JPH06113836A - Soluble nadph-cytochrome p-450 reductase - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To obtain a new gene capable of exhibiting functions of both enzymes of cytochrome P-450 and NADPH-cytochrome P-450 reductases using a single enzyme and useful for producing the enzyme. CONSTITUTION:A gene having a base sequence of the formula and coding soluble NADPH-cytochrome P-450 reductase. This gene is obtained by connecting a region necessary to exhibit activity capable of adding one-atom oxygen which rat liver cytochrome P-450 gene has to a region necessary to exhibit ability capable of feeding reducing force which rat liver NADPH-cytochrome P-450 reductase gene has.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、1 原子酸素添加活性お
よびそれに必要なＮＡＤＰＨからの還元力供給能力を同
一分子内に有する新規な酸化酵素、該酸化酵素をコード
する遺伝子、該遺伝子を含む酵母内発現プラスミドおよ
び該発現プラスミドにより形質転換された酵母菌株に関
する。更に詳しくは、チトクロムＰ−４５０（以下、Ｐ
−４５０と称する）の有する１原子酸素添加活性および
ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ−４５０還元酵素（以下、Ｆ
ｐｔと称する）の有するＮＡＤＰＨからの還元力供給能
を同一分子内に有する酸化酵素、該酸化酵素をコードす
るキメラ融合酵素遺伝子、該遺伝子を含む酵母内発現プ
ラスミドおよび該発現プラスミドにより形質転換された
酵母菌株並びに該形質転換酵母菌株を培養することを特
徴とする該酸化酵素の製造方法に関する。FIELD OF THE INVENTION The present invention includes a novel oxidase having a one-atom oxygen addition activity and the necessary ability to supply reducing power from NADPH in the same molecule, a gene encoding the oxidase, and the gene. The present invention relates to an expression plasmid in yeast and a yeast strain transformed with the expression plasmid. More specifically, cytochrome P-450 (hereinafter, P
-450) having one atom oxygenation activity and NADPH-cytochrome P-450 reductase (hereinafter, F)
PT), which has the ability to supply reducing power from NADPH in the same molecule, a chimeric fusion enzyme gene encoding the oxidase, an expression plasmid in yeast containing the gene, and an expression plasmid It relates to a yeast strain and a method for producing the oxidase, which comprises culturing the transformed yeast strain.

【０００２】[0002]

【従来の技術】Ｐ−４５０は、微生物から哺乳動物にい
たるまで、広く生物界に存在するヘム蛋白質であり、広
範囲の脂溶性化合物を基質として、１原子酸素添加反応
を触媒する。Ｐ−４５０の示すこうした広範囲な基質特
異性は、Ｐ−４５０の分子多様性に起因する。すなわ
ち、Ｐ−４５０には、多数の分子種が存在し、各々は基
質特異性の幅が広く、しかも重複しており、広範囲の脂
溶性化合物を基質とすることができる。しかしながら、
多数のＰ−４５０へ電子を供給する経路は共通であり、
肝ミクロソームでは主として、フラビンアデニンモノヌ
クレオチドとフラビンモノヌクレオチドを分子内に補酵
素として含有するＦｐｔがＮＡＤＰＨからの電子を基質
を結合したＰ−４５０に供給する。従って、Ｐ−４５０
は、基質と結合しＦｐｔと共役することによりはじめて
１原子酸素添加反応を発揮する。本発明者らは、すでに
ラットの肝に存在するＰ−４５０ｃおよびＦｐｔの遺伝
子を単離し、酵母を宿主として、これらの遺伝子を発現
させ、１原子酸素添加反応を示す酵素蛋白質を生産させ
ることに成功した（特開昭61-88878、特開昭61-56072、
特願昭60-146653 、特願昭60-2427720) 。酵母内で合成
されたＰ−４５０ｃは、酵母ミクロソームにおいて、酵
母Ｆｐｔと共役することにより、電子伝達系を構成しラ
ットＰ−４５０ｃ本来の１原子酸素添加活性を示した。
また、Ｐ−４５０ｃ発現酵母菌株は、アセトアニリドか
ら医薬品として有用なアセトアミノフェンを製造するこ
とができた（特願昭60-139128)。したがって、Ｐ−４５
０ｃ発現酵母菌株、あるいは酵母菌体より取得したＰ−
４５０ｃは、有用物質の酸化反応プロセルへ応用可能で
ある他に、産業廃水中の有害物質の酸化的除去などへの
応用が可能である。本発明者らは、既に取得したＰ−４
５０ｃ発現酵母菌株（特願昭61-56072) の1 原子酸素添
加活性を増強するために研究を進め、例えば多コピープ
ラスミドを利用したＰ−４５０ｃ高発現酵母菌株の作製
（特願昭60-139129 ）、Ｐ−４５０ｃとＦｐｔを同時に
酵母細胞内で発現させることを目的としたＰ−４５０ｃ
とＦｐｔの同時発現酵母菌株の作製（特願昭60-242772)
などを実施した。2. Description of the Related Art P-450 is a heme protein widely existing in the living world from microorganisms to mammals, and catalyzes a one-atom oxygen addition reaction using a wide range of fat-soluble compounds as substrates. The broad substrate specificity exhibited by P-450 is due to the molecular diversity of P-450. That is, P-450 has many molecular species, each of which has a wide range of substrate specificity and overlaps with each other, and a wide range of fat-soluble compounds can be used as substrates. However,
The path for supplying electrons to many P-450s is common,
In liver microsomes, Fpt containing flavin adenine mononucleotide and flavin mononucleotide as a coenzyme in the molecule mainly supplies electrons from NADPH to P-450 to which a substrate is bound. Therefore, P-450
Exhibits the one-atom oxygen addition reaction only after binding to the substrate and conjugating with Fpt. The present inventors isolated genes of P-450c and Fpt already existing in rat liver, and expressed these genes using yeast as a host to produce an enzyme protein showing a one-atom oxygenation reaction. Succeeded (JP-A-61-88878, JP-A-61-56072,
Japanese Patent Application 60-146653 and Japanese Patent Application 60-2427720). P-450c synthesized in yeast constituted an electron transfer system by being coupled to yeast Fpt in yeast microsomes, and exhibited the original one-atom oxygenation activity of rat P-450c.
Also, the yeast strain expressing P-450c was able to produce acetaminophen, which is useful as a drug, from acetanilide (Japanese Patent Application No. 60-139128). Therefore, P-45
0-expressing yeast strain or P- obtained from yeast
450c can be applied not only to the oxidation reaction process of useful substances, but also to the oxidative removal of harmful substances in industrial wastewater. The present inventors have already obtained P-4
Research has been carried out to enhance the one-atom oxygenation activity of the 50c-expressing yeast strain (Japanese Patent Application No. 61-56072), and for example, the production of a P-450c high-expressing yeast strain using a multicopy plasmid (Japanese Patent Application No. 60-139129). ), P-450c for the purpose of simultaneously expressing P-450c and Fpt in yeast cells
Of Yeast Strains Co-expressing Fpt and Fpt (Japanese Patent Application No. 60-242772)
And so on.

【０００３】[0003]

【発明が解決しようとする課題および課題を解決するた
めの手段】今回、本発明者らは、さらに研究を発展さ
せ、Ｐ−４５０とＦｐｔの両遺伝子を接続することによ
り単一の遺伝子とし、チトクロムＰ−４５０の有する１
原子酸素添加活性およびＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ−４
５０還元酵素の有するＮＡＤＰＨからの還元力供給能を
同一分子内に有する酸化酵素コードするキメラ融合酵素
遺伝子を構築し、これを酵母内発現ベクターに導入し、
発現プラスミドを構築した。DISCLOSURE OF THE INVENTION Problems to be Solved by the Invention and Means for Solving the Problems This time, the present inventors further developed the research into a single gene by connecting both genes of P-450 and Fpt, 1 of cytochrome P-450
Atomic oxygenation activity and NADPH-cytochrome P-4
50 constructing a chimeric fusion enzyme gene encoding an oxidase having the ability to supply reducing power from NADPH possessed by 50 reductase in the same molecule, and introducing this into an yeast expression vector,
An expression plasmid was constructed.

【０００４】該発現プラスミドを導入した酵母菌株は、
Ｐ−４５０とＦｐｔのキメラ融合酸素を産生し、１原子
酸素添加活性を示した。その酸化活性は、Ｐ−４５０単
独発現酵母菌株より高く、酸化反応プロセスなどへの有
用性が高いことが判明した。また、取得したキメラ融合
酵素は、単一分子で電子伝達と基質の酸化の両機能を有
しており、すぐれた性質を有する従来にない新たな酵素
である。本発明のキメラ融合遺伝子は、Ｐ−４５０遺伝
子の一原子添加活性に必要な領域にＮＡＤＰＨ−チトク
ロムＰ−４５０還元酵素の機能発揮に必要な領域を接続
することにより構築することができる。Ｐ−４５０遺伝
子およびＦｐｔ遺伝子としては、ラット肝Ｐ−４５０お
よびＦｐｔ遺伝子がその代表例として挙げられるが、他
の生物起源のＰ−４５０、Ｆｐｔ遺伝子を用いることも
可能である。Ｐ−４５０遺伝子およびＦｐｔ遺伝子は、
本発明の技術分野において用いられる常法により製造す
ることができる。例えば、ラット肝Ｐ−４５０遺伝子に
ついて言えば、これを含む公知のプラスミドｐＡＭＣ１
（例えば、特開昭61-88878にこのプラスミドの製造方法
が開示されている。) から常法によりこの遺伝子を取り
出すことができる。The yeast strain introduced with the expression plasmid is
A chimeric fusion oxygen of P-450 and Fpt was produced and showed one atom oxygenation activity. It was found that its oxidative activity was higher than that of the yeast strain expressing P-450 alone, and that it was highly useful for the oxidation reaction process and the like. In addition, the obtained chimeric fusion enzyme has both electron transfer and substrate oxidation functions in a single molecule, and is a novel enzyme that has never been seen and has excellent properties. The chimeric fusion gene of the present invention can be constructed by connecting the region required for the function of NADPH-cytochrome P-450 reductase to the region required for the activity of adding one atom of the P-450 gene. Examples of the P-450 gene and Fpt gene include rat liver P-450 and Fpt genes, but P-450 and Fpt genes of other biological origins can also be used. The P-450 gene and Fpt gene are
It can be produced by a conventional method used in the technical field of the present invention. For example, in the case of the rat liver P-450 gene, a known plasmid pAMC1 containing this gene is used.
(For example, a method for producing this plasmid is disclosed in JP-A-61-88878.) This gene can be extracted by a conventional method.

