JPH06181750A - Culture container - Google Patents
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- JPH06181750A JPH06181750A JP5217707A JP21770793A JPH06181750A JP H06181750 A JPH06181750 A JP H06181750A JP 5217707 A JP5217707 A JP 5217707A JP 21770793 A JP21770793 A JP 21770793A JP H06181750 A JPH06181750 A JP H06181750A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、栄養培地を含む供給チ
ャンバーと、該供給チャンバーの中に少なくとも一つ設
けられ、細胞培養物を受け入れ且つ該栄養培地により浸
されている生産チャンバーとを備えており、その際、該
生産チャンバーは、栄養物を該供給チャンバーから該生
産チャンバー中に運ぶと同時に、代謝産物を該生産チャ
ンバーから該供給チャンバー中に運ぶ透析膜により該栄
養培地から分離されており、且つ該供給チャンバーへの
細菌の存在しない気体の供給および排出系を備えてい
る、１mlにつき少なくとも１０7細胞の細胞密度で細胞
培養を行うためのローラーボトルに類似した培養容器に
関するものである。さらに本発明は、すべての面がシー
ルされ且つ培養される培養細胞を含む生産チャンバーを
浸す栄養培地が、ローラーボトルに類似した培養容器中
に入れられ、連続回転運動が培養容器に付与される細胞
培養方法に関するものである。FIELD OF THE INVENTION The present invention comprises a feeding chamber containing a nutrient medium and at least one production chamber provided in the feeding chamber for receiving a cell culture and being immersed in the nutrient medium. Wherein the production chamber conveys nutrients from the feed chamber into the feed chamber while at the same time being separated from the nutrient medium by a dialysis membrane that carries metabolites from the feed chamber into the feed chamber. And a culture container similar to a roller bottle for carrying out a cell culture at a cell density of at least 10 7 cells per ml, which is equipped with a bacteria-free gas supply and discharge system to the supply chamber. . Further, the present invention provides a method in which a nutrient medium, which is sealed on all sides and which immerses a production chamber containing cultured cells to be cultured, is placed in a culture container similar to a roller bottle, and continuous rotary motion is imparted to the culture container. The present invention relates to a culture method.
【０００２】[0002]
【従来の技術】この種の培養容器は、例えば、生体外に
おけるモノクローナル抗体の製造に使用されることがで
きる。現在、モノクローナル抗体は、診断、治療および
生物医学の研究における種々の目的のために、通常ハイ
ブリドーマ技術法を用いて製造されている。“ハイブリ
ドーマ細胞”は、抗体産生細胞とミエローマ細胞との不
死化雑種を意味する術語である。高い特異性を特徴とす
る、ハイブリドーマ細胞により産生される抗体は、“モ
ノクローナル”抗体とよばれる。これらのハイブリドー
マ細胞は、生体外における抗体生産のために、可能な限
り正確に血液の組成と同一の組成とした、ある種の液体
培地中で培養される。これらの培地は、塩類、糖類、ビ
タミン類、アミノ酸類、および炭酸水素ナトリウム（Ｎ
ａＨＣＯ3）を基剤とする緩衝系を包含する成分を含有
する。通常、ハイブリドーマ細胞は、高い湿度雰囲気お
よび培地中に存在するＮａＨＣＯ3と平衡するＣＯ2含量
を有するインキュベーター雰囲気内で培養される。This type of culture vessel can be used, for example, for the production of monoclonal antibodies in vitro. Currently, monoclonal antibodies are commonly produced using hybridoma technology methods for a variety of purposes in diagnostic, therapeutic and biomedical research. "Hybridoma cell" is a term that means an immortalized hybrid between an antibody-producing cell and a myeloma cell. Antibodies produced by hybridoma cells that are characterized by high specificity are called "monoclonal" antibodies. These hybridoma cells are cultivated in a liquid medium of some kind, which has the same composition as blood as accurately as possible for the production of antibodies in vitro. These media include salts, sugars, vitamins, amino acids, and sodium bicarbonate (N
aHCO 3 ) based buffer system. Generally, hybridoma cells are cultured in a high humidity atmosphere and an incubator atmosphere having a CO 2 content that is in equilibrium with the NaHCO 3 present in the medium.
【０００３】従来の生体外静置法を用いた上記方法によ
り組織培養産物の形態で生産されるモノクローナル抗体
は、基礎的な生物医学的研究および臨床診断における種
々の目的に非常に適している。しかし、この方法により
生産されるモノクローナル抗体は、多くの用途に好適で
あるが、この場合このモノクローナル抗体は、困難な別
の処理を行って高純度かつ濃縮された形態にすることが
要求される。生体内生産型（腹水）においては、モノク
ローナル抗体は一次産物中に既に（２０ mg/mlの）非常
な高濃度で存在する。しかしモノクローナル抗体が通常
の生体外静置法により生産される際には、約０.０１〜
０.１０ mg/ml の濃度となるにすぎない。The monoclonal antibody produced in the form of a tissue culture product by the above-mentioned method using the conventional in vitro static method is very suitable for various purposes in basic biomedical research and clinical diagnosis. However, the monoclonal antibody produced by this method is suitable for many applications, in which case this monoclonal antibody is required to undergo another difficult treatment to obtain a highly pure and concentrated form. . In the in vivo produced form (ascites), the monoclonal antibody is already present in the primary product at a very high concentration (20 mg / ml). However, when the monoclonal antibody is produced by the usual in vitro static method, it is about 0.01-
The concentration is only 0.10 mg / ml.
