JPH06113880A - Monoclonal antibody and method for measuring lipoprotein small a using the same - Google Patents
Monoclonal antibody and method for measuring lipoprotein small a using the sameInfo
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- JPH06113880A JPH06113880A JP28676692A JP28676692A JPH06113880A JP H06113880 A JPH06113880 A JP H06113880A JP 28676692 A JP28676692 A JP 28676692A JP 28676692 A JP28676692 A JP 28676692A JP H06113880 A JPH06113880 A JP H06113880A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】 本発明は血中リポプロティンス
モールＡの当該蛋白質各フェノタイプの共通部位を認識
する抗体並びにこの抗体を利用した血中リポプロティン
スモールＡの測定方法に関する。さらに詳細には、免疫
学的測定方法に基づく血中リポプロティンスモールＡの
測定において、リポプロティンスモールＡのフェノタイ
プの違い(リポプロティンスモールＡの多型性)による抗
体の反応性の相違、またそれに伴う測定値の誤差を減ず
る方法を提供する。したがって、本発明は血中リポプロ
ティンスモールＡの測定に生化学あるいは医学的意義が
存する分野、たとえば臨床診断の分野において広く利用
される。TECHNICAL FIELD The present invention relates to an antibody that recognizes a common site of each phenotype of the protein of blood lipoprotein small A and a method of measuring blood lipoprotein small A using this antibody. More specifically, in the measurement of blood lipoprotein small A based on an immunological assay method, the difference in antibody reactivity due to the difference of lipoprotein small A phenotype (polymorphism of lipoprotein small A), and A method for reducing the error in the measurement value associated therewith is provided. Therefore, the present invention is widely used in the fields in which there is biochemical or medical significance in the measurement of blood lipoprotein small A, for example, in the field of clinical diagnosis.
【０００２】[0002]
【従来技術及び発明が解決しようとする問題点】 リポ
蛋白は蛋白質と脂質の複合体であり、生体内、特に血液
中の一成分としてその存在が知られている。リポ蛋白に
は、低比重リポ蛋白(以下ＬＤＬと称する)、高比重リポ
蛋白(以下ＨＤＬと称する)など、種々のリポ蛋白が存在
するが、中でも、リポ蛋白の一つであるリポプロティン
スモールＡ(以下Lp(a)と称する)の生体内存在量と動脈
硬化症との関連性が最近特に注目されている。Prior Art and Problems to be Solved by the Invention Lipoprotein is a complex of protein and lipid, and its existence is known as a component in a living body, particularly in blood. There are various lipoproteins such as low-density lipoprotein (hereinafter referred to as LDL) and high-density lipoprotein (hereinafter referred to as HDL), and among them, among them, lipoprotein small A, which is one of the lipoproteins. Recently, the relationship between the abundance of Lp (a) (hereinafter referred to as Lp (a)) and arteriosclerosis has attracted particular attention.
【０００３】Lp(a)は1963年にBerg等によって発見され
(Berg K. Acta Pathol. Microbiol.Scand. 59, p.369-3
82(1963))、構造的に類似したＬＤＬの遺伝的変異とし
て報告されたもので、現在では動脈硬化性疾患の独立し
た危険因子として考えられている。Lp(a)の構造やその
生理的意義については不明な点が多かったが、1987年Ea
ton等により、Lp(a)に固有なアポ蛋白であるアポリポプ
ロティンスモールＡ(以下apo(a)と称する)が、血液線溶
系の酵素の一種であるプラスミノーゲンと構造的に著し
い相同性を有することが発表されてから、リポ蛋白と血
液凝固線溶系を結びつけるものとして、apo(a)が動脈硬
化性疾患に深く関与しているものと考えられるようにな
った(J. W. McLean, et al., Nature 300, p132-137(19
87))。Lp (a) was discovered by Berg et al. In 1963.
(Berg K. Acta Pathol. Microbiol. Scand. 59 , p.369-3
82 (1963)), which was reported as a structurally similar genetic variation in LDL, and is now considered as an independent risk factor for arteriosclerotic disease. There were many unclear points about the structure of Lp (a) and its physiological significance.
According to ton and others, apolipoprotein small A, an apoprotein specific to Lp (a) (hereinafter referred to as apo (a)), has structurally significant homology with plasminogen, which is one of the blood fibrinolytic enzymes. Since it was announced that it has, apo (a) is thought to be deeply involved in arteriosclerotic diseases as a link between the lipoprotein and the blood coagulation / fibrinolysis system (JW McLean, et al. , Nature 300 , p132-137 (19
87)).
【０００４】図１にLp(a)の構造を示す。図に示したよ
うに、Lp(a)に固有なアポ蛋白であるapo(a)が、ＬＤＬ
にそのアポ蛋白(リポ蛋白の脂質部分を除いた蛋白部
分、ＬＤＬの場合apoB-100)とのジスルフィド結合を介
して結合した構造を有する。apo(a)は大量の糖鎖を含む
高分子量蛋白であり、その分子量は28万から70万ダルト
ンまで報告されている。その特徴は線溶系に働くプラス
ミノーゲンとの構造的相同性が著しいことである。プラ
スミノーゲンにはループ上のクリングルドメインが５つ
あり、最後にセリンプロテアーゼ構造部分をもってい
る。apo(a)も同じくこのクリングル構造を有し、プラス
ミノーゲンのクリングル４と相同性の高いクリングルを
最大37個、次にプラスミノーゲンのクリングル５に相同
性の高い部分、最後にセリンプロテアーゼ部分から形成
されている。FIG. 1 shows the structure of Lp (a). As shown in the figure, apo (a), an apoprotein specific to Lp (a),
To the apoprotein (the protein portion of the lipoprotein excluding the lipid portion, apoB-100 in the case of LDL) is bound via a disulfide bond. apo (a) is a high molecular weight protein containing a large amount of sugar chains, and its molecular weight has been reported to be 280,000 to 700,000 daltons. The feature is that the structural homology with plasminogen acting in the fibrinolytic system is remarkable. Plasminogen has five kringle domains on the loop, and finally has a serine protease structural part. apo (a) also has this kringle structure, with up to 37 kringles highly homologous to kringle 4 of plasminogen, then a part highly homologous to kringle 5 of plasminogen, and finally a serine protease part. Are formed from.
