JPH06181768A - 新規プロモーターおよびその用途 - Google Patents
新規プロモーターおよびその用途Info
- Publication number
- JPH06181768A JPH06181768A JP4325372A JP32537292A JPH06181768A JP H06181768 A JPH06181768 A JP H06181768A JP 4325372 A JP4325372 A JP 4325372A JP 32537292 A JP32537292 A JP 32537292A JP H06181768 A JPH06181768 A JP H06181768A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- human
- promoter
- pacap38
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】ヒトPACAP38遺伝子発現におけるプロモ
ーターを見出し、該発現のメカニズム、ヒトPACAP
38あるいは他の蛋白質の製造を行なう。 【構成】ヒトのDNAライブラリーから単離したヒトP
ACAP38のゲノムDNAにおいて、そのプロモータ
ー領域を決定した。 【効果】ヒトPACAP38のプロモーターを用いて神
経細胞特異的な蛋白質効率よく生産、探索することが可
能と成った。
ーターを見出し、該発現のメカニズム、ヒトPACAP
38あるいは他の蛋白質の製造を行なう。 【構成】ヒトのDNAライブラリーから単離したヒトP
ACAP38のゲノムDNAにおいて、そのプロモータ
ー領域を決定した。 【効果】ヒトPACAP38のプロモーターを用いて神
経細胞特異的な蛋白質効率よく生産、探索することが可
能と成った。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は新規プロモーター、詳し
くは神経細胞特異的な蛋白質、具体的には精巣あるいは
脳の視床下部由来の生理活性を有するペプチドであるヒ
トPACAP38のプロモーターDNA、該プロモータ
ーDNAを含有するDNA、該DNAを保持する形質転
換体および該形質転換体を用いプロモーター活性を利用
する成熟PACAP38を含む種々の蛋白質の製造方法
に関するものである。
くは神経細胞特異的な蛋白質、具体的には精巣あるいは
脳の視床下部由来の生理活性を有するペプチドであるヒ
トPACAP38のプロモーターDNA、該プロモータ
ーDNAを含有するDNA、該DNAを保持する形質転
換体および該形質転換体を用いプロモーター活性を利用
する成熟PACAP38を含む種々の蛋白質の製造方法
に関するものである。
【0002】本明細書においてプロモーターとは、RN
Aポリメラーゼが結合し、RNAの転写の開始のシグナ
ルとなるDNAの領域を指す。
Aポリメラーゼが結合し、RNAの転写の開始のシグナ
ルとなるDNAの領域を指す。
【0003】
【従来の技術】脳の視床下部、下垂体から分泌されるホ
ルモンには種々のものが知られている。甲状腺刺激ホル
モン放出ホルモン(Thyrotropin releasing hormone)や
黄体形成ホルモン放出ホルモン(Luteinizing hormone r
eleasing hormone)、ソマトスタチン(Somatostatin)、
副腎皮質刺激ホルモン(Adrenocorticotropic hormon
e)、成長ホルモン(Growth hormone)、プロラクチン(Pro
lactin)などがその例で、これらの作用については従来
よく研究されている。一方、これ以外の新しい視床下部
由来の生理活性のある物質が、ヒツジ脳下垂体からアデ
ニレート サイクラーゼ アクティヴィティ(adenylate c
yclase activity)を指標にして探求された結果、それま
でには報告されていない、38個のアミノ酸残基からな
るペプチドが発見され、その構造も決定され、このもの
はPACAP38と命名された(ヨーロッパ特許公開0
404 652号)。本発明者等はヒトのPACAP38のc
DNAを精巣のcDNAライブラリーからクローニング
し、その塩基配列及びアミノ酸配列を明らかにしている
(特願平1−259924)。またヒトのPACAP3
8のゲノムDNAを白血球由来DNAライブラリーから
クローニングし、その塩基配列及びアミノ酸配列を明ら
かにしている(特願平3−200232号)。ヒトのP
ACAP38に相当するアミノ酸配列はヒツジと同一で
あるが、その前駆体においてはアミノ酸の置換がある。
ルモンには種々のものが知られている。甲状腺刺激ホル
モン放出ホルモン(Thyrotropin releasing hormone)や
黄体形成ホルモン放出ホルモン(Luteinizing hormone r
eleasing hormone)、ソマトスタチン(Somatostatin)、
副腎皮質刺激ホルモン(Adrenocorticotropic hormon
e)、成長ホルモン(Growth hormone)、プロラクチン(Pro
lactin)などがその例で、これらの作用については従来
よく研究されている。一方、これ以外の新しい視床下部
由来の生理活性のある物質が、ヒツジ脳下垂体からアデ
ニレート サイクラーゼ アクティヴィティ(adenylate c
yclase activity)を指標にして探求された結果、それま
でには報告されていない、38個のアミノ酸残基からな
るペプチドが発見され、その構造も決定され、このもの
はPACAP38と命名された(ヨーロッパ特許公開0
404 652号)。本発明者等はヒトのPACAP38のc
DNAを精巣のcDNAライブラリーからクローニング
し、その塩基配列及びアミノ酸配列を明らかにしている
(特願平1−259924)。またヒトのPACAP3
8のゲノムDNAを白血球由来DNAライブラリーから
クローニングし、その塩基配列及びアミノ酸配列を明ら
かにしている(特願平3−200232号)。ヒトのP
ACAP38に相当するアミノ酸配列はヒツジと同一で
あるが、その前駆体においてはアミノ酸の置換がある。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】動物細胞が産生してい
る蛋白質には、それをコードする遺伝子が存在するが、
蛋白質のmRNAはその遺伝子の上流にあるプロモータ
ーと呼ばれる領域が何らかの因子により活性化され、そ
の蛋白をコードするmRNAを合成する。このプロモー
ター領域の活性化には種々の因子が報告されており、ま
たその蛋白を特異的に発現している細胞に特異性を持つ
場合が多い。ヒトのPACAPは視床下部で特異的に産
生されている神経細胞が分泌する蛋白質である。そこで
上記の知見に鑑み、このPACAPのプロモーターを利
用するならば、神経細胞特異的な物質を産生し、利用す
ることが可能であると考えられる。本発明者等はこのヒ
トPACAPのプロモーター領域を決定し、神経細胞で
特異的に生産される物質の製造に利用できる方法を明ら
かにした。即ち、PACAP等の神経細胞(星状膠細胞
など)で特異的に発現する蛋白質をコードするcDNA
を本発明のプロモーターの下流に結合した発現ベクター
を構築した後に、たとえば培養した星状膠細胞(アスト
ロサイト)などの細胞に取り込ませ、星状膠細胞で該蛋
白質を生産させることができる。さらには、星状膠細胞
での物質生産、その細胞の分化、形態変化、細胞生存維
持の神経科学的な研究にも利用することができる。
る蛋白質には、それをコードする遺伝子が存在するが、
蛋白質のmRNAはその遺伝子の上流にあるプロモータ
ーと呼ばれる領域が何らかの因子により活性化され、そ
の蛋白をコードするmRNAを合成する。このプロモー
ター領域の活性化には種々の因子が報告されており、ま
たその蛋白を特異的に発現している細胞に特異性を持つ
場合が多い。ヒトのPACAPは視床下部で特異的に産
生されている神経細胞が分泌する蛋白質である。そこで
上記の知見に鑑み、このPACAPのプロモーターを利
用するならば、神経細胞特異的な物質を産生し、利用す
ることが可能であると考えられる。本発明者等はこのヒ
トPACAPのプロモーター領域を決定し、神経細胞で
特異的に生産される物質の製造に利用できる方法を明ら
かにした。即ち、PACAP等の神経細胞(星状膠細胞
など)で特異的に発現する蛋白質をコードするcDNA
を本発明のプロモーターの下流に結合した発現ベクター
を構築した後に、たとえば培養した星状膠細胞(アスト
ロサイト)などの細胞に取り込ませ、星状膠細胞で該蛋
白質を生産させることができる。さらには、星状膠細胞
での物質生産、その細胞の分化、形態変化、細胞生存維
持の神経科学的な研究にも利用することができる。
【0005】
【課題を解決するための手段】本発明者らはヒトPAC
AP38遺伝子発現のメカニズムとその誘導の方法を開
発すべく種々研究の結果、PACAP38のゲノムDN
A(Genomic DNA)をヒトのDNAライブラリーから
単離し、その塩基配列を決定することに成功し、これに
基き遺伝子組換え技術を用いることによりヒトPACA
P38の誘導を可能とした。更に今回、本発明者らはヒ
トPACAP38の遺伝子をクローニングし構造決定す
ることにより、先にクローン化したヒトPACAP38
のcDNAとの構造を比較することによって、イントロ
ンとエクソンの関係を明らかにすると共に、同時に該遺
伝子発現に必須のプロモーター領域を決定することに成
功し、本発明に到達したものである。即ち、本発明は新
規プロモーター、詳しくはヒトPACAP38のプロモ
ーターDNA、該プロモーターDNAを含有するDN
A、該DNAを保持する形質転換体および該形質転換体
を用いプロモーター活性を利用する成熟PACAP38
を含む種々の蛋白質の製造方法に関するものである。
AP38遺伝子発現のメカニズムとその誘導の方法を開
発すべく種々研究の結果、PACAP38のゲノムDN
A(Genomic DNA)をヒトのDNAライブラリーから
単離し、その塩基配列を決定することに成功し、これに
基き遺伝子組換え技術を用いることによりヒトPACA
P38の誘導を可能とした。更に今回、本発明者らはヒ
トPACAP38の遺伝子をクローニングし構造決定す
ることにより、先にクローン化したヒトPACAP38
のcDNAとの構造を比較することによって、イントロ
ンとエクソンの関係を明らかにすると共に、同時に該遺
伝子発現に必須のプロモーター領域を決定することに成
功し、本発明に到達したものである。即ち、本発明は新
規プロモーター、詳しくはヒトPACAP38のプロモ
ーターDNA、該プロモーターDNAを含有するDN
A、該DNAを保持する形質転換体および該形質転換体
を用いプロモーター活性を利用する成熟PACAP38
を含む種々の蛋白質の製造方法に関するものである。
【0006】本発明のヒトPACAP38遺伝子のプロ
モーター活性を有する領域を含有するDNAは、ヒトD
NAライブラリーから次のようにして得ることができ
る。(i)ヒト細胞DNAを抽出し、EcoRI,Sa
lIなどの制限酵素処理DNAをファージDNAまたは
プラスミドに組み込み、(ii)得られた組み換えファー
ジまたはプラスミドで宿主を形質転換し、(iii)得ら
れた形質転換体を培養後、形質転換体から適当な方法、
例えばPACAP38の一部をコードするDNAプロー
ブとのハイブリダイゼーションにより、目的とするDN
Aを含有するファージあるいはプラスミドを単離し、
(iv)その組み換えDNAから目的とするクローン化D
NAを切り出す。ヒトDNAライブラリーからPACA
P38DNAをクローニングする方法としては、例えば
ファージベクターλgt11やEMBL3とPACAP38
のアミノ酸配列に基づいて化学合成したオリゴヌクレオ
チドあるいはPACAP38のcDNAをプローブとし
て用いたプラークハイブリダイゼーション法〔ティー・
マニアティス(T.Maniatis)ら,モレキュラー・クローニ
ング(Molecular Cloning)コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laborator
y),(1982)〕などが挙げられる。このようにしてクロー
ン化されたPACAP38DNAは必要があればプラス
ミド、例えばpBR322, pUC12, pUC13, pUC1
8, pUC19, pUC118,pUC119などにサブクロー
ニングしてヒトPACAP38 DNAを得ることがで
きる。
モーター活性を有する領域を含有するDNAは、ヒトD
NAライブラリーから次のようにして得ることができ
る。(i)ヒト細胞DNAを抽出し、EcoRI,Sa
lIなどの制限酵素処理DNAをファージDNAまたは
プラスミドに組み込み、(ii)得られた組み換えファー
ジまたはプラスミドで宿主を形質転換し、(iii)得ら
れた形質転換体を培養後、形質転換体から適当な方法、
例えばPACAP38の一部をコードするDNAプロー
ブとのハイブリダイゼーションにより、目的とするDN
Aを含有するファージあるいはプラスミドを単離し、
(iv)その組み換えDNAから目的とするクローン化D
NAを切り出す。ヒトDNAライブラリーからPACA
P38DNAをクローニングする方法としては、例えば
ファージベクターλgt11やEMBL3とPACAP38
のアミノ酸配列に基づいて化学合成したオリゴヌクレオ
チドあるいはPACAP38のcDNAをプローブとし
て用いたプラークハイブリダイゼーション法〔ティー・
マニアティス(T.Maniatis)ら,モレキュラー・クローニ
ング(Molecular Cloning)コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laborator
y),(1982)〕などが挙げられる。このようにしてクロー
ン化されたPACAP38DNAは必要があればプラス
ミド、例えばpBR322, pUC12, pUC13, pUC1
8, pUC19, pUC118,pUC119などにサブクロー
ニングしてヒトPACAP38 DNAを得ることがで
きる。
【0007】このようにして得られたDNAの塩基配列
を、たとえばマキサム・ギルバート(Maxam-Gilbert)法
〔Maxam, A. M. and Gilbert, w.,プロシーディングズ
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス・オブ・ザ・ユー・エス・エー(Proc. Natl. Acad. S
ci.,U.S.A.),74,560(1977)〕あるいはジデオキシ法〔Me
ssing, J. ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nuc
leic Acids Research)9,309(1981)〕によって決定し、
既知のアミノ酸配列との比較からヒトPACAP38
DNAの存在を確認する。以上のようにして、ヒトPA
CAP38の前駆体たんぱくをコードするDNAを含有
するDNA(図2)(配列番号:1)が得られる。後述
の実施例1で得られたヒトPACAP38の前駆体たん
ぱくをコードするDNAを含有するDNAの制限酵素断
片地図を図1に示す。またジデオキシ法で決定したcD
NAの塩基配列と、その塩基配列から判明したアミノ酸