【０００４】生体外において、より高濃度かつ高純度で
モノクローナル抗体を生産させるために、ある方法なら
びにローラーボトルに類似した培養容器の形態をした装
置が提案されている。その装置においては、供給される
細胞のための栄養を備えた“供給チャンバー”、ならび
に、その中に配置され、細胞生長およびモノクローナル
抗体生産の場である複数の“生産チャンバー”が、それ
ぞれ互いに半透過性透析膜により分けられている。細胞
は前記半透過性透析膜を通して“供給チャンバー”から
栄養を供給され、一方で老廃物と代謝産物が、やはり透
析膜を通して、“生産チャンバー”から“供給チャンバ
ー”内へと排出される。この装置は“バカンガラスマウ
ス（Bochum glass mouse）”として知られている。この
細胞培養用培養容器は、例えば、ポスター用原稿の、
「ガラスマウス：透析バッグにおいてハイブリドーマを
培養するためのローラーボトル状装置」、T.Hengelag
e、F.HaardtおよびF.W.Falkenberg、細胞および組織培
養の世界会議、カルフォルニア州、アナハイム、１９９
１年６月１６〜２０日に記載されている。この公知の細
胞培養用培養容器は、その端が外側に湾曲してフランジ
を形成している外径１２０ｍｍのガラス管からなる。フ
ランジも含めたガラス管の長さは３２０ｍｍである。ガ
ラス管の端は１５ｍｍの厚みのポリメチルメタクリレー
ト（ＰＭＭＡ）ディスクで封されている。ＰＭＭＡディ
スクの１つは５つの貫通孔を有し、それらの孔の１つは
容器の長軸に沿っており、そしてＣＯ2／空気混合気を
通し、圧力を等しくするために使用される２つのより小
さな穴を順番に有するストッパーで封される。混合気を
通し圧力を等しくするために、内径１ｍｍのステンレス
鋼管を２つの穴の１つに通し、それをガラス管の反対端
まで延ばし；これを通し、ＣＯ2／空気混合気が滅菌フ
ィルターを介して容器の内側に供給される。中央の孔を
取り囲む、ＰＭＭＡディスクの残る４つの孔は、培養容
器内に突き出し、かつそれぞれの隔壁が半透過性透析膜
からなる透析袋を差し込むために使用される。培養され
る細胞培養混合物は、生産チャンバーとして機能するこ
れらの透析袋内に置かれるが、培養容器の内部は細胞の
ための供給チャンバーとして付加的に使用され、容器の
容積の約４０％が栄養培地により満たされる。細胞は半
透過性透析膜を通して供給チャンバーから栄養を供給さ
れ、一方では、老廃物および代謝産物がやはり透析膜を
通して排出される。培養容器を長軸に沿って回転させる
ため、容器に、ＣＯ2／空気混合気を通すための供給ラ
インを通す密封回転リードスルーを備えることができ
る。In order to produce monoclonal antibodies with higher concentration and higher purity in vitro, a method and a device in the form of a culture container similar to a roller bottle have been proposed. In that device, a "feeding chamber" with nutrients for the cells to be fed, as well as a plurality of "production chambers", located therein, for cell growth and monoclonal antibody production, are each one half of each other. It is separated by a permeable dialysis membrane. Cells are fed from the "feed chamber" through the semipermeable dialysis membrane, while waste products and metabolites are also drained from the "production chamber" into the "feed chamber" through the dialysis membrane. This device is known as the "Bochum glass mouse". This culture container for cell culture is, for example, a poster manuscript,
"Glass Mouse: Roller Bottle Device for Culturing Hybridomas in Dialysis Bags," T. Hengelag
e, F. Haardt and FW Walkenberg, World Congress on Cell and Tissue Culture, Anaheim, 199, California.
Written June 16-20, 1 year. This known culture container for cell culture is composed of a glass tube having an outer diameter of 120 mm, the end of which is curved outward to form a flange. The length of the glass tube including the flange is 320 mm. The ends of the glass tube are sealed with a 15 mm thick polymethylmethacrylate (PMMA) disc. One of PMMA disc has five through holes, one of the holes is along the long axis of the vessel, and passed through a CO 2 / air mixture, is used to equalize the pressure 2 It is sealed with a stopper that in turn has two smaller holes. In order to pass the mixture through and equalize the pressure, a stainless steel tube with an inner diameter of 1 mm is passed through one of the two holes and extended to the opposite end of the glass tube; through which a CO 2 / air mixture passes through the sterile filter. It is supplied to the inside of the container through. The remaining four holes of the PMMA disk, surrounding the central hole, project into the culture vessel and are used to insert dialysis bags, each septum consisting of a semipermeable dialysis membrane. The cell culture mixture to be cultivated is placed in these dialysis bags, which function as production chambers, but the inside of the culture vessel is additionally used as a supply chamber for the cells, and about 40% of the volume of the vessel is fed by nutrients. Filled with medium. Cells are fed from the feed chamber through the semipermeable dialysis membrane, while waste products and metabolites are also drained through the dialysis membrane. To rotate the culture vessel along the long axis, the vessel can be equipped with a sealed rotating leadthrough for passing a feed line for passing a CO 2 / air mixture.
