JPH0616711B2 - 高温で自律増殖するプラスミド - Google Patents
高温で自律増殖するプラスミドInfo
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- JPH0616711B2 JPH0616711B2 JP60212222A JP21222285A JPH0616711B2 JP H0616711 B2 JPH0616711 B2 JP H0616711B2 JP 60212222 A JP60212222 A JP 60212222A JP 21222285 A JP21222285 A JP 21222285A JP H0616711 B2 JPH0616711 B2 JP H0616711B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/68—Stabilisation of the vector
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 この発明は好熱性細菌で好適に使用可能なベクター・プ
ラスミドに関するものである。
ラスミドに関するものである。
従来の技術 比較的高い培養温度で使用可能な宿主−ベクター系は、
発酵工程において、その取扱い上の安全性、高増殖速
度、培養時の冷却コストの低減等が期待できるとの見地
より精力的な開発がなされている。
発酵工程において、その取扱い上の安全性、高増殖速
度、培養時の冷却コストの低減等が期待できるとの見地
より精力的な開発がなされている。
例えば、ベクターとしては本発明者らにより提供された
バチルス属に属する好熱性細菌で自律的増殖能を有する
組換えプラスミドｐＴＢ５１又はｐＴＢ９０等（特開昭
５９−１９６０９２号公報参照）や、温泉水中から分離
されたサーマス属に属する高度好熱菌より抽出されたプ
ラスミドｐＮＨＳ１７１、ｐＮＨＫ１０１等（特公昭６
０−８１１５号、同５９−５３８３６号公報参照）が知
られている。
バチルス属に属する好熱性細菌で自律的増殖能を有する
組換えプラスミドｐＴＢ５１又はｐＴＢ９０等（特開昭
５９−１９６０９２号公報参照）や、温泉水中から分離
されたサーマス属に属する高度好熱菌より抽出されたプ
ラスミドｐＮＨＳ１７１、ｐＮＨＫ１０１等（特公昭６
０−８１１５号、同５９−５３８３６号公報参照）が知
られている。
発明が解決しようとする問題点 上述のごとく従来から好熱性細菌で使用できるベクター
・プラスミドが提案されており、殊に、ｐＴＢ９０は、
好熱性宿主菌として、また各種の酵素生産に菌自体が汎
用されているバチルス・ステアロサーモフイラス（Baci
llus stearothermophilus）のベクター・プラスミドと
して好適なものである。
・プラスミドが提案されており、殊に、ｐＴＢ９０は、
好熱性宿主菌として、また各種の酵素生産に菌自体が汎
用されているバチルス・ステアロサーモフイラス（Baci
llus stearothermophilus）のベクター・プラスミドと
して好適なものである。
しかしながら、該プラスミドは必ずしもバチルス・ステ
アロサーモフイラスの増殖至適温度（約６２℃）近傍に
おいて該宿主菌中で安定な自律的増殖能を示さないとい
う欠点があつた。
アロサーモフイラスの増殖至適温度（約６２℃）近傍に
おいて該宿主菌中で安定な自律的増殖能を示さないとい
う欠点があつた。
そこで、本発明者らはかかる欠点を解消せんとして多角
的な研究を重ねた結果、プラスミドｐＴＢ９０由来の組
換プラスミドで上記好熱性菌を形質転換した形質転換体
に通常用いられる変異手段を施すことにより、プラスミ
ドに所望の変異を起こし得ることを見い出した。なお、
ここにいう「変異」とはプラスミドが宿主染色体に組み
込まれる（Integration）現象であり、さらに該変異菌
を適当な条件下で培養することにより、該プラスミドを
再び染色体から切り取ること（Excision）ができ、この
切り取りに際して染色体のＤＮＡ配列がプラスミドに連
結して切り出される現象である。
的な研究を重ねた結果、プラスミドｐＴＢ９０由来の組
換プラスミドで上記好熱性菌を形質転換した形質転換体
に通常用いられる変異手段を施すことにより、プラスミ
ドに所望の変異を起こし得ることを見い出した。なお、
ここにいう「変異」とはプラスミドが宿主染色体に組み
込まれる（Integration）現象であり、さらに該変異菌
