JPH06167492A - 変異癌遺伝子の検出測定方法 - Google Patents
変異癌遺伝子の検出測定方法Info
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- JPH06167492A JPH06167492A JP4345280A JP34528092A JPH06167492A JP H06167492 A JPH06167492 A JP H06167492A JP 4345280 A JP4345280 A JP 4345280A JP 34528092 A JP34528092 A JP 34528092A JP H06167492 A JPH06167492 A JP H06167492A
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- oncogene
- primer
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Abstract
(57)【要約】
【構成】本発明は、目的変異癌遺伝子の変異位置を3’
末端とし且つ該3’末端に正常塩基に対応するものとは
異なる3種の塩基を有する各プライマーの混合プライマ
ーと、変異癌遺伝子を挟み得る任意の他のプライマーと
を用いてポリメラーゼ連鎖反応法を実施して、変異癌遺
伝子を変異位置特異的に増幅させ、これを検出する喀痰
試料中の変異癌遺伝子の検出測定方法を提供する。 【効果】本発明方法は、喀痰を用いて実施でき、癌の診
断に有用である。
末端とし且つ該3’末端に正常塩基に対応するものとは
異なる3種の塩基を有する各プライマーの混合プライマ
ーと、変異癌遺伝子を挟み得る任意の他のプライマーと
を用いてポリメラーゼ連鎖反応法を実施して、変異癌遺
伝子を変異位置特異的に増幅させ、これを検出する喀痰
試料中の変異癌遺伝子の検出測定方法を提供する。 【効果】本発明方法は、喀痰を用いて実施でき、癌の診
断に有用である。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、癌の診断に有用な変異
癌遺伝子の新規な検出測定方法、更に詳細には被検試料
として喀痰を用いて実施できる改良された上記変異癌遺
伝子の検出測定方法に関する。
癌遺伝子の新規な検出測定方法、更に詳細には被検試料
として喀痰を用いて実施できる改良された上記変異癌遺
伝子の検出測定方法に関する。
【0002】
【関連技術】癌遺伝子の活性化の機構のひとつとして、
癌遺伝子の点突然変異が知られており、その検出が癌の
診断上着目されている。例えば、肺癌の発生や進展に関
与する癌遺伝子として、p53〔Science (Wash.D.C.),
246, 491-494 (1989)〕、RB〔同、241, 353-357 (19
88) 〕、c−myc〔Oncogene, 2, 607-611 (198
8)〕、ras〔N.Engl.J.Med., 317, 929-935 (1987)〕
等が知られており、各種癌細胞株や臨床手術標本を被検
試料として、それら変異遺伝子の測定がなされている。
癌遺伝子の点突然変異が知られており、その検出が癌の
診断上着目されている。例えば、肺癌の発生や進展に関
与する癌遺伝子として、p53〔Science (Wash.D.C.),
246, 491-494 (1989)〕、RB〔同、241, 353-357 (19
88) 〕、c−myc〔Oncogene, 2, 607-611 (198
8)〕、ras〔N.Engl.J.Med., 317, 929-935 (1987)〕
等が知られており、各種癌細胞株や臨床手術標本を被検
試料として、それら変異遺伝子の測定がなされている。
【0003】一方、ポリメラーゼ連鎖反応(Polymerase
Chain Reaction:以下「PCR」という)法によるイン
ビトロ(in vitro)での遺伝子の増幅は、基礎技術のみ
ならず臨床診断や法医学領域において大きな威力を発揮
している〔蛋白質 核酸 酵素、臨時増刊号「遺伝子増
幅PCR法」、1990年12月10日発行等参照〕。
その原理は、分析したい目的の遺伝子領域を挟む2種の
プライマーを用いて、(1)DNAの熱変成ステップ、
(2)プライマーとのアニーリングステップ及び(3)
プラマーの伸長反応ステップからなる反応サイクルを繰
