JPH0613537B2 - Method for separating and purifying glyceryl phosphate compound derivative - Google Patents
Method for separating and purifying glyceryl phosphate compound derivativeInfo
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- JPH0613537B2 JPH0613537B2 JP17719286A JP17719286A JPH0613537B2 JP H0613537 B2 JPH0613537 B2 JP H0613537B2 JP 17719286 A JP17719286 A JP 17719286A JP 17719286 A JP17719286 A JP 17719286A JP H0613537 B2 JPH0613537 B2 JP H0613537B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は合成リン脂質の原料として、またはそれ自体が
生理活性および薬理作用を持つものとして非常に有用な
グリセリルリン酸エステル化合物誘導体の分離精製方法
に関するものである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [Field of Industrial Application] The present invention is a separation and purification of a glyceryl phosphate compound derivative which is very useful as a raw material for synthetic phospholipids or as a substance having physiological activity and pharmacological activity itself. It is about the method.
グリセリルリン酸エステル化合物は、ホスファチジルコ
リン（ＰＣ）等のリン脂質の脱アシル化物であり、任意
のアシル基を有する合成リン脂質を合成するための原料
として有用である。The glyceryl phosphate compound is a deacylated phospholipid such as phosphatidylcholine (PC) and is useful as a raw material for synthesizing a synthetic phospholipid having an arbitrary acyl group.
従来このようなグリセリルリン酸エステル化合物として
は、ＰＣの脱アシル化物であるグリセリルホスファチジ
ルコリン（ＧＰＣ）についてのみ、リン脂質からＰＣを
分離精製した上で脱アシル化し、ＧＰＣを得ている。
〔E.Bacr and M.Kates,J.Am.Chem.Soc.70,1394-(194
8)〕。Conventionally, as such a glyceryl phosphate compound, only glycerylphosphatidylcholine (GPC), which is a deacylated product of PC, has been separated and purified from phospholipid and then deacylated to obtain GPC.
(E. Bacr and M. Kates, J. Am. Chem. Soc. 70, 1394- (194
8)].
また分離精製を行わないりん脂質混合物を脱アシル化し
たグリセリルリン酸エステル化合物の分離法としては、
リン脂質の分析法の一つとしてリン脂質の脱アシル化物
をペーパークロマトグラフィーまたはイオン交換クロマ
トグラフィー〔J.N.Hawthorne and G.Ｈｂｓｃｈｅ
ｒ，Biochem.J.71,195-(1959)〕により分画して分析す
る方法が知られている。Further, as a method for separating the glyceryl phosphate compound deacylated from the phospholipid mixture without separation and purification,
As one of the analytical methods for phospholipids, deacylation products of phospholipids are subjected to paper chromatography or ion exchange chromatography [JN Hawthorne and G. Hbsche.
r, Biochem. J. 71, 195- (1959)] is known.
さらにＧＰＣを精製する方法として、カドミウム塩等の
重金属塩を不溶性の錯塩を形成させて分離精製する方法
が知られている。Further, as a method for purifying GPC, a method is known in which a heavy metal salt such as a cadmium salt is formed into an insoluble complex salt and separated and purified.
しかしながら、これらのうちリン脂質を分離精製した後
脱アシル化する方法は、リン脂質の分離精製が困難であ
る上、分離されたリン脂質ごとに脱アシル化する必要が
あり、工程が複雑になる。However, among these methods, the method of separating and purifying phospholipids and then deacylating makes it difficult to separate and purify phospholipids, and requires deacylation for each separated phospholipid, which complicates the process. .
またペーパークロマトグラフィーによる方法は分析程度
の微量の分離には用い得るが、グリセリルリン酸エステ
ル化合物の分取を目的とする大量の処理には不適当で、
スケールアップも困難であるという欠点がある。Further, the method by paper chromatography can be used for separation of trace amount of analysis, but is not suitable for large-scale treatment for the purpose of preparative separation of glyceryl phosphate compound,
There is a drawback that it is difficult to scale up.
イオン交換クロマトグラフィーにより分画する方法は大
量処理も可能ではあるが、イオン交換担体から溶離する
ために無機塩溶液を用いなけらばならない。無機塩の混
入は分離したグリセリルリン酸エステル化合物の使用目
的によっては不適当である上に、共に水溶性の低分子化
合物であることからその除去は著しく困難であるという
欠点がある。Although the method of fractionating by ion exchange chromatography allows a large-scale treatment, an inorganic salt solution must be used in order to elute from the ion exchange carrier. Incorporation of the inorganic salt is unsuitable depending on the purpose of use of the separated glyceryl phosphate compound, and in addition, since it is a water-soluble low molecular compound, its removal is extremely difficult.
