JPH06153984A - Antibody and antibody cdna - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To provide a new monoclonal antibody reactive with cell strain of human pulmonary cancer, mammary cancer, gastric cancer and colon cancer, non-reactive with normal human fibroblast cell strain and useful for the clinical diagnosis and immunotherapy, etc., of cancer. CONSTITUTION:The human-type monoclonal antibody is reactive with the cell strain of human pulmonary cancer, mammary cancer, gastric cancer and colon cancer, non-reactive with normal human fibroblast cell strain and reactive with human pulmonary cancer tissue. The antibody contains the amino acid sequences of formula I and formula II in each variable portion of the heavy chain and the light chain of antibody. It can be separated from the product of human-human hybridoma BD9D12 (FERM P13235).

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト型モノクローナル
抗体、抗体ｃＤＮＡ及びヒト−ヒトハイブリドーマに関
する。より具体的には、ヒトの肺癌、乳癌、胃癌、大腸
癌の細胞株と反応し、ヒト正常繊維芽細胞株と反応せ
ず、またヒト肺癌組織と反応するヒト型モノクローナル
抗体、および該ヒト型モノクローナル抗体の抗原結合を
司る可変領域をコードするｃＤＮＡ、更に、該ヒト型モ
ノクローナル抗体を産生するヒト−ヒトハイブリドーマ
に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a human type monoclonal antibody, an antibody cDNA and a human-human hybridoma. More specifically, a humanized monoclonal antibody that reacts with human lung cancer, breast cancer, gastric cancer, and colon cancer cell lines, does not react with human normal fibroblast cell lines, and reacts with human lung cancer tissue, and the human type It relates to a cDNA encoding a variable region that controls antigen binding of a monoclonal antibody, and further to a human-human hybridoma producing the human type monoclonal antibody.

【０００２】該ヒト型モノクローナル抗体は、癌の臨床
診断、免疫治療等の医学的分野での応用や癌特異抗原の
精製手段として利用ができる。また該ｃＤＮＡは、該ヒ
ト型モノクローナル抗体の、遺伝子工学的手法を用いた
工業的規模の大量生産に用いることができる。The human monoclonal antibody can be used in clinical diagnosis of cancer, in medical fields such as immunotherapy, and as a means for purifying a cancer-specific antigen. Further, the cDNA can be used for industrial-scale mass production of the human monoclonal antibody using a genetic engineering technique.

【０００３】[0003]

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】Kohl
er, G およびMilstein, K によるモノクローナル抗体作
成技術（Nature,Vol.256, p495-497, (1975) ）が開発
されて以来、肺ガンや血液のガンと言われる白血病細胞
を始めとする多くのガン細胞に対するマウス型モノクロ
ーナル抗体が作成されている。このような癌特異的とい
われているモノクローナル抗体の利用分野の中で最も期
待されているのは、これに抗ガン剤などを結合して体内
に投与しガンを治療する、いわゆるミサイル療法剤や、
あるいはガンマ線を放出する放射性同位元素で標識した
モノクローナル抗体を体内の癌病巣に集積させて癌の体
内診断を行うといった医学的分野である。[Prior Art and Problems to be Solved by the Invention] Kohl
er, G and Milstein, K monoclonal antibody production technology (Nature, Vol.256, p495-497, (1975)) has been developed since the development of many leukemia cells such as lung cancer and blood cancer. Mouse monoclonal antibodies against cancer cells have been created. The most promising fields of application of such monoclonal antibodies, which are said to be cancer-specific, are the so-called missile therapeutic agents, which bind anti-cancer agents and the like and administer them to the body to treat cancer. ,
Alternatively, it is a medical field in which a monoclonal antibody labeled with a radioisotope that emits gamma rays is accumulated in cancer lesions in the body to perform in-vivo diagnosis of cancer.

【０００４】用いるモノクローナル抗体がマウス型など
人体にとって異種タンパク質である場合にはこのマウス
型抗体に対するヒト抗体（Human anti-mouse antibody
: ＨＡＭＡ）が高頻度に産生されることが知られてい
る。このＨＡＭＡは投与したマウス型モノクローナル抗
体を不活化するばかりでなく、アレルギー反応を引き起
こす危険性を有する。この問題を回避するため、たとえ
ばマウス型抗体の抗原結合能を保持したままＨＡＭＡの
生成を引き起こす抗原性を除こうとする試みがされてい
るが、根本的な解決には至っていない。一方、ヒト型モ
ノクローナル抗体を用いる場合には、このような抗原性
の問題ははじめから考えられないため、マウス型より優
れている。When the monoclonal antibody used is a heterologous protein for the human body such as a mouse type, a human anti-mouse antibody against this mouse type antibody is used.
: HAMA) is frequently produced. This HAMA not only inactivates the mouse type monoclonal antibody administered, but also has a risk of causing an allergic reaction. In order to avoid this problem, for example, attempts have been made to remove the antigenicity that causes the formation of HAMA while retaining the antigen-binding ability of the mouse antibody, but the fundamental solution has not been reached. On the other hand, when a human type monoclonal antibody is used, such a problem of antigenicity is not considered from the beginning, and thus it is superior to the mouse type.

【０００５】マウス型モノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマを得ようとする時には、多くの場合、抗原
となる物質あるいは細胞などをマウスの体内に免疫する
ことによって、抗原に感作されたＢリンパ球を容易に得
ることができるので、これを用いて目的を達することが
できる。これに対して、倫理的及び保健的な理由から、
人体には積極的な免疫はできず、従って所望の特異性を
有するヒト型モノクローナル抗体を容易に得ることはで
きなかった。In order to obtain a hybridoma producing a mouse type monoclonal antibody, in many cases, a substance or cell serving as an antigen is immunized into the body of a mouse to facilitate B lymphocytes sensitized with the antigen. This can be used to achieve the purpose. On the other hand, for ethical and health reasons,
The human body cannot be positively immunized, and thus a humanized monoclonal antibody having a desired specificity cannot be easily obtained.

【０００６】本発明者らはこれまでの精力的な研究の結
果、上記のごとく取得するのが困難であるヒト型モノク
ローナル抗体を取得することに成功している（特公平4-
29357 ）。このヒト型モノクローナル抗体は、肺癌細胞
に対して特異的な反応性を有し、かつ正常細胞には反応
しないもので、さきに述べた医学的分野に応用する目的
には理想的な性質を持っている。しかしこの抗体は、胃
癌など肺癌以外の癌には反応しない。従って肺癌以外の
癌細胞にも広く反応し、かつ正常細胞に反応しないとい
う特異性を持つヒト型モノクローナル抗体が求められて
いた。As a result of energetic research so far, the present inventors have succeeded in obtaining a humanized monoclonal antibody which is difficult to obtain as described above (Japanese Patent Publication No.
29357). This human monoclonal antibody has specific reactivity to lung cancer cells and does not react to normal cells, and has ideal properties for the purpose of application in the medical field mentioned above. ing. However, this antibody does not react with cancers other than lung cancer such as gastric cancer. Therefore, there has been a demand for a humanized monoclonal antibody having specificity that it widely reacts with cancer cells other than lung cancer and does not react with normal cells.

【０００７】更に、特公平4-29357 に述べられているヒ
ト−ヒトハイブリドーマは、無血清培地中で抗体を安定
に産生し得ることから、安価で高純度のヒト型モノクロ
ーナル抗体を得ることができるが、工業的規模の大量生
産においてはより安定的で高産生性の抗体産生細胞が有
利である。Furthermore, since the human-human hybridoma described in Japanese Patent Publication No. 4-29357 can stably produce an antibody in a serum-free medium, an inexpensive and highly purified human monoclonal antibody can be obtained. However, more stable and high-producing antibody-producing cells are advantageous in industrial-scale mass production.

【０００８】また、一方で、遺伝子工学的手法はこれま
でインシュリンを初めとする種々の有用タンパク質を工
業的なスケールで大量に製造する技術を与えている。こ
の遺伝子工学的手法のモノクローナル抗体生産への応用
はモノクローナル抗体の染色体ＤＮＡ、あるいは相補性
ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を取得することに始まる。On the other hand, genetic engineering techniques have provided techniques for producing a large amount of various useful proteins such as insulin on an industrial scale. The application of this genetic engineering technique to the production of monoclonal antibodies begins with obtaining chromosomal DNA or complementary DNA (cDNA) of the monoclonal antibody.

【０００９】以下に、抗体（免疫グロブリン）のうち、
本発明に関連するヒトのＩｇＧの基本構造および遺伝子
について簡単に述べる。Among the antibodies (immunoglobulins) below,
The basic structure and gene of human IgG relevant to the present invention will be briefly described.

