JPH0578253A - Antineoplastic and immunoenhancing agent - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To provide an antineoplastic and immunoenhancing agent containing, as active ingredient, a culture filtrate of Bacillus stearothermophilus. CONSTITUTION:Bacillus stearothermophilus as a moderately thermophilic bacterium, pref. NCA-1503 strain (FERM P-4778) is aerobically cultured in a conventional medium. The resultant culture solution is filtered or centrifuged to remove the microbial from the filtrate, which is then sterilized or put to elimination of bacterial cells, and the product is, directly or after lyophilization or concentration, used as the objective antineoplastic and immunoenhanceing agent. The object filtrate is further put to extraction and/or separation by e.g. column chromatography to obtain a compound of the formula ((n) is 3-8; R1-R2 are each alkyl, phenyl or phenylalkyl) as active ingredient, e.g. 2-(hydroxyethyl) trisulfide.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、優れた抗腫瘍剤及び免
疫増強剤に関するものである。TECHNICAL FIELD The present invention relates to excellent antitumor agents and immunopotentiators.

【０００２】[0002]

【従来の技術】従来、抗腫瘍剤としては、各種の抗癌性
抗生物質、代謝拮抗物質及び免疫賦活物質などに分類さ
れる薬剤が使用されてきた。また、ビス（２−ヒドロキ
シエチル）ジスルフィドに免疫増強作用があることが知
られている。2. Description of the Related Art Conventionally, as antitumor agents, agents classified into various anticancer antibiotics, antimetabolites and immunostimulators have been used. It is also known that bis (2-hydroxyethyl) disulfide has an immunopotentiating action.

【０００３】[0003]

【発明が解決しようとする課題】従来使用されている上
記の薬剤は、その制癌効果がきわめて微弱であるか、制
癌効果が高い場合にも毒性がきわめて高いという欠点が
あった。The above-mentioned agents conventionally used have the drawback that their anti-cancer effect is extremely weak, or that even if they have a high anti-cancer effect, their toxicity is extremely high.

【０００４】[0004]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、悪性腫瘍
に対して制癌効果が高くかつ安全性の高い薬剤を見いだ
すべく鋭意検討を行ったところ、驚くべきことに中等度
好熱菌であるバチルス・ステアロサーモフイルス（Baci
llusstearothermophilus ）の培養ろ液中に目的の活性
を見いだし、さらにその有効成分を追求し、その構造を
明らかにすることにより本発明を完成するにいたった。Means for Solving the Problems The present inventors have conducted earnest studies to find a drug having a high antitumor effect and a high safety against a malignant tumor, and surprisingly, a moderate thermophile. Bacillus stearothermophilus ( Baci
The present invention was completed by finding the desired activity in the culture filtrate of ( llusstearothermophilus ), pursuing its active ingredient, and clarifying its structure.

【０００５】すなわち、本発明は、バチルス・ステアロ
サーモフイルス（Bacillus stear- othermophilus ）の
培養ろ液を有効成分とする抗腫瘍剤及び免疫増強剤並び
に下記の一般式Namely, the present invention is Bacillus steer Rosa Moff virus (Bacillus stear - othermophilus) antitumor agents and immune enhancer and culture filtrate of an active ingredient as well as the following formula

【０００６】[0006]

【化３】 [Chemical 3]

【０００７】（式中ｎは３〜８、Ｒ₁ 及びＲ₂ は水素原
子、アルキル、フェニルまたはフェニルアルキルを示
す。）で表される化合物を有効成分とする抗腫瘍剤及び
免疫増強剤を要旨とするものである。(Summary) An antitumor agent and an immunopotentiator comprising a compound represented by the formula (wherein n is 3 to 8 and R ₁ and R ₂ are hydrogen atom, alkyl, phenyl or phenylalkyl) as an active ingredient. It is what

【０００８】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
抗腫瘍剤及び免疫増強剤の有効成分は一般式化２（式中
ｎは３〜８、Ｒ₁ 及びＲ₂ は水素原子、アルキル、フェ
ニルまたはフェニルアルキルを示す。）で表される化合
物である。The present invention will be described in detail below. The active ingredients of the antitumor agent and immunopotentiator of the present invention are represented by the general formula 2 (wherein n is 3 to 8 and R ₁ and R ₂ are hydrogen atoms, alkyl, phenyl or phenylalkyl). It is a compound.

