JPH06172312A - Method for labeling compound having primary amino group with fluorescence - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To provide a fluorescent-labeling reagent capable of readily introducing a primary amino group-having compound to a pyridylamino group extremely effective for the fluorescent labeling of a fine amount of a substance in water, a polar organic solvent or their mixture under a mild condition. CONSTITUTION:The method for fluorescently labeling a compound having a primary amino group comprises reacting either of compounds of formulas: R1-(CH2)m-NH-CO-(CH2)n-COO-R2, R1-CO-(CH2)n-CO-NH-(CH2)m-COO-R2, and R1-(CH2)m-CO-NH-(CH2)n-COO-R2 (R1 is 2-pyridylamino, 3-pyridylamino; R2 is a group originated from an active esterifying agent; m and n are independently an integer of 1-4) is reacted with a compound having a primary amino group in water, a polar organic solvent, or their mixture.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【発明の利用分野】本発明は、１級アミノ基を有する化
合物の水溶性蛍光標識化試薬として有用な新規な化合物
と、該化合物を蛍光標識化試薬として用いた１級アミノ
基を有する化合物の蛍光標識化方法に関する。FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to a novel compound useful as a water-soluble fluorescent labeling reagent for a compound having a primary amino group, and a compound having a primary amino group using the compound as a fluorescent labeling reagent. It relates to a fluorescent labeling method.

【０００２】[0002]

【発明の背景】測定対象物質を蛍光物質で標識した後、
その蛍光を利用して該物質を測定する方法は、試料中に
ナノモル〜ピコモル程度しか含まれていない微量物質の
測定方法として広く利用されている。BACKGROUND OF THE INVENTION After labeling a substance to be measured with a fluorescent substance,
The method for measuring the substance using the fluorescence is widely used as a method for measuring a trace substance in which a sample contains only nanomolar to picomolar amounts.

【０００３】しかしながら、従来から用いられている測
定対象物質を蛍光標識するための試薬、即ちフルオレッ
センイソチオシアネート（FITC）、エオシン、クマリン
イソチオシアネート等の蛍光標識化試薬は、それ自体の
水溶性が低いため種々の問題点を有していた。即ち、例
えば水溶液中に含まれている微量物質を蛍光標識化する
際には、上記した如き蛍光標識化試薬は一旦極性有機溶
媒に溶解して用いなければならないため、蛍光標識化操
作が煩雑であることや、上記した如き蛍光標識化試薬を
用いて調製された蛍光標識化物質はそれ自体の水溶性が
低下するため、例えば上記蛍光標識化試薬を用いて調製
された蛍光標識化抗体を利用して他の物質の検出を行う
場合に必要濃度の水溶液を調製することができない場合
があること、等である。However, conventionally used reagents for fluorescently labeling a substance to be measured, that is, fluorescent labeling reagents such as fluorescein isothiocyanate (FITC), eosin, and coumarin isothiocyanate are not soluble in water themselves. Since it is low, it has various problems. That is, for example, in the case of fluorescently labeling a trace substance contained in an aqueous solution, the fluorescent labeling reagent as described above must be dissolved in a polar organic solvent and used once, so that the fluorescent labeling operation is complicated. In some cases, since the fluorescent labeling substance prepared by using the fluorescent labeling reagent as described above has a reduced water solubility of itself, for example, a fluorescent labeled antibody prepared by using the above fluorescent labeling reagent is used. Then, when detecting other substances, it may not be possible to prepare an aqueous solution with a required concentration.

【０００４】これらの問題点を解決する目的で、例えば
スルホ基、カルボキシル基等の水溶性基を導入した、ダ
ンシルクロライド、ルシファーイエロー、o-フタルアル
デヒド等の水溶性蛍光標識化試薬が開発された。しかし
ながら、これらを用いて調製された蛍光標識化物質は、
水溶性という面では改善されたものの、それ自体の保存
安定性が悪いため、調製後の保存ができないという問題
点を有していた。For the purpose of solving these problems, a water-soluble fluorescent labeling reagent such as dansyl chloride, lucifer yellow, o-phthalaldehyde, etc., in which a water-soluble group such as a sulfo group or a carboxyl group is introduced, has been developed. . However, the fluorescent labeling substance prepared using these is
Although it is improved in terms of water solubility, it has a problem that it cannot be stored after preparation because of its poor storage stability.

【０００５】一方、2-アミノピリジン、3-アミノピリジ
ン等のアミノピリジンは、それ自体水溶性で且つ非常に
安定な蛍光物質であり、これにより標識された物質も保
存安定性に優れ、且つ標識対象物質が水溶性のものの場
合には水溶性がそのまま維持されるため、糖質等への蛍
光標識物質として近時広く利用されている化合物である
（Biochemical and Biophysical Research Communicati
ons vol.85,257頁,1978等)。On the other hand, aminopyridines such as 2-aminopyridine and 3-aminopyridine are themselves water-soluble and very stable fluorescent substances, and thus labeled substances are also excellent in storage stability and labeled. When the target substance is water-soluble, the water-solubility is maintained as it is, and thus it is a compound that has recently been widely used as a fluorescent labeling substance for sugars (Biochemical and Biophysical Research Communicati
ons vol.85, p.257, 1978 etc.).

【０００６】しかしながら、アミノピリジンそのもの
を、例えば抗体、酵素、ホルモン、各種因子類（例えば
成長因子、増殖因子等）、ハプテン等の生理活性物質の
標識物質として用いるには問題があった。即ち、アミノ
ピリジンを用いた蛍光標識化方法としては、標識対象物
質のアルデヒド基にシッフ塩基を介して結合させる方法
が一般的であるが、該方法を利用してアミノピリジンを
標識対象物質に高収率で且つ定量的に結合させるために
は、標識操作を非水条件下で、且つ90℃前後の高温で行
なわなければならないため（Agri. Biol. Chem.,vol.5
4,2169頁,1990）、標識された抗体等の生理活性物質の
例えば抗体活性、酵素活性、生理活性等が失活する場合
が多いという問題がそれである。However, there are problems in using aminopyridine itself as a labeling substance for physiologically active substances such as antibodies, enzymes, hormones, various factors (eg growth factors, growth factors, etc.) and haptens. That is, as a fluorescent labeling method using aminopyridine, a method of binding to an aldehyde group of a labeling target substance via a Schiff base is generally used. In order to bind in a yield and quantitatively, the labeling operation must be performed under non-aqueous conditions and at a high temperature around 90 ° C. (Agri. Biol. Chem., Vol. 5).
4, 2169, 1990), there is a problem that physiologically active substances such as labeled antibodies often lose their activity such as antibody activity, enzyme activity and physiological activity.

【０００７】そのため、ピリジルアミノ基を、穏和な条
件下で抗体、酵素、ホルモン、各種因子類、ハプテン等
の生理活性物質に導入し得る標識化試薬の開発が望まれ
ていた。Therefore, it has been desired to develop a labeling reagent capable of introducing a pyridylamino group into physiologically active substances such as antibodies, enzymes, hormones, various factors and haptens under mild conditions.

【０００８】[0008]

【発明の目的】本発明は、上記した如き状況に鑑みなさ
れたもので、ピリジルアミノ基を、水又は極性有機溶
媒、或はこれらの混合溶媒中に於いて穏和な条件下で１
級アミノ基を有する化合物に容易に導入し得る蛍光標識
化試薬と、該標識化試薬を用いた１級アミノ基を有する
化合物の蛍光標識化方法を提供することをその目的とす
る。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention has been made in view of the above-mentioned circumstances, in which a pyridylamino group can be prepared in water or a polar organic solvent or a mixed solvent thereof under mild conditions.
It is an object of the present invention to provide a fluorescent labeling reagent which can be easily introduced into a compound having a primary amino group, and a fluorescent labeling method for a compound having a primary amino group using the labeling reagent.

【０００９】[0009]

【発明の構成】本発明は、下記一般式(1)、(2)又は(3) Ｒ1ー(ＣＨ₂)m-ＮＨ-ＣＯ-(ＣＨ₂)n-ＣＯＯ-Ｒ2 (1) Ｒ1ーＣＯ-(ＣＨ₂)n-ＣＯ-ＮＨ-(ＣＨ₂)m-ＣＯＯ-Ｒ2 (2) Ｒ1-(ＣＨ₂)m-ＣＯ-ＮＨ-(ＣＨ₂)n-ＣＯＯ-Ｒ2 (3) （式中、Ｒ1は2-ピリジルアミノ基又は3-ピリジルアミ
ノ基を表わし、Ｒ2は活性エステル化剤に起因する基を
表わし、ｍ及びｎは夫々独立して１〜４の整数を表わ
す。）で示される化合物の内の何れかと、１級アミノ基
を有する化合物とを水又は極性有機溶媒、或はこれらの
混合溶媒中で反応させることを特徴とする、１級アミノ
基を有する化合物の蛍光標識化方法、及び上記一般式
(1)、一般式(2)又は一般式(3)で示される化合物の発明
である。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention has the following general formula (1), (2) or (3) R1 chromatography _{(CH 2) m-NH-} CO- (CH 2) n-COO-R2 (1) R1 over CO -(CH ₂ ) n-CO-NH- (CH ₂ ) m-COO-R2 (2) R1- (CH ₂ ) m-CO-NH- (CH ₂ ) n-COO-R2 (3) (wherein , R1 represents a 2-pyridylamino group or a 3-pyridylamino group, R2 represents a group derived from an active esterifying agent, and m and n each independently represent an integer of 1 to 4). And a compound having a primary amino group are reacted in water or a polar organic solvent, or a mixed solvent thereof, and a fluorescent labeling method for a compound having a primary amino group, and The above general formula
The invention is a compound represented by (1), the general formula (2) or the general formula (3).

【００１０】本発明の一般式(1)〜(3)で示される化合物
に於けるＲ2の活性エステル化剤に起因する基として
は、カルボキシル基の活性化剤に起因する基であって１
級アミノ基に対して反応性を有するものであれば何れに
てもよいが、具体的には例えばコハク酸イミド基、フタ
ル酸イミド基、5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミ
ド基、p-ニトロフェニル基等が好ましく挙げられる。The group derived from the active esterifying agent of R 2 in the compounds represented by the general formulas (1) to (3) of the present invention is a group derived from the activating agent of the carboxyl group.
It may be any as long as it has reactivity with a primary amino group, and specifically, for example, a succinimide group, a phthalic acid imide group, a 5-norbornene-2,3-dicarboximide group, p -Nitrophenyl group and the like are preferable.

【００１１】一般式(1)で示される本発明化合物は、例
えば下記の合成ルートに従って容易に合成し得る。The compound of the present invention represented by the general formula (1) can be easily synthesized, for example, according to the following synthetic route.

【式１】 （上記反応スキーム中、Ｘはハロゲン原子を表わし、
ｍ、ｎ及びＲ2は前記と同じ。）[Formula 1] (In the above reaction scheme, X represents a halogen atom,
m, n and R2 are the same as above. )

