JPH0591888A - オメガ９系高度不飽和脂肪酸およびこれを含有する脂質の製造方法 - Google Patents
オメガ９系高度不飽和脂肪酸およびこれを含有する脂質の製造方法Info
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6409—Fatty acids
- C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
-
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 オメガ９系高度不飽和脂肪酸又はこれを含有
する脂質の新規な製造方法を提供する。 【構成】 オメガ９系高度不飽和脂肪酸生産能を有する
微生物を培養してオメガ９系高度不飽和脂肪酸、又はオ
メガ９系高度不飽和脂肪酸を含有する脂質を生成せし
め、そしてオメガ９系高度不飽和脂肪酸を採取すること
を特徴とするオメガ９系高度不飽和脂肪酸又はそれを含
有する脂質の製造方法。
する脂質の新規な製造方法を提供する。 【構成】 オメガ９系高度不飽和脂肪酸生産能を有する
微生物を培養してオメガ９系高度不飽和脂肪酸、又はオ
メガ９系高度不飽和脂肪酸を含有する脂質を生成せし
め、そしてオメガ９系高度不飽和脂肪酸を採取すること
を特徴とするオメガ９系高度不飽和脂肪酸又はそれを含
有する脂質の製造方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は醗酵法による２つ以上の
二重結合を有し、好ましくは炭素数１８〜２２を有する
オメガ９系高度不飽和脂肪酸及びこれを含有する脂質の
製造方法に関する。
二重結合を有し、好ましくは炭素数１８〜２２を有する
オメガ９系高度不飽和脂肪酸及びこれを含有する脂質の
製造方法に関する。
【０００２】
【従来技術】オメガ９系高度不飽和脂肪酸、例えばミー
ド酸、及び８，１１−エイコサジエン酸は必須脂肪酸欠
乏に陥った動物組織の構成脂肪酸のひとつとして存在す
ることが知られている。しかしながら、その含量はわず
かであるため単離精製はたいへん困難である。また微生
物界におけるその存在は、現在のところ全く知られてい
ない。これらの高度不飽和脂肪酸は生体内でロイコトリ
エン３グループの前駆体になることが可能でその生理活
性が大いに期待される。このためオメガ９系高度不飽和
脂肪酸を大量に製造する方法を開発することが強く望ま
れている。
ド酸、及び８，１１−エイコサジエン酸は必須脂肪酸欠
乏に陥った動物組織の構成脂肪酸のひとつとして存在す
ることが知られている。しかしながら、その含量はわず
かであるため単離精製はたいへん困難である。また微生
物界におけるその存在は、現在のところ全く知られてい
ない。これらの高度不飽和脂肪酸は生体内でロイコトリ
エン３グループの前駆体になることが可能でその生理活
性が大いに期待される。このためオメガ９系高度不飽和
脂肪酸を大量に製造する方法を開発することが強く望ま
れている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、安価
な常用の培地を用いて効率よくオメガ９系高度不飽和脂
肪酸を製造することができる方法を提供しようとするも
のである。
な常用の培地を用いて効率よくオメガ９系高度不飽和脂
肪酸を製造することができる方法を提供しようとするも
のである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記目的
を達成するため種々研究した結果、本発明において、オ
メガ９系高度不飽和脂肪酸生産能を有する微生物を培養
してオメガ９系高度不飽和脂肪酸、又はオメガ９系高度
不飽和脂肪酸を含有する脂質を生成せしめ、そしてオメ
ガ９系高度不飽和脂肪酸を採取することを特徴とするオ
メガ９系高度不飽和脂肪酸の製造方法；及びオメガ９系
高度不飽和脂肪酸生産能を有する微生物を培養してオメ
ガ９系高度不飽和脂肪酸を含有する脂質を採取すること
を特徴とするオメガ９系高度不飽和脂肪酸を含有する脂
質の製造方法を提供する。
を達成するため種々研究した結果、本発明において、オ
メガ９系高度不飽和脂肪酸生産能を有する微生物を培養
してオメガ９系高度不飽和脂肪酸、又はオメガ９系高度
不飽和脂肪酸を含有する脂質を生成せしめ、そしてオメ
ガ９系高度不飽和脂肪酸を採取することを特徴とするオ
メガ９系高度不飽和脂肪酸の製造方法；及びオメガ９系
高度不飽和脂肪酸生産能を有する微生物を培養してオメ
ガ９系高度不飽和脂肪酸を含有する脂質を採取すること
を特徴とするオメガ９系高度不飽和脂肪酸を含有する脂
質の製造方法を提供する。
【０００５】さらに、本発明者は、オメガ９系高度不飽
和脂肪酸を生産する能力を有する微生物を、培地又は培
養中の培養液にオメガ９系高度不飽和脂肪酸の基質、例
えば炭化水素、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪酸塩、又
はこれらを構成成分として含む油脂等を添加して培養し
た場合に、オメガ９系高度不飽和脂肪酸の顕著な生産が
認められるという全く新しい知見を得た。
和脂肪酸を生産する能力を有する微生物を、培地又は培
養中の培養液にオメガ９系高度不飽和脂肪酸の基質、例
えば炭化水素、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪酸塩、又
はこれらを構成成分として含む油脂等を添加して培養し
た場合に、オメガ９系高度不飽和脂肪酸の顕著な生産が
認められるという全く新しい知見を得た。
【０００６】従ってこの発明はさらに、オメガ９系高度
不飽和脂肪酸生産能を有する微生物をオメガ９系高度不
飽和脂肪酸の基質を添加した培地で培養するか、あるい
は該微生物が培養されている培養液にこれらの基質を添
加してさらに培養することによりオメガ９系高度不飽和
脂肪酸又はオメガ９系高度不飽和脂肪酸を含有する脂質
を生成せしめ、そしてオメガ９系高度不飽和脂肪酸を採
取することを特徴とするオメガ９系高度不飽和脂肪酸の
製造方法；及びオメガ９系高度不飽和脂肪酸生産能を有
する微生物をオメガ９系高度不飽和脂肪酸の基質を添加
した培地で培養するか、あるいは該微生物が培養されて
いる培養液にこれらの基質を添加してさらに培養し、そ
してオメガ９系高度不飽和脂肪酸を含有する脂質を採取
することを特徴とするオメガ９系高度不飽和脂肪酸を含
有する脂質の製造方法を提供するものである。
不飽和脂肪酸生産能を有する微生物をオメガ９系高度不
飽和脂肪酸の基質を添加した培地で培養するか、あるい
は該微生物が培養されている培養液にこれらの基質を添
加してさらに培養することによりオメガ９系高度不飽和
脂肪酸又はオメガ９系高度不飽和脂肪酸を含有する脂質
を生成せしめ、そしてオメガ９系高度不飽和脂肪酸を採
取することを特徴とするオメガ９系高度不飽和脂肪酸の
製造方法；及びオメガ９系高度不飽和脂肪酸生産能を有
する微生物をオメガ９系高度不飽和脂肪酸の基質を添加
した培地で培養するか、あるいは該微生物が培養されて
いる培養液にこれらの基質を添加してさらに培養し、そ
してオメガ９系高度不飽和脂肪酸を含有する脂質を採取
することを特徴とするオメガ９系高度不飽和脂肪酸を含
有する脂質の製造方法を提供するものである。
【０００７】さらに、本発明者らは、前記製造方法にお
いてオメガ９系高度不飽和脂肪酸生産能を有する微生物
が、Δ５不飽和化活性およびΔ６不飽和化活性を有しか
つΔ１２不飽和化活性の低下または欠失した微生物であ
ることを特徴とするオメガ９系高度不飽和脂肪酸又はこ
れを含有する脂質の製造方法；及び前記オメガ９系高度
不飽和脂肪酸生産能を有する微生物が、アラキドン酸生
産能を有しかつΔ１２不飽和化活性の低下または欠失し
た微生物であることを特徴とするオメガ９系高度不飽和
脂肪酸又はこれを含有する脂質の製造方法を提供しよう
とするものである。
いてオメガ９系高度不飽和脂肪酸生産能を有する微生物
が、Δ５不飽和化活性およびΔ６不飽和化活性を有しか
つΔ１２不飽和化活性の低下または欠失した微生物であ
ることを特徴とするオメガ９系高度不飽和脂肪酸又はこ
れを含有する脂質の製造方法；及び前記オメガ９系高度
不飽和脂肪酸生産能を有する微生物が、アラキドン酸生
産能を有しかつΔ１２不飽和化活性の低下または欠失し
た微生物であることを特徴とするオメガ９系高度不飽和
脂肪酸又はこれを含有する脂質の製造方法を提供しよう
とするものである。
【０００８】
【具体的な説明】本発明の方法においては、オメガ９系
高度不飽和脂肪酸生産能を有する微生物であれば、すべ
て使用することができる。さらに具体的には、Δ５不飽
和化活性およびΔ６不飽和化活性を有しかつΔ１２不飽
和化活性の低下または欠失した微生物、使用することが
でき、例えばアラキドン酸生産能を有する微生物から誘