を適当な条件下で培養することにより、該プラスミドを
再び染色体から切り取ること（Excision）ができ、この
切り取りに際して染色体のＤＮＡ配列がプラスミドに連
結して切り出される現象である。
そして、前述の現象においてプラスミドに連結して切り
出される染色体ＤＮＡ配列の中に、細胞の耐熱増殖及び
安定化機能を司る遺伝子が含有されていることを確認し
て本発明を完成した。
出される染色体ＤＮＡ配列の中に、細胞の耐熱増殖及び
安定化機能を司る遺伝子が含有されていることを確認し
て本発明を完成した。
問題点を解決するための手段 すなわち、本発明は、細胞の耐熱増殖及び安定化機能を
司る遺伝子を含有し、分子量が1.2Ｍｄ（メガ・ダルト
ン）で且つ制限酵素Hind IIIによるただ一つの切断箇所
をもつＤＮＡ配列を含むことを特徴とする好熱性細菌に
対して有利に用いることができるベクター・プラスミド
を提供するものである。
司る遺伝子を含有し、分子量が1.2Ｍｄ（メガ・ダルト
ン）で且つ制限酵素Hind IIIによるただ一つの切断箇所
をもつＤＮＡ配列を含むことを特徴とする好熱性細菌に
対して有利に用いることができるベクター・プラスミド
を提供するものである。
このプラスミドは、細胞の耐熱増殖及び安定化機能を司
る遺伝子を含有することから、例えば、前述のごとく汎
用性の高いバチルス・ステアロサーモフイラスの中で、
その増殖至適温度近傍において安定に自律的増殖するこ
とができる。
る遺伝子を含有することから、例えば、前述のごとく汎
用性の高いバチルス・ステアロサーモフイラスの中で、
その増殖至適温度近傍において安定に自律的増殖するこ
とができる。
本発明にいう「細胞の耐熱増殖及び安定化機能を司る遺
伝子」は、その起源を問わず各種の微生物由来のもの、
または、化学的合成手段により調製されたものであつて
もよい。宿主菌として汎用性の高いバチルス・ステアロ
サーモフイラスを用いる観点からは、バチルス・ステア
ロサーモフイラス由来のものが好適である。なお、これ
らの微生物の具体的なものとしては、上記バチルス属に
属する細菌のうち、アメリカン・タイプカルター・コレ
クシヨンにＡＴＣＣ１２９８０、１０１９４、８００
５、７９５４又は７９５３の番号で寄託されているも
の、及びそれらの変異菌殊、例えば、ＡＴＣＣ１２９８
０由来のＣＵ２１株〔本菌株の性質については、今中
等、ジヤーナル・オブ・バクテリオロジー（Journal of
Bacteriology），Ｖｏｌ．１４９，No.３，ｐ．８２
５，１９８２年に詳しい〕などを挙げることができる。
伝子」は、その起源を問わず各種の微生物由来のもの、
または、化学的合成手段により調製されたものであつて
もよい。宿主菌として汎用性の高いバチルス・ステアロ
サーモフイラスを用いる観点からは、バチルス・ステア
ロサーモフイラス由来のものが好適である。なお、これ
らの微生物の具体的なものとしては、上記バチルス属に
属する細菌のうち、アメリカン・タイプカルター・コレ
クシヨンにＡＴＣＣ１２９８０、１０１９４、８００
５、７９５４又は７９５３の番号で寄託されているも
の、及びそれらの変異菌殊、例えば、ＡＴＣＣ１２９８
０由来のＣＵ２１株〔本菌株の性質については、今中
等、ジヤーナル・オブ・バクテリオロジー（Journal of
Bacteriology），Ｖｏｌ．１４９，No.３，ｐ．８２
５，１９８２年に詳しい〕などを挙げることができる。
上記遺伝子は、添付図面のプラスミドｐＴＲＺ１１７、
ｐＴＲＺ９０、ｐＴＲＺ９１９における断片Ｆｔで示さ
れるごとく、約1.2Ｍｄの分子量を有し且つ制限酵素Hin
d IIIによるただ一つの切断箇所をもつＤＮＡ配列を含
有することで特定できる。
ｐＴＲＺ９０、ｐＴＲＺ９１９における断片Ｆｔで示さ
れるごとく、約1.2Ｍｄの分子量を有し且つ制限酵素Hin
d IIIによるただ一つの切断箇所をもつＤＮＡ配列を含
有することで特定できる。
そして、本発明により提供されるベクター・プラスミド
は、かかる遺伝子を含有するものであれば全てが含ま
れ、使用宿主、使用目的に応じて適当なプラスミド構成
ＤＮＡ配列を有することができる。しかし、本発明の具
体的使用目的の一つである、好熱性細菌バチルス・ステ
アロサーモフイラスを宿主として用いるに際しては、該
宿主で安定に自律的増殖できるベクター・プラスミドの
構成ＤＮＡ配列との結合したものであつてもよい。
は、かかる遺伝子を含有するものであれば全てが含ま
れ、使用宿主、使用目的に応じて適当なプラスミド構成