カドミウムをはじめとする重金属と不溶性の錯塩を形成
させて精製する方法は、大量の処理に適しているもの
の、極微量に残留する重金属の完全は除去が不可能であ
るという欠点がある。The method of forming an insoluble complex salt with a heavy metal such as cadmium for purification is suitable for a large amount of treatment, but has a drawback that it is impossible to completely remove a very small amount of heavy metal.
リン脂質の分離精製に用いられている液体クロマトグラ
フィーは、グリセリルリン酸エステル化合物が水溶性で
あって有機溶媒に不溶であるため用いることができず、
このため任意のグリセリルリン酸エステル化合物を効率
よく大量に得ることができないという問題点があった。Liquid chromatography used for separation and purification of phospholipids cannot be used because the glyceryl phosphate compound is water-soluble and insoluble in organic solvents,
Therefore, there is a problem that an arbitrary glyceryl phosphate compound cannot be efficiently obtained in a large amount.
本発明は上記問題点を解決するためのもので、任意のグ
リセリルリン酸エステル化合物を製造できるとともに、
それ自体生理活性および薬理作用を有するものとして有
用なグリセリルリン酸エステル化合物誘導体を効率よ
く、大量に得ることができるグリセリルリン酸エステル
化合物誘導体の分離精製方法を提案することを目的とし
ている。The present invention is for solving the above problems, and can produce any glyceryl phosphate compound,
It is an object of the present invention to propose a method for separating and purifying a glyceryl phosphate ester compound derivative, which can efficiently obtain a large amount of a glyceryl phosphate ester compound derivative useful as a substance having physiological activity and pharmacological action.
本発明は、下記式(I)の構造を含むグリセリルリン酸エ
ステル化合物誘導体を、有機溶媒により、ケイ酸を分離
剤として分離精製することを特徴とするグリセリルリン
酸エステル化合物誘導体の分離精製方法である。The present invention is a method for separating and purifying a glyceryl phosphate ester compound derivative having a structure of the following formula (I), characterized in that an organic solvent is used to separate and purify silicic acid as a separating agent. is there.
（式中、Ｘは含窒素アルコール残基またはポリオール残
基、Ｙは容易に着脱可能な導入基、ｎは12以下の自然数
を示す。） 本発明では、リン脂質の脱アシル化物であるグリセリル
リン酸エステル化合物の極性基に適当な導入基（置換
基）を導入して分子全体の極性を低下させることによ
り、有機溶媒への溶解性を付与し、これによりケイ酸を
分離剤として液体クロマトグラフィーによる分離精製を
可能とするものである。 (In the formula, X represents a nitrogen-containing alcohol residue or polyol residue, Y represents an easily removable attachment group, and n represents a natural number of 12 or less.) In the present invention, glyceryl phosphorus which is a deacylated phospholipid By introducing an appropriate introduction group (substituent) into the polar group of the acid ester compound to reduce the polarity of the entire molecule, the solubility in an organic solvent is imparted, and thereby silica gel is used as a separating agent for liquid chromatography. It enables separation and purification by.
Ｉ式のグリセリルリン酸エステル化合物誘導体はリン脂
質の脱アシル化物であるグリセリルリン酸エステル化合
物に導入基Ｙを導入した構造になっているが、グリセリ
ルリン酸エステル化合物に直接導入基Ｙを導入すると、
他の水酸基にも導入されやすいため直接導入することは
できない。このためＩ式のグリセリルリン酸エステル化
合物誘導体は、直接合成するか、またはリン脂質に導入
基Ｙを導入して対応するグリセリルリン酸エステル骨格
を有するリン脂質誘導体とした後、メチルエステル化分
解あるいはケン化分解等により脱アシル化することによ
り得られる。本発明において分離精製に用いるＩ式の誘
導体は単一の誘導体を含むものであってもよいが、Ｘの
異なる数種の混合物であってもよい。The glyceryl phosphate compound derivative of the formula I has a structure in which the introduction group Y is introduced into the glyceryl phosphate compound which is a deacylated phospholipid, but when the introduction group Y is directly introduced into the glyceryl phosphate compound. ,
Since it is easily introduced into other hydroxyl groups, it cannot be introduced directly. Therefore, the glyceryl phosphate compound derivative of the formula I is directly synthesized, or after introducing the introduction group Y into the phospholipid to give a phospholipid derivative having a corresponding glyceryl phosphate skeleton, methyl esterification decomposition or It can be obtained by deacylation by saponification and the like. The derivative of the formula I used for separation and purification in the present invention may contain a single derivative, but may be a mixture of several kinds of X.