【００１０】ＩｇＧ分子は、分子量約51,000のポリペプ
チド鎖の重鎖および分子量約25,000のポリペプチド鎖の
短鎖それぞれ２本ずつから構成される。重鎖−軽鎖間お
よび重鎖−重鎖間はＳ−Ｓ結合によって連結されてい
る。重鎖および軽鎖のアミノ末端から約 100個のアミノ
酸配列は、抗原特異的であり、この領域によって抗原と
結合する。この領域を「可変領域」という。これに続く
領域は「定常領域」と呼ばれ、サブクラス毎に一定であ
り、それぞれ約 400個および約 150個のアミノ酸配列よ
り成る。重鎖の定常領域では、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ
３、Ｃγ４が、また軽鎖ではＣκ、Ｃλが知られてお
り、それぞれ重鎖はγ１鎖、γ２鎖、γ３鎖、γ４鎖で
軽鎖はκ鎖、λ鎖と呼ばれる。An IgG molecule is composed of two heavy chains each having a molecular weight of about 51,000 and two short chains each having a molecular weight of about 25,000. The heavy chain-light chain and the heavy chain-heavy chain are linked by SS bonds. Approximately 100 amino acid sequences from the amino terminus of the heavy and light chains are antigen-specific and this region binds antigen. This region is called a "variable region". The region that follows is called the "constant region," which is constant for each subclass and consists of about 400 and about 150 amino acid sequences, respectively. In the constant region of the heavy chain, Cγ1, Cγ2, Cγ
3, Cγ4, and Cκ and Cλ in the light chain are known. The heavy chain is called γ1 chain, γ2 chain, γ3 chain, γ4 chain, and the light chain is called κ chain and λ chain, respectively.

【００１１】ある特定のモノクローナル抗体はその重鎖
および軽鎖の可変領域がそれぞれある特定のアミノ酸配
列である均質な抗体分子の集団であり、モノクローナル
抗体毎に可変領域のアミノ酸配列が大きく異なる。可変
領域はさらに相補性決定領域群（ＣＤＲ；Complementar
ity determining region）とよばれる高可変領域（Hype
r variable region ）と、比較的共通性の高い枠組み残
基群（ＦＲ：Framework region）から成る。重鎖、軽鎖
にはそれぞれ３個のＣＤＲがあり、抗原結合部位は、重
鎖と軽鎖の折りたたみによって集まったＣＤＲによって
形成される。このためモノクローナル抗体の抗原結合の
特異性および結合強度は、おもにＣＤＲのアミノ酸配列
が規定している。A certain monoclonal antibody is a homogeneous population of antibody molecules in which the variable regions of the heavy and light chains have certain amino acid sequences, and the amino acid sequences of the variable regions differ greatly from monoclonal antibody to monoclonal antibody. The variable region is further composed of complementarity determining regions (CDRs).
Highly variable region (Hype)
r variable region) and a relatively common group of framework residues (FR). The heavy chain and the light chain each have three CDRs, and the antigen-binding site is formed by the CDRs assembled by the folding of the heavy chain and the light chain. Therefore, the antigen binding specificity and binding strength of the monoclonal antibody are mainly defined by the amino acid sequence of CDR.

【００１２】一方、可変領域は、重鎖ではＶ遺伝子、Ｄ
遺伝子、Ｊ遺伝子、軽鎖ではＶ遺伝子、Ｊ遺伝子にコー
ドされていることが知られている。ヒト重鎖ではＶ遺伝
子が100 個以下、Ｄ遺伝子が 6個、Ｊ遺伝子が12個、ヒ
トκ鎖ではＶ遺伝子が 100個以下、Ｊ遺伝子が 5個存在
する。Ｂ細胞の分化に伴って、重鎖ではＶ、Ｄ、Ｊの各
遺伝子群の中からそれぞれ任意の１つの遺伝子が再配列
により隣接し、可変領域に相当する遺伝子が形成され
る。軽鎖においても同様にＶ、Ｊ遺伝子の再配列によ
り、可変領域の遺伝子が形成される。On the other hand, the variable region is composed of V gene and D in the heavy chain.
It is known that genes, J genes, and light chains are encoded by V genes and J genes. There are 100 or less V genes, 6 D genes, 12 J genes in human heavy chains, and 100 or less V genes and 5 J genes in human κ chains. With the differentiation of B cells, any one gene in each of the V, D, and J gene groups is flanked by rearrangements in the heavy chain to form a gene corresponding to the variable region. Similarly in the light chain, rearrangement of the V and J genes forms a variable region gene.

【００１３】また定常領域をコードする遺伝子は、可変
領域遺伝子群の下流に位置している。この遺伝子は可変
領域遺伝子の組換えが終了すると可変領域遺伝子と連な
って発現され、重鎖および軽鎖のポリペプチドが生成さ
れる。The gene encoding the constant region is located downstream of the variable region gene group. When the recombination of the variable region gene is completed, this gene is expressed continuously with the variable region gene, and heavy and light chain polypeptides are produced.

【００１４】このような知見をもとに、ヒト型モノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマから抗体の可変領
域をコードする相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を迅速にクロ
ーニングする方法が開発された（James W. Larrick et
al., Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol.160, p.1
250-1256(1989)； James W. Larrick et al., Bio/Tech
nology, Vol.7, p.934-938(1989)）。Based on these findings, a method for rapidly cloning a complementary DNA (cDNA) encoding a variable region of an antibody from a hybridoma producing a human monoclonal antibody was developed (James W. Larrick et.
al. , Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol.160, p.1
250-1256 (1989); James W. Larrick et al. , Bio / Tech
nology, Vol.7, p.934-938 (1989)).

【００１５】[0015]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、癌細胞株
を用いたヒトリンパ球の生体外免疫法を発明し（特開平
4-281799：Kawahara,k. et al., Human Antibodies and
Hybridomas, Vol.3,p.8-13(1992)）、この方法を施し
たヒト末梢血リンパ球を親細胞と細胞融合することによ
って、ヒト癌細胞に反応し、かつヒト正常繊維芽細胞に
反応しないヒト型モノクローナル抗体を産生するヒト−
ヒトハイブリドーマを取得することに成功した。また該
ヒト−ヒトハイブリドーマより採取した伝令ＲＮＡ（ｍ
ＲＮＡ）をもとに作製した相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の
中から、該ヒト型モノクローナル抗体を構成する重鎖及
び軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡをそれぞれクロ
ーニングすることに成功した。さらにこれらのｃＤＮＡ
の塩基配列を解明すると共にアミノ酸配列を決定するこ
とにより本発明を完成した。The present inventors have invented an in vitro immunization method for human lymphocytes using a cancer cell line.
4-281799: Kawahara, k. Et al. , Human Antibodies and
Hybridomas, Vol.3, p.8-13 (1992)), by fusing human peripheral blood lymphocytes subjected to this method with parent cells, they react with human cancer cells and become human normal fibroblasts. Human producing non-reacting humanized monoclonal antibody-
We succeeded in obtaining a human hybridoma. In addition, a messenger RNA (m
From complementary DNA (cDNA) prepared based on (RNA), the cDNAs encoding the variable regions of the heavy chain and the light chain constituting the human monoclonal antibody were successfully cloned. Furthermore these cDNAs
The present invention has been completed by elucidating the nucleotide sequence of and the amino acid sequence.

【００１６】本発明はヒトの肺癌、乳癌、胃癌、大腸癌
の細胞株と反応し、ヒト正常繊維芽細胞株と反応せず、
またヒト肺癌組織と反応するヒト型モノクローナル抗体
および該モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域
のｃＤＮＡを提供する。The present invention reacts with human lung, breast, gastric and colon cancer cell lines and does not react with human normal fibroblast cell lines,
Also provided are human type monoclonal antibodies that react with human lung cancer tissues and cDNAs of the variable regions of the heavy and light chains of the monoclonal antibodies.

【００１７】また本発明は、抗体重鎖と軽鎖の可変領域
がそれぞれ図３および図４に記載のアミノ酸配列で表さ
れることを特徴とする抗体、およびかかるアミノ酸配列
をコードするＤＮＡを提供するものである。更に、遺伝
子工学的手法に供し得るものとして抗体のＣＤＲをコー
ドするＤＮＡを提供するものである。The present invention also provides an antibody characterized in that the variable regions of the antibody heavy and light chains are represented by the amino acid sequences shown in FIGS. 3 and 4, respectively, and a DNA encoding such an amino acid sequence. To do. Further, the present invention provides a DNA encoding the CDR of an antibody which can be subjected to a genetic engineering technique.

【００１８】本発明のヒト型モノクローナル抗体を産生
するヒト−ヒトハイブリドーマの一具体例として、平成
４年１０月３０日付で微工研（工業技術院微生物工業技
術研究所）に寄託したヒト−ヒトハイブリドーマＢＤ９
Ｄ１２（微工研菌寄第１３２３５号）を挙げることがで
きる。As one specific example of the human-human hybridoma producing the human type monoclonal antibody of the present invention, human-human deposited on the basis of October 30, 1992, at Microindustrial Research Institute (Institute of Industrial Science, Institute for Microbial Technology) Hybridoma BD9
D12 (Microtechnology Research Institute, No. 13235) can be mentioned.

【００１９】以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説
明する。The present invention will be specifically described below with reference to examples.