ＤＮＡ配列を有することができる。しかし、本発明の具
体的使用目的の一つである、好熱性細菌バチルス・ステ
アロサーモフイラスを宿主として用いるに際しては、該
宿主で安定に自律的増殖できるベクター・プラスミドの
構成ＤＮＡ配列との結合したものであつてもよい。
これらの具体的なものとしては、添付図面に示される組
換えプラスミドｐＴＲＺ１１７、ｐＴＲＺ９０またはｐ
ＴＲＺ９１９を好適なものとして挙げることができる。
換えプラスミドｐＴＲＺ１１７、ｐＴＲＺ９０またはｐ
ＴＲＺ９１９を好適なものとして挙げることができる。
次に、本発明のベクター・プラスミドの作成方法につい
て述べる。
て述べる。
(a) 上述した好熱性細菌を宿主とし、該宿主を形質転
換できる適当な選択マーカーを有するプラスミドによ
り、それ自体公知のプロトプラスト法により、形質転換
する。ここに宿主菌の具体的なものとしては、前記バチ
ルス・ステアロサーモフイラスＡＴＣＣ１２９８０、１
０１９４、８００５、７９５４及び７９５３並びにそれ
らの変異菌例えば、ＣＵ２１株が挙げられる。
換できる適当な選択マーカーを有するプラスミドによ
り、それ自体公知のプロトプラスト法により、形質転換
する。ここに宿主菌の具体的なものとしては、前記バチ
ルス・ステアロサーモフイラスＡＴＣＣ１２９８０、１
０１９４、８００５、７９５４及び７９５３並びにそれ
らの変異菌例えば、ＣＵ２１株が挙げられる。
また、該形質転換に用いるプラスミドの具体的なものと
しては、プラスミド、ｐＴＢ１９（微工研菌寄第５８９
５号菌株より得られる）又はｐＴＢ２０〔前述のジヤー
ナル・オブ・バクテリオロジー（Journal of Bacteriol
ogy），Ｖｏｌ．１４９，ｐ．８２４〜８３０参照）か
ら作成されるｐＴＢ５１，ｐＴＢ５２，ｐＴＢ５３又は
ｐＴＢ９０等に更に必要に応じて選択マーカーを付与し
た組換プラスミドを挙げることができる。例えば、ペニ
シリナーゼ遺伝子penPを含むＤＮＡ断片（2.8Ｍｄ）を
上記ｐＴＢ９０に組み込んだｐＬＰ１１（9.5Ｍｄ）等
〔ジヤーナル・オブ・ゼネラル・マイクロバイオロジー
（Journal of General Microbiology）１２８，２９９
７〜３０００（１９８２）〕である。
しては、プラスミド、ｐＴＢ１９（微工研菌寄第５８９
５号菌株より得られる）又はｐＴＢ２０〔前述のジヤー
ナル・オブ・バクテリオロジー（Journal of Bacteriol
ogy），Ｖｏｌ．１４９，ｐ．８２４〜８３０参照）か
ら作成されるｐＴＢ５１，ｐＴＢ５２，ｐＴＢ５３又は
ｐＴＢ９０等に更に必要に応じて選択マーカーを付与し
た組換プラスミドを挙げることができる。例えば、ペニ
シリナーゼ遺伝子penPを含むＤＮＡ断片（2.8Ｍｄ）を
上記ｐＴＢ９０に組み込んだｐＬＰ１１（9.5Ｍｄ）等
〔ジヤーナル・オブ・ゼネラル・マイクロバイオロジー
（Journal of General Microbiology）１２８，２９９
７〜３０００（１９８２）〕である。
この組換プラスミドはpenP遺伝子断片を含むプラスミド
ｐＴＴＥ１１〔ジヤーナル・オブ・バクテリオロジー
（Journal of Bacteriology）１４７，No.3．ｐ．７７
６〜７８６（１９８１）〕とｐＴＢ９０とを用いる公知
の遺伝子組換え操作によつて作成することができる〔モ
レキユラー・クローニング（Molecular Cloning），Ａ
Laboratory Mannual(Cold Spring Harbor Laborator
y,Cold Spring Harbor,NY，１９８２）〕。
ｐＴＴＥ１１〔ジヤーナル・オブ・バクテリオロジー
（Journal of Bacteriology）１４７，No.3．ｐ．７７
６〜７８６（１９８１）〕とｐＴＢ９０とを用いる公知
の遺伝子組換え操作によつて作成することができる〔モ
レキユラー・クローニング（Molecular Cloning），Ａ
Laboratory Mannual(Cold Spring Harbor Laborator
y,Cold Spring Harbor,NY，１９８２）〕。
(b) 上記(a)の方法で得られた形質転換株をＮ−メチル
−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（以下、ＮＴ
Ｇという）等の変異源を用いる公知の変異手段により変
異処理する。この変異処理に供した菌株の中から各種選
択マーカーを指標として調製した変異菌株から、更に、
