JPH0615167A - Porous separating membrane - Google Patents
Porous separating membraneInfo
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- JPH0615167A JPH0615167A JP4178566A JP17856692A JPH0615167A JP H0615167 A JPH0615167 A JP H0615167A JP 4178566 A JP4178566 A JP 4178566A JP 17856692 A JP17856692 A JP 17856692A JP H0615167 A JPH0615167 A JP H0615167A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、多孔性分離膜に関す
る。詳しくは、細胞やウイルスなどを液体中から選択的
に吸着できる多孔性分離膜に関する。FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to a porous separation membrane. Specifically, it relates to a porous separation membrane capable of selectively adsorbing cells, viruses, etc. from a liquid.
【０００２】[0002]
【従来技術】膜分離技術は、限外濾過膜、逆浸透膜、イ
オン交換膜、ガス分離膜、浸透気化膜などの研究を通じ
て広く産業界に浸透している技術ではあるが、その原理
としては濃度差、圧力差、電位差等を利用した膜孔径に
よる分離に基づくものが多く、積極的に選択的認識機構
を膜表面に導入して設計された分離膜は少ない。2. Description of the Related Art Membrane separation technology is a technology widely used in the industry through research on ultrafiltration membranes, reverse osmosis membranes, ion exchange membranes, gas separation membranes, pervaporation membranes, etc. Most of them are based on separation based on the membrane pore size utilizing the difference in concentration, the difference in pressure, the difference in potential, etc., and there are few separation membranes designed by actively introducing a selective recognition mechanism on the membrane surface.
【０００３】選択的認識機構を利用した吸着分離システ
ムとしては、吸着用ビーズを用いたカラム法が良く知ら
れている。生化学分野における精製手法として用いられ
ているアフィニティクロマトグラフィー法や医療分野で
使用されている低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）を血漿中よ
り選択的に吸着除去する硫酸デキストラン固定化ビーズ
などを例示できる。A column method using adsorption beads is well known as an adsorption separation system utilizing a selective recognition mechanism. Examples thereof include affinity chromatography method used as a purification method in the biochemistry field and dextran sulfate-immobilized beads that selectively adsorb and remove low density lipoprotein (LDL) used in the medical field from plasma.
【０００４】ところで、細胞やウイルス、あるいは生体
由来物質などに対する選択的認識能を膜表面に付与する
には、生体の有する選択的認識能、例えば、抗原−抗
体、酵素−基質、細胞表面のリセプターなどを利用する
方法がある。この方法の問題点は、リガンドとする物質
が生体由来の蛋白質のため高価なこと、熱や酸などによ
り変性しやすく滅菌や取り扱いが難しいこと、などであ
る。By the way, in order to impart a selective recognition ability for cells, viruses, or substances derived from a living body to a membrane surface, a selective recognition ability possessed by a living body, for example, an antigen-antibody, an enzyme-substrate, a receptor on a cell surface is used. There is a method to use etc. Problems with this method are that the substance used as a ligand is expensive because it is a protein of biological origin, and it is easily denatured by heat, acid, etc. and is difficult to sterilize and handle.
【０００５】一方、従来の膜によるウイルス除去方法と
しては、再生セルロ−ス多孔質膜により濾過する方法が
ある。この膜の孔径は、ウイルスの大きさより小さいた
め、ウイルスは透過できない。しかしながら、孔径が小
さいために透過速度が小さく目詰まりが生じやすいなど
の問題点を有している。また、ポリビニルピリジニウム
などのポリカチオン構造を表面に有する多孔質膜を用い
て、不純物の少ない水中から静電相互作用を利用してウ
イルスを吸着する例がある。しかしながら、この方法で
は、血漿などのタンパク質を含む溶液からはウイルスを
充分に吸着することができなかった。On the other hand, as a conventional method for removing viruses by using a membrane, there is a method of filtering with a regenerated cellulose porous membrane. Since the pore size of this membrane is smaller than the size of the virus, it cannot penetrate the virus. However, since the pore size is small, there is a problem that the permeation rate is low and clogging is likely to occur. In addition, there is an example in which a virus is adsorbed from water containing few impurities by using electrostatic interaction using a porous film having a polycation structure such as polyvinylpyridinium on the surface. However, this method could not sufficiently adsorb the virus from the solution containing protein such as plasma.
【０００６】また、細胞をフィルターに吸着させて分離
する方法としては、「濾過用繊維フィルター」がある。
このフィルターは、白血球が適度の疎水性を有する曲率
の小さい曲面に吸着しやすいという性質を利用したもの
である。しかしながら、このような濾材の形状や疎水性
度による吸着分離の場合、白血球側の認識能力が強い新
鮮な血液では除去率が大きくなるものの、保存血液など
では白血球側の認識能力が弱くなるため十分に除去され
なくなるという問題を有していた。すなわち、保存血液
中の白血球を捕捉するには、材料側からの白血球の認識
と捕捉が必要ということである。材料表面に、細胞を認
識する分子を導入する方法としては、細胞表層の負に電
荷した糖蛋白に静電的相互作用を及ぼすポリカチオンを
材料表面に固定化する方法が知られている。しかしなが
ら、培養液や血液などの蛋白質等が共存する液体中から
は、前述のウイルスの場合と同様に細胞への選択性に乏
しかったり、細胞に与えるダメージ（毒性）が問題とな
っていた。[0006] As a method for adsorbing cells to a filter to separate them, there is a "fiber filter for filtration".
This filter utilizes the property that white blood cells are easily adsorbed on a curved surface having a moderate hydrophobicity and a small curvature. However, in the case of adsorptive separation based on the shape and hydrophobicity of such a filter medium, although the removal rate increases with fresh blood having a strong leukocyte-side recognizing ability, the leukocyte-side recognizing ability becomes weak in preserved blood, etc. It had a problem that it could not be removed. That is, in order to capture leukocytes in stored blood, it is necessary to recognize and capture leukocytes from the material side. As a method for introducing a cell-recognizing molecule into the material surface, a method is known in which a polycation having an electrostatic interaction with a negatively charged glycoprotein on the cell surface is immobilized on the material surface. However, as in the case of the above-mentioned virus, there is a problem in that it has poor selectivity to cells or damage (toxicity) to cells from a liquid such as a culture solution or blood in which proteins and the like coexist.
【０００７】[0007]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、取り扱いが
容易であり、しかも細胞やウイルスなどに対しての選択
的な相互作用を有する簡便で処理速度の優れた機能性分
離膜を提供することを目的とする。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention provides a functional separation membrane which is easy to handle, has a simple interaction with selective interaction with cells and viruses, and has an excellent processing speed. With the goal.
【０００８】[0008]
【問題点を解決するための手段】上記本発明の目的は以
下に示す多孔性分離膜によって達成される。 （１）分子内に１級および２級アミンを有し該アミン間
には疎水性部を有する分子量が６００以下のポリアミン
化合物を表面に結合させてなる多孔性分離膜。 （２）ポリアミン化合物が脂肪族ポリアミンである
（１）に記載の多孔性分離膜。 （３）ポリアミン化合物がスペルミジンもしくはスペル
ミンである（１）または（２）に記載の多孔性分離膜。 （４）前記表面と前記ポリアミン化合物との間に前記表
面による蛋白吸着を抑制する層を設けた（１）〜（３）
のいずれかに記載の多孔性分離膜。The above objects of the present invention are achieved by the following porous separation membrane. (1) A porous separation membrane having a surface of a polyamine compound having a primary or secondary amine in the molecule and a hydrophobic portion between the amines and having a molecular weight of 600 or less. (2) The porous separation membrane according to (1), wherein the polyamine compound is an aliphatic polyamine. (3) The porous separation membrane according to (1) or (2), wherein the polyamine compound is spermidine or spermine. (4) A layer for suppressing protein adsorption by the surface is provided between the surface and the polyamine compound (1) to (3).
5. The porous separation membrane according to any one of 1.
【０００９】分子内に１級および２級アミンを有するポ
リアミン化合物とは、例えば脂肪族ポリアミンがあり、
生体内ポリアミンとして知られているスペルミジンやス
ペルミンなどを好適に例示できる。基本的な構造とし
て、分子の末端部にアミノ基（１級アミン）、分子内に
イミノ基（２級アミン）を有し、該アミノ基と該イミノ
基の間には炭化水素もしくはハロゲン化炭化水素により
構成される疎水性部が存在することが必要である。尚、
３級アミノ基はあってもなくても構わない。Polyamine compounds having primary and secondary amines in the molecule include, for example, aliphatic polyamines,
Preferable examples include spermidine and spermine, which are known as in-vivo polyamines. The basic structure has an amino group (primary amine) at the end of the molecule and an imino group (secondary amine) in the molecule, and a hydrocarbon or halogenated carbon is present between the amino group and the imino group. It is necessary that there is a hydrophobic part composed of hydrogen. still,
It may or may not have a tertiary amino group.
【００１０】該アミノ基とイミノ基の総和が３〜１０で
あることが好ましい。３未満であるとアミンの量が少な
いため被吸着物との相互作用が少なくなり、また１０よ
り大であると分子量が大きくなるため相互作用が大きく
なり被吸着物への選択性が低下する虞れがある。疎水性
部の構造は特に限定されないが、例えばメチレン鎖［−
（ＣＨ2 ）n −］であり、好ましくはｎが２〜２０以
上、さらに好ましくはｎが３〜１０である。ｎが２以上
であれば、疎水性部としての充分な機能を果たす。ｎが
２０以下であれば、分子量が大きくなり過ぎていないの
で、疎水性相互作用に起因する非選択的蛋白吸着の増加
や水系溶媒への溶解性の低下が起こらず、充分な効果の
発現が期待できる。The sum of the amino group and the imino group is preferably 3-10. When it is less than 3, the amount of amine is small and thus the interaction with the substance to be adsorbed is small, and when it is greater than 10, the molecular weight is large and the interaction is large and the selectivity to the substance to be adsorbed may be lowered. There is The structure of the hydrophobic part is not particularly limited, but for example, a methylene chain [-
(CH2) n-], preferably n is 2 to 20 or more, and more preferably n is 3 to 10. When n is 2 or more, it has a sufficient function as a hydrophobic portion. When n is 20 or less, the molecular weight does not become too large, so that non-selective protein adsorption due to hydrophobic interaction does not increase and solubility in an aqueous solvent does not decrease, and sufficient effect is exhibited. Can be expected.
【００１１】ポリアミンの分子量は６００以下、好まし
くは１００〜３００である。分子量が大きくなると、蛋
白成分や細胞成分などに及ぼす作用が強くなり、蛋白成
分の変性や細胞毒性が発現するようになるので分子量を
６００以下とする必要がある。また、分子量が１００以
上であればポリアミンの高分子効果による細胞やウイル
スなどへの吸着作用が充分であり、３００以下であると
ウイルスや細胞に対する選択性が向上する。The polyamine has a molecular weight of 600 or less, preferably 100 to 300. When the molecular weight becomes large, the action on the protein component or cell component becomes strong, and the protein component becomes denatured or cytotoxic. Therefore, the molecular weight needs to be 600 or less. If the molecular weight is 100 or more, the polymer effect of polyamine is sufficient to adsorb cells and viruses, and if it is 300 or less, the selectivity for viruses and cells is improved.
【００１２】本発明の多孔性分離膜の基材となる多孔性
膜は、セルロースやその誘導体などの天然高分子、ある
いはポリオレフィン、ポリアミド、ポリウレタン、ポリ
エステル、ポリサルホン、ポリアクリルニトリルなどの
合成高分子を素材として成形された中空糸状、平膜状、
不織布状、織布状、チューブ状の多孔質体であり、濾過
できる連通孔を有している多孔性膜であればよい。好ま
しくは、寸法安定性に優れ、親水性であり、かつ水に対
して膨潤性の基材、たとえばポリプロピレンやポリフッ
化ビニリデンなど疎水性素材より成膜された後、親水性
ポリマーのコーティングやグラフト重合により親水化さ
れた膜である。The porous membrane as the base material of the porous separation membrane of the present invention is a natural polymer such as cellulose or a derivative thereof, or a synthetic polymer such as polyolefin, polyamide, polyurethane, polyester, polysulfone or polyacrylonitrile. Hollow fiber shaped, flat membrane shaped,
It may be a non-woven fabric, a woven fabric, or a tubular porous body as long as it is a porous membrane having communication holes that can be filtered. Preferably, after being formed into a film from a substrate having excellent dimensional stability, hydrophilicity, and swelling in water, for example, a hydrophobic material such as polypropylene or polyvinylidene fluoride, coating or graft polymerization of a hydrophilic polymer. It is a membrane hydrophilized by.