【０００５】apo(a)はクリングル４相同性部分の数が一
定ではなく、分子量を異にする多型性が示されている(K
oschinsky, M. L. et al., Biochemistry 29 ,p.640-64
4, (1990))。apo(a)の多型性は、SDS-PAGE電気泳動によ
りアイソフォームとして検出される。Utermann等は６本
の異なるapo(a)バンドを分離して、１あるいは２本のバ
ンドを示すapo(a)アイソフォームを13種類のapo(a)のフ
ェノタイプとして報告している(Utermann, G et al., P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 86,p.4171-4174 (1989))。Apo (a) shows a polymorphism in which the number of kringle 4 homology portions is not constant and the molecular weights are different (K
oschinsky, ML et al., Biochemistry 29 , p.640-64
4, (1990)). The apo (a) polymorphism is detected as an isoform by SDS-PAGE electrophoresis. Utermann et al. Have separated six different apo (a) bands and reported apo (a) isoforms showing one or two bands as 13 phenotypes of apo (a) (Utermann, G et al., P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 86 , p. 4171-4174 (1989)).
【０００６】ところで、心筋梗塞、虚血性心疾患、脳梗
塞などの疾患を持つ疾患群は有意にLp(a)値が対象群に
比べ高値を示すことが知られている。たとえば、Dahlen
等は232人についての血清Lp(a)を測定し、48mg/dl以上
群では11年間の経過中でLp(a)値48mg/dl以下群に比較し
心血管障害による死亡が2.6 倍に達し、虚血性心疾患の
発症率は４倍高いと報告している(Dahlen G. H. et a
l., Circulation 74,p758-765(1968))。またバイパス手
術後１〜14年を経過した167例で、移植静脈片の梗塞群
と非梗塞群ではLp(a)値が有意に異なり、梗塞群が非梗
塞群の２倍であり、この差異は若年者で著しいとの報告
もある(Hoff H.F. et al., Circulation 77, p.1238-
(1988))。[0006] By the way, it is known that the disease group having diseases such as myocardial infarction, ischemic heart disease, and cerebral infarction show significantly higher Lp (a) value than the control group. For example, Dahlen
Measured serum Lp (a) in 232 patients, and in the 48 mg / dl or higher group, the death due to cardiovascular disease reached 2.6 times in the 11-year course compared with the group with Lp (a) value of 48 mg / dl or lower. Report that the incidence of ischemic heart disease is four times higher (Dahlen GH et a
L., Circulation 74 , p758-765 (1968)). In addition, in 167 cases 1 to 14 years after bypass surgery, the Lp (a) value was significantly different between the infarcted group and the non-infarcted group of transplanted veins, and the infarcted group was twice that of the non-infarcted group. Have been reported to be significantly younger (Hoff HF et al., Circulation 77 , p.1238-
(1988)).
【０００７】このLp(a)の血液中の存在量を測定するこ
とにより、これら疾患群の危険因子を予知することが可
能で、危険因子の予知の結果、患者の血液を取り出し、
Lp(a)を除いた後、再び採血者に血液を戻す手法である
ＬＤＬアフェレーシスあるいは薬物投与によりLp(a)を
除くことができればこれら危険因子を除去することが可
能である。By measuring the abundance of Lp (a) in blood, it is possible to predict the risk factors of these disease groups. As a result of the prediction of the risk factors, the blood of the patient is taken out,
These risk factors can be eliminated if Lp (a) can be removed by LDL apheresis or drug administration, which is a method of returning blood to a blood sampler after removing Lp (a).
【０００８】血中Lp(a)量を測定する方法としては種々
の方法があるが、感度のよい方法としては免疫学的測定
方法が推奨される。たとえば抗apo(a)抗体を利用した酵
素免疫測定法(ＥＬＩＳＡ 法)を挙げることができ、す
でにいくつかの報告がなされている(H. Guo, et al.,
J. Lipid Res., 30 p.23-37(1989); W. L. T. Wongeta
l., Clin. Chem., 36, p.192-197 (1990))。There are various methods for measuring the amount of Lp (a) in blood, but an immunological measuring method is recommended as a highly sensitive method. For example, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA method) using an anti-apo (a) antibody can be mentioned, and some reports have already been made (H. Guo, et al.,
J. Lipid Res., 30 p.23-37 (1989); WLT Wongeta
L., Clin. Chem., 36 , p. 192-197 (1990)).
【０００９】上述のように、Lp(a)はその構造上多くの
フェノタイプを持っており、免疫学的測定方法に使用さ
れる通常の方法で得られた抗体は、各フェノタイプつま
りクリングル４の数の変化に伴い、その反応性は変化す
る。そのため、従来の報告されている方法を適用し、１
種のフェノタイプをもって全てのフェノタイプを定量化
することは不可能である。最も正確な測定法としては、
測定検体と同一のフェノタイプの標準物質を用い、その
反応性を基準にLp(a)値を算出することが望ましい。し
かし、これらの方法ではあらかじめ測定検体のフェノタ
イプを知る必要があり現実性に欠ける。この各フェノタ
イプに対する抗体の反応性の違いが、Lp(a)の定量化あ
るいはLp(a)の標準化を妨げる原因となっている。[0009] As described above, Lp (a) has many phenotypes in its structure, and the antibodies obtained by the usual method used for immunoassays are different phenotypes, namely, kringle 4 The reactivity changes with the number of. Therefore, applying the previously reported method, 1
It is not possible to quantify all phenotypes by species phenotype. The most accurate measurement method is
It is desirable to use the same phenotype standard substance as the measurement sample and calculate the Lp (a) value based on its reactivity. However, these methods are not practical because it is necessary to know the phenotype of the measurement sample in advance. This difference in antibody reactivity to each phenotype is a cause of hindering Lp (a) quantification or Lp (a) standardization.
【００１０】このような問題点に鑑み、本発明者はハイ
ブリドーマ法によりLp(a)の各フェノタイプに対して一
様に反応するモノクローナル抗体を作製し、それらを用
いてLp(a)を正確に測定することのできる方法の提供を
課題として検討した。In view of these problems, the present inventor produced a monoclonal antibody uniformly reacting with each phenotype of Lp (a) by the hybridoma method, and used them to accurately determine Lp (a). The issue was to provide a method that can be measured.
【００１１】本件発明者等は鋭意研究の結果、モノクロ
ーナル抗体の技術を用いてLp(a)の多型性の原因となる
クリングル４部分に反応しない抗apo(a)抗体を作製し、
それらを用いて免疫学的測定を実施し、各フェノタイプ
に対して一様に反応する測定系を確立し、本発明を完成
するに至った。以下、本発明の概略を説明する。As a result of earnest research, the present inventors have produced an anti-apo (a) antibody that does not react with the kringle 4 part, which causes Lp (a) polymorphism, using the technique of monoclonal antibody,
Immunological measurements were carried out using these, and a measurement system that responded uniformly to each phenotype was established, and the present invention was completed. The outline of the present invention will be described below.
