JPH06153984A - Antibody and antibody cdna - Google Patents
Antibody and antibody cdnaInfo
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- JPH06153984A JPH06153984A JP4318702A JP31870292A JPH06153984A JP H06153984 A JPH06153984 A JP H06153984A JP 4318702 A JP4318702 A JP 4318702A JP 31870292 A JP31870292 A JP 31870292A JP H06153984 A JPH06153984 A JP H06153984A
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention
【0001】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト型モノクローナル
抗体、抗体cDNA及びヒト−ヒトハイブリドーマに関
する。より具体的には、ヒトの肺癌、乳癌、胃癌、大腸
癌の細胞株と反応し、ヒト正常繊維芽細胞株と反応せ
ず、またヒト肺癌組織と反応するヒト型モノクローナル
抗体、および該ヒト型モノクローナル抗体の抗原結合を
司る可変領域をコードするcDNA、更に、該ヒト型モ
ノクローナル抗体を産生するヒト−ヒトハイブリドーマ
に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a human type monoclonal antibody, an antibody cDNA and a human-human hybridoma. More specifically, a humanized monoclonal antibody that reacts with human lung cancer, breast cancer, gastric cancer, and colon cancer cell lines, does not react with human normal fibroblast cell lines, and reacts with human lung cancer tissue, and the human type It relates to a cDNA encoding a variable region that controls antigen binding of a monoclonal antibody, and further to a human-human hybridoma producing the human type monoclonal antibody.
【0002】該ヒト型モノクローナル抗体は、癌の臨床
診断、免疫治療等の医学的分野での応用や癌特異抗原の
精製手段として利用ができる。また該cDNAは、該ヒ
ト型モノクローナル抗体の、遺伝子工学的手法を用いた
工業的規模の大量生産に用いることができる。The human monoclonal antibody can be used in clinical diagnosis of cancer, in medical fields such as immunotherapy, and as a means for purifying a cancer-specific antigen. Further, the cDNA can be used for industrial-scale mass production of the human monoclonal antibody using a genetic engineering technique.
【0003】[0003]
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】Kohl
er, G およびMilstein, K によるモノクローナル抗体作
成技術(Nature,Vol.256, p495-497, (1975) )が開発
されて以来、肺ガンや血液のガンと言われる白血病細胞
を始めとする多くのガン細胞に対するマウス型モノクロ
ーナル抗体が作成されている。このような癌特異的とい
われているモノクローナル抗体の利用分野の中で最も期
待されているのは、これに抗ガン剤などを結合して体内
に投与しガンを治療する、いわゆるミサイル療法剤や、
あるいはガンマ線を放出する放射性同位元素で標識した
モノクローナル抗体を体内の癌病巣に集積させて癌の体
内診断を行うといった医学的分野である。[Prior Art and Problems to be Solved by the Invention] Kohl
er, G and Milstein, K monoclonal antibody production technology (Nature, Vol.256, p495-497, (1975)) has been developed since the development of many leukemia cells such as lung cancer and blood cancer. Mouse monoclonal antibodies against cancer cells have been created. The most promising fields of application of such monoclonal antibodies, which are said to be cancer-specific, are the so-called missile therapeutic agents, which bind anti-cancer agents and the like and administer them to the body to treat cancer. ,
Alternatively, it is a medical field in which a monoclonal antibody labeled with a radioisotope that emits gamma rays is accumulated in cancer lesions in the body to perform in-vivo diagnosis of cancer.
【0004】用いるモノクローナル抗体がマウス型など
人体にとって異種タンパク質である場合にはこのマウス
型抗体に対するヒト抗体(Human anti-mouse antibody
: HAMA)が高頻度に産生されることが知られてい
る。このHAMAは投与したマウス型モノクローナル抗
体を不活化するばかりでなく、アレルギー反応を引き起
こす危険性を有する。この問題を回避するため、たとえ
ばマウス型抗体の抗原結合能を保持したままHAMAの
生成を引き起こす抗原性を除こうとする試みがされてい
るが、根本的な解決には至っていない。一方、ヒト型モ
ノクローナル抗体を用いる場合には、このような抗原性
の問題ははじめから考えられないため、マウス型より優
れている。When the monoclonal antibody used is a heterologous protein for the human body such as a mouse type, a human anti-mouse antibody against this mouse type antibody is used.
: HAMA) is frequently produced. This HAMA not only inactivates the mouse type monoclonal antibody administered, but also has a risk of causing an allergic reaction. In order to avoid this problem, for example, attempts have been made to remove the antigenicity that causes the formation of HAMA while retaining the antigen-binding ability of the mouse antibody, but the fundamental solution has not been reached. On the other hand, when a human type monoclonal antibody is used, such a problem of antigenicity is not considered from the beginning, and thus it is superior to the mouse type.
【0005】マウス型モノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマを得ようとする時には、多くの場合、抗原
となる物質あるいは細胞などをマウスの体内に免疫する
ことによって、抗原に感作されたBリンパ球を容易に得
ることができるので、これを用いて目的を達することが
できる。これに対して、倫理的及び保健的な理由から、
人体には積極的な免疫はできず、従って所望の特異性を
有するヒト型モノクローナル抗体を容易に得ることはで
きなかった。In order to obtain a hybridoma producing a mouse type monoclonal antibody, in many cases, a substance or cell serving as an antigen is immunized into the body of a mouse to facilitate B lymphocytes sensitized with the antigen. This can be used to achieve the purpose. On the other hand, for ethical and health reasons,
The human body cannot be positively immunized, and thus a humanized monoclonal antibody having a desired specificity cannot be easily obtained.
【0006】本発明者らはこれまでの精力的な研究の結
果、上記のごとく取得するのが困難であるヒト型モノク
ローナル抗体を取得することに成功している(特公平4-
29357 )。このヒト型モノクローナル抗体は、肺癌細胞
に対して特異的な反応性を有し、かつ正常細胞には反応
しないもので、さきに述べた医学的分野に応用する目的
には理想的な性質を持っている。しかしこの抗体は、胃
癌など肺癌以外の癌には反応しない。従って肺癌以外の
癌細胞にも広く反応し、かつ正常細胞に反応しないとい
う特異性を持つヒト型モノクローナル抗体が求められて
いた。As a result of energetic research so far, the present inventors have succeeded in obtaining a humanized monoclonal antibody which is difficult to obtain as described above (Japanese Patent Publication No.
29357). This human monoclonal antibody has specific reactivity to lung cancer cells and does not react to normal cells, and has ideal properties for the purpose of application in the medical field mentioned above. ing. However, this antibody does not react with cancers other than lung cancer such as gastric cancer. Therefore, there has been a demand for a humanized monoclonal antibody having specificity that it widely reacts with cancer cells other than lung cancer and does not react with normal cells.
【0007】更に、特公平4-29357 に述べられているヒ
ト−ヒトハイブリドーマは、無血清培地中で抗体を安定
に産生し得ることから、安価で高純度のヒト型モノクロ
ーナル抗体を得ることができるが、工業的規模の大量生
産においてはより安定的で高産生性の抗体産生細胞が有
利である。Furthermore, since the human-human hybridoma described in Japanese Patent Publication No. 4-29357 can stably produce an antibody in a serum-free medium, an inexpensive and highly purified human monoclonal antibody can be obtained. However, more stable and high-producing antibody-producing cells are advantageous in industrial-scale mass production.
【0008】また、一方で、遺伝子工学的手法はこれま
でインシュリンを初めとする種々の有用タンパク質を工
業的なスケールで大量に製造する技術を与えている。こ
の遺伝子工学的手法のモノクローナル抗体生産への応用
はモノクローナル抗体の染色体DNA、あるいは相補性
DNA(cDNA)を取得することに始まる。On the other hand, genetic engineering techniques have provided techniques for producing a large amount of various useful proteins such as insulin on an industrial scale. The application of this genetic engineering technique to the production of monoclonal antibodies begins with obtaining chromosomal DNA or complementary DNA (cDNA) of the monoclonal antibody.
【0009】以下に、抗体(免疫グロブリン)のうち、
本発明に関連するヒトのIgGの基本構造および遺伝子
について簡単に述べる。Among the antibodies (immunoglobulins) below,
The basic structure and gene of human IgG relevant to the present invention will be briefly described.
