリウマチ疾患の診断方
法。3. The method for diagnosing rheumatic diseases according to claim 1, wherein the removal of hyaluronic acid is digestion with hyaluronidase.