導される突然変異株を挙げることができる。アラキドン
酸生産能を有する微生物としては、モルティエレラ（Ｍ
ｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属、コニディオボラス（Ｃｏｎ
ｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属、フィチウム（Ｐｙｔｈｉｕ
ｍ）属、フィトフトラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｏｒａ）属、
ペニシリューム（Ｐｅｎｉｓｉｌｌｉｕｍ）属、クラド
スポリューム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、ムコー
ル（Ｍｕｃｏｒ）属、フザリューム（Ｆｕｓａｒｉｕ
ｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）
属、ロードトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、エン
トモフトラ（Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ）属に属する
菌株が挙げられる。モルティエレラ属では例えば、モル
ティエレラ・エロンガタ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｅ
ｌｏｎｇａｔａ）、モルティエレラ・エキシグア（Ｍｏ
ｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｅｘｉｇｕａ）、モルティエレラ
・ヒグロフィラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｈｙｇｒｏ
ｐｈｉｌａ）、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉ
ｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）等のモルティエレラ亜属
に属する菌株を挙げることができる。突然変異を誘発さ
せるためには、放射線（Ｘ線、ガンマー線、中性子線）
照射や紫外線照射、高熱処理等を行ったり、また微生物
を適当なバッファー中などに懸濁し、変異源を加えて一
定時間インキュベート後、適当に希釈して寒天培地に植
菌し、変異株のコロニーを得るといった一般的な突然変
異操作を行うこともできる。変異源としては、ナイトロ
ジェンマスタード、メチルメタンサルホネート（ＭＭ
Ｓ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロソ−Ｎ−ニトロソグア
ニジン（ＮＴＧ）等のアルキル化剤や、５−プロモウラ
シル等の塩基類似体や、マイトマイシンＣ等の抗生物質
や、６−メルカプトプリン等の塩基合成阻害剤や、プロ
フラビン等の色素類（その他の誘導体）や、４−ニトロ
キノリン−Ｎ−オキシド等のある種の発がん剤や塩化マ
ンガン、ホルムアルデヒド等のその他の化合物を挙げる
ことができる。また使用する微生物は、生育菌体（菌糸
など）でも良いし、胞子でも良い。またモルティエレラ
属の変異株では例えば、本発明者らが誘導した突然変異
株モルティエレラ・アルピナＳＡＭ１８６１（微工研菌
条第３５９０号）を使用することができる。
高度不飽和脂肪酸生産能を有する微生物であれば、すべ
て使用することができる。さらに具体的には、Δ５不飽
和化活性およびΔ６不飽和化活性を有しかつΔ１２不飽
和化活性の低下または欠失した微生物、使用することが
でき、例えばアラキドン酸生産能を有する微生物から誘
導される突然変異株を挙げることができる。アラキドン
酸生産能を有する微生物としては、モルティエレラ（Ｍ
ｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属、コニディオボラス（Ｃｏｎ
ｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属、フィチウム（Ｐｙｔｈｉｕ
ｍ）属、フィトフトラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｏｒａ）属、
ペニシリューム（Ｐｅｎｉｓｉｌｌｉｕｍ）属、クラド
スポリューム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、ムコー
ル（Ｍｕｃｏｒ）属、フザリューム（Ｆｕｓａｒｉｕ
ｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）
属、ロードトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、エン
トモフトラ（Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ）属に属する
菌株が挙げられる。モルティエレラ属では例えば、モル
ティエレラ・エロンガタ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｅ
ｌｏｎｇａｔａ）、モルティエレラ・エキシグア（Ｍｏ
ｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｅｘｉｇｕａ）、モルティエレラ
・ヒグロフィラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｈｙｇｒｏ
ｐｈｉｌａ）、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉ
ｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）等のモルティエレラ亜属
に属する菌株を挙げることができる。突然変異を誘発さ
せるためには、放射線（Ｘ線、ガンマー線、中性子線）
照射や紫外線照射、高熱処理等を行ったり、また微生物
を適当なバッファー中などに懸濁し、変異源を加えて一
定時間インキュベート後、適当に希釈して寒天培地に植
菌し、変異株のコロニーを得るといった一般的な突然変
異操作を行うこともできる。変異源としては、ナイトロ
ジェンマスタード、メチルメタンサルホネート（ＭＭ
Ｓ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロソ−Ｎ−ニトロソグア
ニジン（ＮＴＧ）等のアルキル化剤や、５−プロモウラ
シル等の塩基類似体や、マイトマイシンＣ等の抗生物質
や、６−メルカプトプリン等の塩基合成阻害剤や、プロ
フラビン等の色素類（その他の誘導体）や、４−ニトロ
キノリン−Ｎ−オキシド等のある種の発がん剤や塩化マ
ンガン、ホルムアルデヒド等のその他の化合物を挙げる
ことができる。また使用する微生物は、生育菌体（菌糸
など）でも良いし、胞子でも良い。またモルティエレラ
属の変異株では例えば、本発明者らが誘導した突然変異
株モルティエレラ・アルピナＳＡＭ１８６１（微工研菌
条第３５９０号）を使用することができる。
【０００９】オメガ９系高度不飽和脂肪酸を有する微生
物を培養して得られるオメガ９系高度不飽和脂肪酸は、
例えば６，９−オクタジエン酸、８，１１−エイコサジ
エン酸、５，８，１１−エイコサトリエン酸（ミード
酸）等を挙げることができる。本発明に使用される菌株
を培養する為には、その菌株の胞子、菌糸、又は予め培
養して得られた前培養液を、液体培地又は固体培地に接
種し培養する。液体培地の場合に、炭素源としてはグル
コース、フラクトース、キシロース、サッカロース、マ
ルトース、可溶性デンプン、糖蜜、グリセロール、マン
ニトール等の一般的に使用されているものが、いずれも
使用できるが、これらに限られるものではない。窒素源
としてはペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキ
ス、カザミノ酸、コーンスティプリカー等の天然窒素源
の他に、尿素等の有機窒素源、ならびに硝酸ナトリウ
ム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等の無機窒素
源を用いることができる。この他必要に応じリン酸塩、
硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸銅等の無機塩及びビタ
ミン等も微量栄養源として使用できる。これらの培地成
分は微生物の成育を害しない濃度であれば特に制限はな
い。実用上一般に、炭素源は０．１〜３０重量％、好ま
しくは１〜１０重量％、窒素源は０．０１〜５重量％、
好ましくは０．１〜２重量％の濃度とするのが良い。
物を培養して得られるオメガ９系高度不飽和脂肪酸は、