【００１２】本発明は、Lp(a)のクリングル４相同性部
分に反応しない抗apo(a)モノクローナル抗体を用いるこ
とを大きな特徴とする。そのため、その抗体の反応部位
は、apo(a)のクリングル５相同ドメイン、セリンプロテ
アーゼ相同ドメイン、Ｎ末端、Ｃ末端のアミノ酸の１次
配列、あるいはその構造を認識する可能性が高い。ま
た、抗apo(a)ポリクローナル抗体をapo(a)のクリングル
４部分で吸収した抗体、あるいはapo(a)のクリングル４
以外の部分を免疫することによって得られた抗体も本発
明と同一の目的のために調製されたものに関しては、本
発明の範躊に入り得る。また、これらの抗体を１種ある
いは数種組み合わせた免疫学的測定系も同様である。し
かしながら、ポリクローナル抗体の使用は理論上、可能
ではあるが、抗体調製の際の吸収操作等の煩雑さ、ある
いは抗原認識の特異性の不完全さ等実際には克服するべ
き問題がなお残っている。The present invention is characterized by using an anti-apo (a) monoclonal antibody which does not react with the kringle 4 homology portion of Lp (a). Therefore, the reactive site of the antibody is likely to recognize the kringle 5 homology domain of apo (a), the serine protease homology domain, the primary sequences of N-terminal and C-terminal amino acids, or the structure thereof. In addition, an antibody obtained by absorbing an anti-apo (a) polyclonal antibody with the kringle 4 portion of apo (a), or kringle 4 of apo (a)
Antibodies obtained by immunizing other parts can also be included in the scope of the present invention as far as they are prepared for the same purpose as the present invention. The same applies to an immunological assay system in which these antibodies are used alone or in combination. However, although the use of polyclonal antibodies is theoretically possible, there still remain problems to be overcome in practice, such as the complexity of the absorption procedure during antibody preparation, or the incomplete specificity of antigen recognition. .
【００１３】以下、本発明の最適な実施態様であるヒト
apo(a)のクリングル４以外の部位を認識するモノクロー
ナル抗体より構成されるサンドイッチ型ＥＬＩＳＡを適
用した場合のLp(a)の測定について概略を述べる。しか
しながら、本発明は抗ヒトapo(a)モノクローナル抗体を
用いた免疫学的測定方法を広く包含するものであり、サ
ンドイッチ型ＥＬＩＳＡに限定されるものではない。例
えば、競合法に基づくＥＬＩＳＡ、サンドイッチ型ＲＩ
Ａ(放射免疫測定法)、競合法に基づくＲＩＡ、蛍光物質
を標識化した免疫学的測定法等も好適な実施態様と考え
られ得る。Human being the most preferred embodiment of the present invention will be described below.
An outline of the measurement of Lp (a) in the case of applying a sandwich type ELISA composed of a monoclonal antibody that recognizes a site other than kringle 4 of apo (a) will be described. However, the present invention broadly includes an immunological measurement method using an anti-human apo (a) monoclonal antibody, and is not limited to the sandwich type ELISA. For example, ELISA based on competitive method, sandwich type RI
A (radioimmunoassay), RIA based on competitive method, immunoassay in which a fluorescent substance is labeled, and the like can be considered as suitable embodiments.
【００１４】まず、あらかじめ用意した抗ヒトapo(a)モ
ノクローナル抗体をマイクロタイタープレートのウェル
に吸着させる。ここに、各フェノタイプのLp(a)を含む
希釈された測定試料と、酵素標識した抗ヒトapo(a)モノ
クローナル抗体を加えインキュベートし、洗浄後、最後
に基質液を加え、一定時間後に反応を停止し、基質の発
色量を吸光度で測定すればよい。First, the anti-human apo (a) monoclonal antibody prepared in advance is adsorbed to the well of the microtiter plate. Here, diluted measurement sample containing Lp (a) of each phenotype and enzyme-labeled anti-human apo (a) monoclonal antibody were added and incubated, and after washing, the substrate solution was added at the end, and the reaction was performed after a certain period of time. Then, the amount of color development of the substrate may be measured by absorbance.
【００１５】抗apo(a)モノクローナル抗体は通常用いら
れている方法を参考にして調製すればよく、その概略は
以下の如くである。Lp(a)は正常ヒト血清より超遠心で
比重1.063〜1.15の画分を分取し、それらをSepharose C
L-4Bカラムを用いて精製する。得られたLp(a)をマウス
に免疫し、このマウスより得られた脾臓細胞と適当なミ
エローマ細胞とを融合し、ハイブリドーマを作製してこ
のハイブリドーマより目的のマウスモノクローナル抗体
を調製する。The anti-apo (a) monoclonal antibody may be prepared by referring to a commonly used method, and its outline is as follows. Lp (a) was collected from normal human serum by ultracentrifugation and fractionated with a specific gravity of 1.063 to 1.15.
Purify using L-4B column. A mouse is immunized with the obtained Lp (a), and a spleen cell obtained from this mouse is fused with an appropriate myeloma cell to prepare a hybridoma, and a desired mouse monoclonal antibody is prepared from this hybridoma.
【００１６】マウス抗体のスクリーニング法は以下の方
法で行なった。つまり、まずLp(a)に反応するが、ＬＤ
Ｌには反応しないクローンを選択した。得られたクロー
ンをマウス腹腔に投与し、腹水を得、Protein Aカラム
を用い精製を行ない、数十種のモノクローナル抗体を得
た。得られたモノクローナル抗体のうちプラスミノーゲ
ンに反応しない抗体を選択し、且つLp(a)添加により免
疫学的比濁を認めない抗体を選択した。Lp(a)はその構
造上同じアミノ酸部位(グリングル４相同ドメイン)が多
く存在するため、１種のモノクローナル抗体であっても
免疫学的凝集塊を生じることが可能である。そのため、
本発明ではこれらの凝集反応を示さない抗体を用いるこ
とで、Lp(a)の多型性の原因となるクリングル４に反応
しないモノクローナル抗体を選択した。本発明において
好適な抗体が得られた事実の背景には、上述のスクリー
ニング法の考案に依るところが大きい。The mouse antibody screening method was performed as follows. In other words, it reacts to Lp (a) first, but LD
A clone that did not react with L was selected. The obtained clone was administered to the peritoneal cavity of a mouse to obtain ascites, and purification was performed using a Protein A column to obtain several tens of kinds of monoclonal antibodies. Among the obtained monoclonal antibodies, an antibody that did not react with plasminogen was selected, and an antibody that did not show immunological turbidity by the addition of Lp (a) was selected. Since Lp (a) has a large number of the same amino acid sites (gringle 4 homology domain) in its structure, it is possible to produce an immunological aggregate even with one kind of monoclonal antibody. for that reason,
In the present invention, a monoclonal antibody that does not react with kringle 4 which causes the polymorphism of Lp (a) was selected by using an antibody that does not show these agglutination reactions. The background to the fact that the preferred antibody was obtained in the present invention is largely due to the idea of the screening method described above.