配列を図2に示す。上記のようにしてクローン化された
ヒトPACAP38の前駆体たんぱくをコードするDN
Aと、先にクローン化したヒトPACAP38のcDN
Aとの構造を比較することによって、イントロンとエク
ソンの関係を明らかにすると共に、同時に該遺伝子発現
に必須のプロモーター領域を推定した。そしてこの推定
されたヒトPACAP38プロモーターをカバーする部
分からプロモーターとして必須の部分の塩基配列を決定
したものである。該プロモーターとしては、具体的には
配列番号2の塩基配列を有するDNAを含有する領域を
用いることができる。該プロモーターは実施例3で得ら
れた形質転換体エシェリキア コリ(Escherichia col
i) MV1184/pHPR10neo(FERM B
P−4084)から入手できるpHPR10neoから
実施例3の方法に従って得ることができる。また、市販
のDNA合成装置〔例えば、アプライド・バイオシステ
ムズ (Applied Biosystems) 社製〕を用いて、そのプロ
トコールに従って、フォスフォアミダイドによって本発
明のプロモーターの塩基配列を有するDNAを合成する
こともできる。
を、たとえばマキサム・ギルバート(Maxam-Gilbert)法
〔Maxam, A. M. and Gilbert, w.,プロシーディングズ
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス・オブ・ザ・ユー・エス・エー(Proc. Natl. Acad. S
ci.,U.S.A.),74,560(1977)〕あるいはジデオキシ法〔Me
ssing, J. ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nuc
leic Acids Research)9,309(1981)〕によって決定し、
既知のアミノ酸配列との比較からヒトPACAP38
DNAの存在を確認する。以上のようにして、ヒトPA
CAP38の前駆体たんぱくをコードするDNAを含有
するDNA(図2)(配列番号:1)が得られる。後述
の実施例1で得られたヒトPACAP38の前駆体たん
ぱくをコードするDNAを含有するDNAの制限酵素断
片地図を図1に示す。またジデオキシ法で決定したcD
NAの塩基配列と、その塩基配列から判明したアミノ酸
配列を図2に示す。上記のようにしてクローン化された
ヒトPACAP38の前駆体たんぱくをコードするDN
Aと、先にクローン化したヒトPACAP38のcDN
Aとの構造を比較することによって、イントロンとエク
ソンの関係を明らかにすると共に、同時に該遺伝子発現
に必須のプロモーター領域を推定した。そしてこの推定
されたヒトPACAP38プロモーターをカバーする部
分からプロモーターとして必須の部分の塩基配列を決定
したものである。該プロモーターとしては、具体的には
配列番号2の塩基配列を有するDNAを含有する領域を
用いることができる。該プロモーターは実施例3で得ら
れた形質転換体エシェリキア コリ(Escherichia col
i) MV1184/pHPR10neo(FERM B
P−4084)から入手できるpHPR10neoから
実施例3の方法に従って得ることができる。また、市販
のDNA合成装置〔例えば、アプライド・バイオシステ
ムズ (Applied Biosystems) 社製〕を用いて、そのプロ
トコールに従って、フォスフォアミダイドによって本発
明のプロモーターの塩基配列を有するDNAを合成する
こともできる。
【0008】DNAを組み込むプラスミドとしては、た
とえば大腸菌由来のpBR322〔ジーン(gene),2,95(197
7)〕,pBR325〔ジーン,4,121(1978)〕,pUC12〔ジ
ーン,19,,259(1982)〕,pUC13〔ジーン,19,259(198
2)〕、枯草菌由来のpUB110〔バイオケミカル・バイオ
フィジカル・リサーチ・コミュニケーョン(Biochemical
and Biophysical Research Communication),112,678(1
983)〕などが挙げられるが、その他のものであっても、
宿主内で複製増殖されるものであれば、いずれをも用い
ることができる。またDNAを組み込むファージベクタ
ーとしては、たとえばλgt11〔ヤング及びデーヴィス(Y
oung, R., and Davis, R.,)プロシーディングズ・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オ
ブ・ザ・ユー・エス・エー(Proc. Natl. Acad. Sci.,U.
S.A.),80,1194(1983)〕や、EMBL3〔Prischaufら、
ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J.M
ol.Biol.)170,827(1983)〕などが挙げられるが、そ
の他のものであっても宿主内で増殖できるものであれば
用いることができる。プラスミドに組み込む方法として
は、たとえば、ティー・マニアティス(T.Maniatis)ら,
モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning) コー
ルド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spr
ing Harbor Laboratory),第239頁(1982)に記載の方法な
どが挙げられる。またファージベクターにDNAを組み
込む方法としては、たとえばヒューン(Hyunh,T.V.)ら
の方法〔ディー・エヌ・エー クローニング ア プラクテ
ィカル アプローチ(DNA Cloning, A Practical Approac
h)1,49(1985)〕などが挙げられる。
とえば大腸菌由来のpBR322〔ジーン(gene),2,95(197
7)〕,pBR325〔ジーン,4,121(1978)〕,pUC12〔ジ
ーン,19,,259(1982)〕,pUC13〔ジーン,19,259(198
2)〕、枯草菌由来のpUB110〔バイオケミカル・バイオ
フィジカル・リサーチ・コミュニケーョン(Biochemical
and Biophysical Research Communication),112,678(1
983)〕などが挙げられるが、その他のものであっても、
宿主内で複製増殖されるものであれば、いずれをも用い
ることができる。またDNAを組み込むファージベクタ
ーとしては、たとえばλgt11〔ヤング及びデーヴィス(Y
oung, R., and Davis, R.,)プロシーディングズ・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オ
ブ・ザ・ユー・エス・エー(Proc. Natl. Acad. Sci.,U.
S.A.),80,1194(1983)〕や、EMBL3〔Prischaufら、
ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J.M
ol.Biol.)170,827(1983)〕などが挙げられるが、そ
の他のものであっても宿主内で増殖できるものであれば
用いることができる。プラスミドに組み込む方法として
は、たとえば、ティー・マニアティス(T.Maniatis)ら,
モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning) コー
ルド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spr
ing Harbor Laboratory),第239頁(1982)に記載の方法な
どが挙げられる。またファージベクターにDNAを組み
込む方法としては、たとえばヒューン(Hyunh,T.V.)ら
の方法〔ディー・エヌ・エー クローニング ア プラクテ
ィカル アプローチ(DNA Cloning, A Practical Approac
h)1,49(1985)〕などが挙げられる。
【0009】このようにして得られたプラスミドは、適
当な宿主たとえばエシェリキア(Escherichia)属菌,バ
チルス(Bacillus)属菌などに導入する。上記エシェリキ
ア属菌の例としては、エシェリキア・コリ(Escherichia
coli)K12DH1〔プロシージング・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Aca
d. Sci. U.S.A.)60,160(1968)〕,M103〔ヌクレイック
・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Research),9,309
(1981)〕,JA221〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・
バイオロジー(Journal of Molecular Biology),120,517
(1978)〕,HB101〔ジャーナル・オブ・モレキュラー
・バイオロジー 41, 459(1969)〕,C600〔ジェネティッ
クス(Genetics),39,440(1954)〕などが挙げられる。上
記バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サチリス
(Bacillus subtilis)MI114〔ジーン,24,255(198
3)〕,207−21〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリ
ー(Journal of Biochemistry)95,87(1984)〕などが挙げ
られる。プラスミドで宿主を形質転換する方法として
は、たとえばティー・マニアティス(T.Maniatis)ら,モ
レキュラー・クローニング(Molecular Cloning),コール
ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring
Harbor Laboratory),第249頁(1982)に記載のカルシウ
ムクロライド法あるいはカルシウムクロライド/ルビジ
ウムクロライド法などが挙げられる。またファージ・ベ
クターを用いる場合には、たとえば増殖させた大腸菌に
インビトロパッケージング法を用いて導入することがで
きる。
当な宿主たとえばエシェリキア(Escherichia)属菌,バ
チルス(Bacillus)属菌などに導入する。上記エシェリキ
ア属菌の例としては、エシェリキア・コリ(Escherichia
coli)K12DH1〔プロシージング・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Aca
d. Sci. U.S.A.)60,160(1968)〕,M103〔ヌクレイック
・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Research),9,309
(1981)〕,JA221〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・
バイオロジー(Journal of Molecular Biology),120,517
(1978)〕,HB101〔ジャーナル・オブ・モレキュラー
・バイオロジー 41, 459(1969)〕,C600〔ジェネティッ
クス(Genetics),39,440(1954)〕などが挙げられる。上
記バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サチリス
(Bacillus subtilis)MI114〔ジーン,24,255(198
3)〕,207−21〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリ
ー(Journal of Biochemistry)95,87(1984)〕などが挙げ
られる。プラスミドで宿主を形質転換する方法として
は、たとえばティー・マニアティス(T.Maniatis)ら,モ
レキュラー・クローニング(Molecular Cloning),コール
ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring
Harbor Laboratory),第249頁(1982)に記載のカルシウ
ムクロライド法あるいはカルシウムクロライド/ルビジ
ウムクロライド法などが挙げられる。またファージ・ベ
クターを用いる場合には、たとえば増殖させた大腸菌に
インビトロパッケージング法を用いて導入することがで
きる。
【0010】本発明方法におけるヒトPACAP38の
前駆体たんぱくまたは成熟PACAP38をはじめとす
る種々の蛋白質をコードする塩基配列を有するDNAを
含有する発現型ベクターは、例えば、(i)ヒト細胞D
NAを抽出し、EcoRI,SalIなどの制限酵素処
理DNAをファージDNAまたはプラスミドに組み込
み、(ii)得られた組み換えファージまたはプラスミド
で宿主を形質転換し、(iii)得られた形質転換体を培
養後、形質転換体から適当な方法、例えばPACAP3
8の一部をコードするDNAプローブとのハイブリダイ
ゼーションにより、目的とするDNAを含有するファー
ジあるいはプラスミドを単離し、(iv)その組み換えD
NAから目的とするクローン化DNAを切り出し、
(v)該クローン化DNAまたはその一部を発現ベクタ
ー中のプロモーターの下流に連結する、ことにより製造
することができる。PACAP38DNA以外の発現し
得る蛋白質としては、神経細胞由来の蛋白質、即ち Neu
ro Growth factor(NGF)、Brain Derived Neurotro
phin−3(BDNT−3)等が挙げられる。
前駆体たんぱくまたは成熟PACAP38をはじめとす
る種々の蛋白質をコードする塩基配列を有するDNAを
含有する発現型ベクターは、例えば、(i)ヒト細胞D
NAを抽出し、EcoRI,SalIなどの制限酵素処
理DNAをファージDNAまたはプラスミドに組み込
み、(ii)得られた組み換えファージまたはプラスミド
で宿主を形質転換し、(iii)得られた形質転換体を培
養後、形質転換体から適当な方法、例えばPACAP3
8の一部をコードするDNAプローブとのハイブリダイ
ゼーションにより、目的とするDNAを含有するファー
ジあるいはプラスミドを単離し、(iv)その組み換えD
NAから目的とするクローン化DNAを切り出し、
(v)該クローン化DNAまたはその一部を発現ベクタ
ー中のプロモーターの下流に連結する、ことにより製造
することができる。PACAP38DNA以外の発現し
得る蛋白質としては、神経細胞由来の蛋白質、即ち Neu
ro Growth factor(NGF)、Brain Derived Neurotro
phin−3(BDNT−3)等が挙げられる。
【0011】発現させたい構造遺伝子を得る際の、DN
Aを組み込むプラスミド、プラスミドへの組み込み方
法、宿主、宿主を形質転換する方法等については、上記
のヒトPACAP38およびそのプロモーターの遺伝子
決定を行なう際に用いられるものが全て用いることがで
きる。このようにしてクローン化されたDNAから発現
させたい領域を切り出し、発現に適したビークル(ベク
ター)中のプロモーターの下流に連結して発現型ベクタ