【００１３】本発明の多孔性分離膜の孔径等の数値は捕
捉する対象によって、あるいは膜の厚さや膜の積層枚数
等により影響を受けるが、モジュール化した際に、目詰
まりが起こらず、吸着率が低下しないような範囲に設定
することが望ましい。Numerical values such as the pore size of the porous separation membrane of the present invention are influenced by the object to be trapped, the thickness of the membrane, the number of laminated layers of the membrane, etc. It is desirable to set the range so that the rate does not decrease.
【００１４】即ち、本発明の多孔性分離膜は、平均直径
１００μ以下の多数の交差するフィラメントより形成さ
れた不織布形状、もしくは、最大孔径０．１〜３０．０
μ、空孔率２０〜９５％、透水量１０ ml/min/m2/mmHg
以上の多孔質膜であることが好ましい。さらに好ましく
は、最大孔径０．２〜１．０μ、空孔率４０〜９０％、
透水量１００ ml/min/m2/mmHg 以上である。最大孔径が
０．１μ以上であれば、流体の透過速度が良好であり、
尚且つ、目詰まり発生の可能性も低くなる。また、３
０．０μ以下であれば被吸着物に対する相互作用が良好
に働く。空孔率が２０％以上であれば、充分な透過速度
が得られ、９５％以下であれば物性的に充分である。ま
た、本発明の多孔性分離膜の透水量は、好ましくは１０
ml/min/m2/mmHg 以上、さらに好ましくは１００ ml/mi
n/m2/mmHg 以上であることが、濾過圧を低くできるため
好ましい。最大孔径、空孔率、透水量はポリアミンを結
合して本発明の多孔性膜とした状態で測定したものであ
る。That is, the porous separation membrane of the present invention has a non-woven fabric shape formed of a large number of intersecting filaments having an average diameter of 100 μ or less, or has a maximum pore diameter of 0.1 to 30.0.
μ, Porosity 20-95%, Permeability 10 ml / min / m2 / mmHg
The above porous film is preferable. More preferably, the maximum pore diameter is 0.2 to 1.0 μ, the porosity is 40 to 90%,
The water permeability is 100 ml / min / m2 / mmHg or more. If the maximum pore size is 0.1μ or more, the fluid permeation rate is good,
Moreover, the possibility of clogging is reduced. Also, 3
If it is 0.0 μm or less, the interaction with the substance to be adsorbed works well. When the porosity is 20% or more, a sufficient permeation rate is obtained, and when it is 95% or less, the physical properties are sufficient. The water permeability of the porous separation membrane of the present invention is preferably 10
ml / min / m2 / mmHg or more, more preferably 100 ml / mi
It is preferably n / m2 / mmHg or more because the filtration pressure can be lowered. The maximum pore diameter, porosity, and water permeation amount are measured in the state where the polyamine is bound to form the porous membrane of the present invention.
【００１５】フィルター材として不織布を用いた場合、
これを形成するフィラメントは、モノフィラメントであ
ってもマルチフィラメントであってもよいが、平均直径
が１００μ以下、好ましくは、５０μ以下であることが
膜の表面積を大きくでき、吸着部位が増加するため好ま
しい。When a non-woven fabric is used as the filter material,
The filament forming this may be a monofilament or a multifilament, but it is preferable that the average diameter is 100 μm or less, preferably 50 μm or less because the surface area of the membrane can be increased and the adsorption sites increase. .
【００１６】ポリアミン化合物は、公知の方法を用いて
膜表面に固定化することができる。例えば、基材表面に
グラフト重合法、コーティング法、化学修飾法、酸化法
などにより、エポキシ基、アミノ基、アルデヒド基、カ
ルボキシル基、ヒドロキシル基、酸クロライド基などの
官能基を導入した後、ポリアミン化合物のアミノ基と直
接もしくはカップリング剤やスペーサーを介して表面に
固定化することができる。好ましくは、グリシジルアク
リレートもしくはグリシジルメタクリレートなどのエポ
キシ基を有する単量体を材料表面にグラフト重合した
後、該エポキシ基を利用してポリアミン化合物を固定化
する方法である。The polyamine compound can be immobilized on the surface of the membrane using a known method. For example, after introducing functional groups such as an epoxy group, an amino group, an aldehyde group, a carboxyl group, a hydroxyl group and an acid chloride group onto the surface of a substrate by a graft polymerization method, a coating method, a chemical modification method, an oxidation method, etc., a polyamine It can be immobilized on the surface directly with the amino group of the compound or through a coupling agent or a spacer. Preferred is a method in which a monomer having an epoxy group such as glycidyl acrylate or glycidyl methacrylate is graft-polymerized on the surface of the material, and then the polyamine compound is immobilized using the epoxy group.
【００１７】尚、ポリアミン化合物の膜表面への固定化
は膜の外表面だけではなく、多孔質細孔の表面にも行わ
れていることが好ましく、上述の固定化方法では細孔表
面への固定化も良好に行うことができる。The immobilization of the polyamine compound on the surface of the membrane is preferably performed not only on the outer surface of the membrane but also on the surface of the porous pores. In the immobilization method described above, the polyamine compound is immobilized on the surface of the pores. Immobilization can also be performed satisfactorily.
【００１８】本発明の多孔性分離膜は膜表面に固定化さ
れたポリアミンがウイルスや細胞といった被吸着物と選
択的に相互作用するためには、被処理液中の蛋白質との
相互作用が小さいことが望ましい。即ち、蛋白吸着を抑
制する表面、例えば水溶性高分子よりなるグラフト鎖や
蛋白吸着を抑制するポリマーでコートした表面であるこ
とが望ましい。具体的には、２−メトキシエチルアクリ
レートより構成されたポリマーもしくはコポリマーをコ
ートもしくは表面グラフト重合した材料、あるいは水溶
性ポリマーであるポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミ
ド）よりなるグラフト鎖を表面に有する材料などを例示
できる。これにより本発明の多孔性分離膜はより一層の
選択性向上を期待できる。In the porous separation membrane of the present invention, since the polyamine immobilized on the membrane surface selectively interacts with the adsorbate such as virus or cell, the interaction with the protein in the liquid to be treated is small. Is desirable. That is, a surface that suppresses protein adsorption, such as a surface coated with a water-soluble polymer graft chain or a polymer that suppresses protein adsorption, is desirable. Specifically, a material obtained by coating or surface-grafting a polymer or copolymer composed of 2-methoxyethyl acrylate, or a material having a graft chain of poly (N, N-dimethylacrylamide), which is a water-soluble polymer, on the surface. Can be exemplified. As a result, the porous separation membrane of the present invention can be expected to have further improved selectivity.
【００１９】本発明の多孔性分離膜は、種々の用途に使
用することができるが、多くのウイルス・細菌・細胞に
対して親和性や生理活性を有することから、細菌、細
胞、ウイルスなどの検出・分離・保存・培養などの用途
に対して、好適に使用することができる。特に、蛋白質
が共存する条件下においても、細胞やウイルスを選択的
に認識できることが特徴であり、有用性も高い。The porous separation membrane of the present invention can be used for various purposes, but since it has affinity and physiological activity for many viruses, bacteria and cells, it can be used for bacteria, cells, viruses and the like. It can be suitably used for applications such as detection, separation, storage, and culture. In particular, it is characterized by being able to selectively recognize cells and viruses even under the condition that proteins coexist, and is highly useful.
【００２０】本明細書におけるウイルス除去とは、ウイ
ルスの感染能力を低減もしくは失わせることである。そ
の性能は、濾過前の液体に添加した指標ウイルス（１０
2 pfu/ml 以上）が、サイズによる分離でなく、濾材表
面との相互作用により捕捉もしくは除去されることであ
り、少なくとも９０％、好ましくは９９％以上のウイル
ス除去率が望ましい。The term “virus removal” as used herein means to reduce or eliminate the infectivity of a virus. Its performance is based on the indicator virus (10
2 pfu / ml or more) is not separated by size, but is captured or removed by interaction with the surface of the filter medium, and a virus removal rate of at least 90%, preferably 99% or more is desirable.
【００２１】本発明におけるウイルス除去とは、ウイル
スが存在することが確認されている液体や気体からのウ
イルス除去ばかりでなく、ウイルス感染を予防する目的
での使用、あるいは熱や薬剤を用いたウイルス不活化防
止法と併用したバックアップ的な使用なども、本発明に
おけるウイルス除去に含まれる。The removal of viruses in the present invention means not only removal of viruses from liquids or gases in which the presence of viruses has been confirmed, but also use for the purpose of preventing viral infection, or viruses using heat or drugs. Backup use in combination with the inactivation prevention method is also included in virus removal in the present invention.
【００２２】本明細書に用いた用語を以下に定義する。 ・通水量は、０．７[kg/cm2]の圧力下で、２５℃±２℃
で測定した値である。 ・空孔率は式Ａで表される値である。式Ａ：空孔率
（％）＝空孔部の体積／（空孔部の体積＋フィルタ−実
質部の体積）×１００ ・膜の最大孔径は、バブルポイント法（ＡＳＴＭ−Ｆ３
１６参考）に従ってイソプロピルアルコ−ルを溶媒とし
て測定した値より求めた。 ・フィラメント直径は、走査型電子顕微鏡で観察したフ
ィラメントの長径と短径の平均値のことであり、異形フ
ィラメントであっても多孔質フィラメントであっても良
い。 ・ウイルスの定量は、プラ−ク（溶菌班）法により行っ
た。すなわち、検体を宿主細胞もしくは宿主細菌と接触
させてたのち、ウイルスに感染することにより生成する
プラ−ク（溶菌班）数を測定することにより求めた。ウ
イルス除去（捕捉）率は、式Ｂにより算出した。式Ｂ：
ウイルス除去（捕捉）率（％）＝（１−生存ウイルス数
／原液中のウイルス数）×１００ （％）。The terms used in this specification are defined below.・ Water flow rate is 25 ℃ ± 2 ℃ under 0.7 [kg / cm2] pressure.
It is the value measured in. -The porosity is a value represented by the formula A. Formula A: Porosity (%) = Volume of voids / (Volume of voids + Volume of filter-Substantial part) x 100-The maximum pore diameter of the membrane is the bubble point method (ASTM-F3).
16 Reference) and obtained from the value measured using isopropyl alcohol as a solvent. The filament diameter is the average value of the major axis and the minor axis of the filament observed with a scanning electron microscope, and may be a deformed filament or a porous filament. The virus was quantified by the plaque method. That is, it was determined by contacting the sample with host cells or host bacteria, and then measuring the number of plaques (lysing plaques) produced by infection with the virus. The virus removal (capture) rate was calculated by the formula B. Formula B:
Virus removal (capture) rate (%) = (1-number of viable viruses / number of viruses in stock solution) × 100 (%).
【００２３】[0023]
【作用】スペルミンやスペルミジンなどのポリアミン化
合物は、真核細胞や原核細胞を問わず生物が保有してお
り、陰性電荷に富む細胞膜や核酸を初めとして種々の生
体高分子に作用してそれらの機能に影響を与えることが
知られている。（例えば、化学と生物、第２８巻、３
号、１６２〜１７１ペ−ジ、１９９１年、白幡晶著：
The Physiology of Polyamines, ed by U.Bachrach and
Y.M.Heimer, CRC Press, Boca Raton, 1989 :The bioc
hemical Journal,vol.260, p1-10, 1989. F.Schuber:
など )これらのポリアミンは、両末端にアミノ基を有
し、細胞内の中性条件下では分子内の窒素原子がイオン
化しているポリカチオンであるが、その分子量はスペル
ミンで２０２、スペルミジンで１４５であり、天然高分
子や合成高分子の分子量と比較すると非常に小さく、細
胞内や細胞膜の移動やその生理活性の発現に適している
ものと推測される。一方、高分子量のポリカチオン化合
物、例えば分子量が２０００を越えるようなポリエチレ
ンイミン、ポリアリルアミン、ポリビニルピリジニウム
などを材料表面に固定化した場合、血液や培養液のよう
に蛋白質などが共存する条件下では、それらの蛋白質と
の相互作用が強くなり非特異的な吸着が増加して、細胞
やウイルスなどへの選択性が失われてしまうこととな
る。[Function] Polyamine compounds such as spermine and spermidine are possessed by organisms regardless of whether they are eukaryotic cells or prokaryotic cells, and they act on various biopolymers including cell membranes and nucleic acids rich in negative charge and their functions. Is known to affect. (For example, Chemistry and Biology, Volume 28, 3
Issue 162-171, 1991, Akira Shirahata:
The Physiology of Polyamines, ed by U. Bachrach and
YMHeimer, CRC Press, Boca Raton, 1989: The bioc
hemical Journal, vol.260, p1-10, 1989. F. Schuber:
Etc.) These polyamines are polycations having amino groups at both ends and in which the nitrogen atom in the molecule is ionized under intracellular neutral conditions, but the molecular weight is 202 for spermine and 145 for spermidine. It is very small compared with the molecular weights of natural polymers and synthetic polymers, and it is presumed that it is suitable for the movement of intracellular and cell membranes and the expression of its physiological activity. On the other hand, when a polycation compound having a high molecular weight, such as polyethyleneimine, polyallylamine, or polyvinylpyridinium having a molecular weight of more than 2000, is immobilized on the surface of the material, under conditions where proteins and the like coexist, such as blood and culture solution. However, the interaction with these proteins becomes stronger, nonspecific adsorption increases, and the selectivity for cells, viruses, etc. is lost.
