JPH06181768A - 新規プロモーターおよびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】ヒトＰＡＣＡＰ３８遺伝子発現におけるプロモ
ーターを見出し、該発現のメカニズム、ヒトＰＡＣＡＰ
３８あるいは他の蛋白質の製造を行なう。 【構成】ヒトのＤＮＡライブラリーから単離したヒトＰ
ＡＣＡＰ３８のゲノムＤＮＡにおいて、そのプロモータ
ー領域を決定した。 【効果】ヒトＰＡＣＡＰ３８のプロモーターを用いて神
経細胞特異的な蛋白質効率よく生産、探索することが可
能と成った。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規プロモーター、詳し
くは神経細胞特異的な蛋白質、具体的には精巣あるいは
脳の視床下部由来の生理活性を有するペプチドであるヒ
トＰＡＣＡＰ３８のプロモーターＤＮＡ、該プロモータ
ーＤＮＡを含有するＤＮＡ、該ＤＮＡを保持する形質転
換体および該形質転換体を用いプロモーター活性を利用
する成熟ＰＡＣＡＰ３８を含む種々の蛋白質の製造方法
に関するものである。

【０００２】本明細書においてプロモーターとは、ＲＮ
Ａポリメラーゼが結合し、ＲＮＡの転写の開始のシグナ
ルとなるＤＮＡの領域を指す。

【０００３】

【従来の技術】脳の視床下部、下垂体から分泌されるホ
ルモンには種々のものが知られている。甲状腺刺激ホル
モン放出ホルモン（Thyrotropin releasing hormone)や
黄体形成ホルモン放出ホルモン(Luteinizing hormone r
eleasing hormone)、ソマトスタチン(Somatostatin)、
副腎皮質刺激ホルモン（Adrenocorticotropic hormon
e)、成長ホルモン(Growth hormone)、プロラクチン(Pro
lactin)などがその例で、これらの作用については従来
よく研究されている。一方、これ以外の新しい視床下部
由来の生理活性のある物質が、ヒツジ脳下垂体からアデ
ニレート サイクラーゼ アクティヴィティ(adenylate c
yclase activity)を指標にして探求された結果、それま
でには報告されていない、３８個のアミノ酸残基からな
るペプチドが発見され、その構造も決定され、このもの
はＰＡＣＡＰ３８と命名された（ヨーロッパ特許公開0
404 652号）。本発明者等はヒトのＰＡＣＡＰ３８のｃ
ＤＮＡを精巣のｃＤＮＡライブラリーからクローニング
し、その塩基配列及びアミノ酸配列を明らかにしている
（特願平１−２５９９２４）。またヒトのＰＡＣＡＰ３
８のゲノムＤＮＡを白血球由来ＤＮＡライブラリーから
クローニングし、その塩基配列及びアミノ酸配列を明ら
かにしている（特願平３−２００２３２号）。ヒトのＰ
ＡＣＡＰ３８に相当するアミノ酸配列はヒツジと同一で
あるが、その前駆体においてはアミノ酸の置換がある。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】動物細胞が産生してい
る蛋白質には、それをコードする遺伝子が存在するが、
蛋白質のｍＲＮＡはその遺伝子の上流にあるプロモータ
ーと呼ばれる領域が何らかの因子により活性化され、そ
の蛋白をコードするｍＲＮＡを合成する。このプロモー
ター領域の活性化には種々の因子が報告されており、ま
たその蛋白を特異的に発現している細胞に特異性を持つ
場合が多い。ヒトのＰＡＣＡＰは視床下部で特異的に産
生されている神経細胞が分泌する蛋白質である。そこで
上記の知見に鑑み、このＰＡＣＡＰのプロモーターを利
用するならば、神経細胞特異的な物質を産生し、利用す
ることが可能であると考えられる。本発明者等はこのヒ
トＰＡＣＡＰのプロモーター領域を決定し、神経細胞で
特異的に生産される物質の製造に利用できる方法を明ら
かにした。即ち、ＰＡＣＡＰ等の神経細胞（星状膠細胞
など）で特異的に発現する蛋白質をコードするｃＤＮＡ
を本発明のプロモーターの下流に結合した発現ベクター
を構築した後に、たとえば培養した星状膠細胞（アスト
ロサイト）などの細胞に取り込ませ、星状膠細胞で該蛋
白質を生産させることができる。さらには、星状膠細胞
での物質生産、その細胞の分化、形態変化、細胞生存維
持の神経科学的な研究にも利用することができる。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らはヒトＰＡＣ
ＡＰ３８遺伝子発現のメカニズムとその誘導の方法を開
発すべく種々研究の結果、ＰＡＣＡＰ３８のゲノムＤＮ
Ａ(Genomic ＤＮＡ）をヒトのＤＮＡライブラリーから
単離し、その塩基配列を決定することに成功し、これに
基き遺伝子組換え技術を用いることによりヒトＰＡＣＡ
Ｐ３８の誘導を可能とした。更に今回、本発明者らはヒ
トＰＡＣＡＰ３８の遺伝子をクローニングし構造決定す
ることにより、先にクローン化したヒトＰＡＣＡＰ３８
のｃＤＮＡとの構造を比較することによって、イントロ
ンとエクソンの関係を明らかにすると共に、同時に該遺
伝子発現に必須のプロモーター領域を決定することに成
功し、本発明に到達したものである。即ち、本発明は新
規プロモーター、詳しくはヒトＰＡＣＡＰ３８のプロモ
ーターＤＮＡ、該プロモーターＤＮＡを含有するＤＮ
Ａ、該ＤＮＡを保持する形質転換体および該形質転換体
を用いプロモーター活性を利用する成熟ＰＡＣＡＰ３８
を含む種々の蛋白質の製造方法に関するものである。

【０００６】本発明のヒトＰＡＣＡＰ３８遺伝子のプロ
モーター活性を有する領域を含有するＤＮＡは、ヒトＤ
ＮＡライブラリーから次のようにして得ることができ
る。（ｉ）ヒト細胞ＤＮＡを抽出し、ＥｃｏＲＩ，Ｓａ
ｌＩなどの制限酵素処理ＤＮＡをファージＤＮＡまたは
プラスミドに組み込み、（ii）得られた組み換えファー
ジまたはプラスミドで宿主を形質転換し、（iii）得ら
れた形質転換体を培養後、形質転換体から適当な方法、
例えばＰＡＣＡＰ３８の一部をコードするＤＮＡプロー
ブとのハイブリダイゼーションにより、目的とするＤＮ
Ａを含有するファージあるいはプラスミドを単離し、
（iv）その組み換えＤＮＡから目的とするクローン化Ｄ
ＮＡを切り出す。ヒトＤＮＡライブラリーからＰＡＣＡ
Ｐ３８ＤＮＡをクローニングする方法としては、例えば
ファージベクターλgt11やＥＭＢＬ３とＰＡＣＡＰ３８
のアミノ酸配列に基づいて化学合成したオリゴヌクレオ
チドあるいはＰＡＣＡＰ３８のｃＤＮＡをプローブとし
て用いたプラークハイブリダイゼーション法〔ティー・
マニアティス(T.Maniatis)ら，モレキュラー・クローニ
ング(Molecular Cloning)コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laborator
y),(1982)〕などが挙げられる。このようにしてクロー
ン化されたＰＡＣＡＰ３８ＤＮＡは必要があればプラス
ミド、例えばｐＢＲ322, ｐＵＣ12, ｐＵＣ13, ｐＵＣ1
8, ｐＵＣ19, ｐＵＣ118，ｐＵＣ119などにサブクロー
ニングしてヒトＰＡＣＡＰ３８ ＤＮＡを得ることがで
きる。

【０００７】このようにして得られたＤＮＡの塩基配列
を、たとえばマキサム・ギルバート(Maxam-Gilbert)法
〔Maxam, A. M. and Gilbert, w.,プロシーディングズ
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス・オブ・ザ・ユー・エス・エー(Proc. Natl. Acad. S
ci.,U.S.A.),74,560(1977)〕あるいはジデオキシ法〔Me
ssing, J. ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nuc
leic Acids Research)9,309(1981)〕によって決定し、
既知のアミノ酸配列との比較からヒトＰＡＣＡＰ３８
ＤＮＡの存在を確認する。以上のようにして、ヒトＰＡ
ＣＡＰ３８の前駆体たんぱくをコードするＤＮＡを含有
するＤＮＡ（図２）（配列番号：1）が得られる。後述
の実施例１で得られたヒトＰＡＣＡＰ３８の前駆体たん
ぱくをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡの制限酵素断
片地図を図１に示す。またジデオキシ法で決定したｃＤ
ＮＡの塩基配列と、その塩基配列から判明したアミノ酸
配列を図２に示す。上記のようにしてクローン化された
ヒトＰＡＣＡＰ３８の前駆体たんぱくをコードするＤＮ
Ａと、先にクローン化したヒトＰＡＣＡＰ３８のｃＤＮ
Ａとの構造を比較することによって、イントロンとエク
ソンの関係を明らかにすると共に、同時に該遺伝子発現
に必須のプロモーター領域を推定した。そしてこの推定
されたヒトＰＡＣＡＰ３８プロモーターをカバーする部
分からプロモーターとして必須の部分の塩基配列を決定
したものである。該プロモーターとしては、具体的には
配列番号２の塩基配列を有するＤＮＡを含有する領域を
用いることができる。該プロモーターは実施例３で得ら
れた形質転換体エシェリキア コリ（Escherichia col
i) ＭＶ１１８４／ｐＨＰＲ１０ｎｅｏ（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−４０８４）から入手できるｐＨＰＲ１０ｎｅｏから
実施例３の方法に従って得ることができる。また、市販
のＤＮＡ合成装置〔例えば、アプライド・バイオシステ
ムズ (Applied Biosystems) 社製〕を用いて、そのプロ
トコールに従って、フォスフォアミダイドによって本発
明のプロモーターの塩基配列を有するＤＮＡを合成する
こともできる。