【０００９】具体的な化合物としてはビス（２−ヒドロ
キシエチル）トリスルフィド、ビス（２−ヒドロキシヘ
キシル）トリスルフィド、ビス（２−ヒドロキシフェニ
ルプロピル）トリスルフィド、ビス（２−ヒドロキシフ
ェニルブチル）トリスルフィドなどがあげられる。Specific compounds include bis (2-hydroxyethyl) trisulfide, bis (2-hydroxyhexyl) trisulfide, bis (2-hydroxyphenylpropyl) trisulfide and bis (2-hydroxyphenylbutyl) trisulfide. Etc.

【００１０】本発明における有効成分である化合物は公
知の化合物であり、ゴム加工の際の加硫（日本ゴム協会
誌４４巻、１２号、１０１０〜１０１４頁、１９７１
年）、染料（特開昭５７−１９２４６６）などとして利
用されているものである。The compound as the active ingredient in the present invention is a known compound, and is vulcanized during rubber processing (Japanese Rubber Association, Vol. 44, No. 12, 1010-1014, 1971).
Year) and dyes (JP-A-57-192466).

【００１１】本発明における有効成分である化合物を得
るための方法としては、バチルス・ステアロサーモフイ
ルス（Bacillus stearothermophilus ）の培養ろ液から
抽出精製する方法と共に有機合成法での製造も可能であ
る。As a method for obtaining a compound which is an active ingredient in the present invention, it is possible to use a method of extracting and purifying from a culture filtrate of Bacillus stearothermophilus as well as a method of producing by an organic synthesis method.

【００１２】まず、バチルス・ステアロサーモフイルス
（Bacillusstearothermophilus ）の培養ろ液から抽出
精製する方法について詳細に述べる。本発明で用いられ
るバチルス・ステアロサーモフイルス（Bacillus stear
othermophilus ）としては、菌株に限定されるものでは
なく、具体例としては例えば、ＮＣＡ−１５０３（微工
研菌寄第４７７８号）、ＵＫ７８８（微工研条寄第２３
７３号）、ＵＫ５６３（微工研菌寄第７２７５号）、Ｉ
ＦＯ−１２５５０、ＩＦＯ−１２９８３，ＩＦＯ−１３
７３７、ＡＴＣＣ−７９５３（微工研菌寄第４７７５
号）、ＡＴＣＣ−８００５（微工研菌寄第４７７６
号）、ＡＴＣＣ−１０１４９（微工研菌寄第４７７７
号）ＡＴＣＣ−１２０１６、ＡＴＣＣ−１２９７６、Ａ
ＴＣＣ−１２９７７，ＡＴＣＣ−１２９７８、ＡＴＣＣ
−１２９７９、ＡＴＣＣ−１２９８０、ＡＴＣＣ−１５
９５１、ＡＴＣＣ−１２９５２、ＡＴＣＣ−２１３６５
などが挙げられる。これらの中で、ＮＣＡ−１５０３
（微工研菌寄第４７７８号）が培養ろ液中の抗腫瘍活性
が高く目的を達成するために最も好都合である。First, the method for extracting and purifying from the culture filtrate of Bacillus stearothermophilus will be described in detail. Bacillus stearophilus used in the present invention
othermophilus ) is not limited to strains, and specific examples thereof include NCA-1503 (Microtechnical Research No. 4778), UK788 (Microtechnical Research Article 23).
No. 73), UK563 (Ministry of Microbiology Research Institute No. 7275), I
FO-12550, IFO-12983, IFO-13
737 and ATCC-7953
No.), ATCC-8005 (Microtech Lab.
No.), ATCC-10149 (Ministry of Industrial Science and Technology, No. 4777)
No.) ATCC-12016, ATCC-12976, A
TCC-12977, ATCC-12978, ATCC
-12979, ATCC-12980, ATCC-15
951, ATCC-12952, ATCC-21365
And so on. Among these, NCA-1503
(Microtechnology Research Institute No. 4778) is the most convenient for achieving the purpose because of high antitumor activity in the culture filtrate.

【００１３】これらの菌株の培養には一般によく用いら
れる培地を使用することができる。具体的には、炭素源
としてはブドウ糖、乳糖、でんぷん、糖蜜などの糖類が
使用できる。また窒素源としてはペプトン、肉エキス、
酵母エキスなどの有機の窒素源と共に塩化アンモニウ
ム、硫酸アンモニウムなどの無機の窒素源も使用するこ
とができる。また必要に応じてビタミン、ミネラルを添
加してもよい。For culturing these strains, a medium that is commonly used can be used. Specifically, sugars such as glucose, lactose, starch and molasses can be used as the carbon source. Also, as the nitrogen source, peptone, meat extract,
Inorganic nitrogen sources such as ammonium chloride and ammonium sulfate can be used together with organic nitrogen sources such as yeast extract. In addition, vitamins and minerals may be added if necessary.

