JPH06167492A - 変異癌遺伝子の検出測定方法 - Google Patents
変異癌遺伝子の検出測定方法Info
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- JPH06167492A JPH06167492A JP4345280A JP34528092A JPH06167492A JP H06167492 A JPH06167492 A JP H06167492A JP 4345280 A JP4345280 A JP 4345280A JP 34528092 A JP34528092 A JP 34528092A JP H06167492 A JPH06167492 A JP H06167492A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】本発明は、目的変異癌遺伝子の変異位置を３’
末端とし且つ該３’末端に正常塩基に対応するものとは
異なる３種の塩基を有する各プライマーの混合プライマ
ーと、変異癌遺伝子を挟み得る任意の他のプライマーと
を用いてポリメラーゼ連鎖反応法を実施して、変異癌遺
伝子を変異位置特異的に増幅させ、これを検出する喀痰
試料中の変異癌遺伝子の検出測定方法を提供する。 【効果】本発明方法は、喀痰を用いて実施でき、癌の診
断に有用である。
末端とし且つ該３’末端に正常塩基に対応するものとは
異なる３種の塩基を有する各プライマーの混合プライマ
ーと、変異癌遺伝子を挟み得る任意の他のプライマーと
を用いてポリメラーゼ連鎖反応法を実施して、変異癌遺
伝子を変異位置特異的に増幅させ、これを検出する喀痰
試料中の変異癌遺伝子の検出測定方法を提供する。 【効果】本発明方法は、喀痰を用いて実施でき、癌の診
断に有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、癌の診断に有用な変異
癌遺伝子の新規な検出測定方法、更に詳細には被検試料
として喀痰を用いて実施できる改良された上記変異癌遺
伝子の検出測定方法に関する。
癌遺伝子の新規な検出測定方法、更に詳細には被検試料
として喀痰を用いて実施できる改良された上記変異癌遺
伝子の検出測定方法に関する。
【０００２】
【関連技術】癌遺伝子の活性化の機構のひとつとして、
癌遺伝子の点突然変異が知られており、その検出が癌の
診断上着目されている。例えば、肺癌の発生や進展に関
与する癌遺伝子として、ｐ５３〔Science (Wash.D.C.),
246, 491-494 (1989)〕、ＲＢ〔同、241, 353-357 (19
88) 〕、ｃ−ｍｙｃ〔Oncogene, 2, 607-611 (198
8)〕、ｒａｓ〔N.Engl.J.Med., 317, 929-935 (1987)〕
等が知られており、各種癌細胞株や臨床手術標本を被検
試料として、それら変異遺伝子の測定がなされている。
癌遺伝子の点突然変異が知られており、その検出が癌の
診断上着目されている。例えば、肺癌の発生や進展に関
与する癌遺伝子として、ｐ５３〔Science (Wash.D.C.),
246, 491-494 (1989)〕、ＲＢ〔同、241, 353-357 (19
88) 〕、ｃ−ｍｙｃ〔Oncogene, 2, 607-611 (198
8)〕、ｒａｓ〔N.Engl.J.Med., 317, 929-935 (1987)〕
等が知られており、各種癌細胞株や臨床手術標本を被検
試料として、それら変異遺伝子の測定がなされている。
【０００３】一方、ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase
Chain Reaction:以下「ＰＣＲ」という）法によるイン
ビトロ（in vitro）での遺伝子の増幅は、基礎技術のみ
ならず臨床診断や法医学領域において大きな威力を発揮
している〔蛋白質 核酸 酵素、臨時増刊号「遺伝子増
幅ＰＣＲ法」、１９９０年１２月１０日発行等参照〕。
その原理は、分析したい目的の遺伝子領域を挟む２種の
プライマーを用いて、（１）ＤＮＡの熱変成ステップ、
（２）プライマーとのアニーリングステップ及び（３）
プラマーの伸長反応ステップからなる反応サイクルを繰
り返すことにより、該プライマーによって挟まれたＤＮ
Ａ断片を特異的に増幅することからなっている。
Chain Reaction:以下「ＰＣＲ」という）法によるイン
ビトロ（in vitro）での遺伝子の増幅は、基礎技術のみ
ならず臨床診断や法医学領域において大きな威力を発揮
している〔蛋白質 核酸 酵素、臨時増刊号「遺伝子増
幅ＰＣＲ法」、１９９０年１２月１０日発行等参照〕。
その原理は、分析したい目的の遺伝子領域を挟む２種の
プライマーを用いて、（１）ＤＮＡの熱変成ステップ、