約４８℃培養では細胞質にプラスミドが存在し、約６３
℃では細胞質にはプラスミドとしては存在しないとう特
性を持つプラスミド保持変異菌株を選択する。
−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（以下、ＮＴ
Ｇという）等の変異源を用いる公知の変異手段により変
異処理する。この変異処理に供した菌株の中から各種選
択マーカーを指標として調製した変異菌株から、更に、
約４８℃培養では細胞質にプラスミドが存在し、約６３
℃では細胞質にはプラスミドとしては存在しないとう特
性を持つプラスミド保持変異菌株を選択する。
(c) (b)で得られた変異菌株より、それ自体公知の方法
〔前述のモレキユラー・クローニング（Molecular Clon
ing）Ａ Laboratory参照）で変異プラスミドを採取す
る。この変異プラスミドの具体的なものとしては、昭和
６０年９月２５日付で工業技術院微生物工業技術研究所
に微工研菌寄第８４５６号で寄託された菌株より、それ
自体公知のプラスミド抽出法〔前述のモレキユラー・ク
ローニング（Molecular Cloning）Ａ Laboratory Mann
ual参照）により採取しうるプラスミドｐＴＲＡ１１７
を挙げることができる。そして、この変異プラスミドで
プロトプラス法を用いて上述の細胞の耐熱増殖及び安定
化機能を司る遺伝子を染色体上に有する好熱性細菌を形
質転換する。
〔前述のモレキユラー・クローニング（Molecular Clon
ing）Ａ Laboratory参照）で変異プラスミドを採取す
る。この変異プラスミドの具体的なものとしては、昭和
６０年９月２５日付で工業技術院微生物工業技術研究所
に微工研菌寄第８４５６号で寄託された菌株より、それ
自体公知のプラスミド抽出法〔前述のモレキユラー・ク
ローニング（Molecular Cloning）Ａ Laboratory Mann
ual参照）により採取しうるプラスミドｐＴＲＡ１１７
を挙げることができる。そして、この変異プラスミドで
プロトプラス法を用いて上述の細胞の耐熱増殖及び安定
化機能を司る遺伝子を染色体上に有する好熱性細菌を形
質転換する。
(d) 上記(c)の変異プラスミドを保持する形質転換体を
栄養培地に植菌し、約４８℃で一晩培養した後、該培養
液を更に同じ培地に接触し、約６３℃で数時間培養し、
変異プラスミドを宿主染色体に組み込ませる。この細胞
を上記栄養培地に植菌し、約４８℃で一晩培養すること
により、宿主染色体に由来する細胞の耐熱増殖及び安定
化機能を司る遺伝子を染色体から切り出し、変異プラス
ミドに連結した新たなプラスミドが形成される。このプ
ラスミドの具体的なものとしては、本出願人により昭和
６０年９月２５日付で前記寄託機関に微工研菌寄第８４
５７号で寄託された菌株より、前述の方法によつて採取
されるプラスミドｐＴＲＺ１１７を挙げることができ
る。
栄養培地に植菌し、約４８℃で一晩培養した後、該培養
液を更に同じ培地に接触し、約６３℃で数時間培養し、
変異プラスミドを宿主染色体に組み込ませる。この細胞
を上記栄養培地に植菌し、約４８℃で一晩培養すること
により、宿主染色体に由来する細胞の耐熱増殖及び安定
化機能を司る遺伝子を染色体から切り出し、変異プラス
ミドに連結した新たなプラスミドが形成される。このプ
ラスミドの具体的なものとしては、本出願人により昭和
６０年９月２５日付で前記寄託機関に微工研菌寄第８４
５７号で寄託された菌株より、前述の方法によつて採取
されるプラスミドｐＴＲＺ１１７を挙げることができ
る。
なお、本発明のプラスミドは、以上の方法によつて染色
体ＤＮＡより切り取られる細胞の耐熱増殖及び安定化機
能を司る遺伝子を含有するものであれば本発明の目的を
達成でき、他のＤＮＡ配列に限定されないので、例えば
上記ｐＴＲＺ１１７を基に使用目的に応じ生体内実験
（in vivo）的又は試験管内実験（in vitro）的手法に
よつて作成される上記遺伝子を含有するプラスミドであ
ればその種類を問わない。後者の具体的なものとして
は、それ自体公知の処理方法、例えばｐＴＲＺ１１７を
制限酵素EcoRIで分離し、Ｔ４−リガーゼ処理して得ら
れるｐＴＲＺ１１７より小さいプラスミドｐＴＲＺ９０
やｐＴＲＺ９１９を挙げることができる。
体ＤＮＡより切り取られる細胞の耐熱増殖及び安定化機
能を司る遺伝子を含有するものであれば本発明の目的を
達成でき、他のＤＮＡ配列に限定されないので、例えば