【０００５】また、Ｆｐｔ遺伝子についても、同様であ
りこれを含むプラスミドｐＴＲＦ２（特願昭60-242772)
から常法により取り出すことが可能である。本発明のキ
メラ融合酵素を発現する発現プラスミドは、上述のとお
りに構築したキメラ遺伝子を適当な発現プラスミドに常
法により挿入することにより構築することができる。発
現プラスミドとしては、公知の発現ベクターを用いるこ
とができる。例えば、酵母アルコール脱水素酵素（ＡＤ
Ｈ１）プロモ−タ−、ＰＧＫプロモ−タ−、Ｇ３ＰＤＨ
プロモ−タ−、ＧＡＬ１０プロモ−タ−等を有する発現
ベクター、例えば、酵母ＡＤＨ１遺伝子のプロモ−タ−
および同ターミネーターを保持する酵母発現ベクターｐ
ＡＡＨ５（Washington Research Fundation から入手可
能、Method in Enzymology,101 part C p.192-201,Amme
rer らの方法により製造できる。なお、酵母ＡＤＨ１遺
伝子のプロモ−タ−は、Washington Research Fundatio
n の米国特許出願第299,733 に含まれており、米国にお
いて、工業的、商業的目的で使用する場合は、権利者か
らの権利許諾を必要とする。) やｐＪＢ２１９等を挙げ
ることができ、宿主内で効率よく機能するプロモ−タ
−、ターミネーターを有するものであれば特に限定され
るものではない。また、発現プラスミドの構造も限定さ
れるものではなく、酵母内で安定に保持されるものであ
ればよい。本発明のキメラ酵素の発現には、酵母、例え
ば、サッカロマイセス・セレビシエＡＨ２２株、サッカ
ロマイセス・セレビシエＳＨＹ３株やサッカロマイセス
・セレビシエＮＡ８７−１１Ａ株等が宿主として好都合
に使用できる。これらの宿主の上記の本発明のキメラ融
合遺伝子を含む発現プラスミドにより形質転換は、アル
カリ金属（ＬｉＣｌ）を用いる方法、プロトプラスト法
などの公知の方法により行うことができる。The same applies to the Fpt gene, and the plasmid pTRF2 containing the same (Japanese Patent Application No. 60-242772).
It is possible to take it out by a conventional method from. The expression plasmid expressing the chimeric fusion enzyme of the present invention can be constructed by inserting the chimeric gene constructed as described above into an appropriate expression plasmid by a conventional method. As the expression plasmid, a known expression vector can be used. For example, yeast alcohol dehydrogenase (AD
H1) Promoter, PGK Promoter, G3PDH
An expression vector having a promoter, GAL10 promoter, etc., for example, a promoter for the yeast ADH1 gene
And a yeast expression vector p carrying the terminator
AAH5 (available from Washington Research Fundation, Method in Enzymology, 101 part C p.192-201, Amme
It can be produced by the method of rer et al. The promoter of the yeast ADH1 gene is the Washington Research Fundatio.
It is included in US Patent Application No. 299,733 of n and requires a license from the right holder for use in the United States for industrial and commercial purposes. ), PJB219, etc., and is not particularly limited as long as it has a promoter and a terminator that function efficiently in the host. Further, the structure of the expression plasmid is not limited, as long as it can be stably retained in yeast. For the expression of the chimeric enzyme of the present invention, yeast such as Saccharomyces cerevisiae AH22 strain, Saccharomyces cerevisiae SHY3 strain and Saccharomyces cerevisiae NA87-11A strain can be conveniently used as hosts. Transformation of these hosts with the expression plasmid containing the above-mentioned chimeric fusion gene of the present invention can be performed by a known method such as a method using alkali metal (LiCl) or a protoplast method.

【０００６】このようにして得られた形質転換微生物を
培養することにより本発明のキメラ融合酵素を製造する
ことができる。本発明により得られる形質転換微生物の
培養な、通常の培養方法により行うことができる。この
ようにして得られたキメラ酵素は培養菌体から本発明の
分野において通常に用いられる常法により抽出精製でき
る。例えば、菌体をザイモリアーゼ等で処理し、スフェ
ロプラスト化した後、これを超音波処理、フレンチプレ
ス、ガラスビーズを用いる機械的方法で破砕しミクロソ
ーム画分を調製する。これから本発明の酵素のＰ−４５
０部分の特性を使用したＤＥＡＥ−セルロースカラムク
ロマトグラフィーやＦｐｔ部分の特性を使用した２’、
５’−ＡＤＰセファロース４Ｂカラムクロマトグラフィ
ーを用い精製することができる。The chimeric fusion enzyme of the present invention can be produced by culturing the transformed microorganism thus obtained. It can be carried out by a usual culturing method such as culturing the transformed microorganism obtained by the present invention. The chimeric enzyme thus obtained can be extracted and purified from the cultured cells by a conventional method commonly used in the field of the present invention. For example, cells are treated with zymolyase or the like to form spheroplasts, which are then sonicated, french press, and disrupted by a mechanical method using glass beads to prepare a microsome fraction. From now on, P-45 of the enzyme of the present invention
DEAE-cellulose column chromatography using the characteristics of the 0 part and 2'using the characteristics of the Fpt part,
It can be purified using 5'-ADP Sepharose 4B column chromatography.

【０００７】[0007]

【実施例】以下に実施例に基づき、本発明を詳細に説明
するが、本発明は、実施例に限定されるものではなく、
通常、本発明分野で行われている程度の変更を含むもの
である。 実施例１ プラスミドｐＡＭＣ１９の構築特願昭６１−
１８７７１３を参照） ステップ１ プラスミドｐＢＭＸ２の構築 Ｐ−４５０ｃ発現プラスミドｐＡＭＣ１（特開昭61-888
78、特開昭61-56072に記載) 約10μg を50μl の制限酵
素緩衝液M(10mM トリス- 塩酸、pH7.5/10mMMgCl₂/50mM
NaCl/1mM ジチオスレイトール) 中で、20単位の制限酵
素HindIII(宝酒造より購入) の添加により、37度で2 時
間切断反応を行った。反応混液を、0.8%の低融点アガロ
ースゲル電気泳動に供し、Ｐ−４５０ｃのコーディング
領域に相当する約1.8Kb のＤＮＡ断片を含むゲルを切り
出し、６５度で５分間加熱することによりゲルを融解し
た。融解したゲルに２倍容のＴＥ緩衝液（１０mMトリス
- 塩酸、pH8.0/0.5mM EDTA) を加え、TE緩衝液で飽和し
たフェノールを等量添加し、攪拌した。遠心分離後、水
層を分取し、2 倍容の冷エタノールを加え、エタノール
沈澱を行い、DNA 断片を回収した。この1.8Kb のHindII
I 断片約3 μg を制限酵素緩衝液M に溶解し、10単位の
制限酵素AvaII を加え、37度で1 時間インキュベートし
た。反応混液を低融点アガロースゲル電気泳動に供し、
同様の方法で約1.2Kb のAvaII 断片を回収した。このAv
aII 断片に、あらかじめ5'- 末端をリン酸化し、アニー
リングを行った合成ＤＮＡリンカー：The present invention will be described in detail below based on examples, but the present invention is not limited to the examples.
It will typically include the extent of modification that is practiced in the art. Example 1 Construction of plasmid pAMC19 Japanese Patent Application No. 61-
187713) Step 1 Construction of plasmid pBMX2 P-450c expression plasmid pAMC1 (JP-A-61-888)
78, described in JP-A-61-56072) about 10μg to 50μl of restriction enzyme buffer M (10 mM Tris - HCl, pH 7.5 / 10 mM MgCl _2/50 mM
The cleavage reaction was carried out at 37 ° C for 2 hours by adding 20 units of restriction enzyme HindIII (purchased from Takara Shuzo) in NaCl / 1 mM dithiothreitol). The reaction mixture was subjected to 0.8% low melting point agarose gel electrophoresis to cut out a gel containing a DNA fragment of about 1.8 Kb corresponding to the coding region of P-450c, and the gel was melted by heating at 65 ° C for 5 minutes. . Add 2 volumes of TE buffer (10 mM Tris) to the melted gel.
-Hydrochloric acid, pH 8.0 / 0.5 mM EDTA) was added, and an equal amount of phenol saturated with TE buffer was added and stirred. After centrifugation, the aqueous layer was separated, 2 volumes of cold ethanol was added, and ethanol precipitation was performed to recover the DNA fragment. This 1.8Kb HindII
About 3 μg of I fragment was dissolved in restriction enzyme buffer M, 10 units of restriction enzyme AvaII was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. The reaction mixture is subjected to low melting point agarose gel electrophoresis,
An AvaII fragment of about 1.2 Kb was recovered by the same method. This Av
Synthetic DNA linker prepared by previously phosphorylating the 5'-end of the aII fragment and annealing:

【化４】 配列番号２ （両端に、それぞれAvaII とHindIII の認識部位をも
ち、XhoI部位を有する。アプライド・バイオシステムス
社製380A型ＤＮＡシンセサイザーを用いて合成した）約
U0.5μg を加えて、20μl のDNA リガーゼ緩衝液（67mM
トリス- 塩酸、pH.7. 6/6.7mM MgCl₂/10mMジチオスレイ
トール/0.5mM ATP) 中で、300 単位のT4ＤＮＡリガーゼ
( 宝酒造より購入) を加えて、15度で終夜インキュベー
トした。ついで、StuI( 宝酒造より購入) とHindIII で
同時に切断し、低融点アガロースゲル電気泳動に供し、
約450bp のStuI-HindIII断片を回収した。一方、プラス
ミドｐＡＭＣ１から調製した約1.8Kb のHindIII 断片約
2 μg を約１０単位の制限酵素StuIで切断し、上述と同
様の方法で、約1.2Kb のＤＮＡ断片を回収した。こうし
て得られた約1.2Kb のHindIII-StuI断片と約450bp のSt
uI-HindIII断片をプラスミドpBR322のHindIII 部位にク
ローニングした。すなわち、約1.2Kb のHindIII-StuI断
片約100ng,およびHindIII で切断し、アルカリ性ホスフ
ァアターゼ処理を施したｐＢＲ３２２約１μｇを20μl
のＤＮＡリガーゼ緩衝液中で、３００単位のT4ＤＮＡリ
ガーゼを添加して、１５度で終夜インキュベートした。
反応混液を用いて、大腸菌ＤＨ１株（ATCC33849)を形質
転換し、アンピシリン耐性のコロニーを選択した。出現
したコロニーから、バーンボイムードリ(Birnboim-Dol
y) の方法により、プラスミドＤＮＡ構造を確認した。
このようにして得られたプラスミドをｐＢＭＸ２と命名
した。 ステップ２ プラスミドｐＫＢ２の構築 本発明者らの発明に係る特許出願（特願昭60-146653)に
記載したいようにラット肝Ｆｐｔは、プロテアーゼによ
りミクロソーム膜から遊離し、可溶性蛋白質となる。こ
のプロテアーゼにより切断をうける部位のアミノ酸配列
とそれに対応する塩基配列は:## STR00004 ## SEQ ID NO: 2 (having AvaII and HindIII recognition sites on both ends and an XhoI site, respectively. Synthesized using Applied Biosystems 380A type DNA synthesizer)
Add 0.5 μg U and 20 μl DNA ligase buffer (67 mM
Tris-HCl, pH 7.6 / 6.7mM MgCl ₂ / 10mM dithiothreitol / 0.5mM ATP) in 300 units of T4 DNA ligase
(Purchased from Takara Shuzo) was added, and the mixture was incubated at 15 ° C overnight. Then, cut with StuI (purchased from Takara Shuzo) and HindIII at the same time, and subject to low melting point agarose gel electrophoresis.
The StuI-HindIII fragment of approximately 450 bp was recovered. On the other hand, about 1.8 Kb HindIII fragment prepared from plasmid pAMC1
2 μg was digested with about 10 units of restriction enzyme StuI, and about 1.2 Kb DNA fragment was recovered by the same method as described above. The thus obtained HindIII-StuI fragment of about 1.2 Kb and St of about 450 bp
The uI-HindIII fragment was cloned into the HindIII site of plasmid pBR322. In other words, about 100 ng of a HindIII-StuI fragment of about 1.2 Kb and about 1 μg of pBR322 digested with HindIII and treated with alkaline phosphatase were added to 20 μl.
300 units of T4 DNA ligase were added in the DNA ligase buffer of the above and incubated at 15 degrees overnight.
Escherichia coli DH1 strain (ATCC33849) was transformed with the reaction mixture, and ampicillin-resistant colonies were selected. From the emerged colony, Birnboim-Dol
The plasmid DNA structure was confirmed by the method of y).
The plasmid thus obtained was named pBMX2. Step 2 Construction of plasmid pKB2 As described in the patent application (Japanese Patent Application No. 60-146653) of the present inventors, rat liver Fpt is released from the microsomal membrane by a protease and becomes a soluble protein. The amino acid sequence of the site that is cleaved by this protease and the corresponding nucleotide sequence are:

【化５】 配列番号３ であり、Lys 残基をコードするコドンＡＡＧをＡＧＧに
変えることにより、⁵⁶Lys 残基がArg 残基に変換すると
同時に、BamHI 認識部位(-GGATCC-)が新たに生じる。従
って、このBmaHI 部位を利用することにより、可溶性Ｆ
ｐｔ蛋白質をコードする遺伝子を容易に単離することが
できる。Ｆｐｔ発現プラスミドpTFR2(特願昭60-242772)
約5 μg を制限酵素HindIII で切断し、Ｆｐｔのコーデ
ィング領域に相当する約2.3Kb のＤＮＡ断片を低融点ア
ガロースゲルから回収した。得られたＤＮＡ断片約１μ
g を、あらかじめHindIII で切断したM13 ファージベク
ターmP8 RF DNA約100ng とともに、20μl のＤＮＡリガ
ーゼ緩衝液中で、３００単位のT4ＤＮＡリガーゼに添加
し、150 度で終夜インキュベートした。反応混液を用い
て、大腸菌JM103 株を形質転換した。2mMIPTG(isopropy
l-b-D-thiogalactopyranoside) および0.2% X-gal(5-br
omo-4-chloro-3-indoyl-b-D-gal) 存在下溶性で透明に
なるプラークを選択し、このプラークからファ−ジSS D
NA およびFR DNAを調製した。FR DNAをHindIII で切断
し、DNA 構造を確認したのち、ssDNA 約2 μg を合成DN
A プライマーEmbedded image is SEQ ID NO: 3, by changing the codon AAG encoding Lys residues AGG, at the same time ⁵⁶ Lys residues are converted to Arg residues, BamHI recognition site (-GGATCC-) occurs anew . Therefore, by utilizing this BmaHI site, soluble F
The gene encoding the pt protein can be easily isolated. Fpt expression plasmid pTFR2 (Japanese Patent Application No. 60-242772)
About 5 μg was cleaved with a restriction enzyme HindIII, and a DNA fragment of about 2.3 Kb corresponding to the coding region of Fpt was recovered from a low melting point agarose gel. About 1μ of the obtained DNA fragment
g was added to 300 units of T4 DNA ligase in 20 μl of DNA ligase buffer with about 100 ng of M13 phage vector mP8 RF DNA which had been previously cleaved with HindIII and incubated at 150 ° C. overnight. The reaction mixture was used to transform Escherichia coli JM103 strain. 2mMIPTG (isopropy
lbD-thiogalactopyranoside) and 0.2% X-gal (5-br
omo-4-chloro-3-indoyl-bD-gal) Select a plaque that becomes soluble and transparent in the presence of this, and from this plaque, the phage SSD
NA and FR DNA were prepared. After cutting the FR DNA with HindIII and confirming the DNA structure, about 2 μg of ssDNA was synthesized.
A primer