【０００５】生産チャンバー内に封じ込められた細胞が
半透過性透析膜に囲まれるこの装置は、ハイブリドーマ
細胞をより長期間に亙って、そして（１０7細胞／ｍｌ
より高い）高密度で培養することができる。しかし、こ
の公知の培養容器は取り扱いの難しい比較的複雑な装置
であり、構築には確かな技術が要求されるが、そのよう
な技術を有する研究所は限られている。この公知の培養
容器においては、培養細胞の代謝および生理学的条件の
創製に必要な気体は、周囲雰囲気を構成する混合気体を
供給チャンバー内に取り入れることにより供給され；酸
素は栄養培地中に物理学的に溶解し、そして透析膜を通
してそこから生産チャンバー内に移し入れられる。透析
膜を通した酸素の供給チャンバーから細胞培養チャンバ
ー内への移送はあまり効率的ではないが、約１０7細胞
／ｍｌまでの細胞密度には充分である。細胞密度がより
高くなると酸素供給の改善が必要となる。細胞密度がよ
り高くなると、細胞培養チャンバー内の酸素含有量が数
分間で排気され、そして供給チャンバー内の酸素が１時
間たらずで使い尽くされる程に細胞の酸素要求が増大す
るので、追加の酸素が気体相から供給チャンバー内の栄
養培地に誘導されなければならない。この公知の培養容
器の弱点は、回転リードスルーを通すＣＯ2／空気混合
気の連続供給が細胞培養の感染を引き起こし得るという
事実であることが知られている。This device, in which cells contained within the production chamber are surrounded by a semipermeable dialysis membrane, allows hybridoma cells to be maintained for longer periods of time and (10 7 cells / ml).
Higher (higher) density can be cultivated. However, this known culture vessel is a relatively complicated device that is difficult to handle, and requires reliable technology for its construction, but there are only a limited number of laboratories having such technology. In this known culture vessel, the gases necessary for the metabolism of the cultured cells and the creation of physiological conditions are supplied by introducing a gas mixture that constitutes the ambient atmosphere into the supply chamber; oxygen is physics present in the nutrient medium. Solution and then transferred through the dialysis membrane into the production chamber. Transfer of oxygen through the dialysis membrane from the supply chamber into the cell culture chamber is less efficient, but sufficient for cell densities up to about 10 7 cells / ml. Higher cell densities require improved oxygen supply. At higher cell densities, the oxygen content in the cell culture chamber is evacuated within minutes, and the oxygen demand of the cells increases so that the oxygen in the supply chamber is exhausted in less than an hour, so Oxygen must be derived from the gas phase into the nutrient medium in the feed chamber. It is known that a weakness of this known culture vessel is the fact that a continuous supply of a CO 2 / air mixture through a rotating readthrough can cause infection of the cell culture.
【０００６】本発明の主目的は、経済的に産生し得且つ
取り扱いの容易であり、さらに感染の危険が減少され
た、高い細胞密度で細胞培養を行うために有用な培養容
器を実用化することである。さらに本発明の主目的は、
実施することが容易であり、高い生存率と同時に高い細
胞密度が短時間で発生し得る細胞培養方法を示すことで
ある。[0006] The main object of the present invention is to put into practical use a culture vessel which can be produced economically, is easy to handle, has a reduced risk of infection, and is useful for culturing cells at a high cell density. That is. Further, the main object of the present invention is to
The purpose of the present invention is to provide a cell culture method which is easy to carry out and can generate high cell density at the same time as high survival rate.
【０００７】[0007]
【課題を解決するための手段】培養容器に関して、本発
明によれば、気体供給および排出システムとして、液体
および細胞培養物を汚染する微生物類に対して不透過性
であり、且つ細胞培養の間に要求され且つ産生される気
体に対しては透過性である気体交換膜を備え、そしてこ
の気体交換膜は、培養容器の外壁の少なくとも一部分を
形成し、その全表面積、材料および厚さは、酸素に対す
る透過性が１０7細胞ごとに少なくとも０.０１mg／時間
であるように選択されることにより、すでに記載した培
養容器をベースとして、本発明の目的は達成される。液
体および細胞培養物を汚染する微生物類に対して不透過
性であり、且つ細胞の呼吸に要求される気体に対しては
透過性である気体交換膜の選択は、気体供給および排出
システムを経てもたらされる細胞培養感染がほとんど排
除され得ることを意味する。細胞の呼吸に要求される気
体は、主に酸素であり、酸素が使用されたとき細胞培養
物により生産されるのは二酸化炭素である。気体交換膜
は、酸素および二酸化炭素に対して透過性であるので、
培養容器の周囲雰囲気における酸素および二酸化炭素の
濃度を調節することにより、培養容器の内側、とくに供
給チャンバーの内側の上記気体の濃度に影響を及ぼすこ
とができる。細胞培養物の生存のための最小酸素要求量
は、細胞の種類を含む要因に依存する。細胞培養におい
て１０7細胞につき０.０１mg／時間の最小酸素要求量が
一般的に考えられる。気体交換膜の全表面積、材料およ
び厚さは、この“最小酸素供給量”が確実となるように
選択される。With respect to a culture vessel, according to the present invention, a gas supply and exhaust system is impermeable to microorganisms contaminating liquids and cell cultures, and during cell cultures. A gas exchange membrane that is permeable to the gas required and produced, and that forms at least a portion of the outer wall of the culture vessel, the total surface area, material and thickness of which is The object of the invention is achieved on the basis of the culture vessels already described, by selecting the permeability for oxygen to be at least 0.01 mg / hr per 10 7 cells. The selection of gas exchange membranes that are impermeable to microorganisms that contaminate liquids and cell cultures and are permeable to the gases required for cell respiration have been selected through gas supply and exhaust systems. It means that the resulting cell culture infection can be almost eliminated. The gas required to breathe cells is predominantly oxygen, and it is carbon dioxide that is produced by the cell culture when oxygen is used. Since the gas exchange membrane is permeable to oxygen and carbon dioxide,
By adjusting the concentrations of oxygen and carbon dioxide in the atmosphere surrounding the culture vessel, it is possible to influence the concentration of the gas inside the culture vessel, in particular inside the feed chamber. The minimum oxygen demand for cell culture survival depends on factors including cell type. A minimum oxygen demand of 0.01 mg / hr per 10 7 cells in cell culture is generally considered. The total surface area, material and thickness of the gas exchange membrane are selected to ensure this "minimum oxygen supply".