【００１２】即ち、先ず例えば2-クロロピリジン，2-ブ
ロモピリジン，3-クロロピリジン，3-ブロモピリジン等
の2-又は3-ハロピリジンと、該2-又は3-ハロピリジンに
対して10〜20倍モルのアルキレンジアミン（例えばエチ
レンジアミン，1,3-プロパンジアミン，1,4-ブタンジア
ミン等）とを80〜120℃で８〜 24時間撹拌下に反応させ
る。反応後、反応液を減圧濃縮し、目的物をクロロホル
ム、ジクロロエタン等で抽出し、溶媒留去後、残渣を、
適当な溶媒（例えばベンゼン−石油エ−テル混合溶媒
等）を用いて結晶化して、上記一般式(1a)で示されるア
ミノアルキルアミノピリジンを得る。次いで、該アミノ
アルキルアミノピリジンとこれに対して１〜３倍モルの
ジカルボン酸無水物（例えば無水コハク酸，無水グルタ
−ル酸，無水マレイン酸等）又は、ジカルボン酸（例え
ばコハク酸，グルタ−ル酸，マレイン酸等）の２分子間
脱水縮合物{[ＨＯＯＣ-(ＣＨ₂)n-ＣＯ]₂Ｏ}（式中ｎは
前記に同じ）とを、例えばメタノ−ル、エタノ−ル、イ
ソプロパノール等の溶媒中、０〜30℃で２〜６時間撹拌
下に反応させる。反応後、析出晶を濾取、乾燥させて、
上記一般式(1b)で示される化合物（以下、化合物(1b)と
略記する。）を得る。＄ 次いで、この化合物(1b)を、
該化合物に対して１〜３倍モルの活性エステル化剤［例
えばN-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイ
ミド（以下、ＨＯＮＢと略記する。）、N-ヒドロキシコ
ハク酸イミド（以下、ＨＯＳｕと略記する。）等］と、
例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラヒドロ
フラン（ＴＨＦ）、ジオキサン等の溶媒中、例えば、化
合物(1b)に対して１〜３倍モルのトリフェニルホスフィ
ンと、これと等モルのジスルフィド化合物［例えば2,2'
-ジチオジピリジン（以下、2-ＰＤＳと略記する。）、
2,2'-ジチオビス(5-ニトロピリジン)等］と、０〜40℃
で２〜８時間撹拌下に反応させる。反応後、反応液を減
圧濃縮し、得られた残渣を、適当な溶媒（例えば酢酸エ
チル−ジエチルエ−テル混合溶媒等）を用いて結晶化す
る等により、一般式(1)で示される本発明 化合物が得ら
れる。尚、上記の反応に於いて、トリフェニルホスフィ
ンとジスルフィド化合物との組合せ試薬を用いる代り
に、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣ
Ｃ）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボ
ジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）等の縮合試薬を用いても、同
様に一般式(1)で示される本発明の 化合物が得られる。That is, first, for example, 2- or 3-halopyridine such as 2-chloropyridine, 2-bromopyridine, 3-chloropyridine, 3-bromopyridine, etc. and 10 to 20 times as much as the 2- or 3-halopyridine. A mole of alkylenediamine (for example, ethylenediamine, 1,3-propanediamine, 1,4-butanediamine, etc.) is reacted at 80 to 120 ° C. for 8 to 24 hours with stirring. After the reaction, the reaction solution was concentrated under reduced pressure, the target product was extracted with chloroform, dichloroethane, etc., and the solvent was distilled off.
Crystallization is performed using an appropriate solvent (for example, a benzene-petroleum ether mixed solvent) to obtain the aminoalkylaminopyridine represented by the above general formula (1a). Then, the aminoalkylaminopyridine and a dicarboxylic acid anhydride (eg, succinic anhydride, glutaric anhydride, maleic anhydride, etc.) in 1 to 3 moles relative thereto or dicarboxylic acid (eg, succinic acid, glutaric anhydride). Intermolecular dehydration condensate {[HOOC- (CH ₂ ) n-CO] ₂ O} (wherein n is the same as above), for example, methanol, ethanol, The reaction is carried out in a solvent such as isopropanol at 0 to 30 ° C. for 2 to 6 hours with stirring. After the reaction, the precipitated crystals are collected by filtration and dried,
A compound represented by the above general formula (1b) (hereinafter abbreviated as compound (1b)) is obtained. $ Then, this compound (1b)
A 1- to 3-fold molar amount of active esterifying agent [eg, N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide (hereinafter abbreviated as HONB)], N-hydroxysuccinimide (hereinafter , HOSu.) Etc.],
For example, in a solvent such as dimethylformamide (DMF), tetrahydrofuran (THF), dioxane, etc., for example, 1 to 3 times the molar amount of triphenylphosphine with respect to the compound (1b) and a disulfide compound [e.g. '
-Dithiodipyridine (hereinafter abbreviated as 2-PDS),
2,2'-dithiobis (5-nitropyridine), etc.], 0-40 ℃
And react for 2 to 8 hours under stirring. After the reaction, the reaction solution is concentrated under reduced pressure, and the obtained residue is crystallized using an appropriate solvent (eg, ethyl acetate-diethyl ether mixed solvent) to give the compound of the present invention represented by the general formula (1). The compound is obtained. In the above reaction, instead of using a combination reagent of triphenylphosphine and a disulfide compound, for example, dicyclohexylcarbodiimide (DC
C), 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (WSC) and the like can also be used to obtain the compound of the present invention represented by the general formula (1).

【００１３】また、一般式(2)で示される本発明化合物
は、例えば下記の如き合成ルートに従って容易に合成し
得る。The compound of the present invention represented by the general formula (2) can be easily synthesized, for example, according to the following synthetic route.

【式２】 （上記反応スキーム中、Ｒはアルキル基を表わし、ｍ、
ｎ及びＲ2は前記と同じ。）[Formula 2] (In the above reaction scheme, R represents an alkyl group, m,
n and R2 are the same as above. )

【００１４】即ち、先ず例えば2-アミノピリジン，3-ア
ミノピリジン等のアミノピリジンと、該アミノピリジン
に対して１〜３倍モルのジカルボン酸無水物（例えば無
水コハク酸，無水グルタ−ル酸，無水マレイン酸等）又
はジカルボン酸（例えばコハク酸，グルタ−ル酸，マレ
イン酸等）の２分子間脱水縮合物{[ＨＯＯＣ-(ＣＨ₂)n-
ＣＯ]₂Ｏ}（式中ｎは前記に同じ）とを、例えばエタノ
−ル、ＴＨＦ、トルエン、ベンゼン等の溶媒中、60〜10
0℃で２〜４時間、次いで10〜30℃で２〜４時間撹拌下
に反応させる。反応後、析出晶を濾取、乾燥させて、上
記一般式(2a)で示される化合物（以下、化合物(2a)と略
記する。）を得る。That is, first, an aminopyridine such as 2-aminopyridine, 3-aminopyridine, etc. and a dicarboxylic acid anhydride (for example, succinic anhydride, glutaric anhydride, Bimolecular intermolecular dehydration condensate {[HOOC- (CH ₂ ) n-] of dicarboxylic acid (eg succinic acid, glutaric acid, maleic acid, etc.)
CO] ₂ O} (wherein n is the same as above) in a solvent such as ethanol, THF, toluene, benzene, etc.
The reaction is carried out at 0 ° C. for 2-4 hours and then at 10-30 ° C. for 2-4 hours with stirring. After the reaction, the precipitated crystals are collected by filtration and dried to obtain the compound represented by the above general formula (2a) (hereinafter abbreviated as compound (2a)).

【００１５】次いで、得られた化合物(2a)と、該化合物
に対して１〜３倍モルのアミノ酸エステル（例えばグリ
シンエチルエステル，β−アラニンメチルエステル等）
とを、例えばＤＭＦ、ジオキサン等の溶媒中、化合物(2
a)に対して１〜３倍モルのトリフェニルホスフィンと、
これと等モルのジスルフィド化合物（例えば2-ＰＤＳ，
2,2'-ジチオビス(5-ニトロピリジン)等）の存在下、０
〜40℃で２〜８時間撹拌下に反応させる。反応後、不溶
物を瀘去し、溶媒を留去して得られた残渣を、例えばク
ロロホルム、ジクロロメタン等の溶媒で抽出し、抽出液
を例えば飽和重ソウ水，炭酸ナトリウム水溶液等のアル
カリ溶液、次いで水で順次洗浄する。その後、抽出液を
例えば無水硫酸ナトリウム、無水硫酸マグネシウム等に
より乾燥し、溶媒を留去して得られた残渣を適当な溶媒
（例えば酢酸エチル−ジエチルエ−テル混合溶媒等）を
用いて結晶化する等により、上記一般式(2b)で示される
化合物を得る。これを、常法により鹸化してエステルを
加水分解すれば一般式(2c)で示される化合物（以下、化
合物(2c)と略記する。）が得られる。尚、上記化合物(2
a)と反応させるアミノ酸エステルは、例えば塩酸塩，硫
酸塩等の鉱酸塩となっているものでも良いが、その場合
は、通常これと等モルの塩基（例えばトリエチルアミ
ン，N-メチルモルホリン等）が併せて用いられる。ま
た、上記化合物(2a)とアミノ酸エステルとの脱水縮合反
応は、トリフェニルホスフィンとジスルフィド化合物の
組合せ試薬を用いる方法の代りに、例えばＤＣＣ，ＷＳ
Ｃ等の縮合試薬を用いる方法、混合酸無水物法、アジド
法等のペプチドの合成の際に用いられる常法により行っ
てもよいことは言うまでもない。Then, the obtained compound (2a) and 1 to 3 moles of the amino acid ester with respect to the compound (eg, glycine ethyl ester, β-alanine methyl ester, etc.)
And (2) in a solvent such as DMF or dioxane,
1 to 3 times the molar amount of triphenylphosphine with respect to a),
An equimolar disulfide compound (eg 2-PDS,
2,2'-dithiobis (5-nitropyridine) etc.)
React with stirring at -40 ° C for 2-8 hours. After the reaction, insoluble materials were removed by filtration, the solvent was distilled off, and the resulting residue was extracted with a solvent such as chloroform or dichloromethane. The extract was saturated with sodium bicarbonate water, an alkaline solution such as an aqueous solution of sodium carbonate, Then, it is washed successively with water. Thereafter, the extract is dried with, for example, anhydrous sodium sulfate, anhydrous magnesium sulfate, etc., and the solvent is distilled off to obtain a residue, which is then crystallized using a suitable solvent (eg, ethyl acetate-diethyl ether mixed solvent). From the above, the compound represented by the above general formula (2b) is obtained. When this is saponified by a conventional method and the ester is hydrolyzed, a compound represented by the general formula (2c) (hereinafter abbreviated as compound (2c)) is obtained. The above compound (2
The amino acid ester to be reacted with a) may be a mineral acid salt such as hydrochloride or sulfate, but in this case, it is usually an equimolar base (eg triethylamine, N-methylmorpholine etc.). Are used together. In addition, the dehydration condensation reaction between the compound (2a) and the amino acid ester is carried out by using, for example, DCC, WS instead of the method using a combined reagent of triphenylphosphine and a disulfide compound.
Needless to say, it may be carried out by a conventional method used in peptide synthesis such as a method using a condensation reagent such as C, a mixed acid anhydride method and an azide method.

【００１６】次いで、得られた化合物(2c)を、該化合物
に対して１〜３倍モルの活性エステル化剤（例えばＨＯ
ＮＢ、ＨＯＳｕ等）と、例えばＤＭＦ、ＴＨＦ、ジオキ
サン等の溶媒中、化合物(2c)に対して１〜３倍モルのト
リフェニルホスフィンと、これと等モルのジスルフィド
化合物（例えば2-ＰＤＳ、2,2'-ジチオビス(5-ニトロピ
リジン)等）の存在下、０〜40℃で２〜８時間撹拌下に
反応させる。反応後、反応液を減圧濃縮し、得られた残
渣を、適当な溶媒（例えば酢酸エチル−ジエチルエ−テ
ル混合溶媒等）を用いて結晶化する等により、一般式
(2)で示される本発明化合物が得られる。尚、上記反応
に於いて、トリフェニルホスフィンとジスルフィド化合
物の組合せ試薬を用いる代りに、例えばＤＣＣ、ＷＳＣ
等の縮合試薬を用いても、同様に一般式(2)で示される
本発明の化合物が得られる。Then, the obtained compound (2c) is added to the compound in an amount of 1 to 3 times the molar amount of the active esterifying agent (eg, HO).
NB, HOSu, etc.) in a solvent such as DMF, THF, dioxane and the like, and 1 to 3 times the molar amount of triphenylphosphine to the compound (2c) and an equimolar disulfide compound (eg 2-PDS, 2 2,2'-dithiobis (5-nitropyridine) and the like) and reacted at 0-40 ° C for 2-8 hours with stirring. After the reaction, the reaction solution is concentrated under reduced pressure, and the obtained residue is crystallized using an appropriate solvent (eg, ethyl acetate-diethyl ether mixed solvent) to give a compound of the general formula
The compound of the present invention represented by (2) is obtained. In the above reaction, instead of using a combined reagent of triphenylphosphine and a disulfide compound, for example, DCC, WSC
The compound of the present invention represented by the general formula (2) can also be obtained by using such a condensation reagent.

【００１７】また、一般式(3)で示される本発明化合物
は、例えば下記の合成ルートに従って容易に合成し得
る。The compound of the present invention represented by the general formula (3) can be easily synthesized, for example, according to the following synthetic route.

【式３】 （上記反応スキーム中、Ｒ'はアルキル基を表わし、ｋ
は０〜２の整数を表わし、ｍ、ｎ及びＲ2は前記と同
じ。）[Formula 3] (In the above reaction scheme, R'represents an alkyl group, k
Represents an integer of 0 to 2, and m, n and R2 are the same as above. )

【００１８】即ち、例えば2-アミノピリジン，3-アミノ
ピリジン等のアミノピリジンと、該アミノピリジンに対
して１〜３倍モルの不飽和脂肪酸エステル（例えばアク
リル酸メチル，アクリル酸エチル，ビニル酢酸メチル，
アリル酢酸エチル等）とを、例えば2,5-ジ-tert-ブチル
ヒドロキノン等の重合禁止剤の存在下、60〜100℃で12
〜36時間撹拌下に反応させる。反応後、反応液を、例え
ばベンゼン、トルエン等の溶媒中に注入して、析出した
結晶を瀘去し、溶媒を留去して得られた残渣を、適当な
溶媒（例えばベンゼン−ヘキサン混合溶媒等）から再結
晶することにより、上記一般式(3a)で示される化合物を
得る。次いで、これを、常法により鹸化してエステルを
加水分解すれば、一般式(3b)で示される化合物（以下、
化合物(3b)と略記する。）が得られる。That is, for example, aminopyridine such as 2-aminopyridine, 3-aminopyridine and the like, and unsaturated fatty acid ester in 1 to 3 moles relative to the aminopyridine (eg, methyl acrylate, ethyl acrylate, methyl vinyl acetate). ，
Ethyl allyl acetate, etc.) in the presence of a polymerization inhibitor such as 2,5-di-tert-butylhydroquinone at 60-100 ° C.
Allow to react for ~ 36 hours with stirring. After the reaction, the reaction solution is poured into a solvent such as benzene or toluene, the precipitated crystals are filtered off, and the solvent is distilled off to obtain a residue, which is then mixed with a suitable solvent (for example, a benzene-hexane mixed solvent). And the like) to obtain the compound represented by the above general formula (3a). Then, this is saponified by a conventional method to hydrolyze the ester, to give a compound represented by the general formula (3b) (hereinafter,
It is abbreviated as compound (3b). ) Is obtained.