Ｉ式において、Ｘで示される含窒素アルコールまたはポ
リオール残基はＹと結合可能なものであり、例えばセリ
ン基、エタノールアミン基、Ｎ−メチルエタノールアミ
ン基、N,N′−ジメチルエタノールアミン基、グリセロ
ール基、アミノアシルグリセロール基、グリセリン酸
基、グリセロリン酸ホスファチジル基、イノシトール
基、イノシトールリン酸基、イノシトールジリン酸基、
単糖、二糖、またはオリゴ糖などがある。In the formula I, the nitrogen-containing alcohol or polyol residue represented by X is capable of binding to Y, and includes, for example, serine group, ethanolamine group, N-methylethanolamine group, N, N'-dimethylethanolamine group, Glycerol group, aminoacylglycerol group, glyceric acid group, glycerophosphate phosphatidyl group, inositol group, inositol phosphate group, inositol diphosphate group,
These include monosaccharides, disaccharides, or oligosaccharides.
これらの残基を有するグリセリルリン酸エステル化合物
誘導体の原料として用い得るリン脂質としては、天然か
ら抽出したあるいは合成したホスファチジルセリン、ホ
スファチジルエタノールアミン、ホスファチジルN-メチ
ルエタノールアミン、ホスファチジルN,N′−ジメチル
エタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホス
ファチジルアミノアシルグリセロール、ホスファチジル
グリセロリン酸、カルジオリピン、ホスファチジルイノ
シトール、ホスファチジルイノシトールジリン酸、ホス
ファチジルイノシトールトリリン酸、糖リン脂質等があ
げられる。これらのリン脂質は天然リン脂質から分離精
製したものを原料としてもよいが、混合状態の天然リン
脂質を原料としてもよい。Examples of the phospholipid that can be used as a raw material for the glyceryl phosphate compound derivative having these residues include phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidyl N-methylethanolamine, phosphatidyl N, N'-dimethyl extracted or synthesized from nature. Examples thereof include ethanolamine, phosphatidylglycerol, phosphatidylaminoacylglycerol, phosphatidylglycerophosphate, cardiolipin, phosphatidylinositol, phosphatidylinositoldiphosphate, phosphatidylinositoltriphosphoric acid, and glycophospholipid. These phospholipids may be separated and purified from natural phospholipids as a raw material, or mixed natural phospholipids may be used as a raw material.
Ｉ式において、Ｙで示される容易に着脱できる導入基と
しては、直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基、直
鎖状、分岐鎖状または環状のアルキロイル基、直鎖状、
分岐鎖状または環状のアルケニル基、直鎖状、分岐鎖状
または環状のアルケロイル基およびアリール基から選ば
れる基を用いることができる。このような基の例として
は、Ｘと結合してアルキルエーテル、アリルエーテル、
ベンジルエーテル、トリアリールメチルエーテル、トリ
アルキルシリルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテ
ル等のエーテル類；酢酸エステル、蟻酸エステル、トリ
フルオロ酢酸エステル、安息香酸エステル等のエステル
類；メチレンアセタール、エチリデンアセタール、ベン
ジリデンアセタール、イソプロピリデンアセタール等の
アセタール類などを生成する基をあげることができ、こ
れらは単一のものを用いるのが好ましい。これらの基の
選択については、導入先であるグリセリルリン酸エステ
ル化合物の極性部位の官能基の反応性などにより決定す
ることができ、その反応方法および反応条件等は、この
種の反応に一般に採用されている方法および条件を採用
することができる。In the formula I, the easily removable attachment group represented by Y is a linear, branched or cyclic alkyl group, a linear, branched or cyclic alkyloyl group, a straight chain,
A group selected from a branched or cyclic alkenyl group, a linear, branched or cyclic alkeroyl group and an aryl group can be used. Examples of such groups include alkyl ethers, allyl ethers, linked to X,
Ethers such as benzyl ether, triarylmethyl ether, trialkylsilyl ether, tetrahydropyranyl ether; esters such as acetic acid ester, formate ester, trifluoroacetic acid ester, benzoic acid ester; methylene acetal, ethylidene acetal, benzylidene acetal, isopropylidene Examples thereof include groups that generate acetals such as lidene acetal, and it is preferable to use a single group. The selection of these groups can be determined by the reactivity of the functional group of the polar site of the glyceryl phosphate compound, which is the introduction destination, and the reaction method and reaction conditions are generally adopted for this type of reaction. The methods and conditions described can be adopted.