【００２０】[0020]

【実施例】【Example】

実施例１ヒト末梢血リンパ球の生体外免疫 生体外免疫を行う免疫原（抗原）としてＡ５４９細胞
（ヒト肺癌細胞株、ATCCCCL-185）を１０％ＦＣＳ（牛
胎児血清）を含有するＥＲＤＦ培地（極東製薬工業）
に、１×１０⁴ cells/mlの細胞密度に懸濁し、２４ウエ
ルプレートに１ｍｌずつ分注して、３６時間、３７℃で
培養した。一方、健康な人の末梢血からフィコール（フ
ァルマシア社製）によりリンパ球を分離し、ＥＲＤＦ培
地にて４回洗浄した。その後リンパ球密度を２×１０⁶
cells/mlに調製し、予めＡ５４９細胞の培養を行ってい
た上記２４ウエルプレートに0.5ml/well添加した。この
とき、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ，Calbiochem社
製）、インターロイキン２（ＩＬ−２，ゼンザイム社
製）およびインターロイキン６（ＩＬ−６，ゼンザイム
社製）を、培養液中の最終濃度がそれぞれ10μg/ml, 10
0U/ml, 10U/ml になるように添加した。さらに４日間培
養を行い、生体外免疫されたリンパ球を得た。Example 1 In vitro immunization of human peripheral blood lymphocytes ERDF medium containing A549 cells (human lung cancer cell line, ATCCCCL-185) as an immunogen (antigen) for in vitro immunization containing 10% FCS (fetal calf serum) ( Far East Pharmaceutical Industry)
Then, the cells were suspended at a cell density of 1 × 10 ⁴ cells / ml, dispensed in 1 ml portions into 24-well plates, and cultured at 37 ° C. for 36 hours. On the other hand, lymphocytes were separated from peripheral blood of a healthy person by Ficoll (Pharmacia) and washed four times with ERDF medium. After that, the lymphocyte density was set to 2 × 10 ^6.
The cells were prepared into cells / ml, and 0.5 ml / well was added to the above 24-well plate in which A549 cells were previously cultured. At this time, muramyl dipeptide (MDP, manufactured by Calbiochem), interleukin 2 (IL-2, manufactured by Zenzyme) and interleukin 6 (IL-6, manufactured by Zenzyme) were used at a final concentration of 10 μg in the culture solution. / ml, 10
It was added at 0 U / ml and 10 U / ml. The cells were further cultured for 4 days to obtain lymphocytes immunized in vitro.

【００２１】実施例２細胞融合によるハイブリドーマ作製 上記リンパ球（４×１０⁶ cells ）とヒト融合パートナ
ー細胞株Ａ₄ Ｈ₁₂（ヒトＴ細胞株ＭＯＬＴ−４を用い５
０μｇ／mlの６−チオグアニンを含む１０％ＦＣＳ添加
ＲＰＭＩ１６４０培地（大日本製薬）を選択培地として
作製したもの；２×１０⁶ cells ）を混合した後、４０
０×ｇ、５分間の遠心分離により混合した細胞を集め
た。遠心上清を除いた後、細胞のペレットに1 mlの５０
％ポリエチレングリコール４０００（Boeringer 社製）
を１分間かけて添加し、その後３７℃、１分間インキュ
ベートした。さらに１分間に１ｍｌの割合で９ｍｌのＥ
ＲＤＦ培地を添加した。４００×ｇ、５分間の遠心分離
を行って上清を捨てて、細胞を２０ｍｌのＥＲＤＦ培地
（１５％ＦＣＳ含有）に懸濁し、これを９６ウエルプレ
ートに播種した。培養は３７℃にて行い、融合細胞のみ
を選択する目的で、100mM ヒポキサンチン、0.4mM アミ
ノプテリン、および16mM チミジンのいわゆるＨＡＴを
含有する、１５％ＦＣＳ−ＥＲＤＦ培地を添加した。ハ
イブリドーマによって形成されるコロニーが、細胞融合
の日から１０日目に現れ始めた。Example 2 Preparation of hybridoma by cell fusion The above lymphocytes (4 × 10 ⁶ cells) and human fusion partner cell line A ₄ H ₁₂ (human T cell line MOLT-4 were used 5
10% FCS-added RPMI1640 medium (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) containing 0 μg / ml 6-thioguanine was prepared as a selective medium; 2 × 10 ⁶ cells) were mixed, and then 40
The mixed cells were collected by centrifugation at 0xg for 5 minutes. After removing the centrifugation supernatant, add 1 ml of 50 to the cell pellet.
% Polyethylene glycol 4000 (Boeringer)
Was added over 1 minute and then incubated at 37 ° C. for 1 minute. 9 ml of E at a rate of 1 ml per minute
RDF medium was added. After centrifugation at 400 × g for 5 minutes, the supernatant was discarded, the cells were suspended in 20 ml of ERDF medium (containing 15% FCS), and this was seeded in a 96-well plate. The culture was performed at 37 ° C., and for the purpose of selecting only the fused cells, 15% FCS-ERDF medium containing 100 mM hypoxanthine, 0.4 mM aminopterin, and 16 mM thymidine so-called HAT was added. Colonies formed by hybridomas began to appear 10 days after the day of cell fusion.

【００２２】実施例３癌細胞に反応するヒト型モノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニング ハイブリドーマの産生する抗体の反応性を、酵素免疫測
定法（enzyme-linkedimmunosorbent assay,ＥＬＩＳ
Ａ）を用いて調べた（Hulette, CM. et al., Tissue A
ntigens, Vol.30, p.25-33(1987) ）。Example 3 Production of human type monoclonal antibody reactive with cancer cells
Screening and cloning of hybridoma The reactivity of the antibody produced by the hybridoma is measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELIS).
(A)) (Hulette, CM. Et al. , Tissue A
ntigens, Vol.30, p.25-33 (1987)).

【００２３】以下に簡潔に述べる。A brief description will be given below.

【００２４】Ａ５４９細胞を培養用９６ウエルプレート
でコンフルエントになるまで１〜５日間培養した。培養
後、プレートの底に付着しているＡ５４９細胞を、０．
２％グルタルアルデヒドで固定し、抗体のプレートに対
する非特異的吸着を防ぐために、３％牛血清アルブミン
（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を
用いてブロッキングを施した。ＰＢＳでウェルを洗浄し
た後、ハイブリドーマの培養上清を加え、室温で３時間
インキュベートした。その後培養上清を捨て、ウェルを
ＰＢＳで３回洗浄した。次に５０倍希釈したペルオキシ
ダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Tago社製）をウェル
に入れ、３７℃で１時間インキュベートした。インキュ
ベート後、ウェルを３回洗浄した。ペルオキシダーゼの
基質溶液（0.003 ％ Ｈ₂ Ｏ₂ および0.3mg/ml p-2.2′
-azino-di(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)
diammonium salt を含有する0.1M citric acid buffer
(pH4.0)）をウェルに入れ、２０分間反応を行った。反
応終了後、各ウェルの４０５ｎｍの吸光度を測定した。
ハイブリドーマの培養上清に対する対照として、ヒト血
清ＩｇＧを用いた。２８８ウェルのハイブリドーマを調
べた結果、Ａ５４９細胞に強く反応する抗体を産生する
ハイブリドーマが１つ得られた。このハイブリドーマを
限界希釈法によってクローニングし、ＩｇＧタイプのモ
ノクローナル抗体を安定に生産するクローンを得た。A549 cells were cultured in a 96-well plate for culture for 1 to 5 days until they became confluent. After culturing, the A549 cells attached to the bottom of the plate were transferred to 0.
It was fixed with 2% glutaraldehyde and blocked with phosphate buffered saline (PBS) containing 3% bovine serum albumin (BSA) to prevent non-specific adsorption of antibody to the plate. After washing the well with PBS, the culture supernatant of the hybridoma was added and incubated at room temperature for 3 hours. Thereafter, the culture supernatant was discarded and the wells were washed 3 times with PBS. Then, a 50-fold diluted peroxidase-labeled goat anti-human IgG antibody (manufactured by Tago) was placed in the well and incubated at 37 ° C. for 1 hour. After incubation, the wells were washed 3 times. Substrate solution of peroxidase (0.003% H ₂ O ₂ and 0.3 mg / ml p-2.2 ′
-azino-di (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)
0.1M citric acid buffer containing diammonium salt
(pH 4.0)) was placed in the well and reacted for 20 minutes. After completion of the reaction, the absorbance at 405 nm of each well was measured.
Human serum IgG was used as a control for the hybridoma culture supernatant. As a result of examining the 288-well hybridoma, one hybridoma producing an antibody that strongly reacts with A549 cells was obtained. This hybridoma was cloned by the limiting dilution method to obtain a clone that stably produces an IgG type monoclonal antibody.