【００１４】培養条件としては、好気培養が採用され、
例えば５８℃、１時間から１２時間培養することにより
培養液を得ることができる。さらに、新鮮な培地を一定
速度で供給しながら培養する連続培養法も適用できる。
培地及び培養条件は上記の条件に応じて適宜選定するこ
とが可能であることは言うまでもない。As the culture conditions, aerobic culture is adopted,
For example, the culture solution can be obtained by culturing at 58 ° C. for 1 to 12 hours. Furthermore, a continuous culture method of culturing while supplying a fresh medium at a constant rate can also be applied.
It goes without saying that the medium and culture conditions can be appropriately selected according to the above conditions.

【００１５】このようにして培養した培養液は、ろ過あ
るいは遠心などの常法によって菌体を除去したのち、ろ
液を得ることができる。得られたろ液は、フィルターな
どによる除菌処理あるいは滅菌処理により菌体を除いた
のち、そのままあるいは凍結乾燥あるいは各種の濃縮操
作を行うことによって抗腫瘍剤として使用することがで
きるが、さらに有機溶媒などによる活性物質の抽出、カ
ラムクロマトグラフィーなどによる分離手段によって得
られる有効成分を含む画分、もしくは有効成分そのもの
を抗腫瘍剤または免疫増強剤として使用することができ
る。The culture broth thus cultivated can be obtained as a filtrate after removing the cells by a conventional method such as filtration or centrifugation. The obtained filtrate can be used as an antitumor agent as it is or after lyophilization or various concentration operations after removing the cells by sterilization or sterilization with a filter or the like. A fraction containing the active ingredient obtained by extraction of the active substance by the above, separation means by column chromatography, or the active ingredient itself can be used as an antitumor agent or immunopotentiator.

【００１６】活性物質の抽出には、ブタノール、プロパ
ノール、酢酸エチル、ベンゼン、ヘキサン、クロロホル
ム、トルエンなどの有機溶媒をもちいることができる。
また、カラムクロマトグラフィーとしては吸着クロマト
グラフィー、分配クロマトグラフィー、イオン交換クロ
マトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、高速液
体クロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて使用する
ことができる。For extraction of the active substance, organic solvents such as butanol, propanol, ethyl acetate, benzene, hexane, chloroform and toluene can be used.
As column chromatography, adsorption chromatography, partition chromatography, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, high performance liquid chromatography and the like can be used in appropriate combination.

【００１７】一方、本出願の抗腫瘍剤または免疫増強剤
は有機合成法によっても製造できる。具体的にはディー
・エヌ・ハープらの方法（ジャーナル オブ アメリカ
ンケミカル ソサイエティー １００巻、１２２２ペー
ジ、１９７８年）により合成できる。On the other hand, the antitumor agent or immunopotentiator of the present application can also be produced by an organic synthetic method. Specifically, it can be synthesized by the method of D. N. Harp et al. (Journal of American Chemical Society, Vol. 100, page 1222, 1978).

【００１８】本発明の化合物はホ乳動物に対して優れた
抗腫瘍活性および免疫増強作用を有するものであり、抗
腫瘍剤、制ガン剤、免疫増強剤として優れたものであ
る。The compound of the present invention has excellent antitumor activity and immunopotentiating activity in mammals, and is excellent as an antitumor agent, anticancer agent and immunopotentiator.

【００１９】本発明の化合物は、種々の形態で患者に投
与できる。例えば、錠剤、ペレット剤、カプセル剤、座
剤、液剤、乳剤、けんだく剤などの形態が使用できる。
これらの形態を用いる場合、安定剤、増量剤、着色剤、
芳香剤及び甘味剤のような補助剤を用いることができ
る。また、静脈注射、筋肉注射、皮下注射などによって
も患者に投与可能である。The compounds of this invention can be administered to a patient in a variety of forms. For example, tablets, pellets, capsules, suppositories, solutions, emulsions, medicines and the like can be used.
When using these forms, stabilizers, extenders, colorants,
Adjuvants such as fragrances and sweeteners can be used. It can also be administered to a patient by intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous injection, or the like.