【０００８】ＤＮＡを組み込むプラスミドとしては、た
とえば大腸菌由来のpＢＲ322〔ジーン（gene),2,95(197
7)〕，pＢＲ325〔ジーン,4,121(1978)〕，pＵＣ12〔ジ
ーン,19,,259(1982)〕，pＵＣ13〔ジーン,19,259(198
2)〕、枯草菌由来のpＵＢ110〔バイオケミカル・バイオ
フィジカル・リサーチ・コミュニケーョン(Biochemical
and Biophysical Research Communication),112,678(1
983)〕などが挙げられるが、その他のものであっても、
宿主内で複製増殖されるものであれば、いずれをも用い
ることができる。またＤＮＡを組み込むファージベクタ
ーとしては、たとえばλgt11〔ヤング及びデーヴィス(Y
oung, R., and Davis, R.,)プロシーディングズ・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オ
ブ・ザ・ユー・エス・エー(Proc. Natl. Acad. Sci.,U.
S.A.),80,1194(1983)〕や、ＥＭＢＬ３〔Prischaufら、
ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J．M
ol．Biol．）170,827(1983)〕などが挙げられるが、そ
の他のものであっても宿主内で増殖できるものであれば
用いることができる。プラスミドに組み込む方法として
は、たとえば、ティー・マニアティス(T.Maniatis)ら，
モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning) コー
ルド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spr
ing Harbor Laboratory),第239頁(1982)に記載の方法な
どが挙げられる。またファージベクターにＤＮＡを組み
込む方法としては、たとえばヒューン（Hyunh,T.V.)ら
の方法〔ディー・エヌ・エー クローニング ア プラクテ
ィカル アプローチ(DNA Cloning, A Practical Approac
h)１，49(1985)〕などが挙げられる。

【０００９】このようにして得られたプラスミドは、適
当な宿主たとえばエシェリキア(Escherichia)属菌，バ
チルス(Bacillus)属菌などに導入する。上記エシェリキ
ア属菌の例としては、エシェリキア・コリ(Escherichia
coli)Ｋ12ＤＨ1〔プロシージング・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Aca
d. Sci. U.S.A.)60,160(1968)〕，Ｍ103〔ヌクレイック
・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research),9,309
(1981)〕,ＪＡ221〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・
バイオロジー(Journal of Molecular Biology),120,517
(1978)〕，ＨＢ101〔ジャーナル・オブ・モレキュラー
・バイオロジー 41, 459(1969)〕,Ｃ600〔ジェネティッ
クス(Genetics),39,440(1954)〕などが挙げられる。上
記バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サチリス
(Bacillus subtilis)ＭＩ114〔ジーン，24,255(198
3)〕，207−21〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリ
ー(Journal of Biochemistry)95,87(1984)〕などが挙げ
られる。プラスミドで宿主を形質転換する方法として
は、たとえばティー・マニアティス(T．Maniatis)ら，モ
レキュラー・クローニング(Molecular Cloning),コール
ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring
Harbor Laboratory)，第249頁(1982)に記載のカルシウ
ムクロライド法あるいはカルシウムクロライド／ルビジ
ウムクロライド法などが挙げられる。またファージ・ベ
クターを用いる場合には、たとえば増殖させた大腸菌に
インビトロパッケージング法を用いて導入することがで
きる。

【００１０】本発明方法におけるヒトＰＡＣＡＰ３８の
前駆体たんぱくまたは成熟ＰＡＣＡＰ３８をはじめとす
る種々の蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡを
含有する発現型ベクターは、例えば、（ｉ）ヒト細胞Ｄ
ＮＡを抽出し、ＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩなどの制限酵素処
理ＤＮＡをファージＤＮＡまたはプラスミドに組み込
み、（ii）得られた組み換えファージまたはプラスミド
で宿主を形質転換し、（iii）得られた形質転換体を培
養後、形質転換体から適当な方法、例えばＰＡＣＡＰ３
８の一部をコードするＤＮＡプローブとのハイブリダイ
ゼーションにより、目的とするＤＮＡを含有するファー
ジあるいはプラスミドを単離し、（iv）その組み換えＤ
ＮＡから目的とするクローン化ＤＮＡを切り出し、
（ｖ）該クローン化ＤＮＡまたはその一部を発現ベクタ
ー中のプロモーターの下流に連結する、ことにより製造
することができる。ＰＡＣＡＰ３８ＤＮＡ以外の発現し
得る蛋白質としては、神経細胞由来の蛋白質、即ち Neu
ro Growth factor（ＮＧＦ）、Brain Derived Neurotro
phin−3（ＢＤＮＴ−３）等が挙げられる。

【００１１】発現させたい構造遺伝子を得る際の、ＤＮ
Ａを組み込むプラスミド、プラスミドへの組み込み方
法、宿主、宿主を形質転換する方法等については、上記
のヒトＰＡＣＡＰ３８およびそのプロモーターの遺伝子
決定を行なう際に用いられるものが全て用いることがで
きる。このようにしてクローン化されたＤＮＡから発現
させたい領域を切り出し、発現に適したビークル（ベク
ター）中のプロモーターの下流に連結して発現型ベクタ
ーを得ることができる。該ＤＮＡはその５’末端に翻訳
開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端には翻
訳終止コドンとしてのＴＡＡ，ＴＧＡまたはＴＡＧを有
していてもよい。さらにこの５’末端のＡＴＧの上流に
はサイクリックＡＭＰに反応するconsensus配列などが
みとめられる。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コド
ンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加するこ
ともできる。

【００１２】ベクターとしては、上記の大腸菌由来のプ
ラスミド（例、pＢＲ322，pＢＲ325，pＵＣ12，pＵＣ1
3)，枯草菌由来プラスミド(例、pＵＢ110，pＴＰ５，p
Ｃ194)，酵母由来プラスミド(例、pＳＨ19，pＳＨ15)，
あるいはλファージなどのバクテリオファージおよびレ
トロウィルス、ワクシニアウィルスなどの動物ウィルス
などが挙げられる。プロモーターとしては、本発明のプ
ロモーター、具体的には配列番号２の塩基配列を有する
ＤＮＡを含有する領域を用いることができる。該プロモ
ーターは実施例３で得られた形質転換体エシェリキア
コリ（Escherichia coli) ＭＶ１１８４／ｐＨＰＲ１０
ｎｅｏ（ＦＥＲＭ ＢＰ−４０８４）から入手できる
ｐＨＰＲ１０ｎｅｏから実施例３の方法に従って得るこ
とができる。なお、発現にエンハンサーの利用も効果的
である。

【００１３】このようにして構築されたヒトＰＡＣＡＰ
３８の前駆体たんぱくや成熟ペプチドＰＡＣＡＰ３８あ
るいはその他の蛋白質をコードするＤＮＡを含有するベ
クターを用いて、形質転換体を製造する。形質転換体の
宿主としては、たとえば上記のようなエシェリキア(Esc
herichia)属菌，バチルス(Bacillus)属菌の他、動物細
胞が用いられる。

【００１４】動物細胞としては、たとえばサル細胞ＣＯ
Ｓ−７,Ｖｅｒｏ,チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ，
マウスＬ細胞，ヒトＦＬ細胞，ヒト神経細胞１ＭＲ−３
２などが挙げられる。上記エシェリキア属菌を形質転換
するには、たとえばプロシージングス・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natｌ.A
cad.Sci.USA),69,2110(1972)やジーン,17,107(1982)な
どに記載の方法に従って行なわれる。動物細胞を形質転
換するには、たとえばヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ）５２，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行
なわれる。このようにして、ヒトＰＡＣＡＰ３８の前駆
体たんぱくや成熟ペプチド（ＰＡＣＡＰ３８）やその他
の蛋白質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで
形質転換された形質転換体が得られる。該形質転換体の
培養により目的とする蛋白質あるいはペプチドを発現、
製造する。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。宿主が動
物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、
たとえば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地
〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）１２２，５０１（１９
５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー(Virology),8,3
96(1959)〕，ＲＰＭＩ１６４０培地〔ジャーナル・オブ
・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（Th
e Jounal of the American Medical Association) 199,
519(1967)〕,１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソ
サイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン
（Pro-ceeding of the Society for the Biological Me
dicine)73, 1 (1950)〕などが挙げられる。ｐＨは約６
〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃
で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加
える。

【００１５】培養物中に蓄積された遺伝子産物は、当分
野における通常の方法、たとえばザイモリエース（キリ
ンビール株式会社製）など溶菌酵素を用いる方法、ガラ
スビーズを用いる機械的破砕法などによって菌体を破砕
して目的物を抽出する。なお必要により、トリトン−Ｘ
１００などの界面活性剤や塩酸グアニジンなどの蛋白変
性剤を加え、目的物の抽出を容易にすることもできる。
このようにして得られた抽出液からの目的物の分離精製
は、通常知られている蛋白質の精製方法、たとえば、沈
殿剤による沈殿法、透析法、電気泳動法、イオン交換樹
脂などによるクロマトグラフ法、ゲルろ過法、抗体カラ
ムを用いる方法などを組み合せて行うことができる。こ
の精製法の具体例としては、例えばＰＡＣＡＰの製造に
ついてはバイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・
リサーチ・コミュニケーションズ（Biochemical And Bi
ophysical Research Communications），Vol. 164，No.
１，ｐ．567〜274（1989）に記載の方法が用いられ、そ
の他の蛋白質についても同様の方法あるいはそれに準じ
る方法で精製することができる。

【００１６】

【作用】本発明のプロモーターを用いた系により神経細
胞特異的な蛋白質を発現、あるいは神経細胞特異的な蛋
白質の探索を行なうことができ、またＰＡＣＡＰ遺伝子
の誘導物質（化学物質）を使用して、例えばサンドイッ
チＥＩＡ法を用いてＰＡＣＡＰの産生量を知ることがで
きる。またこの実験系を使用することにより、ＰＡＣＡ
Ｐの産生に必要な化学物質（薬剤）の検索が可能であ
る。これを実験動物で使用することにより、その作用、
特に脳の機能に関する研究、特にホルモン類による脳機
能の理解に応用し、さらにこれらの知見はヒトの脳機能
の解明に役立つ知見をもたらすものである。そして、ヒ
トＰＡＣＡＰ３８は、ＰＡＣＡＰ２７を含めてｃＡＭＰ
の上昇活性があることから、ヒト脳神経の成長、維持等
に関して、治療薬として利用することができる。以上、
ヒトＰＡＣＡＰ３８をコードするＤＮＡのクローニン
グ、プロモーター活性発現ベクターの作製と、それらに
よる形質転換体の製造、該形質転換体を用いたヒトＰＡ
ＣＡＰ３８の一部および成熟ペプチドあるいは他の蛋白
質の製造及びその有用性等について詳細に述べた。