例えば６，９−オクタジエン酸、８，１１−エイコサジ
エン酸、５，８，１１−エイコサトリエン酸（ミード
酸）等を挙げることができる。本発明に使用される菌株
を培養する為には、その菌株の胞子、菌糸、又は予め培
養して得られた前培養液を、液体培地又は固体培地に接
種し培養する。液体培地の場合に、炭素源としてはグル
コース、フラクトース、キシロース、サッカロース、マ
ルトース、可溶性デンプン、糖蜜、グリセロール、マン
ニトール等の一般的に使用されているものが、いずれも
使用できるが、これらに限られるものではない。窒素源
としてはペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキ
ス、カザミノ酸、コーンスティプリカー等の天然窒素源
の他に、尿素等の有機窒素源、ならびに硝酸ナトリウ
ム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等の無機窒素
源を用いることができる。この他必要に応じリン酸塩、
硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸銅等の無機塩及びビタ
ミン等も微量栄養源として使用できる。これらの培地成
分は微生物の成育を害しない濃度であれば特に制限はな
い。実用上一般に、炭素源は０．１〜３０重量％、好ま
しくは１〜１０重量％、窒素源は０．０１〜５重量％、
好ましくは０．１〜２重量％の濃度とするのが良い。
【００１０】培養温度は５〜４０℃、好ましくは２０〜
３０℃とし、培地のpHは４〜１０、好ましくは６〜９と
して通気攪拌培養、振盪培養、又は静置培養を行う。培
養は通常２〜１０日間行う。固体培地で培養する場合
は、固形物重量に対して５０〜１００重量％の水を加え
たふすま、もみがら、米ぬか等を用い、５〜４０℃、好
ましくは２０〜３０℃の温度において、３〜１４日間培
養を行う。この場合に必要に応じて培地中に窒素源、無
機塩類、微量栄養源を加えることができる。また、本発
明においては、オメガ９系高度不飽和脂肪酸生産能を有
する微生物の培地中に、オメガ９系高度不飽和脂肪酸の
基質を添加して培養することにより、オメガ９系高度不
飽和脂肪酸の蓄積を促進することもできる。テトラデカ
ン、ヘキサデカン、オクタデカン等の炭化水素、テトラ
デカン酸、ヘキサデカン酸、オクタデカン酸等の脂肪酸
又はその塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩等）及び
エステル、又は脂肪酸が構成成分として含まれる油脂
（例えば、オリーブ油、ヤシ油、綿実油）等を挙げるこ
とができるが、これらに限られるものではない。基質の
総添加量は培地に対して０．００１〜１０重量％、好ま
しくは０．５〜１０重量％である。これらの基質は生産
微生物を接種する前又はその直後に加えてもよく、又は
培養を開始した後に加えてもよく、あるいは両時点で加
えてもよい。培養開始後の添加は１回でもよく、又は複
数回に分けて間欠的に添加してもよい。あるいは、連続
的に添加することもできる。又、これらの基質を唯一の
炭素源として培養してもよい。
３０℃とし、培地のpHは４〜１０、好ましくは６〜９と
して通気攪拌培養、振盪培養、又は静置培養を行う。培
養は通常２〜１０日間行う。固体培地で培養する場合
は、固形物重量に対して５０〜１００重量％の水を加え
たふすま、もみがら、米ぬか等を用い、５〜４０℃、好
ましくは２０〜３０℃の温度において、３〜１４日間培
養を行う。この場合に必要に応じて培地中に窒素源、無
機塩類、微量栄養源を加えることができる。また、本発
明においては、オメガ９系高度不飽和脂肪酸生産能を有
する微生物の培地中に、オメガ９系高度不飽和脂肪酸の
基質を添加して培養することにより、オメガ９系高度不
飽和脂肪酸の蓄積を促進することもできる。テトラデカ
ン、ヘキサデカン、オクタデカン等の炭化水素、テトラ
デカン酸、ヘキサデカン酸、オクタデカン酸等の脂肪酸
又はその塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩等）及び
エステル、又は脂肪酸が構成成分として含まれる油脂
（例えば、オリーブ油、ヤシ油、綿実油）等を挙げるこ
とができるが、これらに限られるものではない。基質の
総添加量は培地に対して０．００１〜１０重量％、好ま
しくは０．５〜１０重量％である。これらの基質は生産
微生物を接種する前又はその直後に加えてもよく、又は
培養を開始した後に加えてもよく、あるいは両時点で加
えてもよい。培養開始後の添加は１回でもよく、又は複
数回に分けて間欠的に添加してもよい。あるいは、連続
的に添加することもできる。又、これらの基質を唯一の
炭素源として培養してもよい。
【００１１】このようにして培養して、菌体内にオメガ
９系高度不飽和脂肪酸を大量に含有する脂質が生成蓄積
される。液体培地を使用した場合には、培養菌体から、
例えば、次のようにしてオメガ９系高度不飽和脂肪酸の
採取を行う。培養終了後、培養液より遠心分離及び濾過
等の常用の固液分離手段により培養菌体を得る。菌体は
十分水洗し、好ましくは乾燥する。乾燥は凍結乾燥、風
乾等によって行うことができる。乾燥菌体は、好ましく
は窒素気流下で有機溶媒によって抽出処理する。有機溶
媒としてはエーテル、ヘキサン、メタノール、エタノー
ル、クロロホルム、ジクロロメタン、石油エーテル等を
用いることができ、又メタノールと石油エーテルの交互
抽出やクロロホルム−メタノール−水の一層系の溶媒を
用いた抽出によっても良好な結果を得ることができる。
抽出物から減圧下で有機溶媒を留去することにより、高
濃度のオメガ９系高度不飽和脂肪酸を含有した脂質が得
られる。
９系高度不飽和脂肪酸を大量に含有する脂質が生成蓄積
される。液体培地を使用した場合には、培養菌体から、
例えば、次のようにしてオメガ９系高度不飽和脂肪酸の
採取を行う。培養終了後、培養液より遠心分離及び濾過
等の常用の固液分離手段により培養菌体を得る。菌体は
十分水洗し、好ましくは乾燥する。乾燥は凍結乾燥、風
乾等によって行うことができる。乾燥菌体は、好ましく
は窒素気流下で有機溶媒によって抽出処理する。有機溶
媒としてはエーテル、ヘキサン、メタノール、エタノー
ル、クロロホルム、ジクロロメタン、石油エーテル等を
用いることができ、又メタノールと石油エーテルの交互
抽出やクロロホルム−メタノール−水の一層系の溶媒を
用いた抽出によっても良好な結果を得ることができる。
抽出物から減圧下で有機溶媒を留去することにより、高
濃度のオメガ９系高度不飽和脂肪酸を含有した脂質が得
られる。
【００１２】また、上記の方法に代えて湿菌体を用いて
抽出を行うことができる。メタノール、エタノール等の
水に対して相溶性の溶媒、又はこれらと水及び／又は他
の溶媒とから成る水に対して相溶性の混合溶媒を使用す
る。その他の手順は上記と同様である。上記のようにし
て得られた脂質中には、各種オメガ９系高度不飽和脂肪
酸が脂質化合物、例えば脂肪の構成成分として含まれて
いる。これらを直接分離することもできるが、低級アル
コールとのエステル、例えば８，１１−エイコサジエン
酸メチル、９，１２−オクタジエン酸メチル、ミード酸
メチル等として分離するのが好ましい。このようなエス
テルにすることにより、他の脂質成分から容易に分離す
ることができ、また、培養中に生成する他の脂肪酸、例
えばパルミチン酸、オレイン酸等（これらも、オメガ９
系高度不飽和脂肪酸のエステル化に際してエステル化さ
れる）から容易に分離することができる。例えば、オメ
ガ９系高度不飽和脂肪酸のメチルエステルを得るには、
前記の抽出脂質を無水エタノール−塩酸５〜１０％、Ｂ
Ｆ3 −メタノール１０〜５０％等により、室温にて１〜
２４時間処理するのが好ましい。
抽出を行うことができる。メタノール、エタノール等の
水に対して相溶性の溶媒、又はこれらと水及び／又は他
の溶媒とから成る水に対して相溶性の混合溶媒を使用す
る。その他の手順は上記と同様である。上記のようにし
て得られた脂質中には、各種オメガ９系高度不飽和脂肪
酸が脂質化合物、例えば脂肪の構成成分として含まれて
いる。これらを直接分離することもできるが、低級アル
コールとのエステル、例えば８，１１−エイコサジエン
酸メチル、９，１２−オクタジエン酸メチル、ミード酸
メチル等として分離するのが好ましい。このようなエス
テルにすることにより、他の脂質成分から容易に分離す
ることができ、また、培養中に生成する他の脂肪酸、例
えばパルミチン酸、オレイン酸等（これらも、オメガ９
系高度不飽和脂肪酸のエステル化に際してエステル化さ
れる）から容易に分離することができる。例えば、オメ
ガ９系高度不飽和脂肪酸のメチルエステルを得るには、
前記の抽出脂質を無水エタノール−塩酸５〜１０％、Ｂ