ーを得ることができる。該DNAはその5’末端に翻訳
開始コドンとしてのATGを有し、また3’末端には翻
訳終止コドンとしてのTAA,TGAまたはTAGを有
していてもよい。さらにこの5’末端のATGの上流に
はサイクリックAMPに反応するconsensus配列などが
みとめられる。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コド
ンは、適当な合成DNAアダプターを用いて付加するこ
ともできる。
Aを組み込むプラスミド、プラスミドへの組み込み方
法、宿主、宿主を形質転換する方法等については、上記
のヒトPACAP38およびそのプロモーターの遺伝子
決定を行なう際に用いられるものが全て用いることがで
きる。このようにしてクローン化されたDNAから発現
させたい領域を切り出し、発現に適したビークル(ベク
ター)中のプロモーターの下流に連結して発現型ベクタ
ーを得ることができる。該DNAはその5’末端に翻訳
開始コドンとしてのATGを有し、また3’末端には翻
訳終止コドンとしてのTAA,TGAまたはTAGを有
していてもよい。さらにこの5’末端のATGの上流に
はサイクリックAMPに反応するconsensus配列などが
みとめられる。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コド
ンは、適当な合成DNAアダプターを用いて付加するこ
ともできる。
【0012】ベクターとしては、上記の大腸菌由来のプ
ラスミド(例、pBR322,pBR325,pUC12,pUC1
3),枯草菌由来プラスミド(例、pUB110,pTP5,p
C194),酵母由来プラスミド(例、pSH19,pSH15),
あるいはλファージなどのバクテリオファージおよびレ
トロウィルス、ワクシニアウィルスなどの動物ウィルス
などが挙げられる。プロモーターとしては、本発明のプ
ロモーター、具体的には配列番号2の塩基配列を有する
DNAを含有する領域を用いることができる。該プロモ
ーターは実施例3で得られた形質転換体エシェリキア
コリ(Escherichia coli) MV1184/pHPR10
neo(FERM BP−4084)から入手できる
pHPR10neoから実施例3の方法に従って得るこ
とができる。なお、発現にエンハンサーの利用も効果的
である。
ラスミド(例、pBR322,pBR325,pUC12,pUC1
3),枯草菌由来プラスミド(例、pUB110,pTP5,p
C194),酵母由来プラスミド(例、pSH19,pSH15),
あるいはλファージなどのバクテリオファージおよびレ
トロウィルス、ワクシニアウィルスなどの動物ウィルス
などが挙げられる。プロモーターとしては、本発明のプ
ロモーター、具体的には配列番号2の塩基配列を有する
DNAを含有する領域を用いることができる。該プロモ
ーターは実施例3で得られた形質転換体エシェリキア
コリ(Escherichia coli) MV1184/pHPR10
neo(FERM BP−4084)から入手できる
pHPR10neoから実施例3の方法に従って得るこ
とができる。なお、発現にエンハンサーの利用も効果的
である。
【0013】このようにして構築されたヒトPACAP
38の前駆体たんぱくや成熟ペプチドPACAP38あ
るいはその他の蛋白質をコードするDNAを含有するベ
クターを用いて、形質転換体を製造する。形質転換体の
宿主としては、たとえば上記のようなエシェリキア(Esc
herichia)属菌,バチルス(Bacillus)属菌の他、動物細
胞が用いられる。
38の前駆体たんぱくや成熟ペプチドPACAP38あ
るいはその他の蛋白質をコードするDNAを含有するベ
クターを用いて、形質転換体を製造する。形質転換体の
宿主としては、たとえば上記のようなエシェリキア(Esc
herichia)属菌,バチルス(Bacillus)属菌の他、動物細
胞が用いられる。
【0014】動物細胞としては、たとえばサル細胞CO
S−7,Vero,チャイニーズハムスター細胞CHO,
マウスL細胞,ヒトFL細胞,ヒト神経細胞1MR−3
2などが挙げられる。上記エシェリキア属菌を形質転換
するには、たとえばプロシージングス・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.A
cad.Sci.USA),69,2110(1972)やジーン,17,107(1982)な
どに記載の方法に従って行なわれる。動物細胞を形質転
換するには、たとえばヴィロロジー(Virolog
y)52,456(1973)に記載の方法に従って行
なわれる。このようにして、ヒトPACAP38の前駆
体たんぱくや成熟ペプチド(PACAP38)やその他
の蛋白質をコードするDNAを含有する発現ベクターで
形質転換された形質転換体が得られる。該形質転換体の
培養により目的とする蛋白質あるいはペプチドを発現、
製造する。培地のpHは約5〜8が望ましい。宿主が動
物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、
たとえば約5〜20%の胎児牛血清を含むMEM培地
〔サイエンス(Science)122,501(19
52)〕,DMEM培地〔ヴィロロジー(Virology),8,3
96(1959)〕,RPMI1640培地〔ジャーナル・オブ
・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション(Th
e Jounal of the American Medical Association) 199,
519(1967)〕,199培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソ
サイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン
(Pro-ceeding of the Society for the Biological Me
dicine)73, 1 (1950)〕などが挙げられる。pHは約6
〜8であるのが好ましい。培養は通常約30℃〜40℃
で約15〜60時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加
える。
S−7,Vero,チャイニーズハムスター細胞CHO,
マウスL細胞,ヒトFL細胞,ヒト神経細胞1MR−3
2などが挙げられる。上記エシェリキア属菌を形質転換
するには、たとえばプロシージングス・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.A
cad.Sci.USA),69,2110(1972)やジーン,17,107(1982)な
どに記載の方法に従って行なわれる。動物細胞を形質転
換するには、たとえばヴィロロジー(Virolog
y)52,456(1973)に記載の方法に従って行
なわれる。このようにして、ヒトPACAP38の前駆
体たんぱくや成熟ペプチド(PACAP38)やその他
の蛋白質をコードするDNAを含有する発現ベクターで
形質転換された形質転換体が得られる。該形質転換体の
培養により目的とする蛋白質あるいはペプチドを発現、
製造する。培地のpHは約5〜8が望ましい。宿主が動
物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、
たとえば約5〜20%の胎児牛血清を含むMEM培地
〔サイエンス(Science)122,501(19
52)〕,DMEM培地〔ヴィロロジー(Virology),8,3
96(1959)〕,RPMI1640培地〔ジャーナル・オブ
・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション(Th
e Jounal of the American Medical Association) 199,
519(1967)〕,199培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソ
サイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン
(Pro-ceeding of the Society for the Biological Me
dicine)73, 1 (1950)〕などが挙げられる。pHは約6
〜8であるのが好ましい。培養は通常約30℃〜40℃
で約15〜60時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加
える。
【0015】培養物中に蓄積された遺伝子産物は、当分
野における通常の方法、たとえばザイモリエース(キリ
ンビール株式会社製)など溶菌酵素を用いる方法、ガラ
スビーズを用いる機械的破砕法などによって菌体を破砕
して目的物を抽出する。なお必要により、トリトン−X
100などの界面活性剤や塩酸グアニジンなどの蛋白変
性剤を加え、目的物の抽出を容易にすることもできる。
このようにして得られた抽出液からの目的物の分離精製
は、通常知られている蛋白質の精製方法、たとえば、沈
殿剤による沈殿法、透析法、電気泳動法、イオン交換樹
脂などによるクロマトグラフ法、ゲルろ過法、抗体カラ
ムを用いる方法などを組み合せて行うことができる。こ
の精製法の具体例としては、例えばPACAPの製造に
ついてはバイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・
リサーチ・コミュニケーションズ(Biochemical And Bi
ophysical Research Communications),Vol. 164,No.
1,p.567〜274(1989)に記載の方法が用いられ、そ
の他の蛋白質についても同様の方法あるいはそれに準じ
る方法で精製することができる。
野における通常の方法、たとえばザイモリエース(キリ
ンビール株式会社製)など溶菌酵素を用いる方法、ガラ
スビーズを用いる機械的破砕法などによって菌体を破砕
して目的物を抽出する。なお必要により、トリトン−X
100などの界面活性剤や塩酸グアニジンなどの蛋白変
性剤を加え、目的物の抽出を容易にすることもできる。
このようにして得られた抽出液からの目的物の分離精製
は、通常知られている蛋白質の精製方法、たとえば、沈
殿剤による沈殿法、透析法、電気泳動法、イオン交換樹
脂などによるクロマトグラフ法、ゲルろ過法、抗体カラ
ムを用いる方法などを組み合せて行うことができる。こ
の精製法の具体例としては、例えばPACAPの製造に
ついてはバイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・
リサーチ・コミュニケーションズ(Biochemical And Bi
ophysical Research Communications),Vol. 164,No.
1,p.567〜274(1989)に記載の方法が用いられ、そ
の他の蛋白質についても同様の方法あるいはそれに準じ
る方法で精製することができる。
【0016】
【作用】本発明のプロモーターを用いた系により神経細
胞特異的な蛋白質を発現、あるいは神経細胞特異的な蛋
白質の探索を行なうことができ、またPACAP遺伝子
の誘導物質(化学物質)を使用して、例えばサンドイッ
チEIA法を用いてPACAPの産生量を知ることがで
きる。またこの実験系を使用することにより、PACA
Pの産生に必要な化学物質(薬剤)の検索が可能であ
る。これを実験動物で使用することにより、その作用、
特に脳の機能に関する研究、特にホルモン類による脳機
能の理解に応用し、さらにこれらの知見はヒトの脳機能
の解明に役立つ知見をもたらすものである。そして、ヒ
トPACAP38は、PACAP27を含めてcAMP
の上昇活性があることから、ヒト脳神経の成長、維持等
に関して、治療薬として利用することができる。以上、
ヒトPACAP38をコードするDNAのクローニン
グ、プロモーター活性発現ベクターの作製と、それらに
よる形質転換体の製造、該形質転換体を用いたヒトPA
CAP38の一部および成熟ペプチドあるいは他の蛋白
質の製造及びその有用性等について詳細に述べた。
胞特異的な蛋白質を発現、あるいは神経細胞特異的な蛋
白質の探索を行なうことができ、またPACAP遺伝子
の誘導物質(化学物質)を使用して、例えばサンドイッ
チEIA法を用いてPACAPの産生量を知ることがで
きる。またこの実験系を使用することにより、PACA
Pの産生に必要な化学物質(薬剤)の検索が可能であ
る。これを実験動物で使用することにより、その作用、
特に脳の機能に関する研究、特にホルモン類による脳機
能の理解に応用し、さらにこれらの知見はヒトの脳機能
の解明に役立つ知見をもたらすものである。そして、ヒ
トPACAP38は、PACAP27を含めてcAMP
の上昇活性があることから、ヒト脳神経の成長、維持等
に関して、治療薬として利用することができる。以上、
ヒトPACAP38をコードするDNAのクローニン
グ、プロモーター活性発現ベクターの作製と、それらに
よる形質転換体の製造、該形質転換体を用いたヒトPA
CAP38の一部および成熟ペプチドあるいは他の蛋白
質の製造及びその有用性等について詳細に述べた。
【0017】本発明明細書および図面において、塩基や
アミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC−IU
B Commision on Biochemical Nomenclature による略
号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体
があり得る場合は、特に明示しなければL−体を示すも
のとする。 DNA :デオキシリボ核酸 cDNA:相補的デオキシリボ核酸 A :アデニン T :チミン G :グアニン C :シトシン RNA :リボ核酸 mRNA:メッセンジャーリボ核酸 dATP:デオキシアデノシン三リン酸 dTTP:デオキシチミジン三リン酸 dGTP:デオキシグアノシン三リン酸 dCTP:デオキシシチジン三リン酸 ATP :アデノシン三リン酸 EDTA:エチレンジアミン四酢酸 SDS :ドデシル硫酸ナトリウム BHA :ベンツヒドリルアミン Cl−Z:2-クロロ-ベンジルオキシカルボニル Br−Z:2-ブロモ-ベンジルオキシカルボニル Bzl :ベンジル OBzl:ベンジルエステル HOBt:1−ベンゾトリアゾール DCC :N,N’ジシクロヘキシルカルボジイミド GlyまたはG :グリシン AlaまたはA :アラニン ValまたはV :バリン LeuまたはL :ロイシン IleまたはI :イソロイシン SerまたはS :セリン ThrまたはT :スレオニン CysまたはC :システイン MetまたはM :メチオニン GluまたはE :グルタミン酸 AspまたはD :アスパラギン酸 LysまたはK :リジン ArgまたはR :アルギニン HisまたはH :ヒスチジン PheまたはF :フェニールアラニン TyrまたはY :チロシン TrpまたはW :トリプトファン ProまたはP :プロリン AsnまたはN :アスパラギン GlnまたはQ :グルタミン なお、本発明のヒト・PACAP38前駆体蛋白や成熟
ペプチドにおいては、そのアミノ酸配列の一部が修飾
(付加、除去、その他のアミノ酸への置換など)されて
いてもよい。
アミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC−IU
B Commision on Biochemical Nomenclature による略
号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体
があり得る場合は、特に明示しなければL−体を示すも
のとする。 DNA :デオキシリボ核酸 cDNA:相補的デオキシリボ核酸 A :アデニン T :チミン G :グアニン C :シトシン RNA :リボ核酸 mRNA:メッセンジャーリボ核酸 dATP:デオキシアデノシン三リン酸 dTTP:デオキシチミジン三リン酸 dGTP:デオキシグアノシン三リン酸 dCTP:デオキシシチジン三リン酸 ATP :アデノシン三リン酸 EDTA:エチレンジアミン四酢酸 SDS :ドデシル硫酸ナトリウム BHA :ベンツヒドリルアミン Cl−Z:2-クロロ-ベンジルオキシカルボニル Br−Z:2-ブロモ-ベンジルオキシカルボニル Bzl :ベンジル OBzl:ベンジルエステル HOBt:1−ベンゾトリアゾール DCC :N,N’ジシクロヘキシルカルボジイミド GlyまたはG :グリシン AlaまたはA :アラニン ValまたはV :バリン LeuまたはL :ロイシン IleまたはI :イソロイシン SerまたはS :セリン ThrまたはT :スレオニン CysまたはC :システイン MetまたはM :メチオニン GluまたはE :グルタミン酸 AspまたはD :アスパラギン酸 LysまたはK :リジン ArgまたはR :アルギニン HisまたはH :ヒスチジン PheまたはF :フェニールアラニン TyrまたはY :チロシン TrpまたはW :トリプトファン ProまたはP :プロリン AsnまたはN :アスパラギン GlnまたはQ :グルタミン なお、本発明のヒト・PACAP38前駆体蛋白や成熟
ペプチドにおいては、そのアミノ酸配列の一部が修飾
(付加、除去、その他のアミノ酸への置換など)されて
いてもよい。
【0018】
【実施例】以下の参考例および実施例により本発明をよ
り具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるも
のではない。後述の実施例3で得られた形質転換体エシ
ェリキア コリ(Escherichia coli) MV1184/p
HPR10 neoは、平成4年11月26日に通商産
業省工業技術院微生物工業技術研究所(FRI)にブダ
ペスト条約に基く寄託として受託番号FERM BP−
4084として寄託されている。
り具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるも
のではない。後述の実施例3で得られた形質転換体エシ
ェリキア コリ(Escherichia coli) MV1184/p
HPR10 neoは、平成4年11月26日に通商産
業省工業技術院微生物工業技術研究所(FRI)にブダ
ペスト条約に基く寄託として受託番号FERM BP−
4084として寄託されている。
【0019】
【参考例1】ヒトとヒツジのPACAP38のアミノ酸
配列は同一であるが、ヒツジ視床下部から精製したPA
CAP38(Nat.38p)と合成PACAP38(Syn.38p)を
ラット下垂体細胞にin vitro で作用させるとAdenylate
cyclase activity の上昇が認められる。有効最少量は
10~12Mで濃度が高くなるにつれて、その活性を高ま
ることが示された。また合成の27−NH2(図2のア
ミノ酸132〜158番目、次表のSyn.27p-NH2)にも同様
な活性を認められた。それに反して合成ブタVIP(vas
oactive intestinal polypeptide)にはそれ相当の活性
は認められなかった。結果を表1に示す。 表1 ラット脳下垂体細胞培養におけるAdenylate cyclase 刺激試験 cAMP pモル/ml(M±SEM) 実験1 Syn.pVIP 10~12 M 1.35±0.05 pVIP 10~11 M 1.40±0.00 pVIP 10~10 M 1.45±0.15 pVIP 10~9 M 1.75±0.05 pVIP 10~8 M 2.55±0.25 pVIP 10~7 M 3.30±0.20 対照(ブランク) 1.55±0.15 実験2 Syn.27p-NH2 10~12 M 2.05±0.15 27p-NH2 10~11 M 2.55±0.15 27p-NH2 10~10 M 4.00±0.20 27p-NH2 10~9 M 7.90±0.30 27p-NH2 10~8 M 9.20±0.00 27p-NH2 10~7 M 9.20±0.20 Syn.38p 10~12 M 2.15±0.05 38p 10~11 M 3.05±0.35 38p 10~10 M 4.60±0.20 38p 10~9 M 6.20±0.10 38p 10~8 M 8.60±0.20 38p 10~7 M 8.70±0.20 Nat.38p 10~12 M 1.50±0.10 38p 10~11 M 1.75±0.05 38p 10~10 M 2.60±0.10 38p 10~9 M 4.60±0.00 38p 10~8 M 8.05±0.35 対照(ブランク) 1.35±0.05 。
配列は同一であるが、ヒツジ視床下部から精製したPA
CAP38(Nat.38p)と合成PACAP38(Syn.38p)を
ラット下垂体細胞にin vitro で作用させるとAdenylate
cyclase activity の上昇が認められる。有効最少量は
10~12Mで濃度が高くなるにつれて、その活性を高ま
ることが示された。また合成の27−NH2(図2のア
ミノ酸132〜158番目、次表のSyn.27p-NH2)にも同様
な活性を認められた。それに反して合成ブタVIP(vas
oactive intestinal polypeptide)にはそれ相当の活性
は認められなかった。結果を表1に示す。 表1 ラット脳下垂体細胞培養におけるAdenylate cyclase 刺激試験 cAMP pモル/ml(M±SEM) 実験1 Syn.pVIP 10~12 M 1.35±0.05 pVIP 10~11 M 1.40±0.00 pVIP 10~10 M 1.45±0.15 pVIP 10~9 M 1.75±0.05 pVIP 10~8 M 2.55±0.25 pVIP 10~7 M 3.30±0.20 対照(ブランク) 1.55±0.15 実験2 Syn.27p-NH2 10~12 M 2.05±0.15 27p-NH2 10~11 M 2.55±0.15 27p-NH2 10~10 M 4.00±0.20 27p-NH2 10~9 M 7.90±0.30 27p-NH2 10~8 M 9.20±0.00 27p-NH2 10~7 M 9.20±0.20 Syn.38p 10~12 M 2.15±0.05 38p 10~11 M 3.05±0.35 38p 10~10 M 4.60±0.20 38p 10~9 M 6.20±0.10 38p 10~8 M 8.60±0.20 38p 10~7 M 8.70±0.20 Nat.38p 10~12 M 1.50±0.10 38p 10~11 M 1.75±0.05 38p 10~10 M 2.60±0.10 38p 10~9 M 4.60±0.00 38p 10~8 M 8.05±0.35 対照(ブランク) 1.35±0.05 。
【0020】
【参考例2】参考例1で用いた物質をラット下垂体細胞
に同様に作用させたところ、そこでのプロラクチン(P
RL)、ACTH、GHの放出活性も確認された。
に同様に作用させたところ、そこでのプロラクチン(P
RL)、ACTH、GHの放出活性も確認された。
【0021】
【実施例1】 ヒトPACAP38のcDNAプローブ
の作製 クローン化したヒトPACAP38のcDNAを32P−
dCTPを用いたランダムプライム法でラベルし、ヒト
ゲノムDNAライブラリのスクリーニングに用いた。
の作製 クローン化したヒトPACAP38のcDNAを32P−
dCTPを用いたランダムプライム法でラベルし、ヒト
ゲノムDNAライブラリのスクリーニングに用いた。
【0022】
【実施例2】ヒト・PACAPゲノムDNAの単離とそ
の塩基配列の決定 大腸菌LE392にヒト白血球由来DNAライブラリー
(Clontech Laboratories, Inc. 製 カタログ No.HL10
06d)を感染させてプレーティングし、ファージプラー
クを出現せしめた。ベントンとデイビス(Benton, W., D
avis, R.)の報告〔サイエンス(Science) 196, 180-182
(1977)〕に従ってプラークDNAの一部をニトロセルロ
ース膜にうつしとり、32Pで標識した前項のcDNAプ
ローブとプラークハイブリダイゼーションを行なった。
ハイブリダイゼーションは、ホルムアミド非存在下、60
℃で行なった。ハイブリダイゼーション陽性のクローン
を単離し、そのうちのひとつであるλHGP23のcD
NA部分をSalIで切り出してプラスミドpUC 18
のSalI部位にリクローニングし、プラスミドpHG
P2312,pHGP2306を作製した。このプラス
ミドで大腸菌MV1184を形質転換し、形質転換体エ
シェリキア・コリMV1184/pHGP2312とp
HGP2306を得た。このプラスミドに含まれるDN
A部分は11.1Kbpと6Kbpであり、その簡単な制限
酵素地図を図1に示した。図1中、黒く塗られた部分は
ヒトPACAP38成熟体コード域である。このDNA
部分の塩基配列をサンガー(Sanger)の方法〔プロシー
ジング オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエン
ス( Proc.Nat.Acad.Sci.USA)74,5463-5467(1977)〕
によって決定した。この塩基配列を図2に示した。アミ
ノ酸番号132から169の領域が、ヒトPACAP3
8成熟ペプチド部である。図2中、7539〜7649塩基まで
が第1エクソンで下段のアミノ酸M(1)〜R(37)ま
でをコードする。( )はアミノ酸Noを示す。9813〜
9944までが第2エクソンでアミノ酸P(38)〜R(81)まで
をコードする。10420〜10518までが第3エクソンでアミ
ノ酸D(82)〜G(114)までをコードする。11601〜11787
までが第4エクソンでアミノ酸G(115)〜L(176)までを
コードする。ヒトPACAP38の前駆体は176個の
アミノ酸から成ることがゲノムDNAの解析から明らか
にされた。
の塩基配列の決定 大腸菌LE392にヒト白血球由来DNAライブラリー
(Clontech Laboratories, Inc. 製 カタログ No.HL10
06d)を感染させてプレーティングし、ファージプラー
クを出現せしめた。ベントンとデイビス(Benton, W., D
avis, R.)の報告〔サイエンス(Science) 196, 180-182
(1977)〕に従ってプラークDNAの一部をニトロセルロ
ース膜にうつしとり、32Pで標識した前項のcDNAプ
ローブとプラークハイブリダイゼーションを行なった。
ハイブリダイゼーションは、ホルムアミド非存在下、60
℃で行なった。ハイブリダイゼーション陽性のクローン
を単離し、そのうちのひとつであるλHGP23のcD
NA部分をSalIで切り出してプラスミドpUC 18
のSalI部位にリクローニングし、プラスミドpHG
P2312,pHGP2306を作製した。このプラス
ミドで大腸菌MV1184を形質転換し、形質転換体エ
シェリキア・コリMV1184/pHGP2312とp
HGP2306を得た。このプラスミドに含まれるDN
A部分は11.1Kbpと6Kbpであり、その簡単な制限
酵素地図を図1に示した。図1中、黒く塗られた部分は
ヒトPACAP38成熟体コード域である。このDNA
部分の塩基配列をサンガー(Sanger)の方法〔プロシー
ジング オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエン
ス( Proc.Nat.Acad.Sci.USA)74,5463-5467(1977)〕
によって決定した。この塩基配列を図2に示した。アミ
ノ酸番号132から169の領域が、ヒトPACAP3
8成熟ペプチド部である。図2中、7539〜7649塩基まで
が第1エクソンで下段のアミノ酸M(1)〜R(37)ま
でをコードする。( )はアミノ酸Noを示す。9813〜
9944までが第2エクソンでアミノ酸P(38)〜R(81)まで
をコードする。10420〜10518までが第3エクソンでアミ
ノ酸D(82)〜G(114)までをコードする。11601〜11787
までが第4エクソンでアミノ酸G(115)〜L(176)までを
コードする。ヒトPACAP38の前駆体は176個の
アミノ酸から成ることがゲノムDNAの解析から明らか
にされた。
【0023】
【実施例3】クローン化したヒトPACAPのgeno
mic DNAの5’領域を組み込んだプラスミドpH
GP2312からEcoRIとEco47IIIで切り出
した2.5KbのDNA断片(4646〜7159塩
基)をpuc118のEcoRIとSmaIの部位に組
み込んだ。次いで、SV40のターミネーター519b
p(〜0.52Kbp)を上記のplasmidのBa
mHI,SalI部位に組み込んだ、次いでクロラムフ
ェニコールトランスフェラーゼのgeneを上記プラス
ミドのBamHI部位に組み込んだ。次いで、上記のプ
ラスミドにチミヂンカイネースのプロモーターにネオマ
イシン抵抗性遺伝子・polyAシグナルを持つDNA
断片(ストラトジーン社U.S.A.のpMCIne
o.polyA)をSalI部位に結合して図3のプラ
スミドを構築した。図3には2.5KbのPACAP
geneを組み込んだものを示す。PACAPのgen
eがそれぞれ2.2Kb,1.5Kb,1Kbの長さを
有するplasmidを持つプラスミドをpHPR22
neo,pHPR15neo,pHPR10neoとし
た。これらの精製したプラスミド50μgを直径9cm
のシャーレに増殖させたIMR−32細胞にリン酸カル
シウム法(Graham,PL1973,Virolo
gy52,456−457)でかけ、0.5mg/ml
のG418を含むEagles’MEM(EMEM)培
地(血清10%含有)で培養して、生き残ってくる細胞
をさらに培養して、CATアッセイに使用した。CAT
assayの方法はGorman等の方法〔モレキュ
ラー・セルラー・バイオロジー(Mol.Cell.B
iol.)2,1044〜)に従った。それぞれのプラ
スミドをIMR−32細胞にかけた後、その細胞内に産
生されたCATを測定したのが図4である。PACAP
の2.5Kbから1.0KbのDNA断片を組み込んだ
プラスミドにCATを産生することが明らかになった。
その中でも1Kbの断片を持つプラスミドの活性が最高
でありヒトPACAPの遺伝子上のプロモーターは先に
クローン化した17Kbの塩基番号6143〜7159
塩基の中にあることがわかる。さらに短くしたPACA
P geneを組み込んだplasmidを構築し、I
MR−32細胞にかけてCATを測定すると図5に示し
たとおりpHPRneo6.6(657bp 6503