【００１７】標識抗体の調製法としては固相抗体とは異
なる部位を認識する抗ヒトapo(a)モノクローナル抗体を
マウス腹水よりProtein Aカラムを用いて精製し、さら
にペプシン処理後、そのF(ab)'2をたとえば石川等の方
法に従いペルオキシターゼで標識すればよい。なお、本
発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの
代表例は工業技術院微生物技術研究所(微工研)に受託番
号第13122号(FERM P-13122)及び受託番号第13123号(FER
M P-13123)として寄託されている。As a method for preparing the labeled antibody, an anti-human apo (a) monoclonal antibody that recognizes a site different from that of the solid-phase antibody is purified from mouse ascites using a Protein A column, further treated with pepsin, and then F (ab ) '2 may be labeled with peroxidase according to the method of Ishikawa et al. Incidentally, a representative example of a hybridoma producing the monoclonal antibody of the present invention is a microbiological research institute of Industrial Science and Technology (Microtechnology Research Institute) accession number 13122 (FERM P-13122) and accession number 13123 (FER
It has been deposited as M P-13123).
【００１８】[0018]
【発明の効果】本発明において確立した測定系ではLp
(a)含有血清あるいは純化Lp(a)は、その各フェノタイプ
に対して一様に反応した。従って、本発明によって従来
からの問題点であったLp(a)の多型性に起因するLp(a)定
量の不正確さの問題を克服することができた。[Effect of the Invention] In the measurement system established in the present invention, Lp
Serum containing (a) or purified Lp (a) reacted uniformly to each phenotype. Therefore, the present invention can overcome the problem of inaccuracy in Lp (a) quantification due to the polymorphism of Lp (a), which has been a problem in the past.
【００１９】以下、本発明の理解を深めるために実施例
に沿って説明するが、本発明はこれらの実施例に何等限
定されるものではない。Hereinafter, the present invention will be described along with examples in order to deepen the understanding thereof, but the present invention is not limited to these examples.
【００２０】[0020]
【実施例】実施例 １ (モノクローナル抗体の調製並びに選定) 本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
はケラーとミルシュタインの方法(Kohler and Milstei
n, Nature, 256 p.495-497(1975))としてよく知られた
方法を参考にして得られる。得られたハイブリドーマよ
り調製された数十種の抗ヒトLp(a)モノクローナル抗体
をすべてCambiaso等の方法に従い、ラテックス粒子(セ
キスイ化学社)に感作した(Cambiaso CL et al. Methods
Enzymol. 74 (B): 106, 1981.)。Lp(a)を含む血清40μ
lにグリシンからなる緩衝液を760μl添加し37℃でイン
キュベーション後、調製した抗ヒトLp(a)モノクローナ
ル抗体感作ラテックス液を200μl添加し、37℃で一定時
間インキュベーションした後、その凝集を吸光度及び粒
子粒度を測定することにより確認した(LPA-3100 LASERP
ARTICE ANALYZER 大塚電子社)。上述の方法で選択され
た抗体のラテックス凝集反応での挙動を図２に示す。こ
れらの測定で凝集反応を起こさないモノクローナル抗
体、No.80並びにNo.472を２種選択し、一種を固相抗体
用として、他をF(ab)'2化した後ＨＲＰ(ペルオキシダー
ゼ)標識した。こうして得られたモノクローナル抗体を
実施例２並びに実施例３に示すＥＬＩＳＡ法による測定
に供した。EXAMPLES Example 1 (Preparation and Selection of Monoclonal Antibody) The hybridoma producing the monoclonal antibody of the present invention is the method of Kohler and Milstei.
n, Nature, 256 p. 495-497 (1975)). All dozens of anti-human Lp (a) monoclonal antibodies prepared from the obtained hybridomas were sensitized to latex particles (Sekisui Chemical Co., Ltd.) according to the method of Cambiaso etc. (Cambiaso CL et al. Methods).
Enzymol. 74 (B): 106, 1981.). Serum containing Lp (a) 40μ
After adding 760 μl of a buffer solution consisting of glycine to 37 ° C and incubating at 37 ° C, 200 μl of the prepared anti-human Lp (a) monoclonal antibody-sensitized latex solution was added, and after incubation at 37 ° C for a certain period of time, its aggregation was measured by absorbance and Confirmed by measuring the particle size (LPA-3100 LASERP
ARTICE ANALYZER). The behavior of the antibody selected by the above method in the latex agglutination reaction is shown in FIG. Two kinds of monoclonal antibodies, No. 80 and No. 472, which do not cause agglutination reaction in these measurements were selected. One was used as a solid phase antibody and the other was F (ab) '2 converted and then labeled with HRP (peroxidase). . The monoclonal antibody thus obtained was subjected to the measurement by the ELISA method shown in Examples 2 and 3.
【００２１】なお、上述のモノクローナル抗体の代表例
は何れもＩｇＧ1タイプのサブクラスに属し、これらを
産生するハイブリドーマは微工研に受託番号第13122号
(FERMP-13122)及び受託番号第13123号(FERM P-13123)と
して寄託されている。The representative examples of the above-mentioned monoclonal antibodies all belong to the IgG1 type subclass, and the hybridomas that produce these are subcontracted to Microindustry No. 13122.
(FERMP-13122) and deposit number 13123 (FERM P-13123).