【００１９】得られた化合物(3b)と、該化合物に対して
１〜３倍モルのアミノ酸エステル（例えばグリシンエチ
ルエステル，β−アラニンメチルエステル等）とを、例
えばＤＭＦ、ジオキサン等の溶媒中、例えば、該化合物
に対して１〜３倍モルの例えばＤＣＣ，ＷＳＣ等の縮合
試薬の存在下、０〜30℃で12〜36時間撹拌下に反応させ
る。反応後、不溶物を瀘去し、濾液を減圧濃縮して得ら
れた残渣を例えばクロロホルム、ジクロロメタン等の溶
媒で抽出し、抽出液を例えば飽和重ソウ水、炭酸ナトリ
ウム水溶液等のアルカリ溶液、次いで水で順次洗浄す
る。抽出液を例えば無水硫酸ナトリウム、無水硫酸マグ
ネシウム等により乾燥後、溶媒を留去して、得られた残
渣を適当な溶媒（例えば酢酸エチル−ジエチルエ−テル
混合溶媒等）を用いて結晶化する等により、一般式(3c)
で示される化合物を得る。次いで、これを、常法により
鹸化してエステルを加水分解すれば、一般式(3d)で示さ
れる化合物（以下、化合物(3d)と略記する。）が得られ
る。尚、上記化合物(3b)と反応させるアミノ酸エステル
は、例えば塩酸塩，硫酸塩等の鉱酸塩となっているもの
でも良いが、その場合は、通常これと等モルの塩基（例
えばトリエチルアミン，N-メチルモルホリン等）が併せ
て用いられる。また、上記化合物(3b)とアミノ酸エステ
ルとの脱水縮合反応は、トリフェニルホスフィンとジス
ルフィド化合物の組合せ試薬を用いる方法の代りに、例
えばＤＣＣ，ＷＳＣ等の縮合試薬を用いる方法、混合酸
無水物法、アジド法等のペプチドの合成の際に用いられ
る常法により行ってもよいことは言うまでもない。The compound (3b) thus obtained and 1 to 3 moles of the amino acid ester (eg, glycine ethyl ester, β-alanine methyl ester, etc.) with respect to the compound are mixed in a solvent such as DMF or dioxane. For example, the reaction is carried out at 0 to 30 ° C. for 12 to 36 hours with stirring in the presence of 1 to 3 times the molar amount of a condensation reagent such as DCC or WSC. After the reaction, insoluble matter was removed by filtration, the residue obtained by concentrating the filtrate under reduced pressure was extracted with a solvent such as chloroform or dichloromethane, and the extract was extracted with saturated sodium bicarbonate water, an alkaline solution such as an aqueous solution of sodium carbonate, and then extracted. Wash sequentially with water. The extract is dried with, for example, anhydrous sodium sulfate, anhydrous magnesium sulfate, etc., the solvent is distilled off, and the obtained residue is crystallized using a suitable solvent (eg ethyl acetate-diethyl ether mixed solvent). According to the general formula (3c)
A compound represented by is obtained. Next, this is saponified by a conventional method to hydrolyze the ester to obtain a compound represented by the general formula (3d) (hereinafter, abbreviated as compound (3d)). The amino acid ester to be reacted with the compound (3b) may be a mineral acid salt such as a hydrochloride or a sulfate, but in that case, usually, an equimolar base (eg triethylamine, N -Methylmorpholine, etc.) is also used. In addition, the dehydration condensation reaction between the compound (3b) and the amino acid ester is carried out by a method using a condensation reagent such as DCC, WSC, a mixed acid anhydride method instead of a method using a combination reagent of triphenylphosphine and a disulfide compound. Needless to say, it may be carried out by a conventional method used in peptide synthesis such as the azide method.

【００２０】次いで、得られた化合物(3d)を、該化合物
に対して１〜３倍モルの活性エステル化剤（例えばＨＯ
ＮＢ、ＨＯＳｕ等）と、例えばＤＭＦ、ＴＨＦ、ジオキ
サン等の溶媒中、化合物(3d)に対して１〜３倍モルのト
リフェニルホスフィンと、これと等モルのジスルフィド
化合物（例えば2-ＰＤＳ、2,2'-ジチオビス(5-ニトロピ
リジン)等）の存在下、０〜40℃で２〜８時間撹拌下に
反応させる。反応後、反応液を減圧濃縮し、得られた残
渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ等により精製す
れば、一般式(3)で示される本発明の化合物が得られ
る。尚、上記の反応に於いて、トリフェニルホスフィン
とジスルフィド化合物との組合せ試薬を用いる代りに、
例えばＤＣＣ，ＷＳＣ等の縮合試薬を用いても、同様に
一般式(3)で示される本発明の化合物が容易に得られ
る。Then, the obtained compound (3d) is added to the compound in an amount of 1 to 3 times the molar amount of the active esterifying agent (eg, HO).
NB, HOSu, etc.) in a solvent such as DMF, THF, dioxane and the like, and 1 to 3 moles of triphenylphosphine with respect to the compound (3d) and a disulfide compound (eg, 2-PDS, 2 2,2'-dithiobis (5-nitropyridine) and the like) and reacted at 0-40 ° C for 2-8 hours with stirring. After the reaction, the reaction solution is concentrated under reduced pressure, and the obtained residue is purified by silica gel column chromatography or the like to obtain the compound of the present invention represented by the general formula (3). In the above reaction, instead of using a combination reagent of triphenylphosphine and a disulfide compound,
Similarly, the compound of the present invention represented by the general formula (3) can be easily obtained by using a condensation reagent such as DCC or WSC.

【００２１】本発明の蛍光標識化方法は、例えば１級ア
ミノ基を有する化合物と、該化合物の１級アミノ基１当
量に対して、通常１〜10当量、好ましくは１〜５当量、
より好ましくは２〜４当量の、一般式(1)、一般式(2)又
は一般式(3)で示される本発明の化合物とを、水、又は
例えばメタノール，エタノール等のアルコール類、アセ
トン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド等の極性
有機溶媒、或はこれら極性有機溶媒と水との混合溶媒
（以下、これらを総称して「水溶媒等」と略記する。）
中で反応させることにより容易に実施し得る。The fluorescent labeling method of the present invention is, for example, usually 1 to 10 equivalents, preferably 1 to 5 equivalents, relative to a compound having a primary amino group and 1 equivalent of the primary amino group of the compound,
More preferably, 2 to 4 equivalents of the compound of the present invention represented by the general formula (1), the general formula (2) or the general formula (3) is added to water or alcohols such as methanol and ethanol, acetone, A polar organic solvent such as acetonitrile or dimethylformamide, or a mixed solvent of these polar organic solvents and water (hereinafter, these are collectively referred to as "water solvent and the like").
It can be easily carried out by reacting in.

【００２２】尚、上記反応を実施する際の水溶媒等のp
Ｈとしては、１級アミノ基を有する化合物の安定性に影
響がない範囲であれば特に限定されないが、一般式(1)
〜(3)で示される本発明の化合物の反応性を勘案する
と、中性〜弱アルカリ性（pＨ６〜10程度）が望まし
い。また、上記反応液中には、本発明の化合物と１級ア
ミノ基との反応を阻害しないものであれば、例えばリン
酸塩，重炭酸塩等の１級アミノ基を有さない緩衝剤、防
腐剤、界面活性剤、安定化剤等が共存していてもよい。In carrying out the above reaction, p such as an aqueous solvent is used.
H is not particularly limited as long as it does not affect the stability of the compound having a primary amino group, and is represented by the general formula (1)
Considering the reactivity of the compound of the present invention represented by (3) to (3), neutral to weakly alkaline (pH about 6 to 10) is desirable. Further, in the above reaction solution, a buffer having no primary amino group such as phosphate and bicarbonate, provided that it does not inhibit the reaction between the compound of the present invention and the primary amino group, An antiseptic, a surfactant, a stabilizer and the like may coexist.

【００２３】本発明の方法は、蛍光標識化に際して、従
来のダンシルクロライドによる蛍光標識化のように極性
有機溶媒の使用が必須ではないため、例えば抗体、酵
素、ホルモン、各種因子類（例えば成長因子、増殖因子
等）、ハプテン等の生理活性物質等、有機溶媒により変
性されやすい物質への標識を容易に行うことが可能とな
った。In the method of the present invention, it is not necessary to use a polar organic solvent for fluorescent labeling as in the conventional fluorescent labeling with dansyl chloride, and therefore, for example, antibodies, enzymes, hormones, various factors (eg growth factors) are used. , Growth factors, etc.), physiologically active substances such as haptens, etc., and substances that are easily denatured by organic solvents can be easily labeled.

【００２４】本発明の方法により蛍光標識化が可能な１
級アミノ基を有する化合物としては、水溶媒等に１ピコ
モル以上の濃度で溶解する性質を有する化合物であっ
て、且つ１級アミノ基を有する化合物であれば、天然
品、合成品を問わず特に限定することなく挙げられる
が、より具体的には例えばアミノ酸、例えばグルタチオ
ン，アンジオテンシンＩ，アンジオテンシンII，エンド
ルフィン，エンドセリン等のペプチド類、例えばイムノ
グロブリン，アルブミン，トランスフェリン，甲状腺刺
激ホルモン（ＴＳＨ），ヒト絨毛性ゴナドトロピン（h
ＣＧ），卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ），黄体形成ホルモ
ン（ＬＨ）等の糖蛋白質（又は蛋白質）、これら糖蛋白
質（又は蛋白質）を例えばトリプシン，キモトリプシ
ン，ペプシン，パパイン，Ｖ８プロテアーゼ等のプロテ
アーゼで処理して得られる糖ペプチドフラグメント（又
はペプチドフラグメント）等が好ましく挙げられる。ま
た、本発明の方法により蛍光標識化が可能な１級アミノ
基を有する糖蛋白質（又は糖ペプチドフラグメント）に
於ける糖鎖としては、その構成糖の種類及び数には特に
制限はないが、例えばグルコース，マンノース，ガラク
トース，フコース，シアル酸，N-アセチルグルコサミ
ン，N-アセチルガラクトサミン等の糖残基から構成さ
れ、その糖残基の数が１〜１０個程度のものが好ましく
挙げられる。また、該糖鎖の糖残基間の結合の種類にも
特に制限はなく、例えばα１→４，β１→４，α１→
６，α２→３，β１→２，β１→３，α２→６，α１→
３，α１→２，β１→６等何れにてもよい。但し、本発
明の方法により蛍光標識化した糖蛋白質（糖ペプチド）
を糖転移酵素のアクセプターや糖分解酵素の基質として
使用する場合には、該糖蛋白質（又は糖ペプチド）の糖
鎖は、目的とする糖転移酵素のアクセプターや糖分解酵
素の基質となり得るものでなければならないことは言う
までもない。Fluorescent labeling is possible by the method of the present invention 1.
As the compound having a primary amino group, a compound having a property of being dissolved in a water solvent or the like at a concentration of 1 picomole or more, and a compound having a primary amino group, whether it is a natural product or a synthetic product, is particularly preferable. Specific examples thereof include, but are not limited to, amino acids such as peptides such as glutathione, angiotensin I, angiotensin II, endorphin, endothelin, such as immunoglobulin, albumin, transferrin, thyroid stimulating hormone (TSH), human villi. Sex gonadotropin (h
CG), follicle-stimulating hormone (FSH), luteinizing hormone (LH), and other glycoproteins (or proteins), which are treated with a protease such as trypsin, chymotrypsin, pepsin, papain, V8 protease Preference is given to the glycopeptide fragment (or peptide fragment) obtained by the above. Further, as the sugar chain in the glycoprotein (or glycopeptide fragment) having a primary amino group that can be fluorescently labeled by the method of the present invention, the kind and number of constituent sugars are not particularly limited, For example, it is preferably composed of sugar residues such as glucose, mannose, galactose, fucose, sialic acid, N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine and the like, and those having about 1 to 10 sugar residues are preferable. The type of linkage between sugar residues of the sugar chain is not particularly limited, and may be, for example, α1 → 4, β1 → 4, α1 →
6, α2 → 3, β1 → 2, β1 → 3, α2 → 6, α1 →
3, α1 → 2, β1 → 6, etc. may be used. However, a glycoprotein (glycopeptide) fluorescently labeled by the method of the present invention
When is used as an acceptor of a glycosyltransferase or a substrate of a glycolytic enzyme, the sugar chain of the glycoprotein (or glycopeptide) can be an acceptor of the desired glycosyltransferase or a substrate of a glycolytic enzyme. It goes without saying that it must be done.