上記ｐＴＲＺ１１７を基に使用目的に応じ生体内実験
（in vivo）的又は試験管内実験（in vitro）的手法に
よつて作成される上記遺伝子を含有するプラスミドであ
ればその種類を問わない。後者の具体的なものとして
は、それ自体公知の処理方法、例えばｐＴＲＺ１１７を
制限酵素EcoRIで分離し、Ｔ４−リガーゼ処理して得ら
れるｐＴＲＺ１１７より小さいプラスミドｐＴＲＺ９０
やｐＴＲＺ９１９を挙げることができる。
作 用 本発明のベクター・プラスミドは、その具体的作用につ
いては不明であるが、好熱性細菌の耐熱増殖及び安定化
機能を司ることが考えられる遺伝子断片を包含するプラ
スミドであることから、本発明のプラスミドに耐熱増殖
及び安定化機能が付与されるものと推察できる。
いては不明であるが、好熱性細菌の耐熱増殖及び安定化
機能を司ることが考えられる遺伝子断片を包含するプラ
スミドであることから、本発明のプラスミドに耐熱増殖
及び安定化機能が付与されるものと推察できる。
実施例 本発明を宿主菌としてバチルス・ステアロサーモフイラ
スＣＵ２１（効果としてはＡＴＣＣ12980の寄託菌を用
いる場合と同じ）を用い、組換プラスミドとしては、上
述のプラスミドｐＬＰ１１（カナマイシン不活化酵素の
遺伝子：Ran及びペニシナリーゼ遺伝子：penPを保持す
る）を用いた例により以下に説明する。
スＣＵ２１（効果としてはＡＴＣＣ12980の寄託菌を用
いる場合と同じ）を用い、組換プラスミドとしては、上
述のプラスミドｐＬＰ１１（カナマイシン不活化酵素の
遺伝子：Ran及びペニシナリーゼ遺伝子：penPを保持す
る）を用いた例により以下に説明する。
〔Ａ〕 ＣＵ２１株を常法であるプロトプラスト法によ
りｐＬＰ１１を形質転換した。この形質転換株を１０μ
ｇ／mlのＮＴＧ溶液中に懸濁させ、１５分間ＮＴＧと接
触させた。
りｐＬＰ１１を形質転換した。この形質転換株を１０μ
ｇ／mlのＮＴＧ溶液中に懸濁させ、１５分間ＮＴＧと接
触させた。
ＮＴＧとの接触を経験した細胞を５００μｇ／mlのカナ
マイシンを含むＬ−寒天培地上に展開し、６０℃で一晩
培養した。
マイシンを含むＬ−寒天培地上に展開し、６０℃で一晩
培養した。
上記寒天培地上で生育形成されたコロニーを、５００μ
ｇ／mlカナマイシン、0.7５％（ｗ／ｖ）ポリビニルア
ルコールを含むＬ−寒天培地にレプリカし、４８℃一晩
培養し、再びコロニーを形成させた後、0.8ＮＩ、0.3２
Ｎ ＫＩ、１％（ｗ／ｖ）NaB4O7の溶液で寒天培地を染
色した。この上に２0,0００Ｕ／mlのペニシリン溶液を
展開し、各コロニーの周囲にハローの現われないものは
棄却した。
ｇ／mlカナマイシン、0.7５％（ｗ／ｖ）ポリビニルア
ルコールを含むＬ−寒天培地にレプリカし、４８℃一晩
培養し、再びコロニーを形成させた後、0.8ＮＩ、0.3２
Ｎ ＫＩ、１％（ｗ／ｖ）NaB4O7の溶液で寒天培地を染
色した。この上に２0,0００Ｕ／mlのペニシリン溶液を
展開し、各コロニーの周囲にハローの現われないものは
棄却した。
残つた各コロニー中の細胞を１００μｇ／mlのカナマイ
シンを含むＬ培地で、６３℃で培養し増殖を示さないも
のは棄却した。
シンを含むＬ培地で、６３℃で培養し増殖を示さないも
のは棄却した。
上で増殖を示した各株を、１００μｇ／mlのカナマイシ
ンを含むＬ培地で４８℃で一晩培養し、それぞれの株の
中からプラスミドを調製した。調製したプラスミドそれ
ぞれを用いＣＵ２１株を形質転換した。
ンを含むＬ培地で４８℃で一晩培養し、それぞれの株の
中からプラスミドを調製した。調製したプラスミドそれ
ぞれを用いＣＵ２１株を形質転換した。
各候補プラスミドによる形質転換株を５００μｇ／mlの
カナマイシンを含むＬ寒天培地に植菌し、６０℃一晩培
養し、コロニー形成をしない形質転換株を与えた候補プ
ラスミドは除外した。
カナマイシンを含むＬ寒天培地に植菌し、６０℃一晩培
養し、コロニー形成をしない形質転換株を与えた候補プ
ラスミドは除外した。
ここでコロニー形成を示した株に対して、再度上記の５
００μｇ／mlカナマイシン、0.7５％（ｗ／ｖ）ポリビ
ニルアルールを含むＬ−寒天培地、更に１００μｇ／ml
のカナマイシンを含むＬ−培地で培養する操作を施し、
それぞれの選択の基準を満足しない形質転換株を与える
候補プラスミドは棄却した。
００μｇ／mlカナマイシン、0.7５％（ｗ／ｖ）ポリビ
ニルアルールを含むＬ−寒天培地、更に１００μｇ／ml
のカナマイシンを含むＬ−培地で培養する操作を施し、