【００２０】投与量としては体重１ｋｇあたり０．０１
ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは０．０５ｍｇ〜５０ｍ
ｇ、さらに好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇが適当であ
るが、患者の症状、病状の進行程度などにより適宜最適
投与量を選ぶことは言うまでもない。The dose is 0.01 per kg body weight.
mg to 100 mg, preferably 0.05 mg to 50 m
g, more preferably 0.1 mg to 10 mg is suitable, but it goes without saying that the optimum dose is appropriately selected depending on the patient's symptoms, the degree of progression of the medical condition, and the like.

【００２１】[0021]

【実施例】以下、実施例によりさらに具体的に説明す
る。なお、実施例中、％はＷ／Ｖ％を表す。 実施例１ バチルス・ステアロサーモフイルス（Bacillus stearot
hermophilus ）ＮＣＡ−１５０３（微工研菌寄第４７７
８号）をグルコース０．３５％、酵母エキス０．３％、
ペプトン０．２％、リン酸カリウム０．０４％、リン酸
２ナトリウム０．０４％、硫酸マグネシウム０．１％か
らなる液体培地に接種し、５８℃、４時間前培養した培
養液２．２Ｌを１８Ｌの同培地を仕込んだ３０Ｌジヤー
フアーメンターに移し５８℃、３．５時間培養した。EXAMPLES The present invention will be described more specifically below with reference to examples. In the examples,% represents W / V%. Example 1 Bacillus stearot
hermophilus ) NCA-1503
No. 8) glucose 0.35%, yeast extract 0.3%,
2.2 L of culture medium inoculated into a liquid medium consisting of 0.2% peptone, 0.04% potassium phosphate, 0.04% disodium phosphate and 0.1% magnesium sulfate and precultured at 58 ° C. for 4 hours Was transferred to a 30 L jar fermenter charged with 18 L of the same medium and cultured at 58 ° C. for 3.5 hours.

【００２２】培養液を遠心し得られた培養ろ液のうち１
０Ｌを以後の処理に用いた。この培養ろ液を限外ろ過膜
（分子量排除限界１．３×１０ 4）でろ過し透過液９Ｌ
を得た。この透過液９Ｌに対し３Ｌのｎ−ブタノールで
３回抽出を行いｎ−ブタノール層を回収した。ｎ−ブタ
ノール層を減圧濃縮し、１．１３ｇの固形物を得た。こ
の固形物を２００ｍｌの水に溶解したのち活性化ＯＤＳ
レジン（ウオーターズ社製、５５−１０５μ）２０ｇを
加え３０分間攪はんした。これをグラスフイルターでろ
過しＯＤＳレジンを回収し、ＯＤＳレジンに吸着した活
性成分を５００ｍｌの２０容量％アセトニトリルを用い
て溶出し、２０７ｍｇの活性画分（ＣＦ−ＬＢ２０）を
得た。One of the culture filtrates obtained by centrifuging the culture medium
0 L was used for subsequent processing. This culture filtrate is used as an ultrafiltration membrane.
(Molecular weight exclusion limit 1.3 × 10 Filtered with 4) and permeated liquid 9L
Got 3 L of n-butanol was added to 9 L of this permeate.
Extraction was performed 3 times and the n-butanol layer was collected. n-pig
The nol layer was concentrated under reduced pressure to obtain 1.13 g of a solid. This
Of the solid substance was dissolved in 200 ml of water and then activated ODS
20 g of resin (55-105 μ, manufactured by Waters Co.)
The mixture was stirred for 30 minutes. Use this with a glass filter
The excess ODS resin was collected and the activity absorbed by the ODS resin was recovered.
The sex component is 500 ml of 20% by volume acetonitrile.
Eluted with 207 mg of active fraction (CF-LB20)
Obtained.

【００２３】このようにして得られた活性画分（ＣＦ−
ＬＢ２０）をさらに精製するために、高速液体カラムク
ロマト用カラム、デベロシルＯＤＳ−７（野村化学社
製、８×２５０ｍｍ）を用いて５容量％アセトニトリル
−０．０５容量％ＨＣｌから３０容量％アセトニトリル
−０．０５容量％ＨＣｌのリニアーグラジエントで活性
画分を溶出した。さらに活性画分を高速液体カラムクロ
マト用カラム、アサヒパックＧＳ−３２０（旭化成社
製、７．６×５００ｍｍ）を用いて、５０ｍＭ酢酸アン
モニウム（ｐＨ６．７）／アセトニトリル＝９０／１０
からなる溶出液で活性画分を溶出した。このようにして
得た活性画分をＢＳ−１とした。ＢＳ−１を再度、高速
液体カラムクロマトグラフィーを用いて精製し単一標品
を得た。The active fraction (CF-
In order to further purify LB20), 5 vol% acetonitrile-0.05 vol% HCl to 30 vol% acetonitrile-using a column for high performance liquid column chromatography, Develosil ODS-7 (Nomura Chemical Co., Ltd., 8 × 250 mm). The active fraction was eluted with a linear gradient of 0.05% by volume HCl. Further, the active fraction was subjected to 50 mM ammonium acetate (pH 6.7) / acetonitrile = 90/10 using Asahi Pack GS-320 (manufactured by Asahi Kasei Corporation, 7.6 × 500 mm) for high performance liquid column chromatography.
The active fraction was eluted with an eluent consisting of The active fraction thus obtained was designated as BS-1. BS-1 was purified again using high performance liquid column chromatography to obtain a single standard product.