【００２５】実施例４モノクローナル抗体の癌細胞株および正常繊維芽細胞に
対する反応性 上記で得られたハイブリドーマを１×１０⁵ cells/mlの
細胞密度で、５％ＦＣＳ−ＥＲＤＦ培地に播種し、３７
℃、５日間培養することによって、モノクローナル抗体
を含む培養上清を得た。ヒトＩｇＧを測定するためのＥ
ＬＩＳＡによって培養上清中のモノクローナル抗体濃度
を測定したところ、２μｇ／ｍｌであった。この培養上
清を用いて該モノクローナル抗体の癌細胞株及び正常繊
維芽細胞に対する反応性を、実施例３に示したＥＬＩＳ
Ａによって測定した。その結果を表１に示す。これによ
り該モノクローナル抗体はＡ５４９細胞のみならず、そ
の他のヒトの肺癌細胞株や乳癌、胃癌、および大腸癌の
細胞株に反応し、正常繊維芽細胞には反応しなかった。
該モノクローナル抗体を産生するヒト−ヒトハイブリド
ーマをＢＤ９Ｄ１２と命名した。Example 4 Monoclonal Antibody in Cancer Cell Line and Normal Fibroblast
Reactivity with respect to the hybridoma obtained above was inoculated in a 5% FCS-ERDF medium at a cell density of 1 × 10 ⁵ cells / ml, and 37
By culturing at 5 ° C for 5 days, a culture supernatant containing a monoclonal antibody was obtained. E for measuring human IgG
When the concentration of the monoclonal antibody in the culture supernatant was measured by LISA, it was 2 μg / ml. Using the culture supernatant, the reactivity of the monoclonal antibody with respect to cancer cell lines and normal fibroblasts was determined by the ELIS shown in Example 3.
Measured by A. The results are shown in Table 1. As a result, the monoclonal antibody reacted not only with A549 cells but also with other human lung cancer cell lines, breast cancer, gastric cancer, and colon cancer cell lines, but not with normal fibroblasts.
The human-human hybridoma producing the monoclonal antibody was named BD9D12.

【００２６】また、該モノクローナル抗体を構成する短
鎖のサブクラスをＥＬＩＳＡによって調べたところ、κ
鎖であった。Further, when the short chain subclasses constituting the monoclonal antibody were examined by ELISA, κ
It was a chain.

【００２７】[0027]

【表１】 実施例５モノクローナル抗体の肺癌組織に対する反応性 ホルマリン固定後パラフィン抱埋されたヒト肺癌組織の
薄切をスライドグラスに張り付けた。このスライドグラ
スを、キシレンを用いて脱パラフィンを行い、９５％エ
タノール、８５％エタノール、７５％エタノールに順次
浸し、さらにＰＢＳに浸した。抗体の非特異的吸着を抑
える目的で、ヤギ血清（Vector社製、５６倍希釈）を癌
組織上にたらし、２５分間インキュベートした。次に実
施例４で得たＢＤ９Ｄ１２の培養上清を癌組織上にたら
し、室温で２時間インキュベートした。インキュベート
後、癌組織をＰＢＳで５分間、３回洗浄した。５０倍希
釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ta
go社製）を癌組織上にたらし、室温、１時間インキュベ
ートした。上記と同様に癌組織を洗浄し、ペルオキシダ
ーゼの基質となる0.5mg/ml ＤＡＢ（同仁化学製、Cat.
No.347-00904）および0.01％ Ｈ₂ Ｏ₂ を含む 50mM Tr
is-HCl (pH7.4)を用いて抗体の癌組織に対する反応性を
調べた。結果の判定は、癌組織の染色の度合を Negative (-) Weakly positive (+) Positive (++) Strongly positive (+++) の４段階に分けた。対照としたヒト血清ＩｇＧは調べた
全ての肺癌組織については(-) と判定された。ＢＤ９Ｄ
１２についての結果は、表２に示す。[Table 1] Example 5 Reactivity of Monoclonal Antibody to Lung Cancer Tissue A thin slice of human lung cancer tissue embedded in paraffin after being fixed with formalin was attached to a slide glass. The slide glass was deparaffinized using xylene, successively dipped in 95% ethanol, 85% ethanol and 75% ethanol, and further dipped in PBS. For the purpose of suppressing nonspecific adsorption of antibody, goat serum (manufactured by Vector, 56-fold diluted) was spread on the cancer tissue and incubated for 25 minutes. Next, the BD9D12 culture supernatant obtained in Example 4 was spread on the cancer tissue and incubated at room temperature for 2 hours. After the incubation, the cancer tissue was washed with PBS three times for 5 minutes. A 50-fold diluted peroxidase-labeled goat anti-human IgG antibody (Ta
go) was placed on the cancer tissue and incubated at room temperature for 1 hour. The cancer tissue was washed in the same manner as above, and 0.5 mg / ml DAB serving as a substrate for peroxidase (manufactured by Dojindo, Cat.
No.347-00904) and 0.01% H ₂ O ₂ in 50 mM Tr
The reactivity of the antibody with respect to the cancer tissue was examined using is-HCl (pH 7.4). To judge the results, the degree of staining of the cancer tissue was divided into four stages of Negative (-) Weakly positive (+) Positive (++) and Strongly positive (+++). Human serum IgG used as a control was judged as (-) for all the lung cancer tissues examined. BD9D
The results for 12 are shown in Table 2.

【００２８】[0028]

【表２】 実施例６ｍＲＮＡの調製 実施例４で得られたＢＤ９Ｄ１２細胞を１０％ＦＣＳ−
ＥＲＤＦ培地に５×１０⁵ cells/mlまでまきこんだ。２
日間培養の後、５×１０⁸ の細胞を得た。[Table 2] Example 6 Preparation of mRNA BD9D12 cells obtained in Example 4 were treated with 10% FCS-
Up to 5 × 10 ⁵ cells / ml was added to the ERDF medium. Two
After culture for 5 days, 5 × 10 ⁸ cells were obtained.

【００２９】細胞を４℃においてＰＢＳ（予め氷冷して
おく）で３回洗浄した（２０００×ｇ ５min.）。ま
ず、終濃度１％となるように 2-MercaptoethanolをGuan
idiumThiocyanate Bufferに添加した。これを５倍体積
の 2-Mercaptoethanol-Guanidium Thiocyanate Buffer
に懸濁し、シリンジに２３Ｇのニードルをつけたもので
吸ったり吐いたりし、粘性がなくなるまで破砕した。So
dium Lauryl Sarcosinate を終濃度０．５％で添加し、
よく撹拌した。室温で５，０００×ｇ，１０minの遠心
によって、不溶性の画分を取り除いた。上清を２３Ｇニ
ードルをつけたシリンジで吸い取り、透明な超遠心チュ
ーブの中の5.7M CsCl, 0.01M EDTA(pH7.5)のクッション
の上に静かに重層した。チューブの外にクッション上部
の位置をマークした。重量の補正は、Guanidium Thiocy
anate で行った。SW 50.1 Swing rotor を用い、２０
℃、４０，０００rpm ，２４Hourの条件で超遠心した。
遠心後、下から０．５ｃｍの位置にラインを引いた。パ
スツールピペットでクッションのレベルの上まで液を注
意深く取り除いた。新しいピペットで下の線のところま
で液を除き、残った液のちょうど上のレベルでチューブ
をカミソリで切断した。チューブの底をキムワイプのパ
ッドの上に置き、注意深く自動ピペッタで残った液を抜
いた。チューブを逆さまにし、残った液を完全に取り除
いた。チューブを上向きにしてＲＮＡのペレットがチュ
ーブの外に落ちてないことを確認した。ＣｓＣｌを取り
除くために、ＲＮＡペレットをEthanol で洗浄した。７
０％Ethanol （室温）をチューブの底に満たし、チュー
ブを逆さまにしてEthanol を捨てた。再びＲＮＡの存在
を確認した。ＲＮＡを室温で乾燥した。０．１％ＳＤＳ
を含むＴＥ（ｐＨ７．６）で、ディスポのチップを付け
た自動ピペッタでピペッティングすることによって、Ｒ
ＮＡを溶解した。ＲＮＡ溶液をエッペンドルフチューブ
にとった。遠心管の底は、２５μｌのＴＥで洗い、その
洗浄液もエッペンドルフチューブにとった。１５０μｌ
のＴＥ、３０μｌの３Ｍ Sodium Acetate(pH5.2)、０．
９ｍｌの氷冷Ethanol を添加した。混合した後、少なく
とも３０ min，０℃保存した。ペレットをEthanol で洗
浄し、再度わずかに遠心した。そして、空気中で乾燥さ
せた。ＲＮＡを１ｍｌのＴＥに溶解し、３倍体積のEtha
nol を添加し、小分けして必要なときまで−７０℃で保
存した。以上の結果、４mgのＲＮＡを抽出することがで
きた。The cells were washed 3 times with PBS (previously ice-cooled) at 4 ° C. (2000 × g 5 min.). First, Guan the 2-Mercaptoethanol to a final concentration of 1%
Added to idium Thiocyanate Buffer. Add 5 volumes of 2-Mercaptoethanol-Guanidium Thiocyanate Buffer
Suspended in, and sucked and exhaled with a syringe equipped with a 23G needle, and crushed until the viscosity disappeared. So
dium Lauryl Sarcosinate was added at a final concentration of 0.5%,
Stir well. The insoluble fraction was removed by centrifugation at 5,000 xg for 10 minutes at room temperature. The supernatant was sucked up with a syringe equipped with a 23G needle, and gently layered on a cushion of 5.7M CsCl, 0.01M EDTA (pH 7.5) in a transparent ultracentrifuge tube. The top of the cushion was marked on the outside of the tube. Weight compensation is Guanidium Thiocy
I went with anate. 20 by using SW 50.1 Swing rotor
Ultracentrifugation was carried out under the conditions of 40,000 rpm and 24 hours.
After centrifugation, a line was drawn from the bottom at a position of 0.5 cm. The fluid was carefully removed with a Pasteur pipette to above the level of the cushion. The liquid was removed to the bottom line with a new pipette and the tube was cut with a razor just above the remaining liquid. The bottom of the tube was placed on a Kimwipe pad and the remaining liquid was carefully drained with an automatic pipettor. The tube was inverted and the remaining liquid was completely removed. Check that the RNA pellet did not fall outside the tube with the tube facing up. The RNA pellet was washed with Ethanol to remove CsCl. 7
The bottom of the tube was filled with 0% Ethanol (room temperature), the tube was inverted and the Ethanol was discarded. The presence of RNA was confirmed again. RNA was dried at room temperature. 0.1% SDS
With TE (pH 7.6) containing R, by pipetting with an automatic pipettor equipped with a disposable tip, R
NA was dissolved. The RNA solution was taken in an Eppendorf tube. The bottom of the centrifuge tube was washed with 25 μl of TE, and the washing solution was also transferred to an Eppendorf tube. 150 μl
TE, 30 μl of 3M Sodium Acetate (pH 5.2), 0.
9 ml ice cold Ethanol was added. After mixing, store at 0 ° C. for at least 30 min. The pellet was washed with Ethanol and centrifuged again briefly. Then, it was dried in air. Dissolve RNA in 1 ml TE and add 3 volumes of Etha
Nol was added, aliquoted and stored at -70 ° C until needed. As a result, 4 mg of RNA could be extracted.