それぞれの選択の基準を満足しない形質転換株を与える
候補プラスミドは棄却した。
残つた候補プラスミドによる形質転換株を、１００μｇ
／mlのカナマイシンを含むＬ培地で、４８℃及び６３℃
のそれぞれで培養し、培養菌体より細胞質因子としての
状態で存在するプラスミドだけを抽出することのできる
方法（アルカリ抽出法）でもつて、それぞれの培養菌体
からプラスミドを抽出し、４８℃培養では細胞質にプラ
スミドが存在し、６３℃培養では細胞質にはプラスミド
としては存在しないという特性を持つプラスミドを検索
選択した。以上より得られたプラスミドの１つをｐＴＲ
Ａ１１７と命名した。
／mlのカナマイシンを含むＬ培地で、４８℃及び６３℃
のそれぞれで培養し、培養菌体より細胞質因子としての
状態で存在するプラスミドだけを抽出することのできる
方法（アルカリ抽出法）でもつて、それぞれの培養菌体
からプラスミドを抽出し、４８℃培養では細胞質にプラ
スミドが存在し、６３℃培養では細胞質にはプラスミド
としては存在しないという特性を持つプラスミドを検索
選択した。以上より得られたプラスミドの１つをｐＴＲ
Ａ１１７と命名した。
〔Ｂ〕 ＣＵ２１株を再度ｐＴＲＡ１１７で形質転換し
た。得た形質転換株を１００μｇ／mlのカナマイシンを
含むＬ培地に接種し、６３℃で６時間培養することによ
り、ｐＴＲＡ１１７を宿主染色体に組み込ませることが
できた。
た。得た形質転換株を１００μｇ／mlのカナマイシンを
含むＬ培地に接種し、６３℃で６時間培養することによ
り、ｐＴＲＡ１１７を宿主染色体に組み込ませることが
できた。
ｐＴＲＡ１１７が宿主染色体に組み込んだ細胞を、上と
同じ培地に植菌し、４８℃一晩培養する。この操作によ
り、一旦染色体に組み込まれたｐＴＲＡ１１７が再び染
色体から取り出された（切り取られた（excision））。
このとき染色体の断片がｐＴＲＡ１１７と連結した形
で、ｐＴＲＡ１１７とともに染色体外（細胞質）に一緒
にexcisionする。この染色体由来の断片とｐＴＲＡ１１
７はexcision時に一つの新しいプラスミドを形成した。
同じ培地に植菌し、４８℃一晩培養する。この操作によ
り、一旦染色体に組み込まれたｐＴＲＡ１１７が再び染
色体から取り出された（切り取られた（excision））。
このとき染色体の断片がｐＴＲＡ１１７と連結した形
で、ｐＴＲＡ１１７とともに染色体外（細胞質）に一緒
にexcisionする。この染色体由来の断片とｐＴＲＡ１１
７はexcision時に一つの新しいプラスミドを形成した。
この培養液を、更に同じ培地に植菌し、６５℃で培養
し、増殖する細胞を選択した。
し、増殖する細胞を選択した。
この培養菌体から得られたプラスミドＤＮＡｐＴＲＺ１
１７（１0.7Ｍｄ）は、宿主菌ＣＵ２１株の染色体に由
来する細胞の耐熱増殖及び安定化機能を司る遺伝子を含
有し、分子量が1.2Ｍｄで且つ制限酵素HindIIIによるた
だ１つの切断箇所をもつＤＮＡ配列（1.2Ｍｄを有して
いた。
１７（１0.7Ｍｄ）は、宿主菌ＣＵ２１株の染色体に由
来する細胞の耐熱増殖及び安定化機能を司る遺伝子を含
有し、分子量が1.2Ｍｄで且つ制限酵素HindIIIによるた
だ１つの切断箇所をもつＤＮＡ配列（1.2Ｍｄを有して
いた。
〔Ｃ〕 プラスミドｐＴＲＺ９０及びｐＴＲＺ９１９の
作成 前述のMannualに準じて、ｐＴＲＺ１１７をEcoRIで分
解、Ｔ４−リガーゼ（ligase）処理し、ｐＴＲＺ１１７
よりも小さいプラスミドｐＴＲＺ９０、ｐＴＲＺ９１９
を作成した。これらのプラスミドを保持するＢ．stearo
thermophilusの形質転換株も６５℃で増殖することがで
きた。
作成 前述のMannualに準じて、ｐＴＲＺ１１７をEcoRIで分
解、Ｔ４−リガーゼ（ligase）処理し、ｐＴＲＺ１１７
よりも小さいプラスミドｐＴＲＺ９０、ｐＴＲＺ９１９
を作成した。これらのプラスミドを保持するＢ．stearo
thermophilusの形質転換株も６５℃で増殖することがで
きた。
〔Ｄ〕 プラスミドｐＴＲＺ系のプラスミド中に新たに
含まれた1.2ＭｄのＤＮＡ断片が染色体由来であること
の確認は、次に記載のサザン・ハイブリダイゼーシヨン
（Southernhybridization）によつた。
含まれた1.2ＭｄのＤＮＡ断片が染色体由来であること
の確認は、次に記載のサザン・ハイブリダイゼーシヨン
（Southernhybridization）によつた。
ｐＴＲＺ９１９のEcoRIによる分解物を１％のlow-melti