〜7159塩基)(配列番号:2)のプラスミドに最高
の活性が認められた。この結果から少なくともPACA
PgeneのEcoRIからEco47IIIの領域(4
644〜7159)の中にプロモーター領域がある。こ
れらの結果からヒト、PACAPgeneのプロモータ
ー領域が推定され、これらのプロモーターを利用して、
神経細胞を使用した発現系が利用できる。
mic DNAの5’領域を組み込んだプラスミドpH
GP2312からEcoRIとEco47IIIで切り出
した2.5KbのDNA断片(4646〜7159塩
基)をpuc118のEcoRIとSmaIの部位に組
み込んだ。次いで、SV40のターミネーター519b
p(〜0.52Kbp)を上記のplasmidのBa
mHI,SalI部位に組み込んだ、次いでクロラムフ
ェニコールトランスフェラーゼのgeneを上記プラス
ミドのBamHI部位に組み込んだ。次いで、上記のプ
ラスミドにチミヂンカイネースのプロモーターにネオマ
イシン抵抗性遺伝子・polyAシグナルを持つDNA
断片(ストラトジーン社U.S.A.のpMCIne
o.polyA)をSalI部位に結合して図3のプラ
スミドを構築した。図3には2.5KbのPACAP
geneを組み込んだものを示す。PACAPのgen
eがそれぞれ2.2Kb,1.5Kb,1Kbの長さを
有するplasmidを持つプラスミドをpHPR22
neo,pHPR15neo,pHPR10neoとし
た。これらの精製したプラスミド50μgを直径9cm
のシャーレに増殖させたIMR−32細胞にリン酸カル
シウム法(Graham,PL1973,Virolo
gy52,456−457)でかけ、0.5mg/ml
のG418を含むEagles’MEM(EMEM)培
地(血清10%含有)で培養して、生き残ってくる細胞
をさらに培養して、CATアッセイに使用した。CAT
assayの方法はGorman等の方法〔モレキュ
ラー・セルラー・バイオロジー(Mol.Cell.B
iol.)2,1044〜)に従った。それぞれのプラ
スミドをIMR−32細胞にかけた後、その細胞内に産
生されたCATを測定したのが図4である。PACAP
の2.5Kbから1.0KbのDNA断片を組み込んだ
プラスミドにCATを産生することが明らかになった。
その中でも1Kbの断片を持つプラスミドの活性が最高
でありヒトPACAPの遺伝子上のプロモーターは先に
クローン化した17Kbの塩基番号6143〜7159
塩基の中にあることがわかる。さらに短くしたPACA
P geneを組み込んだplasmidを構築し、I
MR−32細胞にかけてCATを測定すると図5に示し
たとおりpHPRneo6.6(657bp 6503
〜7159塩基)(配列番号:2)のプラスミドに最高
の活性が認められた。この結果から少なくともPACA
PgeneのEcoRIからEco47IIIの領域(4
644〜7159)の中にプロモーター領域がある。こ
れらの結果からヒト、PACAPgeneのプロモータ
ー領域が推定され、これらのプロモーターを利用して、
神経細胞を使用した発現系が利用できる。
【0024】
【0025】
配列番号:1 配列の長さ:17041 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源: 生物名:ヒト白血球 配列の特徴 特徴を表す記号:CDS 存在位置:7539・・7649 特徴を決定した方法:E 特徴を表す記号:CDS 存在位置:9813・・9944 特徴を決定した方法:E 特徴を表す記号:CDS 存在位置:10420・・10518 特徴を決定した方法:E 特徴を表す記号:CDS 存在位置:11601・・11787 特徴を決定した方法:E 特徴を表す記号:mature peptide 存在位置:11653・・11766 特徴を決定した方法:S GATCACGAGG TCACGAGATC GAGACCATCC TGGCCAACAT GGTGAAACCC CATCTCTACT 60 AAAAATACAA AAAATAGCTG GGCATGGTGG CCCATGCCTG TAGTCCCAGC TACTCGGGAG 120 GCTGAGGCAG GAGAATTGCT TAAACCCGGG AAGCGGAGGT TGCAGTGAGC CAAGATCGCA 180 CCACTGCCTC CCAGCCTGGT GATGGAGTGA GACTCCATCT CAAAAAAAAA AAAAAAAAAT 240 TCCTAGAGAA AATAAATATG CCAGTATAAC ATATTATAGT CATTAAGACT GTCTGGAGTC 300 ATTGAGACTT GAATCTGAAG TTCAGCATTA CAATGTAGCA GCTGTGTAAC TTTGGATAAG 360 GTACCTGAGC TCTTTTAGTC CCGATTTCTT GTCTGTAAAA TGGAGGTAAT AACAGTGCCT 420 ACAAAGAAGT TTGTTGTGAG GGAAAGGAAA TAAGTAGTCA AGCACTTAGC CCAGGAAGTG 480 TTCATTAAAC AGTTGTTGCT GTTGCTGTTA TTCACTGGTG AATAACAAAA CCATACAGTC 540 CCTTTGGAAG GAAGGATTTA AAATAATTTA AACAAATAAT CACTAAAAAT TTCAACCAGT 600 ACATTTATGA CAAATGTAAT AGTATTCCAA GCAGATGATA GTTTTTAAAA ATTTATGCCT 660 GTGTATATTT GGGTAGAGAC AAAGGATTAT TTAAAAAGTA TTTTCAGGTT GGGCACACTG 720 GCTCATCCTT GCAACCCCTG CACTTTGGGA GGCTTGAGTC CAGGAGTTTG TGACCAGCCT 780 GGGCAACACA GGGAGACCTT GTCTCTGCAA AGTAATAATA ATAACAATAA TAATAAATAA 840 AATTAGCCAG GCATGGTGGT GGCATGTGCC TGTAGTCCCA GGTATTCAAG AGGTTGAGGC 900 AGGAGTCTCA CTTAAGCCCA AGAGTTTGAG GTTGCTGTGA GCTATGAATG CACTACTGCA 960 CTCCAGCCTG GGTGACCGAG GAAGACTCAG TAAAAACAAA ACAAAACAAA CAAACAAACA 1020 AAAACTGCAA AGCCGTGATT ACCATACAGT GCTAGTAATA ATGATAATAA AAACAAAGGC 1080 TCCAAAATTA TTACATGTAA ACCTATATTC ACAGGTAGAT AATGCCAAGC CTGAGCCCAA 1140 AGGGAAGAGG GATGCTAGGG GCTCACAGAG GAAGACCTTC TTTTGATTTT ACACACAAAA 1200 ACCTTGTTTT ATTTTGCATA TAGATTCCCC TTCCAACATT TTCTGAAGTG GTCTCAAAAG 1260 CTTATTTAGG ATATTGGTTT TCCTGGATCC TGTCCAAGCT TTTCCTTCTG CATTTAAGCC 1320 TTATGTCAGC AGAGGATTTA GACTAAGTAG AGAGAAGACT TTCTTCTCCT TGGCTTTTTA 1380 GAGGAGGTGC TCTGGAATTT GGAAGATGCT ACACAGTGAA GTCTGGGATA TACATTTTTG 1440 GTACCCAGTA AACTCATGTT CAGAGAATAA GGCCTTAGTA GAGCCATATA TGTGAGATAT 1500 TTGGAATCAT CCAAACCTGT AGCAAAGGTT AGATCCTGGT TTTTGTTTCT CAGATGTCTG 1560 CTTTATATCT CAAAACAACA AGCAAAATTT CTTGGCTCTG TGAATATGCA ATTCTGTTCT 1620 TAGATTAGAG AGAAGCTTTA CTCATGTGGT TTGGAAGGCT TCCTTTCCTA GTTGTTTTCA 1680 GTGTGTGAGA AGCACTACAT TTTGAAGGTC AGAGAAGTCA TGACACATTA TAGGTAAGCT 1740 CATCAGCTTC TTACTTCACA GTGAGTTCTG AAAGGCATGA TGCATGCAGT CCAGTAAGTG 1800 ATGGTCATGA TGTTCTGGTT CAGAACATTT GGGTTTCCCT ACAGGTGTAA TCGGTATGAA 1860 GTGAGTCATT AGTCATTGCA TTTTCTGGAA AAGTCGGTAG AGAAAAGTTT AAGTGAAATG 1920 TAATACAGTG TTATAATTCA CTTTTGTCAC TCACAGGAGA GGATGATGTT TTGCATCAGG 1980 CTTGTTTACT GAAAAAGCTT ATTATAGCCT GGTTCTTATG CTAAGTACTG GCTAAAAAAG 2040 AATAGAATGT GCCAGGCACG GTGGCTCACG CCTGTAATCC CATTACTTTG AAAGGCTGAG 2100 GCAGGTGGAT CACAAGGTCA GGAGTTCGAG ACCAGCCTGG CGAACACGGT GAAACTCTGT 2160 CTGTACTAAA AATACAAAAA TTAGCAGGGT GTGGTGGTGG GTGCCTGTAG TCCCAGCTGC 2220 TTGGGAGGCT GAGACAGGAG AATCACTTGA ACCTGGGAGG CGGAGGTGGC AGTGAGCCGA 2280 GATTGTGCCA CTGCACTCCA GCCTGGGGGA CAGAGCGAGA CTTCATCTCA AAAAAAAAAA 2340 AAAAAAATGC ACAACTTTTC CAATCTTGAT TTAGATTATT TATACTAGGA ATGTGTGAGG 2400 ATGCCTTGAA CAAACATGTC CTTTTATATG GTTAAGAAAA TCAAATGTTG TAGGATATAG 2460 AGATAGTGGT AGTAAAAGGT AATGGTGTAG AGATATGTAC CTAAGGAAAG AGAATGTCAT 2520 GGAGAAACCC TGGGTACTAT GGGTGACTGA GCCAAAAAGA AAGTAGTGGA AATCTTATCT 2580 AAGTGACCAG AAGCCGCACT TCACTGGGCT GCTTAAAGGC AAAAATACTT TTAGCTCACC 2640 ACTGATTTGC AATATGGGGA TGGAGGGGAG CAGTGTTTAA AAGATGCTGA AGATTCCCAT 2700 GCAATATAGG GAAAGCCAAT TTCCCAAGTG GTGATGGTCC AAAGGCAGGA ACCTGGCACA 2760 GACACAACAG TACAAACACT ATAGTATTTG CTAATGTTGT GAAGCCATCT GCAATTCAAA 2820 CTCCCAGTAT ATATACTAGA CATATTCCTC CTGTTTGAAT ACAAAAACCC ACTTCCTCAA 2880 AGGCTAGAGT TCTTTAAATT GAATGTTAAT TCAAGGTTCA AGGATTAACC CTTCAACAAA 2940 GGCGGATGTG TTAGCCACCA GGAAAAACAA TTCGGGGAAG GGTTAGTTTG ACTTTTAGCT 3000 ATTATTTATC ATTTCTTACC CAAACTTGTT TTCACATCTG AAGGACCAAC AGGATAAAAG 3060 TTGATACATT AGGGACTTGA AGTTCAGAGT ATTATTAAAT CATTTCCAAC AAATATATAT 3120 AAACAGCGTC TTCCGGGCAG GTCAGGGCTT AGCTCAAGTC ACTTTCAGTT GCTGTGCCTC 3180 AGGGAGGATG CTGGTTAGAC CTCCCACTGA AAGATTTCCA TTGTTCTTCT AACTTTTCTA 3240 GCCAAACATG ATTCCAGTTA ATGTAACAAT CTCATAGCCT GGAAAGAAAC TGCCAGCCTG 3300 GGAAATCTAC TTTTCTGGCC TGGGAAGTAT TCTGGTGAGC ACTGAGGGAA GGGAGTAGGG 3360 GTGTTGGAAA GAAGACTTGA AATTCCTTTG TGTTATCTGT AAATAGAACG TTCTAACTCT 3420 TTGGTCTCTT CTTCCTCCTC TCCCCCAACC CCCTCTTTCA TCATTTTCAA TTATATATAG 3480 GAGGTTGGAA AGTTTCTCTT GAGCTCTTAA CCCCAGTCAC CTAAATACCC TTTGTGAGGG 3540 AAACTGGGTA AGAACAATTA AAGTGGAAGG CTCTCCTACC CTGGTCTTGC TCTTCCCCAA 3600 TTCTCCTCTA GCTCCTCCTC CCTTTATCTC TCTCTCTTCT CATAAAAGTG CTTTAGTTGA 3660 GGCTTCCTAG GATTCACCCT CCAGCTCCTA TCTGCACTTG AAGCCAGGCT GGGGTCTGCA 3720 CTTGCAATTA GTATGTCTGT TGGACTGGGC CACGGTATCC CACCTGGCCA CTGCCGCATG 3780 CCTCCTCAGT GCATGCCGGG GCTCCTGGTC TCTCTAGCCT GGGGCTTTGG GCTGACAAGT 3840 CCCCTCTTCC TTGCAGCTCC CTCAAAGTCC CAGACACAAA GGCCTCCAGG ATGCTCTGTT 3900 AATGCTTGAC TGGAGCCTTC CAAGATTAGA ATCAAAGGGG CATTTGGGGG TAGTTTTGGT 3960 CTTTGAGACT TCAGTCATCC CATATTCCCT CTACCCAATA GAAAGCAGAA GGGGCCTATA 4020 CTCTCATCTA GCAGCTTCTA GTTCCTCCTA TTTATTGGCC TTTTCCCTTG GCCCAGGGCC 4080 AAGGCCAGAT TTTCATGAAT AGGAAAGCTC TCCTGCAGAG AGATGTCAAA CATGCCCAGC 4140 TAGACAATGG CCATGAGCAA CAAAAGATCT GTGGGTGATC CTGTAGGAGT TTGATTCCCC 4200 CAGGCTGCTG TGGGCAGGGC TGTGTGGGTC TTTAGATTGT GTTGAGCAAT TGGTGGGTCT 4260 AGGAAGCTTG ATTTTCTGGA GTTCAGTGAC CTTGAATCTC AAGTTCTCTG TTTAGTCTTT 