【0010】IgG分子は、分子量約51,000のポリペプ
チド鎖の重鎖および分子量約25,000のポリペプチド鎖の
短鎖それぞれ2本ずつから構成される。重鎖−軽鎖間お
よび重鎖−重鎖間はS−S結合によって連結されてい
る。重鎖および軽鎖のアミノ末端から約 100個のアミノ
酸配列は、抗原特異的であり、この領域によって抗原と
結合する。この領域を「可変領域」という。これに続く
領域は「定常領域」と呼ばれ、サブクラス毎に一定であ
り、それぞれ約 400個および約 150個のアミノ酸配列よ
り成る。重鎖の定常領域では、Cγ1、Cγ2、Cγ
3、Cγ4が、また軽鎖ではCκ、Cλが知られてお
り、それぞれ重鎖はγ1鎖、γ2鎖、γ3鎖、γ4鎖で
軽鎖はκ鎖、λ鎖と呼ばれる。An IgG molecule is composed of two heavy chains each having a molecular weight of about 51,000 and two short chains each having a molecular weight of about 25,000. The heavy chain-light chain and the heavy chain-heavy chain are linked by SS bonds. Approximately 100 amino acid sequences from the amino terminus of the heavy and light chains are antigen-specific and this region binds antigen. This region is called a "variable region". The region that follows is called the "constant region," which is constant for each subclass and consists of about 400 and about 150 amino acid sequences, respectively. In the constant region of the heavy chain, Cγ1, Cγ2, Cγ
3, Cγ4, and Cκ and Cλ in the light chain are known. The heavy chain is called γ1 chain, γ2 chain, γ3 chain, γ4 chain, and the light chain is called κ chain and λ chain, respectively.
【0011】ある特定のモノクローナル抗体はその重鎖
および軽鎖の可変領域がそれぞれある特定のアミノ酸配
列である均質な抗体分子の集団であり、モノクローナル
抗体毎に可変領域のアミノ酸配列が大きく異なる。可変
領域はさらに相補性決定領域群(CDR;Complementar
ity determining region)とよばれる高可変領域(Hype
r variable region )と、比較的共通性の高い枠組み残
基群(FR:Framework region)から成る。重鎖、軽鎖
にはそれぞれ3個のCDRがあり、抗原結合部位は、重
鎖と軽鎖の折りたたみによって集まったCDRによって
形成される。このためモノクローナル抗体の抗原結合の
特異性および結合強度は、おもにCDRのアミノ酸配列
が規定している。A certain monoclonal antibody is a homogeneous population of antibody molecules in which the variable regions of the heavy and light chains have certain amino acid sequences, and the amino acid sequences of the variable regions differ greatly from monoclonal antibody to monoclonal antibody. The variable region is further composed of complementarity determining regions (CDRs).
Highly variable region (Hype)
r variable region) and a relatively common group of framework residues (FR). The heavy chain and the light chain each have three CDRs, and the antigen-binding site is formed by the CDRs assembled by the folding of the heavy chain and the light chain. Therefore, the antigen binding specificity and binding strength of the monoclonal antibody are mainly defined by the amino acid sequence of CDR.
【0012】一方、可変領域は、重鎖ではV遺伝子、D
遺伝子、J遺伝子、軽鎖ではV遺伝子、J遺伝子にコー
ドされていることが知られている。ヒト重鎖ではV遺伝
子が100 個以下、D遺伝子が 6個、J遺伝子が12個、ヒ
トκ鎖ではV遺伝子が 100個以下、J遺伝子が 5個存在
する。B細胞の分化に伴って、重鎖ではV、D、Jの各
遺伝子群の中からそれぞれ任意の1つの遺伝子が再配列
により隣接し、可変領域に相当する遺伝子が形成され
る。軽鎖においても同様にV、J遺伝子の再配列によ
り、可変領域の遺伝子が形成される。On the other hand, the variable region is composed of V gene and D in the heavy chain.
It is known that genes, J genes, and light chains are encoded by V genes and J genes. There are 100 or less V genes, 6 D genes, 12 J genes in human heavy chains, and 100 or less V genes and 5 J genes in human κ chains. With the differentiation of B cells, any one gene in each of the V, D, and J gene groups is flanked by rearrangements in the heavy chain to form a gene corresponding to the variable region. Similarly in the light chain, rearrangement of the V and J genes forms a variable region gene.
【0013】また定常領域をコードする遺伝子は、可変
領域遺伝子群の下流に位置している。この遺伝子は可変
領域遺伝子の組換えが終了すると可変領域遺伝子と連な
って発現され、重鎖および軽鎖のポリペプチドが生成さ
れる。The gene encoding the constant region is located downstream of the variable region gene group. When the recombination of the variable region gene is completed, this gene is expressed continuously with the variable region gene, and heavy and light chain polypeptides are produced.
【0014】このような知見をもとに、ヒト型モノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマから抗体の可変領
域をコードする相補性DNA(cDNA)を迅速にクロ
ーニングする方法が開発された(James W. Larrick et
al., Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol.160, p.1
250-1256(1989); James W. Larrick et al., Bio/Tech
nology, Vol.7, p.934-938(1989))。Based on these findings, a method for rapidly cloning a complementary DNA (cDNA) encoding a variable region of an antibody from a hybridoma producing a human monoclonal antibody was developed (James W. Larrick et.
al. , Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol.160, p.1
250-1256 (1989); James W. Larrick et al. , Bio / Tech
nology, Vol.7, p.934-938 (1989)).
【0015】[0015]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、癌細胞株
を用いたヒトリンパ球の生体外免疫法を発明し(特開平
4-281799:Kawahara,k. et al., Human Antibodies and
Hybridomas, Vol.3,p.8-13(1992))、この方法を施し
たヒト末梢血リンパ球を親細胞と細胞融合することによ
って、ヒト癌細胞に反応し、かつヒト正常繊維芽細胞に
反応しないヒト型モノクローナル抗体を産生するヒト−
ヒトハイブリドーマを取得することに成功した。また該
ヒト−ヒトハイブリドーマより採取した伝令RNA(m
RNA)をもとに作製した相補性DNA(cDNA)の
中から、該ヒト型モノクローナル抗体を構成する重鎖及
び軽鎖の可変領域をコードするcDNAをそれぞれクロ
ーニングすることに成功した。さらにこれらのcDNA
の塩基配列を解明すると共にアミノ酸配列を決定するこ
とにより本発明を完成した。The present inventors have invented an in vitro immunization method for human lymphocytes using a cancer cell line.
4-281799: Kawahara, k. Et al. , Human Antibodies and
Hybridomas, Vol.3, p.8-13 (1992)), by fusing human peripheral blood lymphocytes subjected to this method with parent cells, they react with human cancer cells and become human normal fibroblasts. Human producing non-reacting humanized monoclonal antibody-
We succeeded in obtaining a human hybridoma. In addition, a messenger RNA (m
From complementary DNA (cDNA) prepared based on (RNA), the cDNAs encoding the variable regions of the heavy chain and the light chain constituting the human monoclonal antibody were successfully cloned. Furthermore these cDNAs
The present invention has been completed by elucidating the nucleotide sequence of and the amino acid sequence.
【0016】本発明はヒトの肺癌、乳癌、胃癌、大腸癌
の細胞株と反応し、ヒト正常繊維芽細胞株と反応せず、
またヒト肺癌組織と反応するヒト型モノクローナル抗体
および該モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域
のcDNAを提供する。The present invention reacts with human lung, breast, gastric and colon cancer cell lines and does not react with human normal fibroblast cell lines,
Also provided are human type monoclonal antibodies that react with human lung cancer tissues and cDNAs of the variable regions of the heavy and light chains of the monoclonal antibodies.
【0017】また本発明は、抗体重鎖と軽鎖の可変領域
がそれぞれ図3および図4に記載のアミノ酸配列で表さ
れることを特徴とする抗体、およびかかるアミノ酸配列
をコードするDNAを提供するものである。更に、遺伝
子工学的手法に供し得るものとして抗体のCDRをコー
ドするDNAを提供するものである。The present invention also provides an antibody characterized in that the variable regions of the antibody heavy and light chains are represented by the amino acid sequences shown in FIGS. 3 and 4, respectively, and a DNA encoding such an amino acid sequence. To do. Further, the present invention provides a DNA encoding the CDR of an antibody which can be subjected to a genetic engineering technique.
【0018】本発明のヒト型モノクローナル抗体を産生
するヒト−ヒトハイブリドーマの一具体例として、平成
4年10月30日付で微工研(工業技術院微生物工業技
術研究所)に寄託したヒト−ヒトハイブリドーマBD9
D12(微工研菌寄第13235号)を挙げることがで
きる。As one specific example of the human-human hybridoma producing the human type monoclonal antibody of the present invention, human-human deposited on the basis of October 30, 1992, at Microindustrial Research Institute (Institute of Industrial Science, Institute for Microbial Technology) Hybridoma BD9
D12 (Microtechnology Research Institute, No. 13235) can be mentioned.
【0019】以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説
明する。The present invention will be specifically described below with reference to examples.