【００１７】本発明明細書および図面において、塩基や
アミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵ
Ｂ Commision on Biochemical Nomenclature による略
号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体
があり得る場合は、特に明示しなければＬ−体を示すも
のとする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム ＢＨＡ ：ベンツヒドリルアミン Ｃｌ−Ｚ：２-クロロ-ベンジルオキシカルボニル Ｂｒ−Ｚ：２-ブロモ-ベンジルオキシカルボニル Ｂｚｌ ：ベンジル ＯＢｚｌ：ベンジルエステル ＨＯＢｔ：１−ベンゾトリアゾール ＤＣＣ ：Ｎ，Ｎ’ジシクロヘキシルカルボジイミド ＧｌｙまたはＧ ：グリシン ＡｌａまたはＡ ：アラニン ＶａｌまたはＶ ：バリン ＬｅｕまたはＬ ：ロイシン ＩｌｅまたはＩ ：イソロイシン ＳｅｒまたはＳ ：セリン ＴｈｒまたはＴ ：スレオニン ＣｙｓまたはＣ ：システイン ＭｅｔまたはＭ ：メチオニン ＧｌｕまたはＥ ：グルタミン酸 ＡｓｐまたはＤ ：アスパラギン酸 ＬｙｓまたはＫ ：リジン ＡｒｇまたはＲ ：アルギニン ＨｉｓまたはＨ ：ヒスチジン ＰｈｅまたはＦ ：フェニールアラニン ＴｙｒまたはＹ ：チロシン ＴｒｐまたはＷ ：トリプトファン ＰｒｏまたはＰ ：プロリン ＡｓｎまたはＮ ：アスパラギン ＧｌｎまたはＱ ：グルタミン なお、本発明のヒト・ＰＡＣＡＰ３８前駆体蛋白や成熟
ペプチドにおいては、そのアミノ酸配列の一部が修飾
（付加、除去、その他のアミノ酸への置換など）されて
いてもよい。

【００１８】

【実施例】以下の参考例および実施例により本発明をよ
り具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるも
のではない。後述の実施例３で得られた形質転換体エシ
ェリキア コリ（Escherichia coli) ＭＶ１１８４／ｐ
ＨＰＲ１０ ｎｅｏは、平成４年１１月２６日に通商産
業省工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）にブダ
ペスト条約に基く寄託として受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−
４０８４として寄託されている。

【００１９】

【参考例１】ヒトとヒツジのＰＡＣＡＰ３８のアミノ酸
配列は同一であるが、ヒツジ視床下部から精製したＰＡ
ＣＡＰ３８(Nat.38p)と合成ＰＡＣＡＰ３８(Syn.38p)を
ラット下垂体細胞にin vitro で作用させるとAdenylate
cyclase activity の上昇が認められる。有効最少量は
１０~¹²Ｍで濃度が高くなるにつれて、その活性を高ま
ることが示された。また合成の２７−ＮＨ₂（図２のア
ミノ酸132〜158番目、次表のＳyn．27p-NH₂）にも同様
な活性を認められた。それに反して合成ブタＶＩＰ(vas
oactive intestinal polypeptide)にはそれ相当の活性
は認められなかった。結果を表１に示す。 表１ ラット脳下垂体細胞培養におけるAdenylate cyclase 刺激試験 cAMP pモル/ml(M±SEM) 実験１ Syn.pVIP 10~¹² M 1.35±0.05 pVIP 10~¹¹ M 1.40±0.00 pVIP 10~¹⁰ M 1.45±0.15 pVIP 10~⁹ M 1.75±0.05 pVIP 10~⁸ M 2.55±0.25 pVIP 10~⁷ M 3.30±0.20 対照（ブランク） 1.55±0.15 実験２ Syn.27p-NH₂ 10~¹² M 2.05±0.15 27p-NH₂ 10~¹¹ M 2.55±0.15 27p-NH₂ 10~¹⁰ M 4.00±0.20 27p-NH₂ 10~⁹ M 7.90±0.30 27p-NH₂ 10~⁸ M 9.20±0.00 27p-NH₂ 10~⁷ M 9.20±0.20 Syn.38p 10~¹² M 2.15±0.05 38p 10~¹¹ M 3.05±0.35 38p 10~¹⁰ M 4.60±0.20 38p 10~⁹ M 6.20±0.10 38p 10~⁸ M 8.60±0.20 38p 10~⁷ M 8.70±0.20 Nat.38p 10~¹² M 1.50±0.10 38p 10~¹¹ M 1.75±0.05 38p 10~¹⁰ M 2.60±0.10 38p 10~⁹ M 4.60±0.00 38p 10~⁸ M 8.05±0.35 対照（ブランク） 1.35±0.05 。

【００２０】

【参考例２】参考例１で用いた物質をラット下垂体細胞
に同様に作用させたところ、そこでのプロラクチン（Ｐ
ＲＬ）、ＡＣＴＨ、ＧＨの放出活性も確認された。

【００２１】

【実施例１】 ヒトＰＡＣＡＰ３８のｃＤＮＡプローブ
の作製 クローン化したヒトＰＡＣＡＰ３８のｃＤＮＡを³²Ｐ−
ｄＣＴＰを用いたランダムプライム法でラベルし、ヒト
ゲノムＤＮＡライブラリのスクリーニングに用いた。

【００２２】

【実施例２】ヒト・ＰＡＣＡＰゲノムＤＮＡの単離とそ
の塩基配列の決定 大腸菌ＬＥ３９２にヒト白血球由来ＤＮＡライブラリー
(Clontech Laboratories, Inc. 製 カタログ No.ＨＬ10
06ｄ)を感染させてプレーティングし、ファージプラー
クを出現せしめた。ベントンとデイビス(Benton, W., D
avis, R.)の報告〔サイエンス(Science) 196, 180-182
(1977)〕に従ってプラークＤＮＡの一部をニトロセルロ
ース膜にうつしとり、³²Ｐで標識した前項のｃＤＮＡプ
ローブとプラークハイブリダイゼーションを行なった。
ハイブリダイゼーションは、ホルムアミド非存在下、60
℃で行なった。ハイブリダイゼーション陽性のクローン
を単離し、そのうちのひとつであるλＨＧＰ２３のｃＤ
ＮＡ部分をＳａｌＩで切り出してプラスミドｐＵＣ 18
のＳａｌＩ部位にリクローニングし、プラスミドｐＨＧ
Ｐ２３１２，ｐＨＧＰ２３０６を作製した。このプラス
ミドで大腸菌ＭＶ１１８４を形質転換し、形質転換体エ
シェリキア・コリＭＶ１１８４／ｐＨＧＰ２３１２とｐ
ＨＧＰ２３０６を得た。このプラスミドに含まれるＤＮ
Ａ部分は１１．１Ｋbpと６Ｋbpであり、その簡単な制限
酵素地図を図１に示した。図１中、黒く塗られた部分は
ヒトＰＡＣＡＰ３８成熟体コード域である。このＤＮＡ
部分の塩基配列をサンガー（Sanger）の方法〔プロシー
ジング オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエン
ス（ Proc.Nat.Acad.Sci.USA）74,5463-5467（1977）〕
によって決定した。この塩基配列を図２に示した。アミ
ノ酸番号１３２から１６９の領域が、ヒトＰＡＣＡＰ３
８成熟ペプチド部である。図２中、7539〜7649塩基まで
が第１エクソンで下段のアミノ酸Ｍ（１）〜Ｒ（37）ま
でをコードする。（ ）はアミノ酸Ｎｏを示す。9813〜
9944までが第２エクソンでアミノ酸Ｐ(38)〜Ｒ(81)まで
をコードする。10420〜10518までが第３エクソンでアミ
ノ酸Ｄ(82)〜Ｇ(114)までをコードする。11601〜11787
までが第４エクソンでアミノ酸Ｇ(115)〜Ｌ(176)までを
コードする。ヒトＰＡＣＡＰ３８の前駆体は１７６個の
アミノ酸から成ることがゲノムＤＮＡの解析から明らか
にされた。