【化６】 配列番号４ （アプライド・システム社製３８０Ａ型ＤＮＡ合成機で
合成）約１００ｎｇとともに、６５度で１時間加熱し徐
冷することにより、両者をアニールさせた。この混液
に、0.2Mトリス- 塩酸、pH7.5/0.1M MgCl₂/0.1M ジチオ
スレイトール1 μl,10mM dATP,dADT,dGTP 各1 μl,0.1m
M dCTP 0.5μl,[³²P]dcTP(410Ci/mmol, アマーシャムよ
り購入)1.5μl,水2 μl,T4DNA リガーゼ300 単位、DNA
ポリメラーゼI(クレノー酵素)5単位を添加し、室温で1
時間インキュベートした。ついで、10mM dCTP 1 μl を
添加し、室温で1 時間インキュベートした。反応後、水
30μlを添加し、全容を50μl としたのち、1.6M NaCl/1
3% ポリエチレングリコール50μl を加え、水中に15分
間放置した。遠心分離により回収した沈澱を、0.8MNaCl
/6.5% ポリエチレングリコール100 μl で洗浄したの
ち、180 μl のTE緩衝液に溶解した。2N NaOH 20μl を
添加し、室温で5 分間放置したのち、5 、10、17.5、20
% シュクロースを含む0.2N NaOH/1M NaCl/2mM EDTA各0.
9ml からなる不連続密度勾配上に重層し、ソーバル社製
AH-650ローターを用いて、37.000rpm 、2 時間、4 度で
遠心分離した。遠心後、0.2ml ずつの画分に分画し、各
画分の放射能[³²P] をモニターすることにより、チュー
ブ底部に分画されるds DNa画分を集めた。これを中和し
たのち、大腸菌JM103 株を再度形質転換した。出現した
プラークを培養し、RF DNAを調製し、種々の制限酵素で
切断することによりDNA 構造を確認し、⁵⁶Lys 残基をコ
ードするコドンAAG がAGG に変換され、BamHI 認識部位
が生じたDNA を含むプラスミドをpKB2と命名した。 ステップ３ プラスミドｐＢＸＰ３０の構築 ステップ２で得られたプラスミドｐＫＢ２約５μｇを２
０μl の制限酵素緩衝液M 中で、各10単位の制限酵素Hi
ndIII とBamHI を添加して、37度で2 時間インキュベー
トした。低融点アガロースゲル電気泳動に供し、可溶性
Ｆｐｔをコードする約2.1Kb のBamHI-HindIII 断片を回
収した。このDNA 断片約1 μg に対して、合成リンカーEmbedded image About 100 ng of SEQ ID NO: 4 (synthesized by Applied System 380A type DNA synthesizer) were annealed by heating at 65 ° C. for 1 hour and gradually cooling. To this mixture, 0.2M Tris-HCl, pH 7.5 / 0.1M MgCl ₂ /0.1M dithiothreitol 1 μl, 10 mM dATP, dADT, dGTP 1 μl each, 0.1 m
M dCTP 0.5 μl, [ ³² P] dcTP (410Ci / mmol, purchased from Amersham) 1.5 μl, water 2 μl, T4 DNA ligase 300 units, DNA
Add 5 units of Polymerase I (Klenow enzyme) and add 1 unit at room temperature.
Incubated for hours. Then, 1 μl of 10 mM dCTP was added, and the mixture was incubated at room temperature for 1 hour. After the reaction, water
After adding 30 μl to make the total volume 50 μl, add 1.6M NaCl / 1.
50 μl of 3% polyethylene glycol was added and left in water for 15 minutes. The precipitate collected by centrifugation was added to 0.8M NaCl
After washing with 100 μl of 6.5% polyethylene glycol, it was dissolved in 180 μl of TE buffer. After adding 20 μl of 2N NaOH and allowing it to stand at room temperature for 5 minutes, 5, 10, 17.5, 20
0.2N NaOH / 1M NaCl / 2mM EDTA each containing% sucrose 0.
Layered on a discontinuous density gradient consisting of 9 ml and manufactured by Soval
Centrifugation was carried out at 37.000 rpm for 2 hours at 4 degrees using an AH-650 rotor. After centrifugation, 0.2 ml fractions were fractionated, and the radioactivity [ ³² P] of each fraction was monitored to collect the ds DNa fraction fractionated at the bottom of the tube. After neutralizing this, Escherichia coli JM103 strain was transformed again. The plaques that appeared were cultivated, RF DNA was prepared, and the DNA structure was confirmed by digestion with various restriction enzymes.The codon AAG encoding the ⁵⁶ Lys residue was converted to AGG, resulting in the BamHI recognition site. The plasmid containing pKB2 was named pKB2. Step 3 Construction of plasmid pBXP30 Approximately 5 μg of the plasmid pKB2 obtained in Step 2 was
10 units of each restriction enzyme Hi in 0 μl of restriction enzyme buffer M
ndIII and BamHI were added and incubated at 37 degrees for 2 hours. It was subjected to low-melting point agarose gel electrophoresis and an about 2.1 Kb BamHI-HindIII fragment encoding soluble Fpt was recovered. About 1 μg of this DNA fragment

【化７】 配列番号５ （両端にHindIII 、BamHI 認識部位をもち、XhoI認識部
位を有する) 約100ng を添加し、DNA リガーゼ緩衝液中
でT4DNA リガーゼとともに、15度で終夜インキュベート
した。これを制限酵素HindIII で切断したのち、pBR322
のHindIII 部位へサブクローニングした。目的とする下
記の構造を有するプラスミドをpBXP30とした。プラスミ
ドpBXP30は、制限酵素HindIII で切断することにより、
容易に可溶性Ｆｐｔのコーディング領域を取り出せる構
造をとっている。また、可溶性Ｆｐｔの最初のアミノ酸
残基Ilenの前に翻訳開始コドンATG を付加しており、適
当なプロモ−タ−の下流に接続することにより、可溶性
Ｆｐｔを産生させることができる。実際に、pBXP30から
切り出したHindIII 断片を、酵母発現ベクターpAHH5 の
HindIII 部位に挿入することにより、可溶性Ｆｐｔ発現
プラスミドpAXP2 を構築した。この発現プラスミドpAXP
2DE 形質転換した酵母AH22(pAXP2) 株は、可溶性Ｆｐｔ
を大量に生産した。 ステップ4 プラスミドpAMP19の構築 ステップ1 で構築したプラスミドpBMX2 約2 μg をそれ
ぞれステップ3 で構築したプラスミドpBXP30約 2μg を
それぞれ20μl の制限酵素緩衝液M 中で、10単位制限酵
素HindIII を添加して、37度で1 時間インキュベートし
た。ついで、緩衝液中のNaCl濃度を終濃度100mM になる
ように、NaClを添加したのち、10単位の制限酵素XhoIを
添加して、30度でさらに1 時間インキュベートした。反
応混液を低融点アガロースゲル電気泳動に供し、Ｐ−４
５０をコードするHindIII-XhoI断片およびＦｐｔをコー
ドするXhoI-HindIII断片を、それぞれ回収した。酵母発
現ベクターpAAH5 約100ng を制限酵素HindIII で切断
し、アルカリホスファターゼ処理を施したのち、上記DN
A 断片それぞれ200ng と混合し、DNA リガーゼ反応を行
った。反応混液を用いて、大腸菌DH1 株を形質転換し、
アンピシリン耐性のコロニーを選抜した。出現したコロ
ニーからプラスミドDNA を調製し、制限酵素HindIII,Xh
oI,NcsI などで切断することにより、DNA 構造を確認し
た。 実施例2 プラスミドpALP1,pALP17,pALP25,pALP4 の構築
（特願昭６１−１８７７１３参照） 実施例1 で構築したプラスミドpAMP19約2 μg を制限酵
素HindIII で切断し、Ｐ−４５０とＦｐｔのキメラ融合
酵素をコードするDNA 断片( 約3.5Kb)を回収したのち、
pBR322のHindIII 部位へサブクローニングし、このプラ
スミドをpBMP1 とした。約1 μg のpBMP1 を制限酵素Xh
o1で切断したのち、XhoI部位に、以下に示す合成DNA ス
ペーサーを挿入するために、あらかじめリン酸化し、Embedded image About 100 ng of SEQ ID NO: 5 (having HindIII and BamHI recognition sites at both ends and XhoI recognition sites) was added, and the mixture was incubated with T4 DNA ligase in a DNA ligase buffer at 15 ° C. overnight. After cutting this with the restriction enzyme HindIII, pBR322
Was subcloned into the HindIII site. The desired plasmid having the following structure was designated as pBXP30. The plasmid pBXP30 was cleaved with the restriction enzyme HindIII
It has a structure that allows easy extraction of the coding region of soluble Fpt. In addition, a translation initiation codon ATG is added before the first amino acid residue Ilen of soluble Fpt, and soluble Fpt can be produced by connecting it to the downstream of an appropriate promoter. In fact, the HindIII fragment excised from pBXP30 was used to transform the yeast expression vector pAHH5.
The soluble Fpt expression plasmid pAXP2 was constructed by inserting it into the HindIII site. This expression plasmid pAXP
The 2DE-transformed yeast AH22 (pAXP2) strain contained soluble Fpt
Produced in large quantities. Step 4 Construction of plasmid pAMP19 About 2 μg of the plasmid pBMX2 constructed in step 1 and about 2 μg of the plasmid pBXP30 constructed in step 3 were added to 20 μl of restriction enzyme buffer M, and 10 units of restriction enzyme HindIII was added to the plasmid pBMX2. Incubate for 1 hour. Then, NaCl was added so that the final concentration of NaCl in the buffer was 100 mM, 10 units of restriction enzyme XhoI was added, and the mixture was further incubated at 30 ° C. for 1 hour. The reaction mixture was subjected to low melting point agarose gel electrophoresis, and P-4
The HindIII-XhoI fragment encoding 50 and the XhoI-HindIII fragment encoding Fpt were each recovered. About 100 ng of yeast expression vector pAAH5 was cleaved with restriction enzyme HindIII and treated with alkaline phosphatase.
Each A fragment was mixed with 200 ng and subjected to DNA ligase reaction. E. coli DH1 strain was transformed with the reaction mixture,
Ampicillin resistant colonies were selected. Plasmid DNA was prepared from the emerged colonies and the restriction enzymes HindIII and Xh
The DNA structure was confirmed by cutting with oI, NcsI, etc. Example 2 Construction of plasmids pALP1, pALP17, pALP25, pALP4 (see Japanese Patent Application No. 61-187713) About 2 μg of the plasmid pAMP19 constructed in Example 1 was cleaved with a restriction enzyme HindIII, and a chimeric fusion enzyme of P-450 and Fpt. After recovering the DNA fragment (about 3.5 Kb) encoding
It was subcloned into the HindIII site of pBR322, and this plasmid was designated as pBMP1. Approximately 1 μg of pBMP1 with restriction enzyme Xh
After cleaving at o1, phosphorylate in advance to insert the synthetic DNA spacer shown below at the XhoI site,