ng-temperatureアガロースゲル電気泳動で1.2Ｍｄ Ｄ
ＮＡ断片（第１図の２重ハツチング部分）を含む4.1Ｍ
ｄのEcoRI断片を分離し、回収した。得た断片をニツク
トランスレーシヨン法で32Pでラベルし、プローブを作
成した。
ng-temperatureアガロースゲル電気泳動で1.2Ｍｄ Ｄ
ＮＡ断片（第１図の２重ハツチング部分）を含む4.1Ｍ
ｄのEcoRI断片を分離し、回収した。得た断片をニツク
トランスレーシヨン法で32Pでラベルし、プローブを作
成した。
このことによつて、宿主菌バチルス・ステアロサーモフ
イラスの染色体はプローグとハイブリダイゼーシヨンす
ることが確認できた。
イラスの染色体はプローグとハイブリダイゼーシヨンす
ることが確認できた。
なお、上記で用いるＬ−培地の具体的組成は下記の通り
である。
である。
Ｌ−培地組成 バクトトリプトン １０ｇ／ 酵母エキス ５ｇ／ ＮａＣｌ ５ｇ／ 効 果 各プラスミドによる形質転換株の１００μｇ／mlのカナ
マイシンを含むＬ培地の中での増殖に対する温度の影響
を、形質転換体を５〜１０時間培養した結果を下記表に
示す。
マイシンを含むＬ培地の中での増殖に対する温度の影響
を、形質転換体を５〜１０時間培養した結果を下記表に
示す。
以上より、本発明のプラスミド（プラスミドｐＴＲＺ１
１７、ｐＴＲＺ９０、ｐＴＲＺ９１９）による形質転換
株は、バチルス・ステアロサーモフイラスの培養至適温
度以上でも安定に自律的増殖することが確認できた。
１７、ｐＴＲＺ９０、ｐＴＲＺ９１９）による形質転換
株は、バチルス・ステアロサーモフイラスの培養至適温
度以上でも安定に自律的増殖することが確認できた。
第１図は、細胞の耐熱増殖及び安定化機能を司る遺伝子
を含有するベクター・プラスミドの作成例を示す。 なお、第１図中、使用した記号は以下の意を表わす。Ｆ
ｔは、染色体から切り出された1.2メガダルトンの上記
遺伝子断片を示す。
を含有するベクター・プラスミドの作成例を示す。 なお、第１図中、使用した記号は以下の意を表わす。Ｆ
ｔは、染色体から切り出された1.2メガダルトンの上記
遺伝子断片を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:07）
Claims (1)
- 【請求項１】細胞の耐熱増殖及び安定化機能を司る遺伝
子を含有し、分子量が１．２Ｍｄで且つ制限酵素をＨｉ
ｎｄIIIによるただ一つの切断断面をもつ、バチルス・
スチアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilu
s）の染色体に由来するＤＮＡ配列を含み、そして (a) 分子量が約１０．７Ｍｄであり且つ下記の制限酵
素地図 または(b) 分子量が約７．９Ｍｄであり且つ下記の制
限酵素地図 または(c) 分子量が約５．１Ｍｄであり且つ下記の制
限酵素地図 によって特徴づけられるベクタープラスミド。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60212222A JPH0616711B2 (ja) | 1985-09-27 | 1985-09-27 | 高温で自律増殖するプラスミド |
| EP19860113091 EP0221317B1 (en) | 1985-09-27 | 1986-09-23 | Plasmid autonomously replicating at high temperatures |
| DE8686113091T DE3676046D1 (de) | 1985-09-27 | 1986-09-23 | Bei hohen temperaturen autonom replizierendes plasmid. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60212222A JPH0616711B2 (ja) | 1985-09-27 | 1985-09-27 | 高温で自律増殖するプラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6274290A JPS6274290A (ja) | 1987-04-06 |
| JPH0616711B2 true JPH0616711B2 (ja) | 1994-03-09 |
Family
ID=16618967