（２）プライマーとのアニーリングステップ及び（３）
プラマーの伸長反応ステップからなる反応サイクルを繰
り返すことにより、該プライマーによって挟まれたＤＮ
Ａ断片を特異的に増幅することからなっている。
【０００４】上記点突然変異の検出においても、該ＰＣ
Ｒ法の利用が知られている〔Ann.Clin.Res.,18, 297-30
3 (1986); Science (Wash.D.C.), 256, 102-105 (199
2); Cancer Res.,50, 7184-7189 (1990); Nucleic Acid
Res.,17, 8093-8099 (1988)等参照〕。
Ｒ法の利用が知られている〔Ann.Clin.Res.,18, 297-30
3 (1986); Science (Wash.D.C.), 256, 102-105 (199
2); Cancer Res.,50, 7184-7189 (1990); Nucleic Acid
Res.,17, 8093-8099 (1988)等参照〕。
【０００５】しかしながら、肺癌は世界において最も共
通の致死的な癌のひとつでもあるものの、肺癌における
上記変異癌遺伝子の簡便なスクリーニング法は、今だ満
足すべきものがなく、斯界でその開発が望まれている。
通の致死的な癌のひとつでもあるものの、肺癌における
上記変異癌遺伝子の簡便なスクリーニング法は、今だ満
足すべきものがなく、斯界でその開発が望まれている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】肺癌における変異癌遺
伝子のスクリーニング法に満足すべきものがない第１の
理由は、その被検試料の制限にある。生体から採取した
癌細胞を含む組織試料は、癌細胞が多量に含まれている
故に極めて好適な被検試料である。例えば、Ｋ−ｒａｓ
遺伝子の場合は、肺癌細胞の１０〜３０％がその変異遺
伝子を有していることから、かかる細胞組織を被検試料
として用いる場合は、従前より公知の変異癌遺伝子に低
感度の各種方法であっても、その採用により目的変異遺
伝子の測定は可能である。しかしながら、かかる方法は
生体組織試料を被検試料とすることに基づく不利益が避
けられないのは述べるまでもなく、肺癌のスクリーニン
グ法とすることはできない。
伝子のスクリーニング法に満足すべきものがない第１の
理由は、その被検試料の制限にある。生体から採取した
癌細胞を含む組織試料は、癌細胞が多量に含まれている
故に極めて好適な被検試料である。例えば、Ｋ−ｒａｓ
遺伝子の場合は、肺癌細胞の１０〜３０％がその変異遺
伝子を有していることから、かかる細胞組織を被検試料
として用いる場合は、従前より公知の変異癌遺伝子に低
感度の各種方法であっても、その採用により目的変異遺
伝子の測定は可能である。しかしながら、かかる方法は
生体組織試料を被検試料とすることに基づく不利益が避
けられないのは述べるまでもなく、肺癌のスクリーニン
グ法とすることはできない。
【０００７】一方、喀痰を被検試料とする細胞診は、肺
癌の集団検診に大きな評価を与えている。かかる喀痰に
含まれる癌細胞は極めて少ないものの、顕微鏡下の目視
観察による細胞診では、かかる喀痰を被検試料とするこ
とが可能である。しかるに、上記変異癌遺伝子の検出の
ための被検試料としてみれば、喀痰に含まれる核酸自体
が微量であることは勿論のこと、その中の検出すべき目
的の変異癌遺伝子は、圧倒的多量の正常癌遺伝子と共存
していることから、その特異的検出は非常に困難であ
り、課題が残されている。
癌の集団検診に大きな評価を与えている。かかる喀痰に
含まれる癌細胞は極めて少ないものの、顕微鏡下の目視
観察による細胞診では、かかる喀痰を被検試料とするこ
とが可能である。しかるに、上記変異癌遺伝子の検出の
ための被検試料としてみれば、喀痰に含まれる核酸自体
が微量であることは勿論のこと、その中の検出すべき目
的の変異癌遺伝子は、圧倒的多量の正常癌遺伝子と共存
していることから、その特異的検出は非常に困難であ
り、課題が残されている。
【０００８】本発明の目的は之等の課題を解決すること
にあり、被検試料として喀痰を採用することのできる変
異癌遺伝子の新規な検出測定方法を提供することにあ
り、またこれによって肺癌の簡便なスクリーニング法を
提供することにある。
にあり、被検試料として喀痰を採用することのできる変
異癌遺伝子の新規な検出測定方法を提供することにあ
り、またこれによって肺癌の簡便なスクリーニング法を
提供することにある。
【０００９】
【課題を解決する手段】本発明によれば、喀痰を被検試
料として、該被験試料中に含まれる変異癌遺伝子を変異
位置特異的に検出する変異癌遺伝子の検出測定方法であ
って、目的変異癌遺伝子の変異位置を３’末端とし且つ