【化８】 配列番号６ アニーリングを行った合成DNA スペーサー約50〜100ng
を添加し、T4DNA リガーゼ反応を行った。反応混液を用
いて、大腸菌DH1 株を形質転換し、得られたコロニーか
らプラスミドDNA を調製した。合成スペーサーは、制限
酵素PvuI認識部位を有するので、PvuIで切断っせるクロ
ーンを選抜し、図1 並びに図3 、4 、5 及び6 に示した
ように上述の合成スペーサーを上記の合成リンカーのXh
oIサイトに上記と同方向にそれぞれ1 単位および3 単位
挿入したキメラ融合蛋白遺伝子を含むプラスミドをそれ
ぞれ、pBLP1,pBLP17とした。また、上述の合成スペーサ
ーを上記の合成リンカーのXhoIサイトに上記と逆方向に
それぞれ1 単位および3 単位挿入したキメラ融合蛋白遺
伝子を含むプラスミドをそれぞれpBLP25,pBLP4とした。
pBLP1,pBLP17,pBLP25,pBLP4のHindIII 断片を、実施例1
ステップ4 の場合と同様にして、発現ベクターpAAH5
のHindIII 部位に挿入することにより、pALP1,pALP17,p
ALP25,pALP4 を得た。 実施例3:構築したプラスミドにより酵母の形質転換 サッカロマイセス・セレビシエAH22株(ATCC38626) を、
5ml のYPD 培地(1% 酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グ
ルコース) 中で、30度で18時間培養したのち、1ml の酵
母培養液を遠心分離し、集菌した。得られた菌体を0.2M
LiCl 溶液１mlで洗浄したのち、1M LiCl 溶液20μl に
懸濁した。これに、70% ポリエチレングリコール4000溶
液30μl, プラスミドpAMC19,pALP1,pALP17,pALP25ある
いはpALP4 溶液10μl(約1 μg 相当）を添加して、十分
に混合したもち、30度で1 時間インキュベートした。つ
いで、140 μl の水を加え、よく、攪拌したのち、この
溶液をSD合成培地プレート(2% グルコース、0.67% 酵母
窒素源アミノ酸不含、20μg/mlヒスチジン、2%寒天) 上
にまき、30度で3 日間インキュベートすることにより、
プラスミドpAMP19,pALP1,pALP17,pALP25およびpALP4 を
保有する形質転換体AH22(pAMP19),AH22(pALP1),AH22(pA
LP17),AH22(pALP25)およびAH22(pALP4) をそれぞれ得
た。 実施例4:Ｐ−４５０とＦｐｔのキメラ融合質の発現量の
定量 既に取得したＰ−４５０ｃ発現酵母AH22(pAMC1) 株( 特
開昭61-56072) および実施例3 で得たAH22(pAMP19)株,A
H22(pALP1)株,AH22(pALP17) 株,AH22(pALP25)株 およ
びAH22(pALP4) 株を、SD合成培地(2% グルコース、0.67
% 酵母窒素源アミノ酸不含、20μg/mlヒスチジン) でそ
れぞれ約2 ×10⁷ 細胞/ml まで培養したのち集菌し、ザ
イモリアーゼ溶液(1.2M ソルビトール/50mM リン酸カリ
ウム、pH7.2/14mM 2- メルカプトエタノール/0.4mg/ml
ザイモリアーゼ60,000) に懸濁し、30度で1 時間インキ
ュベートした。遠心分離により回収したスフェロプラス
トに、100 度で加熱した緩衝液(1% SDS/50mMトリス- 塩
酸、pH6.8/10% 2-メルカプトエタノール/40%グリセロー
ル/0.02%ブロムフェノールブルー/1mMフェニルメチルス
ルホニルフロリド) を添加し、100 度で5 分間加熱する
ことにより、蛋白質を可溶化した。遠心分離により不溶
物を除去したのち、7.5%ポリアクリルアミドゲルを用い
て電気泳動した。また、ポリアクリルアミド中の蛋白質
を、25mMトリス- 塩酸/192mM グリシン/20%メタノール
中で電気泳動的に、ニトロセルロースフィルター上にブ
ロッティングした。ブロッティングしたフィルターをTB
S 緩衝液(50mM トリス- 塩酸、pH7.5/200mM NaCl) に浸
したのち、3%ゼラチン、0.05%ツィン20を含むTBS 緩衝
液中で、37度で40分間インキュベートした。ついで、50
μg の抗Ｐ−４５０ｃ抗体あるいは30μg の抗- Ｆｐｔ
抗体、1%ゼラチン、0.05% ツィン20を含むTBS 緩衝液中
で、37度で2 時間インキュベートした。抗体との反応
後、0.05% ツィン20を含むTBS 緩衝液中で、37度で30分
ずつ4 回洗浄を繰り返したのち、3%ゼラチン、0.05% ツ
ィン20を含むTBS 緩衝液中で、37度で20分間インキュベ
ートした。つぎに、2 μCiの[¹²⁵I]プロテインA(アマー
シャムから購入) 、1%ゼラチン、0.05% ツィン20を含む
TBS 緩衝液中で、37度で1 時間インキュベートしたの
ち、0,05% ツィン20を含むTBS 緩衝液中で、37度で30分
ずつ 4回洗浄を行った。フィルターを風乾したのち、オ
ートラジオグラフィーを行った。AH22(pAMP19)株,AH22
(pALP1)株,AH22(pALP17) 株,AH22(pALP25) 株 およびA
H22(pALP4) 株はいずれも抗- Ｐ−４５０ｃ抗体および
抗- Ｆｐｔ抗体とそれぞれ反応する蛋白質を産生するこ
とが判明した。産生された蛋白質は、電気泳動からみた
みかけの分子量が、約13〜14万ダルトンであった。この
値は、構築したＰ−４５０とＦｐｔのキメラ融合酵素遺
伝子から計算した分子量とほぼ一致した。 SD 合成培地
で約2 ×10⁷ 細胞/ml まで培養した形質転換酵母AH22(p
AMP19)株,AH22(pALP1)株,AH22(pALP17) 株,AH22(pALP2
5) 株 およびAH22(pALP4) 株を集菌し、100mM リン酸
カリウム、pH7.0 で洗浄したのち、100mM リン酸カリウ
ム、pH7.0 2ml に再懸濁した。2本のキュベットに菌懸
濁液を1ml ずつ分注し、サンプル側キュベットに一酸化
炭素をふきこんだのち、両キュベットにジチオナイト5
〜10mgを添加した。よく、攪拌したのち、400 〜500nm
の差スペクトルを測定し、447nm と490nm との吸光度の
差から、Δε=91mM ^-1cm^-1という値を元にして、ヘム含
有Ｐ−４５０含量を算出した。その結果、表1 に示すよ
うにAH22(pAMP19)株,AH22(pALP1)株,AH22(pALP17) 株,A
H22(pALP25) 株 およびAH22(pALP4) 株は、それぞれ菌
体あたり約6 〜7 ×10⁴ 分子のヘム含有Ｐ−４５０- Ｆ
ｐｔキメラ融合蛋白質を産生することが判明した。 実施例5:形質転換酵母菌株のアセトアニリドP-水酸化に
よるアセトアミノフェン生成量の測定 ＳＤ合成培地で、約２×１０⁷ 細胞/ml まで培養した形
質転換酵母AH22(pAMC1),AH22(pAMP19)株,AH22(pALP1)
株,AH22(pALP17) 株,AH22(pALP25) 株 およびAH22(pAL
P4) 株の培養液中に、それぞれ1.5Mアセトニリド( メタ
ノール溶液) を添加し、終濃度を25mMとした。その後、
振とう培養を続けながら、1 時間毎に培養液を一定量ず
つ分取し、遠心分離により菌体を除去した培養液上清を
HPLC( 高速液体クロマトグラフィー) にかけ、生成した
アセトアミノフェンを定量した。HPLCはカラムとしてμ
Bondapak C18(4×300mm)を用い、メタノール：水：酢酸
(15:84:1, V/V%) で溶出し、245nm の吸光度でモニター
した。その結果、表1 に示すようにＰ−４５０とＦｐｔ
のキメラ融合酵素を発現したAH22(pAMP19)株の活性は、
Ｐ−４５０ｃを発現したAH22(pAMC1) 株の約60% であっ
た。AH22(pAMP19)株のヘム含有酵素の発現量が、AH22(p
AMC1) 株の約6 分の1 であることから、酵素蛋白質あた
りの活性は、約4 倍に上昇したと推測できた。また、AH
22(pALP1)株,AH22(pALP17) 株,AH22(pALP25) 株およびA
H22(pALP4) 株のアセトアミノフェン生産活性は、AH22
(pAMC1) 株とほぼ同程度であった。これらの株のヘム含
有酵素の発現量は、AH22(pAMC1) 株より低いことから、
AH22(pAMP19)株同様、発現酵素蛋白質あたりの活性は、
Ｐ−４５０ｃ単独発現の場合よりも3 〜4 倍高くなっ
た。以上の結果から、Ｐ−４５０ｃとＦｐｔのキメラ融
合酵素は、Ｐ−４５０ｃ単独発現の場合に比べて、より
効率よく電子伝達系を構成し、高い1 原子酸素添加の反
応を示すことが明らかになった。 実施例6 Ｐ−４５０とＦｐｔからなるキメラ融合酸化
酵素の精製 Ｐ−４５０とＦｐｔからなるキメラ融合酸化酵素を発現
したAH22(pAMP19)株から、本酵素の精製を行った。約3
×10¹¹細胞のAH22(pAMP19)株をザイモリアーゼ溶液に懸
濁し、30度で1 時間インキュベートしたのち、遠心分離
によりスフェロプラストを回収した。スフェロプラスト
は、50mMリン酸カリウム、pH7.2/14mM 2- メルカプトエ
タノール/1.2M ソルビトールで2 回洗浄したもち、超音
波処理(60W,5分) を行い、細胞を破砕した。3,000 ×g
10分、10,000×g 20分の遠心分離により得られる上清
を、さらに125,000 ×g 90分間遠心分離にかけ、沈澱を
ミクロソーム画分とした。20.0nmolのＰ−４５０とＦｐ
ｔのキメラ融合酸素を含むミクロソーム画分を、60mlの
緩衝液A(10mMリン酸カリウム、pH7.4/0.1mM EDTA/20%グ
リセロール/0.5% コール酸ナトリウム/0.2% エマルゲン
913) と終濃度1mM のフェニルメチルスルホニルフルオ
リドを添加し、4 度で10分間攪拌した。つぎに、緩衝液
A で平衡化したDEAE- セルロ−スカラム(1.6×12cm) に
重層し、20mlの緩衝液A で洗浄したのち、カラム中央部
に生じる橙色のバンドを回収し、新たなDEAE- セルロ−
スカラム(1.6×12cm) に重層し、0 〜40mM KClの直線濃
度勾配を含む緩衝液A で溶出した。417nm の吸光度をモ
ニターした結果、2 つのピークが認められた。還元型一
酸化炭素結合差スペクトル( 実施例4 参照) を測定した
ところ、Ｐ−４５０とＦｐｔのキメラ融合酸化酵素は、
早く溶出されるピークに含まれることが判明したのでこ
の画分を回収し、予め緩衝液A で平衡化した2'-5'-ADP
セファロース4B(0.9×3cm)に重層し、40mlの緩衝液で洗
浄した。ついで、0.5mM NADP⁺ を含む緩衝液で溶出され
る画分を精製Ｐ−４５０- Ｆｐｔキメラ融合酸化酵素標
品とした。ミクロソーム画分のＰ−４５０- Ｆｐｔキメ
ラ融合酸化酵素の比含量は、0.09nmol/mg 蛋白質であっ
たが、DEAE- セルロ−スカラムを通すことにより、比含
量は、1.14nmol/mg 蛋白質に上昇した。2'-5'-ADPセフ
ァロース4Bカラム溶出画分の350 〜700nm における吸収
スペクトルは、Ｐ−４５０ｃとラットＦｐｔを1:1 で混
合した標品のセペクトルと一致した。したがって、Ｐ−
４５０ｃ- Ｆｐｔキメラ融合酸化酵素は分子中に、プロ
トヘム、フラビンアデニンヌクレオチド、フラビンモノ
ヌクレオチドをおのおの1 分子ずつ含むことが示唆され
た。また、精製標品のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気
泳動は、分子量約130,000ダルトンの位置に、ほぼ単一
のバンドを示した。この精製標品100 μl(0.015nmol Ｐ
−４５０- Ｆｐｔキメラ融合酸化酵素相当分) に、100m
M リン酸カリウム、pH7.4 、10ml, 20mM NADPH 25 μl
を添加し、37度で3 分間プレインキュベーションしたの
ち、500nmol の7-エトキシクマリンを添加し、5 分間イ
ンキュベートした。15% トリクロロ酢酸62.5μl を添加
することにより反応を停止し、反応生成物である7-ヒド
ロキシクマリンを定量した。その結果、7-エトキシクマ
リン 0- 脱エチル化活性は、1.2nmol/分/nmol Ｐ−４５
０となり、ラットＰ−４５０cとラットＦｐｔ0.015nmol
ずつからなる再構成系での活性と同様の値を示した。
従って、Ｐ−４５０- Ｆｐｔキメラ融合酸化酵素標品で
は、分子内あるいは分子間で電子伝達が進行しており、
単一酵素でＰ−４５０とＦｐｔの両酵素の機能を発揮す
ることが明らかとなった。この酵素は、従来の技術では
創製しえないものであり、蛋白質工学的に作られた全く
新規な多機能性酵素である。SEQ ID NO: 6 Synthetic DNA spacer that has been annealed About 50 to 100 ng