【0020】[0020]
実施例1ヒト末梢血リンパ球の生体外免疫 生体外免疫を行う免疫原(抗原)としてA549細胞
(ヒト肺癌細胞株、ATCCCCL-185)を10%FCS(牛
胎児血清)を含有するERDF培地(極東製薬工業)
に、1×104 cells/mlの細胞密度に懸濁し、24ウエ
ルプレートに1mlずつ分注して、36時間、37℃で
培養した。一方、健康な人の末梢血からフィコール(フ
ァルマシア社製)によりリンパ球を分離し、ERDF培
地にて4回洗浄した。その後リンパ球密度を2×106
cells/mlに調製し、予めA549細胞の培養を行ってい
た上記24ウエルプレートに0.5ml/well添加した。この
とき、ムラミルジペプチド(MDP,Calbiochem社
製)、インターロイキン2(IL−2,ゼンザイム社
製)およびインターロイキン6(IL−6,ゼンザイム
社製)を、培養液中の最終濃度がそれぞれ10μg/ml, 10
0U/ml, 10U/ml になるように添加した。さらに4日間培
養を行い、生体外免疫されたリンパ球を得た。Example 1 In vitro immunization of human peripheral blood lymphocytes ERDF medium containing A549 cells (human lung cancer cell line, ATCCCCL-185) as an immunogen (antigen) for in vitro immunization containing 10% FCS (fetal calf serum) ( Far East Pharmaceutical Industry)
Then, the cells were suspended at a cell density of 1 × 10 4 cells / ml, dispensed in 1 ml portions into 24-well plates, and cultured at 37 ° C. for 36 hours. On the other hand, lymphocytes were separated from peripheral blood of a healthy person by Ficoll (Pharmacia) and washed four times with ERDF medium. After that, the lymphocyte density was set to 2 × 10 6.
The cells were prepared into cells / ml, and 0.5 ml / well was added to the above 24-well plate in which A549 cells were previously cultured. At this time, muramyl dipeptide (MDP, manufactured by Calbiochem), interleukin 2 (IL-2, manufactured by Zenzyme) and interleukin 6 (IL-6, manufactured by Zenzyme) were used at a final concentration of 10 μg in the culture solution. / ml, 10
It was added at 0 U / ml and 10 U / ml. The cells were further cultured for 4 days to obtain lymphocytes immunized in vitro.
【0021】実施例2細胞融合によるハイブリドーマ作製 上記リンパ球(4×106 cells )とヒト融合パートナ
ー細胞株A4 H12(ヒトT細胞株MOLT−4を用い5
0μg/mlの6−チオグアニンを含む10%FCS添加
RPMI1640培地(大日本製薬)を選択培地として
作製したもの;2×106 cells )を混合した後、40
0×g、5分間の遠心分離により混合した細胞を集め
た。遠心上清を除いた後、細胞のペレットに1 mlの50
%ポリエチレングリコール4000(Boeringer 社製)
を1分間かけて添加し、その後37℃、1分間インキュ
ベートした。さらに1分間に1mlの割合で9mlのE
RDF培地を添加した。400×g、5分間の遠心分離
を行って上清を捨てて、細胞を20mlのERDF培地
(15%FCS含有)に懸濁し、これを96ウエルプレ
ートに播種した。培養は37℃にて行い、融合細胞のみ
を選択する目的で、100mM ヒポキサンチン、0.4mM アミ
ノプテリン、および16mM チミジンのいわゆるHATを
含有する、15%FCS−ERDF培地を添加した。ハ
イブリドーマによって形成されるコロニーが、細胞融合
の日から10日目に現れ始めた。Example 2 Preparation of hybridoma by cell fusion The above lymphocytes (4 × 10 6 cells) and human fusion partner cell line A 4 H 12 (human T cell line MOLT-4 were used 5
10% FCS-added RPMI1640 medium (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) containing 0 μg / ml 6-thioguanine was prepared as a selective medium; 2 × 10 6 cells) were mixed, and then 40
The mixed cells were collected by centrifugation at 0xg for 5 minutes. After removing the centrifugation supernatant, add 1 ml of 50 to the cell pellet.
% Polyethylene glycol 4000 (Boeringer)
Was added over 1 minute and then incubated at 37 ° C. for 1 minute. 9 ml of E at a rate of 1 ml per minute
RDF medium was added. After centrifugation at 400 × g for 5 minutes, the supernatant was discarded, the cells were suspended in 20 ml of ERDF medium (containing 15% FCS), and this was seeded in a 96-well plate. The culture was performed at 37 ° C., and for the purpose of selecting only the fused cells, 15% FCS-ERDF medium containing 100 mM hypoxanthine, 0.4 mM aminopterin, and 16 mM thymidine so-called HAT was added. Colonies formed by hybridomas began to appear 10 days after the day of cell fusion.
【0022】実施例3癌細胞に反応するヒト型モノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニング ハイブリドーマの産生する抗体の反応性を、酵素免疫測
定法(enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELIS
A)を用いて調べた(Hulette, CM. et al., Tissue A
ntigens, Vol.30, p.25-33(1987) )。Example 3 Production of human type monoclonal antibody reactive with cancer cells
Screening and cloning of hybridoma The reactivity of the antibody produced by the hybridoma is measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELIS).
(A)) (Hulette, CM. Et al. , Tissue A
ntigens, Vol.30, p.25-33 (1987)).
【0023】以下に簡潔に述べる。A brief description will be given below.
【0024】A549細胞を培養用96ウエルプレート
でコンフルエントになるまで1〜5日間培養した。培養
後、プレートの底に付着しているA549細胞を、0.
2%グルタルアルデヒドで固定し、抗体のプレートに対
する非特異的吸着を防ぐために、3%牛血清アルブミン
(BSA)を含むリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)を
用いてブロッキングを施した。PBSでウェルを洗浄し
た後、ハイブリドーマの培養上清を加え、室温で3時間
インキュベートした。その後培養上清を捨て、ウェルを
PBSで3回洗浄した。次に50倍希釈したペルオキシ
ダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgG抗体(Tago社製)をウェル
に入れ、37℃で1時間インキュベートした。インキュ
ベート後、ウェルを3回洗浄した。ペルオキシダーゼの
基質溶液(0.003 % H2 O2 および0.3mg/ml p-2.2′
-azino-di(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)
diammonium salt を含有する0.1M citric acid buffer
(pH4.0))をウェルに入れ、20分間反応を行った。反
応終了後、各ウェルの405nmの吸光度を測定した。
ハイブリドーマの培養上清に対する対照として、ヒト血
清IgGを用いた。288ウェルのハイブリドーマを調
べた結果、A549細胞に強く反応する抗体を産生する
ハイブリドーマが1つ得られた。このハイブリドーマを
限界希釈法によってクローニングし、IgGタイプのモ
ノクローナル抗体を安定に生産するクローンを得た。A549 cells were cultured in a 96-well plate for culture for 1 to 5 days until they became confluent. After culturing, the A549 cells attached to the bottom of the plate were transferred to 0.
It was fixed with 2% glutaraldehyde and blocked with phosphate buffered saline (PBS) containing 3% bovine serum albumin (BSA) to prevent non-specific adsorption of antibody to the plate. After washing the well with PBS, the culture supernatant of the hybridoma was added and incubated at room temperature for 3 hours. Thereafter, the culture supernatant was discarded and the wells were washed 3 times with PBS. Then, a 50-fold diluted peroxidase-labeled goat anti-human IgG antibody (manufactured by Tago) was placed in the well and incubated at 37 ° C. for 1 hour. After incubation, the wells were washed 3 times. Substrate solution of peroxidase (0.003% H 2 O 2 and 0.3 mg / ml p-2.2 ′
-azino-di (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)
0.1M citric acid buffer containing diammonium salt
(pH 4.0)) was placed in the well and reacted for 20 minutes. After completion of the reaction, the absorbance at 405 nm of each well was measured.
Human serum IgG was used as a control for the hybridoma culture supernatant. As a result of examining the 288-well hybridoma, one hybridoma producing an antibody that strongly reacts with A549 cells was obtained. This hybridoma was cloned by the limiting dilution method to obtain a clone that stably produces an IgG type monoclonal antibody.