【００２３】

【実施例３】クローン化したヒトＰＡＣＡＰのｇｅｎｏ
ｍｉｃ ＤＮＡの５’領域を組み込んだプラスミドｐＨ
ＧＰ２３１２からＥｃｏＲＩとＥｃｏ４７IIIで切り出
した２．５ＫｂのＤＮＡ断片（４６４６〜７１５９塩
基）をｐｕｃ１１８のＥｃｏＲＩとＳｍａＩの部位に組
み込んだ。次いで、ＳＶ４０のターミネーター５１９ｂ
ｐ（〜０．５２Ｋｂｐ）を上記のｐｌａｓｍｉｄのＢａ
ｍＨＩ，ＳａｌＩ部位に組み込んだ、次いでクロラムフ
ェニコールトランスフェラーゼのｇｅｎｅを上記プラス
ミドのＢａｍＨＩ部位に組み込んだ。次いで、上記のプ
ラスミドにチミヂンカイネースのプロモーターにネオマ
イシン抵抗性遺伝子・ｐｏｌｙＡシグナルを持つＤＮＡ
断片（ストラトジーン社Ｕ．Ｓ．Ａ．のｐＭＣＩｎｅ
ｏ．ｐｏｌｙＡ）をＳａｌＩ部位に結合して図３のプラ
スミドを構築した。図３には２．５ＫｂのＰＡＣＡＰ
ｇｅｎｅを組み込んだものを示す。ＰＡＣＡＰのｇｅｎ
ｅがそれぞれ２．２Ｋｂ，１．５Ｋｂ，１Ｋｂの長さを
有するｐｌａｓｍｉｄを持つプラスミドをｐＨＰＲ２２
ｎｅｏ，ｐＨＰＲ１５ｎｅｏ，ｐＨＰＲ１０ｎｅｏとし
た。これらの精製したプラスミド５０μｇを直径９ｃｍ
のシャーレに増殖させたＩＭＲ−３２細胞にリン酸カル
シウム法（Ｇｒａｈａｍ，ＰＬ１９７３，Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ５２，４５６−４５７）でかけ、０．５ｍｇ／ｍｌ
のＧ４１８を含むＥａｇｌｅｓ’ＭＥＭ（ＥＭＥＭ）培
地（血清１０％含有）で培養して、生き残ってくる細胞
をさらに培養して、ＣＡＴアッセイに使用した。ＣＡＴ
ａｓｓａｙの方法はＧｏｒｍａｎ等の方法〔モレキュ
ラー・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂ
ｉｏｌ．）２，１０４４〜）に従った。それぞれのプラ
スミドをＩＭＲ−３２細胞にかけた後、その細胞内に産
生されたＣＡＴを測定したのが図４である。ＰＡＣＡＰ
の２．５Ｋｂから１．０ＫｂのＤＮＡ断片を組み込んだ
プラスミドにＣＡＴを産生することが明らかになった。
その中でも１Ｋｂの断片を持つプラスミドの活性が最高
でありヒトＰＡＣＡＰの遺伝子上のプロモーターは先に
クローン化した１７Ｋｂの塩基番号６１４３〜７１５９
塩基の中にあることがわかる。さらに短くしたＰＡＣＡ
Ｐ ｇｅｎｅを組み込んだｐｌａｓｍｉｄを構築し、Ｉ
ＭＲ−３２細胞にかけてＣＡＴを測定すると図５に示し
たとおりｐＨＰＲｎｅｏ６．６（６５７ｂｐ ６５０３
〜７１５９塩基）（配列番号：２）のプラスミドに最高
の活性が認められた。この結果から少なくともＰＡＣＡ
ＰｇｅｎｅのＥｃｏＲＩからＥｃｏ４７IIIの領域（４
６４４〜７１５９）の中にプロモーター領域がある。こ
れらの結果からヒト、ＰＡＣＡＰｇｅｎｅのプロモータ
ー領域が推定され、これらのプロモーターを利用して、
神経細胞を使用した発現系が利用できる。