Was added and a T4 DNA ligase reaction was performed. Escherichia coli DH1 strain was transformed with the reaction mixture, and plasmid DNA was prepared from the obtained colonies. Since the synthetic spacer has a restriction enzyme PvuI recognition site, a clone that can be cleaved with PvuI was selected, and as shown in FIGS. 1 and 3, 4, 5 and 6, the synthetic spacer was replaced with the synthetic linker Xh.
Plasmids containing the chimeric fusion protein genes having 1 unit and 3 units inserted in the oI site in the same direction as above were designated as pBLP1 and pBLP17, respectively. Further, plasmids containing the chimeric fusion protein gene in which the above-mentioned synthetic spacer was inserted into the XhoI site of the above-mentioned synthetic linker in the opposite direction to the above, respectively, were designated as pBLP25 and pBLP4, respectively.
The HindIII fragment of pBLP1, pBLP17, pBLP25, pBLP4 was used in Example 1
As in step 4, the expression vector pAAH5
By inserting it into the HindIII site of pALP1, pALP17, p
ALP25 and pALP4 were obtained. Example 3: Transformation of yeast with the constructed plasmid Saccharomyces cerevisiae AH22 strain (ATCC38626),
After culturing in 5 ml of YPD medium (1% yeast extract, 2% polypeptone, 2% glucose) at 30 ° C for 18 hours, 1 ml of yeast culture solution was centrifuged to collect the cells. 0.2 M of the obtained bacterial cells
After washing with 1 ml of LiCl solution, it was suspended in 20 μl of 1M LiCl solution. To this, 30 μl of a 70% polyethylene glycol 4000 solution and 10 μl of plasmid pAMC19, pALP1, pALP17, pALP25 or pALP4 solution (corresponding to about 1 μg) were added, thoroughly mixed and incubated at 30 ° C. for 1 hour. Then, add 140 μl of water, stir well, and sprinkle this solution on SD synthetic medium plate (2% glucose, 0.67% yeast nitrogen source amino acid-free, 20 μg / ml histidine, 2% agar), 30 By incubating for 3 days at
Transformants AH22 (pAMP19), AH22 (pALP1), AH22 (pA containing the plasmids pAMP19, pALP1, pALP17, pALP25 and pALP4
LP17), AH22 (pALP25) and AH22 (pALP4) were obtained, respectively. Example 4: Quantification of expression level of chimeric fusion of P-450 and Fpt P-450c-expressing yeast AH22 (pAMC1) strain obtained previously (JP-A-61-56072) and AH22 (pAMP19) obtained in Example 3 Shares, A
H22 (pALP1) strain, AH22 (pALP17) strain, AH22 (pALP25) strain and AH22 (pALP4) strain were treated with SD synthetic medium (2% glucose, 0.67
% Yeast nitrogen source amino acid-free, 20 μg / ml histidine) to about 2 × 10 ⁷ cells / ml each, and then the cells were collected and zymolyase solution (1.2 M sorbitol / 50 mM potassium phosphate, pH 7.2 / 14 mM 2- Mercaptoethanol / 0.4mg / ml
It was suspended in zymolyase 60,000) and incubated at 30 ° C for 1 hour. The spheroplasts collected by centrifugation were added to a buffer (1% SDS / 50 mM Tris-HCl, pH 6.8 / 10% 2-mercaptoethanol / 40% glycerol / 0.02% bromphenol blue / 1 mM phenyl) heated at 100 ° C. Methylsulfonyl fluoride) was added and the protein was solubilized by heating at 100 ° C. for 5 minutes. After removing insoluble matter by centrifugation, electrophoresis was performed using 7.5% polyacrylamide gel. The protein in polyacrylamide was electrophoretically blotted on a nitrocellulose filter in 25 mM Tris-hydrochloric acid / 192 mM glycine / 20% methanol. TB the blotted filter
After soaking in S buffer (50 mM Tris-hydrochloric acid, pH 7.5 / 200 mM NaCl), the cells were incubated in TBS buffer containing 3% gelatin and 0.05% Tween 20 at 37 degrees for 40 minutes. Then, 50
μg anti-P-450c antibody or 30 μg anti-Fpt
Incubated for 2 hours at 37 degrees in TBS buffer containing antibody, 1% gelatin, 0.05% Tween 20. After the reaction with the antibody, the plate was washed 4 times with TBS buffer containing 0.05% Tween 20 at 37 ° C for 30 minutes 4 times each, and then in TBS buffer containing 3% gelatin and 0.05% Tween 20 at 37 ° C. And incubated for 20 minutes. Next, 2 μCi of [ ¹²⁵ I] Protein A (purchased from Amersham), 1% gelatin, 0.05% Tween 20
After incubating in TBS buffer at 37 ° C for 1 hour, the plate was washed 4 times in TBS buffer containing 0,05% Tween 20 at 37 ° C for 30 minutes each. After air-drying the filter, autoradiography was performed. AH22 (pAMP19) strain, AH22
(pALP1) strain, AH22 (pALP17) strain, AH22 (pALP25) strain and A
Both H22 (pALP4) strains were found to produce proteins that react with anti-P-450c antibody and anti-Fpt antibody, respectively. The protein produced had an apparent molecular weight of about 130,000 to 140,000 daltons as observed by electrophoresis. This value almost coincided with the molecular weight calculated from the constructed P-450 and Fpt chimeric fusion enzyme gene. Transformed yeast AH22 (p) cultured in SD synthetic medium to about 2 × 10 ⁷ cells / ml.
AMP19) strain, AH22 (pALP1) strain, AH22 (pALP17) strain, AH22 (pALP2
5) The strain and AH22 (pALP4) strain were collected, washed with 100 mM potassium phosphate, pH 7.0 and then resuspended in 100 mM potassium phosphate, pH 7.0 2 ml. Dispense 1 ml each of the bacterial suspension into two cuvettes, wipe carbon dioxide into the sample-side cuvette, and then put dithionite 5 into both cuvettes.
~ 10 mg was added. After stirring well, 400-500nm
Was measured, and the heme-containing P-450 content was calculated from the difference in absorbance between 447 nm and 490 nm based on the value Δε = 91 mM ⁻¹ cm ⁻¹ . As a result, as shown in Table 1, AH22 (pAMP19) strain, AH22 (pALP1) strain, AH22 (pALP17) strain, AH22 (pALP17) strain,
The H22 (pALP25) strain and the AH22 (pALP4) strain each contain approximately 6 to 7 × 10 ⁴ molecules of heme-containing P-450-F per cell.