天然リン脂質にＹで示される導入基を導入した後、脱ア
シル化することにより、Ｉ式が誘導体が得られる。脱ア
シル化の方法はリン脂質の脱アシル化に採用されている
方法を採用することができる。合成によりＩ式の誘導体
を得るには、例えばＸ、Ｙの反応物とグリセロリン酸を
反応させることにより、単一のＩ式の誘導体を得ること
ができる。After introducing the introducing group represented by Y into the natural phospholipid, the derivative is obtained by deacylating. As the deacylation method, the method used for deacylation of phospholipids can be adopted. In order to obtain the derivative of formula I by synthesis, a single derivative of formula I can be obtained by reacting the reaction products of X and Y with glycerophosphoric acid.
こうして得られるＩ式の誘導体は導入基Ｙの導入によ
り、全体の極性が低下して有機溶媒に可溶となり、液体
クロマトグラフィーによる分離が可能となる。この場合
Ｙとして単一の基を導入すると、リン脂質の雑多なアシ
ル基は除去されているため、Ｘの違いによりカラムクロ
マトグラフィーによる分離精製が可能となる。またＸが
単一の基である場合には、バッチ方式で水溶性成分を除
去することにより、Ｉ式の誘導体を分離精製することが
できる。The thus-obtained derivative of the formula I becomes less soluble in the organic solvent by the introduction of the introduction group Y and becomes soluble in the organic solvent, and can be separated by liquid chromatography. In this case, when a single group is introduced as Y, miscellaneous acyl groups of phospholipids are removed, so that separation and purification by column chromatography can be performed depending on the difference in X. Further, when X is a single group, the derivative of the formula I can be separated and purified by removing the water-soluble component by a batch method.
分離剤として使用するケイ酸としては、破砕形のもので
もゲル状のもの（シリカゲル）でもよく、粒径10〜800
μｍ、細孔径0.25〜10μｍの範囲のものが好ましく、市
販品を用いることもでき、例えばClarkson Chemicals C
o.製Unisil、和光純薬工業（株）製ワコーゲル、Merck
社製Silica Gel 60、（株）ヤトロン製イアトロビーズ
（いずれも商標）等が分離性能等の面で好適である。高
速液体クロマトグラフィー用として市販されているケイ
酸は、分離性能では一段優れてはいるが、コスト的には
高くなる。その他の製品でも、使用前に粒径を揃える等
の精製を十分に行えば、使用可能である。The silicic acid used as a separating agent may be a crushed type or a gel type (silica gel) and has a particle size of 10 to 800.
μm and pore size in the range of 0.25 to 10 μm are preferable, and commercially available products can be used. For example, Clarkson Chemicals C
o. Unisil, Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Wakogel, Merck
Silica Gel 60 manufactured by the company, Iatro beads manufactured by Yatron Co., Ltd. (both are trademarks), and the like are preferable in terms of separation performance and the like. Although silicic acid commercially available for high performance liquid chromatography is more excellent in separation performance, it is costly. Other products can also be used if they are sufficiently refined such that the particle size is made uniform before use.
分離の方法としては、上述のケイ酸を使用する公知のカ
ラムクロマトグラフィーまたはバッチ式に準じた方式を
採用することができる。すなわち、グリセリルリン酸エ
ステル化合物誘導体が吸着し得る低極性溶媒でケイ酸を
前処理した後、同様の低極性溶媒に溶かしたグリセリル
リン酸エステル化合物誘導体を含む試料を加えてケイ酸
に吸着させ、不用物等を洗い流した後、高極性の溶媒を
用いてグリセリルリン酸エステル化合物誘導体を溶離さ
せる。吸着剤から不用物を洗い流す洗浄効果を高めるた
めには、化合物が溶離しない程度に極性の高い溶媒を用
いることが望ましい。As a method of separation, a method based on known column chromatography using the above-mentioned silicic acid or a batch method can be adopted. That is, after pretreatment of silicic acid in a low polar solvent that can be adsorbed glyceryl phosphate compound derivative, adsorbed to silicic acid by adding a sample containing a glyceryl phosphate compound derivative dissolved in a similar low polar solvent, After washing away unnecessary substances and the like, the glyceryl phosphate compound derivative is eluted with a highly polar solvent. In order to enhance the cleaning effect of washing away the unnecessary substances from the adsorbent, it is desirable to use a solvent having a high polarity so that the compound does not elute.