【００３０】spun column をよく振って、 oligo（ｄ
Ｔ）−cellulose をよく懸濁した。カラムの下のキャッ
プを外し、それから上のキャップを外した。カラムを１
５ｍｌの遠心管にセットし、保存用緩衝液をドレーンし
た。High−salt buffer を１ｍｌ添加し、重力でドレー
ンした（２回）。遠心管の底に溜った液を捨て、またカ
ラムを遠心管にセットした。Shake the spun column well to remove oligo (d
T) -cellulose was well suspended. The bottom cap of the column was removed and then the top cap was removed. Column 1
It was set in a 5 ml centrifuge tube and the storage buffer was drained. 1 ml of High-salt buffer was added, and drained by gravity (twice). The liquid accumulated at the bottom of the centrifuge tube was discarded, and the column was set in the centrifuge tube.

【００３１】ＲＮＡサンプルを１．０ｍｌのＴＥ（ｐＨ
７．４）に溶解し、６５℃、５min処理した。この時、
ＲＮＡが完全に溶解していることを確認した。また、El
ution bufferを６５℃に保温しておいた。サンプルを氷
冷し、sample buffer を０．２ｍｌ加え、穏やかに撹拌
した。サンプルを調製済みのカラムの上にのせ、重力で
溶出させた。１４００ｒｐｍ（ｒ＝１６５）２min 遠心
した。High−salt buffer を０．２５ｍｌカラムに添加
し、遠心した（２回）。 Low−salt buffer ０．２５ｍ
ｌでカラムを洗浄した（３回）。遠心管の底に溜ったbu
fferを捨て、滅菌したエッペンドルフチューブを遠心管
にセットし、さらにカラムの溶出口がエッペンドルフチ
ューブの中に入るようにしてカラムを遠心管にセットし
た。ｐｏｌｙ（Ａ）⁺ ＲＮＡを溶出するために、６５℃
に保温しておいた Elution buffer ０．２５ｍｌで４回
カラムを洗浄した。遠心管からカラムを取り除き、それ
から乾熱したピンセットでエッペンドルフチューブを取
り出しすぐに氷冷した。１／１０ ｖｏｌ．の３Ｍ So
dium Acetateを添加し、その２．５〜３ ｖｏｌ．のEt
hanol を添加し、−８０℃に保存した。The RNA sample was treated with 1.0 ml TE (pH
It was dissolved in 7.4) and treated at 65 ° C. for 5 minutes. At this time,
It was confirmed that RNA was completely dissolved. Also, El
The ution buffer was kept warm at 65 ° C. The sample was ice-cooled, 0.2 ml of sample buffer was added, and the mixture was gently stirred. The sample was loaded onto the prepared column and eluted by gravity. It was centrifuged at 1400 rpm (r = 165) for 2 minutes. High-salt buffer was added to a 0.25 ml column and centrifuged (twice). Low-salt buffer 0.25m
The column was washed with 1 (3 times). Bu collected at the bottom of the centrifuge tube
The ffer was discarded, a sterilized Eppendorf tube was set in the centrifuge tube, and the column was set in the centrifuge tube so that the eluent of the column entered the Eppendorf tube. 65 ° C to elute poly (A) ⁺ RNA
The column was washed 4 times with 0.25 ml of Elution buffer that had been kept warm. The column was removed from the centrifuge tube, and the Eppendorf tube was taken out with dry tweezers and immediately cooled with ice. 1/10 vol. 3M So
dium Acetate was added, and 2.5 to 3 vol. Et
Hanol was added and the mixture was stored at -80 ° C.

【００３２】その結果、２００μｇのｍＲＮＡを得るこ
とができた。このｍＲＮＡを、電気泳動したところ、ｒ
ＲＮＡは分解されておらず、５ｋｂ以上のｍＲＮＡも確
認できた。また、in vitro translationの結果、軽鎖遺
伝子が含まれることが確認できた。このｍＲＮＡを用い
てｃＤＮＡ合成を行うことにした。As a result, 200 μg of mRNA could be obtained. When this mRNA was electrophoresed, r
RNA was not degraded, and mRNA of 5 kb or more was also confirmed. As a result of in vitro translation, it was confirmed that the light chain gene was included. It was decided to perform cDNA synthesis using this mRNA.

【００３３】実施例７ファーストストランドｃＤＮＡの合成 Water Bath（４２．１２℃）の準備をし、Ｋｉｔ（ｃＤ
ＮＡ合成システムプラス（Ａｍｅｒｓｈａｍ））の酵素
以外の試薬及びｍＲＮＡを溶解し、氷冷した。酵素は使
用の直前まで−２０℃に保存しておいた。以下の試薬を
順番に加えた。Example 7 Synthesis of first-strand cDNA Prepare a water bath (42.12 ° C.) and use Kit (cD
Reagents other than the enzyme of the NA synthesis system plus (Amersham) and mRNA were dissolved and ice-cooled. The enzyme was stored at -20 ° C until just before use. The following reagents were added in order.

【００３４】 ５×ファーストストランド合成反応用ｂｕｆｆｅｒ １０．０μｌ ピロリン酸ナトリウム溶液 ２．５μｌ ヒト胎盤リボヌクレースインヒビター ２．５μｌ デオキシヌクレオタイド三リン酸混液 ５．０μｌ オリゴ（ｄＴ）プライマー ２．５μｌ ｍＲＮＡ（ｉｎ ｗａｔｅｒ） １７．５μｌ Ｔｏｔａｌ ４０．０μｌ 逆転写酵素 １０．０μｌ Ｔｏｔａｌ ５０．０μｌ 静かに混和し、混液を遠心によって遠心管の底に集め
た。ｍＲＮＡ １μｇ当たり２０ｕｎｉｔｓの逆転写酵
素を添加、混和し、４２℃、４０min インキュベートし
た。尚、温度は厳密に４２℃にし、時間に関しては４０
min よりもあまり長くしてはならない。インキュベート
後、直ちに氷冷した。その後、−２０℃に保存した。長
期保存するときには、−８０℃に保存した。Buffer for 5 × First Strand Synthesis Reaction 10.0 μl Sodium Pyrophosphate Solution 2.5 μl Human Placental Ribonucleose Inhibitor 2.5 μl Deoxynucleotide Triphosphate Mixture 5.0 μl Oligo (dT) Primer 2.5 μl mRNA ( in water) 17.5 μl Total 40.0 μl reverse transcriptase 10.0 μl Total 50.0 μl Gently mixed and the mixture was collected by centrifugation at the bottom of the centrifuge tube. 20 units of reverse transcriptase was added to 1 μg of mRNA, mixed, and incubated at 42 ° C. for 40 min. The temperature is strictly set to 42 ° C and the time is set to 40 ° C.
It should not be much longer than min. Immediately after the incubation, it was cooled on ice. Then, it preserve | saved at -20 degreeC. For long-term storage, it was stored at -80 ° C.

【００３５】実施例８ＰＣＲ法による抗体可変領域ｃＤＮＡの増幅 抗体可変領域を挟み込むプライマーＬＳ−４，ＬＣ−８
を作製し、ＰＣＲ法により軽鎖可変領域遺伝子の増幅を
試みた。ＬＳ−４は、ＡＴＧ開始コドンを含む、配列の
よく保存されたシグナルペプタイドをもとに、ＬＣ−８
は、配列既知の定常領域を基に作製した。これらプライ
マーを用いて抗体可変領域を特異的に増幅した。重鎖は
プライマーＨＳ−１，２，３及びＰ−７を用いて同様に
ＰＣＲ法により増幅を試みた。ＨＳ−１，２，３は、シ
グナルペプタイド、Ｐ−７は定常領域を基に作製され
た。以下の試薬を順番に加えて反応を行った。Example 8 Amplification of cDNA of antibody variable region by PCR method Primers LS-4 and LC-8 sandwiching antibody variable region
Was prepared and an attempt was made to amplify the light chain variable region gene by the PCR method. LS-4 is based on a well-conserved signal peptide containing the ATG start codon, LC-8.
Was prepared based on the constant region of known sequence. The antibody variable region was specifically amplified using these primers. The heavy chain was similarly amplified by the PCR method using the primers HS-1, 2, 3 and P-7. HS-1, 2, and 3 were produced based on the signal peptide, and P-7 was produced based on the constant region. The following reagents were added in order to carry out the reaction.