【００２４】

【００２５】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：17041 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源： 生物名：ヒト白血球 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：7539・・7649 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：CDS 存在位置：9813・・9944 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：CDS 存在位置：10420・・10518 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：CDS 存在位置：11601・・11787 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：mature peptide 存在位置：11653・・11766 特徴を決定した方法：S GATCACGAGG TCACGAGATC GAGACCATCC TGGCCAACAT GGTGAAACCC CATCTCTACT 60 AAAAATACAA AAAATAGCTG GGCATGGTGG CCCATGCCTG TAGTCCCAGC TACTCGGGAG 120 GCTGAGGCAG GAGAATTGCT TAAACCCGGG AAGCGGAGGT TGCAGTGAGC CAAGATCGCA 180 CCACTGCCTC CCAGCCTGGT GATGGAGTGA GACTCCATCT CAAAAAAAAA AAAAAAAAAT 240 TCCTAGAGAA AATAAATATG CCAGTATAAC ATATTATAGT CATTAAGACT GTCTGGAGTC 300 ATTGAGACTT GAATCTGAAG TTCAGCATTA CAATGTAGCA GCTGTGTAAC TTTGGATAAG 360 GTACCTGAGC TCTTTTAGTC CCGATTTCTT GTCTGTAAAA TGGAGGTAAT AACAGTGCCT 420 ACAAAGAAGT TTGTTGTGAG GGAAAGGAAA TAAGTAGTCA AGCACTTAGC CCAGGAAGTG 480 TTCATTAAAC AGTTGTTGCT GTTGCTGTTA TTCACTGGTG AATAACAAAA CCATACAGTC 540 CCTTTGGAAG GAAGGATTTA AAATAATTTA AACAAATAAT CACTAAAAAT TTCAACCAGT 600 ACATTTATGA CAAATGTAAT AGTATTCCAA GCAGATGATA GTTTTTAAAA ATTTATGCCT 660 GTGTATATTT GGGTAGAGAC AAAGGATTAT TTAAAAAGTA TTTTCAGGTT GGGCACACTG 720 GCTCATCCTT GCAACCCCTG CACTTTGGGA GGCTTGAGTC CAGGAGTTTG TGACCAGCCT 780 GGGCAACACA GGGAGACCTT GTCTCTGCAA AGTAATAATA ATAACAATAA TAATAAATAA 840 AATTAGCCAG GCATGGTGGT GGCATGTGCC TGTAGTCCCA GGTATTCAAG AGGTTGAGGC 900 AGGAGTCTCA CTTAAGCCCA AGAGTTTGAG GTTGCTGTGA GCTATGAATG CACTACTGCA 960 CTCCAGCCTG GGTGACCGAG GAAGACTCAG TAAAAACAAA ACAAAACAAA CAAACAAACA 1020 AAAACTGCAA AGCCGTGATT ACCATACAGT GCTAGTAATA ATGATAATAA AAACAAAGGC 1080 TCCAAAATTA TTACATGTAA ACCTATATTC ACAGGTAGAT AATGCCAAGC CTGAGCCCAA 1140 AGGGAAGAGG GATGCTAGGG GCTCACAGAG GAAGACCTTC TTTTGATTTT ACACACAAAA 1200 ACCTTGTTTT ATTTTGCATA TAGATTCCCC TTCCAACATT TTCTGAAGTG GTCTCAAAAG 1260 CTTATTTAGG ATATTGGTTT TCCTGGATCC TGTCCAAGCT TTTCCTTCTG CATTTAAGCC 1320 TTATGTCAGC AGAGGATTTA GACTAAGTAG AGAGAAGACT TTCTTCTCCT TGGCTTTTTA 1380 GAGGAGGTGC TCTGGAATTT GGAAGATGCT ACACAGTGAA GTCTGGGATA TACATTTTTG 1440 GTACCCAGTA AACTCATGTT CAGAGAATAA GGCCTTAGTA GAGCCATATA TGTGAGATAT 1500 TTGGAATCAT CCAAACCTGT AGCAAAGGTT AGATCCTGGT TTTTGTTTCT CAGATGTCTG 1560 CTTTATATCT CAAAACAACA AGCAAAATTT CTTGGCTCTG TGAATATGCA ATTCTGTTCT 1620 TAGATTAGAG AGAAGCTTTA CTCATGTGGT TTGGAAGGCT TCCTTTCCTA GTTGTTTTCA 1680 GTGTGTGAGA AGCACTACAT TTTGAAGGTC AGAGAAGTCA TGACACATTA TAGGTAAGCT 1740 CATCAGCTTC TTACTTCACA GTGAGTTCTG AAAGGCATGA TGCATGCAGT CCAGTAAGTG 1800 ATGGTCATGA TGTTCTGGTT CAGAACATTT GGGTTTCCCT ACAGGTGTAA TCGGTATGAA 1860 GTGAGTCATT AGTCATTGCA TTTTCTGGAA AAGTCGGTAG AGAAAAGTTT AAGTGAAATG 1920 TAATACAGTG TTATAATTCA CTTTTGTCAC TCACAGGAGA GGATGATGTT TTGCATCAGG 1980 CTTGTTTACT GAAAAAGCTT ATTATAGCCT GGTTCTTATG CTAAGTACTG GCTAAAAAAG 2040 AATAGAATGT GCCAGGCACG GTGGCTCACG CCTGTAATCC CATTACTTTG AAAGGCTGAG 2100 GCAGGTGGAT CACAAGGTCA GGAGTTCGAG ACCAGCCTGG CGAACACGGT GAAACTCTGT 2160 CTGTACTAAA AATACAAAAA TTAGCAGGGT GTGGTGGTGG GTGCCTGTAG TCCCAGCTGC 2220 TTGGGAGGCT GAGACAGGAG AATCACTTGA ACCTGGGAGG CGGAGGTGGC AGTGAGCCGA 2280 GATTGTGCCA CTGCACTCCA GCCTGGGGGA CAGAGCGAGA CTTCATCTCA AAAAAAAAAA 2340 AAAAAAATGC ACAACTTTTC CAATCTTGAT TTAGATTATT TATACTAGGA ATGTGTGAGG 2400 ATGCCTTGAA CAAACATGTC CTTTTATATG GTTAAGAAAA TCAAATGTTG TAGGATATAG 2460 AGATAGTGGT AGTAAAAGGT AATGGTGTAG AGATATGTAC CTAAGGAAAG AGAATGTCAT 2520 GGAGAAACCC TGGGTACTAT GGGTGACTGA GCCAAAAAGA AAGTAGTGGA AATCTTATCT 2580 AAGTGACCAG AAGCCGCACT TCACTGGGCT GCTTAAAGGC AAAAATACTT TTAGCTCACC 2640 ACTGATTTGC AATATGGGGA TGGAGGGGAG CAGTGTTTAA AAGATGCTGA AGATTCCCAT 2700 GCAATATAGG GAAAGCCAAT TTCCCAAGTG GTGATGGTCC AAAGGCAGGA ACCTGGCACA 2760 GACACAACAG TACAAACACT ATAGTATTTG CTAATGTTGT GAAGCCATCT GCAATTCAAA 2820 CTCCCAGTAT ATATACTAGA CATATTCCTC CTGTTTGAAT ACAAAAACCC ACTTCCTCAA 2880 AGGCTAGAGT TCTTTAAATT GAATGTTAAT TCAAGGTTCA AGGATTAACC CTTCAACAAA 2940 GGCGGATGTG TTAGCCACCA GGAAAAACAA TTCGGGGAAG GGTTAGTTTG ACTTTTAGCT 3000 ATTATTTATC ATTTCTTACC CAAACTTGTT TTCACATCTG AAGGACCAAC AGGATAAAAG 3060 TTGATACATT AGGGACTTGA AGTTCAGAGT ATTATTAAAT CATTTCCAAC AAATATATAT 3120 AAACAGCGTC TTCCGGGCAG GTCAGGGCTT AGCTCAAGTC ACTTTCAGTT GCTGTGCCTC 3180 AGGGAGGATG CTGGTTAGAC CTCCCACTGA AAGATTTCCA TTGTTCTTCT AACTTTTCTA 3240 GCCAAACATG ATTCCAGTTA ATGTAACAAT CTCATAGCCT GGAAAGAAAC TGCCAGCCTG 3300 GGAAATCTAC TTTTCTGGCC TGGGAAGTAT TCTGGTGAGC ACTGAGGGAA GGGAGTAGGG 3360 GTGTTGGAAA GAAGACTTGA AATTCCTTTG TGTTATCTGT AAATAGAACG TTCTAACTCT 3420 TTGGTCTCTT CTTCCTCCTC TCCCCCAACC CCCTCTTTCA TCATTTTCAA TTATATATAG 3480 GAGGTTGGAA AGTTTCTCTT GAGCTCTTAA CCCCAGTCAC CTAAATACCC TTTGTGAGGG 3540 AAACTGGGTA AGAACAATTA AAGTGGAAGG CTCTCCTACC CTGGTCTTGC TCTTCCCCAA 3600 TTCTCCTCTA GCTCCTCCTC CCTTTATCTC TCTCTCTTCT CATAAAAGTG CTTTAGTTGA 3660 GGCTTCCTAG GATTCACCCT CCAGCTCCTA TCTGCACTTG AAGCCAGGCT GGGGTCTGCA 3720 CTTGCAATTA GTATGTCTGT TGGACTGGGC CACGGTATCC CACCTGGCCA CTGCCGCATG 3780 CCTCCTCAGT GCATGCCGGG GCTCCTGGTC TCTCTAGCCT GGGGCTTTGG GCTGACAAGT 3840 CCCCTCTTCC TTGCAGCTCC CTCAAAGTCC CAGACACAAA GGCCTCCAGG ATGCTCTGTT 3900 AATGCTTGAC TGGAGCCTTC CAAGATTAGA ATCAAAGGGG CATTTGGGGG TAGTTTTGGT 3960 CTTTGAGACT TCAGTCATCC CATATTCCCT CTACCCAATA GAAAGCAGAA GGGGCCTATA 4020 CTCTCATCTA GCAGCTTCTA GTTCCTCCTA TTTATTGGCC TTTTCCCTTG GCCCAGGGCC 4080 AAGGCCAGAT TTTCATGAAT AGGAAAGCTC TCCTGCAGAG AGATGTCAAA CATGCCCAGC 4140 TAGACAATGG CCATGAGCAA CAAAAGATCT GTGGGTGATC CTGTAGGAGT TTGATTCCCC 4200 CAGGCTGCTG TGGGCAGGGC TGTGTGGGTC TTTAGATTGT GTTGAGCAAT TGGTGGGTCT 4260 AGGAAGCTTG ATTTTCTGGA GTTCAGTGAC CTTGAATCTC AAGTTCTCTG TTTAGTCTTT 4320 CACTCTCGTG AATGGGTTCA GGTCTGAAGG CCTGTAATTT TTGGGTGCTG AGCCCCGAGT 4380 TCTGAGCTGA GAGTATCTAA GCTGAGAAGA GCACGGGGTC ACAGCCTTGG TAAGTCAGAG 4440 GCACAGTTCA GCCTCTGTTG GCCCTTGGAG CCAGCAGTTA GTTGTCCTCC CCAGATAGTT 4500 AATCGTGTTT GTGGTTTTCC CCCTTTAATG GGCCGTGAAG TCAGCAAACT CCCCACATGG 4560 TGGCTCCCTT TACTAAAGTT GAGTAGTGAA TTGTACAAGG AGTCTTGGAA ATTTTCAAAT 4620 ATTTCTCCAG ATTGAACTCA ACTCAGAATT CGTGTGGGAG GAAAGAGTAA GGATTTTAAT 4680 GGGGTTCACC TTTGACGTGA AGCAAGGCGG AAGACAGGAA AGCCACAGTG GGGAATAGCT 4740 TTGGGCGCTT TAGTAAGAAA GACATCTCTG CTTGATTATC TGGTAGTGTT CACCGCAGGC 4800 TCTTTGTGTG CGAGCTTGCT GCAGAGGCAG AGCTGAACAC GGAAAACACG CATGTAAACA 4860 GTCCAACATA AATCAGTGAG CATATGTATC AGAGAAAAAG AGACATATTC CCATGTAGAT 4920 GTGGTTTGAA GCTTTATTGA AGGCAGACAA TCTGAAGCAC GGCCAGGAAT AAACTAAGAG 4980 GAAGCAGACA GTTTTCGGTC ATTCATGGCC AGGAATAAAC AAAACTTAGT TTTTTTTTTA 5040 AGAAGGAGGA AGTATTAAAT CTCAAATAAG AGCAGGAACA GCATTTAGAA GGAGAAATAT 5100 AATATCTTGG AAAAAGCAAG CAGAACTAAT ATAGCTTATT TAAATGTGAG ATCCAAATCG 5160 TAGTAACAGG AAACCCTCCC ACTAAACTGG AATTTCCCCT AATTTTTGTG TAAGATCCAA 5220 ATAATTAAAA TGCACTCTAA TGGTTATTGA TGGCTCTATT TTCTTTCTTT CTTTCTTCTT 5280 CTTCTTTTTT TTTTTTTTAA AGAAATAGAC CTGAGTTCTC TTACTGGAGT AGAAATATAT 5340 GAACCTTCTT CAATTACCCA GGAAATTGGA AGCCTCTGGG TGGATATGGT CTTCCCTTAT 5400 TGCTTTCCTC TTCCCACATC ATTTTCAGTT AAAAAAATTA ACTGTTTCCA GCAGAGGGAT 5460 TCCTGTTAGA AACCTTCATC AGGTGAACTT GTACTGGGAA CCCTCATGCT TTCCCAGTCT 5520 GTCTGTGTCT CCCAAACAGA GCTGAAGTTG TAAACAAAGT GGAAAAACAT ATTTCTCACC 5580 CCAAAATTCT TAAAATTTCA CTTCTTGTGG AAAACACAAT TTCACAACAT CAATTTTTAA 5640 AATCTGTAAG AGCCACAGAA GGTGTGAAAG TAGCCAAACA GCCGGTCTAG AAATCCAAAA 5700 GCCAGGACTA ACGGGGGACA GAATGCTTTT TCCTCAAATC CAGGCAGGGA TGGGGAGCAT 5760 TCTCAGCATT AGGGCATTTA TGGACGCTAC AAGGGGAAAG GATGTATCTG AACGGTGGGG 5820 GTGATTTAGC GATGAATCGC CACGTTAATA GCACTACTGC CAAATCTTCA AATTTAGAGG 5880 CTCTGGTGAA AAATTAAACC GGTGGCAATT TTCAACGTTT GTAGCATCTG TTACCCTACA 5940 CTTCAGCACC CGGAGTCTGG ACAGCTCCGC AGGCCGCGCT CCGGAGGCAG CATGAGCTCT 6000 CATCAATCTA CTCATAGCCC TACTGTCAAC GGCAGCCAGA CTCAGGAGAG ATTTACTGAA 6060 AATCCTCCAA GACTTCCCTT TAAAAACAAA ACGACTTCCA CATTTAATGG TCTATCTGAA 6120 AGAACATACG CAAGAAATTA GGAGATCTAA ATTAAATTTA TTAATAGGAG AGCTTGATGA 6180 TGCTTAATTC CAGAGACCAG AGCTCCGATT GGTGAGGCTT GATGAAAAAG TAAAGAGAAA 6240 TCGTAATTGT ATAGTTAAAA ACATAACTTT TGTCATCCTC AAAATTCTAA AAATTCTTTA 6300 CCTGTCCTTG GGAAATGGGT GAAATTGAAA ACCATCAAAA CAATTGGACT TCTTAAAAAT 6360 TGGATTGTAT GAGTGAAAGG TGTTTATGAG AAGTCGATGA CTCCGGATCT TATCATCCAA 6420 GAGGACAGCA CAGAATAGTT AATATGTTCC TTGAGGGACT AGGATGCTGA CGTCTTTTTC 6480 TGATACCCGA TCATTACGTG ACTGAGAAAA AAAAAAAGGA AGTCATTTCA TGAATAAAAA 6540 TCGGAGCGCA ACAGTGCAAC AAAATATTCT GTACTTAAAG GCAACAGGCA GGCAGATGTT 6600 GACAAAGAGG GCTCTCCAAA AACCATGTTC GGATAGATTT TTGCGAACTG CACAGATAAA 6660 TAGGAGCAGA AGGCCGGTCA CCTCTGTAAC CAGCGGTAGC AGCAGCAGAA GCCGCAGCTT 6720 CAGAGGCAGC CGGAGAGACC TCGGAGCAGA GAAGGCGCCG CCGACCCTCG CGGCTGCCTG 6780 GCCCGCGGCT CCTACAAAGG CGGGCTAGCC GCCCGCCCTC TCCCTTGCCT TCCTCCCCTT 6840 CTTTTCTGAC TTTCCCTCTT TCCCTTAATC GCCTGCTTCT TCCTCCGGGT GGACTTACGG 6900 CCACCTTGCT CCTCCGCGCT TCACCTCATC GCCCCCTCTT TCTTTCTTCT GCCTCTCTCT 6960 CTGCGCCCCC TTCTCTCCGT GTCACGCTCC CTCCTGGTTC TGCGCGTCTA CAAACTTTTG 7020 AGCAGAACAC GAGCCTCGGC AAACGAGTCC CGCAGCTCCT CCTGCTGCTC CCGCTGGTTC 7080 CTGCGGCTTC TGCTCAGACA CCAACGCCAG ACGGCGATGC CTCTCGGGTG GTGACTCCAG 7140 CGCAGGAACT TGAAGAAGCG CTTTGCCCGC CGTCCTACCT GGCAGCTCTC CTGGCAGCGG 7200 GAGGAGTTGA AGGGTAAGGG AGGGAAAATC TTACCAAAGC GACCGGCTCA CTCGACTGCT 7260 GATTCTTTCG CTTGGCGTCG CGTCAGGGGA GTTAGCTTTC CTTCAGCCGG GTCTGGCTAG 7320 TTATTGGGCG CCGGGTAGAT GCATATATAT ATATTTTTTT CTAACTATAG CAAGCAAGAA 7380 GTGGCAGGGC GCGCACCGGC TGTCGCCAAG TGCTGTTCAA CTCAGGGAGC CGGGGCTTCG 7440 CTCCGTCCCT CCCCCGGCTT CCAGAGCTTT TTGGGGTTGG AGGGTGGGAG GCCAGGGGCG 7500 TTCTCACAGC TGTGTGTCCT CTTTCCCATC CTGCGCAGA ATG ACC ATG TGT AGC 7554 Met Thr Met Cys Ser 1 5 GGA GCG AGG CTG GCC CTG CTG GTC TAT GGG ATA ATC ATG CAC AGC AGC 7602 Gly Ala Arg Leu Ala Leu Leu Val Tyr Gly Ile Ile Met His Ser Ser 10 15 20 GTC TAC AGC TCA CCT GCC GCC GCC GGA CTC CGG TTC CCC GGG ATC AGG 7650 Val Tyr Ser Ser Pro Ala Ala Ala Gly Leu Arg Phe Pro Gly Ile Arg 25 30 35 TAGGTGCTGG CTGCCTGGCC CAAGCAGGAG CTGGGGCTCC CCAGGCACAG ACGCTTCCTC 7710 ACGGTCTCCT TCCTGCAGTC CTTTGGGTCC AGACTACTAG CATCGCCCTC TGCGCCCCCG 7770 GTGCGCCTCC GCCAGCCTCG GCTGGACAGC GGGTCCCCAT TCTAGCCGAG GGTCTGGCAG 7830 GCTCCGCGAC TGCTCGGACG CCTCCCCCAG CCCTAGGCAG CTCAGGGTCC CGGGTAGAGC 7890 CAGTGAGCTT CTGGCCGCTG GAGAACCCCC CCTCCCCCAA CCCGGCCCAC AGGATGGGGG 7950 CAGGGCACGG CCCCTAGCTT GGTTTCTTTT ACCTATTCTT GGGACGAGTT AGGAGAACTT 8010 CAGCTCTGGA GCCTGGCCGG GGGTTGAGCG TGAAGCTCCC TCGGACTTTG CTTTGTTACT 8070 GCTTGTTCTG GACTATCCGG GTGGGGTCTC TCTCTCTCCT CCACCCTTTC TTTTCATTTC 8130 ATTCCAATTC TTTCCCCTGA AGAGCTTTCT TTCAAGTGAT CCGTGTTCCA ACTGCATTTT 8190 GAATCCCAGG CTGTCTTGGG GGGCGTGCGG TGGGGAGGGT GTTGGCCCGG TGTGATTGAG 8250 GAAAAGCGAC TTAAGAGAGG GAAGAACAAG GACGAGACTG CGAAGGAGGG GGAAAAACAG 8310 GCGCAAAGGA GGAGGAAGGG AAAGCCAGCA GGCAGGCAGG ACCGGGAGAG CAGCCCTGCC 8370 TGGCCCGGGA TGGAGGAACC TTGGCTTTTT TCTTAACCCC GGGTTTCTAA CCCGCAGGCG 8430 CGGCCCAGGT TCCCGGAGGC AGCCCCAGAG TCGCGGGCCG ATGTGCCAGG CTGTGGATGA 8490 GCCCCGGGTA GGGGAGGGTT CGTACCAGCG GCGCCTGGGG CAGCGAGGAG CGCGCGTTCT 8550 GCCTGCGAAG CTGCCTTCTC CGAGCCCCGC CCAGGAACAT TAGCTCTGGG GGGCCGCTGA 8610 