【００２４】細胞の多くは、細胞表面に負に荷電した糖
蛋白質を有しており、ポリカチオン等と静電的に結合す
ることが知られているが、４級アンモニウム塩を有する
強塩基性化合物や高分子量のポリカチオンでは静電相互
作用が強すぎるため、細胞やウイルス等の被吸着物への
選択性が低く、しかも細胞へのダメージが大きくなる。
本発明の多孔性膜は、分子量も小さく共存する蛋白質な
どとの相互作用も小さいため細胞成分との相互作用もマ
イルドとなり、より選択的となる。Most of the cells have a negatively charged glycoprotein on the cell surface and are known to electrostatically bind to polycations and the like, but they are strongly basic with quaternary ammonium salts. Since electrostatic interaction is too strong with compounds and high molecular weight polycations, the selectivity for adsorbates such as cells and viruses is low, and damage to cells is large.
Since the porous membrane of the present invention has a small molecular weight and a small interaction with coexisting proteins and the like, the interaction with a cell component also becomes mild and becomes more selective.
【００２５】脊椎動物のウイルスは、単純なウイルスで
２〜３種類、きわめて複雑なポックルウイルスなどでは
１００種以上にも及ぶ蛋白質やポリペプチドを有してい
る。エンヴェロープを持たない単純なウイルスではカプ
シドと呼ばれる蛋白質の殻を有しており、エンヴェロー
プを有するウイルスではエンヴェロープより突出するペ
プロマーと呼ばれる糖蛋白質がウイルス粒子の表面に存
在している。そのため、ウイルス粒子は正もしくは負の
表面電荷を有している。多くのウイルスは、アニオン性
のリン脂質やシアル酸、あるいはカプシド蛋白質などに
由来するアニオン性部位を有し、高分子量のポリカチオ
ンなどへ静電的相互作用により吸着することが知られて
いる。しかしながら、分子量の大きいポリカチオンも細
胞の場合と同様に前述の理由により、培養液中や血漿中
などのような蛋白質の共存下より選択的にウイルスを吸
着することができない。The vertebrate viruses have proteins of 2 to 3 types as simple viruses and more than 100 types of proteins and polypeptides as extremely complicated pockle virus. A simple virus without an envelope has a protein shell called a capsid, and a virus with an envelope has a glycoprotein called a pepromer protruding from the envelope on the surface of the virus particle. Therefore, virus particles have a positive or negative surface charge. It is known that many viruses have an anionic site derived from anionic phospholipids, sialic acid, capsid proteins, etc. and adsorb to high molecular weight polycations by electrostatic interaction. However, like the case of cells, polycations having a large molecular weight cannot selectively adsorb viruses in the presence of proteins such as in the culture solution or plasma for the same reasons as described above.
【００２６】[0026]
実施例１ ・ポリプロピレン多孔質膜の製造 メルトフローインデックスが３０及び０．３のポリプロ
ピレン混合物（混合重量比１００：４０）１００重量部
当り、３２０重量部の流動パラフィン（数平均分子量３
２４）及び０．３重量部の結晶核形成剤としての１，
３、２，４−ビス（ｐ−エチルベンジリデン）ソルビト
ールを二軸型押出機により溶融混練しペレット化した。
このペレットを上記押出機を用いて１５０〜２００℃で
溶融し、スリット幅０．６ｍｍのＴダイスより空気中に
押し出して、Ｔダイス直下に置かれた冷却液相のガイド
ローラーの回転によってポリエチレングリコ−ルよりな
る冷却固化液中に導き、冷却固化した後巻取った。巻取
ったフィルム状物を一定長に切断し、縦横両方向を固定
した後、１，１，２−トリクロロ−１，２，２−トリフ
ルオロエタン中に１０分間×４回（合計４０分）浸漬し
て流動パラフィンの抽出を行い、次いで１３５℃の空気
中で２分間熱処理し、最大孔径０．５μ、空孔率６９
％、膜厚８０μのポリプロピレンフィルターを得た。Example 1 Production of Porous Polypropylene Membrane 320 parts by weight of liquid paraffin (number average molecular weight: 3) per 100 parts by weight of a polypropylene mixture having a melt flow index of 30 and 0.3 (mixing weight ratio 100: 40).
24) and 0.3 part by weight of 1, as a crystal nucleating agent
3,2,4-bis (p-ethylbenzylidene) sorbitol was melt-kneaded and pelletized by a twin-screw extruder.
The pellets were melted at 150 to 200 ° C. using the above extruder, extruded into the air through a T-die having a slit width of 0.6 mm, and rotated by a guide roller in a cooling liquid phase placed immediately below the T-die to produce polyethylene glycol. It was introduced into a cooling and solidifying solution consisting of a resin, cooled and solidified, and then wound. The wound film is cut to a certain length, fixed in both length and width directions, and then immersed in 1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluoroethane for 10 minutes x 4 times (40 minutes in total). To extract liquid paraffin, and then heat-treat in air at 135 ° C. for 2 minutes to obtain a maximum pore size of 0.5 μ and a porosity of 69.
%, And a film thickness of 80 μ was obtained.
【００２７】・多孔質膜の蛋白吸着抑制表面加工 このようにして得られたポリプロピレンフィルターに、
アルゴンプラズマ（１００Ｗ、０．１Torr、１５秒間）
を照射した後、２−メトキシエチルアクリレ−トガス
（１．０ Torr ）に３分間、グリシジルアクリレートガ
ス（０．７Torr )に１分間接触させて表面グラフト重合
を行い、表面に反応性官能基を有する親水性多孔質膜を
得た。-Protein adsorption-suppressing surface treatment of the porous membrane The polypropylene filter thus obtained,
Argon plasma (100 W, 0.1 Torr, 15 seconds)
After irradiating, the surface was graft-polymerized by contacting it with 2-methoxyethyl acrylate gas (1.0 Torr) for 3 minutes and glycidyl acrylate gas (0.7 Torr) for 1 minute to give reactive functional groups on the surface. A hydrophilic porous membrane having the above was obtained.
【００２８】・ポリアミン化合物の固定 続いて、１ｗｔ％のスペルミジンと触媒としての０．５
ｗｔ％のピリジンを含む水溶液に、６０℃、１８時間浸
漬することにより膜表面にスペルミジンを固定化した。
得られた膜は、メタノールで良く洗浄した後、試料とし
た。ポリプロピレン膜の表面に導入されたポリ（２−メ
トキシエチルアクリレート）とグリシジル基に結合した
スペルミジンは、ＩＲ（ＡＴＲ法）、ＮＭＲ、ＥＳＣＡ
により確認した。Immobilization of polyamine compound Subsequently, 1 wt% of spermidine and 0.5 as a catalyst
Spermidine was immobilized on the membrane surface by immersing in an aqueous solution containing wt% pyridine at 60 ° C. for 18 hours.
The obtained film was thoroughly washed with methanol and then used as a sample. The poly (2-methoxyethyl acrylate) introduced on the surface of the polypropylene film and spermidine bonded to the glycidyl group have IR (ATR method), NMR and ESCA.
Confirmed by.
【００２９】該膜の空孔率は６５％、透水量３８０[ml/
min/m2/mmHg]、最大孔径０．５μであった。この膜を、
ニュークリポア製スウインロックフィルターホルダー
（φ２５ｍｍ）にセットし、ヘルペスウイルス type Ｉ
H.F. 株を約１０4 (PFU/ml)含むＰＢＳバッファー（Ｐ
Ｈ７．３５〜ＰＨ７．６）と人新鮮血より採取した血漿
を、各々１０ｍｌ濾過し、ウイルス除去率を測定したと
ころ、ＰＢＳバッファ−中で９９．９％以上、人血漿中
で９９％であった。また、φＸ１７４（バクテリオファ
−ジ）についても同様に試験を行った結果、人血漿中で
９９％、水中で９９．９％以上の除去率を示した。The membrane has a porosity of 65% and a water permeability of 380 [ml /
min / m2 / mmHg] and the maximum pore size was 0.5μ. This film
Set it on a Nuclepore Swin lock filter holder (φ25 mm) and use herpesvirus type I
PBS buffer containing about 10 4 (PFU / ml) of HF strain (P
H7.35-PH7.6) and plasma collected from human fresh blood were filtered with 10 ml each, and the virus removal rate was measured to be 99.9% or more in PBS buffer and 99% in human plasma. It was Further, φX174 (bacteriophage) was also tested in the same manner, and as a result, it showed a removal rate of 99% in human plasma and 99.9% or more in water.
【００３０】実施例２ スペルミジンに代えて１ｗｔ％のスペルミンを用いた以
外は、実施例１と同様の方法で多孔質分離膜を得た。Example 2 A porous separation membrane was obtained in the same manner as in Example 1 except that 1 wt% spermine was used instead of spermidine.
【００３１】この空孔率は６４％、透水量３８０[ml/mi
n/m2/mmHg]、最大孔径０．５μであった。この膜を、ニ
ュークリポア製スウインロックフィルターホルダー（φ
２５ｍｍ）にセットし、ヘルペスウイルス type Ｉ H.
F. 株を約１０4 (PFU/ml)含むＰＢＳバッファ−（ＰＨ
７．３５〜ＰＨ７．６）と人新鮮血より採取した血漿
を、各々１０ｍｌ濾過し、ウイルス除去率を測定したと
ころ、ＰＢＳバッファー中で９９．９％以上、人血漿中
で９９％であった。また、φＸ１７４（バクテリオファ
−ジ）についても同様に試験を行った結果、人血漿中で
９８％，水中で９９．９％以上の除去率を示した。The porosity is 64% and the water permeability is 380 [ml / mi.
n / m2 / mmHg] and the maximum pore diameter was 0.5 μ. Use this membrane as a Swinlock filter holder (φ
25 mm) and herpesvirus type I H.
PBS buffer containing approximately 10 4 (PFU / ml) of F.
7.35 to PH7.6) and 10 ml of plasma collected from human fresh blood were filtered and the virus removal rate was measured to be 99.9% or more in PBS buffer and 99% in human plasma. . Further, φX174 (bacteriophage) was similarly tested, and as a result, it showed a removal rate of 98% in human plasma and 99.9% or more in water.
【００３２】実施例３ ・ポリフッ化ビニリデン多孔質膜の製造 ポリフッ化ビニリデン粉末（三菱油化（株）製、ｋｙｎ
ａｒ Ｋ３０１）１８重量部を、アセトン７３．８重量
部およびジメチルホルムアミド８．２重量部に溶解して
なる溶液を、ポリエチレンテレフタレートフィルム上に
キャストした後、１，１，２−トリクロロトリフルオロ
エタン浴中に５分間浸漬し、乾燥して膜厚１２５μ、最
大孔径０．４５μのポリフッ化ビニリデン多孔質膜を得
た。Example 3 Production of Polyvinylidene Fluoride Porous Membrane Polyvinylidene fluoride powder (manufactured by Mitsubishi Petrochemical Co., Ltd., kyn)
ar K301) 18 parts by weight dissolved in 73.8 parts by weight of acetone and 8.2 parts by weight of dimethylformamide, cast on a polyethylene terephthalate film, and then in a 1,1,2-trichlorotrifluoroethane bath. It was immersed in the solution for 5 minutes and dried to obtain a polyvinylidene fluoride porous film having a film thickness of 125μ and a maximum pore size of 0.45μ.