【０００８】気体供給および排出システムは、培養容器
の外壁の少なくとも一部分を形成するので、チューブま
たはホースの形状の気体供給および排出ラインは必要と
しない。従って、例えばローラーボトルとして設計され
るこの培養容器は、経済的に製造することができ、取り
扱いが容易となる。The gas supply and discharge system forms at least a part of the outer wall of the culture vessel, so that gas supply and discharge lines in the form of tubes or hoses are not required. Therefore, this culture container, which is designed as a roller bottle, for example, can be manufactured economically and is easy to handle.
【０００９】好適な細胞培養物は、例えば、ハイブリド
ーマ細胞、腫瘍細胞または穿刺された腫瘍細胞を包含す
る。Suitable cell cultures include, for example, hybridoma cells, tumor cells or punctured tumor cells.
【００１０】とくに、もっとも高い細胞密度に関して、
酸素に対する気体交換膜の透過性が１０7細胞につき少
なくとも０.５mg／時間である培養容器が有効であるこ
とが証明された。Especially regarding the highest cell density,
Culture vessels having a gas exchange membrane permeability to oxygen of at least 0.5 mg / hr per 10 7 cells have proven effective.
【００１１】少なくとも１×１０19m2／秒×Ｐａ、有利
には少なくとも５×１０19m2／秒×Ｐａの透過係数を有
する材料は、気体交換膜にとくに好適な材料であること
が証明された。十分な酸素供給を保証するために、でき
るだけ薄い気体交換膜が好適であり；０.１〜１ｍｍの
厚さを有する膜が好適であることが分かった。シリコー
ン膜は特に経済的であり、射出成形によりいかなる所望
の形状にも製造され得る。シリコーンは種々の厚み、形
状および特定の気体透過性のものが購入可能である。シ
リコーンは高い引裂抵抗および細胞培養に普通に用いら
れる培地に対する良好な耐薬品性を有しており、従っ
て、その取り扱いもまた特に容易である。シリコーン気
体交換膜の容易に滅菌され得る性質もまた、特に有利な
点であり、とりわけ、シリコーンがオートクレーブで非
常に効率的に滅菌され得ること、そして形状に実質的な
変化をきたさないことは有利な点である。この性質によ
り、シリコーンは何回も使用されることができる。気体
透過性を設定するにあたって、気体交換膜に要求される
形状は、細胞の呼吸による気体の必要性、ならびに細胞
の呼吸に拘わる気体の分圧、特に外側から細胞の呼吸に
作用する酸素分圧に依存する。１ａｔｍの外圧、および
酸素分圧がほぼ空気のそれに対応するインキュベーター
雰囲気であるときには、少なくとも５ｃｍ2の表面積の
気体交換膜が、１ｍｌ当たり１０7細胞の細胞培養液を
３５ｍｌ培養するのに適していることが分かった。Materials having a permeability coefficient of at least 1 × 10 19 m 2 / sec × Pa, preferably at least 5 × 10 19 m 2 / sec × Pa prove to be particularly suitable for gas exchange membranes. Was done. It has been found that gas exchange membranes which are as thin as possible are suitable in order to ensure a sufficient oxygen supply; membranes having a thickness of 0.1-1 mm are suitable. Silicone membranes are particularly economical and can be manufactured by injection molding into any desired shape. Silicones are available in various thicknesses, shapes and specific gas permeability. Silicones have high tear resistance and good chemical resistance to the media commonly used for cell culture, and therefore their handling is also particularly easy. The easily sterilizable nature of silicone gas exchange membranes is also of particular advantage, in particular that silicones can be sterilized very efficiently in an autoclave and that they do not undergo any substantial change in shape. That is the point. Due to this property, silicone can be used many times. In setting the gas permeability, the shape required for the gas exchange membrane is the necessity of gas due to the respiration of cells, and the partial pressure of the gas involved in the respiration of cells, especially the oxygen partial pressure that acts on the respiration of cells from the outside. Depends on. A gas exchange membrane with a surface area of at least 5 cm 2 is suitable for culturing 35 ml of cell culture solution of 10 7 cells per ml when the external pressure is 1 atm and the oxygen partial pressure is an incubator atmosphere corresponding to that of air. I found out.
【００１２】表面積が少なくとも５ｃｍ2である気体交
換膜を有する培養容器を提供することが有利であること
が見いだされた。少なくとも５ｃｍ2の表面積を有する
気体交換膜は、例えば約１０7細胞／mlの細胞密度を有
する細胞培養物の約３５mlを含む約３００mlの容量の培
養容器において、とくに有効であることが証明された。It has been found to be advantageous to provide a culture vessel with a gas exchange membrane having a surface area of at least 5 cm 2 . Gas exchange membranes with a surface area of at least 5 cm 2 have proven to be particularly effective in culture vessels with a volume of about 300 ml containing, for example, about 35 ml of cell culture with a cell density of about 10 7 cells / ml. .
【００１３】両方の末端が気体交換膜でシールされ、中
空円筒形として設計された培養容器は、とくに有効であ
ることが証明された。この場合において、中空円筒形の
周縁表面は、培養容器の機械的安定性を保証するが、二
箇所の末端で、気体交換膜は、細胞培養物への気体の良
好な供給および細胞培養物からの気体の良好な排出を提
供する。Culture vessels designed as hollow cylinders, both ends of which are sealed with gas exchange membranes, have proven to be particularly effective. In this case, the hollow cylindrical peripheral surface ensures the mechanical stability of the culture vessel, but at the two ends, the gas exchange membranes provide a good supply of gas to the cell culture and from the cell culture. Provide good discharge of gas.