該３’末端に正常塩基に対応するものとは異なる３種の
塩基を有する各プライマーの混合プライマーと、変異癌
遺伝子を挟み得る任意の他のプライマーとを用いてポリ
メラーゼ連鎖反応法を実施して、変異癌遺伝子を変異位
置特異的に増幅させることを特徴とする変異癌遺伝子の
検出測定方法が提供される。
料として、該被験試料中に含まれる変異癌遺伝子を変異
位置特異的に検出する変異癌遺伝子の検出測定方法であ
って、目的変異癌遺伝子の変異位置を３’末端とし且つ
該３’末端に正常塩基に対応するものとは異なる３種の
塩基を有する各プライマーの混合プライマーと、変異癌
遺伝子を挟み得る任意の他のプライマーとを用いてポリ
メラーゼ連鎖反応法を実施して、変異癌遺伝子を変異位
置特異的に増幅させることを特徴とする変異癌遺伝子の
検出測定方法が提供される。
【００１０】本発明によればまた、上記変異癌遺伝子が
Ｋ−ｒａｓ遺伝子であり、変異位置がコドン１２、１３
又は６１のいずれかの位置である上記の検出測定方法が
提供される。
Ｋ−ｒａｓ遺伝子であり、変異位置がコドン１２、１３
又は６１のいずれかの位置である上記の検出測定方法が
提供される。
【００１１】更に本発明によれば、上記変異位置がコド
ン１２の２番目のヌクレオチドである上記の検出測定方
法が提供される。
ン１２の２番目のヌクレオチドである上記の検出測定方
法が提供される。
【００１２】以下、本発明方法につき詳述すれば、本発
明において被検試料として用いる喀痰は、前記の通りそ
れ自体公知であり、かかる被検試料からのＤＮＡの調整
もまた常法に従い行なうことができる。例えば、被検試
料は酵素処理され、常法によりＤＮＡを抽出することに
より調整することができる〔J.Clinical Microbiology,
29(9),1985-1190(1991) 等〕。
明において被検試料として用いる喀痰は、前記の通りそ
れ自体公知であり、かかる被検試料からのＤＮＡの調整
もまた常法に従い行なうことができる。例えば、被検試
料は酵素処理され、常法によりＤＮＡを抽出することに
より調整することができる〔J.Clinical Microbiology,
29(9),1985-1190(1991) 等〕。
【００１３】本発明により検出測定される変異癌遺伝子
としては、特に限定はなく、例えば前記した肺癌との関
与において知られている各種の癌遺伝子の点突然変異を
含むことができる。より具体的には、Ｋ−ｒａｓ遺伝子
のコドン１２、１３又は６１のいずれかの位置、好まし
くはコドン１２の２番目のヌクレオチドが変異したＫ−
ｒａｓ遺伝子を挙げることができる。
としては、特に限定はなく、例えば前記した肺癌との関
与において知られている各種の癌遺伝子の点突然変異を
含むことができる。より具体的には、Ｋ−ｒａｓ遺伝子
のコドン１２、１３又は６１のいずれかの位置、好まし
くはコドン１２の２番目のヌクレオチドが変異したＫ−
ｒａｓ遺伝子を挙げることができる。
【００１４】本発明における変異癌遺伝子の検出測定
は、具体的には前記したＰＣＲ法を利用して行なわれ
る。該ＰＣＲ法はそれ自体公知であり、本発明において
も従来から公知のそれらと同様の条件をそのまま採用す
ることができる〔Science, 230,1350-1354(1985)等〕。
は、具体的には前記したＰＣＲ法を利用して行なわれ
る。該ＰＣＲ法はそれ自体公知であり、本発明において
も従来から公知のそれらと同様の条件をそのまま採用す
ることができる〔Science, 230,1350-1354(1985)等〕。
【００１５】本発明方法における最も特徴的な点は、変
異位置特異的な検出を行なうことにあり、これは該ＰＣ
Ｒ法において、一方のプライマーとして目的とする変異
癌遺伝子の変異位置を３’末端とし且つ該３’末端に正
常塩基に対応するものとは異なる３種の塩基を有する各
プライマーの混合プライマーを利用することにより実施
することができる。かくして、検出測定対象である特定
位置に変異を有する変異癌遺伝子のみが特異的に増幅さ
れ、これが検出可能となる。この本発明に特有の混合プ
ライマーを用いるＰＣＲ法を以下「ＭＴＯ−ＰＣＲ」と
略記する。
異位置特異的な検出を行なうことにあり、これは該ＰＣ
Ｒ法において、一方のプライマーとして目的とする変異
癌遺伝子の変異位置を３’末端とし且つ該３’末端に正
常塩基に対応するものとは異なる３種の塩基を有する各
プライマーの混合プライマーを利用することにより実施
することができる。かくして、検出測定対象である特定
位置に変異を有する変異癌遺伝子のみが特異的に増幅さ
れ、これが検出可能となる。この本発明に特有の混合プ
ライマーを用いるＰＣＲ法を以下「ＭＴＯ−ＰＣＲ」と
略記する。
【００１６】このＭＴＯ−ＰＣＲは、被検試料として喀
痰を用いると共に上記特定の混合プライマーを利用する