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60212222A Expired - Lifetime JPH0616711B2 (ja) | 1985-09-27 | 1985-09-27 | 高温で自律増殖するプラスミド |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0221317B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0616711B2 (ja) |
| DE (1) | DE3676046D1 (ja) |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL61982A (en) * | 1980-02-15 | 1984-01-31 | Cpc International Inc | Genetically engineered microorganisms for massive production of amyloytic enzymes and process for preparing same using the corresponding recombinant dnas containing amylase coding genes |
| CA1170202A (en) * | 1981-01-15 | 1984-07-03 | Susan Mickel | Process for cloning the gene coding for a thermostable alpha-amylase into escherichia coli and bacillus subtilis |
| CA1206108A (en) * | 1981-03-06 | 1986-06-17 | Shuichi Aiba | Process for transforming microorganism by means of plasmid introduction |
| CA1198069A (en) * | 1982-06-08 | 1985-12-17 | David H. Gelfand | Temperature sensitive multicopy plasmids |
| JPS59196092A (ja) * | 1983-04-25 | 1984-11-07 | Sanraku Inc | 組換えプラスミドによる耐熱性α−アミラ−ゼの新規製造法 |
| DE3480411D1 (en) * | 1983-07-06 | 1989-12-14 | Gist Brocades Nv | Molecular cloning and expression in industrial microorganism species |
| US4861718A (en) * | 1984-09-29 | 1989-08-29 | Wakamoto Pharmaceutical Co., Ltd. | Gene coding for thermostable beta-galactosidase, bacillus subtilis having the gene, enzyme coded by the gene and a process for the production thereof |
-
1985
- 1985-09-27 JP JP60212222A patent/JPH0616711B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-09-23 DE DE8686113091T patent/DE3676046D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-09-23 EP EP19860113091 patent/EP0221317B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3676046D1 (de) | 1991-01-17 |
| EP0221317B1 (en) | 1990-12-05 |
| EP0221317A1 (en) | 1987-05-13 |
| JPS6274290A (ja) | 1987-04-06 |
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