【0025】実施例4モノクローナル抗体の癌細胞株および正常繊維芽細胞に
対する反応性 上記で得られたハイブリドーマを1×105 cells/mlの
細胞密度で、5%FCS−ERDF培地に播種し、37
℃、5日間培養することによって、モノクローナル抗体
を含む培養上清を得た。ヒトIgGを測定するためのE
LISAによって培養上清中のモノクローナル抗体濃度
を測定したところ、2μg/mlであった。この培養上
清を用いて該モノクローナル抗体の癌細胞株及び正常繊
維芽細胞に対する反応性を、実施例3に示したELIS
Aによって測定した。その結果を表1に示す。これによ
り該モノクローナル抗体はA549細胞のみならず、そ
の他のヒトの肺癌細胞株や乳癌、胃癌、および大腸癌の
細胞株に反応し、正常繊維芽細胞には反応しなかった。
該モノクローナル抗体を産生するヒト−ヒトハイブリド
ーマをBD9D12と命名した。Example 4 Monoclonal Antibody in Cancer Cell Line and Normal Fibroblast
Reactivity with respect to the hybridoma obtained above was inoculated in a 5% FCS-ERDF medium at a cell density of 1 × 10 5 cells / ml, and 37
By culturing at 5 ° C for 5 days, a culture supernatant containing a monoclonal antibody was obtained. E for measuring human IgG
When the concentration of the monoclonal antibody in the culture supernatant was measured by LISA, it was 2 μg / ml. Using the culture supernatant, the reactivity of the monoclonal antibody with respect to cancer cell lines and normal fibroblasts was determined by the ELIS shown in Example 3.
Measured by A. The results are shown in Table 1. As a result, the monoclonal antibody reacted not only with A549 cells but also with other human lung cancer cell lines, breast cancer, gastric cancer, and colon cancer cell lines, but not with normal fibroblasts.
The human-human hybridoma producing the monoclonal antibody was named BD9D12.
【0026】また、該モノクローナル抗体を構成する短
鎖のサブクラスをELISAによって調べたところ、κ
鎖であった。Further, when the short chain subclasses constituting the monoclonal antibody were examined by ELISA, κ
It was a chain.
【0027】[0027]
【表1】 実施例5モノクローナル抗体の肺癌組織に対する反応性 ホルマリン固定後パラフィン抱埋されたヒト肺癌組織の
薄切をスライドグラスに張り付けた。このスライドグラ
スを、キシレンを用いて脱パラフィンを行い、95%エ
タノール、85%エタノール、75%エタノールに順次
浸し、さらにPBSに浸した。抗体の非特異的吸着を抑
える目的で、ヤギ血清(Vector社製、56倍希釈)を癌
組織上にたらし、25分間インキュベートした。次に実
施例4で得たBD9D12の培養上清を癌組織上にたら
し、室温で2時間インキュベートした。インキュベート
後、癌組織をPBSで5分間、3回洗浄した。50倍希
釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgG抗体(Ta
go社製)を癌組織上にたらし、室温、1時間インキュベ
ートした。上記と同様に癌組織を洗浄し、ペルオキシダ
ーゼの基質となる0.5mg/ml DAB(同仁化学製、Cat.
No.347-00904)および0.01% H2 O2 を含む 50mM Tr
is-HCl (pH7.4)を用いて抗体の癌組織に対する反応性を
調べた。結果の判定は、癌組織の染色の度合を Negative (-) Weakly positive (+) Positive (++) Strongly positive (+++) の4段階に分けた。対照としたヒト血清IgGは調べた
全ての肺癌組織については(-) と判定された。BD9D
12についての結果は、表2に示す。[Table 1] Example 5 Reactivity of Monoclonal Antibody to Lung Cancer Tissue A thin slice of human lung cancer tissue embedded in paraffin after being fixed with formalin was attached to a slide glass. The slide glass was deparaffinized using xylene, successively dipped in 95% ethanol, 85% ethanol and 75% ethanol, and further dipped in PBS. For the purpose of suppressing nonspecific adsorption of antibody, goat serum (manufactured by Vector, 56-fold diluted) was spread on the cancer tissue and incubated for 25 minutes. Next, the BD9D12 culture supernatant obtained in Example 4 was spread on the cancer tissue and incubated at room temperature for 2 hours. After the incubation, the cancer tissue was washed with PBS three times for 5 minutes. A 50-fold diluted peroxidase-labeled goat anti-human IgG antibody (Ta
go) was placed on the cancer tissue and incubated at room temperature for 1 hour. The cancer tissue was washed in the same manner as above, and 0.5 mg / ml DAB serving as a substrate for peroxidase (manufactured by Dojindo, Cat.
No.347-00904) and 0.01% H 2 O 2 in 50 mM Tr
The reactivity of the antibody with respect to the cancer tissue was examined using is-HCl (pH 7.4). To judge the results, the degree of staining of the cancer tissue was divided into four stages of Negative (-) Weakly positive (+) Positive (++) and Strongly positive (+++). Human serum IgG used as a control was judged as (-) for all the lung cancer tissues examined. BD9D
The results for 12 are shown in Table 2.
【0028】[0028]
【表2】 実施例6mRNAの調製 実施例4で得られたBD9D12細胞を10%FCS−
ERDF培地に5×105 cells/mlまでまきこんだ。2
日間培養の後、5×108 の細胞を得た。[Table 2] Example 6 Preparation of mRNA BD9D12 cells obtained in Example 4 were treated with 10% FCS-
Up to 5 × 10 5 cells / ml was added to the ERDF medium. Two
After culture for 5 days, 5 × 10 8 cells were obtained.
【0029】細胞を4℃においてPBS(予め氷冷して
おく)で3回洗浄した(2000×g 5min.)。ま
ず、終濃度1%となるように 2-MercaptoethanolをGuan
idiumThiocyanate Bufferに添加した。これを5倍体積
の 2-Mercaptoethanol-Guanidium Thiocyanate Buffer
に懸濁し、シリンジに23Gのニードルをつけたもので
吸ったり吐いたりし、粘性がなくなるまで破砕した。So
dium Lauryl Sarcosinate を終濃度0.5%で添加し、
よく撹拌した。室温で5,000×g,10minの遠心
によって、不溶性の画分を取り除いた。上清を23Gニ
ードルをつけたシリンジで吸い取り、透明な超遠心チュ
ーブの中の5.7M CsCl, 0.01M EDTA(pH7.5)のクッション
の上に静かに重層した。チューブの外にクッション上部
の位置をマークした。重量の補正は、Guanidium Thiocy
anate で行った。SW 50.1 Swing rotor を用い、20
℃、40,000rpm ,24Hourの条件で超遠心した。
遠心後、下から0.5cmの位置にラインを引いた。パ
スツールピペットでクッションのレベルの上まで液を注
意深く取り除いた。新しいピペットで下の線のところま
で液を除き、残った液のちょうど上のレベルでチューブ
をカミソリで切断した。チューブの底をキムワイプのパ
ッドの上に置き、注意深く自動ピペッタで残った液を抜
いた。チューブを逆さまにし、残った液を完全に取り除
いた。チューブを上向きにしてRNAのペレットがチュ
ーブの外に落ちてないことを確認した。CsClを取り
除くために、RNAペレットをEthanol で洗浄した。7
0%Ethanol (室温)をチューブの底に満たし、チュー
ブを逆さまにしてEthanol を捨てた。再びRNAの存在
を確認した。RNAを室温で乾燥した。0.1%SDS
を含むTE(pH7.6)で、ディスポのチップを付け
た自動ピペッタでピペッティングすることによって、R
NAを溶解した。RNA溶液をエッペンドルフチューブ
にとった。遠心管の底は、25μlのTEで洗い、その
洗浄液もエッペンドルフチューブにとった。150μl
のTE、30μlの3M Sodium Acetate(pH5.2)、0.
9mlの氷冷Ethanol を添加した。混合した後、少なく
とも30 min,0℃保存した。ペレットをEthanol で洗
浄し、再度わずかに遠心した。そして、空気中で乾燥さ
せた。RNAを1mlのTEに溶解し、3倍体積のEtha
nol を添加し、小分けして必要なときまで−70℃で保
存した。以上の結果、4mgのRNAを抽出することがで
きた。The cells were washed 3 times with PBS (previously ice-cooled) at 4 ° C. (2000 × g 5 min.). First, Guan the 2-Mercaptoethanol to a final concentration of 1%
Added to idium Thiocyanate Buffer. Add 5 volumes of 2-Mercaptoethanol-Guanidium Thiocyanate Buffer
Suspended in, and sucked and exhaled with a syringe equipped with a 23G needle, and crushed until the viscosity disappeared. So
dium Lauryl Sarcosinate was added at a final concentration of 0.5%,
Stir well. The insoluble fraction was removed by centrifugation at 5,000 xg for 10 minutes at room temperature. The supernatant was sucked up with a syringe equipped with a 23G needle, and gently layered on a cushion of 5.7M CsCl, 0.01M EDTA (pH 7.5) in a transparent ultracentrifuge tube. The top of the cushion was marked on the outside of the tube. Weight compensation is Guanidium Thiocy
I went with anate. 20 by using SW 50.1 Swing rotor
Ultracentrifugation was carried out under the conditions of 40,000 rpm and 24 hours.