【００１４】気体交換膜が屈曲した培養容器は、特に細
胞培養の高い細胞密度に関して、有利であることが分か
った。膜を屈曲させることにより、気体交換膜により覆
われる設定領域における気体交換膜の総表面積が増加
し、それにより気体交換、特に細胞に対する酸素の供給
が改善される。中空円筒形の培養容器では、例えば、周
縁表面はベローズ形状で設計されることができる。その
ようなベローズは容易に製造される。Culture vessels with bent gas exchange membranes have proved to be advantageous, especially for high cell densities in cell culture. Bending the membrane increases the total surface area of the gas exchange membrane in the set area covered by the gas exchange membrane, thereby improving gas exchange, especially oxygen supply to cells. In a hollow cylindrical culture vessel, for example, the peripheral surface can be designed in a bellows shape. Such bellows are easily manufactured.
【００１５】外壁を機械的に固定する支持部材を除き、
全外壁が気体交換膜として設計されている培養容器の実
施態様がとくに好ましい。この種類の培養容器を用いる
ことにより、気体交換が良好となり、高い活力でもって
迅速に高い細胞密度が達成され得る。支持部材は、培養
容器の形状および各部品の幾何学的配置を固定する。例
えば、これらは、気体交換膜により覆われたメッシュを
有する金属格子、または安定なプラスチック製格子とし
て設計され得る；あるいは、気体交換膜と同様の材料で
製造された、外壁の厚い部分として設計され得る。とく
に有利であると証明されたローラーボトルに類似した培
養容器は、培養容器の末端が気体交換膜のための支持部
材として機能するものであり、周囲表面は、実質上気体
交換膜として設計されている。Excluding the support member for mechanically fixing the outer wall,
Particularly preferred is the embodiment of the culture vessel in which all outer walls are designed as gas exchange membranes. By using this type of culture vessel, good gas exchange can be achieved, and high cell density can be rapidly achieved with high vitality. The support member fixes the shape of the culture vessel and the geometrical arrangement of each part. For example, they may be designed as a metal grid with a mesh covered by a gas exchange membrane, or a stable plastic grid; or as a thick section of outer wall made of a material similar to the gas exchange membrane. obtain. A culture vessel, which has proved to be particularly advantageous, resembles a roller bottle, in which the end of the culture vessel functions as a support member for the gas exchange membrane and the surrounding surface is designed substantially as a gas exchange membrane. There is.
【００１６】この方法に関して、本発明によれば、上記
の方法から得られた目的は、生産チャンバーが、その容
量の少なくとも１０％を占める容量の気泡を含むよう
に、培養される細胞培養物で満たされ、この気泡が浮力
により細胞培養物中で動くように、回転運動に加え転倒
運動（tumbling movement）が加えられることにより達
成される。培養容器の転倒運動およびその液体細胞培養
物の浮力により、気泡は生産チャンバー中で後退および
前進する運動を行う。この気泡の後退−前進運動は、細
胞培養混合物を良好に混合することに貢献し、また、そ
こに栄養物を安定に供給すること、とくに安定な酸素供
給および代謝産物の連続排出に顕著に貢献する。転倒運
動は、例えば、揺動運動において培養容器の長軸を周期
的に傾斜することにより達成することができる；揺動運
動のための旋回軸の場所は、例えば培養容器の末端間の
領域に設けることができる。このことは、例えば、ロー
ラーボトルに類似した培養容器の末端に、周囲表面を超
えて突出するカムを設けることにより達成される。この
カムは、断面において、楕円形の回転接触表面として機
能し、二つの長円形の長軸はお互いずれている。With respect to this method, according to the invention, the object obtained from the above method is that the cell culture is cultivated so that the production chamber contains a volume of air bubbles which comprises at least 10% of its volume. It is filled and is achieved by adding a rolling motion as well as a tumbling movement so that the bubbles move in the cell culture by buoyancy. Due to the tumbling movement of the culture vessel and the buoyancy of its liquid cell culture, the bubbles move back and forth in the production chamber. This backward-forward movement of bubbles contributes to the good mixing of the cell culture mixture, and also contributes to the stable supply of nutrients to the cell culture mixture, particularly to stable oxygen supply and continuous excretion of metabolites. To do. The tipping movement can be achieved, for example, by periodically tilting the long axis of the culture vessel in a rocking movement; the location of the pivot axis for the rocking movement is, for example, in the region between the ends of the culture vessel. Can be provided. This is accomplished, for example, by providing the end of the culture vessel, which resembles a roller bottle, with a cam that projects beyond the surrounding surface. In cross section, the cam acts as an elliptical rolling contact surface, with the major axes of the two ovals offset from each other.
【００１７】各運動サイクルにおいて、気泡が、生産チ
ャンバーの上昇したそれぞれの末端に、充分な時間上昇
しているように、転倒運動の周期を的確に長くするのが
有利である。In each movement cycle, it is advantageous to precisely lengthen the cycle of the tipping movement so that the bubbles are rising to the respective raised end of the production chamber for a sufficient time.
【００１８】気泡の混合効果は、生産チャンバーの容量
の２０％〜５０％をしめる気泡の場合にとくに顕著とな
る。The effect of mixing bubbles is particularly remarkable in the case of bubbles that make up 20% to 50% of the volume of the production chamber.
【００１９】培養容器の回転運動の速度は、一方では、
細胞培養物が生産チャンバーに沈殿しない程度に速くす
ること、また他方では、細胞培養物がその慣性に拘わら
ずその回転運動に従う程度にゆっくりとすることが有利
である。これらの条件を満足する速度は、細胞培養物の
沈殿速度、その嵩および生産チャンバーのサイズに依存
する。生産チャンバーの周縁部で、直線速度として２０
mm／秒〜５０mm／秒の値が有効であることが証明され
た。The speed of rotation of the culture vessel is, on the one hand,
It is advantageous to make the cell culture so fast that it does not settle in the production chamber, and, on the other hand, slow enough so that the cell culture follows its rotational movement despite its inertia. The rate at which these conditions are met depends on the rate of precipitation of the cell culture, its bulk and the size of the production chamber. A linear velocity of 20 at the periphery of the production chamber
Values from mm / sec to 50 mm / sec have proven to be valid.