このような溶媒系としては、例えば以下のような組合せ
を示すことができる。高極性溶媒としては、炭素数１〜
10の直鎖状、分岐鎖状もしくは環状の脂肪族アルコール
またアルデヒド等および水あるいはそれらの混合物など
があり、これらは分子内にエーテル結合、エステル結合
または二重結合などを有していてもよく、またアルキル
基、シアン基、アミン基等の官能基を有していてもよ
く、例としてメタノール、３％含水イソプロパノール、
アセトニトリル、酪酸プロピルおよびこれらのうち２種
以上の混合系などがあげられる。低極性溶媒としては、
炭素数１〜10の直鎖状、分岐鎖状もしくは環状の炭化水
素化合物または炭素数１〜２のハロゲン化炭化水素化合
物、あるいはこれらと上記高極性溶媒群から選ばれる１
種以上との混合物などがあり、これらは分子内に二重結
合またはエーテル結合などを有していてもよく、またア
ルキル基等の官能基を有していてもよく、例として、ｎ
−ヘキサン、イソオクタン、ジエチルエーテル、ジイソ
プロピルエーテル、シクロヘキサン、ベンゼン、キシレ
ン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、イソ
オクタン−クロロホルム（３：７）、ｎ−ヘキサン−ベ
ンゼン（４：７）、クロロホルム−メタノール−水（６
５：２５：４）などがあげられる。As such a solvent system, for example, the following combinations can be shown. As the highly polar solvent, the number of carbon atoms is 1 to 1.
There are 10 linear, branched or cyclic aliphatic alcohols, aldehydes and the like and water or a mixture thereof, which may have an ether bond, an ester bond or a double bond in the molecule. Further, it may have a functional group such as an alkyl group, a cyan group and an amine group, and examples thereof include methanol, 3% hydrous isopropanol,
Examples thereof include acetonitrile, propyl butyrate, and a mixed system of two or more of these. As a low polar solvent,
A straight-chain, branched-chain or cyclic hydrocarbon compound having 1 to 10 carbon atoms, a halogenated hydrocarbon compound having 1 to 2 carbon atoms, or 1 or more selected from the above high polar solvent group
Mixtures of two or more species, and these may have a double bond or an ether bond in the molecule, or may have a functional group such as an alkyl group. For example, n
-Hexane, isooctane, diethyl ether, diisopropyl ether, cyclohexane, benzene, xylene, chloroform, carbon tetrachloride, dichloroethane, isooctane-chloroform (3: 7), n-hexane-benzene (4: 7), chloroform-methanol-water. (6
5: 25: 4) and the like.
このようにして分離精製したグリセリルリン酸エステル
化合物誘導体は、それ自体生理活性および薬理作用を有
しているため、溶媒が適当なものであればそのまま目的
に応じて使用することができる。また溶媒を留去等によ
り容易に除去することにより、精製されたＩ式の誘導体
として得ることもできる。さらにこの誘導体から導体基
を脱離させれば、対応するグリセリルリン酸エステル化
合物を得ることができ、任意のアシル基を導入して合成
リン脂質を合成するための原料として利用することがで
きる。Since the glyceryl phosphate compound derivative thus separated and purified has physiological activity and pharmacological action itself, it can be used as it is for any purpose if the solvent is suitable. Further, the solvent can be easily removed by distillation or the like to obtain a purified derivative of the formula I. Further, by removing the conductor group from this derivative, a corresponding glyceryl phosphate compound can be obtained, which can be used as a raw material for synthesizing a synthetic phospholipid by introducing an arbitrary acyl group.
こうして本発明の方法により、従来事実上不可能であっ
た任意のグリセリルリン酸エステル化合物誘導体の入手
が容易に可能となり、また本発明の分離精製方法を導入
することにより、リン脂質の合成原料となる任意の構造
のグリセリルリン酸エステル化合物の供給の途が開かれ
る。Thus, according to the method of the present invention, it becomes possible to easily obtain any glyceryl phosphate compound derivative, which has been practically impossible in the past, and by introducing the separation and purification method of the present invention, it can be used as a synthetic raw material for phospholipids. The supply of the glyceryl phosphate compound having any structure is opened.
本発明によれば、特定のグリセリルリン酸エステル化合
物誘導体を、ケイ酸により有機溶媒を使用して分離精製
するようにしたため、任意のグリセリルリン酸エステル
化合物製造の原料になるとともに、それ自体が生理活性
および薬理作用を有するグリセリルリン酸エステル化合
物誘導体を、簡便かつ容易に、効率よく高純度かつ高収
率で、大量に得ることができ、経済性に優れるなどの効
果がある。According to the present invention, a specific glyceryl phosphate compound derivative is separated and purified using silicic acid using an organic solvent, and thus it is used as a raw material for the production of any glyceryl phosphate compound, and is itself physiological. A glyceryl phosphate compound derivative having an activity and a pharmacological action can be obtained simply and easily, efficiently, in high purity and in high yield in a large amount, and is economically advantageous.
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明する。実
施例中、化合物の同定は、主として後述条件でのＴＬＣ
分析により標準物質と比較して行ったが、必要に応じて
質量分析を行った。Hereinafter, the present invention will be specifically described based on Examples. In the examples, compounds were identified mainly by TLC under the conditions described below.