It was found to produce a pt chimeric fusion protein. Example 5: Measurement of acetaminophen production amount by acetanilide P-hydroxylation of transformed yeast strain Transformed yeast AH22 (pAMC1), AH22 (pAMP19) cultured in SD synthesis medium to about 2 × 10 ⁷ cells / ml Strain, AH22 (pALP1)
Strain, AH22 (pALP17) strain, AH22 (pALP25) strain and AH22 (pALP25) strain
1.5M acetonilide (methanol solution) was added to the culture solution of the P4) strain to give a final concentration of 25 mM. afterwards,
While shaking culture is continued, a fixed amount of the culture solution is collected every hour and the culture solution supernatant obtained by removing the bacterial cells by centrifugation is used.
The resulting acetaminophen was quantified by HPLC (high performance liquid chromatography). HPLC as a column
Bondapak C18 (4 × 300mm) is used, methanol: water: acetic acid
Elution was performed at (15: 84: 1, V / V%) and the absorbance was monitored at 245 nm. As a result, as shown in Table 1, P-450 and Fpt
The activity of the AH22 (pAMP19) strain expressing the chimeric fusion enzyme of
It was about 60% of the AH22 (pAMC1) strain expressing P-450c. The expression level of the heme-containing enzyme in the AH22 (pAMP19) strain was
Since it was about one-sixth that of AMC1) strain, it could be inferred that the activity per enzyme protein was increased about 4-fold. Also, AH
22 (pALP1) strain, AH22 (pALP17) strain, AH22 (pALP25) strain and A
The acetaminophen-producing activity of the H22 (pALP4) strain was AH22
It was almost the same as the (pAMC1) strain. Since the expression level of heme-containing enzyme in these strains is lower than that of AH22 (pAMC1) strain,
Similar to the AH22 (pAMP19) strain, the activity per expressed enzyme protein is
It was 3 to 4 times higher than that of P-450c expression alone. From the above results, it is clear that the chimeric fusion enzyme of P-450c and Fpt constitutes an electron transfer system more efficiently and exhibits a higher 1-atom oxygenation reaction than in the case of P-450c alone expression. became. Example 6 Purification of chimeric fusion oxidase composed of P-450 and Fpt This enzyme was purified from the AH22 (pAMP19) strain expressing the chimeric fusion oxidase composed of P-450 and Fpt. About 3
The AH22 (pAMP19) strain of × 10 ¹¹ cells was suspended in a zymolyase solution, incubated at 30 ° C for 1 hour, and then spheroplasts were collected by centrifugation. The spheroplasts were washed twice with 50 mM potassium phosphate, pH 7.2 / 14 mM 2-mercaptoethanol / 1.2 M sorbitol, and then sonicated (60 W, 5 minutes) to disrupt the cells. 3,000 xg
The supernatant obtained by centrifugation at 10 minutes and 10,000 × g for 20 minutes was further centrifuged at 125,000 × g for 90 minutes, and the precipitate was used as a microsome fraction. 20.0 nmol P-450 and Fp
The microsome fraction containing the chimeric fusion oxygen of t was added to 60 ml of buffer solution A (10 mM potassium phosphate, pH 7.4 / 0.1 mM EDTA / 20% glycerol / 0.5% sodium cholate / 0.2% emulgen).
913) and phenylmethylsulfonyl fluoride at a final concentration of 1 mM were added, and the mixture was stirred at 4 ° C for 10 minutes. Next, the buffer
After overlaying on a DEAE-cellulose column (1.6 × 12 cm) equilibrated with A and washing with 20 ml of buffer A, the orange band generated in the center of the column was collected and a new DEAE-cellulose was collected.
Layered on a column (1.6 × 12 cm) and eluted with buffer A containing a linear concentration gradient of 0 to 40 mM KCl. As a result of monitoring the absorbance at 417 nm, two peaks were observed. When the reduced carbon monoxide bond difference spectrum (see Example 4) was measured, the chimeric fusion oxidase of P-450 and Fpt showed that
Since it was found to be contained in the peak that eluted early, this fraction was collected and 2'-5'-ADP equilibrated with buffer A in advance was collected.
Layered on Sepharose 4B (0.9 x 3 cm) and washed with 40 ml of buffer. Then, the fraction eluted with a buffer containing 0.5 mM NADP ⁺ was used as a purified P-450-Fpt chimeric fusion oxidase preparation. The specific content of P-450-Fpt chimeric fusion oxidase in the microsomal fraction was 0.09 nmol / mg protein, but the specific content increased to 1.14 nmol / mg protein by passing through the DEAE-cellulose column. . The absorption spectrum at 350 to 700 nm of the elution fraction of the 2'-5'-ADP Sepharose 4B column was in agreement with the standard spectrum of P-450c and rat Fpt mixed at 1: 1. Therefore, P-
It was suggested that the 450c-Fpt chimeric fusion oxidase contains one molecule of each of protoheme, flavin adenine nucleotide, and flavin mononucleotide in the molecule. In addition, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of the purified sample showed an almost single band at a position of molecular weight of about 130,000 daltons. 100 μl of this purified sample (0.015 nmol P
-450- Fpt chimeric fusion oxidase equivalent), 100m
M potassium phosphate, pH 7.4, 10 ml, 20 mM NADPH 25 μl
Was added and pre-incubated at 37 degrees for 3 minutes, then 500 nmol of 7-ethoxycoumarin was added and incubated for 5 minutes. The reaction was stopped by adding 62.5 μl of 15% trichloroacetic acid, and the reaction product, 7-hydroxycoumarin, was quantified. As a result, 7-ethoxycoumarin 0-deethylation activity was 1.2 nmol / min / nmol P-45.
0, rat P-450c and rat Fpt 0.015 nmol
The same values as the activity in the reconstituted system consisting of
Therefore, in the P-450-Fpt chimeric fusion oxidase preparation, electron transfer is progressing intramolecularly or intermolecularly,
It was revealed that a single enzyme exerts the functions of both P-450 and Fpt enzymes. This enzyme cannot be created by conventional techniques and is a completely new multifunctional enzyme produced by protein engineering.