【００２０】[0020]
【実施例】本発明の実施例を図面に示し、その詳細を以
下に説明する。図１において、本発明の細胞培養用容器
が、概略的に、縦断面図として描かれている。DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS An embodiment of the present invention is shown in the drawings and the details thereof will be described below. In FIG. 1, the cell culture container of the present invention is schematically illustrated as a vertical sectional view.
【００２１】参照番号１は、培養容器の全体に与えられ
ている。この培養容器は、実質上中空で円筒形の供給チ
ャンバー２を有する。供給チャンバー２の外壁は、シリ
コーンチューブ３からなり、その末端領域には、外部の
ねじ山４、５および内部に位置するフランジ６、７が設
けられている。シリコーンチューブ３の壁の厚さは、約
３mmである。これは、０.３８mmの厚さのシリコーンフ
ィルム８で外部が覆われている開口部を有し（この開口
部は周囲表面全体にわたり均一に分布している）、これ
により、シリコーンチューブ３の周囲表面に残るウエブ
９が、シリコーンフィルム８から、供給チャンバー２の
内部に突出して、培養の間に起こる応力に対し十分な機
械的安定性を与える凝集力のある格子を形成するように
なっている。供給チャンバー２は、約１５cmの長さ、約
５cmの外部直径を有し、および約３００mlの全容量を有
することができる。シリコーンチューブ３の全周囲表面
積は、約２４０cm2であり、その約２／３はシリコーン
フィルム３で覆われた開口部により占められている。シ
リコーンチューブ３の末端部は、安定なプラスチックか
ら作製された、中心孔１０、１１を有する環状ディスク
１２、１３でそれぞれシールされている；環状ディスク
１２の中心孔１０は、環状ディスク１２から供給チャン
バー２の内部に向かって延びるスリーブ状カラー１４に
より囲まれ、ホースニップルの一種を形成している。透
析袋１５（Visking 20/32）の一つの自由末端は、カラ
ー１４を覆うようにかぶされ、その上をシリコーンスリ
ーブ１６で留められている。透析袋１５の他の末端は、
供給チャンバー２中に突出しており、シールされてい
る。薄い、半透過性の透析膜（参照番号１５）からなる
透析袋１５は、約６０mlの全容量を有することができ
る。中心孔１０、１１がそれぞれゴムストッパー１７で
シールされ得る２つの環状ディスク１２、１３は、供給
チャンバー２の外部のねじ山４、５においてかみ合う環
状のスクリューキャップ１９により、供給チャンバー２
のフランジ６、７に対して液密に押し付けられる。ゴム
ストッパー１７、１８は、スクリューキャップ１９、２
０中の開口部を通して利用することができる。培養容器
１は、矢印２２の方向に示したように、その長軸２１を
中心として回転することができる。The reference number 1 is given to the entire culture vessel. The culture vessel has a substantially hollow, cylindrical feed chamber 2. The outer wall of the supply chamber 2 consists of a silicone tube 3, which is provided at its end region with external threads 4, 5 and internal flanges 6, 7. The wall thickness of the silicone tube 3 is about 3 mm. It has openings that are externally covered with a 0.38 mm thick silicone film 8 (the openings are evenly distributed over the entire peripheral surface), so that the circumference of the silicone tube 3 is The web 9 that remains on the surface projects from the silicone film 8 into the interior of the feed chamber 2 to form a cohesive lattice that provides sufficient mechanical stability to the stresses that occur during incubation. . The feed chamber 2 can have a length of about 15 cm, an outer diameter of about 5 cm, and a total volume of about 300 ml. The total peripheral surface area of the silicone tube 3 is about 240 cm 2 , about 2/3 of which is occupied by the opening covered with the silicone film 3. The distal end of the silicone tube 3 is sealed with annular discs 12, 13 each having a central bore 10, 11 made of stable plastic; the central bore 10 of the annular disc 12 is fed from the annular disc 12 to the feed chamber. It is surrounded by a sleeve-like collar 14 which extends inwardly of 2, forming a kind of hose nipple. One free end of the dialysis bag 15 (Visking 20/32) is covered over the collar 14 and secured with a silicone sleeve 16 thereon. The other end of the dialysis bag 15 is
It projects into the supply chamber 2 and is sealed. A dialysis bag 15 consisting of a thin, semi-permeable dialysis membrane (reference numeral 15) can have a total volume of about 60 ml. Two annular discs 12, 13 whose central bores 10, 11 can each be sealed with a rubber stopper 17 are provided by means of an annular screw cap 19 which engages in the threads 4, 5 outside the feeding chamber 2.
It is pressed against the flanges 6 and 7 in a liquid-tight manner. The rubber stoppers 17 and 18 are screw caps 19 and 2.
It is available through the opening in 0. The culture vessel 1 can rotate about its long axis 21 as shown in the direction of arrow 22.