【００３３】・多孔質膜の蛋白吸着抑制表面加工および
ポリアミン化合物の固定 ポリフッ化ビニリデン多孔質膜に、実施例１と同様にし
て膜表面に２−メトキシエチルアクリレートをグラフト
重合し、更にスペルミジンを固定化した膜を得た。-Protein adsorption-suppressing surface treatment of porous membrane and immobilization of polyamine compound In the same manner as in Example 1, grafting polymerization of 2-methoxyethyl acrylate on the surface of polyvinylidene fluoride porous membrane and further fixing spermidine. A converted film was obtained.
【００３４】この空孔率は７１％、透水量４３０[ml/mi
n/m2/mmHg]、最大孔径０．４５μであった。この膜を、
ニュークリポア製スウインロックフィルターホルダー
（φ２５ｍｍ）にセットし、ヘルペスウイルス type Ｉ
H.F. 株を約１０4 (PFU/ml)含むＰＢＳバッファー（Ｐ
Ｈ７．３５〜ＰＨ７．６）と人新鮮血より採取した血漿
を、各々１０ｍｌ濾過し、ウイルス除去率を測定したと
ころ、ＰＢＳバッファー中で９９．９％以上、人血漿中
で９８％であった。また、φＸ１７４（バクテリオファ
ージ）についても同様に試験を行った結果、人血漿中で
９８％、水中で９９．９％以上の除去率を示した。The porosity is 71% and the water permeability is 430 [ml / mi.
n / m2 / mmHg] and the maximum pore size was 0.45μ. This film
Set it on a Nuclepore Swin lock filter holder (φ25 mm) and use herpesvirus type I
PBS buffer containing about 10 4 (PFU / ml) of HF strain (P
H7.35-PH7.6) and plasma collected from human fresh blood were filtered with 10 ml each, and the virus removal rate was measured to be 99.9% or more in PBS buffer and 98% in human plasma. . Further, φX174 (bacteriophage) was similarly tested, and as a result, a removal rate of 98% in human plasma and 99.9% or more in water was shown.
【００３５】実施例４ ポリプロピレン製不織布（東燃（株）製タピルス）に、
実施例１と同様にしてスペルミジンを固定化した膜を得
た。Example 4 A polypropylene non-woven fabric (Tapyrus made by Tonen Corporation)
A film having spermidine immobilized thereon was obtained in the same manner as in Example 1.
【００３６】このスペルミジン固定化フィルターをニュ
−クリポア製スウインロックフィルターホルダー（φ２
５ｍｍ）に２０枚積層してセットし、ヘルペスウイルス
type Ｉ H.F. 株を約１０4 (PFU/ml)含むＰＢＳバッフ
ァー（ＰＨ７．３５〜ＰＨ７．６）と人新鮮血より採取
した血漿を、各々１０ｍｌ濾過し、ウイルス除去率を測
定したところ、ＰＢＳバッファー中で９９．９％以上、
人血漿中で９９％であった。また、φＸ１７４（バクテ
リオファージ）についても同様に試験を行った結果、人
血漿中で９９％、水中で９９．９％以上の除去率を示し
た。This spermidine-immobilized filter is used in a Nuclelipor Swinlock filter holder (φ2
5 mm) with 20 sheets stacked and set, herpes virus
A PBS buffer (PH7.35-PH7.6) containing about 10 4 (PFU / ml) of type I HF strain and 10 ml of plasma collected from human fresh blood were filtered and the virus removal rate was measured. More than 99.9%,
It was 99% in human plasma. Further, φX174 (bacteriophage) was also tested in the same manner, and as a result, a removal rate of 99% in human plasma and 99.9% or more in water was shown.
【００３７】実施例５ 実施例１で用いたポリプロピレン多孔質膜にアルゴンプ
ラズマ（１００Ｗ、０．１Torr、１５秒間）を照射した
後、グリシジルアクリレートガス（０．７Torr)に５分
間接触させて表面グラフト重合を行い、表面に反応性官
能基を有する親水性多孔質膜を得た。続いて、１ｗｔ％
のスペルミジンと０．５ｗｔ％のピリジンを含む水溶液
に、６０℃、５時間浸漬することにより膜表面にスペル
ミジンを固定化した。Example 5 The polypropylene porous film used in Example 1 was irradiated with argon plasma (100 W, 0.1 Torr, 15 seconds), and then contacted with glycidyl acrylate gas (0.7 Torr) for 5 minutes for surface grafting. Polymerization was performed to obtain a hydrophilic porous film having a reactive functional group on the surface. Then 1 wt%
The spermidine was immobilized on the membrane surface by immersing in an aqueous solution containing spermidine and 0.5 wt% pyridine at 60 ° C. for 5 hours.
【００３８】このスペルミジン固定化フィルターをニュ
ークリポア製スウインロックフィルターホルダー（φ２
５ｍｍ）に３枚積層してセットし、ヘルペスウイルス t
ypeＩ H.F. 株を約１０4 (PFU/ml)含むＰＢＳバッファ
ー（ＰＨ７．３５〜ＰＨ７．６）と人新鮮血より採取し
た血漿を、各々１０ｍｌ濾過し、ウイルス除去率を測定
したところ、ＰＢＳバッファー中で９９．９％以上、人
血漿中で９１％であった。また、φＸ１７４（バクテリ
オファージ）についても同様に試験を行った結果、人血
漿中で９０％、水中で９９．９％以上の除去率を示し
た。[0038] This spermidine-immobilized filter is used in a New Krepoir swin lock filter holder (φ2
5 mm) and stack 3 sheets to set herpesvirus t
PBS buffer (PH7.35-PH7.6) containing about 10 4 (PFU / ml) of ypeI HF strain and 10 ml each of plasma collected from fresh human blood were filtered, and the virus removal rate was measured. It was 99.9% or more and 91% in human plasma. Further, φX174 (bacteriophage) was also similarly tested, and as a result, a removal rate of 90% in human plasma and 99.9% or more in water was shown.
【００３９】比較例１ 実施例１と同様の方法で、２−メトキシエチルアクリレ
ートとグリシジルアクリレートを表面グラフト重合した
膜を作製し、ウイルス除去試験を行った。Comparative Example 1 In the same manner as in Example 1, a film obtained by surface-grafting polymerization of 2-methoxyethyl acrylate and glycidyl acrylate was prepared and a virus removal test was conducted.
【００４０】該フィルターは、ＰＢＳバッファ−中、血
漿中のどちらにおいても、ヘルペスウイルス、φＸ１７
４の各除去率は５０％以下であり、除去することができ
なかった。The filter was a herpes virus, φX17, either in PBS buffer or in plasma.
Each removal rate of No. 4 was 50% or less and could not be removed.
【００４１】比較例２ 実施例１と同様の方法で、平均分子量１２００のポリエ
チレンイミンを固定化したポリプロピレン多孔質膜を作
製した。Comparative Example 2 In the same manner as in Example 1, a polypropylene porous membrane having polyethyleneimine having an average molecular weight of 1200 fixed thereon was prepared.
【００４２】この空孔率は６４％、透水量３４０[ml/mi
n/m2/mmHg]、最大孔径０．５μであった。この膜を、ニ
ュークリポア製スウインロックフィルターホルダー（φ
２５ｍｍ）にセットし、ヘルペスウイルス type Ｉ H.
F. 株を約１０4 (PFU/ml)含むＰＢＳバッファー（ＰＨ
７．３５〜ＰＨ７．６）と人新鮮血より採取した血漿
を、各々１０ｍｌ濾過し、ウイルス除去率を測定したと
ころ、ＰＢＳバッファー中で９９．９％以上、人血漿中
で６９％であった。また、φＸ１７４（バクテリオファ
−ジ）についても同様に試験を行った結果、人血漿中で
４７％、水中で９９．９％以上の除去率を示した。水中
ではウイルスを捕捉できるものの、血漿中ではウイルス
を除去することができなかった。The porosity is 64% and the water permeability is 340 [ml / mi
n / m2 / mmHg] and the maximum pore diameter was 0.5 μ. Use this membrane as a Swinlock filter holder (φ
25 mm) and herpesvirus type I H.
PBS buffer containing approximately 10 4 (PFU / ml) of F. strain (PH
7.35 to PH7.6) and 10 ml of plasma collected from human fresh blood were filtered and the virus removal rate was measured to be 99.9% or more in PBS buffer and 69% in human plasma. . Further, φX174 (bacteriophage) was also tested in the same manner, and as a result, it showed a removal rate of 47% in human plasma and 99.9% or more in water. Although the virus could be trapped in water, it could not be removed in plasma.
【００４３】比較例３ 実施例１で基材として用いたポリプロピレンフィルター
に、アルゴンプラズマ（１００Ｗ、０．１Torr、１５秒
間）を照射した後、２−メトキシエチルアクリレート
（０．８Ｔorr ）を３分間、４−ビニルピリジン（０．
８Ｔorr ）で２分間接触させて表面グラフト重合を行な
った後、０．１モルのベンジルクロライドを含むメタノ
ール中で５５℃で３時間、４級化反応を行なうことによ
り、ピリジニウム構造を表面に有する空孔率６３％
（０．８Ｔorr ），透水量１２０[ ml/min/m2/mmHg] 、
最大孔径０．５μの膜を得た。Comparative Example 3 The polypropylene filter used as the substrate in Example 1 was irradiated with argon plasma (100 W, 0.1 Torr, 15 seconds), and then 2-methoxyethyl acrylate (0.8 Torr) was added for 3 minutes. 4-vinyl pyridine (0.
(8 Torr) for 2 minutes to carry out surface graft polymerization, and then quaternization reaction in methanol containing 0.1 mol of benzyl chloride at 55 ° C. for 3 hours to give a void having a pyridinium structure on the surface. Porosity 63%
(0.8 Torr), Permeability 120 [ml / min / m2 / mmHg],
A membrane with a maximum pore size of 0.5 μ was obtained.
【００４４】該フィルターのウイルス除去率を測定した
ところ、ＰＢＳバッファー中では、ヘルペスウイルス及
びφＸ１７４を９９．９％以上除去することができた
が、人血漿中ではどちらのウイルスの除去率も５０％以
下であった。When the virus removal rate of the filter was measured, it was possible to remove more than 99.9% of herpes virus and φX174 in PBS buffer, but in human plasma, the removal rate of both viruses was 50%. It was below.
【００４５】[0045]
【発明の効果】本発明の多孔性分離膜は、分子内に１級
および２級アミンを有し該アミン間には疎水性部を有す
る分子量が６００以下のポリアミン化合物を表面に結合
させてなるものなので、取り扱いが容易であり、処理速
度に優れ、蛋白質が共存する条件下においても細胞やウ
イルスを選択的に認識し吸着することができる。また、
多くのウイルス・細菌・細胞に対して親和性や生理活性
を有することから細菌、細胞、ウイルスなどの検出・分
離・保存・培養などの用途に対して、好適に使用するこ
とができる。また、血漿などの蛋白質等の存在下でもウ
イルスを除去できるため、食品工業、発酵工業、医薬品
工業、医療現場におけるウイルス汚染やウイルス感染の
防止に効果を発揮する。Industrial Applicability The porous separation membrane of the present invention comprises a polyamine compound having a molecular weight of 600 or less, which has primary and secondary amines in the molecule and a hydrophobic portion between the amines, and is bound to the surface thereof. Since it is a substance, it is easy to handle, has an excellent processing speed, and can selectively recognize and adsorb cells and viruses even under the condition that proteins coexist. Also,
Since it has affinity and physiological activity for many viruses, bacteria, and cells, it can be suitably used for applications such as detection, separation, storage, and culture of bacteria, cells, viruses and the like. In addition, since the virus can be removed even in the presence of proteins such as plasma, it is effective in preventing virus contamination and virus infection in the food industry, fermentation industry, pharmaceutical industry, and medical field.
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【手続補正書】[Procedure amendment]
【提出日】平成４年７月８日[Submission date] July 8, 1992
【手続補正１】[Procedure Amendment 1]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】全文[Correction target item name] Full text
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction content]
【書類名】 明細書[Document name] Statement
【発明の名称】 多孔性分離膜Title of the Invention Porous separation membrane
【特許請求の範囲】[Claims]
【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、多孔性分離膜に関す
る。詳しくは、細胞やウイルスなどを液体中から選択的
に吸着できる多孔性分離膜に関する。FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to a porous separation membrane. Specifically, it relates to a porous separation membrane capable of selectively adsorbing cells, viruses, etc. from a liquid.