Ｆ3 −メタノール１０〜５０％等により、室温にて１〜
２４時間処理するのが好ましい。
【００１３】前記の処理液からオメガ９系高度不飽和脂
肪酸メチルエステルを回収するにはヘキサン、エーテ
ル、酢酸エチル等の有機溶媒で抽出するのが好ましい。
次に、この抽出液を無水硫酸ナトリウム等により乾燥
し、有機溶媒を好ましくは減圧下で留去することにより
主として脂肪酸エステルからなる混合物が得られる。こ
の混合物中には、目的とするオメガ９系高度不飽和脂肪
酸メチルエステルの他に、パルミチン酸メチルエステ
ル、ステアリン酸メチルエステル、オレイン酸メチルエ
ステル等の脂肪酸メチルエステルが含まれている。これ
らの脂肪酸メチルエステル混合物からオメガ９系高度不
飽和脂肪酸メチルエステルを単離するには、カラムクロ
マトグラフィー、低温結晶化法、尿素包接法、液々交流
分配クロマトグラフィー等を単独で、又は組み合わせて
使用することができる。
肪酸メチルエステルを回収するにはヘキサン、エーテ
ル、酢酸エチル等の有機溶媒で抽出するのが好ましい。
次に、この抽出液を無水硫酸ナトリウム等により乾燥
し、有機溶媒を好ましくは減圧下で留去することにより
主として脂肪酸エステルからなる混合物が得られる。こ
の混合物中には、目的とするオメガ９系高度不飽和脂肪
酸メチルエステルの他に、パルミチン酸メチルエステ
ル、ステアリン酸メチルエステル、オレイン酸メチルエ
ステル等の脂肪酸メチルエステルが含まれている。これ
らの脂肪酸メチルエステル混合物からオメガ９系高度不
飽和脂肪酸メチルエステルを単離するには、カラムクロ
マトグラフィー、低温結晶化法、尿素包接法、液々交流
分配クロマトグラフィー等を単独で、又は組み合わせて
使用することができる。
【００１４】こうして単離された各種オメガ９系高度不
飽和脂肪酸メチルからオメガ９系高度不飽和脂肪酸を得
るには、アルカリで加水分解した後、エーテル、酢酸エ
チル等の有機溶媒で抽出すればよい。又、オメガ９系高
度不飽和脂肪酸をそのメチルエステルを経ないで採取す
るには、前記の抽出脂質をアルカリ分解（例えば５％水
酸化ナトリウムにより室温にて２〜３時間）した後、こ
の分解液から、脂肪酸の抽出・精製に常用されている方
法により抽出・精製することができる。
飽和脂肪酸メチルからオメガ９系高度不飽和脂肪酸を得
るには、アルカリで加水分解した後、エーテル、酢酸エ
チル等の有機溶媒で抽出すればよい。又、オメガ９系高
度不飽和脂肪酸をそのメチルエステルを経ないで採取す
るには、前記の抽出脂質をアルカリ分解（例えば５％水
酸化ナトリウムにより室温にて２〜３時間）した後、こ
の分解液から、脂肪酸の抽出・精製に常用されている方
法により抽出・精製することができる。
【００１５】次に、実施例により、この発明をさらに具
体的に説明する。
体的に説明する。
【００１６】
【実施例】実施例１． グルコース２％または４％及び酵母エキス１
％を含む培地（pH６．０）２mlを１０mlのエルレンマイ
ヤーフラスコに入れ、１２０℃で２０分間殺菌した。モ
ルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａ
ｌｐｉｎａ）の突然変異株ＳＡＭ１８６１を培地に１白
金耳接種し、レシプロシェーカー（１１０rpm ）によ
り、１２℃，２０℃，２８℃の３種類の温度で１０日間
培養した。
％を含む培地（pH６．０）２mlを１０mlのエルレンマイ
ヤーフラスコに入れ、１２０℃で２０分間殺菌した。モ
ルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａ
ｌｐｉｎａ）の突然変異株ＳＡＭ１８６１を培地に１白
金耳接種し、レシプロシェーカー（１１０rpm ）によ
り、１２℃，２０℃，２８℃の３種類の温度で１０日間
培養した。
【００１７】培養後、濾過により菌体を回収し、十分水
洗した後、遠心エバポレーター（６０℃、２時間）で乾
燥させ、そして、塩化メチレン２ml、無水メタノール−
塩酸（１０％）２ml加え、５０℃で３時間処理すること
によってメチルエステル化し、ｎ−ヘキサン４ml、水１
mlを加え、２回抽出し溶媒を遠心エバポレーター（４０
℃、１時間）で留去した後、得られた脂肪酸メチルエス
テルをガスクロマトグラフィーで分析した。表１にその
結果を示す。
洗した後、遠心エバポレーター（６０℃、２時間）で乾
燥させ、そして、塩化メチレン２ml、無水メタノール−
塩酸（１０％）２ml加え、５０℃で３時間処理すること
によってメチルエステル化し、ｎ−ヘキサン４ml、水１
mlを加え、２回抽出し溶媒を遠心エバポレーター（４０
℃、１時間）で留去した後、得られた脂肪酸メチルエス
テルをガスクロマトグラフィーで分析した。表１にその
結果を示す。
【００１８】
【表１】
【００１９】実施例２．グルコース２％及び酵母エキス
１％を含む培地（pH６．０）２．５ｌを５ｌのジャーフ
ァーメンターに入れ、１２０℃で３０分間殺菌した。モ
ルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａ
ｌｐｉｎａ）の突然変異株ＳＡＭ１８６１の前培養液４
０mlを接種し、２０℃，２４℃，２８℃の３通りの温度
で通気量１vvm 、７日間の通気攪拌培養を行なった。培
養２日目から５日目まで毎日１％のグルコースを添加し
た。培養終了後、各々の得られた菌体について、実施例
１のそれぞれの反応試薬量を５００倍にした条件で同様
にメチルエステル化し一部をとってガスクロマトグラフ
ィーで分析した。表２にその結果を示す。
１％を含む培地（pH６．０）２．５ｌを５ｌのジャーフ
ァーメンターに入れ、１２０℃で３０分間殺菌した。モ
ルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａ
ｌｐｉｎａ）の突然変異株ＳＡＭ１８６１の前培養液４
０mlを接種し、２０℃，２４℃，２８℃の３通りの温度
で通気量１vvm 、７日間の通気攪拌培養を行なった。培
養２日目から５日目まで毎日１％のグルコースを添加し
た。培養終了後、各々の得られた菌体について、実施例
１のそれぞれの反応試薬量を５００倍にした条件で同様
にメチルエステル化し一部をとってガスクロマトグラフ
ィーで分析した。表２にその結果を示す。
【００２０】
【表２】
【００２１】６，９−オクタジエン酸、８，１１−エイ
コサジエン酸、５，８，１１−エイコサトリエン酸（ミ
ード酸）を、得られた脂肪酸メチルエステルを逆相カラ
ム（５Ｃ18）、溶離液アセトニトリル−水（８５：１
５）を使って高速液体クロマトグラフィーで分取するこ
とにより単離した。それぞれ、質量分析、ＮＭＲ分析等
により、構造 同定、確認した。実施例３． グルコース２％、酵母エキス１％に、第３表
に示したオメガ９系高度不飽和脂肪酸の前駆体またはそ
れを含む油脂をそれぞれ０．５％添加した培地（pH６．
０）を用いて、モルティエレラ・アルピナの突然変異株
ＳＡＭ１８６１を用いて実施例１と同様の方法で培養を
実施した。表３にその結果を示す。
コサジエン酸、５，８，１１−エイコサトリエン酸（ミ
ード酸）を、得られた脂肪酸メチルエステルを逆相カラ
ム（５Ｃ18）、溶離液アセトニトリル−水（８５：１
５）を使って高速液体クロマトグラフィーで分取するこ
とにより単離した。それぞれ、質量分析、ＮＭＲ分析等
により、構造 同定、確認した。実施例３． グルコース２％、酵母エキス１％に、第３表
に示したオメガ９系高度不飽和脂肪酸の前駆体またはそ
れを含む油脂をそれぞれ０．５％添加した培地（pH６．
０）を用いて、モルティエレラ・アルピナの突然変異株
ＳＡＭ１８６１を用いて実施例１と同様の方法で培養を
実施した。表３にその結果を示す。
【００２２】
【表３】
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年８月１２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００８】
【具体的な説明】本発明の方法においては、オメガ９系
高度不飽和脂肪酸生産能を有する微生物であれば、すべ
て使用することができる。さらに具体的には、Δ５不飽
和化活性およびΔ６不飽和化活性を有しかつΔ１２不飽
和化活性の低下または欠失した微生物を使用することが
でき、例えばアラキドン酸生産能を有する微生物から誘
導される突然変異株を挙げることができる。アラキドン
酸生産能を有する微生物としては、モルティエレラ（Ｍ
ｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属、コニディオボラス（Ｃｏｎ
ｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属、フィチウム（Ｐｙｔｈｉｕ