り返すことにより、該プライマーによって挟まれたDN
A断片を特異的に増幅することからなっている。
Chain Reaction:以下「PCR」という)法によるイン
ビトロ(in vitro)での遺伝子の増幅は、基礎技術のみ
ならず臨床診断や法医学領域において大きな威力を発揮
している〔蛋白質 核酸 酵素、臨時増刊号「遺伝子増
幅PCR法」、1990年12月10日発行等参照〕。
その原理は、分析したい目的の遺伝子領域を挟む2種の
プライマーを用いて、(1)DNAの熱変成ステップ、
(2)プライマーとのアニーリングステップ及び(3)
プラマーの伸長反応ステップからなる反応サイクルを繰
り返すことにより、該プライマーによって挟まれたDN
A断片を特異的に増幅することからなっている。
【0004】上記点突然変異の検出においても、該PC
R法の利用が知られている〔Ann.Clin.Res.,18, 297-30
3 (1986); Science (Wash.D.C.), 256, 102-105 (199
2); Cancer Res.,50, 7184-7189 (1990); Nucleic Acid
Res.,17, 8093-8099 (1988)等参照〕。
R法の利用が知られている〔Ann.Clin.Res.,18, 297-30
3 (1986); Science (Wash.D.C.), 256, 102-105 (199
2); Cancer Res.,50, 7184-7189 (1990); Nucleic Acid
Res.,17, 8093-8099 (1988)等参照〕。
【0005】しかしながら、肺癌は世界において最も共
通の致死的な癌のひとつでもあるものの、肺癌における
上記変異癌遺伝子の簡便なスクリーニング法は、今だ満
足すべきものがなく、斯界でその開発が望まれている。
通の致死的な癌のひとつでもあるものの、肺癌における
上記変異癌遺伝子の簡便なスクリーニング法は、今だ満
足すべきものがなく、斯界でその開発が望まれている。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】肺癌における変異癌遺
伝子のスクリーニング法に満足すべきものがない第1の
理由は、その被検試料の制限にある。生体から採取した
癌細胞を含む組織試料は、癌細胞が多量に含まれている
故に極めて好適な被検試料である。例えば、K−ras
遺伝子の場合は、肺癌細胞の10〜30%がその変異遺
伝子を有していることから、かかる細胞組織を被検試料
として用いる場合は、従前より公知の変異癌遺伝子に低
感度の各種方法であっても、その採用により目的変異遺
伝子の測定は可能である。しかしながら、かかる方法は
生体組織試料を被検試料とすることに基づく不利益が避
けられないのは述べるまでもなく、肺癌のスクリーニン
グ法とすることはできない。
伝子のスクリーニング法に満足すべきものがない第1の
理由は、その被検試料の制限にある。生体から採取した
癌細胞を含む組織試料は、癌細胞が多量に含まれている
故に極めて好適な被検試料である。例えば、K−ras
遺伝子の場合は、肺癌細胞の10〜30%がその変異遺
伝子を有していることから、かかる細胞組織を被検試料
として用いる場合は、従前より公知の変異癌遺伝子に低
感度の各種方法であっても、その採用により目的変異遺
伝子の測定は可能である。しかしながら、かかる方法は
生体組織試料を被検試料とすることに基づく不利益が避
けられないのは述べるまでもなく、肺癌のスクリーニン
グ法とすることはできない。
【0007】一方、喀痰を被検試料とする細胞診は、肺
癌の集団検診に大きな評価を与えている。かかる喀痰に
含まれる癌細胞は極めて少ないものの、顕微鏡下の目視
観察による細胞診では、かかる喀痰を被検試料とするこ
とが可能である。しかるに、上記変異癌遺伝子の検出の
ための被検試料としてみれば、喀痰に含まれる核酸自体
が微量であることは勿論のこと、その中の検出すべき目
的の変異癌遺伝子は、圧倒的多量の正常癌遺伝子と共存
していることから、その特異的検出は非常に困難であ
り、課題が残されている。
癌の集団検診に大きな評価を与えている。かかる喀痰に
含まれる癌細胞は極めて少ないものの、顕微鏡下の目視
観察による細胞診では、かかる喀痰を被検試料とするこ
とが可能である。しかるに、上記変異癌遺伝子の検出の
ための被検試料としてみれば、喀痰に含まれる核酸自体