【０００２】[0002]
【従来技術】膜分離技術は、限外濾過膜、逆浸透膜、イ
オン交換膜、ガス分離膜、浸透気化膜などの研究を通じ
て広く産業界に浸透している技術ではあるが、その原理
としては濃度差、圧力差、電位差等を利用した膜孔径に
よる分離に基づくものが多く、積極的に選択的認識機構
を膜表面に導入して設計された分離膜は少ない。2. Description of the Related Art Membrane separation technology is a technology widely used in the industry through research on ultrafiltration membranes, reverse osmosis membranes, ion exchange membranes, gas separation membranes, pervaporation membranes, etc. Most of them are based on separation based on the membrane pore size utilizing the difference in concentration, the difference in pressure, the difference in potential, etc., and there are few separation membranes designed by actively introducing a selective recognition mechanism on the membrane surface.
【０００３】選択的認識機構を利用した吸着分離システ
ムとしては、吸着用ビーズを用いたカラム法が良く知ら
れている。生化学分野における精製手法として用いられ
ているアフィニティクロマトグラフィー法や医療分野で
使用されている低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）を血漿中よ
り選択的に吸着除去する硫酸デキストラン固定化ビーズ
などを例示できる。A column method using adsorption beads is well known as an adsorption separation system utilizing a selective recognition mechanism. Examples thereof include affinity chromatography method used as a purification method in the biochemistry field and dextran sulfate-immobilized beads that selectively adsorb and remove low density lipoprotein (LDL) used in the medical field from plasma.
【０００４】ところで、細胞やウイルス、あるいは生体
由来物質などに対する選択的認識能を膜表面に付与する
には、生体の有する選択的認識能、例えば、抗原−抗
体、酵素−基質、細胞表面のリセプターなどを利用する
方法がある。この方法の問題点は、リガンドとする物質
が生体由来の蛋白質のため高価なこと、熱や酸などによ
り変性しやすく滅菌や取り扱いが難しいこと、などであ
る。By the way, in order to impart a selective recognition ability for cells, viruses, or substances derived from a living body to a membrane surface, a selective recognition ability possessed by a living body, for example, an antigen-antibody, an enzyme-substrate, a receptor on a cell surface is used. There is a method to use etc. Problems with this method are that the substance used as a ligand is expensive because it is a protein of biological origin, and it is easily denatured by heat, acid, etc. and is difficult to sterilize and handle.
【０００５】一方、従来の膜によるウイルス除去方法と
しては、再生セルロース多孔質膜により濾過する方法が
ある。この膜の孔径は、ウイルスの大きさより小さいた
め、ウイルスは透過できない。しかしながら、孔径が小
さいために透過速度が小さく目詰まりが生じやすいなど
の問題点を有している。また、ポリビニルピリジニウム
などのポリカチオン構造を表面に有する多孔質膜を用い
て、不純物の少ない水中から静電相互作用を利用してウ
イルスを吸着する例がある。しかしながら、この方法で
は、血漿などのタンパク質を含む溶液からはウイルスを
充分に吸着することができなかった。On the other hand, as a conventional method for removing viruses by a membrane, there is a method of filtering with a regenerated cellulose porous membrane. Since the pore size of this membrane is smaller than the size of the virus, it cannot penetrate the virus. However, since the pore size is small, there is a problem that the permeation rate is low and clogging is likely to occur. In addition, there is an example in which a virus is adsorbed from water containing few impurities by using electrostatic interaction using a porous film having a polycation structure such as polyvinylpyridinium on the surface. However, this method could not sufficiently adsorb the virus from the solution containing protein such as plasma.
【０００６】また、細胞をフィルターに吸着させて分離
する方法としては、「濾過用繊維フィルター」がある。
このフィルターは、白血球が適度の疎水性を有する曲率
の小さい曲面に吸着しやすいという性質を利用したもの
である。しかしながら、このような濾材の形状や疎水性
度による吸着分離の場合、白血球側の認識能力が強い新
鮮な血液では除去率が大きくなるものの、保存血液など
では白血球側の認識能力が弱くなるため十分に除去され
なくなるという問題を有していた。すなわち、保存血液
中の白血球を捕捉するには、材料側からの白血球の認識
と捕捉が必要ということである。材料表面に、細胞を認
識する分子を導入する方法としては、細胞表層の負に電
荷した糖蛋白に静電的相互作用を及ぼすポリカチオンを
材料表面に固定化する方法が知られている。しかしなが
ら、培養液や血液などの蛋白質等が共存する液体中から
は、前述のウイルスの場合と同様に細胞への選択性に乏
しかったり、細胞に与えるダメージ（毒性）が問題とな
っていた。[0006] As a method for adsorbing cells to a filter to separate them, there is a "fiber filter for filtration".
This filter utilizes the property that white blood cells are easily adsorbed on a curved surface having a moderate hydrophobicity and a small curvature. However, in the case of adsorptive separation based on the shape and hydrophobicity of such a filter medium, although the removal rate increases with fresh blood having a strong leukocyte-side recognizing ability, the leukocyte-side recognizing ability becomes weak in preserved blood, etc. It had a problem that it could not be removed. That is, in order to capture leukocytes in stored blood, it is necessary to recognize and capture leukocytes from the material side. As a method for introducing a cell-recognizing molecule into the material surface, a method is known in which a polycation having an electrostatic interaction with a negatively charged glycoprotein on the cell surface is immobilized on the material surface. However, as in the case of the above-mentioned virus, there is a problem in that it has poor selectivity to cells or damage (toxicity) to cells from a liquid such as a culture solution or blood in which proteins and the like coexist.
【０００７】[0007]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、取り扱いが
容易であり、しかも細胞やウイルスなどに対しての選択
的な相互作用を有する簡便で処理速度の優れた機能性分
離膜を提供することを目的とする。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention provides a functional separation membrane which is easy to handle, has a simple interaction with selective interaction with cells and viruses, and has an excellent processing speed. With the goal.
【０００８】[0008]
【問題点を解決するための手段】上記本発明の目的は以
下に示す多孔性分離膜によって達成される。 （１）分子内に１級および２級アミンを有し該アミン間
には疎水性部を有する分子量が６００以下のポリアミン
化合物を表面に結合させてなる多孔性分離膜。 （２）ポリアミン化合物が脂肪族ポリアミンである
（１）に記載の多孔性分離膜。 （３）ポリアミン化合物がスペルミジンもしくはスペル
ミンである（１）または（２）に記載の多孔性分離膜。 （４）前記表面と前記ポリアミン化合物との間に前記表
面による蛋白吸着を抑制する層を設けた（１）〜（３）
のいずれかに記載の多孔性分離膜。The above objects of the present invention are achieved by the following porous separation membrane. (1) A porous separation membrane having a surface of a polyamine compound having a primary or secondary amine in the molecule and a hydrophobic portion between the amines and having a molecular weight of 600 or less. (2) The porous separation membrane according to (1), wherein the polyamine compound is an aliphatic polyamine. (3) The porous separation membrane according to (1) or (2), wherein the polyamine compound is spermidine or spermine. (4) A layer for suppressing protein adsorption by the surface is provided between the surface and the polyamine compound (1) to (3).
5. The porous separation membrane according to any one of 1.
【０００９】分子内に１級および２級アミンを有するポ
リアミン化合物とは、例えば脂肪族ポリアミンがあり、
生体内ポリアミンとして知られているスペルミジンやス
ペルミンなどを好適に例示できる。基本的な構造とし
て、分子の末端部にアミノ基（１級アミン）、分子内に
イミノ基（２級アミン）を有し、該アミノ基と該イミノ
基の間には炭化水素もしくはハロゲン化炭化水素により
構成される疎水性部が存在することが必要である。尚、
３級アミノ基はあってもなくても構わない。Polyamine compounds having primary and secondary amines in the molecule include, for example, aliphatic polyamines,
Preferable examples include spermidine and spermine, which are known as in-vivo polyamines. The basic structure has an amino group (primary amine) at the end of the molecule and an imino group (secondary amine) in the molecule, and a hydrocarbon or halogenated carbon is present between the amino group and the imino group. It is necessary that there is a hydrophobic part composed of hydrogen. still,
It may or may not have a tertiary amino group.
【００１０】該アミノ基とイミノ基の総和が３〜１０で
あることが好ましい。３未満であるとアミンの量が少な
いため被吸着物との相互作用が少なくなり、また１０よ
り大であると分子量が大きくなるため相互作用が大きく
なり被吸着物への選択性が低下する虞れがある。疎水性
部の構造は特に限定されないが、例えばメチレン鎖［−
（ＣＨ2 ）n −］であり、好ましくはｎが２〜２０以
上、さらに好ましくはｎが３〜１０である。ｎが２以上
であれば、疎水性部としての充分な機能を果たす。ｎが
２０以下であれば、分子量が大きくなり過ぎていないの
で、疎水性相互作用に起因する非選択的蛋白吸着の増加
や水系溶媒への溶解性の低下が起こらず、充分な効果の
発現が期待できる。The sum of the amino group and the imino group is preferably 3-10. When it is less than 3, the amount of amine is small and thus the interaction with the substance to be adsorbed is small, and when it is greater than 10, the molecular weight is large and the interaction is large and the selectivity to the substance to be adsorbed may be lowered. There is The structure of the hydrophobic part is not particularly limited, but for example, a methylene chain [-
(CH2) n-], preferably n is 2 to 20 or more, and more preferably n is 3 to 10. When n is 2 or more, it has a sufficient function as a hydrophobic portion. When n is 20 or less, the molecular weight does not become too large, so that non-selective protein adsorption due to hydrophobic interaction does not increase and solubility in an aqueous solvent does not decrease, and sufficient effect is exhibited. Can be expected.
【００１１】ポリアミンの分子量は６００以下、好まし
くは１００〜３００である。分子量が大きくなると、蛋
白成分や細胞成分などに及ぼす作用が強くなり、蛋白成
分の変性や細胞毒性が発現するようになるので分子量を
６００以下とする必要がある。また、分子量が１００以
上であればポリアミンの高分子効果による細胞やウイル
スなどへの吸着作用が充分であり、３００以下であると
ウイルスや細胞に対する選択性が向上する。The polyamine has a molecular weight of 600 or less, preferably 100 to 300. When the molecular weight becomes large, the action on the protein component or cell component becomes strong, and the protein component becomes denatured or cytotoxic. Therefore, the molecular weight needs to be 600 or less. If the molecular weight is 100 or more, the polymer effect of polyamine is sufficient to adsorb cells and viruses, and if it is 300 or less, the selectivity for viruses and cells is improved.
【００１２】本発明の多孔性分離膜の基材となる多孔性
膜は、セルロースやその誘導体などの天然高分子、ある
いはポリオレフィン、ポリアミド、ポリウレタン、ポリ
エステル、ポリサルホン、ポリアクリルニトリルなどの
合成高分子を素材として成形された中空糸状、平膜状、
不織布状、織布状、チューブ状の多孔質体であり、濾過
できる連通孔を有している多孔性膜であればよい。好ま
しくは、寸法安定性に優れ、親水性であり、かつ水に対
して膨潤性の基材、たとえばポリプロピレンやポリフッ
化ビニリデンなど疎水性素材より成膜された後、親水性
ポリマーのコーティングやグラフト重合により親水化さ
れた膜である。The porous membrane as the base material of the porous separation membrane of the present invention is a natural polymer such as cellulose or a derivative thereof, or a synthetic polymer such as polyolefin, polyamide, polyurethane, polyester, polysulfone or polyacrylonitrile. Hollow fiber shaped, flat membrane shaped,
It may be a non-woven fabric, a woven fabric, or a tubular porous body as long as it is a porous membrane having communication holes that can be filtered. Preferably, after being formed into a film from a substrate having excellent dimensional stability, hydrophilicity, and swelling in water, for example, a hydrophobic material such as polypropylene or polyvinylidene fluoride, coating or graft polymerization of a hydrophilic polymer. It is a membrane hydrophilized by.
【００１３】本発明の多孔性分離膜の孔径等の数値は捕
捉する対象によって、あるいは膜の厚さや膜の積層枚数
等により影響を受けるが、モジュール化した際に、目詰
まりが起こらず、吸着率が低下しないような範囲に設定
することが望ましい。Numerical values such as the pore size of the porous separation membrane of the present invention are influenced by the object to be trapped, the thickness of the membrane, the number of laminated layers of the membrane, etc. It is desirable to set the range so that the rate does not decrease.