【００２５】本発明の蛍光標識化方法は、以下に述べる
如く様々な応用が可能である。即ち、例えば１級アミノ
基を有する化合物がアミノ酸である場合には、アミノ酸
組成分析のためのアミノ酸の蛍光標識化方法として、ま
た、１級アミノ基を有する化合物がペプチドである場合
には、例えばa)プロテアーゼ処理後のペプチドフラグメ
ントの検出のための蛍光標識化方法、b)例えば血清、血
漿、尿、髄液等の生体体液中に含まれる超微量ペプチド
（ホルモン等）を検出するための蛍光標識化方法、c)プ
ロテアーゼ活性測定用の蛍光標識化ペプチド基質の調製
方法、d)蛍光標識化ペプチドの調製方法、e)ペプチドの
Ｎ末端保護方法、等として、更にまた、１級アミノ基を
有する化合物が蛋白質である場合には、例えばa)蛍光標
識化抗体の調製方法、b)例えば血清、血漿、尿、髄液等
の生体体液中に含まれる超微量蛋白質を検出するための
蛍光標識化方法（特に、ＵＶ吸収や酵素活性で検出でき
ない微量蛋白質を検出するのに有効である。）、c)プロ
テアーゼ活性測定用の蛍光標識化蛋白質基質の調製方
法、d)蛍光標識化蛋白質の調製方法、等として、また、
１級アミノ基を有する化合物が糖ペプチドや糖蛋白質で
ある場合には、例えばa)フコース、シアル酸、ガラクト
ース、Ｎ−アセチルグルコサミン等を転移する糖転移酵
素の蛍光標識化アクセプターの調製方法、b)各種糖分解
酵素活性測定用の蛍光標識化基質の調製方法、等として
本発明方法は広く利用可能である。The fluorescent labeling method of the present invention can be applied in various ways as described below. That is, for example, when the compound having a primary amino group is an amino acid, as a fluorescent labeling method of an amino acid for amino acid composition analysis, and when the compound having a primary amino group is a peptide, for example, a) Fluorescence labeling method for detection of peptide fragments after protease treatment, b) Fluorescence for detection of ultratrace peptides (hormones, etc.) contained in biological fluids such as serum, plasma, urine, and spinal fluid As a labeling method, c) a method for preparing a fluorescently labeled peptide substrate for measuring protease activity, d) a method for preparing a fluorescently labeled peptide, e) a method for protecting the N-terminal of a peptide, etc., a primary amino group When the compound having is a protein, for example, a) a method for preparing a fluorescently labeled antibody, b) for detecting an ultratrace protein contained in a biological fluid such as serum, plasma, urine, or spinal fluid Fluorescent labeling method (especially effective for detecting a trace amount of protein that cannot be detected by UV absorption or enzyme activity), c) preparation method of fluorescent labeled protein substrate for measuring protease activity, d) fluorescent labeled protein As a method for preparing
When the compound having a primary amino group is a glycopeptide or glycoprotein, for example, a) a method for preparing a fluorescently labeled acceptor of a glycosyltransferase that transfers fucose, sialic acid, galactose, N-acetylglucosamine, etc., b The method of the present invention can be widely used as a method for preparing a fluorescently labeled substrate for measuring various glycolytic enzyme activities, and the like.

【００２６】尚、本発明の方法は、１級アミノ基を有す
る化合物であれば特に限定されることなく蛍光標識化が
可能であるので、その用途は上記した如きものに限定さ
れるものではないことは言うまでもない。The method of the present invention is not particularly limited as long as it is a compound having a primary amino group, and fluorescent labeling is possible. Therefore, its use is not limited to those described above. Needless to say.

【００２７】従来、主に用いられてきたダンシルクロラ
イド、フェニルチオヒダントイン(PTH)、ルシファイエ
ロー等の蛍光標識化剤により蛍光標識化されたアミノ
酸、ペプチド、蛋白質、糖ペプチド、糖蛋白質等は保存
時の安定性が悪いため、標準品でさえ用時調製しなけれ
ばならないという問題点を有していた。一方、本発明化
合物を用いて蛍光標識化されたアミノ酸、ペプチド、蛋
白質、糖ペプチド、糖蛋白質等は保存時の安定性が極め
て高いので、予め調製したものを標準品として適宜使用
することが可能である。尚、本発明化合物により蛍光標
識化されたアミノ酸、ペプチド、蛋白質、糖ペプチド、
糖蛋白質等の検出感度は数ヒ゜コモルと極めて高感度であ
る。以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明す
るが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるもの
ではない。[0027] Amino acids, peptides, proteins, glycopeptides, glycoproteins and the like which have been fluorescently labeled with a fluorescent labeling agent such as dansyl chloride, phenylthiohydantoin (PTH) and lucifer yellow, which have been mainly used in the past, are stored. Due to the poor stability of, the standard product had to be prepared before use. On the other hand, fluorescently labeled amino acids, peptides, proteins, glycopeptides, glycoproteins, etc., using the compound of the present invention have extremely high stability during storage, so that those prepared in advance can be appropriately used as standard products. Is. Amino acids, peptides, proteins, glycopeptides fluorescently labeled with the compound of the present invention,
The sensitivity of detection of glycoproteins is extremely high at several picomoles. Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.

【００２８】[0028]

【実施例】【Example】

実施例１．2-ピリジルアミノエチルスクシナミン酸 5-
ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミドエステル（ＰＡ
Ｅ−Ｓｕｃ−ＯＮＢ）の合成 1)2-(2-アミノエチル)アミノピリジン（ＰＡＥＡ）の合
成 2-クロルピリジン85gとエチレンジアミン450gとを、120
℃で８時間還流下に反応させた。反応終了後、反応液を
減圧濃縮し、クロロホルムにより目的物を抽出した。抽
出液からクロロホルムを留去し、残渣をベンゼン−石油
エ−テル（１：５）で再結晶して、ＰＡＥＡ86gを得た
（収率83.7％）。 融点：36〜40℃。 ＩＲνmax(neat)cm^-1：3500〜3100(NH)、3000〜2800(-C
H₂-)、780(ピリジン環)。¹ Ｈ−ＮＭＲ（60MHz、CDCl₃）δppm：1.64(bs,2H,N
H₂)、2.82〜3.58(m,4H,-CH₂CH₂-)、6.40〜8.24(m,4H,ピ
リジン環)。 ＭＳ：ｍ／ｚ 137（Ｍ⁺）。Example 1. 2-Pyridylaminoethylsuccinamic acid 5-
Norbornene-2,3-dicarboximide ester (PA
Synthesis of E-Suc-ONB) 1) Synthesis of 2- (2-aminoethyl) aminopyridine (PAEA) 2-Chloropyridine 85 g and ethylenediamine 450 g
The mixture was reacted under reflux at 8 ° C for 8 hours. After completion of the reaction, the reaction solution was concentrated under reduced pressure, and the target product was extracted with chloroform. Chloroform was distilled off from the extract, and the residue was recrystallized with benzene-petroleum ether (1: 5) to obtain 86 g of PAEA (yield 83.7%). Melting point: 36-40 ° C. IRνmax (neat) cm ^-1 : 3500-3100 (NH), 3000-2800 (-C
H ₂ -), 780 (pyridine ring). ¹ H-NMR (60 MHz, CDCl ₃ ) δppm: 1.64 (bs, 2H, N
_{H 2), 2.82~3.58 (m,} 4H, -CH 2 CH 2 -), 6.40~8.24 (m, 4H, pyridine ring). MS: m / z 137 (M ⁺ ).

【００２９】2)2-ピリジルアミノエチルスクシナミン酸
（ＰＡＥ−Ｓｕｃ−ＯＨ）の合成 上記1)で得たＰＡＥＡ10gと無水コハク酸7.3gとをエタ
ノ−ル300mlに溶解し、室温にて２時間撹拌下に反応さ
せた。反応終了後、析出晶を濾取し、乾燥させてＰＡＥ
−Ｓｕｃ−ＯＨ13.6gを得た（収率78.6％）。 融点：128〜130℃。 ＩＲνmax(KBr)cm^-1：3400〜3200(NH)、1700(カルボン
酸)、1660,1560(アミド)、780(ピリジン環)。¹ Ｈ−ＮＭＲ（270MHz、DMSO-d6）δppm：2.32(t,2H,Suc
-CH₂-,J=6.48Hz)、2.34(t,2H,Suc-CH₂-,J=6.48Hz)、3.2
0〜3.30(m,4H,AEA-CH₂-CH₂-)、6.43〜7.95(m,4H,ピリジ
ン環)。 ＭＳ：ｍ／ｚ 237（Ｍ⁺）。2) Synthesis of 2-pyridylaminoethylsuccinamic acid (PAE-Suc-OH) 10 g of PAEA obtained in 1) above and 7.3 g of succinic anhydride were dissolved in 300 ml of ethanol, and the solution was stirred at room temperature for 2 hours. The reaction was carried out with stirring. After the reaction was completed, the precipitated crystals were collected by filtration, dried and PAE.
13.6 g of -Suc-OH was obtained (yield 78.6%). Melting point: 128-130 ° C. IR (nu) max (KBr) cm < ^-1 >: 3400-3200 (NH), 1700 (carboxylic acid), 1660,1560 (amide), 780 (pyridine ring). ¹ H-NMR (270 MHz, DMSO-d6) δppm: 2.32 (t, 2H, Suc
-CH _2- , J = 6.48Hz), 2.34 (t, 2H, Suc-CH _2- , J = 6.48Hz), 3.2
0~3.30 (m, 4H, AEA- CH 2 -CH 2 -), 6.43~7.95 (m, 4H, pyridine ring). MS: m / z 237 (M ⁺ ).

【００３０】3)2-ピリジルアミノエチルスクシナミン酸
5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミドエステル
（ＰＡＥ−Ｓｕｃ−ＯＮＢ）の合成 上記2)で得たＰＡＥ−Ｓｕｃ−ＯＨ 2.37gと、N-ヒドロ
キシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド（ＨＯＮ
Ｂ）1.8gとを、ＤＭＦ50mlに溶解し、これに、2,2'-ジ
チオジピリジン（2ーＰＤＳ）2.2gと、トリフェニルホス
フィン2.6gを含むＤＭＦ溶液20mlを添加した後、室温で
４時間撹拌下に反応させた。反応終了後、ＤＭＦを減圧
留去し、得られた残渣を酢酸エチル−エ−テルで結晶化
して、下記化学式で示されるＰＡＥ−Ｓｕｃ−ＯＮＢ2.
5gを得た（収率62.5％）。3) 2-pyridylaminoethylsuccinamic acid
Synthesis of 5-norbornene-2,3-dicarboximide ester (PAE-Suc-ONB) 2.37 g of PAE-Suc-OH obtained in 2) above and N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboxyl Imide (HON
B) 1.8 g was dissolved in DMF 50 ml, and DMF solution 20 ml containing 2,2′-dithiodipyridine (2-PDS) 2.2 g and triphenylphosphine 2.6 g was added thereto, and then the mixture was stirred at room temperature for 4 hours. The reaction was allowed to stir for hours. After completion of the reaction, DMF was distilled off under reduced pressure and the obtained residue was crystallized with ethyl acetate-ether to give PAE-Suc-ONB2.
5 g was obtained (yield 62.5%).

【化１】 融点：122℃〜(dec.)。 ＩＲνmax(KBr)cm^-1：3300〜3100(NH)、3100〜2800(-CH
₂-)、1780(エステル)、1660,1600(アミド)、780(ピリジ
ン環)。¹ Ｈ−ＮＭＲ（60MHz、DMSO-d6）δppm：1.60(m,2H,N
B)、2.50〜2.88(m,4H,AEA-CH₂CH₂-)、3.33〜3.60(m,8H,
Suc-CH₂CH₂- and NB)、6.23(s,2H,NB)、6.50〜8.16(m,4
H,ピリジン環)。 ＭＳ：ｍ／ｚ 398（Ｍ⁺）。[Chemical 1] Melting point: 122 ° C- (dec.). IRνmax (KBr) cm ^-1 : 3300-3100 (NH), 3100-2800 (-CH
_2- ), 1780 (ester), 1660, 1600 (amide), 780 (pyridine ring). ¹ H-NMR (60 MHz, DMSO-d6) δppm: 1.60 (m, 2H, N
B), 2.50 ~ 2.88 (m, 4H, AEA-CH ₂ CH _2- ), 3.33 ~ 3.60 (m, 8H,
Suc-CH ₂ CH ₂ -and NB), 6.23 (s, 2H, NB), 6.50 ~ 8.16 (m, 4
H, pyridine ring). MS: m / z 398 (M ⁺ ).