【００３６】 ｗａｔｅｒ １０．６μｌ １０×ＰＣＲ反応用ｂｕｆｆｅｒ ２．０μｌ デオキシヌクレオタイド三リン酸混液 ３．３μｌ プライマー（＋） １．０μｌ プライマー（−） １．０μｌ ファーストストランドｃＤＮＡ ２．０μｌ Ｔａｑ ポリメレース ０．１μｌ Ｔｏｔａｌ ２０．０μｌ ＰＣＲは９４℃ １min 、５５℃ ２min ，７２℃ ３
min の反応温度で３０サイクル行った。Water 10.6 μl Buffer for 10 × PCR 2.0 μl Deoxynucleotide triphosphate mixed solution 3.3 μl Primer (+) 1.0 μl Primer (−) 1.0 μl First strand cDNA 2.0 μl Taq Polymerase 0. 1 μl Total 20.0 μl PCR was performed at 94 ° C. for 1 min, 55 ° C. for 2 min, 72 ° C. 3
Thirty cycles were performed at a reaction temperature of min.

【００３７】その結果、約４５０ｂｐの予想されたサイ
ズの増幅断片が認められた。このことから抗体可変領域
のｃＤＮＡが特異的に増幅されたものと考えた。この増
幅断片に関して、塩基配列決定することにした。As a result, an amplified fragment of the expected size of about 450 bp was observed. From this, it was considered that the cDNA of the antibody variable region was specifically amplified. It was decided to determine the base sequence of this amplified fragment.

【００３８】実施例９増幅断片のサブクローニング 増幅断片に挿入してある制限酵素部位を用いて、ｐＵＣ
１１９シークエンスベクターのＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ I
IIにサブクローニングした。増幅断片は１．５％アガロ
ースゲル電気泳動によって、分離され、グラスビーズを
用いて抽出され、ＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ III処理した。
一方、ベクターである、ｐＵＣ１１９もＥｃｏＲＩ−Ｈ
ｉｎｄ III処理し、制限酵素処理した増幅断片ととも
に、除タンパクを行った後、ライゲーションした。宿主
をＭＶ１１８４として形質転換を行った。Example 9 Subcloning of Amplified Fragment Using the restriction enzyme sites inserted in the amplified fragment, pUC
119 of the sequence vector Eco RI- Hin d I
Subcloned into II. The amplified fragment of 1.5% agarose gel electrophoresis, separated, extracted with glass beads, and Eco RI- Hin d III process.
On the other hand, the vector, pUC119, is also Eco RI- H.
in d III treated, amplified fragment with that restriction enzyme treatment, after deproteinization, were ligated. Transformation was performed using MV1184 as the host.

【００３９】その結果、挿入断片を含むもののが約５０
％得られた。これらについてアルカリラピッド法を用い
てサイズ確認したところ、３２クローン中３０クローン
に目的サイズと思われるプラスミドがみられた。このう
ちの、１２クローンに関して、アルカリＳＤＳ法によっ
て、挿入断片のサイズ確認を行った。その結果１２クロ
ーンすべてが目的サイズの断片を含んでいた。このうち
の、４クローンに関して、一本鎖ＤＮＡを調製して、塩
基配列決定を行った。As a result, about 50 clones contained the insert fragment.
% Obtained. When the size of each of these clones was confirmed using the alkaline rapid method, 30 clones out of 32 clones had a plasmid that was considered to be the target size. Of the 12 clones among these, the size of the inserted fragment was confirmed by the alkaline SDS method. As a result, all 12 clones contained fragments of the desired size. For these 4 clones, single-stranded DNA was prepared and the nucleotide sequence was determined.

【００４０】実施例１０塩基配列決定のための一本鎖ＤＮＡ配列 挿入断片のサイズを確認した後、ヘルパーファージＭ１
３ＫＯ７を用いて一本鎖を調製した。Example 10 After confirming the size of a single-stranded DNA sequence insert for nucleotide sequencing , the helper phage M1
Single strands were prepared with 3KO7.

【００４１】ＭＶ１１８４（pUC119−Insert）を、２×
ＹＴ（１５０μｇ／ｍｌ Ampicillinを含む）で前培養
した。前培養液３０μｌに、ヘルパーファージＭ１３Ｋ
０７液（＞１０１０ｐｆｕ／ｍｌ）３０μｌを加え、３
７℃で３０ min静置した。３７℃に温めておいた２×Ｙ
Ｔ ｂｒｏｔｈ（１５０μｇ／ｍｌ Ampicillin，７０
μｇ／ｍｌ Kanamycin ，０．０１％ thiamineを含
む。）を３ｍｌ加えた。３７℃で１４〜１８時間培養し
た。（この時、ヘルパーファージ液の調製と同様に、な
るべく通気性のよい条件で培養した。）培養液をミクロ
遠心管に移し、遠心分離にて菌体を取り除き、上清を別
のミクロ遠心管にとった。培養上清１ｍｌに対して２０
０μｌのＰＥＧ−ＮａＣｌ溶液を加え、よく混合し、１
５ min室温においた。遠心分離上清を除いた。濾紙等で
完全にＰＥＧ−ＮａＣｌ溶液を取り除いた。沈澱を１０
０μｌのTE-buffer で完全に溶解させた。ＴＥ飽和Phen
olを５０μｌ添加し、約１０ｓｅｃ振盪し、約１０ min
放置した。クロロホルム：イソアミルアルコールを５０
μｌ添加し、約１０ｓｅｃ振盪した。５ min遠心後水層
（上層）を別のミクロ遠心管に移した。１０μｌの３Ｍ
Sodium Acetateを添加し、２５０μｌのcold Ethanol
を加え混和後、−７０℃で５ min放置した。長期保存す
る場合はこの状態で置いておいた。５ min遠心し、沈澱
を７０％ Ethanol で洗浄した。再遠心し、上清を除き
減圧乾燥した。TE−buffer ５０μｌに沈澱を溶かし、
−２０℃に保存した。MV1184 (pUC119-Insert) was added to 2 ×
Precultured with YT (containing 150 μg / ml Ampicillin). Helper phage M13K was added to 30 μl of the preculture medium.
Add 30 μl of solution 07 (> 1010 pfu / ml) and add 3
It was left still at 7 ° C for 30 min. 2 x Y warmed to 37 ° C
T broth (150 μg / ml Ampicillin, 70
It contains μg / ml Kanamycin and 0.01% thiamine. ) Was added. It was cultured at 37 ° C. for 14 to 18 hours. (At this time, like the preparation of the helper phage solution, it was cultivated under conditions with good air permeability.) The culture solution was transferred to a microcentrifuge tube, the bacterial cells were removed by centrifugation, and the supernatant was put into another microcentrifuge tube. I took it. 20 for 1 ml of culture supernatant
Add 0 μl PEG-NaCl solution, mix well,
Placed at room temperature for 5 min. The centrifugation supernatant was removed. The PEG-NaCl solution was completely removed with a filter paper or the like. 10 precipitation
It was completely dissolved in 0 μl of TE-buffer. TE saturated Phen
Add 50 μl of ol, shake for about 10 sec, about 10 min
I left it. Chloroform: Isoamyl alcohol 50
μl was added, and the mixture was shaken for about 10 seconds. After centrifugation for 5 min, the aqueous layer (upper layer) was transferred to another microcentrifuge tube. 10 μl of 3M
Add Sodium Acetate and add 250 μl cold Ethanol
After mixing, the mixture was allowed to stand at -70 ° C for 5 min. It was left in this state for long-term storage. After centrifugation for 5 min, the precipitate was washed with 70% Ethanol. The solution was re-centrifuged, the supernatant was removed, and the residue was dried under reduced pressure. Dissolve the precipitate in 50 μl of TE-buffer,
Stored at -20 ° C.

【００４２】実施例１１塩基配列決定 塩基配列決定は、Taq Polymerase, Sequenase, Klenow
Fragment等の酵素を用いて行ったが、Taq Polymerase及
びSequenase を用いたとき、きれいなバンドパターンが
みられた。また、Klenow Fragment を用いた場合にはフ
ルストップがみられた。Taq Polymeraseに比べよりバン
ドのシグナルが均一であるSequenase について今回その
塩基配列決定方法を示した。Example 11 Nucleotide Sequence Determination Nucleotide sequence determination was carried out by Taq Polymerase, Sequenase, Klenow
When an enzyme such as Fragment was used, a clean band pattern was observed when Taq Polymerase and Sequenase were used. In addition, a full stop was observed when Klenow Fragment was used. This time, we showed the method for determining the nucleotide sequence of Sequenase, which has a more uniform band signal than Taq Polymerase.