TCATTGATTT GGACGGAGAG ATGGGTTCTG GGTTCTGTAT TAGGATTCCA GCATCTGGGC 8670 TCGAGGCAGG GCAATATCCA GAAAGACCCC AGGGTTCGGG GTACCCGGGC CAGGGCTGAG 8730 GCGCATCGCC GAGCAAAGGC TGGGTGCGAG GCGTGCGGAA TGATGCGCTT GCCTTGCCCG 8790 GGCCTCTCCA AGGATGGAGA AAAGGCGAGT GAAGTAGCGA AGTACGACTC CAACCCCGCC 8850 CAGAGAGTGC TACTAGCGCT GGCTGCACGC CAAGTCTCTC CAGGGGTCCA AAGCGAGAGG 8910 GATTTGTTTT AACCCATCTC TACCCGTCCT GTGTCAAGAA CGGAGGCTGT AGAGGGCGAC 8970 TGCGAAGTCG CCAGGCACTC GCTGGATCTC GGTCCCCCTC CTCGTGCTCT GGGGTTGAGA 9030 TGGGGCACCG CCATCGATAA CAGATCAGCG CGAACTATTC GTTTAGTGGC CTTAAAACAC 9090 CCTGGTTTCA CCCTCAGCTA TTTTCAAGTT CCCGTGTGCC TGGCACTTTC TCCGTGCGAG 9150 AAGCACCGGA GGGTGCGGAC GCGCCACAGT CTGAGCCGCC GCCGAACTGG CTAAGTTTAG 9210 GGGCATTTAT TATTCATGTT CCTGCCAGAT CCTCGCCTGC CCAAAATAGA AACCGAGGTT 9270 CTCCGTGACC TACATCTGCT CGGGGAAGGG CTCCCCTGGG CTCGGAGGCT GGGGTGGGGG 9330 TGGCTGAGGA GTTGGCCCCC GCACGCCCCA CGCATCCTCT CCTTTGCTTT CTGGGCCTCC 9390 CCATTCGGGT CTTCGCGTGG GTCAGCGCCC GGTCTCCCAG GGCCTTTCTC GTCCCCGCCC 9450 GTTGCTGCTT TGGGGAGGCT CGGGAGCCAG GCGGGGAGGG GGGCGGTCCT TTTCCGTAGA 9510 CAGGTGTGCG CGATCGGCGG AGACGCCTCG GTTTCCCAGC GCTTGTTGAG GCCGTGGCCC 9570 GCAGGACGAC CCTTTACCCG CGAAGGGGGG GTGGGCGGGA CCGCCCGGCG GGGTAGGAGT 9630 GGTTGGGTGT CGTTGCCTCC TCCTTACCTC TGCTCCCACC CCCAGTCCTG GGAGAAGAGA 9690 CAATTCTCAG CGGAGGACTT TTATCACCTG TGAAAATCCG CGCGAGCCCC TTACTTTGGA 9750 TCCTCGCCGA GCTGGGGAGG AACTTGCACT GACCACACCT TCTGTCCCCG GCCACCCCGC 9810 AGG CCA GAG GAA GAG GCG TAC GGC GAG GAC GGA AAC CCG CTG CCA GAC 9858 Pro Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Glu Asp Gly Asn Pro Leu Pro Asp 40 45 50 TTC GGT GGC TCG GAG CCG CCG GGC GCA GGG AGC CCC GCC TCC GCG CCG 9906 Phe Gly Gly Ser Glu Pro Pro Gly Ala Gly Ser Pro Ala Ser Ala Pro 55 60 65 CGC GCC GCC GCC GCC TGG TAC CGC CCG GCC GGG AGA AGG TGAGATTCGC 9955 Arg Ala Ala Ala Ala Trp Tyr Arg Pro Ala Gly Arg Arg 70 75 80 GCGGCCTCGC GCACACCCGC GGCTGGGAGC TCGGGACTGC GGTGACGGGA GGGGCAGTGT 10015 GGTGACCCAC CCAGGATTTT TTTTTTTTTT CCCGTGAAAG TCCTCAAGCC TGTCCTCTCC 10075 CTGGCCCGAT CCTATTGCAG CGACAGAAAA TCAGCAGCGG GCGGGTCTGT GTGGACCTGA 10135 GGGCCGCGTG GGGACCGAGG GGGGCTGTGG CCCAAAGAGT GGCAGTGAGT GGCGTCAAGG 10195 AACCCACACT CCGCATCTGC CACTCCTAGA GCCGGGACTA GCTCCCGATC CTAGCAGTTG 10255 CTCTCGAGAT CATCCCGGGA GTTATTGGCG AGTTCTGGGC CTCTGGAGGT TTCCCTGTCA 10315 GCCTCCCCGG CCGCCGAGGG GGCGCGCGCC CAACAAGGGG GTCTCTAGCG GCCACCTGGG 10375 GACAGAAACA GTGACCCTGG GCGCGCACTT TGCCTCCCCG TTAGA GAT GTC GCC CAC 10432 Asp Val Ala His 85 GGG ATC CTT AAC GAG GCC TAC CGC AAA GTG CTG GAC CAG CTG TCC GCC 10480 Gly Ile Leu Asn Glu Ala Tyr Arg Lys Val Leu Asp Gln Leu Ser Ala 90 95 100 GGG AAG CAC CTG CAG TCG CTC GTG GCC CGG GGC GTG GGG TAAGAGTTTG 10529 Gly Lys His Leu Gln Ser Leu Val Ala Arg Gly Val Gly 105 110 TGGAAGGATT AACCTGCGCG CGCCGGGGTG GGTGCCTGTG CGGGGCGCGC GGGGCGGGCG 10589 GCGGTGGGTG CCCGTGGGGG CCAGGGTGAG TCTGCGCCCC TGGGTCTGGG GTGGGCATCC 10649 GCCACGGGTC GCAGTTGGAG ATTTTGAAGT GGCACTTTAA ATTTGCCCAG AGAGCTCTGG 10709 AAGAGGCAAA AAGGGAACGC GAGCCAGGGA GTTTGATCCG TTTTGAATGA AAAGAAAGAG 10769 AAACCAAACC AAACCTCTCA GTCATCCAAA ACCTTCAGGC TTCCAGGGAG GTTTTGCTAT 10829 AATTTTCTCT AAGCATGACT GTTTCTGGGG GAGGGGAAAG GGGTGGTTGT ATTTACTGAA 10889 AATTCAAATC GAAATAATAA ATGGCCAAAT GTGGACACTT ATGGACCCAA ACAGTTTTGC 10949 TCACGCCAGA GAAACTGAGA GCACAGGGCT TGCGTGAAGC CTATCTCGGC AGAAGGCAAC 11009 ATTCTAATAA AGCCCGTGGG AAAACAGATT ACATTTTCGC CATGAATAAG TCATGCAGTG 11069 AAAAATATTG CCTACAGCCT GTCGACTTAT ATTATTATCA CGTTTTTCAA CTCGGCGTGA 11129 GGAGGGAGAG GAGTGTTCAT ATTTGACTAG GAATTGCAGG ATCGATGCAA ACTCCAGGGC 11189 AGCAGCCAGA CTGGCATATG TAGGGCTCTC CGGTTACTTT CTCTGTATGT CGCGGGTGAG 11249 AGGAACAGCG AGGACAATTT AGCGCAAACA CACGAAGGGT CGGATCTCAA GGGGGCAGCG 11309 CTGGGAGAAA GGTTAGGCTT GAAGCGCGCG TCGCCTGCCC GGATCTTATC CCGGGCCCCC 11369 TCCGCAGGGT TTGGTGCCAG GAGATCCTGC GTGGGGAGGG GGGCATCGAG GGGCTGCCGT 11429 CTCGGCCCTC CCCACGGCTG CTTCCAGGCA GAGGCGGGCG ACGCGGTGGG CAGTGCGAGC 11489 CCCGGGCCCT CCCCGAAGGC TCCCGCGTGG GGTGGGGCCC GCCTGCTCCC CGCGGCGATT 11549 GAACCTGTGT CTCCCGCCCC GCCACCCTCT TCCCGACCCC TTTGCTTGCA GT GGG AGC 11607 Gly Ser 115 CTC GGC GGC GGC GCG GGG GAC GAC GCG GAG CCG CTC TCC AAG CGC CAC 11655 Leu Gly Gly Gly Ala Gly Asp Asp Ala Glu Pro Leu Ser Lys Arg His 120 125 130 TCG GAC GGG ATC TTC ACG GAC AGC TAC AGC CGC TAC CGG AAA CAA ATG 11703 Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln Met 135 140 145 GCT GTC AAG AAA TAC TTG GCG GCC GTC CTA GGG AAG AGG TAT AAA CAA 11751 Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Ler Gly Lys Arg Tyr Lys Gln 150 155 160 AGG GTT AAA AAC AAA GGA CGC CGA ATA GCT TAT TTG TAGCGATGGG 11797 Arg Val Lys Asn Lys Gly Arg Arg Ile Ala Tyr Leu* 165 170 175 TTACCAGCTA CCCTGTGTAT ACAGCCCTGA CGCAATGAAA AGTCGTTTTC CAAACTGACT 11857 CAACAGTCAT CGCTCGTGTG TTCTATCCAA ACATGTATTT ATGTAATGAA GTAAAGCCAT 11917 TAAATGAATA TTTTGATAAT AATATTGTTT TTCTTTCTAC AAAGCACTAG AGAATGCACA 11977 GATATACTTT GTGGACCAAT TATTGATATA TATTATAAAT ATATATAAAG AATATATATA 12037 TATATATATA TATAAAGTAT AGAGAGAAGT TCATACAAAG CGTGCACAAG GATTGAAAAT 12097 TCGCCCGAGC TGTTTATGTT TTTATAAAAA TAAATAGAAA AGTAGACAAT CATTGTTTTG 12157 AATATTACTC CTATTTTTGT AAACTGGAAT TAAAAGGATA GTATTTTTAT CCATGACAGG 12217 CCTGAAGATA TTACTACTTA CCATTTGCTA CTGTACATAA ACAATGATGC CCTGCTCCAG 12277 GGAGATTTTG AGGTAAAGAT ATGGAGAATT GCTGAAGGGC ATTCTTTCCC AGTGAGTCTC 12337 TGGGGCAGGC TGCTTCAATC CCAGCCTAAC TCAACTGGGC TCTGTCCCCC TGGTTGGGTG 12397 GCAATTCCAA TATTTCTGCT TTCTTTGATT CTCCTTTTAT GTGTAGTTGT CTCTCTTCAG 12457 ACTCTCAGCC CAGAAGAAAA TTCTCCTGAT AAAACAACAG CTCGATCCAA ATTGTGCTTC 12517 TCCCCAGAAT TCACGCCTCT CCCTAGGAGA AGAGTTGAGG AACTGTACAG AAAAGGGCGG 12577 CTTCGTTAGA CCGCTCTCTT TTCTGTACTT CCTGAGTGGC CAGGGAATCT AATATCCCCA 12637 AATTAGGGCA ATTGGAACAA AGTGAAGGAC ATAGAGGTAT ATTGGAAGAG GCAGAGCCTG 12697 AGGTGGTAGG AGGACGACCC TGGAAATGGA CTGGTTTGAG ATTGCCCCAG GTCTGGGAAG 12757 CTGAGGGCAA ATCCAGTCCC AGTGGTCCTG ACTTTGGGCG CTGGGTATTG GAAATGGATG 12817 CAAAGTACAA TGTGTTTTTC TCCAGTGCTG TCCATGCTTC TCATCTTGTG AAATGGCCAG 12877 GATCCTCTCC TTTGAAACCT GCTCTGTAGG AGCTACCCTT TTCCTTTGTG GTTTTATGGA 12937 GACCTCTCCT TCCTACCCTC CTGCACTGTT TAAGTACTGT TTACCATTTT TCATTCACTT 12997 CTCTTAAACT TGTGAATGCT TCTCACTTTT TTTTTTGTTT GATGCAGGCA CTTATTGTAA 13057 ATTTTAGAAA CCCCTCTGTA GCCACTAGTA AGTAATTATG CACTAAATAT GAACCCTTTG 13117 TTTCTTGTTT ATTGAGTTTG TAGGTAAAAT GTATTTTTCT ACATTATTGC TTATTGCTTA 13177 GTAAAATTTA TTTCATAAAA CCAACCTTTG TCATATTAGA ATGTGTAGTG TTCACATGTT 13237 GCTCAGTTTT GCTAACTGAT AAATCATTTA ATCCTCTTCT TCATATGTAT GAGTACTATC 13297 TTATATCTGT GGTCAAGAGT GAGGTAAGCA AGCTCCAACA GACCCTGAGA ACCTACGCTT 13357 GTATCCTTTC TTTGGCTAAA GAAAGCATGT CTGTTTCCTG TCAATTCTTT GAACATACAG 13417 AGTAATCTTT ATAAACAAAA GAACCTTCAC CCAGCAATCA GATCGAGCAG CAACAGACAA 13477 ACCAGCCAGC CAATCTCCCA AATTTCAGGC ACAAGTTTAT TTTTTTTTTT TTTATGTTTT 13537 GAAAAAAGAA GATGAAGAAG AAGAAAAAAA AAAGAACAAG GAAAGATTAA ACGTTAGCTT 13597 GTAAAGTTTA AAGGACCTTT CCTTTTCCTT TACGGATTTG ATCAGTATGA AGTCATAAAT 13657 CAAAGAAAAC AGAATTGGAT TTGCATTCCC AGGCGGGATG GATGCTGCCA GGAGATCACA 13717 TTGCAAATAG TGAAAACAGA GGCATTCGGT CTATGCCTGA GTCCTGTGTA TAGGATCAAT 13777 CTTCCTTTAA TTCCGCAGTC TCCTCAGGCA ATGTGACACG GGATGCAGTT TGCAGCTTTA 13837 GTGCCTTTCT TCGCCTTTTA AATTGCCACG AATCACAGAT GGCTATTTAG TGGCCCTACA 13897 ATGCTGCAAC ACATCAGCTT GCATTTTAGT CTTAATTATT TGTTTCTTGG ATAATGGGCA 13957 GAGTTTTCTG TATTTGTATC GACTGTTAGT GGTGAAATAG GGCTCTAGTT AACCTTTTAT 14017 TTATGAAGTC TAATTTAGTG TTCCCGTGGC TAGTTGCAAG CATTTTACAG TGATCACCCA 14077 GTTTAATCTT TTGTATACTT TTTAGAAATG CCAAGAGCCT TACTAAACTG AAGCAGATTT 14137 ATGATATAGT GATAATTTAG GTAGATGTTA GTCTTGAAGC TCTTATTTTG TGTGCAACTG 14197 ATTATAAAAA CACCTTAACC AAGTATTATT ACACACATGA TATCTATAAC TAGGACTTTG 14257 ATAACTGTTA TATAAAGTGT GTAAAATTTG TATGAATAAA TTTTTGTAAA CAATGCAACT 14317 TGGTCTAATG TTTGGGAAAA AAGACATTCA GGAAATAATT ACTTTAAAAT CTCTTAAAGT 14377 ATTATATTTC TTTAGCAACC ATAAGATTTT TTTACGTCTG GAATATATAT CTATCTAAGC 14437 ACCCTTGTAT TTTCATGAAC TGCACTTTAA TAATTGATGG GCAACTGGAT TCTGCTAAAA 14497 ATTTAAAGTA GCTACTCAGA TGGAGATGCC TAAGAAGGTT TTAAGCTCAT AAACAGGCAT 14557 GATGTTGCAA CATTATAAGA CACACAATTT AGATTAATTT CCATCCCCTA GTGTGTATAT 14617 ACTTTGCTCA ATATTCAGAA AGTTACTAGG TAGTAGTGGG AGACAATGCT GGAGCATTAG 14677 TTACACATCT AAAATAGCAA TCTAACATTG TTCTTTTATT TTTTATTTTA GTGGCCAGGT 14737 CTCACTATGT TGCCCAGGCT GGTCTTGCTC AAGCGATCCT CCCACCTCAG CCTCCCAAAG 14797 TGCTGGGATT ACAGGCGTGA GCCACCACAC CCAGCCTAAA ATAGGGATCT AACATTGTTC 14857 TTATACAAGT AACTCTGCAG ACTAAACTTG TCTTGATAAA ATTTTGTATA AAATGATCTA 14917 AATAATCAGT TTTTGGAGGT TTTAAAATGT ATTTAGAGAC ATACAAACTA CTGTCTCTGA 14977 TTAAAATGCT TTAGGTAGAA GGAACGTGAA CATGAGTAAG TAAAGAGTTA ATTAGATGCC 15037 TTTAAAAGAA AATGTACTTT GAAGTCCAGG AAGAAACACA AGAAGTCATT TGTGGATTGT 15097 ATGCTTTCTT AGTTCATATT TACAAACTTT AGGGCAAAGC TTTCATACGA AATTCCTTCA 15157 AATTCCGTAG TGGTGTGTGT TTTGGCACCT TTGACTATTT CTGGCTTAGA AAATGTATAG 15217 AAAGTCACAC AATAATTGAC ATACCATTTA ATTTAAAATG CCAGGGTTTC ATCCTAAAAA 15277 TTAATGGTCT CAATTAGTAA ATCAATAAAT ATGTTACGAT AGAATTAAAG GATGAGTGAG 15337 GATTCTAAAA TTATCTTCAG AATTTAGCTC AGTATTTAAG GCCTAGAATC AAATAGGGAG 15397 GAGCCCACAG TCTAGAAATC CCGTTTGTAG TCAATGAAAA AATGAATCCA GTACAGTTCA 15457 TATTTGCATT TGATTTTATT GGATAAGGAA TTTTTCTTCT CCATCTTTAA CTGCCCCTCT 15517 TTGTCCTTGA AGACATAGTG TGGTAGATGA AAAAATGAAG AAGACTTTAT TCGGTTGGGG 15577 CTAGGCTAAT GACTTGTCAA GAACATAAAG ATAAACCCCA GACTTGGCTG ACTTCAAGTG 15637 AATTTCATGT ATTTAGCAAC TTGCCATATT ATCTTCGGTG ATAACTCAAA TTACATCTTT 15697 TTAAAGGCAG ACTTGATACA TATGGGTATT CAAGAAGCTG TAATAGGTGC CTTAATGCTG 15757 TTAGGGCGGA GAACACACTT ATTCAATACA ATGCACACTT ATTGAACACA TGAAATGGGC 15817 CACCGCACTG GTCGAGAGAG CTTGACTAAC ACCTGGGAGC TCAGGTAGTA TTTTTTTCAG 15877 AATGTTTTTC TGAAATGTGA TCATCTTTGG GGCGGGGGGA GCTTAAAAAT GCAAAATTGT 15937 AGGGCTCTGC CAGATCCAGT GAATCTGCAT TTTAAATAAA AACCCTAGAT TACTGTGCAC 15997 TAAAATTTGA GACTGCCTAG ATTTAGAATT GGTGACATAT GTAGGCATAC ATATGTGCTG 16057 GTCTGAATGT TTTTTTCATA TGAAATAAGC AAAAGGTCAT GTTACCTGCA TACAGTAATA 16117 AATACATAAC TGTGCCATAT TCTTCCAAGA TATCTGGTCA TTAAGCTCTT TGACAATTTC 16177 AGTATTTCCT TTAGGTCACT AAAACTACTA GTTAGCATTA TTTTACTTGT ACAGTCTGGT 16237 TGGACCTCTC CTACAGGAGC TTGTGGAAGG AGAGTGATCC TCTAAGTTGG GTCCAAAATA 16297 TTCAATCACA GGACTAAGAG ATTATGGCTA TAATGAGGAG AACTTGTGCA GCTAGCTAGC 16357 CATAATTCTG GGGATCCAGA AGTCAACTTC CAGTTGCATT ATATCCCAAT TTGGTTTGAA 16417 TGTATTTACT GCTCCCCAAC TGTTTACATG ATGGTTTCTC TTGGATGGCT CACTATGACC 16477 TTCAACCCAA CCCTACTGTT CACATGATCA CAAGATTGGA AGCCAAGATC AAGTCATCCC 16537 TCTTCTCTTT TGTTGCCACT CTTTTTTGTA GAAGGGAGAT GCCAGCTGCC CCTGCTGCTG 16597 CAGATTGCAT CACTGCTGGA TTCTTACATT GGTTTGTAGT TGGTCATCCT GGTCACTTCC 16657 CCTGCAACCA CATAGTTTTA GCTCCATCTT AGTATCATGT CCCTCTGATC AGATGTTCCA 16717 GAGTAGCTTC CATTGTCAAA GGGTTAAAGG GTTTAAGGTA ATCAGTAGTC AATTTTACCT 16777 CTCTGTTCTT CAACACGATC CTTCCTCTTT TTTTTGTTTT GAGAAAGGGT CTTACTCTGT 16837 TGCCCAGGCT GGAGTGCAGT GGCACGATCT CGGCTCACTG CAACCTCTGC CTCCCGGGTT 16897 TAAGCGATTC TCCTGTCTCA ACCTCCCGAG TAGCTGGGAT TACAGGTGCA TGCCAACGCG 16957 CCCGGCTAAT TTTTGTATTT TTAGTAGAGA CGGGGTTTCA CTGTGTTGGC CAGGCTGGTC 17017 TTGGACTCTT GTCCCCAAAT GATC 17041。