【表１】 [Table 1]

【配列表】[Sequence list]

配列番号：１ 配列の長さ：１８７２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：長鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATGATCCAAA CAACGGCCCC ACCCGTCAAA GAGAGCAGCT TCGTGGAAAA GATGAAGAAA 60 ACGGGAAGGA ACATTATCGT ATTCTATGGC TCCCAGACGG GAACCGCTGA GGAGTTTGCC 120 AACCGGCTGT CCAAGGATGC CCACCGCTAC GGGATGCGGG GCATGTCCGC AGACCCTGAA 180 GAGTATGACT TGGCCGACCT GAGCAGCCTG CCTGAGATCG ACAAGTCCCT GGTAGTCTTC 240 TGCATGGCCA CATACGGAGA GGGCGACCCC ACGGACAATG CGCAGGACTT CTATGACTGG 300 CTGCAGGAGA CTGACGTGGA CCTCACTGGG GTCAAGTTTG CTGTATTTGG TCTTGGGAAC 360 AAGACCTATG AGCACTTCAA TGCCATGGGC AAGTATGTGG ACCAGCGGCT GGAGCAGCTT 420 GGCGCCCAGC GCATCTTTGA GTTGGGCCTT GGTGATGATG ACGGGAACTT GGAAGAGGAT 480 TTCATCACGT GGAGGGAGCA GTTCTGGCCA GCTGTGTGCG AGTTCTTTGG GGTAGAAGCC 540 ACTGGGGAGG AGTCGAGCAT TCGCCAGTAT GAGCTCGTGG TCCACGAAGA CATGGACGTA 600 GCCAAGGTGT ACACGGGTGA GATGGGCCGT CTGAAGAGCT ACGAGAACCA GAAACCCCCC 660 TTCGATGCTA AGAATCCATT CCTGGCTGCT GTCACCGCCA ACCGGAAGCT GAACCAAGGC 720 ACTGAGCGGC ATCTAATGCA CCTGGAGTTG GACATCTCAG ACTCCAAGAT CAGGTATGAA 780 TCTGGAGATC ACGTGGCTGT GTACCCAGCC AATGACTCAG CCCTGGTCAA CCAGATTGGG 840 GAGATCCTGG GAGCTGACCT GGATGTCATC ATGTCTCTAA ACAATCTCGA TGAGGAGTCA 900 AACAAGAAGC ATCCGTTCCC CTGCCCCACC ACCTACCGCA CGGCCCTCAC CTACTACCTG 960 GACATCACTA ACCCGCCACG CACCAATGTG CTCTACGAAC TGGCACAGTA CGCCTCAGAG 1020 CCCTCGGAGC AGGAGCACCT GCACAAGATG GCGTCATCCT CAGGCGAGGG CAAGGAGCTG 1080 TACCTGAGCT GGGTGGTGGA AGCCCGGAGG CACATCCTAG CCATCCTCCA AGACTACCCA 1140 TCACTGCGGC CACCCATCGA CCACCTGTGT GAGCTGCTGC CACGCCTGCA GGCCCGATAC 1200 TACTCCATTG CCTCATCCTC CAAGGTCCAC CCCAACTCCG TGCACATCTG TGCCGTGGCC 1260 GTGGAGTACG AAGCGAAGTC TGGCCGAGTG AACAAGGGGG TGGCCACTAG CTGGCTTCGG 1320 GCCAAGGAAC CAGCAGGCGA GAATGGCGGC CGCGCCCTGG TACCCATGTT CGTGCGCAAA 1380 TCTCAGTTCC GCTTGCCTTT CAAGTCCACC ACACCTGTCA TCATGGTGGG CCCCGGCACT 1440 GGGATTGCCC CTTTCATGGG CTTCATCCAG GAACGAGCTT GGCTTCGAGA GCAAGGCAAG 1500 GAGGTGGGAG AGACGCTGCT ATACTATGGC TGCCGGCGCT CGGATGAGGA CTATCTGTAC 1560 CGTGAAGAGC TAGCCCGCTT CCACAAGGAC GGTGCCCTCA CGCAGCTTAA TGTGGCCTTT 1620 TCCCGGGAGC AGGCCCACAA GGTCTATGTC CAGCACCTTC TGAAGAGAGA CAGGGAACAC 1680 CTGTGGAAGC TGATCCACGA GGGCGGTGCC CACATCTATG TGTGCGGGGA TGCTCGAAAT 1740 ATGGCCAAAG ATGTGCAAAA CACATTCTAT GACATTGTGG CTGAGTTCGG GCCCATGGAG 1800 CACACCCAGG CTGTGGACTA TGTTAAGAAG CTGATGACCA AGGGCCGCTA CTCACTAGAT 1860 GTGTGGAGCT AG 1872 配列番号：２ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：長鎖状 配列の種類：他の核酸 合成リンカー 配列番号：３ 配列の長さ：６ 配列の型：ペプチド トポロジー：長鎖状 起源 ラット肝Ｆｐｔ 配列番号：４ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：長鎖状 配列の種類：他の核酸 合成リンカー 配列 GTTTGGATCC TGCTGAACT CAAACCTAGG ACGACTTGA 配列番号：５ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：長鎖状 配列の種類：他の核酸 合成リンカー 配列番号：６ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：長鎖状 配列の種類：他の核酸 合成リンカー SEQ ID NO: 1 Sequence length: 1872 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double-stranded topology: Long-chain sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA sequence ATGATCCAAA CAACGGCCCC ACCCGTCAAA GAGAGCAGCT TCGTGGAAAA GATGAAGAAA 60 ACGGGAAGGA ACATTATCGT ATTCTATGGC TCCCGAACGG GATCGCGACCGG 120 AACCGGCTGT CCAAGGATGC CCACCGCTAC GGGATGCGGG GCATGTCCGC AGACCCTGAA 180 GAGTATGACT TGGCCGACCT GAGCAGCCTG CCTGAGATCG ACAAGTCCCT GGTAGTCTTC 240 TGCATGGCCA CATACGGAGA GGGCGACCCC ACGGACAATG CGCAGGACTT CTATGACTGG 300 CTGCAGGAGA CTGACGTGGA CCTCACTGGG GTCAAGTTTG CTGTATTTGG TCTTGGGAAC 360 AAGACCTATG AGCACTTCAA TGCCATGGGC AAGTATGTGG ACCAGCGGCT GGAGCAGCTT 420 GGCGCCCAGC GCATCTTTGA GTTGGGCCTT GGTGATGATG ACGGGAACTT GGAAGAGGAT 480 TTCATCACGT GGAGGGAGCA GTTCTGGCCA GCTGTGTGCG AGTTCTTTGG GGTAGAAGCC 540 ACTGGGGAGG AGTCGAGCAT TCGCCAGTAT GAGCTCGTGG TCCACGAAGA CATGGACGTA 600 GCCAAGGTGT ACACGGGTGA GATGGGCCGT CTGAAGAGCT ACGAGAACCA GAAACCCCCC 660 TTCGATGCTA AGAATCCATT CCTGGCTGCT GTCACCGCCA ACCGGAAGCT GAACCAAGGC 720 ACTGAGCGGC ATCTAATGCA CCTGGAGTTG GACATCTCAG ACTCCAAGAT CAGGTATGAA 780 TCTGGAGATC ACGTGGCTGT GTACCCAGCC AATGACTCAG CCCTGGTCAA CCAGATTGGG 840 GAGATCCTGG GAGCTGACCT GGATGTCATC ATGTCTCTAA ACAATCTCGA TGAGGAGTCA 900 AACAAGAAGC ATCCGTTCCC CTGCCCCACC ACCTACCGCA CGGCCCTCAC CTACTACCTG 960 GACATCACTA ACCCGCCACG CACCAATGTG CTCTACGAAC TGGCACAGTA CGCCTCAGAG 1020 CCCTCGGAGC AGGAGCACCT 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NO: 2 sequence length of 16 sequences Type: Nucleic acid Number of strands: Duplex Topology: Long chain Sequence type: Other nucleic acids Synthetic linker SEQ ID NO: 3 Sequence length: 6 Sequence type: Peptide Topology: Long chain Origin Rat liver Fpt SEQ ID NO: 4 Sequence length: 19 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double-stranded Topology: Long-chain Sequence type: Other nucleic acid Synthetic linker Sequence GTTTGGATCC TGCTGAACT CAAACCTAGG ACGACTTGA SEQ ID NO: 5 Sequence length: 15 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double strand Topology: Long chain Sequence type: Other nucleic acid Synthetic linker SEQ ID NO: 6 Sequence length: 18 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double strand Topology: Long chain Sequence type: Other nucleic acid Synthetic linker

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 柴田 恵 兵庫県宝塚市高司４丁目２番１号 住友化 学工業株式会社内 (72)発明者 大川 秀郎 兵庫県宝塚市高司４丁目２番１号 住友化 学工業株式会社内─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁵ Identification number Office reference number FI technical display location // (C12N 9/02 C12R 1: 865) (C12N 1/19 C12R 1: 865) (72) Inventor Megumi Shibata 4-2-1 Takashi Takarazuka City, Hyogo Prefecture Sumitomo Kagaku Kogyo Co., Ltd. (72) Inventor Hideo Okawa 4-2-1 Takashi Takarazuka City, Hyogo Sumitomo Kagaku Kogyo Co., Ltd.

Claims (4)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】ラット肝チトクロムＰ−４５０遺伝子の１
原子酸素添加活性に必要な領域とラット肝ＮＡＤＰＨ−
チトクロムＰ−４５０還元酵素遺伝子の還元力供給能発
揮に必要な領域を接続し構築したキメラ酵素遺伝子を含
む該酸化酵素を発現する酵母発現プラスミドを保持する
形質転換酵母菌株を培養することを特徴とするチトクロ
ムＰ−４５０の有する１原子酸素添加活性とＮＡＤＰＨ
−チトクロムＰ−４５０還元酸素の有する還元力供給能
を併せ持つ酸化酵素の製造方法1. A rat liver cytochrome P-450 gene 1
Area required for atomic oxygenation activity and rat liver NADPH-
A method of culturing a transformed yeast strain having a yeast expression plasmid that expresses the oxidase containing a chimeric enzyme gene constructed by connecting a region required for exhibiting a reducing power supply ability of a cytochrome P-450 reductase gene. Oxygenation Activity and NADPH of Cytochrome P-450
-Method for producing oxidase that also has a reducing power supply ability of cytochrome P-450 reducing oxygen 【請求項２】下記塩基配列で表される可溶性ＮＡＤＰＨ
−チトクロムＰ−４５０還元酵素をコードする遺伝子 【化１】 配列番号１2. A soluble NADPH represented by the following nucleotide sequence:
-A gene encoding cytochrome P-450 reductase embedded image SEQ ID NO: 1 【請求項３】下記塩基配列で表される可溶性ＮＡＤＰＨ
−チトクロムＰ−４５０還元酵素をコードする遺伝子を
含むプラスミド 【化２】 配列番号２3. A soluble NADPH represented by the following nucleotide sequence:
-A plasmid containing the gene encoding cytochrome P-450 reductase. 【請求項４】下記塩基配列で表される可溶性ＮＡＤＰＨ
−チトクロムＰ−４５０還元酵素をコードする遺伝子を
含むプラスミドにより形質転換され可溶性酵素を産生す
る酵母菌株 【化３】 配列番号３4. A soluble NADPH represented by the following nucleotide sequence:
A yeast strain transformed with a plasmid containing the gene encoding cytochrome P-450 reductase to produce a soluble enzyme.