After centrifugation, a line was drawn from the bottom at a position of 0.5 cm. The fluid was carefully removed with a Pasteur pipette to above the level of the cushion. The liquid was removed to the bottom line with a new pipette and the tube was cut with a razor just above the remaining liquid. The bottom of the tube was placed on a Kimwipe pad and the remaining liquid was carefully drained with an automatic pipettor. The tube was inverted and the remaining liquid was completely removed. Check that the RNA pellet did not fall outside the tube with the tube facing up. The RNA pellet was washed with Ethanol to remove CsCl. 7
The bottom of the tube was filled with 0% Ethanol (room temperature), the tube was inverted and the Ethanol was discarded. The presence of RNA was confirmed again. RNA was dried at room temperature. 0.1% SDS
With TE (pH 7.6) containing R, by pipetting with an automatic pipettor equipped with a disposable tip, R
NA was dissolved. The RNA solution was taken in an Eppendorf tube. The bottom of the centrifuge tube was washed with 25 μl of TE, and the washing solution was also transferred to an Eppendorf tube. 150 μl
TE, 30 μl of 3M Sodium Acetate (pH 5.2), 0.
9 ml ice cold Ethanol was added. After mixing, store at 0 ° C. for at least 30 min. The pellet was washed with Ethanol and centrifuged again briefly. Then, it was dried in air. Dissolve RNA in 1 ml TE and add 3 volumes of Etha
Nol was added, aliquoted and stored at -70 ° C until needed. As a result, 4 mg of RNA could be extracted.
【0030】spun column をよく振って、 oligo(d
T)−cellulose をよく懸濁した。カラムの下のキャッ
プを外し、それから上のキャップを外した。カラムを1
5mlの遠心管にセットし、保存用緩衝液をドレーンし
た。High−salt buffer を1ml添加し、重力でドレー
ンした(2回)。遠心管の底に溜った液を捨て、またカ
ラムを遠心管にセットした。Shake the spun column well to remove oligo (d
T) -cellulose was well suspended. The bottom cap of the column was removed and then the top cap was removed. Column 1
It was set in a 5 ml centrifuge tube and the storage buffer was drained. 1 ml of High-salt buffer was added, and drained by gravity (twice). The liquid accumulated at the bottom of the centrifuge tube was discarded, and the column was set in the centrifuge tube.
【0031】RNAサンプルを1.0mlのTE(pH
7.4)に溶解し、65℃、5min処理した。この時、
RNAが完全に溶解していることを確認した。また、El
ution bufferを65℃に保温しておいた。サンプルを氷
冷し、sample buffer を0.2ml加え、穏やかに撹拌
した。サンプルを調製済みのカラムの上にのせ、重力で
溶出させた。1400rpm(r=165)2min 遠心
した。High−salt buffer を0.25mlカラムに添加
し、遠心した(2回)。 Low−salt buffer 0.25m
lでカラムを洗浄した(3回)。遠心管の底に溜ったbu
fferを捨て、滅菌したエッペンドルフチューブを遠心管
にセットし、さらにカラムの溶出口がエッペンドルフチ
ューブの中に入るようにしてカラムを遠心管にセットし
た。poly(A)+ RNAを溶出するために、65℃
に保温しておいた Elution buffer 0.25mlで4回
カラムを洗浄した。遠心管からカラムを取り除き、それ
から乾熱したピンセットでエッペンドルフチューブを取
り出しすぐに氷冷した。1/10 vol.の3M So
dium Acetateを添加し、その2.5〜3 vol.のEt
hanol を添加し、−80℃に保存した。The RNA sample was treated with 1.0 ml TE (pH
It was dissolved in 7.4) and treated at 65 ° C. for 5 minutes. At this time,
It was confirmed that RNA was completely dissolved. Also, El
The ution buffer was kept warm at 65 ° C. The sample was ice-cooled, 0.2 ml of sample buffer was added, and the mixture was gently stirred. The sample was loaded onto the prepared column and eluted by gravity. It was centrifuged at 1400 rpm (r = 165) for 2 minutes. High-salt buffer was added to a 0.25 ml column and centrifuged (twice). Low-salt buffer 0.25m
The column was washed with 1 (3 times). Bu collected at the bottom of the centrifuge tube
The ffer was discarded, a sterilized Eppendorf tube was set in the centrifuge tube, and the column was set in the centrifuge tube so that the eluent of the column entered the Eppendorf tube. 65 ° C to elute poly (A) + RNA
The column was washed 4 times with 0.25 ml of Elution buffer that had been kept warm. The column was removed from the centrifuge tube, and the Eppendorf tube was taken out with dry tweezers and immediately cooled with ice. 1/10 vol. 3M So
dium Acetate was added, and 2.5 to 3 vol. Et
Hanol was added and the mixture was stored at -80 ° C.
【0032】その結果、200μgのmRNAを得るこ
とができた。このmRNAを、電気泳動したところ、r
RNAは分解されておらず、5kb以上のmRNAも確
認できた。また、in vitro translationの結果、軽鎖遺
伝子が含まれることが確認できた。このmRNAを用い
てcDNA合成を行うことにした。As a result, 200 μg of mRNA could be obtained. When this mRNA was electrophoresed, r
RNA was not degraded, and mRNA of 5 kb or more was also confirmed. As a result of in vitro translation, it was confirmed that the light chain gene was included. It was decided to perform cDNA synthesis using this mRNA.
【0033】実施例7ファーストストランドcDNAの合成 Water Bath(42.12℃)の準備をし、Kit(cD
NA合成システムプラス(Amersham))の酵素
以外の試薬及びmRNAを溶解し、氷冷した。酵素は使
用の直前まで−20℃に保存しておいた。以下の試薬を
順番に加えた。Example 7 Synthesis of first-strand cDNA Prepare a water bath (42.12 ° C.) and use Kit (cD
Reagents other than the enzyme of the NA synthesis system plus (Amersham) and mRNA were dissolved and ice-cooled. The enzyme was stored at -20 ° C until just before use. The following reagents were added in order.
【0034】 5×ファーストストランド合成反応用buffer 10.0μl ピロリン酸ナトリウム溶液 2.5μl ヒト胎盤リボヌクレースインヒビター 2.5μl デオキシヌクレオタイド三リン酸混液 5.0μl オリゴ(dT)プライマー 2.5μl mRNA(in water) 17.5μl Total 40.0μl 逆転写酵素 10.0μl Total 50.0μl 静かに混和し、混液を遠心によって遠心管の底に集め
た。mRNA 1μg当たり20unitsの逆転写酵
素を添加、混和し、42℃、40min インキュベートし
た。尚、温度は厳密に42℃にし、時間に関しては40
min よりもあまり長くしてはならない。インキュベート
後、直ちに氷冷した。その後、−20℃に保存した。長
期保存するときには、−80℃に保存した。Buffer for 5 × First Strand Synthesis Reaction 10.0 μl Sodium Pyrophosphate Solution 2.5 μl Human Placental Ribonucleose Inhibitor 2.5 μl Deoxynucleotide Triphosphate Mixture 5.0 μl Oligo (dT) Primer 2.5 μl mRNA ( in water) 17.5 μl Total 40.0 μl reverse transcriptase 10.0 μl Total 50.0 μl Gently mixed and the mixture was collected by centrifugation at the bottom of the centrifuge tube. 20 units of reverse transcriptase was added to 1 μg of mRNA, mixed, and incubated at 42 ° C. for 40 min. The temperature is strictly set to 42 ° C and the time is set to 40 ° C.
It should not be much longer than min. Immediately after the incubation, it was cooled on ice. Then, it preserve | saved at -20 degreeC. For long-term storage, it was stored at -80 ° C.
【0035】実施例8PCR法による抗体可変領域cDNAの増幅 抗体可変領域を挟み込むプライマーLS−4,LC−8
を作製し、PCR法により軽鎖可変領域遺伝子の増幅を
試みた。LS−4は、ATG開始コドンを含む、配列の
よく保存されたシグナルペプタイドをもとに、LC−8
は、配列既知の定常領域を基に作製した。これらプライ
マーを用いて抗体可変領域を特異的に増幅した。重鎖は
プライマーHS−1,2,3及びP−7を用いて同様に
PCR法により増幅を試みた。HS−1,2,3は、シ
グナルペプタイド、P−7は定常領域を基に作製され
た。以下の試薬を順番に加えて反応を行った。Example 8 Amplification of cDNA of antibody variable region by PCR method Primers LS-4 and LC-8 sandwiching antibody variable region
Was prepared and an attempt was made to amplify the light chain variable region gene by the PCR method. LS-4 is based on a well-conserved signal peptide containing the ATG start codon, LC-8.