ことを除いて、他は従来のＰＣＲ法と同様にして実施す
ることができる。上記変異癌遺伝子に好適なプライマー
の一般的な選択条件や、ＰＣＲ法の各ステップ、即ち
（１）ＤＮＡの熱変成ステップ、（２）プライマーとの
アニーリングステップ及び（３）プライマーの伸長反応
ステップからなる反応サイクルの操作条件等も、殊に限
定なく従来のＰＣＲ法で採用されている通常の条件を採
用することができる。
痰を用いると共に上記特定の混合プライマーを利用する
ことを除いて、他は従来のＰＣＲ法と同様にして実施す
ることができる。上記変異癌遺伝子に好適なプライマー
の一般的な選択条件や、ＰＣＲ法の各ステップ、即ち
（１）ＤＮＡの熱変成ステップ、（２）プライマーとの
アニーリングステップ及び（３）プライマーの伸長反応
ステップからなる反応サイクルの操作条件等も、殊に限
定なく従来のＰＣＲ法で採用されている通常の条件を採
用することができる。
【００１７】かくして、目的のＤＮＡ断片を位置特異的
に増幅させることができる。この位置特異的に増幅され
たＤＮＡ断片の検出は、従来よりよく知られている一般
的方法に従って実施することができる。その例としては
例えば例えばエチジュームブロマイド（ＥＢ）染色法
〔Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd Ed.(19
89) Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Laboratory
Press.〕による検出等を好ましいものとして例示するこ
とができる、該方法によれば、ハイブリダイゼーション
を必須のステップとせず、時間や手間が省かれ、また放
射性標識が不要であることから、本発明の目的であるス
クリーニング法に極めて好適である。
に増幅させることができる。この位置特異的に増幅され
たＤＮＡ断片の検出は、従来よりよく知られている一般
的方法に従って実施することができる。その例としては
例えば例えばエチジュームブロマイド（ＥＢ）染色法
〔Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd Ed.(19
89) Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Laboratory
Press.〕による検出等を好ましいものとして例示するこ
とができる、該方法によれば、ハイブリダイゼーション
を必須のステップとせず、時間や手間が省かれ、また放
射性標識が不要であることから、本発明の目的であるス
クリーニング法に極めて好適である。
【００１８】尚、本発明においては大量の被検試料をス
クリーニングすることを前提に作業の効率化が図られて
いるものであるが、例えば、本発明において使用される
必須の３種の混合プライマーを個々の変異プライマーと
して使用する場合にも、目的の変異癌遺伝子の変異を位
置及び塩基特異的に増幅させ得、これを同様に検出する
ことができる。本発明においては、かかる特定の態様か
らなる変異癌遺伝子の測定方法をも提供するものであ
る。
クリーニングすることを前提に作業の効率化が図られて
いるものであるが、例えば、本発明において使用される
必須の３種の混合プライマーを個々の変異プライマーと
して使用する場合にも、目的の変異癌遺伝子の変異を位
置及び塩基特異的に増幅させ得、これを同様に検出する
ことができる。本発明においては、かかる特定の態様か
らなる変異癌遺伝子の測定方法をも提供するものであ
る。
【００１９】
【実施例】以下、参考例及び実施例を挙げて本発明を更
に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるもの
ではない。
に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるもの
ではない。
【００２０】参考例１ ５名の肺癌患者からの凍結した喀痰の各々約１ｍｌを、
２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ
ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＥＤＴＡ、５４％シュクロー
ス、２％ＳＤＳ及び１ｍｇ／ｍｌプロテイネースＫ（Pr
oteinase K）を含む溶液１ｍｌに加え、３７℃で１０時
間インキュベートした。ＤＮＡを、フェノール：クロロ
フォルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で
３回抽出後、エタノール沈殿させ、１０ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．５）及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＴＥ緩