【００２６】配列番号：２ 配列の長さ：657 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源： 生物名：ヒト白血球 ＴＧＡＧＡＡＡＡＡＡ ＡＡＡＡＡＧＧＡＡＧ ＴＣＡＴＴＴＣＡＴＧ ＡＡＴ
ＡＡＡＡＡＴＣ ＧＧＡＧＣＧＣＡＡＣ ＡＧＴＧＣＡＡＣＡＡ 60 AATATTCTGT ACTTAAAGGC AACAGGCAGG CAGATGTTGA CAAAGAGGGC TCTCCAAAAA 120 CCATGTTCGG ATAGATTTTT GCGAACTGCA CAGATAAATA GGAGCAGAAG GCCGGTCACC 180 TCTGTAACCA GCGGTAGCAG CAGCAGAAGC CGCAGCTTCA GAGGCAGCCG GAGAGACCTC 240 GGAGCAGAGA AGGCGCCGCC GACCCTCGCG GCTGCCTGGC CCGCGGCTCC TACAAAGGCG 300 GGCTAGCCGC CCGCCCTCTC CCTTGCCTTC CTCCCCTTCT TTTCTGACTT TCCCTCTTTC 360 CCTTAATCGC CTGCTTCTTC CTCCGGGTGG ACTTACGGCC ACCTTGCTCC TCCGCGCTTC 420 ACCTCATCGC CCCCTCTTTC TTTCTTCTGC CTCTCTCTCT GCGCCCCCTT CTCTCCGTGT 480 CACGCTCCCT CCTGGTTCTG CGCGTCTACA AACTTTTGAG CAGAACACGA GCCTCGGCAA 540 ACGAGTCCCG CAGCTCCTCC TGCTGCTCCC GCTGGTTCCT GCGGCTTCTG CTCAGACACC 600 AACGCCAGAC GGCGATGCCT CTCGGGTGGT GACTCCAGCG CAGGAACTTG AAGAAGC 657