【００３１】実施例２．N-(2-ピリジル)スクシナモイル
アミノプロピオン酸 コハク酸イミドエステル（Ｐｙ−
Ｓｕｃ−Ａｌａ−ＯＳｕ）の合成 1)2-ピリジルスクシナミン酸（Ｐｙ−Ｓｕｃ−ＯＨ）の
合成 2-アミノピリジン131gと無水コハク酸139gとを、トルエ
ン２ｌに懸濁させた後、90℃で１時間、更に室温で１時
間撹拌下に反応させた。反応終了後、析出晶を濾取し、
乾燥させてＰｙ−Ｓｕｃ−ＯＨ195gを得た（収率72.2
％）。 融点：171〜172℃。 ＩＲνmax(KBr)cm^-1：3300〜3000(NH)、1700(カルボン
酸)、1620,1580(アミド)、780(ピリジン環)。¹ Ｈ−ＮＭＲ（270MHz、DMSO-d6）δppm：1.84(dd,2H,-C
H₂-,J=6.21)、1.98(dd,2H,-CH₂-,J=6.21)、6.35〜7.62
(m,4H,ピリジン環)、9.72(s,1H,NH)、11.36(s,1H,カル
ボン酸)。 ＭＳ：ｍ／ｚ 194（Ｍ⁺）。Example 2. N- (2-pyridyl) succinamoylaminopropionic acid succinimide ester (Py-
Synthesis of Suc-Ala-OSu) 1) Synthesis of 2-pyridylsuccinamic acid (Py-Suc-OH) 131 g of 2-aminopyridine and 139 g of succinic anhydride were suspended in 2 l of toluene and then 90 ° C. The mixture was reacted for 1 hour at room temperature and then for 1 hour at room temperature with stirring. After the reaction was completed, the precipitated crystals were collected by filtration,
It was dried to obtain 195 g of Py-Suc-OH (yield 72.2
%). Melting point: 171-172 ° C. IR ν max (KBr) cm ⁻¹ : 3300 to 3000 (NH), 1700 (carboxylic acid), 1620,1580 (amide), 780 (pyridine ring). ¹ H-NMR (270 MHz, DMSO-d6) δppm: 1.84 (dd, 2H, -C
H _2- , J = 6.21), 1.98 (dd, 2H, -CH _2- , J = 6.21), 6.35 ~ 7.62
(m, 4H, pyridine ring), 9.72 (s, 1H, NH), 11.36 (s, 1H, carboxylic acid). MS: m / z 194 (M ⁺ ).

【００３２】2)N-(2-ピリジル)スクシナモイルアミノプ
ロピオン酸 メチルエステル（Ｐｙ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−
ＯＭｅ）の合成 上記1)で得たＰｙ−Ｓｕｃ−ＯＨ 9.7gとβ-アラニン
メチルエステル塩酸塩7.0gとをＤＭＦ250mlに溶解し、
これにトリエチルアミン7.0mlを加えた後、2-ＰＤＳ11.
0gとトリフェニルホスフィン13.1gを含むＤＭＦ溶液100
mlを加えて、室温で６時間撹拌下に反応させた。反応終
了後、反応液を減圧濃縮し、得られた残渣をクロロホル
ムで抽出、抽出液を飽和重ソウ水、飽和食塩水で順次洗
浄した。クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥
後、クロロホルムを留去し、得られた残渣を酢酸エチル
−エ−テルで再結晶して、Ｐｙ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−ＯＭ
ｅ11.7gを得た（収率84.0％）。 融点：135〜139℃。 ＩＲνmax(KBr)cm^-1：3400〜3100(NH)、3100〜2900(-CH
₂-)、1740(エステル）、1660,1580(アミド)、780(ピリ
ジン環)。¹ Ｈ−ＮＭＲ（270MHz、DMSO-d6）δppm：2.36〜2.51(m,
4H,Suc-CH₂CH₂-,J=7.02)、2.61(t,2H,Ala-CH₂CO,J=6.2
1)、3.26(t,2H,AlaN-CH₂-,J=6.21)、3.60(s,3H,CH₃)、
7.02〜8.28(m,5H,ピリジン環 and NH)、10.41(s,1H,N
H)。 ＭＳ：ｍ／ｚ 279（Ｍ⁺）。2) N- (2-pyridyl) succinamoylaminopropionic acid methyl ester (Py-Suc-Ala-
Synthesis of OMe) Py-Suc-OH (9.7 g) obtained in 1) and β-alanine
Dissolve 7.0 g of methyl ester hydrochloride in 250 ml of DMF,
After adding 7.0 ml of triethylamine to this, 2-PDS11.
DMF solution containing 0g and 13.1g triphenylphosphine 100
ml was added, and the mixture was reacted at room temperature for 6 hours with stirring. After completion of the reaction, the reaction solution was concentrated under reduced pressure, the obtained residue was extracted with chloroform, and the extract was washed successively with saturated aqueous sodium bicarbonate solution and saturated brine. The chloroform layer was dried over anhydrous sodium sulfate, chloroform was distilled off, and the obtained residue was recrystallized from ethyl acetate-ether to obtain Py-Suc-Ala-OM.
e11.7g was obtained (yield 84.0%). Melting point: 135-139 ° C. IRνmax (KBr) cm ^-1 : 3400-3100 (NH), 3100-2900 (-CH
_2- ), 1740 (ester), 1660,1580 (amide), 780 (pyridine ring). ¹ H-NMR (270 MHz, DMSO-d6) δppm: 2.36 to 2.51 (m,
4H, Suc-CH ₂ CH _2- , J = 7.02), 2.61 (t, 2H, Ala-CH ₂ CO, J = 6.2
1), 3.26 (t, 2H, AlaN-CH _2- , J = 6.21), 3.60 (s, 3H, CH ₃ ),
7.02 ~ 8.28 (m, 5H, pyridine ring and NH), 10.41 (s, 1H, N
H). MS: m / z 279 (M ⁺ ).

【００３３】3)N-(2-ピリジル)スクシナモイルアミノプ
ロピオン酸（Ｐｙ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−ＯＨ）の合成 上記2)で得たＰｙ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−ＯＭｅ 15.4gと水
酸化ナトリウム2.5gとを、水200mlとメタノ−ル100mlの
混合溶媒に溶解し、室温で８時間撹拌下に反応させた。
反応終了後、1N-塩酸62mlで中和し、液量が100mlになる
まで減圧濃縮した。析出した結晶を濾取し、水、アセト
ンで順次洗浄した後乾燥させてＰｙ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−
ＯＨ12.1gを得た（収率82.5％）。 融点：186〜189℃。 ＩＲνmax(KBr)cm^-1：3500〜3200(NH)、3100〜2900(-CH
₂-)、1700(カルボン酸)、1680〜1550(アミド)、800(ピ
リジン環)。¹ Ｈ−ＮＭＲ（270MHz、DMSO-d6）δppm：2.35〜2.42(m,
4H,Suc-CH₂CH-,J=7.02)、2.61(t,2H,Ala-CH₂CO,J=6.4
8)、3.24(dd,2H,AlaN-CH₂-J=6.48)、7.03〜8.08(m,5H,
ピリジン環 and NH)、10.42(s,1H,NH)。 ＭＳ：ｍ／ｚ 265（Ｍ⁺）。3) Synthesis of N- (2-pyridyl) succinamoylaminopropionic acid (Py-Suc-Ala-OH) 15.4 g of Py-Suc-Ala-OMe obtained in 2) above and 2.5 g of sodium hydroxide And were dissolved in a mixed solvent of 200 ml of water and 100 ml of methanol and reacted at room temperature for 8 hours with stirring.
After the reaction was completed, it was neutralized with 62 ml of 1N-hydrochloric acid and concentrated under reduced pressure until the liquid volume became 100 ml. The precipitated crystals were collected by filtration, washed successively with water and acetone and then dried to give Py-Suc-Ala-.
12.1 g of OH was obtained (yield 82.5%). Melting point: 186-189 ° C. IRνmax (KBr) cm ^-1 : 3500-3200 (NH), 3100-2900 (-CH
_2- ), 1700 (carboxylic acid), 1680 to 1550 (amide), 800 (pyridine ring). ¹ H-NMR (270 MHz, DMSO-d6) δppm: 2.35 to 2.42 (m,
4H, Suc-CH ₂ CH-, J = 7.02), 2.61 (t, 2H, Ala-CH ₂ CO, J = 6.4
8), 3.24 (dd, 2H, AlaN-CH ₂ -J = 6.48), 7.03 ~ 8.08 (m, 5H,
Pyridine ring and NH), 10.42 (s, 1H, NH). MS: m / z 265 (M ⁺ ).

【００３４】4)N-(2-ピリジル)スクシナモイルアミノプ
ロピオン酸 コハク酸イミドエステル（Ｐｙ−Ｓｕｃ−
Ａｌａ−ＯＳｕ）の合成 上記3)で得たＰｙ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−ＯＨ 2.7gとN-ヒ
ドロキシコハク酸イミド1.2gとを、ＤＭＦ50mlに溶解
し、これに、2-ＰＤＳ2.2gとトリフェニルホスフィン2.
6gを含むＤＭＦ溶液20mlを添加した後、室温で４時間撹
拌下に反応させた。反応終了後、反応液を減圧濃縮し、
得られた残渣を酢酸エチル−エ−テルで結晶化して、下
記化学式で示されるＰｙ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−ＯＳｕ3.4g
を得た（収率93.1％）。4) N- (2-pyridyl) succinamoylaminopropionic acid succinimide ester (Py-Suc-
Synthesis of Ala-OSu) 2.7 g of Py-Suc-Ala-OH obtained in 3) above and 1.2 g of N-hydroxysuccinimide were dissolved in 50 ml of DMF, and 2.2 g of 2-PDS and triphenylphosphine were dissolved therein. 2.
After adding 20 ml of a DMF solution containing 6 g, the mixture was reacted at room temperature for 4 hours with stirring. After the reaction was completed, the reaction solution was concentrated under reduced pressure,
The obtained residue was crystallized with ethyl acetate-ether to give 3.4 g of Py-Suc-Ala-OSu represented by the following chemical formula.
Was obtained (yield 93.1%).

【化２】 融点：172〜176℃。 ＩＲνmax(KBr)cm^-1：3400〜3200(NH)、3100〜2900(-CH
₂-)、1790(エステル)、1660,1580(アミド)、790(ピリジ
ン環)。¹ Ｈ−ＮＭＲ（270MHz、DMSO-d6）δppm：2.42〜2.59(m,
4H,Suc-CH₂CH₂-,J=7.02)、2.83(s,4H,Su)、2.83〜2.97
(m,2H,Ala-CH₂CO)、3.24〜3.42(dd,2H,AlaN-CH₂-,J=6.2
1)、7.00〜8.45(m,4H,ピリジン環)、10.47(b,1H,NH)。 ＭＳ：ｍ／ｚ 362（Ｍ⁺）。[Chemical 2] Melting point: 172-176 ° C. IRνmax (KBr) cm ^-1 : 3400-3200 (NH), 3100-2900 (-CH
_2- ), 1790 (ester), 1660, 1580 (amide), 790 (pyridine ring). ¹ H-NMR (270 MHz, DMSO-d6) δppm: 2.42 to 2.59 (m,
4H, Suc-CH ₂ CH _2- , J = 7.02), 2.83 (s, 4H, Su), 2.83 to 2.97
(m, 2H, Ala-CH ₂ CO), 3.24 to 3.42 (dd, 2H, AlaN-CH _2- , J = 6.2
1), 7.00 to 8.45 (m, 4H, pyridine ring), 10.47 (b, 1H, NH). MS: m / z 362 (M ⁺ ).