【００１４】即ち、本発明の多孔性分離膜は、平均直径
１００μ以下の多数の交差するフィラメントより形成さ
れた不織布形状、もしくは、最大孔径０．１〜３０．０
μ、空孔率２０〜９５％、透水量１０ ml/min/m2/mmHg
以上の多孔質膜であることが好ましい。さらに好ましく
は、最大孔径０．２〜１．０μ、空孔率４０〜９０％、
透水量１００ ml/min/m2/mmHg 以上である。最大孔径が
０．１μ以上であれば、流体の透過速度が良好であり、
尚且つ、目詰まり発生の可能性も低くなる。また、３
０．０μ以下であれば被吸着物に対する相互作用が良好
に働く。空孔率が２０％以上であれば、充分な透過速度
が得られ、９５％以下であれば物性的に充分である。ま
た、本発明の多孔性分離膜の透水量は、好ましくは１０
ml/min/m2/mmHg 以上、さらに好ましくは１００ ml/mi
n/m2/mmHg 以上であることが、濾過圧を低くできるため
好ましい。最大孔径、空孔率、透水量はポリアミンを結
合して本発明の多孔性膜とした状態で測定したものであ
る。That is, the porous separation membrane of the present invention has a non-woven fabric shape formed of a large number of intersecting filaments having an average diameter of 100 μ or less, or has a maximum pore diameter of 0.1 to 30.0.
μ, porosity 20-95%, water permeability 10 ml / min / m 2 / mmHg
The above porous film is preferable. More preferably, the maximum pore diameter is 0.2 to 1.0 μ, the porosity is 40 to 90%,
The water permeability is 100 ml / min / m 2 / mmHg or more. If the maximum pore size is 0.1μ or more, the fluid permeation rate is good,
Moreover, the possibility of clogging is reduced. Also, 3
If it is 0.0 μm or less, the interaction with the substance to be adsorbed works well. When the porosity is 20% or more, a sufficient permeation rate is obtained, and when it is 95% or less, the physical properties are sufficient. The water permeability of the porous separation membrane of the present invention is preferably 10
ml / min / m 2 / mmHg or more, more preferably 100 ml / mi
It is preferably n / m 2 / mmHg or more because the filtration pressure can be lowered. The maximum pore diameter, porosity, and water permeation amount are measured in the state where the polyamine is bound to form the porous membrane of the present invention.
【００１５】フィルター材として不織布を用いた場合、
これを形成するフィラメントは、モノフィラメントであ
ってもマルチフィラメントであってもよいが、平均直径
が１００μ以下、好ましくは、５０μ以下であることが
膜の表面積を大きくでき、吸着部位が増加するため好ま
しい。When a non-woven fabric is used as the filter material,
The filament forming this may be a monofilament or a multifilament, but it is preferable that the average diameter is 100 μm or less, preferably 50 μm or less because the surface area of the membrane can be increased and the adsorption sites increase. .
【００１６】ポリアミン化合物は、公知の方法を用いて
膜表面に固定化することができる。例えば、基材表面に
グラフト重合法、コーティング法、化学修飾法、酸化法
などにより、エポキシ基、アミノ基、アルデヒド基、カ
ルボキシル基、ヒドロキシル基、酸クロライド基などの
官能基を導入した後、ポリアミン化合物のアミノ基と直
接もしくはカップリング剤やスペーサーを介して表面に
固定化することができる。好ましくは、グリシジルアク
リレートもしくはグリシジルメタクリレートなどのエポ
キシ基を有する単量体を材料表面にグラフト重合した
後、該エポキシ基を利用してポリアミン化合物を固定化
することができる。The polyamine compound can be immobilized on the surface of the membrane using a known method. For example, after introducing functional groups such as an epoxy group, an amino group, an aldehyde group, a carboxyl group, a hydroxyl group and an acid chloride group onto the surface of a substrate by a graft polymerization method, a coating method, a chemical modification method, an oxidation method, etc., a polyamine It can be immobilized on the surface directly with the amino group of the compound or through a coupling agent or a spacer. Preferably, after graft-polymerizing a monomer having an epoxy group such as glycidyl acrylate or glycidyl methacrylate on the material surface, the polyamine compound can be immobilized using the epoxy group.
【００１７】尚、ポリアミン化合物の膜表面への固定化
は膜の外表面だけではなく、多孔質細孔の表面にも行わ
れていることが好ましく、上述の固定化方法では細孔表
面への固定化も良好に行うことができる。The immobilization of the polyamine compound on the surface of the membrane is preferably performed not only on the outer surface of the membrane but also on the surface of the porous pores. In the immobilization method described above, the polyamine compound is immobilized on the surface of the pores. Immobilization can also be performed satisfactorily.
【００１８】本発明の多孔性分離膜は膜表面に固定化さ
れたポリアミンがウイルスや細胞といった被吸着物と選
択的に相互作用するためには、被処理液中の蛋白質との
相互作用が小さいことが望ましい。即ち、蛋白吸着を抑
制する表面、例えば水溶性高分子よりなるグラフト鎖や
蛋白吸着を抑制するポリマーでコートした表面であるこ
とが望ましい。具体的には、２−メトキシエチルアクリ
レートより構成されたポリマーもしくはコポリマーをコ
ートもしくは表面グラフト重合した材料、あるいは水溶
性ポリマーであるポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミ
ド）よりなるグラフト鎖を表面に有する材料などを例示
できる。これにより本発明の多孔性分離膜はより一層の
選択性向上を期待できる。In the porous separation membrane of the present invention, since the polyamine immobilized on the membrane surface selectively interacts with the adsorbate such as virus or cell, the interaction with the protein in the liquid to be treated is small. Is desirable. That is, a surface that suppresses protein adsorption, such as a surface coated with a water-soluble polymer graft chain or a polymer that suppresses protein adsorption, is desirable. Specifically, a material obtained by coating or surface-grafting a polymer or copolymer composed of 2-methoxyethyl acrylate, or a material having a graft chain of poly (N, N-dimethylacrylamide), which is a water-soluble polymer, on the surface. Can be exemplified. As a result, the porous separation membrane of the present invention can be expected to have further improved selectivity.
【００１９】本発明の多孔性分離膜は、種々の用途に使
用することができるが、多くのウイルス・細菌・細胞に
対して親和性や生理活性を有することから、細菌、細
胞、ウイルスなどの検出・分離・保存・培養などの用途
に対して、好適に使用することができる。特に、蛋白質
が共存する条件下においても、細胞やウイルスを選択的
に認識できることが特徴であり、有用性も高い。The porous separation membrane of the present invention can be used for various purposes, but since it has affinity and physiological activity for many viruses, bacteria and cells, it can be used for bacteria, cells, viruses and the like. It can be suitably used for applications such as detection, separation, storage, and culture. In particular, it is characterized by being able to selectively recognize cells and viruses even under the condition that proteins coexist, and is highly useful.
【００２０】本明細書におけるウイルス除去とは、ウイ
ルスの感染能力を低減もしくは失わせることである。そ
の性能は、濾過前の液体に添加した指標ウイルス（１０
2 pfu/ml 以上）が、サイズによる分離でなく、濾材表
面との相互作用により捕捉もしくは除去されることであ
り、少なくとも９０％、好ましくは９９％以上のウイル
ス除去率が望ましい。The term “virus removal” as used herein means to reduce or eliminate the infectivity of a virus. Its performance is based on the indicator virus (10
2 pfu / ml or more) is not separated by size, but is captured or removed by interaction with the surface of the filter medium, and a virus removal rate of at least 90%, preferably 99% or more is desirable.
【００２１】本発明におけるウイルス除去とは、ウイル
スが存在することが確認されている液体や気体からのウ
イルス除去ばかりでなく、ウイルス感染を予防する目的
での使用、あるいは熱や薬剤を用いたウイルス不活化防
止法と併用したバックアップ的な使用なども、本発明に
おけるウイルス除去に含まれる。The removal of viruses in the present invention means not only removal of viruses from liquids or gases in which the presence of viruses has been confirmed, but also use for the purpose of preventing viral infection, or viruses using heat or drugs. Backup use in combination with the inactivation prevention method is also included in virus removal in the present invention.
【００２２】本明細書に用いた用語を以下に定義する。 ・通水量は、０．７[kg/cm2]の圧力下で、２５℃±２℃
で測定した値である。 ・空孔率は式Ａで表される値である。式Ａ：空孔率
（％）＝空孔部の体積／（空孔部の体積＋フィルター実
質部の体積）×１００ ・膜の最大孔径は、バブルポイント法（ＡＳＴＭ−Ｆ３
１６参考）に従ってイソプロピルアルコールを溶媒とし
て測定した値より求めた。 ・フィラメント直径は、走査型電子顕微鏡で観察したフ
ィラメントの長径と短径の平均値のことであり、異形フ
ィラメントであっても多孔質フィラメントであっても良
い。 ・ウイルスの定量は、プラーク（溶菌班）法により行っ
た。すなわち、検体を宿主細胞もしくは宿主細菌と接触
させてたのち、ウイルスに感染することにより生成する
プラーク（溶菌班）数を測定することにより求めた。ウ
イルス除去（捕捉）率は、式Ｂにより算出した。式Ｂ：
ウイルス除去（捕捉）率（％）＝（１−生存ウイルス数
／原液中のウイルス数）×１００ （％）。The terms used in this specification are defined below.・ Water flow rate is 25 ℃ ± 2 ℃ under the pressure of 0.7 [kg / cm 2 ].
It is the value measured in. -The porosity is a value represented by the formula A. Formula A: Porosity (%) = volume of pores / (volume of pores + volume of filter substantial portion) × 100. The maximum pore diameter of the membrane is the bubble point method (ASTM-F3).
16 Reference) and obtained from the value measured using isopropyl alcohol as a solvent. The filament diameter is the average value of the major axis and the minor axis of the filament observed with a scanning electron microscope, and may be a deformed filament or a porous filament. The virus was quantified by the plaque method. That is, it was determined by contacting the sample with host cells or host bacteria, and then measuring the number of plaques (lytic plaques) produced by infection with the virus. The virus removal (capture) rate was calculated by the formula B. Formula B:
Virus removal (capture) rate (%) = (1-number of viable viruses / number of viruses in stock solution) × 100 (%).
【００２３】[0023]
【作用】スペルミンやスペルミジンなどのポリアミン化
合物は、真核細胞や原核細胞を問わず生物が保有してお
り、陰性電荷に富む細胞膜や核酸を初めとして種々の生
体高分子に作用してそれらの機能に影響を与えることが
知られている。（例えば、化学と生物、第２８巻、３
号、１６２〜１７１ペ−ジ、１９９１年、白幡晶著：
The Physiology of Polyamines, ed by U.Bachrach and
Y.M.Heimer, CRC Press, Boca Raton, 1989 :The bioc
hemical Journal,vol.260, p1-10, 1989. F.Schuber:
など )これらのポリアミンは、両末端にアミノ基を有
し、細胞内の中性条件下では分子内の窒素原子がイオン
化しているポリカチオンであるが、その分子量はスペル
ミンで２０２、スペルミジンで１４５であり、天然高分
子や合成高分子の分子量と比較すると非常に小さく、細
胞内や細胞膜の移動やその生理活性の発現に適している
ものと推測される。一方、高分子量のポリカチオン化合
物、例えば分子量が２０００を越えるようなポリエチレ
ンイミン、ポリアリルアミン、ポリビニルピリジニウム
などを材料表面に固定化した場合、血液や培養液のよう
に蛋白質などが共存する条件下では、それらの蛋白質と
の相互作用が強くなり非特異的な吸着が増加して、細胞
やウイルスなどへの選択性が失われてしまうこととな
る。[Function] Polyamine compounds such as spermine and spermidine are possessed by organisms regardless of whether they are eukaryotic cells or prokaryotic cells, and they act on various biopolymers including cell membranes and nucleic acids rich in negative charge and their functions. Is known to affect. (For example, Chemistry and Biology, Volume 28, 3
Issue 162-171, 1991, Akira Shirahata:
The Physiology of Polyamines, ed by U. Bachrach and
YMHeimer, CRC Press, Boca Raton, 1989: The bioc
hemical Journal, vol.260, p1-10, 1989. F. Schuber:
Etc.) These polyamines are polycations having amino groups at both ends and in which the nitrogen atom in the molecule is ionized under intracellular neutral conditions, but the molecular weight is 202 for spermine and 145 for spermidine. It is very small compared with the molecular weights of natural polymers and synthetic polymers, and it is presumed that it is suitable for the movement of intracellular and cell membranes and the expression of its physiological activity. On the other hand, when a polycation compound having a high molecular weight, such as polyethyleneimine, polyallylamine, or polyvinylpyridinium having a molecular weight of more than 2000, is immobilized on the surface of the material, under conditions where proteins and the like coexist, such as blood and culture solution. However, the interaction with these proteins becomes stronger, nonspecific adsorption increases, and the selectivity for cells, viruses, etc. is lost.