4320 CACTCTCGTG AATGGGTTCA GGTCTGAAGG CCTGTAATTT TTGGGTGCTG AGCCCCGAGT 4380 TCTGAGCTGA GAGTATCTAA GCTGAGAAGA GCACGGGGTC ACAGCCTTGG TAAGTCAGAG 4440 GCACAGTTCA GCCTCTGTTG GCCCTTGGAG CCAGCAGTTA GTTGTCCTCC CCAGATAGTT 4500 AATCGTGTTT GTGGTTTTCC CCCTTTAATG GGCCGTGAAG TCAGCAAACT CCCCACATGG 4560 TGGCTCCCTT TACTAAAGTT GAGTAGTGAA TTGTACAAGG AGTCTTGGAA ATTTTCAAAT 4620 ATTTCTCCAG ATTGAACTCA ACTCAGAATT CGTGTGGGAG GAAAGAGTAA GGATTTTAAT 4680 GGGGTTCACC TTTGACGTGA AGCAAGGCGG AAGACAGGAA AGCCACAGTG GGGAATAGCT 4740 TTGGGCGCTT TAGTAAGAAA GACATCTCTG CTTGATTATC TGGTAGTGTT CACCGCAGGC 4800 TCTTTGTGTG CGAGCTTGCT GCAGAGGCAG AGCTGAACAC GGAAAACACG CATGTAAACA 4860 GTCCAACATA AATCAGTGAG CATATGTATC AGAGAAAAAG AGACATATTC CCATGTAGAT 4920 GTGGTTTGAA GCTTTATTGA AGGCAGACAA TCTGAAGCAC GGCCAGGAAT AAACTAAGAG 4980 GAAGCAGACA GTTTTCGGTC ATTCATGGCC AGGAATAAAC AAAACTTAGT TTTTTTTTTA 5040 AGAAGGAGGA AGTATTAAAT CTCAAATAAG AGCAGGAACA GCATTTAGAA GGAGAAATAT 5100 AATATCTTGG AAAAAGCAAG CAGAACTAAT ATAGCTTATT TAAATGTGAG ATCCAAATCG 5160 TAGTAACAGG AAACCCTCCC ACTAAACTGG AATTTCCCCT AATTTTTGTG TAAGATCCAA 5220 ATAATTAAAA TGCACTCTAA TGGTTATTGA TGGCTCTATT TTCTTTCTTT CTTTCTTCTT 5280 CTTCTTTTTT TTTTTTTTAA AGAAATAGAC CTGAGTTCTC TTACTGGAGT AGAAATATAT 5340 GAACCTTCTT CAATTACCCA GGAAATTGGA AGCCTCTGGG TGGATATGGT CTTCCCTTAT 5400 TGCTTTCCTC TTCCCACATC ATTTTCAGTT AAAAAAATTA ACTGTTTCCA GCAGAGGGAT 5460 TCCTGTTAGA AACCTTCATC AGGTGAACTT GTACTGGGAA CCCTCATGCT TTCCCAGTCT 5520 GTCTGTGTCT CCCAAACAGA GCTGAAGTTG TAAACAAAGT GGAAAAACAT ATTTCTCACC 5580 CCAAAATTCT TAAAATTTCA CTTCTTGTGG AAAACACAAT TTCACAACAT CAATTTTTAA 5640 AATCTGTAAG AGCCACAGAA GGTGTGAAAG TAGCCAAACA GCCGGTCTAG AAATCCAAAA 5700 GCCAGGACTA ACGGGGGACA GAATGCTTTT TCCTCAAATC CAGGCAGGGA TGGGGAGCAT 5760 TCTCAGCATT AGGGCATTTA TGGACGCTAC AAGGGGAAAG GATGTATCTG AACGGTGGGG 5820 GTGATTTAGC GATGAATCGC CACGTTAATA GCACTACTGC CAAATCTTCA AATTTAGAGG 5880 CTCTGGTGAA AAATTAAACC GGTGGCAATT TTCAACGTTT GTAGCATCTG TTACCCTACA 5940 CTTCAGCACC CGGAGTCTGG ACAGCTCCGC AGGCCGCGCT CCGGAGGCAG CATGAGCTCT 6000 CATCAATCTA CTCATAGCCC TACTGTCAAC GGCAGCCAGA CTCAGGAGAG ATTTACTGAA 6060 AATCCTCCAA GACTTCCCTT TAAAAACAAA ACGACTTCCA CATTTAATGG TCTATCTGAA 6120 AGAACATACG CAAGAAATTA GGAGATCTAA ATTAAATTTA TTAATAGGAG AGCTTGATGA 6180 TGCTTAATTC CAGAGACCAG AGCTCCGATT GGTGAGGCTT GATGAAAAAG TAAAGAGAAA 6240 TCGTAATTGT ATAGTTAAAA ACATAACTTT TGTCATCCTC AAAATTCTAA AAATTCTTTA 6300 CCTGTCCTTG GGAAATGGGT GAAATTGAAA ACCATCAAAA CAATTGGACT TCTTAAAAAT 6360 TGGATTGTAT GAGTGAAAGG TGTTTATGAG AAGTCGATGA CTCCGGATCT TATCATCCAA 6420 GAGGACAGCA CAGAATAGTT AATATGTTCC TTGAGGGACT AGGATGCTGA CGTCTTTTTC 6480 TGATACCCGA TCATTACGTG ACTGAGAAAA AAAAAAAGGA AGTCATTTCA TGAATAAAAA 6540 TCGGAGCGCA ACAGTGCAAC AAAATATTCT GTACTTAAAG GCAACAGGCA GGCAGATGTT 6600 GACAAAGAGG GCTCTCCAAA AACCATGTTC GGATAGATTT TTGCGAACTG CACAGATAAA 6660 TAGGAGCAGA AGGCCGGTCA CCTCTGTAAC CAGCGGTAGC AGCAGCAGAA GCCGCAGCTT 6720 CAGAGGCAGC CGGAGAGACC TCGGAGCAGA GAAGGCGCCG CCGACCCTCG CGGCTGCCTG 6780 GCCCGCGGCT CCTACAAAGG CGGGCTAGCC GCCCGCCCTC TCCCTTGCCT TCCTCCCCTT 6840 CTTTTCTGAC TTTCCCTCTT TCCCTTAATC GCCTGCTTCT TCCTCCGGGT GGACTTACGG 6900 CCACCTTGCT CCTCCGCGCT TCACCTCATC GCCCCCTCTT TCTTTCTTCT GCCTCTCTCT 6960 CTGCGCCCCC TTCTCTCCGT GTCACGCTCC CTCCTGGTTC TGCGCGTCTA CAAACTTTTG 7020 AGCAGAACAC GAGCCTCGGC AAACGAGTCC CGCAGCTCCT CCTGCTGCTC CCGCTGGTTC 7080 CTGCGGCTTC TGCTCAGACA CCAACGCCAG ACGGCGATGC CTCTCGGGTG GTGACTCCAG 7140 CGCAGGAACT TGAAGAAGCG CTTTGCCCGC CGTCCTACCT GGCAGCTCTC CTGGCAGCGG 7200 GAGGAGTTGA AGGGTAAGGG AGGGAAAATC TTACCAAAGC GACCGGCTCA CTCGACTGCT 7260 GATTCTTTCG CTTGGCGTCG CGTCAGGGGA GTTAGCTTTC CTTCAGCCGG GTCTGGCTAG 7320 TTATTGGGCG CCGGGTAGAT GCATATATAT ATATTTTTTT CTAACTATAG CAAGCAAGAA 7380 GTGGCAGGGC GCGCACCGGC TGTCGCCAAG TGCTGTTCAA CTCAGGGAGC CGGGGCTTCG 7440 CTCCGTCCCT CCCCCGGCTT CCAGAGCTTT TTGGGGTTGG AGGGTGGGAG GCCAGGGGCG 7500 TTCTCACAGC TGTGTGTCCT CTTTCCCATC CTGCGCAGA ATG ACC ATG TGT AGC 7554 Met Thr Met Cys Ser 1 5 GGA GCG AGG CTG GCC CTG CTG GTC TAT GGG ATA ATC ATG CAC AGC AGC 7602 Gly Ala Arg Leu Ala Leu Leu Val Tyr Gly Ile Ile Met His Ser Ser 10 15 20 GTC TAC AGC TCA CCT GCC GCC GCC GGA CTC CGG TTC CCC GGG ATC AGG 7650 Val Tyr Ser Ser Pro Ala Ala Ala Gly Leu Arg Phe Pro Gly Ile Arg 25 30 35 TAGGTGCTGG CTGCCTGGCC CAAGCAGGAG CTGGGGCTCC CCAGGCACAG ACGCTTCCTC 7710 ACGGTCTCCT TCCTGCAGTC CTTTGGGTCC AGACTACTAG CATCGCCCTC TGCGCCCCCG 7770 GTGCGCCTCC GCCAGCCTCG GCTGGACAGC GGGTCCCCAT TCTAGCCGAG GGTCTGGCAG 7830 GCTCCGCGAC TGCTCGGACG CCTCCCCCAG CCCTAGGCAG CTCAGGGTCC CGGGTAGAGC 7890 CAGTGAGCTT CTGGCCGCTG GAGAACCCCC CCTCCCCCAA CCCGGCCCAC AGGATGGGGG 7950 CAGGGCACGG CCCCTAGCTT GGTTTCTTTT ACCTATTCTT GGGACGAGTT AGGAGAACTT 8010 CAGCTCTGGA GCCTGGCCGG GGGTTGAGCG TGAAGCTCCC TCGGACTTTG CTTTGTTACT 8070 GCTTGTTCTG GACTATCCGG GTGGGGTCTC TCTCTCTCCT CCACCCTTTC TTTTCATTTC 8130 ATTCCAATTC TTTCCCCTGA AGAGCTTTCT TTCAAGTGAT CCGTGTTCCA ACTGCATTTT 8190 GAATCCCAGG CTGTCTTGGG GGGCGTGCGG TGGGGAGGGT GTTGGCCCGG TGTGATTGAG 8250 GAAAAGCGAC TTAAGAGAGG GAAGAACAAG GACGAGACTG CGAAGGAGGG GGAAAAACAG 8310 GCGCAAAGGA GGAGGAAGGG AAAGCCAGCA GGCAGGCAGG ACCGGGAGAG CAGCCCTGCC 8370 TGGCCCGGGA TGGAGGAACC TTGGCTTTTT TCTTAACCCC GGGTTTCTAA CCCGCAGGCG 8430 CGGCCCAGGT TCCCGGAGGC AGCCCCAGAG TCGCGGGCCG ATGTGCCAGG CTGTGGATGA 8490 GCCCCGGGTA GGGGAGGGTT CGTACCAGCG GCGCCTGGGG CAGCGAGGAG CGCGCGTTCT 8550 GCCTGCGAAG CTGCCTTCTC CGAGCCCCGC CCAGGAACAT TAGCTCTGGG GGGCCGCTGA 8610 TCATTGATTT GGACGGAGAG ATGGGTTCTG GGTTCTGTAT TAGGATTCCA GCATCTGGGC 8670 TCGAGGCAGG GCAATATCCA GAAAGACCCC AGGGTTCGGG GTACCCGGGC CAGGGCTGAG 8730 GCGCATCGCC GAGCAAAGGC TGGGTGCGAG GCGTGCGGAA TGATGCGCTT GCCTTGCCCG 8790 GGCCTCTCCA AGGATGGAGA AAAGGCGAGT GAAGTAGCGA AGTACGACTC CAACCCCGCC 8850 CAGAGAGTGC TACTAGCGCT GGCTGCACGC CAAGTCTCTC CAGGGGTCCA AAGCGAGAGG 8910 GATTTGTTTT AACCCATCTC TACCCGTCCT GTGTCAAGAA CGGAGGCTGT AGAGGGCGAC 8970 TGCGAAGTCG CCAGGCACTC GCTGGATCTC GGTCCCCCTC CTCGTGCTCT GGGGTTGAGA 9030 TGGGGCACCG CCATCGATAA CAGATCAGCG CGAACTATTC GTTTAGTGGC CTTAAAACAC 9090 CCTGGTTTCA CCCTCAGCTA TTTTCAAGTT CCCGTGTGCC TGGCACTTTC TCCGTGCGAG 9150 AAGCACCGGA GGGTGCGGAC GCGCCACAGT CTGAGCCGCC GCCGAACTGG CTAAGTTTAG 9210 GGGCATTTAT TATTCATGTT CCTGCCAGAT CCTCGCCTGC CCAAAATAGA AACCGAGGTT 9270 CTCCGTGACC TACATCTGCT CGGGGAAGGG CTCCCCTGGG CTCGGAGGCT GGGGTGGGGG 9330 TGGCTGAGGA GTTGGCCCCC GCACGCCCCA CGCATCCTCT CCTTTGCTTT CTGGGCCTCC 9390 CCATTCGGGT CTTCGCGTGG GTCAGCGCCC GGTCTCCCAG GGCCTTTCTC GTCCCCGCCC 9450 GTTGCTGCTT TGGGGAGGCT CGGGAGCCAG GCGGGGAGGG GGGCGGTCCT TTTCCGTAGA 9510 CAGGTGTGCG CGATCGGCGG AGACGCCTCG GTTTCCCAGC GCTTGTTGAG GCCGTGGCCC 9570 GCAGGACGAC CCTTTACCCG CGAAGGGGGG GTGGGCGGGA CCGCCCGGCG GGGTAGGAGT 9630 GGTTGGGTGT CGTTGCCTCC TCCTTACCTC TGCTCCCACC CCCAGTCCTG GGAGAAGAGA 9690 CAATTCTCAG CGGAGGACTT TTATCACCTG TGAAAATCCG CGCGAGCCCC TTACTTTGGA 9750 TCCTCGCCGA GCTGGGGAGG AACTTGCACT GACCACACCT TCTGTCCCCG GCCACCCCGC 9810 AGG CCA GAG GAA GAG GCG TAC GGC GAG GAC GGA AAC CCG CTG CCA GAC 9858 