Was prepared based on the constant region of known sequence. The antibody variable region was specifically amplified using these primers. The heavy chain was similarly amplified by the PCR method using the primers HS-1, 2, 3 and P-7. HS-1, 2, and 3 were produced based on the signal peptide, and P-7 was produced based on the constant region. The following reagents were added in order to carry out the reaction.
【0036】 water 10.6μl 10×PCR反応用buffer 2.0μl デオキシヌクレオタイド三リン酸混液 3.3μl プライマー(+) 1.0μl プライマー(−) 1.0μl ファーストストランドcDNA 2.0μl Taq ポリメレース 0.1μl Total 20.0μl PCRは94℃ 1min 、55℃ 2min ,72℃ 3
min の反応温度で30サイクル行った。Water 10.6 μl Buffer for 10 × PCR 2.0 μl Deoxynucleotide triphosphate mixed solution 3.3 μl Primer (+) 1.0 μl Primer (−) 1.0 μl First strand cDNA 2.0 μl Taq Polymerase 0. 1 μl Total 20.0 μl PCR was performed at 94 ° C. for 1 min, 55 ° C. for 2 min, 72 ° C. 3
Thirty cycles were performed at a reaction temperature of min.
【0037】その結果、約450bpの予想されたサイ
ズの増幅断片が認められた。このことから抗体可変領域
のcDNAが特異的に増幅されたものと考えた。この増
幅断片に関して、塩基配列決定することにした。As a result, an amplified fragment of the expected size of about 450 bp was observed. From this, it was considered that the cDNA of the antibody variable region was specifically amplified. It was decided to determine the base sequence of this amplified fragment.
【0038】実施例9増幅断片のサブクローニング 増幅断片に挿入してある制限酵素部位を用いて、pUC
119シークエンスベクターのEcoRI−Hind I
IIにサブクローニングした。増幅断片は1.5%アガロ
ースゲル電気泳動によって、分離され、グラスビーズを
用いて抽出され、EcoRI−Hind III処理した。
一方、ベクターである、pUC119もEcoRI−H
ind III処理し、制限酵素処理した増幅断片ととも
に、除タンパクを行った後、ライゲーションした。宿主
をMV1184として形質転換を行った。Example 9 Subcloning of Amplified Fragment Using the restriction enzyme sites inserted in the amplified fragment, pUC
119 of the sequence vector Eco RI- Hin d I
Subcloned into II. The amplified fragment of 1.5% agarose gel electrophoresis, separated, extracted with glass beads, and Eco RI- Hin d III process.
On the other hand, the vector, pUC119, is also Eco RI- H.
in d III treated, amplified fragment with that restriction enzyme treatment, after deproteinization, were ligated. Transformation was performed using MV1184 as the host.
【0039】その結果、挿入断片を含むもののが約50
%得られた。これらについてアルカリラピッド法を用い
てサイズ確認したところ、32クローン中30クローン
に目的サイズと思われるプラスミドがみられた。このう
ちの、12クローンに関して、アルカリSDS法によっ
て、挿入断片のサイズ確認を行った。その結果12クロ
ーンすべてが目的サイズの断片を含んでいた。このうち
の、4クローンに関して、一本鎖DNAを調製して、塩
基配列決定を行った。As a result, about 50 clones contained the insert fragment.
% Obtained. When the size of each of these clones was confirmed using the alkaline rapid method, 30 clones out of 32 clones had a plasmid that was considered to be the target size. Of the 12 clones among these, the size of the inserted fragment was confirmed by the alkaline SDS method. As a result, all 12 clones contained fragments of the desired size. For these 4 clones, single-stranded DNA was prepared and the nucleotide sequence was determined.
【0040】実施例10塩基配列決定のための一本鎖DNA配列 挿入断片のサイズを確認した後、ヘルパーファージM1
3KO7を用いて一本鎖を調製した。Example 10 After confirming the size of a single-stranded DNA sequence insert for nucleotide sequencing , the helper phage M1
Single strands were prepared with 3KO7.
【0041】MV1184(pUC119−Insert)を、2×
YT(150μg/ml Ampicillinを含む)で前培養
した。前培養液30μlに、ヘルパーファージM13K
07液(>1010pfu/ml)30μlを加え、3
7℃で30 min静置した。37℃に温めておいた2×Y
T broth(150μg/ml Ampicillin,70
μg/ml Kanamycin ,0.01% thiamineを含
む。)を3ml加えた。37℃で14〜18時間培養し
た。(この時、ヘルパーファージ液の調製と同様に、な
るべく通気性のよい条件で培養した。)培養液をミクロ
遠心管に移し、遠心分離にて菌体を取り除き、上清を別
のミクロ遠心管にとった。培養上清1mlに対して20
0μlのPEG−NaCl溶液を加え、よく混合し、1
5 min室温においた。遠心分離上清を除いた。濾紙等で
完全にPEG−NaCl溶液を取り除いた。沈澱を10
0μlのTE-buffer で完全に溶解させた。TE飽和Phen
olを50μl添加し、約10sec振盪し、約10 min
放置した。クロロホルム:イソアミルアルコールを50
μl添加し、約10sec振盪した。5 min遠心後水層
(上層)を別のミクロ遠心管に移した。10μlの3M
Sodium Acetateを添加し、250μlのcold Ethanol
を加え混和後、−70℃で5 min放置した。長期保存す
る場合はこの状態で置いておいた。5 min遠心し、沈澱
を70% Ethanol で洗浄した。再遠心し、上清を除き
減圧乾燥した。TE−buffer 50μlに沈澱を溶かし、
−20℃に保存した。MV1184 (pUC119-Insert) was added to 2 ×
Precultured with YT (containing 150 μg / ml Ampicillin). Helper phage M13K was added to 30 μl of the preculture medium.
Add 30 μl of solution 07 (> 1010 pfu / ml) and add 3
It was left still at 7 ° C for 30 min. 2 x Y warmed to 37 ° C
T broth (150 μg / ml Ampicillin, 70
It contains μg / ml Kanamycin and 0.01% thiamine. ) Was added. It was cultured at 37 ° C. for 14 to 18 hours. (At this time, like the preparation of the helper phage solution, it was cultivated under conditions with good air permeability.) The culture solution was transferred to a microcentrifuge tube, the bacterial cells were removed by centrifugation, and the supernatant was put into another microcentrifuge tube. I took it. 20 for 1 ml of culture supernatant
Add 0 μl PEG-NaCl solution, mix well,
Placed at room temperature for 5 min. The centrifugation supernatant was removed. The PEG-NaCl solution was completely removed with a filter paper or the like. 10 precipitation
It was completely dissolved in 0 μl of TE-buffer. TE saturated Phen
Add 50 μl of ol, shake for about 10 sec, about 10 min
I left it. Chloroform: Isoamyl alcohol 50
μl was added, and the mixture was shaken for about 10 seconds. After centrifugation for 5 min, the aqueous layer (upper layer) was transferred to another microcentrifuge tube. 10 μl of 3M
Add Sodium Acetate and add 250 μl cold Ethanol
After mixing, the mixture was allowed to stand at -70 ° C for 5 min. It was left in this state for long-term storage. After centrifugation for 5 min, the precipitate was washed with 70% Ethanol. The solution was re-centrifuged, the supernatant was removed, and the residue was dried under reduced pressure. Dissolve the precipitate in 50 μl of TE-buffer,
Stored at -20 ° C.
【0042】実施例11塩基配列決定 塩基配列決定は、Taq Polymerase, Sequenase, Klenow
Fragment等の酵素を用いて行ったが、Taq Polymerase及
びSequenase を用いたとき、きれいなバンドパターンが
みられた。また、Klenow Fragment を用いた場合にはフ
ルストップがみられた。Taq Polymeraseに比べよりバン
ドのシグナルが均一であるSequenase について今回その
塩基配列決定方法を示した。Example 11 Nucleotide Sequence Determination Nucleotide sequence determination was carried out by Taq Polymerase, Sequenase, Klenow
When an enzyme such as Fragment was used, a clean band pattern was observed when Taq Polymerase and Sequenase were used. In addition, a full stop was observed when Klenow Fragment was used. This time, we showed the method for determining the nucleotide sequence of Sequenase, which has a more uniform band signal than Taq Polymerase.
【0043】シークエンス反応 0.5mlチューブの中でアニーリング及びラベリング
を行った。Sequencing reaction Annealing and labeling were performed in a 0.5 ml tube.
【0044】1.アニーリング Primer 1μl 5×Sequenase Buffer 2μl DNA(約1μg) 7μl チューブのキャップをして、65℃で2min インキュベ
ートした後、30min 以上かけて室温に戻した。1. Annealing Primer 1 μl 5 × Sequenase Buffer 2 μl DNA (about 1 μg) 7 μl After capping the tube and incubating at 65 ° C. for 2 min, it was returned to room temperature over 30 min.