衝液の３００μｌに溶解し、これをサンプルとした。
２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ
ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＥＤＴＡ、５４％シュクロー
ス、２％ＳＤＳ及び１ｍｇ／ｍｌプロテイネースＫ（Pr
oteinase K）を含む溶液１ｍｌに加え、３７℃で１０時
間インキュベートした。ＤＮＡを、フェノール：クロロ
フォルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で
３回抽出後、エタノール沈殿させ、１０ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．５）及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＴＥ緩
衝液の３００μｌに溶解し、これをサンプルとした。
【００２１】また、大腸癌及び正常末梢白血球からＤＮ
Ａを常法〔Cancer Res.,50, 7184-7189 (1990)）に従い
調製し、対照サンプルとした。
Ａを常法〔Cancer Res.,50, 7184-7189 (1990)）に従い
調製し、対照サンプルとした。
【００２２】参考例２ ＰＣＲに使用したプライマー及びハイブリダイゼーショ
ン用プローブを、Ｋ−ｒａｓ遺伝子とそのコード領域に
おける位置対比において図１に示す。
ン用プローブを、Ｋ−ｒａｓ遺伝子とそのコード領域に
おける位置対比において図１に示す。
【００２３】図１において、□はＫ−ｒａｓ遺伝子エク
ソン１(exon 1)のオープンリーディングフレーム（open
reading frame) を示し、その中の斜線部はそのコドン
１２(codon 12)を示す。また、矢印はプライマー方向性
を、星印は変異させた塩基（但しプローブ(probe) の場
合はＫ−ｒａｓコドン１２の２番目の塩基に星印が付し
てある）をそれぞれ示す。
ソン１(exon 1)のオープンリーディングフレーム（open
reading frame) を示し、その中の斜線部はそのコドン
１２(codon 12)を示す。また、矢印はプライマー方向性
を、星印は変異させた塩基（但しプローブ(probe) の場
合はＫ−ｒａｓコドン１２の２番目の塩基に星印が付し
てある）をそれぞれ示す。
【００２４】ＭＴＯプライマー(MTO primer)のセット１
(set 1) は、Ｋ−ｒａｓコドン１２（GGT-Gly)の１番目
のヌクレオチドの変異（TGT-Gys,CGT-Arg 及びAGT-Ser)
を、同セット２(set 2) は、同２番目のヌクレオチドの
変異（GAT-Asp,GTT-Val 及びGCT-Ala)をそれぞれ３’末
端に有するものである。
(set 1) は、Ｋ−ｒａｓコドン１２（GGT-Gly)の１番目
のヌクレオチドの変異（TGT-Gys,CGT-Arg 及びAGT-Ser)
を、同セット２(set 2) は、同２番目のヌクレオチドの
変異（GAT-Asp,GTT-Val 及びGCT-Ala)をそれぞれ３’末
端に有するものである。
【００２５】これらプライマー及びプローブは、ＤＮＡ
合成装置（ABI DNA synthesizer model 392: Applied B
iosystem) を用いて製造した。
合成装置（ABI DNA synthesizer model 392: Applied B
iosystem) を用いて製造した。
【００２６】実施例１ （１）ＭＴＯ−ＰＣＲ ＭＴＯプライマーのセット１又はセット２のいずれか
と、Ｋ１２０４Ｌプライマーとを用いて、前記サンプル
ＤＮＡをテンプレートとするＰＣＲを、ＤＭＳＯを使用
しない以外はベーカーらの方法〔Cancer Res.,50, 7177
-7722 (1990)〕に従って、９５℃の０．５分、５９℃な
いし６０℃の２分及び７０℃の２分の３２サイクルにて
行なった。
と、Ｋ１２０４Ｌプライマーとを用いて、前記サンプル
ＤＮＡをテンプレートとするＰＣＲを、ＤＭＳＯを使用
しない以外はベーカーらの方法〔Cancer Res.,50, 7177
-7722 (1990)〕に従って、９５℃の０．５分、５９℃な
いし６０℃の２分及び７０℃の２分の３２サイクルにて
行なった。
【００２７】また、対照としてＫ−ｒａｓ遺伝子エクソ
ン１のオープンリーディングフレームを挟むＫ１２０３
とＫ１２０４のプライマーを用いるＰＣＲを、上記ベー
カーらの方法に従い、９５℃の０．５分、５３℃の２分
及び７０℃の２分の４０サイクルにて行なった。
ン１のオープンリーディングフレームを挟むＫ１２０３