【００２２】実施例 ２(モノクローナル抗体を用いたＥ
ＬＩＳＡ法による測定) 抗体希釈液に抗ヒトapo(a)モノクローナル抗体を５μg/
mlになるように溶解し、これを96ウェルマイクロタイタ
ープレート(NUNC社製、IMMUNO MODULE MAXISORP F8)
に、１ウェル当り150μlずつ添加し４℃で一夜放置し
た。各ウェルより上記抗体液を吸引除去し、マイクロプ
レート洗浄機(DYNATECH社製、ULTRA WASHI II)を用いて
ＰＢＳ洗浄液で３回洗浄した後、１％アルブミン(生化
学工業社製、Albumin Fraction V, Bovine)溶解液を300
μl添加し、４℃で一夜放置した。アルブミン溶液を吸
引除去し、前記緩衝液で３回洗浄し測定ウェルとした。
別にペルオキシダーゼ標識した固相抗体とは異なる部位
を認識する抗ヒトapo(a)モノクローナル抗体F(ab)'2 を
準備した。測定用ウェルに下記の方法で調製した測定試
料を１ウェル当たり50μlずつ入れ、同時にペルオキシ
ダーゼ標識した抗apo(a)モノクローナル抗体F(ab)'2を5
0μlを入れ、37℃で２時間放置し抗原抗体反応させた。
各ウェル中の反応液を吸引除去し、0.5％ Tween 20を含
むＰＢＳ(ｐＨ7.2)で５回洗浄後、基質溶液(OPD/H2O2)1
00μlを各ウェルに添加後15分間室温遮光下で放置した
後、４Ｎ硫酸を各ウェルに100μlずつ加え反応を停止さ
せた。撹拌しウェル内を均一にした後、オートリーダー
(WAKO Molecular Devices, THRMO maxmicroplate reade
r)で490nmの吸光度を測定した。 Example 2 (E using a monoclonal antibody
Measurement by LISA method) Anti-human apo (a) monoclonal antibody was added to the antibody diluent at 5 μg /
Dissolve so that it becomes ml, and this is a 96 well microtiter plate (NUNC, IMMUNO MODULE MAXISORP F8)
To each well, 150 μl was added per well, and the mixture was left at 4 ° C. overnight. The above antibody solution was removed by suction from each well, and the plate was washed 3 times with a PBS washing solution using a microplate washer (DYNATECH, ULTRA WASHI II), and then 1% albumin (Seikagaku Corporation, Albumin Fraction V, Bovine) solution 300
μl was added and the mixture was left at 4 ° C. overnight. The albumin solution was removed by suction and washed three times with the above buffer solution to prepare a measurement well.
Separately, an anti-human apo (a) monoclonal antibody F (ab) '2 that recognizes a site different from that of the solid antibody labeled with peroxidase was prepared. 50 μl of the measurement sample prepared by the following method was put in each well for measurement, and at the same time, 5% of peroxidase-labeled anti-apo (a) monoclonal antibody F (ab) '2 was added.
0 μl was added and left at 37 ° C. for 2 hours for antigen-antibody reaction.
The reaction solution in each well is removed by suction, washed 5 times with PBS (pH 7.2) containing 0.5% Tween 20, and then the substrate solution (OPD / H 2 O 2 ) 1
After adding 00 μl to each well, the mixture was allowed to stand for 15 minutes at room temperature in the dark, and 100 μl of 4N sulfuric acid was added to each well to stop the reaction. After stirring to make the inside of the well uniform, use an auto reader
(WAKO Molecular Devices, THRMO maxmicroplate reade
The absorbance at 490 nm was measured with r).
【００２３】実施例 ３(モノクローナル抗体を用いた競
合法ＥＬＩＳＡによる測定) 実施例２の方法と同様に調製された抗ヒトapo(a)モノク
ローナル抗体固相プレートに、測定試料を１ウェル当り
20μl添加し、同時に固相抗体と同一の抗ヒトapo(a)モ
ノクローナル抗体を200μlを加え、37℃で１時間放置し
抗原抗体反応させた。各ウェル内の反応液を吸引除去
し、0.5％のTween 20を含むＰＢＳ(ｐＨ7.2)で５回洗浄
後、前述のペルオキシダーゼ標識した抗apo(a)モノクロ
ーナル抗体を100μl添加後、37℃で１時間放置して抗原
抗体反応させた。以下の操作は実施例２に準じた。 Example 3 (Measurement by Competitive ELISA Using Monoclonal Antibody) A measurement sample was added per well to an anti-human apo (a) monoclonal antibody solid phase plate prepared in the same manner as in Example 2.
20 μl was added, and at the same time, 200 μl of the same anti-human apo (a) monoclonal antibody as the solid phase antibody was added, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour for antigen-antibody reaction. The reaction solution in each well was removed by suction, washed 5 times with PBS containing 0.5% Tween 20 (pH 7.2), and 100 μl of the above-mentioned peroxidase-labeled anti-apo (a) monoclonal antibody was added, followed by incubation at 37 ° C. It was left for 1 hour for antigen-antibody reaction. The following operation was based on Example 2.
【００２４】実施例 ４(ポリクローナル抗体を用いたＥ
ＬＩＳＡ法による測定) 抗体希釈液に抗ヒトapo(a)抗体(DAKO社)を10μg/mlにな
るように溶解し、これを96ウェルマイクロタイタープレ
ート(NUNC社製、IMMUNO MODULE MAXISORP F8)に、１ウ
ェル当り150μlずつ添加し４℃で一夜放置した。各ウェ
ルより上記抗体液を吸引除去し、マイクロプレート洗浄
機(DYNATECH社製、ULTRA WASHI II)を用いてＰＢＳ洗浄
液で３回洗浄した後、１％アルブミン(生化学工業社
製、AlbuminFraction V, Bovine)溶液を300μl添加し、
４℃で一夜放置した。アルブミン溶液を吸引除去し、前
記緩衝液で３回洗浄し測定用ウェルとした。別にペルオ
キシダーゼ標識した抗ヒトapo(a)抗体F(ab)'2を準備し
た。測定用ウェルに下記の方法で調製した測定試料を１
ウェル当り50μlを入れ、37℃で２時間放置し抗原抗体
反応させた。各ウェル中の反応液を吸引除去し、0.5％
Tween 20を含むＰＢＳ(ｐＨ7.2)で５回洗浄後、ペルオ
キシダーゼ標識した抗apo(a)抗体F(ab)'2 を入れ、37℃
で２時間放置し抗原抗体反応させた。各ウェルの反応液
を吸引除去し、0.5％Tween 20を含むＰＢＳ(ｐＨ7.2)で
５回洗浄後基質溶液(OPD/H2O2)100μlを各ウェルに添加
後15分間室温遮光下で放置した後、４Ｎ硫酸を各ウェル
に100μlずつ加え反応を停止させた。撹拌しウェル内を
均一にした後、オートリーダー(WAKO Molecular Device
s, THRMO maxmicroplate reader)で490nmの吸光度を測
定した。 Example 4 (E using a polyclonal antibody
(Measurement by LISA method) An anti-human apo (a) antibody (DAKO) was dissolved in an antibody diluent at 10 μg / ml, and this was dissolved in a 96-well microtiter plate (NUNC, IMMUNO MODULE MAXISORP F8). 150 μl was added per well and the plate was left at 4 ° C. overnight. The above antibody solution was removed by suction from each well, and the plate was washed 3 times with a PBS washing solution using a microplate washer (DYNATECH, ULTRA WASHI II), and then 1% albumin (Seikagaku Corporation, Albumin Fraction V, Bovine ) Add 300 μl of the solution,
It was left overnight at 4 ° C. The albumin solution was removed by suction, and the wells were washed 3 times with the above-mentioned buffer solution to obtain measurement wells. Separately, anti-human apo (a) antibody F (ab) '2 labeled with peroxidase was prepared. 1 in each measurement well, the measurement sample prepared by the following method
50 μl was added to each well and left at 37 ° C. for 2 hours for antigen-antibody reaction. Aspirate the reaction solution from each well and remove it by 0.5%.