【００３５】実施例３．N-(2ーピリジル)ーβ-アラニルア
ミノプロピオン酸 5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシ
イミドエステル（Ｐｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＮＢ）の合
成 1)N-(2-ピリジル)-β-アラニン メチルエステル（Ｐｙ
−Ａｌａ−ＯＭｅ）の合成 2-アミノピリジン94gにアクリル酸メチル100mlと2,5-ジ
-tert-ブチルヒドロキノン1.1gを加え、撹拌下24時間還
流反応させた。反応終了後、反応液をベンゼン１ｌに注
ぎ、０℃で５時間放置した。析出した結晶を瀘去し、瀘
液を濃縮して得られた残渣をベンゼン−ヘキサン（１：
５）で結晶化して、Ｐｙ−Ａｌａ−ＯＭｅ64.5gを得た
（収率35.8％）。 融点：48〜49℃。 ＩＲνmax(KBr)cm^-1：3300〜3200(NH)、3100〜2800(-CH
₂-)、1760(エステル)、1610,1580(アミド)、780(ピリジ
ン環)。¹ Ｈ−ＮＭＲ（270MHz、DMSO-d6）δppm：2.57(t,2H,-CH
₂CO-,J=7.02)、3.48(dd,2H,NCH₂-,J=7.02)、3.60(s,3H,
CH₃)、6.44〜7.98(m,4H,ピリジン環)。 ＭＳ：ｍ／ｚ 180（Ｍ⁺）。Example 3. Synthesis of N- (2-pyridyl) -β-alanylaminopropionic acid 5-norbornene-2,3-dicarboximide ester (Py-Ala-Ala-ONB) 1) N- (2-pyridyl) -β-alanine Methyl ester (Py
Synthesis of 2-Ala-OMe) To 94 g of 2-aminopyridine, 100 ml of methyl acrylate and 2,5-di
1.1 g of -tert-butylhydroquinone was added, and the mixture was refluxed for 24 hours with stirring. After completion of the reaction, the reaction solution was poured into 1 liter of benzene and left at 0 ° C. for 5 hours. The precipitated crystals were filtered off, the filtrate was concentrated, and the resulting residue was benzene-hexane (1:
Crystallization was performed in 5) to obtain 64.5 g of Py-Ala-OMe (yield 35.8%). Melting point: 48-49 ° C. IRνmax (KBr) cm ^-1 : 3300-3200 (NH), 3100-2800 (-CH
_2- ), 1760 (ester), 1610,1580 (amide), 780 (pyridine ring). ¹ H-NMR (270 MHz, DMSO-d6) δppm: 2.57 (t, 2H, -CH
₂ CO-, J = 7.02), 3.48 (dd, 2H, NCH _2- , J = 7.02), 3.60 (s, 3H,
_{CH 3), 6.44~7.98 (m,} 4H, pyridine ring). MS: m / z 180 (M ⁺ ).

【００３６】2)N-(2-ピリジル)-β-アラニン（Ｐｙ−Ａ
ｌａ−ＯＨ）の合成 上記1)で得たＰｙ−Ａｌａ−０Ｍｅ 62.1gを水620mlに
懸濁し、撹拌下24時間還流反応させた。反応終了後、水
を減圧留去し、得られた残渣をエタノ−ルで再結晶し
て、Ｐｙ−Ａｌａ−ＯＨ43.1gを得た（収率75.2％）。 融点：136〜138℃。 ＩＲνmax(KBr)cm^-1：3300〜3000(NH)、3000〜2800(-CH
₂-)、1700(カルボン酸)、1640,1550(アミド)、760(ピリ
ジン環)。¹ Ｈ-ＮＭＲ（270MHz、DMSOーd6）δppm：2.50(t,2H,-CH₂
CO,J=6.75)、3.45(m,2H,NCH₂-,J=6.75)、6.44〜7.98(m,
4H,ピリジン環)。 ＭＳ：ｍ／ｚ 166（Ｍ⁺）。2) N- (2-pyridyl) -β-alanine (Py-A
Synthesis of la-OH) 62.1 g of Py-Ala-0Me obtained in 1) above was suspended in 620 ml of water and refluxed for 24 hours with stirring. After completion of the reaction, water was distilled off under reduced pressure, and the obtained residue was recrystallized with ethanol to obtain 43.1 g of Py-Ala-OH (yield 75.2%). Melting point: 136-138 ° C. IRνmax (KBr) cm ^-1 : 3300 ~ 3000 (NH), 3000 ~ 2800 (-CH
_2- ), 1700 (carboxylic acid), 1640,1550 (amide), 760 (pyridine ring). ¹ H-NMR (270 MHz, DMSO-d6) δppm: 2.50 (t, 2H, -CH ₂
CO, J = 6.75), 3.45 (m, 2H, NCH _2- , J = 6.75), 6.44 ~ 7.98 (m,
4H, pyridine ring). MS: m / z 166 (M ⁺ ).

【００３７】3)N-(2-ピリジル)-β-アラニルアミノプロ
ピオン酸 メチルエステル（Ｐｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｏ
Ｍｅ）の合成 ＤＭＦ60mlに、上記2)で得たＰｙ−Ａｌａ−ＯＨ 3.3g
とβ-アラニン メチルエステル塩酸塩 2.8g及びＤＣＣ
4.1gを加え、これに更にトリエチルアミン2.8mlを加え
て、室温で24時間撹拌下に反応させた。反応終了後、不
溶物を瀘去し、瀘液を減圧濃縮して得られた残渣をクロ
ロホルムで抽出し、抽出液を飽和重ソウ水、飽和食塩水
で順次洗浄した。クロロホルム層を無水硫酸ナトリウム
で乾燥後、クロロホルムを留去し、得られた残渣を酢酸
エチル−エ−テルで再結晶して、Ｐｙ−Ａｌａ−Ａｌａ
−ＯＭｅ4.3gを得た（収率86.5％）。 融点：68〜70℃。 ＩＲνmax(KBr)cm^-1：3400〜3200(NH)、3100〜2800(-CH
₂-)、1730(エステル)、1650,1600(アミド)、780(ピリジ
ン環)。¹ Ｈ−ＮＭＲ（60MHz、DMSO-d6）δppm：2.35〜2.69(m,4
H,2×Ala-CH₂CO)、3.30〜3.57(m,4H,2×AlaN-CH₂-)、3.
59(s,3H,CH₃)、6.33〜8.02(m,6H,ピリジン環 and 2×N
H)。 ＭＳ：ｍ／ｚ 251（Ｍ⁺）。3) N- (2-pyridyl) -β-alanylaminopropionic acid methyl ester (Py-Ala-Ala-O
Synthesis of Me) In 60 ml of DMF, 3.3 g of Py-Ala-OH obtained in 2) above.
And β-alanine methyl ester hydrochloride 2.8g and DCC
4.1 g was added, and triethylamine (2.8 ml) was further added thereto, and the mixture was reacted at room temperature for 24 hours with stirring. After completion of the reaction, the insoluble matter was filtered off, the filtrate was concentrated under reduced pressure, the resulting residue was extracted with chloroform, and the extract was washed successively with saturated sodium bicarbonate water and saturated saline. The chloroform layer was dried over anhydrous sodium sulfate, chloroform was distilled off, and the obtained residue was recrystallized from ethyl acetate-ether to obtain Py-Ala-Ala.
-OMe 4.3g was obtained (yield 86.5%). Melting point: 68-70 ° C. IRνmax (KBr) cm ^-1 : 3400-3200 (NH), 3100-2800 (-CH
_2- ), 1730 (ester), 1650, 1600 (amide), 780 (pyridine ring). ¹ H-NMR (60 MHz, DMSO-d6) δppm: 2.35 to 2.69 (m, 4
H, 2 × Ala-CH ₂ CO), 3.30 to 3.57 (m, 4H, 2 × AlaN-CH _2- ), 3.
59 (s, 3H, CH ₃ ), 6.33-8.02 (m, 6H, pyridine ring and 2 × N
H). MS: m / z 251 (M ⁺ ).

【００３８】4)N-(2-ピリジル)-β-アラニルアミノプロ
ピオン酸（Ｐｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＨ）の合成 上記3)で得たＰｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＭｅ 16.0gと水
酸化ナトリウム2.6gとを、水200mlとメタノ−ル100mlの
混合溶媒に溶解した後、室温で24時間撹拌下に反応させ
た。反応終了後、1N-塩酸64mlで中和し、減圧濃縮し
た。得られた残渣を水−エタノ−ル（１：５）で再結晶
して、Ｐｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＨ14.7gを得た（収率9
7.4％）。 融点：146〜149℃ ＩＲνmax(KBr)cm^-1：3300(NH)、3000〜2800(-CH₂-)、1
680(カルボン酸)、1630,1550(アミド)、760(ピリジン
環)。¹ Ｈ−ＮＭＲ（60MHz、DMSP-d6）δppm：2.20〜2.59(m,4
H,2×Ala-CH₂CO)、3.09〜3.64(m,4H,2×AlaN-CH₂-)、6.
38〜8.09(ピリジン環 and 2×NH)。 ＭＳ：ｍ／ｚ 237（Ｍ⁺）。4) Synthesis of N- (2-pyridyl) -β-alanylaminopropionic acid (Py-Ala-Ala-OH) 16.0 g of Py-Ala-Ala-OMe obtained in 3) above and sodium hydroxide 2.6 g was dissolved in a mixed solvent of 200 ml of water and 100 ml of methanol, and then reacted at room temperature with stirring for 24 hours. After completion of the reaction, the mixture was neutralized with 1N-hydrochloric acid 64 ml and concentrated under reduced pressure. The obtained residue was recrystallized from water-ethanol (1: 5) to obtain 14.7 g of Py-Ala-Ala-OH (yield 9
7.4%). Melting point: 146 to 149 ° C IRνmax (KBr) cm ^-1 : 3300 (NH), 3000 to 2800 (-CH _2- ), 1
680 (carboxylic acid), 1630,1550 (amide), 760 (pyridine ring). ¹ H-NMR (60 MHz, DMSP-d6) δppm: 2.20 to 2.59 (m, 4
H, 2 × Ala-CH ₂ CO), 3.09 to 3.64 (m, 4H, 2 × AlaN-CH _2- ), 6.
38-8.09 (pyridine ring and 2xNH). MS: m / z 237 (M ⁺ ).

【００３９】5)N-(2-ピリジル)-β-アラニルアミノプロ
ピオン酸 5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシミドエス
テル（Ｐｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−０ＮＢ）の合成 上記4)で得たＰｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＨ 3.6gとＨＯ
ＮＢ 2.7gとを、ＤＭＦ75mlに溶解し、次いで、これ
に、2-ＰＤＳ 3.3gとトリフェニルホスフィン3.9gを含
むＤＭＦ溶液30mlを加えた後、室温で６時間撹拌下に反
応させた。反応終了後、反応液を減圧濃縮し、得られた
残渣をシリカゲルクロマトグラフィ（溶出液；クロロホ
ルム−アセトン＝１：１の混合溶媒）にて精製し、下記
化学式で示されるＰｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＮＢ2.4gを
油状物質として得た（収率40.5％）。5) Synthesis of N- (2-pyridyl) -β-alanylaminopropionic acid 5-norbornene-2,3-dicarboximide ester (Py-Ala-Ala-0NB) Py obtained in 4) above -Ala-Ala-OH 3.6g and HO
2.7 g of NB was dissolved in 75 ml of DMF, and then 30 ml of a DMF solution containing 3.3 g of 2-PDS and 3.9 g of triphenylphosphine was added thereto, and the mixture was reacted at room temperature for 6 hours with stirring. After completion of the reaction, the reaction solution was concentrated under reduced pressure, the obtained residue was purified by silica gel chromatography (eluent; chloroform-acetone = 1: 1 mixed solvent), and Py-Ala-Ala-ONB2 represented by the following chemical formula: 0.4 g was obtained as an oily substance (yield 40.5%).

【化３】 ＩＲνmax(neat)cm^-1：3600〜3200(NH)、3100〜2900(-C
H₂-)、1780(エステル)、1700,1580(アミド)、760(ピリ
ジン環)。¹ Ｈ−ＮＭＲ（60MHz、DMSO-d6）δppm：1.29(s,2H,N
B)、2.41〜2.85(m,4H,2×Ala-CH₂CO)、3.09〜3.68(m,8
H,2×AlaNCH₂- and NB)、6.15(s,2H,NB)、6.44〜7.97
(m,6H,ピリジン環 and 2×NH)。 ＭＳ：ｍ／ｚ 398（Ｍ⁺）。[Chemical 3] IRνmax (neat) cm ^-1 : 3600-3200 (NH), 3100-2900 (-C
H ₂ -), 1780 (ester), 1700,1580 (amide), 760 (pyridine ring). ¹ H-NMR (60 MHz, DMSO-d6) δppm: 1.29 (s, 2H, N
B), 2.41 to 2.85 (m, 4H, 2 x Ala-CH ₂ CO), 3.09 to 3.68 (m, 8
H, 2 × AlaNCH ₂ -and NB), 6.15 (s, 2H, NB), 6.44 ~ 7.97
(m, 6H, pyridine ring and 2xNH). MS: m / z 398 (M ⁺ ).