【００２４】細胞の多くは、細胞表面に負に荷電した糖
蛋白質を有しており、ポリカチオン等と静電的に結合す
ることが知られているが、４級アンモニウム塩を有する
強塩基性化合物や高分子量のポリカチオンでは静電相互
作用が強すぎるため、細胞やウイルス等の被吸着物への
選択性が低く、しかも細胞へのダメージが大きくなる。
本発明の多孔性膜は、分子量も小さく共存する蛋白質な
どとの相互作用も小さいため細胞成分との相互作用もマ
イルドとなり、より選択的となる。Most of the cells have a negatively charged glycoprotein on the cell surface and are known to electrostatically bind to polycations and the like, but they are strongly basic with quaternary ammonium salts. Since electrostatic interaction is too strong with compounds and high molecular weight polycations, the selectivity for adsorbates such as cells and viruses is low, and damage to cells is large.
Since the porous membrane of the present invention has a small molecular weight and a small interaction with coexisting proteins and the like, the interaction with a cell component also becomes mild and becomes more selective.
【００２５】脊椎動物のウイルスは、単純なウイルスで
２〜３種類、きわめて複雑なポックルウイルスなどでは
１００種以上にも及ぶ蛋白質やポリペプチドを有してい
る。エンヴェロープを持たない単純なウイルスではカプ
シドと呼ばれる蛋白質の殻を有しており、エンヴェロー
プを有するウイルスではエンヴェロープより突出するペ
プロマーと呼ばれる糖蛋白質がウイルス粒子の表面に存
在している。そのため、ウイルス粒子は正もしくは負の
表面電荷を有している。多くのウイルスは、アニオン性
のリン脂質やシアル酸、あるいはカプシド蛋白質などに
由来するアニオン性部位を有し、高分子量のポリカチオ
ンなどへ静電的相互作用により吸着することが知られて
いる。しかしながら、分子量の大きいポリカチオンも細
胞の場合と同様に前述の理由により、培養液中や血漿中
などのような蛋白質の共存下より選択的にウイルスを吸
着することができない。The vertebrate viruses have proteins of 2 to 3 types as simple viruses and more than 100 types of proteins and polypeptides as extremely complicated pockle virus. A simple virus without an envelope has a protein shell called a capsid, and a virus with an envelope has a glycoprotein called a pepromer protruding from the envelope on the surface of the virus particle. Therefore, virus particles have a positive or negative surface charge. It is known that many viruses have an anionic site derived from anionic phospholipids, sialic acid, capsid proteins, etc. and adsorb to high molecular weight polycations by electrostatic interaction. However, like the case of cells, polycations having a large molecular weight cannot selectively adsorb viruses in the presence of proteins such as in the culture solution or plasma for the same reasons as described above.
【００２６】[0026]
【実施例】 実施例１ ・ポリプロピレン多孔質膜の製造 メルトフローインデックスが３０及び０．３のポリプロ
ピレン混合物（混合重量比１００：４０）１００重量部
当り、３２０重量部の流動パラフィン（数平均分子量３
２４）及び０．３重量部の結晶核形成剤としての１，
３、２，４−ビス（ｐ−エチルベンジリデン）ソルビト
ールを二軸型押出機により溶融混練しペレット化した。
このペレットを上記押出機を用いて１５０〜２００℃で
溶融し、スリット幅０．６ｍｍのＴダイスより空気中に
押し出して、Ｔダイス直下に置かれた冷却液相のガイド
ローラーの回転によってポリエチレングリコールよりな
る冷却固化液中に導き、冷却固化した後巻取った。巻取
ったフィルム状物を一定長に切断し、縦横両方向を固定
した後、１，１，２−トリクロロ−１，２，２−トリフ
ルオロエタン中に１０分間×４回（合計４０分）浸漬し
て流動パラフィンの抽出を行い、次いで１３５℃の空気
中で２分間熱処理し、最大孔径０．５μ、空孔率６９
％、膜厚８０μのポリプロピレンフィルターを得た。Example 1 Production of Porous Polypropylene Membrane 320 parts by weight of liquid paraffin (number average molecular weight: 3) per 100 parts by weight of a polypropylene mixture having a melt flow index of 30 and 0.3 (mixing weight ratio 100: 40).
24) and 0.3 part by weight of 1, as a crystal nucleating agent
3,2,4-bis (p-ethylbenzylidene) sorbitol was melt-kneaded and pelletized by a twin-screw extruder.
The pellets were melted at 150 to 200 ° C. using the above extruder, extruded into the air through a T-die having a slit width of 0.6 mm, and rotated by a guide roller for a cooling liquid phase placed immediately below the T-die to produce polyethylene glycol. It was introduced into a cooling and solidifying liquid consisting of The wound film is cut to a certain length, fixed in both length and width directions, and then immersed in 1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluoroethane for 10 minutes x 4 times (40 minutes in total). To extract liquid paraffin, and then heat-treat in air at 135 ° C. for 2 minutes to obtain a maximum pore size of 0.5 μ and a porosity of 69.
%, And a film thickness of 80 μ was obtained.
【００２７】・多孔質膜の蛋白吸着抑制表面加工 このようにして得られたポリプロピレンフィルターに、
アルゴンプラズマ（１００Ｗ、０．１Torr、１５秒間）
を照射した後、２−メトキシエチルアクリレートガス
（１．０Torr ）に３分間、グリシジルアクリレートガ
ス（０．７Torr )に１分間接触させて表面グラフト重合
を行い、表面に反応性官能基を有する親水性多孔質膜を
得た。-Protein adsorption-suppressing surface treatment of the porous membrane The polypropylene filter thus obtained,
Argon plasma (100 W, 0.1 Torr, 15 seconds)
After irradiating, the surface was graft-polymerized by contacting it with 2-methoxyethyl acrylate gas (1.0 Torr) for 3 minutes and glycidyl acrylate gas (0.7 Torr) for 1 minute to obtain a hydrophilic surface having a reactive functional group. A porous film was obtained.
【００２８】・ポリアミン化合物の固定 続いて、１ｗｔ％のスペルミジンと触媒としての０．５
ｗｔ％のピリジンを含む水溶液に、６０℃、１８時間浸
漬することにより膜表面にスペルミジンを固定化した。
得られた膜は、メタノールで良く洗浄した後、試料とし
た。ポリプロピレン膜の表面に導入されたポリ（２−メ
トキシエチルアクリレート）とグリシジル基に結合した
スペルミジンは、ＩＲ（ＡＴＲ法）、ＮＭＲ、ＥＳＣＡ
により確認した。Immobilization of polyamine compound Subsequently, 1 wt% of spermidine and 0.5 as a catalyst
Spermidine was immobilized on the membrane surface by immersing in an aqueous solution containing wt% pyridine at 60 ° C. for 18 hours.
The obtained film was thoroughly washed with methanol and then used as a sample. The poly (2-methoxyethyl acrylate) introduced on the surface of the polypropylene film and spermidine bonded to the glycidyl group have IR (ATR method), NMR and ESCA.
Confirmed by.
【００２９】該膜の空孔率は６５％、透水量３８０[ml/
min/m2/mmHg]、最大孔径０．５μであった。この膜を、
ニュークリポア製スウインロックフィルターホルダー
（φ２５ｍｍ）にセットし、ヘルペスウイルス type Ｉ
H.F. 株を約１０4 (PFU/ml)含むＰＢＳバッファー（ｐ
Ｈ７．３５〜ｐＨ７．６）と人新鮮血より採取した血漿
を、各々１０ｍｌ濾過し、ウイルス除去率を測定したと
ころ、ＰＢＳバッファー中で９９．９％以上、人血漿中
で９９％であった。また、φＸ１７４（バクテリオファ
ージ）についても同様に試験を行った結果、人血漿中で
９９％、水中で９９．９％以上の除去率を示した。The membrane has a porosity of 65% and a water permeability of 380 [ml /
min / m 2 / mmHg] and the maximum pore size was 0.5 μ. This film
Set it on a Nuclepore Swin lock filter holder (φ25 mm) and use herpesvirus type I
PBS buffer containing about 10 4 (PFU / ml) of HF strain (p
H7.35-pH7.6) and 10 ml of plasma collected from human fresh blood were filtered and the virus removal rate was measured to be 99.9% or more in PBS buffer and 99% in human plasma. . Further, φX174 (bacteriophage) was also tested in the same manner, and as a result, a removal rate of 99% in human plasma and 99.9% or more in water was shown.
【００３０】実施例２ スペルミジンに代えて１ｗｔ％のスペルミンを用いた以
外は、実施例１と同様の方法で多孔質分離膜を得た。Example 2 A porous separation membrane was obtained in the same manner as in Example 1 except that 1 wt% spermine was used instead of spermidine.
【００３１】この空孔率は６４％、透水量３８０[ml/mi
n/m2/mmHg]、最大孔径０．５μであった。この膜を、ニ
ュークリポア製スウインロックフィルターホルダー（φ
２５ｍｍ）にセットし、ヘルペスウイルス type Ｉ H.
F. 株を約１０4 (PFU/ml)含むＰＢＳバッファー（ｐＨ
７．３５〜ｐＨ７．６）と人新鮮血より採取した血漿
を、各々１０ｍｌ濾過し、ウイルス除去率を測定したと
ころ、ＰＢＳバッファー中で９９．９％以上、人血漿中
で９９％であった。また、φＸ１７４（バクテリオファ
ージ）についても同様に試験を行った結果、人血漿中で
９８％、水中で９９．９％以上の除去率を示した。The porosity is 64% and the water permeability is 380 [ml / mi.
n / m 2 / mmHg] and the maximum pore diameter was 0.5 μ. Use this membrane as a Swinlock filter holder (φ
25 mm) and herpesvirus type I H.
PBS buffer containing approximately 10 4 (PFU / ml) of F. strain (pH
7.35 to pH 7.6) and 10 ml of plasma collected from fresh human blood were filtered, and the virus removal rate was measured to be 99.9% or more in PBS buffer and 99% in human plasma. . Further, φX174 (bacteriophage) was similarly tested, and as a result, a removal rate of 98% in human plasma and 99.9% or more in water was shown.
【００３２】実施例３ ・ポリフッ化ビニリデン多孔質膜の製造 ポリフッ化ビニリデン粉末（三菱油化（株）製、ｋｙｎ
ａｒ Ｋ３０１）１８重量部を、アセトン７３．８重量
部およびジメチルホルムアミド８．２重量部に溶解して
なる溶液を、ポリエチレンテレフタレートフィルム上に
キャストした後、１，１，２−トリクロロトリフルオロ
エタン浴中に５分間浸漬し、乾燥して膜厚１２５μ、最
大孔径０．４５μのポリフッ化ビニリデン多孔質膜を得
た。Example 3 Production of Polyvinylidene Fluoride Porous Membrane Polyvinylidene fluoride powder (manufactured by Mitsubishi Petrochemical Co., Ltd., kyn)
ar K301) 18 parts by weight dissolved in 73.8 parts by weight of acetone and 8.2 parts by weight of dimethylformamide, cast on a polyethylene terephthalate film, and then in a 1,1,2-trichlorotrifluoroethane bath. It was immersed in the solution for 5 minutes and dried to obtain a polyvinylidene fluoride porous film having a film thickness of 125μ and a maximum pore size of 0.45μ.
【００３３】・多孔質膜の蛋白吸着抑制表面加工および
ポリアミン化合物の固定 ポリフッ化ビニリデン多孔質膜に、実施例１と同様にし
て膜表面に２−メトキシエチルアクリレートをグラフト
重合し、更にスペルミジンを固定化した膜を得た。-Protein adsorption-suppressing surface treatment of porous membrane and immobilization of polyamine compound In the same manner as in Example 1, grafting polymerization of 2-methoxyethyl acrylate on the surface of polyvinylidene fluoride porous membrane and further fixing spermidine. A converted film was obtained.