【００２２】細胞培養混合物２３の約３５mlが、透析袋
１５中に入れられ、これは、生産チャンバーとして機能
し、次に生産チャンバーがゴムストッパー１７でシール
される。結果として、約２５mlの容量を有する気泡２４
は、透析袋１５に封じられる。同時に、供給チャンバー
２は、細胞培養混合物２３のための栄養培地により、そ
の高さ（水平におかれたとき）の約半分が満たされる。
細胞培養は、ＮａＨＣＯ3バッファーに基づく培地中で
行われる。バッファー系を維持するために、培養は、あ
らかじめ決められたＣＯ2およびＯ2雰囲気、高湿度雰囲
気および決められた温度で、インキュベーターにおいて
行われる（図示せず）。培養容器１は回転するので、透
析袋１５は栄養培地２５によりすべての面が浸されるこ
とになる。結果として栄養物は、半透過性透析膜１５を
通り、供給チャンバー２から細胞培養物（参照番号２
３）中に移動し、同時に、代謝生成物は供給チャンバー
２中にそこから運ばれ出る。細胞培養物２３の酸素要求
量（１０7細胞あたり少なくとも０.０１mg／時間）を満
たすために、インキュベーター雰囲気中に存在する酸素
は、酸素に対して十分な透過性を有するシリコーンフィ
ルム８を通り、栄養培地２５およびその上部に位置する
供給チャンバー雰囲気２６の両方に直接通過する。酸素
は、栄養培地２５中に物理的に溶解し、透析膜１５を徐
々に通過し、したがって細胞培養物２３中に運ばれる。
酸素が消費されるために生じる二酸化炭素ガスは、透析
膜１５を通り、細胞培養物２３から供給チャンバー２の
栄養培地２５中に排出され、シリコーンフィルム８を通
って培養容器１から除去される。二酸化炭素ガスに対す
るシリコーンフィルム８の透過性は、過剰な圧力が供給
チャンバー２の内側に生じないように、酸素に対する透
過性よりも実質上高くする。一方、シリコーンフィルム
８は、細胞培養物を汚染する可能性のある液体および細
菌、カビまたは胞子のような微生物に対して不透過性で
ある。培養の間、サンプルは取り出され得、細胞培養物
２３を接種することができ、あるいは栄養培地２５は、
ゴムストッパー１７、１８それぞれを通してチェックま
たは交換することができる。About 35 ml of the cell culture mixture 23 is placed in a dialysis bag 15, which functions as a production chamber, which is then sealed with a rubber stopper 17. As a result, bubbles 24 having a volume of about 25 ml
Are sealed in a dialysis bag 15. At the same time, the feed chamber 2 is filled with the nutrient medium for the cell culture mixture 23 to about half its height (when placed horizontally).
Cell culture is performed in a NaHCO 3 buffer based medium. In order to maintain the buffer system, the culture is carried out in an incubator at a predetermined CO 2 and O 2 atmosphere, a high humidity atmosphere and a predetermined temperature (not shown). Since the culture container 1 rotates, the dialysis bag 15 is soaked on all sides with the nutrient medium 25. As a result, nutrients pass through the semipermeable dialysis membrane 15 from the feed chamber 2 into the cell culture (reference 2
3) into which the metabolites are simultaneously carried out into the feeding chamber 2. In order to meet the oxygen demand of the cell culture 23 (at least 0.01 mg / hr per 10 7 cells), the oxygen present in the incubator atmosphere passes through the silicone film 8 which has sufficient permeability for oxygen, It passes directly through both the nutrient medium 25 and the feed chamber atmosphere 26 located above it. Oxygen physically dissolves in the nutrient medium 25 and gradually passes through the dialysis membrane 15 and is thus carried into the cell culture 23.
Carbon dioxide gas generated due to the consumption of oxygen is discharged from the cell culture 23 into the nutrient medium 25 of the supply chamber 2 through the dialysis membrane 15, and is removed from the culture container 1 through the silicone film 8. The permeability of the silicone film 8 to carbon dioxide gas is substantially higher than the permeability to oxygen so that excess pressure does not occur inside the supply chamber 2. On the other hand, the silicone film 8 is impermeable to liquids and microorganisms such as bacteria, molds or spores that can contaminate the cell culture. During culturing, a sample may be removed and inoculated with cell culture 23, or nutrient medium 25
It can be checked or replaced through the rubber stoppers 17, 18 respectively.
【００２３】細胞培養物２３および栄養培地２５の良好
な混合に関して、培養容器１は、約３４rpmの回転速度
でその長軸２１を中心として回転することができる；こ
の回転２２に加え、シリコーンチューブ３の末端部が揺
動するような方法において、連続的な後退および前進運
動を受けるように、培養容器１のゆっくりとした周期的
な転倒運動が行われる。細胞培養物２３における浮力の
結果として、とくに有効な方法において、気泡２４は、
透析袋１５の内側で、後退および前進するように動き、
これにより細胞培養物２３の混合を促進し、栄養物（と
くに酸素）を安定して供給することができる。For good mixing of the cell culture 23 and the nutrient medium 25, the culture vessel 1 can rotate about its long axis 21 at a rotation speed of about 34 rpm; in addition to this rotation 22, the silicone tube 3 In a manner such that the distal end of the culture vessel oscillates, a slow, periodic tumbling movement of the culture vessel 1 is performed so that it undergoes a continuous backward and forward movement. As a result of the buoyancy in the cell culture 23, in a particularly effective manner, the bubbles 24
Inside the dialysis bag 15, move backward and forward,
As a result, the mixing of the cell culture 23 can be promoted and the nutrients (especially oxygen) can be stably supplied.
【００２４】本発明の培養容器１は、とくに取り扱いが
容易であり；１０7細胞／mlを超える細胞密度で、ま
た、ハイブリドーマ細胞の場合においては、標準的な静
置法培養で達成される濃度よりも、少なくとも１０倍は
高いモノクローナル抗体の濃度で、高純度の細胞培養物
を生産することができる。The culture vessel 1 of the present invention is particularly easy to handle; at cell densities above 10 7 cells / ml and, in the case of hybridoma cells, the concentrations achieved by standard static culture. It is possible to produce highly pure cell cultures at concentrations of monoclonal antibodies that are at least 10 times higher than.