とＫ１２０４のプライマーを用いるＰＣＲを、上記ベー
カーらの方法に従い、９５℃の０．５分、５３℃の２分
及び７０℃の２分の４０サイクルにて行なった。
【００２８】ＰＣＲ産物を、エチジュームブロマイド
（ＥＢ）染色法〔Molecular Cloning(1989):前述〕に従
い、その５μｌを１ｍｇ／ｍｌＥＢ含有２％アガロース
ゲル中電気泳動することにより検出した。
（ＥＢ）染色法〔Molecular Cloning(1989):前述〕に従
い、その５μｌを１ｍｇ／ｍｌＥＢ含有２％アガロース
ゲル中電気泳動することにより検出した。
【００２９】上記セット２のプライマーを用いた時の結
果を図２に示す。
果を図２に示す。
【００３０】図２中、レーン１は被検試料として大腸癌
サンプル（陽性対照）を、レーン２は同正常白血球サン
プル（陰性対照）を、レーン３〜７は同喀痰サンプルを
それぞれ用いた結果を示している。
サンプル（陽性対照）を、レーン２は同正常白血球サン
プル（陰性対照）を、レーン３〜７は同喀痰サンプルを
それぞれ用いた結果を示している。
【００３１】図２より、コドン１２の変異（GGT からGA
T への変異）を持つことが知られている大腸癌からのサ
ンプル及び喀痰サンプルの１例（レーン４）において、
増幅されたＤＮＡのバンドが検出されたことが判る。
尚、他の４例の喀痰サンプル及び正常白血球サンプルに
おいては、いずれもバンドは認められなかった。
T への変異）を持つことが知られている大腸癌からのサ
ンプル及び喀痰サンプルの１例（レーン４）において、
増幅されたＤＮＡのバンドが検出されたことが判る。
尚、他の４例の喀痰サンプル及び正常白血球サンプルに
おいては、いずれもバンドは認められなかった。
【００３２】（２）サザンブロット分析 常法〔J.Molecular Biology,98,503-517(1975)〕に従
い、５μｌのＰＣＲ産物を電気泳動後、メンブランに移
し、図１に示すそれぞれのプローブとハイブリダイゼー
ションを行なった。
い、５μｌのＰＣＲ産物を電気泳動後、メンブランに移
し、図１に示すそれぞれのプローブとハイブリダイゼー
ションを行なった。
【００３３】図１に示すプローブ（ＮはＡ、Ｔ又はＣ）
のそれぞれは、32Ｐ−ＡＴＰとＴ４キナーゼによりラベ
ルされ、５×１０8 dpm の比活性を有している。
のそれぞれは、32Ｐ−ＡＴＰとＴ４キナーゼによりラベ
ルされ、５×１０8 dpm の比活性を有している。
【００３４】上記ＰＣＲ産物とのハイブリダイゼーショ
ンは、５０℃で６時間を要して行なった。ハイブリダイ
ゼーション後、メンブラン(Biodyne transmembrane,Pal
l)を６×ＳＳＣ（４５０ｍＭ ＮａＣｌ、１８ｍＭクエ
ン酸ナトリウム及び１ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．
２）中、５０℃で５分間洗浄し、−８０℃でＸ線フィル
ム（Kodak)に増感紙を用い感光させた。
ンは、５０℃で６時間を要して行なった。ハイブリダイ
ゼーション後、メンブラン(Biodyne transmembrane,Pal
l)を６×ＳＳＣ（４５０ｍＭ ＮａＣｌ、１８ｍＭクエ
ン酸ナトリウム及び１ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．
２）中、５０℃で５分間洗浄し、−８０℃でＸ線フィル
ム（Kodak)に増感紙を用い感光させた。
【００３５】その結果、コドン１２のVal （ＮがＴ）又
はAla （ＮがＣ）への変異を含むプローブにおいては、
全てのＰＣＲ産物においてシグナルが検出されなかっ
た。
はAla （ＮがＣ）への変異を含むプローブにおいては、
全てのＰＣＲ産物においてシグナルが検出されなかっ
た。
【００３６】Asp への変異を含むプローブ（ＮがＡ）を
使用した時の結果を図３に示す。
使用した時の結果を図３に示す。
【００３７】図３において、（Ａ）はＫ１２０３及びＫ
１２０４をプライマーとするＰＣＲ産物の結果（コント
ロール）を、（Ｂ）は前記セット２及びＫ１２０４Ｌの
プライマーを用いたＭＴＯ−ＰＣＲの産物の結果（本発
明）をそれぞれ示し、レーン１は大腸癌サンプルを、レ
ーン２は白血球サンプルを、レーン３〜７は図２のレー
ン３〜７に対応する喀痰サンプルをそれぞれ示す。
１２０４をプライマーとするＰＣＲ産物の結果（コント
ロール）を、（Ｂ）は前記セット２及びＫ１２０４Ｌの
プライマーを用いたＭＴＯ−ＰＣＲの産物の結果（本発
明）をそれぞれ示し、レーン１は大腸癌サンプルを、レ
ーン２は白血球サンプルを、レーン３〜７は図２のレー
ン３〜７に対応する喀痰サンプルをそれぞれ示す。
【００３８】図３より、本発明にかかる（Ｂ）の結果か
ら、陽性対照（レーン１）に加えて、１例の喀痰サンプ