【００４３】シークエンス反応 ０．５ｍｌチューブの中でアニーリング及びラベリング
を行った。Sequencing reaction Annealing and labeling were performed in a 0.5 ml tube.

【００４４】１．アニーリング Ｐｒｉｍｅｒ １μｌ ５×Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ ２μｌ ＤＮＡ（約１μｇ） ７μｌ チューブのキャップをして、６５℃で２min インキュベ
ートした後、３０min 以上かけて室温に戻した。1. Annealing Primer 1 μl 5 × Sequenase Buffer 2 μl DNA (about 1 μg) 7 μl After capping the tube and incubating at 65 ° C. for 2 min, it was returned to room temperature over 30 min.

【００４５】 ２．ラベリング ＤＴＴ ０．１Ｍ １．０μｌ Ｄｉｌｕｔｅｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｍｉｘ ２．０μｌ ［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰ ０．５μｌ Ｄｉｌｕｔｅｄ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ２．０μｌ ３．ターミネーション ４本のチューブにＧ．Ａ．Ｔ．Ｃと記入し、それぞれの
チューブにTermination Mix ２．５μｌをいれた。2. Labeling DTT 0.1M 1.0 μl Diluted Labeling Mix 2.0 μl [α- ³² P] dCTP 0.5 μl Diluted Sequenase 2.0 μl 3. Termination G. 4 tubes. A. T. Enter C and add 2.5 μl of Termination Mix to each tube.

【００４６】１．のアニーリングが終ったら、溶液を
２．の反応液に加え、穏やかに撹拌の後、３．５μｌず
つ３．のチューブに、液が混ざらないように注意しなが
ら、チューブの縁につけた。室温で５min インキュベー
トし、遠心によって液を混ぜた。もう一度液を混和し、
３７℃で５min インキュベートした。各Termination 反
応液に、 Stop Solution ４μｌを加えて、十分混和
し、Sequencing Gelにロードする用意ができるまで氷冷
した。用意が整ったら、試料を７５〜８０℃で２min 加
熱し、その後、４μｌずつＧｅｌにロードした。５０Ｖ
／ｃｍで電気泳動を行った。泳動後、ゲルドライヤーを
用いて、ゲルをよく乾燥させ、オートラジオグラフィー
を行った。1. When the annealing of 2 is completed, add the solution to 2. 3. After gently adding to the reaction solution of 3., 3.5 μl each 3. The tube was attached to the edge of the tube, being careful not to mix the liquid. After incubating at room temperature for 5 minutes, the solution was mixed by centrifugation. Mix the liquid again,
Incubated at 37 ° C for 5 min. 4 μl of Stop Solution was added to each Termination reaction solution, mixed well, and cooled on ice until ready to be loaded on a Sequencing Gel. When ready, the sample was heated at 75-80 ° C. for 2 min and then loaded in 4 μl aliquots on the Gel. 50V
Electrophoresis was performed at / cm. After the electrophoresis, the gel was thoroughly dried using a gel dryer and autoradiography was performed.

【００４７】その結果、図２に示されるような、本発明
抗体軽鎖をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列が得
られた。このヌクレオチド配列を翻訳することによっ
て、該抗体軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を解明し、図
４に示した。As a result, a nucleotide sequence of cDNA encoding the light chain of the antibody of the present invention as shown in FIG. 2 was obtained. By translating this nucleotide sequence, the amino acid sequence of the variable region of the antibody light chain was elucidated and shown in FIG.

【００４８】図４に示したアミノ酸配列を、既知のヒト
型抗体のアミノ酸配列データのリスト（Elvin A.Kabat
et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INT
EREST, FOURTH EDITION, U.S. DEPARTMENT OF HEALTH A
ND HUMAN SERVICES, PublicHealth Service, National
Institute of Health(1987)）と比較することにより、
該抗体軽鎖が、κ鎖のサブグループ１〜４の分類のうち
のサブグループ１に属すると判定した。さらに、３つの
ＣＤＲを挟む位置に存在する４つのＦＲのアミノ酸は配
列が、サブグループ毎に大略において保存されているこ
とから、図１４、図１５および図１６に示したアミノ酸
配列が、それぞれ該抗体軽鎖のＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２
及びＣＤＲ−３であると決定した。これにより該抗体軽
鎖のＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２及びＣＤＲ−３をコードす
るヌクレオチド配列は、それぞれ図８、図９及び図１０
で表されることが明白となった。The amino acid sequence shown in FIG. 4 is a list of amino acid sequence data of known human antibodies (Elvin A. Kabat
et al. , SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INT
EREST, FOURTH EDITION, US DEPARTMENT OF HEALTH A
ND HUMAN SERVICES, PublicHealth Service, National
By comparing with Institute of Health (1987),
The antibody light chain was determined to belong to subgroup 1 of subgroups 1 to 4 of kappa chain. Furthermore, since the sequences of the four FR amino acids existing at the positions sandwiching the three CDRs are generally conserved in each subgroup, the amino acid sequences shown in FIGS. 14, 15 and 16 are CDR-1 and CDR-2 of antibody light chain
And CDR-3. Accordingly, the nucleotide sequences encoding CDR-1, CDR-2 and CDR-3 of the antibody light chain are shown in FIG. 8, FIG. 9 and FIG. 10, respectively.
It became clear that it is represented by.

【００４９】以上の操作を本発明抗体の重鎖についても
実施し、夫々の配列を決定した。The above operation was carried out for the heavy chain of the antibody of the present invention, and the respective sequences were determined.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】本発明抗体の重鎖の可変領域をコードするヌク
レオチド配列。FIG. 1 is a nucleotide sequence encoding the variable region of the heavy chain of the antibody of the present invention.

【図２】本発明抗体の軽鎖の可変領域をコードするヌク
レオチド配列。FIG. 2 is a nucleotide sequence encoding the variable region of the light chain of the antibody of the present invention.

【図３】本発明抗体の重鎖の可変領域を構成するアミノ
酸配列。FIG. 3 is an amino acid sequence constituting the variable region of the heavy chain of the antibody of the present invention.

【図４】本発明抗体の軽鎖の可変領域を構成するアミノ
酸配列。FIG. 4 is an amino acid sequence constituting the variable region of the light chain of the antibody of the present invention.

【図５】本発明抗体の重鎖のＣＤＲ−１をコードするヌ
クレオチド配列。FIG. 5 is a nucleotide sequence encoding CDR-1 of the heavy chain of the antibody of the present invention.

【図６】本発明抗体の重鎖のＣＤＲ−２をコードするヌ
クレオチド配列。FIG. 6 is a nucleotide sequence encoding CDR-2 of the heavy chain of the antibody of the present invention.

【図７】本発明抗体の重鎖のＣＤＲ−３をコードするヌ
クレオチド配列。FIG. 7 is a nucleotide sequence encoding CDR-3 of the heavy chain of the antibody of the present invention.

【図８】本発明抗体の軽鎖のＣＤＲ−１をコードするヌ
クレオチド配列。FIG. 8 is a nucleotide sequence encoding CDR-1 of the light chain of the antibody of the present invention.

【図９】本発明抗体の軽鎖のＣＤＲ−２をコードするヌ
クレオチド配列。FIG. 9 is a nucleotide sequence encoding CDR-2 of the light chain of the antibody of the present invention.

【図１０】本発明抗体の軽鎖のＣＤＲ−３をコードする
ヌクレオチド配列。FIG. 10 is a nucleotide sequence encoding CDR-3 of the light chain of the antibody of the present invention.

【図１１】本発明抗体の重鎖のＣＤＲ−１を構成するア
ミノ酸配列。FIG. 11 is an amino acid sequence constituting CDR-1 of the heavy chain of the antibody of the present invention.

【図１２】本発明抗体の重鎖のＣＤＲ−２を構成するア
ミノ酸配列。FIG. 12 is an amino acid sequence constituting CDR-2 of the heavy chain of the antibody of the present invention.

【図１３】本発明抗体の重鎖のＣＤＲ−３を構成するア
ミノ酸配列。FIG. 13 is an amino acid sequence constituting CDR-3 of the heavy chain of the antibody of the present invention.

【図１４】本発明抗体の軽鎖のＣＤＲ−１を構成するア
ミノ酸配列。FIG. 14 is an amino acid sequence constituting CDR-1 of the light chain of the antibody of the present invention.

【図１５】本発明抗体の軽鎖のＣＤＲ−２を構成するア
ミノ酸配列。FIG. 15 is an amino acid sequence constituting CDR-2 of the light chain of the antibody of the present invention.

【図１６】本発明抗体の軽鎖のＣＤＲ−３を構成するア
ミノ酸配列。FIG. 16 is an amino acid sequence constituting CDR-3 of the light chain of the antibody of the present invention.