が微量であることは勿論のこと、その中の検出すべき目
的の変異癌遺伝子は、圧倒的多量の正常癌遺伝子と共存
していることから、その特異的検出は非常に困難であ
り、課題が残されている。
【0008】本発明の目的は之等の課題を解決すること
にあり、被検試料として喀痰を採用することのできる変
異癌遺伝子の新規な検出測定方法を提供することにあ
り、またこれによって肺癌の簡便なスクリーニング法を
提供することにある。
にあり、被検試料として喀痰を採用することのできる変
異癌遺伝子の新規な検出測定方法を提供することにあ
り、またこれによって肺癌の簡便なスクリーニング法を
提供することにある。
【0009】
【課題を解決する手段】本発明によれば、喀痰を被検試
料として、該被験試料中に含まれる変異癌遺伝子を変異
位置特異的に検出する変異癌遺伝子の検出測定方法であ
って、目的変異癌遺伝子の変異位置を3’末端とし且つ
該3’末端に正常塩基に対応するものとは異なる3種の
塩基を有する各プライマーの混合プライマーと、変異癌
遺伝子を挟み得る任意の他のプライマーとを用いてポリ
メラーゼ連鎖反応法を実施して、変異癌遺伝子を変異位
置特異的に増幅させることを特徴とする変異癌遺伝子の
検出測定方法が提供される。
料として、該被験試料中に含まれる変異癌遺伝子を変異
位置特異的に検出する変異癌遺伝子の検出測定方法であ
って、目的変異癌遺伝子の変異位置を3’末端とし且つ
該3’末端に正常塩基に対応するものとは異なる3種の
塩基を有する各プライマーの混合プライマーと、変異癌
遺伝子を挟み得る任意の他のプライマーとを用いてポリ
メラーゼ連鎖反応法を実施して、変異癌遺伝子を変異位
置特異的に増幅させることを特徴とする変異癌遺伝子の
検出測定方法が提供される。
【0010】本発明によればまた、上記変異癌遺伝子が
K−ras遺伝子であり、変異位置がコドン12、13
又は61のいずれかの位置である上記の検出測定方法が
提供される。
K−ras遺伝子であり、変異位置がコドン12、13
又は61のいずれかの位置である上記の検出測定方法が
提供される。
【0011】更に本発明によれば、上記変異位置がコド
ン12の2番目のヌクレオチドである上記の検出測定方
法が提供される。
ン12の2番目のヌクレオチドである上記の検出測定方
法が提供される。
【0012】以下、本発明方法につき詳述すれば、本発
明において被検試料として用いる喀痰は、前記の通りそ
れ自体公知であり、かかる被検試料からのDNAの調整
もまた常法に従い行なうことができる。例えば、被検試
料は酵素処理され、常法によりDNAを抽出することに
より調整することができる〔J.Clinical Microbiology,
29(9),1985-1190(1991) 等〕。
明において被検試料として用いる喀痰は、前記の通りそ
れ自体公知であり、かかる被検試料からのDNAの調整
もまた常法に従い行なうことができる。例えば、被検試
料は酵素処理され、常法によりDNAを抽出することに
より調整することができる〔J.Clinical Microbiology,
29(9),1985-1190(1991) 等〕。
【0013】本発明により検出測定される変異癌遺伝子
としては、特に限定はなく、例えば前記した肺癌との関
与において知られている各種の癌遺伝子の点突然変異を
含むことができる。より具体的には、K−ras遺伝子
のコドン12、13又は61のいずれかの位置、好まし
くはコドン12の2番目のヌクレオチドが変異したK−
ras遺伝子を挙げることができる。
としては、特に限定はなく、例えば前記した肺癌との関
与において知られている各種の癌遺伝子の点突然変異を
含むことができる。より具体的には、K−ras遺伝子
のコドン12、13又は61のいずれかの位置、好まし
くはコドン12の2番目のヌクレオチドが変異したK−
ras遺伝子を挙げることができる。
【0014】本発明における変異癌遺伝子の検出測定
は、具体的には前記したPCR法を利用して行なわれ
る。該PCR法はそれ自体公知であり、本発明において
も従来から公知のそれらと同様の条件をそのまま採用す
ることができる〔Science, 230,1350-1354(1985)等〕。
は、具体的には前記したPCR法を利用して行なわれ
る。該PCR法はそれ自体公知であり、本発明において
も従来から公知のそれらと同様の条件をそのまま採用す
ることができる〔Science, 230,1350-1354(1985)等〕。