Analysis was performed by comparison with a standard substance, but mass spectrometry was performed when necessary.
実施例１ ホスファチジルグリセロールのグリセロール残基にベン
ジル基を導入した後、クロロホルム溶液中で１M NaOHメ
タノール溶液を用いてアルカリ加水分解し、脱アシル化
した。Example 1 A benzyl group was introduced into the glycerol residue of phosphatidylglycerol, and then alkaline hydrolysis was carried out in a chloroform solution using a 1M NaOH methanol solution to deacylate.
得られたジベンゾイルグリセリルホスファチジルグリセ
ロール2.38ミリモルを含む反応混液にメタノールと水を
加え、Folchらの方法〔J.Folch,et.al.,J.Biol.Chem.22
6,497-(1957)〕で水洗した。クロロホルム層と取り、Na
2SO4で脱水した後、減圧乾固したものをｎ−ヘキサン約
５mlに溶かした。Methanol and water were added to the reaction mixture containing 2.38 mmol of the obtained dibenzoylglycerylphosphatidylglycerol, and the method of Folch et al. [J.Folch, et.al., J.Biol.Chem.22.
6,497- (1957)]. Take with the chloroform layer, Na
After dehydration with 2 SO 4 , the product dried under reduced pressure was dissolved in about 5 ml of n-hexane.
ケイ酸としてClarkson Chemical Co.製Unisilを充填
し、ｎ−ヘキサンで前処理したカラム（径４cm×56cm）
に上述の試料を加え、ｎ−ヘキサン−エタノール（１：
１）1500mlでカラムを洗浄し、さらにカラムに95%エタ
ノールを流し、溶出して来た初めの200mlを集めた。Column filled with Clarkson Chemical Co. Unisil as silicic acid and pretreated with n-hexane (diameter 4 cm x 56 cm)
Was added to the above sample, and n-hexane-ethanol (1:
1) The column was washed with 1500 ml, 95% ethanol was flown through the column, and the first 200 ml that had been eluted was collected.
ｎ−ヘキサン−エタノール（１：１）溶出画分およびエ
タノール溶出分を、ＴＬＣで分析した。すなわちMerck
社製NO.5717プレートに20〜100μｇの試料を直径３〜５
mmにスポットし、クロロホルム−メタノール−水（６
５：２５：４）で展開した。展開溶媒を風乾後、50%硫
酸をスプレーし、120℃で20分間加熱して発色させた。
その結果、ｎ−ヘキサン−エタノール（１：１）溶出画
分には遊離脂肪酸と未分解のジベンゾイル化ホスファチ
ジルグリセロールが検出され、エタノール溶出画分には
ジベンゾイルグリセリルホスファチジルグリセロールの
みが検出された。The n-hexane-ethanol (1: 1) elution fraction and the ethanol elution fraction were analyzed by TLC. Ie Merck
The NO.5717 plate made by the same company is used to measure 20 to 100 μg of sample to a diameter of 3 to 5
spot, and chloroform-methanol-water (6
It was developed at 5: 25: 4). After air-drying the developing solvent, 50% sulfuric acid was sprayed and heated at 120 ° C. for 20 minutes for color development.
As a result, free fatty acids and undecomposed dibenzoylated phosphatidylglycerol were detected in the n-hexane-ethanol (1: 1) elution fraction, and only dibenzoylglycerylphosphatidylglycerol was detected in the ethanol elution fraction.
エタノール溶出画分を濃縮し、910mg（2.28ミリモル）
のジベンゾイルグリセリルホスファチジルグリセロール
を得た（回収率95.8％）。The ethanol elution fraction was concentrated to 910 mg (2.28 mmol)
Then, dibenzoylglycerylphosphatidylglycerol was obtained (recovery rate: 95.8%).
実施例２ ホスファチジルイノシトールのイノシトール残基にニコ
チン酸を導入した後、ｎ−ヘキサンに溶かし、ホスフォ
リパーゼＡ１およびホスフォリパーゼＡ２を用いて、ア
シル基を加水分解した。Example 2 After introducing nicotinic acid into the inositol residue of phosphatidylinositol, it was dissolved in n-hexane and the acyl group was hydrolyzed using phospholipase A 1 and phospholipase A 2 .
得られたグリセリルホスファチジルイノシトールニコチ
ン酸エステル0.64ミリモルを含むｎ−ヘキサン層を分取
し、Na2SO4で脱水した後、減圧乾固したものを２mlのベ
ンゼンに溶かした。The obtained n-hexane layer containing 0.64 mmol of glycerylphosphatidylinositol nicotinate was separated, dehydrated with Na 2 SO 4 , and dried under reduced pressure to dissolve in 2 ml of benzene.