ルにおいて、強いシグナルが検出されたことが判る。ま
た、Ｋ１２０３及びＫ１２０４をプライマーとしたＰＣ
Ｒによれば、陽性対照においてのみシグナルが検出さ
れ、喀痰サンプルの変異遺伝子を検出し得ないことが判
る。
ら、陽性対照（レーン１）に加えて、１例の喀痰サンプ
ルにおいて、強いシグナルが検出されたことが判る。ま
た、Ｋ１２０３及びＫ１２０４をプライマーとしたＰＣ
Ｒによれば、陽性対照においてのみシグナルが検出さ
れ、喀痰サンプルの変異遺伝子を検出し得ないことが判
る。
【００３９】（３）ＰＣＲ産物のサブクローニングとＤ
ＮＡ配列決定／コロニーハイブリダイゼーション ＰＣＲ産物をニシショーらの方法〔Science (Wash.D.
C.), 253, 665-669 (1991)〕に従い、プラスミドベクタ
ー(pBluescriptSK,Stratagene)にクローニングし、少な
くとも５０サブクローンのプールからのＤＮＡを、ＤＮ
Ａ配列決定のテンプレートとして用いた。ＤＮＡ配列は
ニグロらの方法〔Nature (Lond.), 342, 705-708 (198
9) 〕に従い決定した。
ＮＡ配列決定／コロニーハイブリダイゼーション ＰＣＲ産物をニシショーらの方法〔Science (Wash.D.
C.), 253, 665-669 (1991)〕に従い、プラスミドベクタ
ー(pBluescriptSK,Stratagene)にクローニングし、少な
くとも５０サブクローンのプールからのＤＮＡを、ＤＮ
Ａ配列決定のテンプレートとして用いた。ＤＮＡ配列は
ニグロらの方法〔Nature (Lond.), 342, 705-708 (198
9) 〕に従い決定した。
【００４０】その結果、前記において陽性を示した喀痰
サンプルについて、Ｋ１２０３及びＫ１２０４をプライ
マーとするＰＣＲ産物には、いかなる変異配列も検出す
ることができなかった。一方、上記本発明方法の採用に
よれば、同一サンプルについて、コドン１２のAsp への
変異配列が特異的に検出され、変異遺伝子に相当するプ
ライマーのみがＤＮＡ増幅に使用され、該ＤＮＡ配列の
みが特異的に増幅されることが判った。
サンプルについて、Ｋ１２０３及びＫ１２０４をプライ
マーとするＰＣＲ産物には、いかなる変異配列も検出す
ることができなかった。一方、上記本発明方法の採用に
よれば、同一サンプルについて、コドン１２のAsp への
変異配列が特異的に検出され、変異遺伝子に相当するプ
ライマーのみがＤＮＡ増幅に使用され、該ＤＮＡ配列の
みが特異的に増幅されることが判った。
【００４１】また、陽性を示したサンプルのＫ１２０３
及びＫ１２０４をプライマーとするＰＣＲ産物につき、
コドン１２のAsp への変異を含むプローブ（ＮがＡ）を
用いて、常法に従いコロニーハイブリダイゼ々ーション
〔Proc Natl.Acad.Sci.USA,72,3961-3965(1975)〕を行
なった。
及びＫ１２０４をプライマーとするＰＣＲ産物につき、
コドン１２のAsp への変異を含むプローブ（ＮがＡ）を
用いて、常法に従いコロニーハイブリダイゼ々ーション
〔Proc Natl.Acad.Sci.USA,72,3961-3965(1975)〕を行
なった。
【００４２】その結果、喀痰サンプルについては、約１
０００コロニーのトランスフォーマントにつき全てが陰
性を示し、変異遺伝子を検出し得なかった。このこと
は、喀痰サンプルにおいては、正常Ｋ−ｒａｓ配列に比
較して、変異Ｋ−ｒａｓ配列が１０００分の１以下しか
存在せず、変異に特異的かつ高感度な測定が必要である
ことを示す。尚、大腸癌サンプルについては、約半数が
陽性を示した。
０００コロニーのトランスフォーマントにつき全てが陰
性を示し、変異遺伝子を検出し得なかった。このこと
は、喀痰サンプルにおいては、正常Ｋ−ｒａｓ配列に比
較して、変異Ｋ−ｒａｓ配列が１０００分の１以下しか
存在せず、変異に特異的かつ高感度な測定が必要である
ことを示す。尚、大腸癌サンプルについては、約半数が
陽性を示した。
【００４３】以上より、本発明方法によれば、サンプル
中の大多数の正常配列に対して極僅かにしか混在してい
ない変異配列を、特異的に増幅させて、これを感度よく
検出できることが明らかであり、従って本発明方法は、
喀痰をサンプルとする変異癌遺伝子の検出測定に、極め
て優れた方法であることが判る。
中の大多数の正常配列に対して極僅かにしか混在してい
ない変異配列を、特異的に増幅させて、これを感度よく
検出できることが明らかであり、従って本発明方法は、
喀痰をサンプルとする変異癌遺伝子の検出測定に、極め
て優れた方法であることが判る。
【図１】本発明方法に用いるプライマー及びハイブリダ
イゼーション用プローブの塩基配列と、之等のＫ−ｒａ
ｓ遺伝子（そのコード領域）との位置対比に示す。