【0045】 2.ラベリング DTT 0.1M 1.0μl Diluted Labeling Mix 2.0μl [α−32P]dCTP 0.5μl Diluted Sequenase 2.0μl 3.ターミネーション 4本のチューブにG.A.T.Cと記入し、それぞれの
チューブにTermination Mix 2.5μlをいれた。2. Labeling DTT 0.1M 1.0 μl Diluted Labeling Mix 2.0 μl [α- 32 P] dCTP 0.5 μl Diluted Sequenase 2.0 μl 3. Termination G. 4 tubes. A. T. Enter C and add 2.5 μl of Termination Mix to each tube.
【0046】1.のアニーリングが終ったら、溶液を
2.の反応液に加え、穏やかに撹拌の後、3.5μlず
つ3.のチューブに、液が混ざらないように注意しなが
ら、チューブの縁につけた。室温で5min インキュベー
トし、遠心によって液を混ぜた。もう一度液を混和し、
37℃で5min インキュベートした。各Termination 反
応液に、 Stop Solution 4μlを加えて、十分混和
し、Sequencing Gelにロードする用意ができるまで氷冷
した。用意が整ったら、試料を75〜80℃で2min 加
熱し、その後、4μlずつGelにロードした。50V
/cmで電気泳動を行った。泳動後、ゲルドライヤーを
用いて、ゲルをよく乾燥させ、オートラジオグラフィー
を行った。1. When the annealing of 2 is completed, add the solution to 2. 3. After gently adding to the reaction solution of 3., 3.5 μl each 3. The tube was attached to the edge of the tube, being careful not to mix the liquid. After incubating at room temperature for 5 minutes, the solution was mixed by centrifugation. Mix the liquid again,
Incubated at 37 ° C for 5 min. 4 μl of Stop Solution was added to each Termination reaction solution, mixed well, and cooled on ice until ready to be loaded on a Sequencing Gel. When ready, the sample was heated at 75-80 ° C. for 2 min and then loaded in 4 μl aliquots on the Gel. 50V
Electrophoresis was performed at / cm. After the electrophoresis, the gel was thoroughly dried using a gel dryer and autoradiography was performed.
【0047】その結果、図2に示されるような、本発明
抗体軽鎖をコードするcDNAのヌクレオチド配列が得
られた。このヌクレオチド配列を翻訳することによっ
て、該抗体軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を解明し、図
4に示した。As a result, a nucleotide sequence of cDNA encoding the light chain of the antibody of the present invention as shown in FIG. 2 was obtained. By translating this nucleotide sequence, the amino acid sequence of the variable region of the antibody light chain was elucidated and shown in FIG.
【0048】図4に示したアミノ酸配列を、既知のヒト
型抗体のアミノ酸配列データのリスト(Elvin A.Kabat
et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INT
EREST, FOURTH EDITION, U.S. DEPARTMENT OF HEALTH A
ND HUMAN SERVICES, PublicHealth Service, National
Institute of Health(1987))と比較することにより、
該抗体軽鎖が、κ鎖のサブグループ1〜4の分類のうち
のサブグループ1に属すると判定した。さらに、3つの
CDRを挟む位置に存在する4つのFRのアミノ酸は配
列が、サブグループ毎に大略において保存されているこ
とから、図14、図15および図16に示したアミノ酸
配列が、それぞれ該抗体軽鎖のCDR−1、CDR−2
及びCDR−3であると決定した。これにより該抗体軽
鎖のCDR−1、CDR−2及びCDR−3をコードす
るヌクレオチド配列は、それぞれ図8、図9及び図10
で表されることが明白となった。The amino acid sequence shown in FIG. 4 is a list of amino acid sequence data of known human antibodies (Elvin A. Kabat
et al. , SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INT
EREST, FOURTH EDITION, US DEPARTMENT OF HEALTH A
ND HUMAN SERVICES, PublicHealth Service, National
By comparing with Institute of Health (1987),
The antibody light chain was determined to belong to subgroup 1 of subgroups 1 to 4 of kappa chain. Furthermore, since the sequences of the four FR amino acids existing at the positions sandwiching the three CDRs are generally conserved in each subgroup, the amino acid sequences shown in FIGS. 14, 15 and 16 are CDR-1 and CDR-2 of antibody light chain
And CDR-3. Accordingly, the nucleotide sequences encoding CDR-1, CDR-2 and CDR-3 of the antibody light chain are shown in FIG. 8, FIG. 9 and FIG. 10, respectively.
It became clear that it is represented by.
【0049】以上の操作を本発明抗体の重鎖についても
実施し、夫々の配列を決定した。The above operation was carried out for the heavy chain of the antibody of the present invention, and the respective sequences were determined.
【図1】本発明抗体の重鎖の可変領域をコードするヌク
レオチド配列。FIG. 1 is a nucleotide sequence encoding the variable region of the heavy chain of the antibody of the present invention.
【図2】本発明抗体の軽鎖の可変領域をコードするヌク
レオチド配列。FIG. 2 is a nucleotide sequence encoding the variable region of the light chain of the antibody of the present invention.
【図3】本発明抗体の重鎖の可変領域を構成するアミノ
酸配列。FIG. 3 is an amino acid sequence constituting the variable region of the heavy chain of the antibody of the present invention.
【図4】本発明抗体の軽鎖の可変領域を構成するアミノ
酸配列。FIG. 4 is an amino acid sequence constituting the variable region of the light chain of the antibody of the present invention.
【図5】本発明抗体の重鎖のCDR−1をコードするヌ
クレオチド配列。FIG. 5 is a nucleotide sequence encoding CDR-1 of the heavy chain of the antibody of the present invention.
【図6】本発明抗体の重鎖のCDR−2をコードするヌ
クレオチド配列。FIG. 6 is a nucleotide sequence encoding CDR-2 of the heavy chain of the antibody of the present invention.
【図7】本発明抗体の重鎖のCDR−3をコードするヌ
クレオチド配列。FIG. 7 is a nucleotide sequence encoding CDR-3 of the heavy chain of the antibody of the present invention.
【図8】本発明抗体の軽鎖のCDR−1をコードするヌ
クレオチド配列。FIG. 8 is a nucleotide sequence encoding CDR-1 of the light chain of the antibody of the present invention.
【図9】本発明抗体の軽鎖のCDR−2をコードするヌ
クレオチド配列。FIG. 9 is a nucleotide sequence encoding CDR-2 of the light chain of the antibody of the present invention.
【図10】本発明抗体の軽鎖のCDR−3をコードする
ヌクレオチド配列。FIG. 10 is a nucleotide sequence encoding CDR-3 of the light chain of the antibody of the present invention.
【図11】本発明抗体の重鎖のCDR−1を構成するア
ミノ酸配列。FIG. 11 is an amino acid sequence constituting CDR-1 of the heavy chain of the antibody of the present invention.
【図12】本発明抗体の重鎖のCDR−2を構成するア
ミノ酸配列。FIG. 12 is an amino acid sequence constituting CDR-2 of the heavy chain of the antibody of the present invention.
【図13】本発明抗体の重鎖のCDR−3を構成するア
ミノ酸配列。FIG. 13 is an amino acid sequence constituting CDR-3 of the heavy chain of the antibody of the present invention.
【図14】本発明抗体の軽鎖のCDR−1を構成するア
ミノ酸配列。FIG. 14 is an amino acid sequence constituting CDR-1 of the light chain of the antibody of the present invention.
【図15】本発明抗体の軽鎖のCDR−2を構成するア
ミノ酸配列。FIG. 15 is an amino acid sequence constituting CDR-2 of the light chain of the antibody of the present invention.
【図16】本発明抗体の軽鎖のCDR−3を構成するア
ミノ酸配列。FIG. 16 is an amino acid sequence constituting CDR-3 of the light chain of the antibody of the present invention.