【0015】本発明方法における最も特徴的な点は、変
異位置特異的な検出を行なうことにあり、これは該PC
R法において、一方のプライマーとして目的とする変異
癌遺伝子の変異位置を3’末端とし且つ該3’末端に正
常塩基に対応するものとは異なる3種の塩基を有する各
プライマーの混合プライマーを利用することにより実施
することができる。かくして、検出測定対象である特定
位置に変異を有する変異癌遺伝子のみが特異的に増幅さ
れ、これが検出可能となる。この本発明に特有の混合プ
ライマーを用いるPCR法を以下「MTO−PCR」と
略記する。
異位置特異的な検出を行なうことにあり、これは該PC
R法において、一方のプライマーとして目的とする変異
癌遺伝子の変異位置を3’末端とし且つ該3’末端に正
常塩基に対応するものとは異なる3種の塩基を有する各
プライマーの混合プライマーを利用することにより実施
することができる。かくして、検出測定対象である特定
位置に変異を有する変異癌遺伝子のみが特異的に増幅さ
れ、これが検出可能となる。この本発明に特有の混合プ
ライマーを用いるPCR法を以下「MTO−PCR」と
略記する。
【0016】このMTO−PCRは、被検試料として喀
痰を用いると共に上記特定の混合プライマーを利用する
ことを除いて、他は従来のPCR法と同様にして実施す
ることができる。上記変異癌遺伝子に好適なプライマー
の一般的な選択条件や、PCR法の各ステップ、即ち
(1)DNAの熱変成ステップ、(2)プライマーとの
アニーリングステップ及び(3)プライマーの伸長反応
ステップからなる反応サイクルの操作条件等も、殊に限
定なく従来のPCR法で採用されている通常の条件を採
用することができる。
痰を用いると共に上記特定の混合プライマーを利用する
ことを除いて、他は従来のPCR法と同様にして実施す
ることができる。上記変異癌遺伝子に好適なプライマー
の一般的な選択条件や、PCR法の各ステップ、即ち
(1)DNAの熱変成ステップ、(2)プライマーとの
アニーリングステップ及び(3)プライマーの伸長反応
ステップからなる反応サイクルの操作条件等も、殊に限
定なく従来のPCR法で採用されている通常の条件を採
用することができる。
【0017】かくして、目的のDNA断片を位置特異的
に増幅させることができる。この位置特異的に増幅され
たDNA断片の検出は、従来よりよく知られている一般
的方法に従って実施することができる。その例としては
例えば例えばエチジュームブロマイド(EB)染色法
〔Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd Ed.(19
89) Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Laboratory
Press.〕による検出等を好ましいものとして例示するこ
とができる、該方法によれば、ハイブリダイゼーション
を必須のステップとせず、時間や手間が省かれ、また放
射性標識が不要であることから、本発明の目的であるス
クリーニング法に極めて好適である。
に増幅させることができる。この位置特異的に増幅され
たDNA断片の検出は、従来よりよく知られている一般
的方法に従って実施することができる。その例としては
例えば例えばエチジュームブロマイド(EB)染色法
〔Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd Ed.(19
89) Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Laboratory
Press.〕による検出等を好ましいものとして例示するこ
とができる、該方法によれば、ハイブリダイゼーション
を必須のステップとせず、時間や手間が省かれ、また放
射性標識が不要であることから、本発明の目的であるス
クリーニング法に極めて好適である。
【0018】尚、本発明においては大量の被検試料をス
クリーニングすることを前提に作業の効率化が図られて
いるものであるが、例えば、本発明において使用される
必須の3種の混合プライマーを個々の変異プライマーと
して使用する場合にも、目的の変異癌遺伝子の変異を位
置及び塩基特異的に増幅させ得、これを同様に検出する
ことができる。本発明においては、かかる特定の態様か
らなる変異癌遺伝子の測定方法をも提供するものであ