イゼーション用プローブの塩基配列と、之等のＫ−ｒａ
ｓ遺伝子（そのコード領域）との位置対比に示す。
【図２】実施例１の（１）に記載のＭＴＯ−ＰＣＲ法に
おいて、セット２のプライマーを用いた時の結果を示す
図面に代わる写真である。
おいて、セット２のプライマーを用いた時の結果を示す
図面に代わる写真である。
【図３】実施例１の（２）に記載のサザンブロット分析
において、Asp への変異を含むプローブを用いた時の結
果を示す図面に代わる写真である。
において、Asp への変異を含むプローブを用いた時の結
果を示す図面に代わる写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 7823−4Ｂ
Claims (3)
- 【請求項１】 喀痰を被検試料として、該被験試料中に
含まれる変異癌遺伝子を変異位置特異的に検出する変異
癌遺伝子の検出測定方法であって、目的変異癌遺伝子の
変異位置を３’末端とし且つ該３’末端に正常塩基に対
応するものとは異なる３種の塩基を有する各プライマー
の混合プライマーと、変異癌遺伝子を挟み得る任意の他
のプライマーとを用いてポリメラーゼ連鎖反応法を実施
して、変異癌遺伝子を変異位置特異的に増幅させること
を特徴とする変異癌遺伝子の検出測定方法。 - 【請求項２】 変異癌遺伝子がＫ−ｒａｓ遺伝子であ
り、変異位置がコドン１２、１３又は６１のいずれかの
位置である請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 変異位置がコドン１２の２番目のヌクレ
オチドである請求項２に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4345280A JPH06167492A (ja) | 1992-11-30 | 1992-11-30 | 変異癌遺伝子の検出測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4345280A JPH06167492A (ja) | 1992-11-30 | 1992-11-30 | 変異癌遺伝子の検出測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06167492A true JPH06167492A (ja) | 1994-06-14 |
Family
ID=18375526
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4345280A Pending JPH06167492A (ja) | 1992-11-30 | 1992-11-30 | 変異癌遺伝子の検出測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06167492A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002024905A1 (fr) * | 2000-09-19 | 2002-03-28 | Nobuyuki Hamajima | Procede permettant de determiner la mutation genetique |
| EP1394272A1 (en) * | 1995-11-17 | 2004-03-03 | Nordiag As | Method for detection of Ki-ras mutations |
| CN102796811A (zh) * | 2011-05-26 | 2012-11-28 | 上海赛安生物医药科技有限公司 | 检测kras突变的试剂及方法 |
-
1992
- 1992-11-30 JP JP4345280A patent/JPH06167492A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1394272A1 (en) * | 1995-11-17 | 2004-03-03 | Nordiag As | Method for detection of Ki-ras mutations |
| WO2002024905A1 (fr) * | 2000-09-19 | 2002-03-28 | Nobuyuki Hamajima | Procede permettant de determiner la mutation genetique |
| CN102796811A (zh) * | 2011-05-26 | 2012-11-28 | 上海赛安生物医药科技有限公司 | 检测kras突变的试剂及方法 |
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