【図１】本発明の実施例における細胞培養用容器の概略
的な縦断面図である。FIG. 1 is a schematic vertical cross-sectional view of a cell culture container in an example of the present invention.
１ 培養容器 ２ 供給チャンバー ３ シリコーンチューブ ６，７ フランジ ８ シリコーンフィルム ９ ウエブ １０，１１ 中心孔 １２，１３ 環状ディスク １５ 透析袋 ２３ 細胞培養物 ２４ 気泡 ２５ 栄養培地 ２６ 供給チャンバー雰囲気 1 Culture Container 2 Supply Chamber 3 Silicone Tube 6,7 Flange 8 Silicone Film 9 Web 10,11 Center Hole 12,13 Annular Disk 15 Dialysis Bag 23 Cell Culture 24 Air Bubble 25 Nutrient Medium 26 Supply Chamber Atmosphere
Claims (8)
チャンバーの中に少なくとも一つ設けられ、細胞培養物
を受け入れ且つ該栄養培地により浸されている生産チャ
ンバーとを備えており、その際、該生産チャンバーは、
栄養物を該供給チャンバーから該生産チャンバー中に運
ぶと同時に、代謝産物を該生産チャンバーから該供給チ
ャンバー中に運ぶ透析膜により該栄養培地から分離され
ており、且つ該供給チャンバーへの気体の供給および排
出系を備えている、１mlにつき少なくとも１０7細胞の
細胞密度で細胞培養を行うためのローラーボトルに類似
した培養容器において、 該培養容器には、気体の供給および排出系として、細胞
培養物を汚染する微生物および液体に対して不透過性で
あり且つ細胞培養中に要求され且つ産生される気体に対
して透過性である気体交換膜８が設けられ、該気体交換
膜８は、該培養容器１の外壁の少なくとも一部分を形成
し且つその全表面積、材料および厚さは、酸素に対する
透過性が、１０7細胞につき少なくとも０.１mg／時間で
あるように選択されることを特徴とする培養容器。1. A supply chamber containing a nutrient medium, and a production chamber provided in at least one of the supply chambers for receiving a cell culture and being immersed in the nutrient medium, wherein: The production chamber is
A gas supply to the feed chamber, which is separated from the nutrient medium by a dialysis membrane that carries nutrients from the feed chamber into the production chamber while simultaneously carrying metabolites from the feed chamber into the feed chamber. And a discharge system, which is similar to a roller bottle for carrying out cell culture at a cell density of at least 10 7 cells per ml, the culture container serving as a gas supply and discharge system for the cell culture. A gas exchange membrane 8 is provided which is impermeable to microorganisms and liquids that contaminate cells and is permeable to the gas required and produced during cell culture. It forms at least part of the outer wall of the container 1 and its total surface area, material and thickness are such that it has a permeability to oxygen of at least 0.1 mg / h per 10 7 cells. A culture vessel characterized by being selected to be between.
細胞培養物における細胞１０7個につき少なくとも０.０
５mg／時間である請求項１に記載の培養容器。2. The permeability of the gas exchange membrane 8 to oxygen is
At least 0.0 per 10 7 cells in cell culture
The culture container according to claim 1, which has a dose of 5 mg / hour.
され、該気体交換膜８が、０.１〜１mmの厚さを有する
請求項１または２に記載の培養容器。3. The culture container according to claim 1 or 2, wherein the gas exchange membrane 8 is made of silicone, and the gas exchange membrane 8 has a thickness of 0.1 to 1 mm.
表面積を覆う請求項１ないし３のいずれか１項に記載の
培養容器。4. The culture container according to claim 1, wherein the gas exchange membrane 8 covers the entire surface area of at least 5 cm 2 .
端部がシールされている中空シリンダー３として設計さ
れている請求項１ないし４のいずれか１項に記載の培養
容器。5. The culture container according to any one of claims 1 to 4, wherein the culture container 1 is designed as a hollow cylinder 3 whose both ends are sealed with a gas exchange membrane 8.
いし５のいずれか１項に記載の培養容器。6. The culture container according to claim 1, wherein the gas exchange membrane 8 is bent.
を除き、培養容器１の全外壁が、気体交換膜８として設
計されている請求項１ないし６のいずれか１項に記載の
培養容器。7. A support member 9 for mechanically stabilizing the outer wall 3.
The culture container according to any one of claims 1 to 6, wherein the entire outer wall of the culture container 1 is designed as a gas exchange membrane 8 except for.
培養細胞を含む生産チャンバーを浸す栄養培地が、請求
項１ないし７のいずれか１項に記載のローラーボトルに
類似した培養容器中に入れられ、連続回転運動が培養容
器に付与される細胞培養方法において、 該生産チャンバー１５が、該生産チャンバー１５の容量
の少なくとも１０％を占める気泡２４を含むように、培
養される培養細胞で満たされ、該培養容器１の回転運動
に加え、該気泡２４が浮力により細胞培養物２３中で動
くように、転倒運動が行われることを特徴とする細胞培
養方法。8. A nutrient medium immersing a production chamber containing cultured cells to be cultured and sealed on all sides is placed in a culture container similar to the roller bottle according to any one of claims 1 to 7. In a cell culture method in which a continuous rotary movement is applied to a culture vessel, the production chamber 15 is filled with cultured cells to be cultured so as to contain bubbles 24 occupying at least 10% of the volume of the production chamber 15. A cell culturing method characterized in that, in addition to the rotational movement of the culturing vessel 1, a tumbling movement is performed so that the bubbles 24 move in the cell culture 23 by buoyancy.
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