る。
クリーニングすることを前提に作業の効率化が図られて
いるものであるが、例えば、本発明において使用される
必須の3種の混合プライマーを個々の変異プライマーと
して使用する場合にも、目的の変異癌遺伝子の変異を位
置及び塩基特異的に増幅させ得、これを同様に検出する
ことができる。本発明においては、かかる特定の態様か
らなる変異癌遺伝子の測定方法をも提供するものであ
る。
【0019】
【実施例】以下、参考例及び実施例を挙げて本発明を更
に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるもの
ではない。
に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるもの
ではない。
【0020】参考例1 5名の肺癌患者からの凍結した喀痰の各々約1mlを、
20mMトリス−HCl(pH7.4)、100mM
NaCl、100mM EDTA、54%シュクロー
ス、2%SDS及び1mg/mlプロテイネースK(Pr
oteinase K)を含む溶液1mlに加え、37℃で10時
間インキュベートした。DNAを、フェノール:クロロ
フォルム:イソアミルアルコール(25:24:1)で
3回抽出後、エタノール沈殿させ、10mMトリス−H
Cl(pH7.5)及び1mM EDTAを含むTE緩
衝液の300μlに溶解し、これをサンプルとした。
20mMトリス−HCl(pH7.4)、100mM
NaCl、100mM EDTA、54%シュクロー
ス、2%SDS及び1mg/mlプロテイネースK(Pr
oteinase K)を含む溶液1mlに加え、37℃で10時
間インキュベートした。DNAを、フェノール:クロロ
フォルム:イソアミルアルコール(25:24:1)で
3回抽出後、エタノール沈殿させ、10mMトリス−H
Cl(pH7.5)及び1mM EDTAを含むTE緩
衝液の300μlに溶解し、これをサンプルとした。
【0021】また、大腸癌及び正常末梢白血球からDN
Aを常法〔Cancer Res.,50, 7184-7189 (1990))に従い
調製し、対照サンプルとした。
Aを常法〔Cancer Res.,50, 7184-7189 (1990))に従い
調製し、対照サンプルとした。
【0022】参考例2 PCRに使用したプライマー及びハイブリダイゼーショ
ン用プローブを、K−ras遺伝子とそのコード領域に
おける位置対比において図1に示す。
ン用プローブを、K−ras遺伝子とそのコード領域に
おける位置対比において図1に示す。
【0023】図1において、□はK−ras遺伝子エク
ソン1(exon 1)のオープンリーディングフレーム(open
reading frame) を示し、その中の斜線部はそのコドン
12(codon 12)を示す。また、矢印はプライマー方向性
を、星印は変異させた塩基(但しプローブ(probe) の場
合はK−rasコドン12の2番目の塩基に星印が付し
てある)をそれぞれ示す。
ソン1(exon 1)のオープンリーディングフレーム(open
reading frame) を示し、その中の斜線部はそのコドン
12(codon 12)を示す。また、矢印はプライマー方向性
を、星印は変異させた塩基(但しプローブ(probe) の場
合はK−rasコドン12の2番目の塩基に星印が付し
てある)をそれぞれ示す。
【0024】MTOプライマー(MTO primer)のセット1
(set 1) は、K−rasコドン12(GGT-Gly)の1番目
のヌクレオチドの変異(TGT-Gys,CGT-Arg 及びAGT-Ser)
を、同セット2(set 2) は、同2番目のヌクレオチドの
変異(GAT-Asp,GTT-Val 及びGCT-Ala)をそれぞれ3’末
端に有するものである。
(set 1) は、K−rasコドン12(GGT-Gly)の1番目
のヌクレオチドの変異(TGT-Gys,CGT-Arg 及びAGT-Ser)
を、同セット2(set 2) は、同2番目のヌクレオチドの
変異(GAT-Asp,GTT-Val 及びGCT-Ala)をそれぞれ3’末
端に有するものである。
【0025】これらプライマー及びプローブは、DNA
合成装置(ABI DNA synthesizer model 392: Applied B
iosystem) を用いて製造した。
合成装置(ABI DNA synthesizer model 392: Applied B