ケイ酸として和光純薬工業（株）製ワコーゲルC300を充
填し、イソオクタン−ベンゼン（９：１）前処理したカ
ラム（径４cm×48cm）に上記試料を加え、カラムをイソ
オクタン−アセトン（３：２）1200mlで洗浄後、イソオ
クタン−アセトン（２：８）で溶出した。Wako gel C300 manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. was filled as silicic acid, and the above sample was added to a column (diameter 4 cm × 48 cm) pretreated with isooctane-benzene (9: 1), and the column was isooctane-acetone (3: 2). ) After washing with 1200 ml, it was eluted with isooctane-acetone (2: 8).
実施例１と同様にしてＴＬＣで分析したところ、イソオ
クタン−アセトン（３：２）画分には脂肪酸と未分解の
ホスファチジルイノシトールニコチン酸エステルおよび
そのリゾ体た含まれ、イソオクタン−アセトン（２：
８）画分にはグリセリルホスファチジルイノシトールニ
コチン酸エステルのみが検出された。When analyzed by TLC in the same manner as in Example 1, the isooctane-acetone (3: 2) fraction contained fatty acids and undecomposed phosphatidylinositol nicotinic acid ester and its lyso form, and isooctane-acetone (2:
8) Only glycerylphosphatidylinositol nicotinic acid ester was detected in the fraction.
イソオクタン−アセトン（２：８）画分を濃縮し、グリ
セリルホスファチジルイノシトールニコチン酸エステル
505mg（0.53ミルモル）を得た（回収率83.6％）。Isooctane-acetone (2: 8) fraction was concentrated to give glycerylphosphatidylinositol nicotinic acid ester.
505 mg (0.53 mmol) was obtained (recovery rate 83.6%).
実施例３ グリセロリン酸とセロビオースヘプタアセテートを公知
の方法でリン酸エステル化させ、グリセリルホスファチ
ジルセロビオースヘプタアセテートを合成した。Example 3 Glycerophosphoric acid and cellobiose heptaacetate were phosphorylated by a known method to synthesize glycerylphosphatidyl cellobiose heptaacetate.
得られたグリセリルホスファチジルセロビオースヘプタ
アセテート6.33ミリモルを含む反応混液をFolchらの方
法で水洗し、実施例１と同様にしてジイソプロピルエー
テル50mlに溶かした試料を調製した。The reaction mixture containing 6.33 mmol of glycerylphosphatidyl cellobiose heptaacetate thus obtained was washed with water by the method of Folch et al., And a sample dissolved in 50 ml of diisopropyl ether was prepared in the same manner as in Example 1.
ジイソプロピルエーテル−アセトニトリル（８：２）で
緩衝化したMerck製Silica Gel 60 2.3kgに上記試料を加
えバッチ式で処理した。ゲルを同じ溶媒2.5で５回洗
浄した後、ジイソプロピルエーテル−アセトニトリル
（２：８）２．５で３回溶出した。The above sample was added to 2.3 kg of Silica Gel 60 manufactured by Merck buffered with diisopropyl ether-acetonitrile (8: 2) and processed in a batch system. The gel was washed with the same solvent 2.5 times 5 times and then eluted with diisopropyl ether-acetonitrile (2: 8) 2.5 3 times.
実施例１と同様にしてＴＬＣ分析したところ、ジイソプ
ロピルエーテル−アセトニトリル（２：８）溶出画分に
は、グリセリルホスファチジルセロビオースヘプタアセ
テートのみが検出された。When TLC analysis was performed in the same manner as in Example 1, only glycerylphosphatidylcellobiose heptaacetate was detected in the diisopropyl ether-acetonitrile (2: 8) elution fraction.
ジイソプロピルエーテル−アセトニトリル（２：８）溶
出画分を濃縮し、グリセリルホスファチジルセロビオー
スヘプタアセテート3.89g（4.83ミリモル）を得た（回
収率76.3％）。The fraction eluted with diisopropyl ether-acetonitrile (2: 8) was concentrated to obtain 3.89 g (4.83 mmol) of glycerylphosphatidyl cellobiose heptaacetate (recovery rate 76.3%).
実施例４ リン脂質混合物（ホスファチジルコリン48%，ホスファ
チジルエタノールアミン44%，ホスファチジン酸８％）
を公知の方法でエチルビニルエーテルと反応させた。Example 4 Phospholipid mixture (phosphatidylcholine 48%, phosphatidylethanolamine 44%, phosphatidic acid 8%)
Was reacted with ethyl vinyl ether in a known manner.