【００３４】この空孔率は７１％、透水量４３０[ml/mi
n/m2/mmHg]、最大孔径０．４５μであった。この膜を、
ニュークリポア製スウインロックフィルターホルダー
（φ２５ｍｍ）にセットし、ヘルペスウイルス type Ｉ
H.F. 株を約１０4 (PFU/ml)含むＰＢＳバッファー（ｐ
Ｈ７．３５〜ｐＨ７．６）と人新鮮血より採取した血漿
を、各々１０ｍｌ濾過し、ウイルス除去率を測定したと
ころ、ＰＢＳバッファー中で９９．９％以上、人血漿中
で９８％であった。また、φＸ１７４（バクテリオファ
ージ）についても同様に試験を行った結果、人血漿中で
９８％、水中で９９．９％以上の除去率を示した。The porosity is 71% and the water permeability is 430 [ml / mi.
n / m 2 / mmHg] and the maximum pore size was 0.45μ. This film
Set it on a Nuclepore Swin lock filter holder (φ25 mm) and use herpesvirus type I
PBS buffer containing about 10 4 (PFU / ml) of HF strain (p
H7.35-pH7.6) and 10 ml of plasma collected from fresh human blood were filtered and the virus removal rate was measured to be 99.9% or more in PBS buffer and 98% in human plasma. . Further, φX174 (bacteriophage) was similarly tested, and as a result, a removal rate of 98% in human plasma and 99.9% or more in water was shown.
【００３５】実施例４ ポリプロピレン製不織布（東燃（株）製タピルス）に、
実施例１と同様にしてスペルミジンを固定化した膜を得
た。Example 4 A polypropylene non-woven fabric (Tapyrus made by Tonen Corporation)
A film having spermidine immobilized thereon was obtained in the same manner as in Example 1.
【００３６】このスペルミジン固定化フィルターをニュ
ークリポア製スウインロックフィルターホルダー（φ２
５ｍｍ）に２０枚積層してセットし、ヘルペスウイルス
type Ｉ H.F. 株を約１０4 (PFU/ml)含むＰＢＳバッフ
ァー（ｐＨ７．３５〜ｐＨ７．６）と人新鮮血より採取
した血漿を、各々１０ｍｌ濾過し、ウイルス除去率を測
定したところ、ＰＢＳバッファー中で９９．９％以上、
人血漿中で９９％であった。また、φＸ１７４（バクテ
リオファージ）についても同様に試験を行った結果、人
血漿中で９９％、水中で９９．９％以上の除去率を示し
た。This spermidine-immobilized filter is used in a New Krepoir swin lock filter holder (φ2
5 mm) with 20 sheets stacked and set, herpes virus
PBS buffer (pH 7.35-pH 7.6) containing about 10 4 (PFU / ml) of type I HF strain and 10 ml each of plasma collected from human fresh blood were filtered and the virus removal rate was measured. Among them, 99.9% or more,
It was 99% in human plasma. Further, φX174 (bacteriophage) was also tested in the same manner, and as a result, a removal rate of 99% in human plasma and 99.9% or more in water was shown.
【００３７】実施例５ 実施例１で用いたポリプロピレン多孔質膜にアルゴンプ
ラズマ（１００Ｗ、０．１Torr、１５秒間）を照射した
後、グリシジルアクリレートガス（０．７Torr)に５分
間接触させて表面グラフト重合を行い、表面に反応性官
能基を有する親水性多孔質膜を得た。続いて、１ｗｔ％
のスペルミジンと０．５ｗｔ％のピリジンを含む水溶液
に、６０℃、５時間浸漬することにより膜表面にスペル
ミジンを固定化した。Example 5 The polypropylene porous film used in Example 1 was irradiated with argon plasma (100 W, 0.1 Torr, 15 seconds), and then contacted with glycidyl acrylate gas (0.7 Torr) for 5 minutes for surface grafting. Polymerization was performed to obtain a hydrophilic porous film having a reactive functional group on the surface. Then 1 wt%
The spermidine was immobilized on the membrane surface by immersing in an aqueous solution containing spermidine and 0.5 wt% pyridine at 60 ° C. for 5 hours.
【００３８】このスペルミジン固定化フィルターをニュ
ークリポア製スウインロックフィルターホルダー（φ２
５ｍｍ）に３枚積層してセットし、ヘルペスウイルス t
ypeＩ H.F. 株を約１０4 (PFU/ml)含むＰＢＳバッファ
ー（ｐＨ７．３５〜ｐＨ７．６）と人新鮮血より採取し
た血漿を、各々１０ｍｌ濾過し、ウイルス除去率を測定
したところ、ＰＢＳバッファー中で９９．９％以上、人
血漿中で９１％であった。また、φＸ１７４（バクテリ
オファージ）についても同様に試験を行った結果、人血
漿中で９０％、水中で９９．９％以上の除去率を示し
た。[0038] This spermidine-immobilized filter is used in a New Krepoir swin lock filter holder (φ2
5 mm) and stack 3 sheets to set herpesvirus t
PBS buffer (pH 7.35-pH 7.6) containing about 10 4 (PFU / ml) of ypeI HF strain and 10 ml each of plasma collected from human fresh blood were filtered and the virus removal rate was measured. 99.1% or more and 91% in human plasma. Further, φX174 (bacteriophage) was also similarly tested, and as a result, a removal rate of 90% in human plasma and 99.9% or more in water was shown.
【００３９】比較例１ 実施例１と同様の方法で、２−メトキシエチルアクリレ
ートとグリシジルアクリレートを表面グラフト重合した
膜を作製し、ウイルス除去試験を行った。Comparative Example 1 In the same manner as in Example 1, a film obtained by surface-grafting polymerization of 2-methoxyethyl acrylate and glycidyl acrylate was prepared and a virus removal test was conducted.
【００４０】該フィルターは、ＰＢＳバッファー中、血
漿中のどちらにおいても、ヘルペスウイルス、φＸ１７
４の各除去率は５０％以下であり、除去することができ
なかった。The filter was a herpesvirus, φX17, in both PBS buffer and plasma.
Each removal rate of No. 4 was 50% or less and could not be removed.
【００４１】比較例２ 実施例１と同様の方法で、平均分子量１２００のポリエ
チレンイミンを固定化したポリプロピレン多孔質膜を作
製した。Comparative Example 2 In the same manner as in Example 1, a polypropylene porous membrane having polyethyleneimine having an average molecular weight of 1200 fixed thereon was prepared.
【００４２】この空孔率は６４％、透水量３４０[ml/mi
n/m2/mmHg]、最大孔径０．５μであった。この膜を、ニ
ュークリポア製スウインロックフィルターホルダー（φ
２５ｍｍ）にセットし、ヘルペスウイルス type Ｉ H.
F. 株を約１０4 (PFU/ml)含むＰＢＳバッファー（ｐＨ
７．３５〜ｐＨ７．６）と人新鮮血より採取した血漿
を、各々１０ｍｌ濾過し、ウイルス除去率を測定したと
ころ、ＰＢＳバッファー中で９９．９％以上、人血漿中
で６９％であった。また、φＸ１７４（バクテリオファ
ージ）についても同様に試験を行った結果、人血漿中で
４７％、水中で９９．９％以上の除去率を示した。水中
ではウイルスを捕捉できるものの、血漿中ではウイルス
を除去することができなかった。The porosity is 64% and the water permeability is 340 [ml / mi
n / m 2 / mmHg] and the maximum pore diameter was 0.5 μ. Use this membrane as a Swinlock filter holder (φ
25 mm) and herpesvirus type I H.
PBS buffer containing approximately 10 4 (PFU / ml) of F. strain (pH
7.35 to pH 7.6) and 10 ml of plasma collected from fresh human blood were filtered, and the virus removal rate was measured to be 99.9% or more in PBS buffer and 69% in human plasma. . Further, φX174 (bacteriophage) was also similarly tested, and as a result, a removal rate of 47% in human plasma and 99.9% or more in water was shown. Although the virus could be trapped in water, it could not be removed in plasma.
【００４３】比較例３ 実施例１で基材として用いたポリプロピレンフィルター
に、アルゴンプラズマ（１００Ｗ、０．１Torr、１５秒
間）を照射した後、２−メトキシエチルアクリレート
（０．８Torr ）を３分間、４−ビニルピリジン（０．
８Torr ）で２分間接触させて表面グラフト重合を行な
った後、０．１モルのベンジルクロライドを含むメタノ
ール中で５５℃で３時間、４級化反応を行なうことによ
り、ピリジニウム構造を表面に有する空孔率６３％
（０．８Torr ），透水量１２０[ ml/min/m2/mmHg] 、
最大孔径０．５μの膜を得た。Comparative Example 3 The polypropylene filter used as the substrate in Example 1 was irradiated with argon plasma (100 W, 0.1 Torr, 15 seconds), and then 2-methoxyethyl acrylate (0.8 Torr) was used for 3 minutes. 4-vinyl pyridine (0.
(8 Torr) for 2 minutes for surface graft polymerization, and then quaternization reaction at 55 ° C. for 3 hours in methanol containing 0.1 mol of benzyl chloride to give a void having a pyridinium structure on the surface. Porosity 63%
(0.8Torr), water permeability 120 [ml / min / m 2 / mmHg],
A membrane with a maximum pore size of 0.5 μ was obtained.
【００４４】該フィルターのウイルス除去率を測定した
ところ、ＰＢＳバッファー中では、ヘルペスウイルス及
びφＸ１７４を９９．９％以上除去することができた
が、人血漿中ではどちらのウイルスの除去率も５０％以
下であった。When the virus removal rate of the filter was measured, it was possible to remove more than 99.9% of herpes virus and φX174 in PBS buffer, but the removal rate of both viruses was 50% in human plasma. It was below.
【００４５】[0045]
【発明の効果】本発明の多孔性分離膜は、分子内に１級
および２級アミンを有し該アミン間には疎水性部を有す
る分子量が６００以下のポリアミン化合物を表面に結合
させてなるものなので、取り扱いが容易であり、処理速
度に優れ、蛋白質が共存する条件下においても細胞やウ
イルスを選択的に認識し吸着することができる。また、
多くのウイルス・細菌・細胞に対して親和性や生理活性
を有することから細菌、細胞、ウイルスなどの検出・分
離・保存・培養などの用途に対して、好適に使用するこ
とができる。また、血漿などの蛋白質等の存在下でもウ
イルスを除去できるため、食品工業、発酵工業、医薬品
工業、医療現場におけるウイルス汚染やウイルス感染の
防止に効果を発揮する。The porous separation membrane of the present invention comprises a polyamine compound having a molecular weight of 600 or less having primary and secondary amines in the molecule and having a hydrophobic portion between the amines and bound to the surface thereof. Since it is a substance, it is easy to handle, has an excellent processing speed, and can selectively recognize and adsorb cells and viruses even under the condition that proteins coexist. Also,
Since it has affinity and physiological activity for many viruses, bacteria, and cells, it can be suitably used for applications such as detection, separation, storage, and culture of bacteria, cells, viruses and the like. In addition, since the virus can be removed even in the presence of proteins such as plasma, it is effective in preventing virus contamination and virus infection in the food industry, fermentation industry, pharmaceutical industry, and medical field.
Claims (1)
ミン間には疎水性部を有する分子量が６００以下のポリ
アミン化合物を表面に結合させてなる多孔性分離膜。1. A porous separation membrane comprising a primary and secondary amine in the molecule and a hydrophobic portion between the amines, and a polyamine compound having a molecular weight of 600 or less bound to the surface.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4178566A JPH0615167A (en) | 1992-07-06 | 1992-07-06 | Porous separating membrane |
| US08/085,813 US5547576A (en) | 1992-07-06 | 1993-07-06 | Pathogenic substance removing material and a blood filter containing the material |
| EP93401743A EP0586268B1 (en) | 1992-07-06 | 1993-07-06 | A pathogenic substance removing material and a blood filter comprising said material |
| DE69327891T DE69327891T2 (en) | 1992-07-06 | 1993-07-06 | Material for removing pathogenic substance and blood filter made with this material |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4178566A JPH0615167A (en) | 1992-07-06 | 1992-07-06 | Porous separating membrane |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0615167A true JPH0615167A (en) | 1994-01-25 |
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ID=16050724
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| JP4178566A Pending JPH0615167A (en) | 1992-07-06 | 1992-07-06 | Porous separating membrane |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0615167A (en) |
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1992
- 1992-07-06 JP JP4178566A patent/JPH0615167A/en active Pending
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