iosystem) を用いて製造した。
【0026】実施例1 (1)MTO−PCR MTOプライマーのセット1又はセット2のいずれか
と、K1204Lプライマーとを用いて、前記サンプル
DNAをテンプレートとするPCRを、DMSOを使用
しない以外はベーカーらの方法〔Cancer Res.,50, 7177
-7722 (1990)〕に従って、95℃の0.5分、59℃な
いし60℃の2分及び70℃の2分の32サイクルにて
行なった。
と、K1204Lプライマーとを用いて、前記サンプル
DNAをテンプレートとするPCRを、DMSOを使用
しない以外はベーカーらの方法〔Cancer Res.,50, 7177
-7722 (1990)〕に従って、95℃の0.5分、59℃な
いし60℃の2分及び70℃の2分の32サイクルにて
行なった。
【0027】また、対照としてK−ras遺伝子エクソ
ン1のオープンリーディングフレームを挟むK1203
とK1204のプライマーを用いるPCRを、上記ベー
カーらの方法に従い、95℃の0.5分、53℃の2分
及び70℃の2分の40サイクルにて行なった。
ン1のオープンリーディングフレームを挟むK1203
とK1204のプライマーを用いるPCRを、上記ベー
カーらの方法に従い、95℃の0.5分、53℃の2分
及び70℃の2分の40サイクルにて行なった。
【0028】PCR産物を、エチジュームブロマイド
(EB)染色法〔Molecular Cloning(1989):前述〕に従
い、その5μlを1mg/mlEB含有2%アガロース
ゲル中電気泳動することにより検出した。
(EB)染色法〔Molecular Cloning(1989):前述〕に従
い、その5μlを1mg/mlEB含有2%アガロース
ゲル中電気泳動することにより検出した。
【0029】上記セット2のプライマーを用いた時の結
果を図2に示す。
果を図2に示す。
【0030】図2中、レーン1は被検試料として大腸癌
サンプル(陽性対照)を、レーン2は同正常白血球サン
プル(陰性対照)を、レーン3〜7は同喀痰サンプルを
それぞれ用いた結果を示している。
サンプル(陽性対照)を、レーン2は同正常白血球サン
プル(陰性対照)を、レーン3〜7は同喀痰サンプルを
それぞれ用いた結果を示している。
【0031】図2より、コドン12の変異(GGT からGA
T への変異)を持つことが知られている大腸癌からのサ
ンプル及び喀痰サンプルの1例(レーン4)において、
増幅されたDNAのバンドが検出されたことが判る。
尚、他の4例の喀痰サンプル及び正常白血球サンプルに
おいては、いずれもバンドは認められなかった。
T への変異)を持つことが知られている大腸癌からのサ
ンプル及び喀痰サンプルの1例(レーン4)において、
増幅されたDNAのバンドが検出されたことが判る。
尚、他の4例の喀痰サンプル及び正常白血球サンプルに
おいては、いずれもバンドは認められなかった。
【0032】(2)サザンブロット分析 常法〔J.Molecular Biology,98,503-517(1975)〕に従
い、5μlのPCR産物を電気泳動後、メンブランに移
し、図1に示すそれぞれのプローブとハイブリダイゼー
ションを行なった。
い、5μlのPCR産物を電気泳動後、メンブランに移
し、図1に示すそれぞれのプローブとハイブリダイゼー
ションを行なった。
【0033】図1に示すプローブ(NはA、T又はC)
のそれぞれは、32P−ATPとT4キナーゼによりラベ
ルされ、5×108 dpm の比活性を有している。
のそれぞれは、32P−ATPとT4キナーゼによりラベ
ルされ、5×108 dpm の比活性を有している。
【0034】上記PCR産物とのハイブリダイゼーショ
ンは、50℃で6時間を要して行なった。ハイブリダイ
ゼーション後、メンブラン(Biodyne transmembrane,Pal
l)を6×SSC(450mM NaCl、18mMクエ
ン酸ナトリウム及び1mMトリス−HCl、pH7.
2)中、50℃で5分間洗浄し、−80℃でX線フィル
ム(Kodak)に増感紙を用い感光させた。
ンは、50℃で6時間を要して行なった。ハイブリダイ
ゼーション後、メンブラン(Biodyne transmembrane,Pal
l)を6×SSC(450mM NaCl、18mMクエ
ン酸ナトリウム及び1mMトリス−HCl、pH7.