After washing 5 times with PBS (pH 7.2) containing Tween 20, peroxidase-labeled anti-apo (a) antibody F (ab) '2 was added, and the temperature was 37 ° C.
It was left for 2 hours to react with the antigen-antibody. The reaction solution in each well was removed by suction, by 5 washes after a substrate solution (OPD / H 2 O 2) 100μl at room temperature under light shielding for 15 minutes after the addition to each well PBS (pH 7.2) containing 0.5% Tween 20 After standing, 100 μl of 4N sulfuric acid was added to each well to stop the reaction. After stirring to make the inside of the well uniform, use an auto reader (WAKO Molecular Device
s, THRMO max microplate reader) and the absorbance at 490 nm was measured.
【００２５】実施例 ５ (測定試料のLp(a)のフェノタイプの決定) 測定試料のLp(a)のフェノタイプの決定は電気泳動とイ
ムノブロット法で行なった。３％ポリアクリドアミドに
0.75％アガロースを含むスラブゲルを作製し各レーンに
２Ｍメルカプトエタノールで処理した血清を２μl添加
し、25Ｖで電気泳動後(ミニプロティアンII(BIO-RA
D))、ニトロセルロース膜 PVDF (MILLIPORE社)に４℃、
40Ｖで一晩トランスブロットし、その後、抗Lp(a)抗体
(DAKO社)を用いたイムノブロット法によりapo(a)バンド
を検出しそのフェノタイプを決定した。蛋白をトランス
ブロットした膜は３％スキムミルク(DIFCO 社)中でイン
キュベーションを行ないブロッキングを行なった。この
膜を10μg/mlの抗ヒトLp(a)抗体(ウサギ)に浸積し、37
℃１時間反応させた。反応後、未反応の抗体をTris/Sal
ine/0.05%Bridge(pH7.2)で洗浄し、その後HRP標識抗ウ
サギ抗体(DAKO社)５μg/mlの溶液に浸積し、37℃で１時
間反応させた。反応後、未反応の抗体を同様の緩衝液で
洗浄し、次にDAB(3,3'-Diaminobenzidine, tetrahydroc
hloride)を基質として発色を行なった。Lp(a)のフェノ
タイプの決定はUtermann等の方法に従い行なった(Uterm
ann, G. et al. Proc, Natl. Acad. Sci. USA 86,p.417
1-4174, 1989)。その分類はapoB-100を基準とし、それ
より早い移動度を示す分子量の小さいものをＦ、同じ移
動度のものをＢ、遅い移動度のものを順にＳ１、Ｓ２、
Ｓ３、Ｓ４とした。以下の検討で用いる血清のフェノタ
イプは上述の方法により決定した。 Example 5 (Determination of phenotype of Lp (a) of measurement sample) The phenotype of Lp (a) of the measurement sample was determined by electrophoresis and immunoblotting. To 3% polyacryamide
A slab gel containing 0.75% agarose was prepared, and 2 μl of serum treated with 2M mercaptoethanol was added to each lane, which was electrophoresed at 25 V (Miniprotian II (BIO-RA
D)), nitrocellulose membrane PVDF (MILLIPORE) at 4 ℃,
Transblot overnight at 40V, then anti-Lp (a) antibody
(DAKO) was used to detect the apo (a) band by immunoblotting, and its phenotype was determined. The membrane on which proteins were trans-blotted was incubated in 3% skim milk (DIFCO) for blocking. This membrane was immersed in 10 μg / ml anti-human Lp (a) antibody (rabbit) and
The reaction was performed at 1 ° C for 1 hour. After the reaction, unreacted antibody is removed by Tris / Sal
The cells were washed with ine / 0.05% Bridge (pH 7.2), then immersed in a solution of HRP-labeled anti-rabbit antibody (DAKO) at 5 μg / ml, and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After the reaction, unreacted antibody was washed with the same buffer, and then DAB (3,3'-Diaminobenzidine, tetrahydroc
hloride) was used as a substrate for color development. The phenotype of Lp (a) was determined according to the method of Utermann et al.
ann, G. et al. Proc, Natl. Acad. Sci. USA 86 , p.417
1-4174, 1989). The classification is based on apoB-100, F having a smaller molecular weight showing a higher mobility, F having the same mobility, B having the same mobility, S1, S2 having the lower mobility in this order.
These are S3 and S4. The serum phenotype used in the following studies was determined by the method described above.
【００２６】実施例 ６(標準物質の設定) 標準物質の設定は実施例５でフェノタイプを決定した血
清からLp(a)を純化し、その全体量(脂質、蛋白量)を測
定することにより決定した。Lp(a)の純化は以下の方法
により行なった。Lp(a)陽性血清(B Type) 50mlに等量の
100mＭ トリス、２mＭ EDTA、２mＭアジ化ナトリウム、
２mＭ PMSF(pH7.5)を添加して、塩化ナトリウムを加え
その比重を1.021 に調整後、超遠心(40,000rpm. 24 時
間 Beckman45 ROTOR)処理し、その浮上画分を除いた。
残りの画分に塩化ブロマイドを加え、その比重を1.21ｇ
/mlに調整後、ふたたび超遠心(40,000rpm. 48 時間 Bec
kman45 ROTOR)を行ないその浮上画分を得た。 Example 6 (Setting of standard substance) The standard substance was set by purifying Lp (a) from the serum whose phenotype was determined in Example 5 and measuring the total amount (lipid, protein amount) thereof. Were determined. Purification of Lp (a) was performed by the following method. Lp (a) positive serum (B Type)
100 mM Tris, 2 mM EDTA, 2 mM sodium azide,
After adding 2 mM PMSF (pH 7.5) and adding sodium chloride to adjust its specific gravity to 1.021, ultracentrifugation (40,000 rpm. 24 hours Beckman 45 ROTOR) was performed to remove the floating fraction.
Chloride bromide was added to the remaining fraction, and its specific gravity was 1.21 g.