ｍ）属、フィトフトラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｏｒａ）属、
ペニシリューム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、クラド
スポリューム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、ムコー
ル（Ｍｕｃｏｒ）属、フザリューム（Ｆｕｓａｒｉｕ
ｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）
属、ロードトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、エン
トモフトラ（Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ）属に属する
菌株が挙げられる。モルティエレラ属では例えば、モル
ティエレラ・エロンガタ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｅ
ｌｏｎｇａｔａ）、モルティエレラ・エキシグア（Ｍｏ
ｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｅｘｉｇｕａ）、モルティエレラ
・ヒグロフィラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｈｙｇｒｏ
ｐｈｉｌａ）、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉ
ｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）等のモルティエレラ亜属
に属する菌株を挙げることができる。突然変異を誘発さ
せるためには、放射線（Ｘ線、ガンマー線、中性子線）
照射や紫外線照射、高熱処理等を行ったり、また微生物
を適当なバッファー中などに懸濁し、変異源を加えて一
定時間インキュベート後、適当に希釈して寒天培地に植
菌し、変異株のコロニーを得るといった一般的な突然変
異操作を行うこともできる。変異源としては、ナイトロ
ジェンマスタード、メチルメタンサルホネート（ＭＭ
Ｓ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロソ−Ｎ−ニトロソグア
ニジン（ＮＴＧ）等のアルキル化剤や、５−ブロモウラ
シル等の塩基類似体や、マイトマイシンＣ等の抗生物質
や、６−メルカプトプリン等の塩基合成阻害剤や、プロ
フラビン等の色素類（その他の誘導体）や、４−ニトロ
キノリン−Ｎ−オキシド等のある種の発がん剤や塩化マ
ンガン、ホルムアルデヒド等のその他の化合物を挙げる
ことができる。また使用する微生物は、生育菌体（菌糸
など）でも良いし、胞子でも良い。またモルティエレラ
属の変異株では例えば、本発明者らが誘導した突然変異
株モルティエレラ・アルピナＳＡＭ１８６１（微工研条
寄第３５９０号，ＦＥＲＭ ＢＰ−３５９０）を使用す
ることができる。
高度不飽和脂肪酸生産能を有する微生物であれば、すべ
て使用することができる。さらに具体的には、Δ５不飽
和化活性およびΔ６不飽和化活性を有しかつΔ１２不飽
和化活性の低下または欠失した微生物を使用することが
でき、例えばアラキドン酸生産能を有する微生物から誘
導される突然変異株を挙げることができる。アラキドン
酸生産能を有する微生物としては、モルティエレラ（Ｍ
ｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属、コニディオボラス（Ｃｏｎ
ｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属、フィチウム（Ｐｙｔｈｉｕ
ｍ）属、フィトフトラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｏｒａ）属、
ペニシリューム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、クラド
スポリューム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、ムコー
ル（Ｍｕｃｏｒ）属、フザリューム（Ｆｕｓａｒｉｕ
ｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）
属、ロードトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、エン
トモフトラ（Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ）属に属する
菌株が挙げられる。モルティエレラ属では例えば、モル
ティエレラ・エロンガタ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｅ
ｌｏｎｇａｔａ）、モルティエレラ・エキシグア（Ｍｏ
ｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｅｘｉｇｕａ）、モルティエレラ
・ヒグロフィラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｈｙｇｒｏ
ｐｈｉｌａ）、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉ
ｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）等のモルティエレラ亜属
に属する菌株を挙げることができる。突然変異を誘発さ
せるためには、放射線（Ｘ線、ガンマー線、中性子線）
照射や紫外線照射、高熱処理等を行ったり、また微生物
を適当なバッファー中などに懸濁し、変異源を加えて一
定時間インキュベート後、適当に希釈して寒天培地に植
菌し、変異株のコロニーを得るといった一般的な突然変
異操作を行うこともできる。変異源としては、ナイトロ
ジェンマスタード、メチルメタンサルホネート（ＭＭ
Ｓ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロソ−Ｎ−ニトロソグア
ニジン（ＮＴＧ）等のアルキル化剤や、５−ブロモウラ
シル等の塩基類似体や、マイトマイシンＣ等の抗生物質
や、６−メルカプトプリン等の塩基合成阻害剤や、プロ
フラビン等の色素類（その他の誘導体）や、４−ニトロ
キノリン−Ｎ−オキシド等のある種の発がん剤や塩化マ
ンガン、ホルムアルデヒド等のその他の化合物を挙げる
ことができる。また使用する微生物は、生育菌体（菌糸
など）でも良いし、胞子でも良い。またモルティエレラ
属の変異株では例えば、本発明者らが誘導した突然変異
株モルティエレラ・アルピナＳＡＭ１８６１（微工研条
寄第３５９０号，ＦＥＲＭ ＢＰ−３５９０）を使用す
ることができる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１０】培養温度は５〜４０℃、好ましくは２０〜
３０℃とし、培地のpHは４〜１０、好ましくは６〜９と
して通気攪拌培養、振盪培養、又は静置培養を行う。培
養は通常２〜１０日間行う。固体培地で培養する場合
は、固形物重量に対して５０〜１００重量％の水を加え
たふすま、もみがら、米ぬか等を用い、５〜４０℃、好
ましくは２０〜３０℃の温度において、３〜１４日間培
養を行う。この場合に必要に応じて培地中に窒素源、無
機塩類、微量栄養源を加えることができる。また、本発
明においては、オメガ９系高度不飽和脂肪酸生産能を有
する微生物の培地中に、オメガ９系高度不飽和脂肪酸の
基質を添加して培養することにより、オメガ９系高度不
飽和脂肪酸の蓄積を促進することもできる。テトラデカ
ン、ヘキサデカン、オクタデカン等の炭化水素、テトラ
デカン酸、ヘキサデカン酸、オクタデカン酸等の脂肪酸
又はその塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩等）及び
エステル、又は脂肪酸が構成成分として含まれる油脂
（例えば、オリーブ油、ヤシ油、パーム油）等を挙げる
ことができるが、これらに限られるものではない。基質
の総添加量は培地に対して０．００１〜１０重量％、好
ましくは０．５〜１０重量％である。これらの基質は生
産微生物を接種する前又はその直後に加えてもよく、又
は培養を開始した後に加えてもよく、あるいは両時点で
加えてもよい。培養開始後の添加は１回でもよく、又は
複数回に分けて間欠的に添加してもよい。あるいは、連
続的に添加することもできる。又、これらの基質を唯一
の炭素源として培養してもよい。
３０℃とし、培地のpHは４〜１０、好ましくは６〜９と
して通気攪拌培養、振盪培養、又は静置培養を行う。培