2)中、50℃で5分間洗浄し、−80℃でX線フィル
ム(Kodak)に増感紙を用い感光させた。
【0035】その結果、コドン12のVal (NがT)又
はAla (NがC)への変異を含むプローブにおいては、
全てのPCR産物においてシグナルが検出されなかっ
た。
はAla (NがC)への変異を含むプローブにおいては、
全てのPCR産物においてシグナルが検出されなかっ
た。
【0036】Asp への変異を含むプローブ(NがA)を
使用した時の結果を図3に示す。
使用した時の結果を図3に示す。
【0037】図3において、(A)はK1203及びK
1204をプライマーとするPCR産物の結果(コント
ロール)を、(B)は前記セット2及びK1204Lの
プライマーを用いたMTO−PCRの産物の結果(本発
明)をそれぞれ示し、レーン1は大腸癌サンプルを、レ
ーン2は白血球サンプルを、レーン3〜7は図2のレー
ン3〜7に対応する喀痰サンプルをそれぞれ示す。
1204をプライマーとするPCR産物の結果(コント
ロール)を、(B)は前記セット2及びK1204Lの
プライマーを用いたMTO−PCRの産物の結果(本発
明)をそれぞれ示し、レーン1は大腸癌サンプルを、レ
ーン2は白血球サンプルを、レーン3〜7は図2のレー
ン3〜7に対応する喀痰サンプルをそれぞれ示す。
【0038】図3より、本発明にかかる(B)の結果か
ら、陽性対照(レーン1)に加えて、1例の喀痰サンプ
ルにおいて、強いシグナルが検出されたことが判る。ま
た、K1203及びK1204をプライマーとしたPC
Rによれば、陽性対照においてのみシグナルが検出さ
れ、喀痰サンプルの変異遺伝子を検出し得ないことが判
る。
ら、陽性対照(レーン1)に加えて、1例の喀痰サンプ
ルにおいて、強いシグナルが検出されたことが判る。ま
た、K1203及びK1204をプライマーとしたPC
Rによれば、陽性対照においてのみシグナルが検出さ
れ、喀痰サンプルの変異遺伝子を検出し得ないことが判
る。
【0039】(3)PCR産物のサブクローニングとD
NA配列決定/コロニーハイブリダイゼーション PCR産物をニシショーらの方法〔Science (Wash.D.
C.), 253, 665-669 (1991)〕に従い、プラスミドベクタ
ー(pBluescriptSK,Stratagene)にクローニングし、少な
くとも50サブクローンのプールからのDNAを、DN
A配列決定のテンプレートとして用いた。DNA配列は
ニグロらの方法〔Nature (Lond.), 342, 705-708 (198
9) 〕に従い決定した。
NA配列決定/コロニーハイブリダイゼーション PCR産物をニシショーらの方法〔Science (Wash.D.
C.), 253, 665-669 (1991)〕に従い、プラスミドベクタ
ー(pBluescriptSK,Stratagene)にクローニングし、少な
くとも50サブクローンのプールからのDNAを、DN
A配列決定のテンプレートとして用いた。DNA配列は
ニグロらの方法〔Nature (Lond.), 342, 705-708 (198
9) 〕に従い決定した。
【0040】その結果、前記において陽性を示した喀痰
サンプルについて、K1203及びK1204をプライ
マーとするPCR産物には、いかなる変異配列も検出す
ることができなかった。一方、上記本発明方法の採用に
よれば、同一サンプルについて、コドン12のAsp への
変異配列が特異的に検出され、変異遺伝子に相当するプ
ライマーのみがDNA増幅に使用され、該DNA配列の
みが特異的に増幅されることが判った。
サンプルについて、K1203及びK1204をプライ
マーとするPCR産物には、いかなる変異配列も検出す
ることができなかった。一方、上記本発明方法の採用に
よれば、同一サンプルについて、コドン12のAsp への
変異配列が特異的に検出され、変異遺伝子に相当するプ
ライマーのみがDNA増幅に使用され、該DNA配列の
みが特異的に増幅されることが判った。
【0041】また、陽性を示したサンプルのK1203
及びK1204をプライマーとするPCR産物につき、
コドン12のAsp への変異を含むプローブ(NがA)を
用いて、常法に従いコロニーハイブリダイゼ々ーション
〔Proc Natl.Acad.Sci.USA,72,3961-3965(1975)〕を行
なった。
及びK1204をプライマーとするPCR産物につき、
コドン12のAsp への変異を含むプローブ(NがA)を
用いて、常法に従いコロニーハイブリダイゼ々ーション
〔Proc Natl.Acad.Sci.USA,72,3961-3965(1975)〕を行
なった。
【0042】その結果、喀痰サンプルについては、約1
000コロニーのトランスフォーマントにつき全てが陰
性を示し、変異遺伝子を検出し得なかった。このこと
は、喀痰サンプルにおいては、正常K−ras配列に比
較して、変異K−ras配列が1000分の1以下しか
存在せず、変異に特異的かつ高感度な測定が必要である
ことを示す。尚、大腸癌サンプルについては、約半数が
陽性を示した。
000コロニーのトランスフォーマントにつき全てが陰
性を示し、変異遺伝子を検出し得なかった。このこと
は、喀痰サンプルにおいては、正常K−ras配列に比
較して、変異K−ras配列が1000分の1以下しか
存在せず、変異に特異的かつ高感度な測定が必要である
ことを示す。尚、大腸癌サンプルについては、約半数が
陽性を示した。
【0043】以上より、本発明方法によれば、サンプル