Pro Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Glu Asp Gly Asn Pro Leu Pro Asp 40 45 50 TTC GGT GGC TCG GAG CCG CCG GGC GCA GGG AGC CCC GCC TCC GCG CCG 9906 Phe Gly Gly Ser Glu Pro Pro Gly Ala Gly Ser Pro Ala Ser Ala Pro 55 60 65 CGC GCC GCC GCC GCC TGG TAC CGC CCG GCC GGG AGA AGG TGAGATTCGC 9955 Arg Ala Ala Ala Ala Trp Tyr Arg Pro Ala Gly Arg Arg 70 75 80 GCGGCCTCGC GCACACCCGC GGCTGGGAGC TCGGGACTGC GGTGACGGGA GGGGCAGTGT 10015 GGTGACCCAC CCAGGATTTT TTTTTTTTTT CCCGTGAAAG TCCTCAAGCC TGTCCTCTCC 10075 CTGGCCCGAT CCTATTGCAG CGACAGAAAA TCAGCAGCGG GCGGGTCTGT GTGGACCTGA 10135 GGGCCGCGTG GGGACCGAGG GGGGCTGTGG CCCAAAGAGT GGCAGTGAGT GGCGTCAAGG 10195 AACCCACACT CCGCATCTGC CACTCCTAGA GCCGGGACTA GCTCCCGATC CTAGCAGTTG 10255 CTCTCGAGAT CATCCCGGGA GTTATTGGCG AGTTCTGGGC CTCTGGAGGT TTCCCTGTCA 10315 GCCTCCCCGG CCGCCGAGGG GGCGCGCGCC CAACAAGGGG GTCTCTAGCG GCCACCTGGG 10375 GACAGAAACA GTGACCCTGG GCGCGCACTT TGCCTCCCCG TTAGA GAT GTC GCC CAC 10432 Asp Val Ala His 85 GGG ATC CTT AAC GAG GCC TAC CGC AAA GTG CTG GAC CAG CTG TCC GCC 10480 Gly Ile Leu Asn Glu Ala Tyr Arg Lys Val Leu Asp Gln Leu Ser Ala 90 95 100 GGG AAG CAC CTG CAG TCG CTC GTG GCC CGG GGC GTG GGG TAAGAGTTTG 10529 Gly Lys His Leu Gln Ser Leu Val Ala Arg Gly Val Gly 105 110 TGGAAGGATT AACCTGCGCG CGCCGGGGTG GGTGCCTGTG CGGGGCGCGC GGGGCGGGCG 10589 GCGGTGGGTG CCCGTGGGGG CCAGGGTGAG TCTGCGCCCC TGGGTCTGGG GTGGGCATCC 10649 GCCACGGGTC GCAGTTGGAG ATTTTGAAGT GGCACTTTAA ATTTGCCCAG AGAGCTCTGG 10709 AAGAGGCAAA AAGGGAACGC GAGCCAGGGA GTTTGATCCG TTTTGAATGA AAAGAAAGAG 10769 AAACCAAACC AAACCTCTCA GTCATCCAAA ACCTTCAGGC TTCCAGGGAG GTTTTGCTAT 10829 AATTTTCTCT AAGCATGACT GTTTCTGGGG GAGGGGAAAG GGGTGGTTGT ATTTACTGAA 10889 AATTCAAATC GAAATAATAA ATGGCCAAAT GTGGACACTT ATGGACCCAA ACAGTTTTGC 10949 TCACGCCAGA GAAACTGAGA GCACAGGGCT TGCGTGAAGC CTATCTCGGC AGAAGGCAAC 11009 ATTCTAATAA AGCCCGTGGG AAAACAGATT ACATTTTCGC CATGAATAAG TCATGCAGTG 11069 AAAAATATTG CCTACAGCCT GTCGACTTAT ATTATTATCA CGTTTTTCAA CTCGGCGTGA 11129 GGAGGGAGAG GAGTGTTCAT ATTTGACTAG GAATTGCAGG ATCGATGCAA ACTCCAGGGC 11189 AGCAGCCAGA CTGGCATATG TAGGGCTCTC CGGTTACTTT CTCTGTATGT CGCGGGTGAG 11249 AGGAACAGCG AGGACAATTT AGCGCAAACA CACGAAGGGT CGGATCTCAA GGGGGCAGCG 11309 CTGGGAGAAA GGTTAGGCTT GAAGCGCGCG TCGCCTGCCC GGATCTTATC CCGGGCCCCC 11369 TCCGCAGGGT TTGGTGCCAG GAGATCCTGC GTGGGGAGGG GGGCATCGAG GGGCTGCCGT 11429 CTCGGCCCTC CCCACGGCTG CTTCCAGGCA GAGGCGGGCG ACGCGGTGGG CAGTGCGAGC 11489 CCCGGGCCCT CCCCGAAGGC TCCCGCGTGG GGTGGGGCCC GCCTGCTCCC CGCGGCGATT 11549 GAACCTGTGT CTCCCGCCCC GCCACCCTCT TCCCGACCCC TTTGCTTGCA GT GGG AGC 11607 Gly Ser 115 CTC GGC GGC GGC GCG GGG GAC GAC GCG GAG CCG CTC TCC AAG CGC CAC 11655 Leu Gly Gly Gly Ala Gly Asp Asp Ala Glu Pro Leu Ser Lys Arg His 120 125 130 TCG GAC GGG ATC TTC ACG GAC AGC TAC AGC CGC TAC CGG AAA CAA ATG 11703 Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln Met 135 140 145 GCT GTC AAG AAA TAC TTG GCG GCC GTC CTA GGG AAG AGG TAT AAA CAA 11751 Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Ler Gly Lys Arg Tyr Lys Gln 150 155 160 AGG GTT AAA AAC AAA GGA CGC CGA ATA GCT TAT TTG TAGCGATGGG 11797 Arg Val Lys Asn Lys Gly Arg Arg Ile Ala Tyr Leu* 165 170 175 TTACCAGCTA CCCTGTGTAT ACAGCCCTGA CGCAATGAAA AGTCGTTTTC CAAACTGACT 11857 CAACAGTCAT CGCTCGTGTG TTCTATCCAA ACATGTATTT ATGTAATGAA GTAAAGCCAT 11917 TAAATGAATA TTTTGATAAT AATATTGTTT TTCTTTCTAC AAAGCACTAG AGAATGCACA 11977 GATATACTTT GTGGACCAAT TATTGATATA TATTATAAAT ATATATAAAG AATATATATA 12037 TATATATATA TATAAAGTAT AGAGAGAAGT TCATACAAAG CGTGCACAAG GATTGAAAAT 12097 TCGCCCGAGC TGTTTATGTT TTTATAAAAA TAAATAGAAA AGTAGACAAT CATTGTTTTG 12157 AATATTACTC CTATTTTTGT AAACTGGAAT TAAAAGGATA GTATTTTTAT CCATGACAGG 12217 CCTGAAGATA TTACTACTTA CCATTTGCTA CTGTACATAA ACAATGATGC CCTGCTCCAG 12277 GGAGATTTTG AGGTAAAGAT ATGGAGAATT GCTGAAGGGC ATTCTTTCCC AGTGAGTCTC 12337 TGGGGCAGGC TGCTTCAATC CCAGCCTAAC TCAACTGGGC TCTGTCCCCC TGGTTGGGTG 12397 GCAATTCCAA TATTTCTGCT TTCTTTGATT CTCCTTTTAT GTGTAGTTGT CTCTCTTCAG 12457 ACTCTCAGCC CAGAAGAAAA TTCTCCTGAT AAAACAACAG CTCGATCCAA ATTGTGCTTC 12517 TCCCCAGAAT TCACGCCTCT CCCTAGGAGA AGAGTTGAGG AACTGTACAG AAAAGGGCGG 12577 CTTCGTTAGA CCGCTCTCTT TTCTGTACTT CCTGAGTGGC CAGGGAATCT AATATCCCCA 12637 AATTAGGGCA ATTGGAACAA AGTGAAGGAC ATAGAGGTAT ATTGGAAGAG GCAGAGCCTG 12697 AGGTGGTAGG AGGACGACCC TGGAAATGGA CTGGTTTGAG ATTGCCCCAG GTCTGGGAAG 12757 CTGAGGGCAA ATCCAGTCCC AGTGGTCCTG ACTTTGGGCG CTGGGTATTG GAAATGGATG 12817 CAAAGTACAA TGTGTTTTTC TCCAGTGCTG TCCATGCTTC TCATCTTGTG AAATGGCCAG 12877 GATCCTCTCC TTTGAAACCT GCTCTGTAGG AGCTACCCTT TTCCTTTGTG GTTTTATGGA 12937 GACCTCTCCT TCCTACCCTC CTGCACTGTT TAAGTACTGT TTACCATTTT TCATTCACTT 12997 CTCTTAAACT TGTGAATGCT TCTCACTTTT TTTTTTGTTT GATGCAGGCA CTTATTGTAA 13057 ATTTTAGAAA CCCCTCTGTA GCCACTAGTA AGTAATTATG CACTAAATAT GAACCCTTTG 13117 TTTCTTGTTT ATTGAGTTTG TAGGTAAAAT GTATTTTTCT ACATTATTGC TTATTGCTTA 13177 GTAAAATTTA TTTCATAAAA CCAACCTTTG TCATATTAGA ATGTGTAGTG TTCACATGTT 13237 GCTCAGTTTT GCTAACTGAT AAATCATTTA ATCCTCTTCT TCATATGTAT GAGTACTATC 13297 TTATATCTGT GGTCAAGAGT GAGGTAAGCA AGCTCCAACA GACCCTGAGA ACCTACGCTT 13357 GTATCCTTTC TTTGGCTAAA GAAAGCATGT CTGTTTCCTG TCAATTCTTT GAACATACAG 13417 AGTAATCTTT ATAAACAAAA GAACCTTCAC CCAGCAATCA GATCGAGCAG CAACAGACAA 13477 ACCAGCCAGC CAATCTCCCA AATTTCAGGC ACAAGTTTAT TTTTTTTTTT TTTATGTTTT 13537 GAAAAAAGAA GATGAAGAAG AAGAAAAAAA AAAGAACAAG GAAAGATTAA ACGTTAGCTT 13597 GTAAAGTTTA AAGGACCTTT CCTTTTCCTT TACGGATTTG ATCAGTATGA AGTCATAAAT 13657 CAAAGAAAAC AGAATTGGAT TTGCATTCCC AGGCGGGATG GATGCTGCCA GGAGATCACA 13717 TTGCAAATAG TGAAAACAGA GGCATTCGGT CTATGCCTGA GTCCTGTGTA TAGGATCAAT 13777 CTTCCTTTAA TTCCGCAGTC TCCTCAGGCA ATGTGACACG GGATGCAGTT TGCAGCTTTA 13837 GTGCCTTTCT TCGCCTTTTA AATTGCCACG AATCACAGAT GGCTATTTAG TGGCCCTACA 13897 ATGCTGCAAC ACATCAGCTT GCATTTTAGT CTTAATTATT TGTTTCTTGG ATAATGGGCA 13957 GAGTTTTCTG TATTTGTATC GACTGTTAGT GGTGAAATAG GGCTCTAGTT AACCTTTTAT 14017 TTATGAAGTC TAATTTAGTG TTCCCGTGGC TAGTTGCAAG CATTTTACAG TGATCACCCA 14077 GTTTAATCTT TTGTATACTT TTTAGAAATG CCAAGAGCCT TACTAAACTG AAGCAGATTT 14137 ATGATATAGT GATAATTTAG GTAGATGTTA GTCTTGAAGC TCTTATTTTG TGTGCAACTG 14197 ATTATAAAAA CACCTTAACC AAGTATTATT ACACACATGA TATCTATAAC TAGGACTTTG 14257 ATAACTGTTA TATAAAGTGT GTAAAATTTG TATGAATAAA TTTTTGTAAA CAATGCAACT 14317 TGGTCTAATG TTTGGGAAAA AAGACATTCA GGAAATAATT ACTTTAAAAT CTCTTAAAGT 14377 ATTATATTTC TTTAGCAACC ATAAGATTTT TTTACGTCTG GAATATATAT CTATCTAAGC 14437 ACCCTTGTAT TTTCATGAAC TGCACTTTAA TAATTGATGG GCAACTGGAT TCTGCTAAAA 14497 ATTTAAAGTA GCTACTCAGA TGGAGATGCC TAAGAAGGTT TTAAGCTCAT AAACAGGCAT 14557 GATGTTGCAA CATTATAAGA CACACAATTT AGATTAATTT CCATCCCCTA GTGTGTATAT 14617 ACTTTGCTCA ATATTCAGAA AGTTACTAGG TAGTAGTGGG AGACAATGCT GGAGCATTAG 14677 TTACACATCT AAAATAGCAA TCTAACATTG TTCTTTTATT TTTTATTTTA GTGGCCAGGT 14737 CTCACTATGT TGCCCAGGCT GGTCTTGCTC AAGCGATCCT CCCACCTCAG CCTCCCAAAG 14797 TGCTGGGATT ACAGGCGTGA GCCACCACAC CCAGCCTAAA ATAGGGATCT AACATTGTTC 14857 TTATACAAGT AACTCTGCAG