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─────────────────────────────────────────────────── ───

【手続補正書】[Procedure amendment]

【提出日】平成５年３月４日[Submission date] March 4, 1993

【手続補正１】[Procedure Amendment 1]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】００２７[Name of item to be corrected] 0027

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction content]

【００２７】[0027]

【表１】 実施例５モノクローナル抗体の肺癌組織に対する反応性 ホルマリン固定後パラフィン抱埋されたヒト肺癌組織の
薄切をスライドグラスに張り付けた。このスライドグラ
スを、キシレンを用いて脱パラフィンを行い、９５％エ
タノール、８５％エタノール、７５％エタノールに順次
浸し、さらにＰＢＳに浸した。抗体の非特異的吸着を抑
える目的で、ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ社製、５６倍希
釈）を癌組織上にたらし、２５分間インキュベートし
た。次に実施例４で得たＢＤ９Ｄ１２の培養上清を癌組
織上にたらし、室温で２時間インキュベートした。イン
キュベート後、癌組織をＰＢＳで５分間、３回洗浄し
た。５０倍希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩ
ｇＧ抗体（Ｔａｇｏ社製）を癌組織上にたらし、室温、
１時間インキュベートした。上記と同様に癌組織を洗浄
し、ペルオキシダーゼの基質となる０．５ｍｇ／ｍｌ
ＤＡＢ（同仁化学製、ｃａｔ．Ｎｏ．３４７−００９０
４）および０．０１％ Ｈ_２Ｏ_２を含む５０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を用いて抗体の癌組織に対す
る反応性を調べた。結果の判定は、癌組織の染色の度合
を Ｎｅｇａｔｉｖｅ （−） Ｗｅａｋｌｙ ｐｏｓｉｔｉｖｅ （＋） Ｐｏｓｉｔｉｖｅ （＋＋） Ｓｔｒｏｎｇｌｙ ｐｏｓｉｔｉｖｅ （＋＋＋） の４段階に分けた。対照としたヒト血清ＩｇＧは調べた
全ての肺癌組織については（−）と判定された。ＢＤ９
Ｄ１２についての結果は、表２に示す。[Table 1] Example 5 Reactivity of Monoclonal Antibody to Lung Cancer Tissue A thin slice of human lung cancer tissue embedded in paraffin after being fixed with formalin was attached to a slide glass. The slide glass was deparaffinized using xylene, successively dipped in 95% ethanol, 85% ethanol and 75% ethanol, and further dipped in PBS. For the purpose of suppressing nonspecific adsorption of antibody, goat serum (manufactured by Vector, 56-fold diluted) was spread on the cancer tissue and incubated for 25 minutes. Next, the BD9D12 culture supernatant obtained in Example 4 was spread on the cancer tissue and incubated at room temperature for 2 hours. After the incubation, the cancer tissue was washed with PBS three times for 5 minutes. Peroxidase-labeled goat anti-human I diluted 50 times
gG antibody (manufactured by Tago) was spread on the cancer tissue,
Incubated for 1 hour. The cancer tissue was washed in the same manner as described above, and 0.5 mg / ml serving as a substrate for peroxidase
DAB (manufactured by Dojindo, cat. No. 347-0090)
4) and 50 mM Tri containing 0.01% H ₂ O _2.
The reactivity of the antibody with respect to the cancer tissue was examined using s-HCl (pH 7.4). For the determination of the results, the degree of staining of the cancer tissue was divided into four stages of Negative (−) Weakly positive (+) Positive (++) Strong positive (+++). The control human serum IgG was judged as (-) for all the lung cancer tissues examined. BD9
The results for D12 are shown in Table 2.

【手続補正２】[Procedure Amendment 2]

【補正対象書類名】図面[Document name to be corrected] Drawing

【補正対象項目名】図８[Correction target item name] Figure 8

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction content]

【図８】 [Figure 8]

【手続補正３】[Procedure 3]

【補正対象書類名】図面[Document name to be corrected] Drawing

【補正対象項目名】図１４[Name of item to be corrected] Fig. 14

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction content]

【図１４】 FIG. 14

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/24 15/07 15/13 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｄ 9015−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ 8931−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁵ Identification code Internal reference number FI Technical display location C12N 5/24 15/07 15/13 G01N 33/574 D 9015-2J 33/577 B 9015-2J 8931-4B C12N 15/00 A

Claims (16)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 ヒトの肺癌、乳癌、胃癌、大腸癌の細胞
株と反応し、ヒト正常繊維芽細胞株と反応せず、またヒ
ト肺癌組織と反応するヒト型モノクローナル抗体。1. A humanized monoclonal antibody that reacts with human lung cancer, breast cancer, gastric cancer, and colon cancer cell lines, does not react with human normal fibroblast cell lines, and reacts with human lung cancer tissue. 【請求項２】 ヒト−ヒトハイブリドーマＢＤ９Ｄ１２
（微工研菌寄第１３２３５号）の産生する請求項１記載
のヒト型モノクローナル抗体。2. A human-human hybridoma BD9D12.
The humanized monoclonal antibody according to claim 1, which is produced by (Microtechnology Research Institute, No. 13235). 【請求項３】 請求項１又は２記載のヒト型モノクロー
ナル抗体をコードするｃＤＮＡ。3. A cDNA encoding the humanized monoclonal antibody according to claim 1 or 2. 【請求項４】 抗体重鎖の可変領域をコードするｃＤＮ
Ａが、図１に記載のヌクレオチド配列を含むことを特徴
とする請求項３記載のｃＤＮＡ。4. A cDNA encoding the variable region of an antibody heavy chain.
The cDNA according to claim 3, wherein A comprises the nucleotide sequence shown in FIG. 1. 【請求項５】 抗体軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮ
Ａが、図２に記載のヌクレオチド配列を含むことを特徴
とする請求項３記載のｃＤＮＡ。5. A cDNA encoding the variable region of an antibody light chain
The cDNA according to claim 3, wherein A comprises the nucleotide sequence shown in FIG. 2. 【請求項６】 抗体重鎖の可変領域が図３に記載のアミ
ノ酸配列で表されることを特徴とする抗体。6. An antibody, wherein the variable region of the antibody heavy chain is represented by the amino acid sequence shown in FIG. 【請求項７】 抗体軽鎖の可変領域が図４に記載のアミ
ノ酸配列で表されることを特徴とする抗体。7. An antibody, wherein the variable region of the antibody light chain is represented by the amino acid sequence shown in FIG. 【請求項８】 図３に記載のアミノ酸配列から成る抗体
重鎖の可変領域をコードすることを特徴とするＤＮＡ。8. A DNA encoding the variable region of an antibody heavy chain consisting of the amino acid sequence shown in FIG. 【請求項９】 図４に記載のアミノ酸配列から成る抗体
軽鎖の可変領域をコードすることを特徴とするＤＮＡ。9. A DNA encoding the variable region of an antibody light chain consisting of the amino acid sequence shown in FIG. 【請求項１０】 抗体重鎖のＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２お
よびＣＤＲ−３がそれぞれ図５、図６および図７に記載
のヌクレオチド配列でコードされることを特徴とする請
求項３記載のｃＤＮＡ。10. The cDNA according to claim 3, wherein CDR-1, CDR-2 and CDR-3 of the antibody heavy chain are encoded by the nucleotide sequences shown in FIG. 5, FIG. 6 and FIG. 7, respectively. . 【請求項１１】 抗体軽鎖のＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２お
よびＣＤＲ−３がそれぞれ図８、図９および図１０に記
載のヌクレオチド配列でコードされることを特徴とする
請求項３記載のｃＤＮＡ。11. The cDNA according to claim 3, wherein the antibody light chain CDR-1, CDR-2 and CDR-3 are encoded by the nucleotide sequences shown in FIG. 8, FIG. 9 and FIG. 10, respectively. . 【請求項１２】 抗体重鎖のＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２お
よびＣＤＲ−３としてそれぞれ図１１、図１２および図
１３に記載のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを有
することを特徴とする抗体。12. An antibody having at least one of the amino acid sequences shown in FIG. 11, FIG. 12 and FIG. 13 as CDR-1, CDR-2 and CDR-3 of the antibody heavy chain, respectively. 【請求項１３】 抗体軽鎖のＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２お
よびＣＤＲ−３としてそれぞれ図１４、図１５および図
１６に記載のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを有
することを特徴とする抗体。13. An antibody, which has at least one of the amino acid sequences shown in FIGS. 14, 15 and 16 as CDR-1, CDR-2 and CDR-3 of the antibody light chain, respectively. 【請求項１４】 それぞれ図１１、図１２および図１３
に記載のアミノ酸配列から成る抗体重鎖のＣＤＲ−１、
ＣＤＲ−２およびＣＤＲ−３の少なくとも１つをコード
することを特徴とするＤＮＡ。14. FIGS. 11, 12 and 13 respectively.
CDR-1 of the antibody heavy chain consisting of the amino acid sequence of
A DNA encoding at least one of CDR-2 and CDR-3. 【請求項１５】 それぞれ図１４、図１５および図１６
に記載のアミノ酸配列から成る抗体軽鎖のＣＤＲ−１、
ＣＤＲ−２およびＣＤＲ−３の少なくとも１つをコード
することを特徴とするＤＮＡ。15. FIGS. 14, 15 and 16 respectively.
CDR-1 of the antibody light chain consisting of the amino acid sequence described in
A DNA encoding at least one of CDR-2 and CDR-3. 【請求項１６】 ヒト−ヒトハイブリドーマＢＤ９Ｄ１
２（微工研菌寄第１３２３５号）。16. A human-human hybridoma BD9D1.
2 (Ministry of Microbiological Research, No. 13235).