中の大多数の正常配列に対して極僅かにしか混在してい
ない変異配列を、特異的に増幅させて、これを感度よく
検出できることが明らかであり、従って本発明方法は、
喀痰をサンプルとする変異癌遺伝子の検出測定に、極め
て優れた方法であることが判る。
中の大多数の正常配列に対して極僅かにしか混在してい
ない変異配列を、特異的に増幅させて、これを感度よく
検出できることが明らかであり、従って本発明方法は、
喀痰をサンプルとする変異癌遺伝子の検出測定に、極め
て優れた方法であることが判る。
【図1】本発明方法に用いるプライマー及びハイブリダ
イゼーション用プローブの塩基配列と、之等のK−ra
s遺伝子(そのコード領域)との位置対比に示す。
イゼーション用プローブの塩基配列と、之等のK−ra
s遺伝子(そのコード領域)との位置対比に示す。
【図2】実施例1の(1)に記載のMTO−PCR法に
おいて、セット2のプライマーを用いた時の結果を示す
図面に代わる写真である。
おいて、セット2のプライマーを用いた時の結果を示す
図面に代わる写真である。
【図3】実施例1の(2)に記載のサザンブロット分析
において、Asp への変異を含むプローブを用いた時の結
果を示す図面に代わる写真である。
において、Asp への変異を含むプローブを用いた時の結
果を示す図面に代わる写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12Q 1/68 A 7823−4B
Claims (3)
- 【請求項1】 喀痰を被検試料として、該被験試料中に
含まれる変異癌遺伝子を変異位置特異的に検出する変異
癌遺伝子の検出測定方法であって、目的変異癌遺伝子の
変異位置を3’末端とし且つ該3’末端に正常塩基に対
応するものとは異なる3種の塩基を有する各プライマー
の混合プライマーと、変異癌遺伝子を挟み得る任意の他
のプライマーとを用いてポリメラーゼ連鎖反応法を実施
して、変異癌遺伝子を変異位置特異的に増幅させること
を特徴とする変異癌遺伝子の検出測定方法。 - 【請求項2】 変異癌遺伝子がK−ras遺伝子であ
り、変異位置がコドン12、13又は61のいずれかの
位置である請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 変異位置がコドン12の2番目のヌクレ
オチドである請求項2に記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP4345280A JPH06167492A (ja) | 1992-11-30 | 1992-11-30 | 変異癌遺伝子の検出測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP4345280A JPH06167492A (ja) | 1992-11-30 | 1992-11-30 | 変異癌遺伝子の検出測定方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH06167492A true JPH06167492A (ja) | 1994-06-14 |
Family
ID=18375526
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP4345280A Pending JPH06167492A (ja) | 1992-11-30 | 1992-11-30 | 変異癌遺伝子の検出測定方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH06167492A (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002024905A1 (fr) * | 2000-09-19 | 2002-03-28 | Nobuyuki Hamajima | Procede permettant de determiner la mutation genetique |
EP1394272A1 (en) * | 1995-11-17 | 2004-03-03 | Nordiag As | Method for detection of Ki-ras mutations |
CN102796811A (zh) * | 2011-05-26 | 2012-11-28 | 上海赛安生物医药科技有限公司 | 检测kras突变的试剂及方法 |
-
1992
- 1992-11-30 JP JP4345280A patent/JPH06167492A/ja active Pending
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1394272A1 (en) * | 1995-11-17 | 2004-03-03 | Nordiag As | Method for detection of Ki-ras mutations |
WO2002024905A1 (fr) * | 2000-09-19 | 2002-03-28 | Nobuyuki Hamajima | Procede permettant de determiner la mutation genetique |
CN102796811A (zh) * | 2011-05-26 | 2012-11-28 | 上海赛安生物医药科技有限公司 | 检测kras突变的试剂及方法 |
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