養は通常２〜１０日間行う。固体培地で培養する場合
は、固形物重量に対して５０〜１００重量％の水を加え
たふすま、もみがら、米ぬか等を用い、５〜４０℃、好
ましくは２０〜３０℃の温度において、３〜１４日間培
養を行う。この場合に必要に応じて培地中に窒素源、無
機塩類、微量栄養源を加えることができる。また、本発
明においては、オメガ９系高度不飽和脂肪酸生産能を有
する微生物の培地中に、オメガ９系高度不飽和脂肪酸の
基質を添加して培養することにより、オメガ９系高度不
飽和脂肪酸の蓄積を促進することもできる。テトラデカ
ン、ヘキサデカン、オクタデカン等の炭化水素、テトラ
デカン酸、ヘキサデカン酸、オクタデカン酸等の脂肪酸
又はその塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩等）及び
エステル、又は脂肪酸が構成成分として含まれる油脂
（例えば、オリーブ油、ヤシ油、パーム油）等を挙げる
ことができるが、これらに限られるものではない。基質
の総添加量は培地に対して０．００１〜１０重量％、好
ましくは０．５〜１０重量％である。これらの基質は生
産微生物を接種する前又はその直後に加えてもよく、又
は培養を開始した後に加えてもよく、あるいは両時点で
加えてもよい。培養開始後の添加は１回でもよく、又は
複数回に分けて間欠的に添加してもよい。あるいは、連
続的に添加することもできる。又、これらの基質を唯一
の炭素源として培養してもよい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１６】
【実施例】実施例１． グルコース２％または４％及び酵母エキス１
％を含む培地（pH６．０）２mlを１０mlのエルレンマイ
ヤーフラスコに入れ、１２０℃で２０分間殺菌した。モ
ルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａ
ｌｐｉｎａ）の突然変異株ＳＡＭ１８６１を培地に１白
金耳接種し、レシプロシェーカー（１１０rpm ）によ
り、１２℃，２０℃，２８℃の３種類の温度で１０日間
培養した。
％を含む培地（pH６．０）２mlを１０mlのエルレンマイ
ヤーフラスコに入れ、１２０℃で２０分間殺菌した。モ
ルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａ
ｌｐｉｎａ）の突然変異株ＳＡＭ１８６１を培地に１白
金耳接種し、レシプロシェーカー（１１０rpm ）によ
り、１２℃，２０℃，２８℃の３種類の温度で１０日間
培養した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１９】実施例２．グルコース２％及び酵母エキス
１％を含む培地（pH６．０）２．５ｌを５ｌのジャーフ
ァーメンターに入れ、１２０℃で３０分間殺菌した。モ
ルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａ
ｌｐｉｎａ）の突然変異株ＳＡＭ１８６１の前培養液４
０mlを接種し、２０℃，２４℃，２８℃の３通りの温度
で通気量１vvm 、７日間の通気攪拌培養を行なった。培
養２日目から５日目まで毎日１％のグルコースを添加し
た。培養終了後、各々の得られた菌体について、実施例
１のそれぞれの反応試薬量を５００倍にした条件で同様
にメチルエステル化し一部をとってガスクロマトグラフ
ィーで分析した。表２にその結果を示す。
１％を含む培地（pH６．０）２．５ｌを５ｌのジャーフ
ァーメンターに入れ、１２０℃で３０分間殺菌した。モ
ルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａ
ｌｐｉｎａ）の突然変異株ＳＡＭ１８６１の前培養液４
０mlを接種し、２０℃，２４℃，２８℃の３通りの温度
で通気量１vvm 、７日間の通気攪拌培養を行なった。培
養２日目から５日目まで毎日１％のグルコースを添加し
た。培養終了後、各々の得られた菌体について、実施例
１のそれぞれの反応試薬量を５００倍にした条件で同様
にメチルエステル化し一部をとってガスクロマトグラフ
ィーで分析した。表２にその結果を示す。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２１】６，９−オクタジエン酸、８，１１−エイ
コサジエン酸、５，８，１１−エイコサトリエン酸（ミ
ード酸）を、得られた脂肪酸メチルエステルを逆相カラ
ム（５Ｃ18）、溶離液アセトニトリル−水（８５：１
５）を使って高速液体クロマトグラフィーで分取するこ
とにより単離した。それぞれ、質量分析、ＮＭＲ分析等
により、構造を同定、確認した。実施例３． グルコース２％、酵母エキス１％に、第３表
に示したオメガ９系高度不飽和脂肪酸の前駆体またはそ
れを含む油脂をそれぞれ０．５％添加した培地（pH６．
０）を用いて、モルティエレラ・アルピナの突然変異株
ＳＡＭ１８６１を用いて実施例１と同様の方法で培養を
実施した。表３にその結果を示す。
コサジエン酸、５，８，１１−エイコサトリエン酸（ミ
ード酸）を、得られた脂肪酸メチルエステルを逆相カラ
ム（５Ｃ18）、溶離液アセトニトリル−水（８５：１
５）を使って高速液体クロマトグラフィーで分取するこ
とにより単離した。それぞれ、質量分析、ＮＭＲ分析等
により、構造を同定、確認した。実施例３． グルコース２％、酵母エキス１％に、第３表
に示したオメガ９系高度不飽和脂肪酸の前駆体またはそ
れを含む油脂をそれぞれ０．５％添加した培地（pH６．
０）を用いて、モルティエレラ・アルピナの突然変異株
ＳＡＭ１８６１を用いて実施例１と同様の方法で培養を
実施した。表３にその結果を示す。
【手続補正書】
【提出日】平成４年１０月２９日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００９】オメガ９系高度不飽和脂肪酸を有する微生
物を培養して得られるオメガ９系高度不飽和脂肪酸は、
例えば６，９−オクタデカジエン酸、８，１１−エイコ
サジエン酸、５，８，１１−エイコサトリエン酸（ミー
ド酸）等を挙げることができる。本発明に使用される菌
株を培養する為には、その菌株の胞子、菌糸、又は予め
培養して得られた前培養液を、液体培地又は固体培地に
接種し培養する。液体培地の場合に、炭素源としてはグ
ルコース、フラクトース、キシロース、サッカロース、
マルトース、可溶性デンプン、糖蜜、グリセロール、マ
ンニトール等の一般的に使用されているものが、いずれ
も使用できるが、これらに限られるものではない。窒素
源としてはペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキ
ス、カザミノ酸、コーンスティプリカー等の天然窒素源
の他に、尿素等の有機窒素源、ならびに硝酸ナトリウ
ム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等の無機窒素
源を用いることができる。この他必要に応じリン酸塩、
硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸銅等の無機塩及びビタ
ミン等も微量栄養源として使用できる。これらの培地成
分は微生物の成育を害しない濃度であれば特に制限はな
い。実用上一般に、炭素源は０．１〜３０重量％、好ま
しくは１〜１０重量％、窒素源は０．０１〜５重量％、
好ましくは０．１〜２重量％の濃度とするのが良い。
物を培養して得られるオメガ９系高度不飽和脂肪酸は、
例えば６，９−オクタデカジエン酸、８，１１−エイコ
サジエン酸、５，８，１１−エイコサトリエン酸（ミー
ド酸）等を挙げることができる。本発明に使用される菌
株を培養する為には、その菌株の胞子、菌糸、又は予め
培養して得られた前培養液を、液体培地又は固体培地に
接種し培養する。液体培地の場合に、炭素源としてはグ
ルコース、フラクトース、キシロース、サッカロース、
マルトース、可溶性デンプン、糖蜜、グリセロール、マ
ンニトール等の一般的に使用されているものが、いずれ
も使用できるが、これらに限られるものではない。窒素
源としてはペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキ
ス、カザミノ酸、コーンスティプリカー等の天然窒素源
の他に、尿素等の有機窒素源、ならびに硝酸ナトリウ
ム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等の無機窒素
源を用いることができる。この他必要に応じリン酸塩、
硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸銅等の無機塩及びビタ
ミン等も微量栄養源として使用できる。これらの培地成
分は微生物の成育を害しない濃度であれば特に制限はな