【００４０】実施例４．アミノ酸の蛍光標識化 （蛍光標識化試液）上記実施例１で得られたＰＡＥ−Ｓ
ｕｃ−ＯＮＢを蒸留水に溶解して0.1M溶液としたものを
蛍光標識化試液とした。 （反応緩衝液）炭酸水素ナトリウムを蒸留水に溶解し、
0.2Mとしたものを反応緩衝液とした。 （アミノ酸試料）グリシン、アスパラギン酸、リジン及
びフェニルアラニンを夫々蒸留水に溶解し、夫々0.1Mと
したものをアミノ酸試料とした。 （操作法）蛍光標識化試液20μl、反応緩衝液70μl及び
所定のアミノ酸試料10μlを混合した後、37℃で３時間
反応させた。反応終了後、反応液10μlをとり、これに
蒸留水200μlを加えてよく混合し、その20μlを高速液
体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により分析した。尚、
ＨＰＬＣの測定条件は以下の通り。 ・装置：SHIMADSU LC-6A（(株)島津製作所製）。 ・カラム：Wakopak 5C18 (4.6 x 150 mm) （和光純薬
工業（株）製）。 ・溶離液Ａ：0.1M 酢酸アンモニウム緩衝液 (pH 4.0)。 ・溶離液Ｂ：30% アセトニトリルを含む0.1M 酢酸アン
モニウム緩衝液 (pH 4.0)。 ・グラジエント：Ａ→Ｂ 0→17分 （リニア
グラジエント） Ｂ 17→20分 ・溶離液流速：1.5ml/min。 ・カラム温度：55℃。 ・蛍光検出波長：励起波長314nm及び蛍光波長386nm。 （結果）ＨＰＬＣによる分析結果を図１に示す。尚、図
中、１はアミノ酸としてアスパラギン酸を含むアミノ酸
試料を用いて得られたＨＰＬＣによる分析結果を、２は
アミノ酸としてリジンを含むアミノ酸試料を用いて得ら
れたＨＰＬＣによる分析結果を、３はアミノ酸としてグ
リシンを含むアミノ酸試料を用いて得られたＨＰＬＣに
よる分析結果を、４はアミノ酸としてフェニルアラニン
を含むアミノ酸試料を用いて得られたＨＰＬＣによる分
析結果を、５は蒸留水を試料として得られたＨＰＬＣに
よる分析結果を夫々示す。図１から明らかな如く、何れ
のアミノ酸試料の場合も、10.8分にＰＡＥＡ−Ｓｕｃ−
ＯＮＢの分解物が溶出し、15分付近に未反応のＰＡＥＡ
−Ｓｕｃ−ＯＮＢが溶出していることが判る。一方、蛍
光標識化アスパラギン酸は10.2分に、蛍光標識化リジン
は10.3分に、蛍光標識化グリシンは9.8分に、蛍光標識
化リジンは10.3分に、蛍光標識化フェニルアラニンは1
7.8分に、夫々特異的なピークが得られることが判る。
以上の結果から、本発明の蛍光標識化方法を利用して、
アミノ酸組成分析が可能であることが判る。Example 4. Fluorescent labeling of amino acids (fluorescent labeling reagent) PAE-S obtained in Example 1 above
A 0.1 M solution of uc-ONB dissolved in distilled water was used as a fluorescent labeling reagent solution. (Reaction buffer) Sodium hydrogen carbonate is dissolved in distilled water,
The reaction buffer was 0.2M. (Amino acid sample) Glycine, aspartic acid, lysine, and phenylalanine were each dissolved in distilled water to make 0.1 M, which was used as an amino acid sample. (Procedure) 20 μl of the fluorescent labeling reagent solution, 70 μl of the reaction buffer and 10 μl of the predetermined amino acid sample were mixed and then reacted at 37 ° C. for 3 hours. After the reaction was completed, 10 μl of the reaction solution was taken, 200 μl of distilled water was added thereto and mixed well, and 20 μl thereof was analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC). still,
The HPLC measurement conditions are as follows. -Device: SHIMADSU LC-6A (manufactured by Shimadzu Corporation). -Column: Wakopak 5C18 (4.6 x 150 mm) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Eluent A: 0.1 M ammonium acetate buffer (pH 4.0). Eluent B: 0.1 M ammonium acetate buffer (pH 4.0) containing 30% acetonitrile.・ Gradient: A → B 0 → 17 minutes (linear gradient) B 17 → 20 minutes ・ Eluent flow rate: 1.5 ml / min. -Column temperature: 55 ° C. -Fluorescence detection wavelength: excitation wavelength 314 nm and fluorescence wavelength 386 nm. (Result) The analysis result by HPLC is shown in FIG. In the figure, 1 is an analysis result by HPLC obtained by using an amino acid sample containing aspartic acid as an amino acid, 2 is an analysis result by HPLC obtained by using an amino acid sample containing lysine as an amino acid, and 3 is HPLC analysis results obtained using an amino acid sample containing glycine as an amino acid, 4 were obtained by HPLC using an amino acid sample containing phenylalanine as an amino acid, and 5 was obtained using distilled water as a sample. The analysis results by HPLC are shown respectively. As is clear from FIG. 1, PAEA-Suc-at 10.8 minutes was obtained for all amino acid samples.
The unreacted PAEA was eluted around 15 minutes after the decomposition products of ONB were eluted.
It can be seen that -Suc-ONB is eluted. On the other hand, fluorescence-labeled aspartic acid at 10.2 minutes, fluorescence-labeled lysine at 10.3 minutes, fluorescence-labeled glycine at 9.8 minutes, fluorescence-labeled lysine at 10.3 minutes, fluorescence-labeled phenylalanine 1
It can be seen that a specific peak is obtained at 7.8 minutes.
From the above results, utilizing the fluorescent labeling method of the present invention,
It turns out that amino acid composition analysis is possible.

【００４１】実施例５．アンジオテンシンIIの蛍光標識
化及びその定量 （蛍光標識化試液）実施例４と同じ。 （反応緩衝液）実施例４と同じ。 （試料）ヒト・アンジオテンシンII（(株)ペプチド研究
所製）0.58mgを蒸留水に適宜溶解して、ヒト・アンジオ
テンシンIIを10、50、100、250及び500μg/ml含む溶液
を調製し、試料とした。 （操作法）蛍光標識化試液20μl、反応緩衝液60μl及び
所定の試料20μlを混合した後、37℃で３時間反応させ
た。反応終了後、反応液10μlをとり、これに蒸留水200
μlを加えてよく混合し、その100μlをＨＰＬＣにより
分析した。尚、ＨＰＬＣの測定条件は以下の通り。 ・装置：SHIMADSU LC-6A（(株)島津製作所製）。 ・カラム：Wakopak 5C18 (4.6 x 150 mm) （和光純薬
工業（株）製）。 ・溶離液Ａ：0.1M 酢酸アンモニウム緩衝液 (pH 4.0)。 ・溶離液Ｂ：60% アセトニトリルを含む0.1M 酢酸アン
モニウム緩衝液 (pH 4.0)。 ・グラジエント：Ａ 0→ 5分 Ａ→Ｂ 5→20分 （リニアグラジエント） Ｂ 20→25分 ・溶離液流速：1.5ml/min。 ・カラム温度：55℃。 ・蛍光検出波長：励起波長314nm及び蛍光波長386nm。 （結果）ＨＰＬＣによる分析結果を図２に、また、試料
中のヒト・アンジオテンシンII濃度と蛍光標識化ヒト・
アンジオテンシンIIの蛍光強度との関係を示すグラフを
図３に夫々示す。図２から、蛍光標識化ヒト・アンジオ
テンシンIIは15.9分に溶出することが判った。また、図
３より、試料中のヒト・アンジオテンシンII濃度と、該
試料を用いて得られる蛍光標識化ヒト・アンジオテンシ
ンIIの蛍光強度との関係を示すグラフは良好な直線性を
示すことが判る。以上の結果から、本発明化合物はヒト
・アンジオテンシンIIと定量的に反応し、本発明の方法
によりヒト・アンジオテンシンIIを蛍光標識化すること
により、試料中のヒト・アンジオテンシンII量を高感度
で定量することができることが判った。Example 5. Fluorescent labeling of angiotensin II and its quantification (fluorescent labeling reagent) The same as in Example 4. (Reaction buffer) The same as in Example 4. (Sample) 0.58 mg of human angiotensin II (manufactured by Peptide Institute Co., Ltd.) was appropriately dissolved in distilled water to prepare a solution containing 10, 50, 100, 250 and 500 μg / ml of human angiotensin II, and the sample was prepared. And (Procedure) 20 μl of the fluorescent labeling reagent solution, 60 μl of the reaction buffer and 20 μl of the predetermined sample were mixed and then reacted at 37 ° C. for 3 hours. After the reaction was completed, take 10 μl of the reaction solution and add 200 ml of distilled water to it.
μl was added and mixed well, 100 μl of which was analyzed by HPLC. The measurement conditions of HPLC are as follows. -Device: SHIMADSU LC-6A (manufactured by Shimadzu Corporation). -Column: Wakopak 5C18 (4.6 x 150 mm) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Eluent A: 0.1 M ammonium acetate buffer (pH 4.0). Eluent B: 0.1 M ammonium acetate buffer (pH 4.0) containing 60% acetonitrile.・ Gradient: A 0 → 5 minutes A → B 5 → 20 minutes (linear gradient) B 20 → 25 minutes ・ Eluent flow rate: 1.5 ml / min. -Column temperature: 55 ° C. -Fluorescence detection wavelength: excitation wavelength 314 nm and fluorescence wavelength 386 nm. (Results) The analysis results by HPLC are shown in FIG. 2, and the human angiotensin II concentration in the sample and the fluorescence-labeled human
Graphs showing the relationship with the fluorescence intensity of angiotensin II are shown in FIG. 3, respectively. From FIG. 2, it was found that the fluorescently labeled human angiotensin II elutes at 15.9 minutes. Further, it is understood from FIG. 3 that the graph showing the relationship between the concentration of human angiotensin II in the sample and the fluorescence intensity of the fluorescently labeled human angiotensin II obtained by using the sample shows good linearity. From the above results, the compound of the present invention quantitatively reacts with human angiotensin II, and by fluorescently labeling human angiotensin II by the method of the present invention, the amount of human angiotensin II in a sample can be quantified with high sensitivity. It turns out that you can do it.

【００４２】尚、ＰＡＥ−Ｓｕｃ−ＯＮＢの代りに、実
施例２で得られたＰｙ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−ＯＳｕ又は実
施例３で得られたＰｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＮＢを用い
てヒト・アンジオテンシンIIを蛍光標識化した場合も、
上記と同様の結果が得られた。このことから、これらを
蛍光標識化試薬として用いた場合も、試料中のヒト・ア
ンジオテンシンII量を高感度で定量することができるこ
とが判った。In place of PAE-Suc-ONB, Py-Suc-Ala-OSu obtained in Example 2 or Py-Ala-Ala-ONB obtained in Example 3 was used for human angiotensin II. When fluorescence is labeled,
The same result as above was obtained. From this, it was found that the amount of human angiotensin II in a sample can be quantified with high sensitivity even when these are used as fluorescent labeling reagents.

【００４３】[0043]

【発明の効果】以上述べた如く、本発明は、微量物質の
蛍光標識化に極めて有効なピリジルアミノ基を、水溶媒
等中に於いて１級アミノ基を有する化合物に容易に導入
し得る水溶性蛍光標識化試薬と、これを用いた１級アミ
ノ基を有する化合物へのピリジルアミノ基の導入方法を
提供するものであり、本発明によれば、従来の方法では
抗体、酵素、ホルモン、各種因子類、ハプテン等の生理
活性物質にこれらの活性を保持させたまま導入するのが
難しかったピリジルアミノ基を、穏和な条件下でこれら
の活性を保持させたまま導入することが可能となる点に
優れた効果を奏するものであり、斯業に貢献するところ
大なる発明である。INDUSTRIAL APPLICABILITY As described above, according to the present invention, a pyridylamino group, which is extremely effective for fluorescent labeling of trace substances, can be easily introduced into a compound having a primary amino group in a water solvent or the like. The present invention provides a fluorescent labeling reagent and a method for introducing a pyridylamino group into a compound having a primary amino group using the same. According to the present invention, conventional methods include antibodies, enzymes, hormones, and various factors. , Pyridylamino group, which was difficult to introduce into physiologically active substances such as hapten while retaining these activities, was excellent in that it was possible to introduce them under mild conditions while retaining these activities. It is an invention that produces effects and contributes to the industry.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】実施例４で得られた、本発明により蛍光標識化
された各種アミノ酸の高速液体クロマトグラフィ（ＨＰ
ＬＣ）による分析結果を示す。FIG. 1 is a high-performance liquid chromatography (HP) of various amino acids fluorescently labeled according to the present invention obtained in Example 4.
The analysis result by LC) is shown.

【図２】実施例５で得られた、本発明により蛍光標識化
されたヒト・アンジオテンシンIIのＨＰＬＣによる分析
結果を示す。FIG. 2 shows the results of HPLC analysis of the human angiotensin II fluorescently labeled according to the present invention obtained in Example 5.