After adjusting to / ml, ultracentrifuge again (40,000 rpm.
kman45 ROTOR) was performed and the surfacing fraction was obtained.
【００２７】得られた画分を50mＭトリス、１Ｍ塩化ナ
トリウム、１mＭ EDTA、１mＭアジ化ナトリウム、１mＭ
PMSF (pH 7.5)の緩衝液で希釈後別に調製した抗ヒトLp
(a)モノクローナル抗体結合カラムに供した。抗Lp(a)
モノクローナル抗体結合カラムは市販のCNBr活性化ゲル
(CNBr-活性化Sepharose 4B Pharmacia社)を用い、抗体
濃度５mg/ml gelで抗体をゲルに結合させた。 超遠心法
により調製した試料は、50mＭトリス、１mＭ EDTA、１m
Ｍアジ化ナトリウム、１mＭ PMSF、１Ｍ塩化ナトリウム
で平衡化した抗体結合カラムに通液し、同緩衝液で洗浄
後、１Ｍ Gly-HCl(pH2.3)で溶出を行なった。溶出画分
は直ちに１Ｍトリス(pH7.5)で中性化し、その後窒素条
件下生理食塩水に対して透析を行なった。The obtained fraction was mixed with 50 mM Tris, 1 M sodium chloride, 1 mM EDTA, 1 mM sodium azide, 1 mM.
Separately prepared anti-human Lp after dilution with PMSF (pH 7.5) buffer
(a) It was applied to a monoclonal antibody binding column. Anti-Lp (a)
Monoclonal antibody binding column is a commercially available CNBr activated gel
(CNBr-activated Sepharose 4B Pharmacia) was used to bind the antibody to the gel at an antibody concentration of 5 mg / ml gel. Samples prepared by ultracentrifugation are 50mM Tris, 1mM EDTA, 1m
The solution was passed through an antibody-binding column equilibrated with M sodium azide, 1 mM PMSF and 1 M sodium chloride, washed with the same buffer, and eluted with 1 M Gly-HCl (pH 2.3). The eluted fraction was immediately neutralized with 1M Tris (pH 7.5), and then dialyzed against physiological saline under nitrogen.
【００２８】以上の方法により精製されたLp(a)はSDS-P
AGEでその純度を検討したが、apoB-100、apo(a)に相当
するバンド以外は検出されなかった。この検体の蛋白量
はローリー法で測定を行なった。なお、脂質類は(リン
脂質、コレステロール類、中性脂質)は市販の測定キッ
トを用い測定を行なった。以上の方法によって標準化し
た標品を一次標準品とし、それらを基準に出発原料であ
る血清のLp(a)含有量を決定し、これを２次標準品とし
た。なお、対照のLp(a)標準品としてはバイオプール社
のレファレンスプラズマ(Lp(a) Reference Plasma Biop
oolTM バイオプール社)を用いた。なお、このレファレ
ンスプラズマのフェノタイプはＳ〜Ｂに対応するもので
あった。Lp (a) purified by the above method is SDS-P
The purity was examined by AGE, but no bands other than those corresponding to apoB-100 and apo (a) were detected. The protein amount of this sample was measured by the Lowry method. The lipids (phospholipids, cholesterols, neutral lipids) were measured using a commercially available measurement kit. The standard product standardized by the above method was used as a primary standard product, and the Lp (a) content of serum as a starting material was determined based on the standard product, which was used as a secondary standard product. As a control Lp (a) standard, reference plasma (Lp (a) Reference Plasma Biop
oolTM BioPool) was used. The phenotype of this reference plasma corresponds to S to B.
【００２９】実施例 ７(モノクローナル抗体を用いたＥ
ＬＩＳＡ法による本発明の評価) 先ず、フェノタイプの異なる３種類の検体(S1, S2, S3,
B)を対照として選んだバイオプール社のレファレンス
プラズマを用いて測定を行ない、その値を基準に各々の
希釈系を作製、反応の後、そのドーズレスポンスカーブ
を作成した。図３に示すように、S1, S2, S3, B の全て
が同一のドーズレスポンスカーブに対応した。以上の結
果は、S1〜B タイプまでの検体及びバイオプール社のレ
ファレンスが本発明のＥＬＩＳＡ系で同様に反応してい
ることを示すものである。また、本発明の測定系におい
て異なるフェノタイプを測定する際、検体と同じフェノ
タイプのスタンダードを用いる必要がないことを示して
いる。 Example 7 (E using a monoclonal antibody
Evaluation of the Present Invention by LISA Method) First, three types of specimens (S1, S2, S3,
Measurement was carried out using a reference plasma manufactured by BioPool Co., which was selected as B) as a control, and each diluted system was prepared based on the value, and after the reaction, its dose response curve was prepared. As shown in FIG. 3, S1, S2, S3, and B all corresponded to the same dose response curve. The above results show that the specimens of S1 to B types and the reference of Biopool Co. are similarly reacted in the ELISA system of the present invention. It also shows that it is not necessary to use the same phenotype standard as the sample when measuring different phenotypes in the measurement system of the present invention.
【００３０】実施例 ８(モノクローナル抗体を用いた競
合法ＥＬＩＳＡによる本発明の評価) フェノタイプの異なる血清を0.5％のTween 20を含むＰ
ＢＳ(ｐＨ7.2)で51倍に希釈したものを測定試料とし
た。実施例３の競合法によって測定された測定試料の値
は、実施例２の測定法によって得られた値と同等であ
り、競合法においてもLp(a)の各タイプに対する反応性
は一様であった。 Example 8 (Evaluation of the present invention by a competitive ELISA using a monoclonal antibody) Ps containing 0.5% Tween 20 in sera having different phenotypes.
A sample diluted 51 times with BS (pH 7.2) was used as a measurement sample. The value of the measurement sample measured by the competitive method of Example 3 is equivalent to the value obtained by the measuring method of Example 2, and even in the competitive method, the reactivity to each type of Lp (a) is uniform. there were.
【００３１】実施例 ９(ポリクローナル抗体を用いたＥ
ＬＩＳＡとの比較) 実施例５で純化したＢタイプのLp(a)２検体をポリクロ
ーナル抗体をベースとしたＥＬＩＳＡで標準物質をバイ
オプール社のレファレンスプラズマと実施例４で調製し
たＢType血清の両方を用い測定を行なった。結果を表１
に示した。純化した検体 １、検体 ２のＢタイプのLp
(a)を測定した結果、Ｓタイプを多く含むバイオプール
のレファレンスプラズマを標準物質として得られた結果
はどちらも同一タイプの血清を標準物質とした場合に比
べて高い値を示した。なお参考のために、同一系内で、
その測定系を本発明のモノクローナル抗体をベースとし
たＥＬＩＳＡ系で測定した値を下に示した。 Example 9 (E using a polyclonal antibody
(Comparison with LISA) The B-type Lp (a) 2 specimen purified in Example 5 was subjected to ELISA using a polyclonal antibody as the standard substance, and both the reference plasma of Biopool and the BType serum prepared in Example 4 were used. The measurement was carried out. The results are shown in Table 1.