い。実用上一般に、炭素源は０．１〜３０重量％、好ま
しくは１〜１０重量％、窒素源は０．０１〜５重量％、
好ましくは０．１〜２重量％の濃度とするのが良い。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１２】また、上記の方法に代えて湿菌体を用いて
抽出を行うことができる。メタノール、エタノール等の
水に対して相溶性の溶媒、又はこれらと水及び／又は他
の溶媒とから成る水に対して相溶性の混合溶媒を使用す
る。その他の手順は上記と同様である。上記のようにし
て得られた脂質中には、各種オメガ９系高度不飽和脂肪
酸が脂質化合物、例えば脂肪の構成成分として含まれて
いる。これらを直接分離することもできるが、低級アル
コールとのエステル、例えば８，１１−エイコサジエン
酸メチル、９，１２−オクタデカジエン酸メチル、ミー
ド酸メチル等として分離するのが好ましい。このような
エステルにすることにより、他の脂質成分から容易に分
離することができ、また、培養中に生成する他の脂肪
酸、例えばパルミチン酸、オレイン酸等（これらも、オ
メガ９系高度不飽和脂肪酸のエステル化に際してエステ
ル化される）から容易に分離することができる。例え
ば、オメガ９系高度不飽和脂肪酸のメチルエステルを得
るには、前記の抽出脂質を無水エタノール−塩酸５〜１
０％、ＢＦ3 −メタノール１０〜５０％等により、室温
にて１〜２４時間処理するのが好ましい。
抽出を行うことができる。メタノール、エタノール等の
水に対して相溶性の溶媒、又はこれらと水及び／又は他
の溶媒とから成る水に対して相溶性の混合溶媒を使用す
る。その他の手順は上記と同様である。上記のようにし
て得られた脂質中には、各種オメガ９系高度不飽和脂肪
酸が脂質化合物、例えば脂肪の構成成分として含まれて
いる。これらを直接分離することもできるが、低級アル
コールとのエステル、例えば８，１１−エイコサジエン
酸メチル、９，１２−オクタデカジエン酸メチル、ミー
ド酸メチル等として分離するのが好ましい。このような
エステルにすることにより、他の脂質成分から容易に分
離することができ、また、培養中に生成する他の脂肪
酸、例えばパルミチン酸、オレイン酸等（これらも、オ
メガ９系高度不飽和脂肪酸のエステル化に際してエステ
ル化される）から容易に分離することができる。例え
ば、オメガ９系高度不飽和脂肪酸のメチルエステルを得
るには、前記の抽出脂質を無水エタノール−塩酸５〜１
０％、ＢＦ3 −メタノール１０〜５０％等により、室温
にて１〜２４時間処理するのが好ましい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１７】培養後、濾過により菌体を回収し、十分水
洗した後、遠心エバポレーター（６０℃、２時間）で乾
燥させ、そして、その乾燥菌体に塩化メチレン２ml、無
水メタノール−塩酸（１０％）２ml加え、５０℃で３時
間処理することによってメチルエステル化し、ｎ−ヘキ
サン４ml、水１mlを加え、２回抽出し、抽出液の溶媒を
遠心エバポレーター（４０℃、１時間）で留去した後、
得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィ
ーで分析した。表１にその結果を示す。
洗した後、遠心エバポレーター（６０℃、２時間）で乾
燥させ、そして、その乾燥菌体に塩化メチレン２ml、無
水メタノール−塩酸（１０％）２ml加え、５０℃で３時
間処理することによってメチルエステル化し、ｎ−ヘキ
サン４ml、水１mlを加え、２回抽出し、抽出液の溶媒を
遠心エバポレーター（４０℃、１時間）で留去した後、
得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィ
ーで分析した。表１にその結果を示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１８】
【表１】
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２２】
【表３】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 7/64 Ｃ１２Ｒ 1:80） (Ｃ１２Ｐ 7/64 Ｃ１２Ｒ 1:66）
Claims (7)
- 【請求項１】 オメガ９系高度不飽和脂肪酸生産能を有
する微生物を培養してオメガ９系高度不飽和脂肪酸、又
はオメガ９系高度不飽和脂肪酸を含有する脂質を生成せ
しめ、そしてオメガ９系高度不飽和脂肪酸を採取するこ
とを特徴とするオメガ９系高度不飽和脂肪酸の製造方
法。 - 【請求項２】 オメガ９系高度不飽和脂肪酸生産能を有
する微生物を培養してオメガ９系高度不飽和脂肪酸を含
有する脂質を採取することを特徴とするオメガ９系高度
不飽和脂肪酸を含有する脂質の製造方法。 - 【請求項３】 オメガ９系高度不飽和脂肪酸生産能を有
する微生物を、炭化水素、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂
肪酸塩またはこれらを構成成分として含む油脂を添加し
た培地で培養するか、あるいは該微生物が培養されてい
る培養液にこれらの基質を添加してさらに培養すること
によりオメガ９系高度不飽和脂肪酸、又はオメガ９系高
度不飽和脂肪酸を含有する脂質を生成せしめ、そしてオ
メガ９系高度不飽和脂肪酸を採取することを特徴とする
オメガ９系高度不飽和脂肪酸の製造方法。 - 【請求項４】 オメガ９系高度不飽和脂肪酸生産能を有
する微生物を、炭化水素、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂
肪酸塩またはこれらを構成成分として含む油脂を添加し
た培地で培養するか、あるいは該微生物が培養されてい
る培養液にこれらの基質を添加してさらに培養し、そし
てオメガ９系高度不飽和脂肪酸を含有する脂質を採取す
ることを特徴とするオメガ９系高度不飽和脂肪酸を含有
する脂質の製造方法。 - 【請求項５】 前記オメガ９系高度不飽和脂肪酸生産能
を有する微生物がΔ５不飽和化活性およびΔ６不飽和化
活性を有し、かつΔ１２不飽和化活性の低下または欠失
した微生物であることを特徴とする請求項１〜４記載の
オメガ９系高度不飽和脂肪酸又はこれを含有する脂質の
製造方法。 - 【請求項６】 前記オメガ９系高度不飽和脂肪酸生産能
を有する微生物がアラキドン酸生産能を有し、かつΔ１
２不飽和化活性の低下または欠失した微生物であること
を特徴とする請求項１〜４記載のオメガ９系高度不飽和
脂肪酸又はこれを含有する脂質の製造方法。 - 【請求項７】 前記オメガ９系高度不飽和脂肪酸生産能
を有する微生物が、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅ
ｌｌａ）属に属する微生物であることを特徴とする請求
項１〜６のいずれか１項に記載のオメガ９系高度不飽和
脂肪酸又はこれを含有する脂質の製造方法。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25196691A JP3354582B2 (ja) | 1991-09-30 | 1991-09-30 | オメガ９系高度不飽和脂肪酸およびこれを含有する脂質の製造方法 |
| CA002079367A CA2079367C (en) | 1991-09-30 | 1992-09-29 | Process for production of omega 9 type polyunsaturated fatty acid |
| US07/953,030 US5322780A (en) | 1991-09-30 | 1992-09-29 | Process for production of omega 9 type polyunsaturated fatty acid |
| DE69220746T DE69220746T2 (de) | 1991-09-30 | 1992-09-30 | Verfahren zur Herstellung einer mehrfach ungesättigten Fettsäure des Omega 9 Typs |
| EP92308927A EP0535939B1 (en) | 1991-09-30 | 1992-09-30 | Process for production of omega 9 type polyunsaturated fatty acid |
| ES92308927T ES2103895T3 (es) | 1991-09-30 | 1992-09-30 | Procedimiento para la produccion de acido graso poliinsaturado de tipo omega 9. |