─────────────────────────────────────────────────────
─────────────────────────────────────────────────── ───
【手続補正書】[Procedure amendment]
【提出日】平成5年3月4日[Submission date] March 4, 1993
【手続補正1】[Procedure Amendment 1]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】0027[Name of item to be corrected] 0027
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction content]
【0027】[0027]
【表1】 実施例5モノクローナル抗体の肺癌組織に対する反応性 ホルマリン固定後パラフィン抱埋されたヒト肺癌組織の
薄切をスライドグラスに張り付けた。このスライドグラ
スを、キシレンを用いて脱パラフィンを行い、95%エ
タノール、85%エタノール、75%エタノールに順次
浸し、さらにPBSに浸した。抗体の非特異的吸着を抑
える目的で、ヤギ血清(Vector社製、56倍希
釈)を癌組織上にたらし、25分間インキュベートし
た。次に実施例4で得たBD9D12の培養上清を癌組
織上にたらし、室温で2時間インキュベートした。イン
キュベート後、癌組織をPBSで5分間、3回洗浄し
た。50倍希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトI
gG抗体(Tago社製)を癌組織上にたらし、室温、
1時間インキュベートした。上記と同様に癌組織を洗浄
し、ペルオキシダーゼの基質となる0.5mg/ml
DAB(同仁化学製、cat.No.347−0090
4)および0.01% H2O2を含む50mMTri
s−HCl(pH7.4)を用いて抗体の癌組織に対す
る反応性を調べた。結果の判定は、癌組織の染色の度合
を Negative (−) Weakly positive (+) Positive (++) Strongly positive (+++) の4段階に分けた。対照としたヒト血清IgGは調べた
全ての肺癌組織については(−)と判定された。BD9
D12についての結果は、表2に示す。[Table 1] Example 5 Reactivity of Monoclonal Antibody to Lung Cancer Tissue A thin slice of human lung cancer tissue embedded in paraffin after being fixed with formalin was attached to a slide glass. The slide glass was deparaffinized using xylene, successively dipped in 95% ethanol, 85% ethanol and 75% ethanol, and further dipped in PBS. For the purpose of suppressing nonspecific adsorption of antibody, goat serum (manufactured by Vector, 56-fold diluted) was spread on the cancer tissue and incubated for 25 minutes. Next, the BD9D12 culture supernatant obtained in Example 4 was spread on the cancer tissue and incubated at room temperature for 2 hours. After the incubation, the cancer tissue was washed with PBS three times for 5 minutes. Peroxidase-labeled goat anti-human I diluted 50 times
gG antibody (manufactured by Tago) was spread on the cancer tissue,
Incubated for 1 hour. The cancer tissue was washed in the same manner as described above, and 0.5 mg / ml serving as a substrate for peroxidase
DAB (manufactured by Dojindo, cat. No. 347-0090)
4) and 50 mM Tri containing 0.01% H 2 O 2.
The reactivity of the antibody with respect to the cancer tissue was examined using s-HCl (pH 7.4). For the determination of the results, the degree of staining of the cancer tissue was divided into four stages of Negative (−) Weakly positive (+) Positive (++) Strong positive (+++). The control human serum IgG was judged as (-) for all the lung cancer tissues examined. BD9
The results for D12 are shown in Table 2.
【手続補正2】[Procedure Amendment 2]
【補正対象書類名】図面[Document name to be corrected] Drawing
【補正対象項目名】図8[Correction target item name] Figure 8
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction content]
【図8】 [Figure 8]
【手続補正3】[Procedure 3]
【補正対象書類名】図面[Document name to be corrected] Drawing
【補正対象項目名】図14[Name of item to be corrected] Fig. 14
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction content]
【図14】 FIG. 14
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12N 5/24 15/07 15/13 G01N 33/574 D 9015−2J 33/577 B 9015−2J 8931−4B C12N 15/00 A ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 5 Identification code Internal reference number FI Technical display location C12N 5/24 15/07 15/13 G01N 33/574 D 9015-2J 33/577 B 9015-2J 8931-4B C12N 15/00 A
Claims (16)
株と反応し、ヒト正常繊維芽細胞株と反応せず、またヒ
ト肺癌組織と反応するヒト型モノクローナル抗体。1. A humanized monoclonal antibody that reacts with human lung cancer, breast cancer, gastric cancer, and colon cancer cell lines, does not react with human normal fibroblast cell lines, and reacts with human lung cancer tissue.
(微工研菌寄第13235号)の産生する請求項1記載
のヒト型モノクローナル抗体。2. A human-human hybridoma BD9D12.
The humanized monoclonal antibody according to claim 1, which is produced by (Microtechnology Research Institute, No. 13235).
ナル抗体をコードするcDNA。3. A cDNA encoding the humanized monoclonal antibody according to claim 1 or 2.
Aが、図1に記載のヌクレオチド配列を含むことを特徴
とする請求項3記載のcDNA。4. A cDNA encoding the variable region of an antibody heavy chain.
The cDNA according to claim 3, wherein A comprises the nucleotide sequence shown in FIG. 1.
Aが、図2に記載のヌクレオチド配列を含むことを特徴
とする請求項3記載のcDNA。5. A cDNA encoding the variable region of an antibody light chain
The cDNA according to claim 3, wherein A comprises the nucleotide sequence shown in FIG. 2.
ノ酸配列で表されることを特徴とする抗体。6. An antibody, wherein the variable region of the antibody heavy chain is represented by the amino acid sequence shown in FIG.
ノ酸配列で表されることを特徴とする抗体。7. An antibody, wherein the variable region of the antibody light chain is represented by the amino acid sequence shown in FIG.
重鎖の可変領域をコードすることを特徴とするDNA。8. A DNA encoding the variable region of an antibody heavy chain consisting of the amino acid sequence shown in FIG.
軽鎖の可変領域をコードすることを特徴とするDNA。9. A DNA encoding the variable region of an antibody light chain consisting of the amino acid sequence shown in FIG.
よびCDR−3がそれぞれ図5、図6および図7に記載
のヌクレオチド配列でコードされることを特徴とする請
求項3記載のcDNA。10. The cDNA according to claim 3, wherein CDR-1, CDR-2 and CDR-3 of the antibody heavy chain are encoded by the nucleotide sequences shown in FIG. 5, FIG. 6 and FIG. 7, respectively. .
よびCDR−3がそれぞれ図8、図9および図10に記
載のヌクレオチド配列でコードされることを特徴とする
請求項3記載のcDNA。11. The cDNA according to claim 3, wherein the antibody light chain CDR-1, CDR-2 and CDR-3 are encoded by the nucleotide sequences shown in FIG. 8, FIG. 9 and FIG. 10, respectively. .
よびCDR−3としてそれぞれ図11、図12および図
13に記載のアミノ酸配列のうちの少なくとも1つを有
することを特徴とする抗体。12. An antibody having at least one of the amino acid sequences shown in FIG. 11, FIG. 12 and FIG. 13 as CDR-1, CDR-2 and CDR-3 of the antibody heavy chain, respectively.
よびCDR−3としてそれぞれ図14、図15および図
16に記載のアミノ酸配列のうちの少なくとも1つを有
することを特徴とする抗体。13. An antibody, which has at least one of the amino acid sequences shown in FIGS. 14, 15 and 16 as CDR-1, CDR-2 and CDR-3 of the antibody light chain, respectively.
に記載のアミノ酸配列から成る抗体重鎖のCDR−1、
CDR−2およびCDR−3の少なくとも1つをコード
することを特徴とするDNA。14. FIGS. 11, 12 and 13 respectively.
CDR-1 of the antibody heavy chain consisting of the amino acid sequence of
A DNA encoding at least one of CDR-2 and CDR-3.
に記載のアミノ酸配列から成る抗体軽鎖のCDR−1、
CDR−2およびCDR−3の少なくとも1つをコード
することを特徴とするDNA。15. FIGS. 14, 15 and 16 respectively.
CDR-1 of the antibody light chain consisting of the amino acid sequence described in
A DNA encoding at least one of CDR-2 and CDR-3.
2(微工研菌寄第13235号)。16. A human-human hybridoma BD9D1.
2 (Ministry of Microbiological Research, No. 13235).
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP4318702A JPH06153984A (en) | 1992-11-27 | 1992-11-27 | Antibody and antibody cdna |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP4318702A JPH06153984A (en) | 1992-11-27 | 1992-11-27 | Antibody and antibody cdna |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH06153984A true JPH06153984A (en) | 1994-06-03 |
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ID=18102049
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP4318702A Pending JPH06153984A (en) | 1992-11-27 | 1992-11-27 | Antibody and antibody cdna |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH06153984A (en) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1495053A4 (en) * | 2001-10-11 | 2006-05-31 | Amgen Inc | Angiopoietin-2 specific binding agents |
US10336820B2 (en) | 2008-02-20 | 2019-07-02 | Amgen Inc. | Antibodies directed to angiopoietin-1 and angiopoietin-2 and uses thereof |
-
1992
- 1992-11-27 JP JP4318702A patent/JPH06153984A/en active Pending
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1495053A4 (en) * | 2001-10-11 | 2006-05-31 | Amgen Inc | Angiopoietin-2 specific binding agents |
US7521053B2 (en) | 2001-10-11 | 2009-04-21 | Amgen Inc. | Angiopoietin-2 specific binding agents |
EP2272869A3 (en) * | 2001-10-11 | 2011-05-11 | Amgen Inc. | Angiopoietin-2 specific binding agents |
US10336820B2 (en) | 2008-02-20 | 2019-07-02 | Amgen Inc. | Antibodies directed to angiopoietin-1 and angiopoietin-2 and uses thereof |
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