ACTAAACTTG TCTTGATAAA ATTTTGTATA AAATGATCTA 14917 AATAATCAGT TTTTGGAGGT TTTAAAATGT ATTTAGAGAC ATACAAACTA CTGTCTCTGA 14977 TTAAAATGCT TTAGGTAGAA GGAACGTGAA CATGAGTAAG TAAAGAGTTA ATTAGATGCC 15037 TTTAAAAGAA AATGTACTTT GAAGTCCAGG AAGAAACACA AGAAGTCATT TGTGGATTGT 15097 ATGCTTTCTT AGTTCATATT TACAAACTTT AGGGCAAAGC TTTCATACGA AATTCCTTCA 15157 AATTCCGTAG TGGTGTGTGT TTTGGCACCT TTGACTATTT CTGGCTTAGA AAATGTATAG 15217 AAAGTCACAC AATAATTGAC ATACCATTTA ATTTAAAATG CCAGGGTTTC ATCCTAAAAA 15277 TTAATGGTCT CAATTAGTAA ATCAATAAAT ATGTTACGAT AGAATTAAAG GATGAGTGAG 15337 GATTCTAAAA TTATCTTCAG AATTTAGCTC AGTATTTAAG GCCTAGAATC AAATAGGGAG 15397 GAGCCCACAG TCTAGAAATC CCGTTTGTAG TCAATGAAAA AATGAATCCA GTACAGTTCA 15457 TATTTGCATT TGATTTTATT GGATAAGGAA TTTTTCTTCT CCATCTTTAA CTGCCCCTCT 15517 TTGTCCTTGA AGACATAGTG TGGTAGATGA AAAAATGAAG AAGACTTTAT TCGGTTGGGG 15577 CTAGGCTAAT GACTTGTCAA GAACATAAAG ATAAACCCCA GACTTGGCTG ACTTCAAGTG 15637 AATTTCATGT ATTTAGCAAC TTGCCATATT ATCTTCGGTG ATAACTCAAA TTACATCTTT 15697 TTAAAGGCAG ACTTGATACA TATGGGTATT CAAGAAGCTG TAATAGGTGC CTTAATGCTG 15757 TTAGGGCGGA GAACACACTT ATTCAATACA ATGCACACTT ATTGAACACA TGAAATGGGC 15817 CACCGCACTG GTCGAGAGAG CTTGACTAAC ACCTGGGAGC TCAGGTAGTA TTTTTTTCAG 15877 AATGTTTTTC TGAAATGTGA TCATCTTTGG GGCGGGGGGA GCTTAAAAAT GCAAAATTGT 15937 AGGGCTCTGC CAGATCCAGT GAATCTGCAT TTTAAATAAA AACCCTAGAT TACTGTGCAC 15997 TAAAATTTGA GACTGCCTAG ATTTAGAATT GGTGACATAT GTAGGCATAC ATATGTGCTG 16057 GTCTGAATGT TTTTTTCATA TGAAATAAGC AAAAGGTCAT GTTACCTGCA TACAGTAATA 16117 AATACATAAC TGTGCCATAT TCTTCCAAGA TATCTGGTCA TTAAGCTCTT TGACAATTTC 16177 AGTATTTCCT TTAGGTCACT AAAACTACTA GTTAGCATTA TTTTACTTGT ACAGTCTGGT 16237 TGGACCTCTC CTACAGGAGC TTGTGGAAGG AGAGTGATCC TCTAAGTTGG GTCCAAAATA 16297 TTCAATCACA GGACTAAGAG ATTATGGCTA TAATGAGGAG AACTTGTGCA GCTAGCTAGC 16357 CATAATTCTG GGGATCCAGA AGTCAACTTC CAGTTGCATT ATATCCCAAT TTGGTTTGAA 16417 TGTATTTACT GCTCCCCAAC TGTTTACATG ATGGTTTCTC TTGGATGGCT CACTATGACC 16477 TTCAACCCAA CCCTACTGTT CACATGATCA CAAGATTGGA AGCCAAGATC AAGTCATCCC 16537 TCTTCTCTTT TGTTGCCACT CTTTTTTGTA GAAGGGAGAT GCCAGCTGCC CCTGCTGCTG 16597 CAGATTGCAT CACTGCTGGA TTCTTACATT GGTTTGTAGT TGGTCATCCT GGTCACTTCC 16657 CCTGCAACCA CATAGTTTTA GCTCCATCTT AGTATCATGT CCCTCTGATC AGATGTTCCA 16717 GAGTAGCTTC CATTGTCAAA GGGTTAAAGG GTTTAAGGTA ATCAGTAGTC AATTTTACCT 16777 CTCTGTTCTT CAACACGATC CTTCCTCTTT TTTTTGTTTT GAGAAAGGGT CTTACTCTGT 16837 TGCCCAGGCT GGAGTGCAGT GGCACGATCT CGGCTCACTG CAACCTCTGC CTCCCGGGTT 16897 TAAGCGATTC TCCTGTCTCA ACCTCCCGAG TAGCTGGGAT TACAGGTGCA TGCCAACGCG 16957 CCCGGCTAAT TTTTGTATTT TTAGTAGAGA CGGGGTTTCA CTGTGTTGGC CAGGCTGGTC 17017 TTGGACTCTT GTCCCCAAAT GATC 17041。
【0026】配列番号:2 配列の長さ:657 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源: 生物名:ヒト白血球 TGAGAAAAAA AAAAAGGAAG TCATTTCATG AAT
AAAAATC GGAGCGCAAC AGTGCAACAA 60 AATATTCTGT ACTTAAAGGC AACAGGCAGG CAGATGTTGA CAAAGAGGGC TCTCCAAAAA 120 CCATGTTCGG ATAGATTTTT GCGAACTGCA CAGATAAATA GGAGCAGAAG GCCGGTCACC 180 TCTGTAACCA GCGGTAGCAG CAGCAGAAGC CGCAGCTTCA GAGGCAGCCG GAGAGACCTC 240 GGAGCAGAGA AGGCGCCGCC GACCCTCGCG GCTGCCTGGC CCGCGGCTCC TACAAAGGCG 300 GGCTAGCCGC CCGCCCTCTC CCTTGCCTTC CTCCCCTTCT TTTCTGACTT TCCCTCTTTC 360 CCTTAATCGC CTGCTTCTTC CTCCGGGTGG ACTTACGGCC ACCTTGCTCC TCCGCGCTTC 420 ACCTCATCGC CCCCTCTTTC TTTCTTCTGC CTCTCTCTCT GCGCCCCCTT CTCTCCGTGT 480 CACGCTCCCT CCTGGTTCTG CGCGTCTACA AACTTTTGAG CAGAACACGA GCCTCGGCAA 540 ACGAGTCCCG CAGCTCCTCC TGCTGCTCCC GCTGGTTCCT GCGGCTTCTG CTCAGACACC 600 AACGCCAGAC GGCGATGCCT CTCGGGTGGT GACTCCAGCG CAGGAACTTG AAGAAGC 657
AAAAATC GGAGCGCAAC AGTGCAACAA 60 AATATTCTGT ACTTAAAGGC AACAGGCAGG CAGATGTTGA CAAAGAGGGC TCTCCAAAAA 120 CCATGTTCGG ATAGATTTTT GCGAACTGCA CAGATAAATA GGAGCAGAAG GCCGGTCACC 180 TCTGTAACCA GCGGTAGCAG CAGCAGAAGC CGCAGCTTCA GAGGCAGCCG GAGAGACCTC 240 GGAGCAGAGA AGGCGCCGCC GACCCTCGCG GCTGCCTGGC CCGCGGCTCC TACAAAGGCG 300 GGCTAGCCGC CCGCCCTCTC CCTTGCCTTC CTCCCCTTCT TTTCTGACTT TCCCTCTTTC 360 CCTTAATCGC CTGCTTCTTC CTCCGGGTGG ACTTACGGCC ACCTTGCTCC TCCGCGCTTC 420 ACCTCATCGC CCCCTCTTTC TTTCTTCTGC CTCTCTCTCT GCGCCCCCTT CTCTCCGTGT 480 CACGCTCCCT CCTGGTTCTG CGCGTCTACA AACTTTTGAG CAGAACACGA GCCTCGGCAA 540 ACGAGTCCCG CAGCTCCTCC TGCTGCTCCC GCTGGTTCCT GCGGCTTCTG CTCAGACACC 600 AACGCCAGAC GGCGATGCCT CTCGGGTGGT GACTCCAGCG CAGGAACTTG AAGAAGC 657
【図1】ヒトPACAP38ゲノムDNAの簡単な制限
酵素地図である。
酵素地図である。
【図2】ヒトPACAP38ゲノムDNAの塩基配列お
よびそれより推定されるヒトPACAP38前駆体や成
熟ペプチドのアミノ酸配列を示す。
よびそれより推定されるヒトPACAP38前駆体や成
熟ペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図3】ヒトPACAP38ゲノムDNAの5’領域を
組み込んだプラスミドの構築図である。
組み込んだプラスミドの構築図である。
【図4】ヒトPACAP38ゲノムDNAの5’領域に
相当する2.5〜1kbの種々のDNA断片のプロモー
ター活性を測定、比較した図である。
相当する2.5〜1kbの種々のDNA断片のプロモー
ター活性を測定、比較した図である。
【図5】ヒトPACAP38ゲノムDNAの5’領域の
更に短かい長さの種々のDNA断片のプロモーター活性
を測定、比較した図である。
更に短かい長さの種々のDNA断片のプロモーター活性
を測定、比較した図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12N 15/62 15/73 C12P 21/02 C 8214−4B //(C12P 21/02 C12R 1:91)
Claims (11)
- 【請求項1】 ヒトPACAP38遺伝子のプロモータ
ー活性を有する領域を含有するDNA。 - 【請求項2】 配列番号2の塩基配列を有するDNAを
含有する請求項1記載のDNA。 - 【請求項3】 ヒトゲノムDNA由来の請求項1記載の
DNA。 - 【請求項4】 プロモーター活性を有する配列番号2の
塩基配列を有するDNA。 - 【請求項5】 神経細胞特異性蛋白質の遺伝子のプロモ
ーター活性を有する請求項4記載のDNA。 - 【請求項6】 請求項1又は4記載のDNAを含有する
ベクター。 - 【請求項7】 請求項1又は4記載のDNAの下流に接
続した蛋白質又はペプチドをコードする構造遺伝子を有
する請求項6記載のベクター。 - 【請求項8】 請求項6又は7記載のベクターを保持す
る形質転換体。 - 【請求項9】 細菌である請求項8記載の形質転換体。
- 【請求項10】 動物細胞である請求項8記載の形質転
換体。 - 【請求項11】 請求項7記載のベクターを保持する形
質転換体を培養し、プロモーター活性を有するDNAの
下流に接続した蛋白質又はペプチドをコードする構造遺
伝子を発現させることを特徴とする、蛋白質又はペプチ
ドの生産方法。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP4325372A JPH06181768A (ja) | 1992-12-04 | 1992-12-04 | 新規プロモーターおよびその用途 |
US08/076,011 US5521069A (en) | 1990-08-10 | 1993-06-11 | Genomic DNA exons having exons encoding human pituitary adenylate cyclase activity peptide with 38 amino acids residues(PACAP38) and a promoter thereof |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP4325372A JPH06181768A (ja) | 1992-12-04 | 1992-12-04 | 新規プロモーターおよびその用途 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH06181768A true JPH06181768A (ja) | 1994-07-05 |
Family
ID=18176102
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP4325372A Pending JPH06181768A (ja) | 1990-08-10 | 1992-12-04 | 新規プロモーターおよびその用途 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH06181768A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007071382A2 (en) * | 2005-12-22 | 2007-06-28 | Siemens Medical Solutions Diagnostics Gmbh | Method for the prediction of adverse drug responses to statins |
-
1992
- 1992-12-04 JP JP4325372A patent/JPH06181768A/ja active Pending
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007071382A2 (en) * | 2005-12-22 | 2007-06-28 | Siemens Medical Solutions Diagnostics Gmbh | Method for the prediction of adverse drug responses to statins |
WO2007071382A3 (en) * | 2005-12-22 | 2007-10-11 | Bayer Healthcare Ag | Method for the prediction of adverse drug responses to statins |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20030317 |