| AT92308927T ATE155172T1 (de) | 1991-09-30 | 1992-09-30 | Verfahren zur herstellung einer mehrfach ungesättigten fettsäure des omega 9 typs |
| DK92308927.0T DK0535939T3 (da) | 1991-09-30 | 1992-09-30 | Fremgangsmåde til fremstilling af omega 9-type polyumættet fedtsyre |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25196691A JP3354582B2 (ja) | 1991-09-30 | 1991-09-30 | オメガ９系高度不飽和脂肪酸およびこれを含有する脂質の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0591888A true JPH0591888A (ja) | 1993-04-16 |
| JP3354582B2 JP3354582B2 (ja) | 2002-12-09 |
Family
ID=17230645
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25196691A Expired - Lifetime JP3354582B2 (ja) | 1991-09-30 | 1991-09-30 | オメガ９系高度不飽和脂肪酸およびこれを含有する脂質の製造方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5322780A (ja) |
| EP (1) | EP0535939B1 (ja) |
| JP (1) | JP3354582B2 (ja) |
| AT (1) | ATE155172T1 (ja) |
| CA (1) | CA2079367C (ja) |
| DE (1) | DE69220746T2 (ja) |
| DK (1) | DK0535939T3 (ja) |
| ES (1) | ES2103895T3 (ja) |
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| WO1998029558A1 (fr) | 1996-12-27 | 1998-07-09 | Suntory Limited | Milieu destine a la culture de micro-organismes et procede permettant de produire des acides gras insatures ou des lipides renfermant ceux-ci |
| US5834512A (en) * | 1993-05-28 | 1998-11-10 | Suntory Limited | Prevention and improvement of allergy caused by leucotriene B 4 |
| JP2005206476A (ja) * | 2004-01-20 | 2005-08-04 | Suntory Ltd | 肝障害を伴う肝臓疾患の予防又は改善剤 |
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| EP2239316A1 (en) | 2004-08-12 | 2010-10-13 | Nippon Suisan Kaisha, Ltd. | Method for polyunsaturated fatty acid production using novel cell preservation technique |
| US7863024B2 (en) | 2002-04-26 | 2011-01-04 | Suntory Holdings Limited | Process for producing highly unsaturated fatty acid-containing lipid |
| EP2333094A1 (en) | 2005-02-08 | 2011-06-15 | Nippon Suisan Kaisha, Ltd. | Production of polyunsaturated fatty acids using novel cell treatment method |
| EP2966172A1 (en) | 2002-10-11 | 2016-01-13 | Nippon Suisan Kaisha, Ltd. | Process for producing microbial fat or oil having lowered unsaponifiable matter content and said fat or oil |
| US9782378B2 (en) | 1999-08-13 | 2017-10-10 | Suntory Holdings Limited | Microorganisms that extracellularly secrete lipid particles encapsulating lipids |
Families Citing this family (9)
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|---|---|---|---|---|
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| JP3995290B2 (ja) * | 1996-08-23 | 2007-10-24 | サントリー株式会社 | オメガ９系高度不飽和脂肪酸及びそれを含有する脂質の製造方法 |
| JP3792309B2 (ja) * | 1996-08-30 | 2006-07-05 | サントリー株式会社 | 不飽和脂肪酸含有油脂の製造方法 |
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| KR101288258B1 (ko) * | 2002-06-19 | 2013-07-26 | 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. | 다가불포화 지방산을 함유하는 미생물 오일의 제조방법 |
| AU2004290051A1 (en) * | 2003-11-12 | 2005-05-26 | E.I. Dupont De Nemours And Company | Delta-15 desaturases suitable for altering levels of polyunsaturated fatty acids in oilseed plants and oleaginous yeast |
| FR2873934B1 (fr) * | 2004-08-06 | 2007-12-14 | Elysee Lab | Procede d'extraction de glycolipides riches en omega 3 a partir de matieres vegetales alimentaires ainsi que poudre riche en omega 3 obtenue suite a la mise en oeuvre de ce procede |
| CA2577676A1 (en) * | 2004-08-24 | 2006-03-02 | Suntory Limited | Process for production of microbial fat/oil containing discretional amount of diacylglycerol and said fat/oil |
Family Cites Families (12)
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| US5130242A (en) * | 1988-09-07 | 1992-07-14 | Phycotech, Inc. | Process for the heterotrophic production of microbial products with high concentrations of omega-3 highly unsaturated fatty acids |
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