【図３】実施例５で得られた、本発明化合物により蛍光
標識化されたヒト・アンジオテンシンIIの濃度（μg/m
l）と蛍光強度（10-3μV）との関係を示すグラフであ
る。FIG. 3 shows the concentration of human angiotensin II fluorescently labeled with the compound of the present invention (μg / m 2) obtained in Example 5.
3 is a graph showing the relationship between l) and fluorescence intensity (10-3 μV).

【符号の説明】[Explanation of symbols]

図１に於ける各符号は夫々以下のものを示す。 １ アミノ酸としてアスパラギン酸を含むアミノ酸試料
を用いて得られたＨＰＬＣによる分析結果。 ２ アミノ酸としてリジンを含むアミノ酸試料を用いて
得られたＨＰＬＣによる分析結果。 ３ アミノ酸としてグリシンを含むアミノ酸試料を用い
て得られたＨＰＬＣによる分析結果。 ４ アミノ酸としてフェニルアラニンを含むアミノ酸試
料を用いて得られたＨＰＬＣによる分析結果。 ５ 蒸留水を試料として得られたＨＰＬＣによる分析結
果。Each symbol in FIG. 1 indicates the following respectively. 1 HPLC analysis results obtained using an amino acid sample containing aspartic acid as an amino acid. 2 HPLC analysis results obtained using an amino acid sample containing lysine as the amino acid. 3 HPLC analysis results obtained using an amino acid sample containing glycine as the amino acid. 4 HPLC analysis results obtained using an amino acid sample containing phenylalanine as an amino acid. 5 HPLC analysis results obtained using distilled water as a sample.

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【手続補正書】[Procedure amendment]

【提出日】平成５年１月２９日[Submission date] January 29, 1993

【手続補正１】[Procedure Amendment 1]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】００１２[Correction target item name] 0012

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction content]

【００１２】即ち、先ず例えば2-クロロピリジン，2-ブ
ロモピリジン，3-クロロピリジン，3-ブロモピリジン等
の2-又は3-ハロピリジンと、該2-又は3-ハロピリジンに
対して10〜20倍モルのアルキレンジアミン（例えばエチ
レンジアミン，1,3-プロパンジアミン，1,4-ブタンジア
ミン等）とを80〜120℃で８〜 24時間撹拌下に反応させ
る。反応後、反応液を減圧濃縮し、目的物をクロロホル
ム、ジクロロエタン等で抽出し、溶媒留去後、残渣を、
適当な溶媒（例えばベンゼン−石油エ−テル混合溶媒
等）を用いて結晶化して、上記一般式(1a)で示されるア
ミノアルキルアミノピリジンを得る。次いで、該アミノ
アルキルアミノピリジンとこれに対して１〜３倍モルの
ジカルボン酸無水物（例えば無水コハク酸，無水グルタ
−ル酸，無水マレイン酸等）又は、ジカルボン酸（例え
ばコハク酸，グルタ−ル酸，マレイン酸等）の２分子間
脱水縮合物{[ＨＯＯＣ-(ＣＨ₂)n-ＣＯ]₂Ｏ}（式中ｎは
前記に同じ）とを、例えばメタノ−ル、エタノ−ル、イ
ソプロパノール等の溶媒中、０〜30℃で２〜６時間撹拌
下に反応させる。反応後、析出晶を濾取、乾燥させて、
上記一般式(1b)で示される化合物（以下、化合物(1b)と
略記する。）を得る。次いで、この化合物(1b)を、該化
合物に対して１〜３倍モルの活性エステル化剤［例えば
N-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド
（以下、ＨＯＮＢと略記する。）、N-ヒドロキシコハク
酸イミド（以下、ＨＯＳｕと略記する。）等］と、例え
ばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラヒドロフラ
ン（ＴＨＦ）、ジオキサン等の溶媒中、例えば、化合物
(1b)に対して１〜３倍モルのトリフェニルホスフィン
と、これと等モルのジスルフィド化合物［例えば2,2'-
ジチオジピリジン（以下、2-ＰＤＳと略記する。）、2,
2'-ジチオビス(5-ニトロピリジン)等］と、０〜40℃で
２〜８時間撹拌下に反応させる。反応後、反応液 を減
圧濃縮し、得られた残渣を、適当な溶媒（例えば酢酸エ
チル−ジエチルエ−テル混合溶媒等）を用いて結晶化す
る等により、一般式(1)で示される本発明の化合物が得
られる。尚、上記の反応に於いて、トリフェニルホスフ
ィンとジスルフィド化合物との組合せ試薬を用いる代り
に、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣ
Ｃ）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボ
ジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）等の縮合試薬を用いても、同
様に一般式(1)で示される本発明の化合物が得られる。That is, first, for example, 2- or 3-halopyridine such as 2-chloropyridine, 2-bromopyridine, 3-chloropyridine, 3-bromopyridine, etc. and 10 to 20 times as much as the 2- or 3-halopyridine. A mole of alkylenediamine (for example, ethylenediamine, 1,3-propanediamine, 1,4-butanediamine, etc.) is reacted at 80 to 120 ° C. for 8 to 24 hours with stirring. After the reaction, the reaction solution was concentrated under reduced pressure, the target product was extracted with chloroform, dichloroethane, etc., and the solvent was distilled off.
Crystallization is performed using an appropriate solvent (for example, a benzene-petroleum ether mixed solvent) to obtain the aminoalkylaminopyridine represented by the above general formula (1a). Then, the aminoalkylaminopyridine and a dicarboxylic acid anhydride (eg, succinic anhydride, glutaric anhydride, maleic anhydride, etc.) in 1 to 3 moles relative thereto or dicarboxylic acid (eg, succinic acid, glutaric anhydride). Intermolecular dehydration condensate {[HOOC- (CH ₂ ) n-CO] ₂ O} (wherein n is the same as above), for example, methanol, ethanol, The reaction is carried out in a solvent such as isopropanol at 0 to 30 ° C. for 2 to 6 hours with stirring. After the reaction, the precipitated crystals are collected by filtration and dried,
A compound represented by the above general formula (1b) (hereinafter abbreviated as compound (1b)) is obtained. Then, the compound (1b) is added to a 1- to 3-fold molar amount of the active esterifying agent [eg,
N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide (hereinafter abbreviated as HONB), N-hydroxysuccinimide (hereinafter abbreviated as HOSu), etc.] and, for example, dimethylformamide (DMF) , A solvent such as tetrahydrofuran (THF), dioxane, etc.
(1b) 1 to 3 times the molar amount of triphenylphosphine and an equimolar disulfide compound [eg 2,2'-
Dithiodipyridine (hereinafter abbreviated as 2-PDS), 2,
2′-dithiobis (5-nitropyridine) and the like] at 0-40 ° C. for 2-8 hours with stirring. After the reaction, the reaction solution is concentrated under reduced pressure, and the obtained residue is crystallized using an appropriate solvent (eg, ethyl acetate-diethyl ether mixed solvent) to give the compound of the present invention represented by the general formula (1). The compound of In the above reaction, instead of using a combination reagent of triphenylphosphine and a disulfide compound, for example, dicyclohexylcarbodiimide (DC
C), 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (WSC) and the like can also be used to obtain the compound of the present invention represented by the general formula (1).

【手続補正２】[Procedure Amendment 2]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】００１８[Correction target item name] 0018

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction content]

【００１８】即ち、例えば2-アミノピリジン，3-アミノ
ピリジン等のアミノピリジンと、該アミノピリジンに対
して１〜３倍モルのアクリル酸エステル（例えばアクリ
ル酸メチル，アクリル酸エチル等）とを、例えば2,5-ジ
-tert-ブチルヒドロキノン等の重合禁止剤の存在下、60
〜100℃で12〜36時間撹拌下に反応させる。反応後、反
応液を、例えばベンゼン、トルエン 等の溶媒中に注入
して、析出した結晶を瀘去し、溶媒を留去して得られた
残渣を、適当な溶媒（例えばベンゼン−ヘキサン混合溶
媒等）から再結晶することにより、上記一般式(3a)で示
される化合物を得る。次いで、これを、常法により鹸化
してエステルを加水分解すれば、一般式(3b)で示される
化合物（以下、化合物(3b)と略記する。）が得られる。That is, for example, aminopyridine such as 2-aminopyridine and 3-aminopyridine, and 1 to 3 moles of acrylic acid ester (for example, methyl acrylate, ethyl acrylate, etc.) relative to the aminopyridine, For example 2,5-di
In the presence of a polymerization inhibitor such as -tert-butylhydroquinone, 60
React with stirring at ~ 100 ° C for 12-36 hours. After the reaction, the reaction solution is poured into a solvent such as benzene or toluene, the precipitated crystals are filtered off, and the solvent is distilled off to obtain a residue, which is then mixed with a suitable solvent (for example, a benzene-hexane mixed solvent). And the like) to obtain the compound represented by the above general formula (3a). Next, this is saponified by a conventional method to hydrolyze the ester to obtain a compound represented by the general formula (3b) (hereinafter, abbreviated as compound (3b)).

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/533 8310−2Ｊ // Ｃ０７Ｋ 1/06 8318−4Ｈ (72)発明者 田中 巧 尼崎市高田町６番１号 和光純薬工業株式 会社大阪研究所内─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁵ Identification code Internal reference number FI Technical indication location G01N 33/533 8310-2J // C07K 1/06 8318-4H (72) Inventor Takumi Tanaka Amagasaki City Takadacho 6-1 Wako Pure Chemical Industries Ltd. Osaka Research Institute

Claims (5)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】下記一般式(1)、(2)又は(3) Ｒ1ー(ＣＨ₂)m-ＮＨ-ＣＯ-(ＣＨ₂)n-ＣＯＯ-Ｒ2 (1) Ｒ1ーＣＯ-(ＣＨ₂)n-ＣＯ-ＮＨ-(ＣＨ₂)m-ＣＯＯ-Ｒ2 (2) Ｒ1-(ＣＨ₂)m-ＣＯ-ＮＨ-(ＣＨ₂)n-ＣＯＯ-Ｒ2 (3) （式中、Ｒ1は2-ピリジルアミノ基又は3-ピリジルアミ
ノ基を表わし、Ｒ2は活性エステル化剤に起因する基を
表わし、ｍ及びｎは夫々独立して１〜４の整数を表わ
す。）で示される化合物の内の何れかと、１級アミノ基
を有する化合物とを水又は極性有機溶媒、或はこれらの
混合溶媒中で反応させることを特徴とする、１級アミノ
基を有する化合物の蛍光標識化方法。1. A following general formula (1), (2) or (3) R1 chromatography _{(CH 2) m-NH-} CO- (CH 2) n-COO-R2 (1) R1 chromatography CO- (CH ₂ ) n-CO-NH- (CH ₂ ) m-COO-R2 (2) R1- (CH ₂ ) m-CO-NH- (CH ₂ ) n-COO-R2 (3) (wherein R 1 is 2 -Pyridylamino group or 3-pyridylamino group, R2 represents a group derived from an active esterifying agent, and m and n each independently represent an integer of 1 to 4). A method for fluorescently labeling a compound having a primary amino group, which comprises reacting the compound having a primary amino group in water, a polar organic solvent, or a mixed solvent thereof. 【請求項２】１級アミノ基を有する化合物が、アミノ
酸、ペプチド、蛋白質、糖ペプチド又は糖蛋白質であ
る、請求項１に記載の蛍光標識化方法。2. The fluorescent labeling method according to claim 1, wherein the compound having a primary amino group is an amino acid, a peptide, a protein, a glycopeptide or a glycoprotein. 【請求項３】下記一般式(1) Ｒ1ー(ＣＨ₂)m-ＮＨ-ＣＯ-(ＣＨ₂)n-ＣＯＯ-Ｒ2 (1) で示される化合物。（式中、Ｒ1、Ｒ2、ｍ及びｎは前記
に同じ。）3. A following general formula (1) R1 chromatography _{(CH 2) m-NH-} CO- (CH 2) n-COO-R2 compound of formula (1). (In the formula, R1, R2, m and n are the same as above.) 【請求項４】下記一般式(2) Ｒ1ーＣＯ-(ＣＨ₂)n-ＣＯ-ＮＨ-(ＣＨ₂)m-ＣＯＯ-Ｒ2 (2) で示される化合物。（式中、Ｒ1、Ｒ2、ｍ及びｎは前記
に同じ。）4. A compound represented by the following general formula (2) R 1 —CO— (CH ₂ ) n—CO—NH— (CH ₂ ) m—COO—R 2 (2). (In the formula, R1, R2, m and n are the same as above.) 【請求項５】下記一般式(3) Ｒ1-(ＣＨ₂)m-ＣＯ-ＮＨ-(ＣＨ₂)n-ＣＯＯ-Ｒ2 (3) で示される化合物。（式中、Ｒ1、Ｒ2、ｍ及びｎは前記
に同じ。）5. The following general formula _{(3) R1- (CH 2)} m-CO-NH- (CH 2) n-COO-R2 compound represented by (3). (In the formula, R1, R2, m and n are the same as above.)