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトＰＡＣＡＰ３８ゲノムＤＮＡの簡単な制限
酵素地図である。

【図２】ヒトＰＡＣＡＰ３８ゲノムＤＮＡの塩基配列お
よびそれより推定されるヒトＰＡＣＡＰ３８前駆体や成
熟ペプチドのアミノ酸配列を示す。

【図３】ヒトＰＡＣＡＰ３８ゲノムＤＮＡの５’領域を
組み込んだプラスミドの構築図である。

【図４】ヒトＰＡＣＡＰ３８ゲノムＤＮＡの５’領域に
相当する２．５〜１ｋｂの種々のＤＮＡ断片のプロモー
ター活性を測定、比較した図である。

【図５】ヒトＰＡＣＡＰ３８ゲノムＤＮＡの５’領域の
更に短かい長さの種々のＤＮＡ断片のプロモーター活性
を測定、比較した図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/62 15/73 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトＰＡＣＡＰ３８遺伝子のプロモータ
   ー活性を有する領域を含有するＤＮＡ。
2. 【請求項２】 配列番号２の塩基配列を有するＤＮＡを
   含有する請求項１記載のＤＮＡ。
3. 【請求項３】 ヒトゲノムＤＮＡ由来の請求項１記載の
   ＤＮＡ。
4. 【請求項４】 プロモーター活性を有する配列番号２の
   塩基配列を有するＤＮＡ。
5. 【請求項５】 神経細胞特異性蛋白質の遺伝子のプロモ
   ーター活性を有する請求項４記載のＤＮＡ。
6. 【請求項６】 請求項１又は４記載のＤＮＡを含有する
   ベクター。
7. 【請求項７】 請求項１又は４記載のＤＮＡの下流に接
   続した蛋白質又はペプチドをコードする構造遺伝子を有
   する請求項６記載のベクター。
8. 【請求項８】 請求項６又は７記載のベクターを保持す
   る形質転換体。
9. 【請求項９】 細菌である請求項８記載の形質転換体。
10. 【請求項１０】 動物細胞である請求項８記載の形質転
    換体。
11. 【請求項１１】 請求項７記載のベクターを保持する形
    質転換体を培養し、プロモーター活性を有するＤＮＡの
    下流に接続した蛋白質又はペプチドをコードする構造遺
    伝子を発現させることを特徴とする、蛋白質又はペプチ
    ドの生産方法。