It was shown to. B-type Lp of purified sample 1 and sample 2
As a result of measuring (a), the results obtained by using the reference plasma of the biopool containing a large amount of S type as the standard substance were both higher than those obtained by using the same type of serum as the standard substance. For reference, in the same system,
The values measured by an ELISA system based on the monoclonal antibody of the present invention are shown below.
【００３２】モノクローナル抗体をベースとした測定系
では、バイオプールレファレンスプラズマ、Ｂタイプ血
清のどちらを用いても同様の値が得られた。また、その
値は、ポリクローナル抗体でＢタイプの血清を標準物質
として測定した値と一致した。以上の結果は用いた標準
物質のフェノタイプに対してポリクローナル抗体をベー
スとしたＥＬＩＳＡでは一様に反応していない為に起こ
ったものである。図４は上述の結果を得る際に用いた標
準物質の検量線を示している。横軸はLp(a)濃度を対数
に目盛ったものであり、縦軸は得られた吸光度を対数で
目盛ったものである。図のように、モノクローナル抗体
をベースとしたＥＬＩＳＡではどの標準物質を用いた際
もその反応性が同等であり、同グラフより得られた回帰
線の傾きも同じであった。一方、ポリクローナル抗体を
ベースとたＥＬＩＳＡ系ではその回帰線の傾きは、用い
たスタンダードのフェノタイプで異なることが認められ
た。In the measurement system based on the monoclonal antibody, the same value was obtained using either biopool reference plasma or B type serum. In addition, the value was in agreement with the value measured with a polyclonal antibody using B type serum as a standard substance. The above results were caused because the polyclonal antibody-based ELISA did not uniformly react with the phenotype of the standard substance used. FIG. 4 shows a calibration curve of the standard substance used in obtaining the above results. The abscissa is a logarithmic scale of the Lp (a) concentration, and the ordinate is a logarithmic scale of the obtained absorbance. As shown in the figure, in the ELISA based on the monoclonal antibody, the reactivity was the same regardless of which standard substance was used, and the slope of the regression line obtained from the graph was also the same. On the other hand, in the ELISA system based on the polyclonal antibody, the slope of the regression line was found to differ depending on the phenotype of the standard used.
【００３３】[0033]
【表１】 [Table 1]
【図１】Ｌｐ(a)の構造を解説する図FIG. 1 is a diagram explaining the structure of Lp (a).
【図２】抗体の選定に関するラテックス凝集反応の結果
を示す図FIG. 2 is a diagram showing the results of a latex agglutination reaction regarding antibody selection.
【図３】本発明のＥＬＩＳＡ系でのLp(a)各フェノタイ
プ検体に対する反応性を示す図FIG. 3 is a diagram showing the reactivity of Lp (a) phenotype samples in the ELISA system of the present invention.
【図４】ポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ系と本
発明のＥＬＩＳＡ系での反応性の相違を示す図FIG. 4 is a diagram showing the difference in reactivity between the ELISA system using a polyclonal antibody and the ELISA system of the present invention.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｗ 8310−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 5 Identification code Internal reference number FI Technical display location G01N 33/53 W 8310-2J (C12P 21/08 C12R 1:91)
Claims (4)
し(クリングル)構造を認識せず各フェノタイプの共通部
位を認識し、各フェノタイプに一様に反応するモノクロ
ーナル抗体。1. A monoclonal antibody which recognizes a common site of each phenotype without recognizing a repeating (kringle) structure in a lipoprotein small A molecule and uniformly reacts with each phenotype.
託番号第13122号(FERM P-13122)及び受託番号第13123号
(FERM P-13123)として寄託されたハイブリドーマより調
製される請求項１記載のモノクローナル抗体。[Claim 2] Contract No. 13122 (FERM P-13122) and contract No. 13123 to the Institute for Microbial Technology (MIC) of the Agency of Industrial Science and Technology
The monoclonal antibody according to claim 1, which is prepared from the hybridoma deposited as (FERM P-13123).
プに一様に反応するモノクローナル抗体を用いることを
特徴とする免疫学的測定方法に基づく血中リポプロティ
ンスモールＡの測定方法。3. A method for measuring blood lipoprotein small A based on an immunological method, which comprises using a monoclonal antibody that uniformly reacts with each phenotype of lipoprotein small A.
託番号第13122号(FERM P-13122)及び受託番号第13123号
(FERM P-13123)として寄託されたハイブリドーマより調
製されるモノクローナル抗体を利用する請求項３記載の
血中リポプロティンスモールＡの測定方法。[Claim 4] Contract No. 13122 (FERM P-13122) and Contract No. 13123 to the Institute for Microbial Technology (MIC) of the Agency of Industrial Science and Technology
The method for measuring blood lipoprotein small A according to claim 3, wherein a monoclonal antibody prepared from the hybridoma deposited as (FERM P-13123) is used.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28676692A JPH06113880A (en) | 1992-09-30 | 1992-09-30 | Monoclonal antibody and method for measuring lipoprotein small a using the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28676692A JPH06113880A (en) | 1992-09-30 | 1992-09-30 | Monoclonal antibody and method for measuring lipoprotein small a using the same |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06113880A true JPH06113880A (en) | 1994-04-26 |
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ID=17708774
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| JP28676692A Pending JPH06113880A (en) | 1992-09-30 | 1992-09-30 | Monoclonal antibody and method for measuring lipoprotein small a using the same |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06113880A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5733549A (en) * | 1992-08-14 | 1998-03-31 | Shino-Test Corporation | Peptides including amino acid sequences selected from lipoprotein (a) and apolipoprotein (a), antibodies recognizing these amino acid sequences, and methods of determination using these antibodies |
-
1992
- 1992-09-30 JP JP28676692A patent/JPH06113880A/en active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5733549A (en) * | 1992-08-14 | 1998-03-31 | Shino-Test Corporation | Peptides including amino acid sequences selected from lipoprotein (a) and apolipoprotein (a), antibodies recognizing these amino acid sequences, and methods of determination using these antibodies |
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| Date | Code | Title | Description |
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| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20020813 |