エチルビニルエーテル化したリン脂質混合物５ｇを実施
例１と同様にしてアルカリ加水分解後水洗し、クロロホ
ルム溶液とした。5 g of the ethyl vinyl etherified phospholipid mixture was alkali-hydrolyzed and washed with water in the same manner as in Example 1 to obtain a chloroform solution.
クロロホルム緩衝化した（株）ヤトロン製イアトロビー
ズGRS-80100カラム（径2.5cm×50cm）に試料を加え、ク
ロロホルム−メタノール−水（６５：２５：４）500ml
カラムを洗浄後、10％含水メタノールで溶出した。The sample was added to a chloroform-buffered Jatro Incorporated Iatro beads GRS-80100 column (diameter 2.5 cm x 50 cm), and chloroform-methanol-water (65: 25: 4) 500 ml was added.
After washing the column, it was eluted with 10% water-containing methanol.
10％含水メタノール溶出画分を濃縮し、グリセリルホス
ファチジル−N,N′−ジ（２−エトキシエチル）エタノ
ールアミン0.48gを得た。The 10% water-containing methanol elution fraction was concentrated to give 0.48 g of glycerylphosphatidyl-N, N'-di (2-ethoxyethyl) ethanolamine.
Claims (5)
エステル化合物誘導体を、有機溶媒により、ケイ酸を分
離剤として分離精製することを特徴とするグリセリルリ
ン酸エステル化合物誘導体の分離精製方法。 （式中、Ｘは含窒素アルコール残基またはポリオール残
基、Ｙは容易に着脱可能な導入基、ｎは12以下の自然数
を示す。）1. A method for separating and purifying a glyceryl phosphate compound derivative, which comprises separating and purifying a glyceryl phosphate compound derivative containing a structure of the following formula (I) with an organic solvent using silicic acid as a separating agent. . (In the formula, X represents a nitrogen-containing alcohol residue or a polyol residue, Y represents an easily removable attachment group, and n represents a natural number of 12 or less.)
メチルエタノールアミン基、N,N′−ジメチルエタノー
ルアミン基、グリセロール基、アミノアシルグリセロー
ル基、グリセロリン酸基、グリセロリン酸ホスファチジ
ル基、イノシトール基、イノシトールリン酸基、イノシ
トールジリン酸基、単糖、二糖またはオリゴ糖である特
許請求の範囲第１項記載の分離精製方法。2. X is serine group, ethanolamine group, N-
Methylethanolamine group, N, N′-dimethylethanolamine group, glycerol group, aminoacylglycerol group, glycerophosphate group, glycerophosphate phosphatidyl group, inositol group, inositol phosphate group, inositol diphosphate group, monosaccharide, disaccharide or The method for separating and purifying according to claim 1, which is an oligosaccharide.
ル基、アルキロイル基、アルケニル基、アルケロイル基
またはアリール基である特許請求の範囲第１項または第
２項記載の分離精製方法。3. The method for separating and purifying according to claim 1 or 2, wherein Y is a linear, branched or cyclic alkyl group, an alkyloyl group, an alkenyl group, an alkeroyl group or an aryl group.
ｍ、細孔径0.25〜10μｍである特許請求の範囲第１項な
いし第３項のいずれかに記載の分離精製方法。4. The particle size of silicic acid as a separating agent is 10 to 800 μm.
The method for separation and purification according to any one of claims 1 to 3, wherein m and a pore diameter are 0.25 to 10 µm.
酸エステル化合物誘導体を分離剤に吸着させ、分離剤を
洗浄後、極性の高い溶媒で目的とするグリセリルリン酸
エステル化合物誘導体を溶離する特許請求の範囲第１項
ないし第４項のいずれかに記載の分離精製方法。5. A patent in which a glyceryl phosphate ester compound derivative is adsorbed to a separating agent in the presence of a solvent having a low polarity, the separating agent is washed, and then the desired glyceryl phosphate ester compound derivative is eluted with a solvent having a high polarity. The method for separation and purification according to any one of claims 1 to 4.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17719286A JPH0613537B2 (en) | 1986-07-28 | 1986-07-28 | Method for separating and purifying glyceryl phosphate compound derivative |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17719286A JPH0613537B2 (en) | 1986-07-28 | 1986-07-28 | Method for separating and purifying glyceryl phosphate compound derivative |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6333386A JPS6333386A (en) | 1988-02-13 |
| JPH0613537B2 true JPH0613537B2 (en) | 1994-02-23 |
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| JP (1) | JPH0613537B2 (en) |
-
1986
- 1986-07-28 JP JP17719286A patent/JPH0613537B2/en not_active Expired - Fee Related
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| JPS6333386A (en) | 1988-02-13 |
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