【００２４】本品の構造を確定するために¹³Ｃ−ＮＭ
Ｒ、 ¹Ｈ−ＮＭＲ、質量分析を行ったところ、化１（式
中ｎは３、Ｒ₁ 及びＲ₂ は水素原子）で示される構造を
持つビス（２−ヒドロキシエチル）トリスルフィドであ
ることが明らかになった。To determine the structure of this product, ¹³ C-NM
R, ¹ H-NMR, and mass spectrometric analysis revealed that it was bis (2-hydroxyethyl) trisulfide having the structure shown in Chemical formula 1 (n is 3, and R ₁ and R ₂ are hydrogen atoms). Became clear.

【００２５】図１に ¹Ｈ−ＮＭＲ、図２に¹³Ｃ−ＮＭＲ
分析結果を示した。[0025] ¹ in FIG. 1 H-NMR, in FIG. 2 ¹³ C-NMR
The analysis results are shown.

【００２６】実施例２ 実施例１で得られたＣＦ−ＬＢ２０について、培養細胞
を用いて抗腫瘍活性を調べた。株化されたマウスガン細
胞Ｐ３８８−Ｄ１（国立衛生試験所から入手した）を２
×１０⁵ ／ｍｌになるように１０％ＦＣＳ(Fetal Calf
Serum)、５０μＭ２−メルカプトエタノールを含むＲＰ
ＭＩ１６４０培地に浮遊させ、３５ｍｍ径のシャーレに
１ｍｌずつまき、滅菌水の懸濁した各種濃度の上記活性
画分ＣＦ−ＬＢ２０とコントロールとして滅菌水のみの
ものを１０μｌ添加し、３７℃で５容量％ＣＯ₂ インキ
ュベーター内で４８時間培養した。４８時間後、０．２
％トリパンブルーで２倍希釈し、計数板にて生細胞数を
カウントした。結果を表１に示す。表１の結果からＣＦ
−ＬＢ２０に抗腫瘍活性があることは明らかである。Example 2 The antitumor activity of CF-LB20 obtained in Example 1 was examined using cultured cells. 2 strains of mouse cancer cells P388-D1 (obtained from National Institute of Health)
× 10 ⁵ / ml 10% FCS (Fetal Calf
Serum), RP containing 50 μM 2-mercaptoethanol
Floating in MI1640 medium, sprinkling 1 ml each on a petri dish with a diameter of 35 mm, adding 10 μl of the above-mentioned active fraction CF-LB20 of various concentrations suspended in sterile water and sterile water alone as a control, and 5% by volume at 37 ° C. The cells were cultured in a CO ₂ incubator for 48 hours. After 48 hours, 0.2
The cells were diluted 2-fold with% trypan blue, and the number of viable cells was counted with a counting plate. The results are shown in Table 1. CF from the results in Table 1
-It is clear that LB20 has antitumor activity.

【００２７】[0027]

【表１】 [Table 1]

【００２８】実施例３ 次に、実施例１で得られたＢＳ−１について、培養細胞
を用いて抗腫瘍活性を調べた。株化されたヒトガン細胞
Ｕ９３７（国立衛生試験所から入手した）を２×１０⁵
／ｍｌになるように１０％ＦＣＳ、５０μＭ２−メルカ
プトエタノールを含むＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊さ
せ、３５ｍｍ径のシャーレに１ｍｌずつまき、滅菌水に
懸濁した各種濃度の上記活性画分ＢＳ−１とコントール
として滅菌水のみのものを１０μｌ添加し３７℃で５容
量％ＣＯ₂ インキュベーター内で４８時間培養した。４
８時間後、０．２％トリパンブルーで２倍希釈し、計数
板にて生細胞数をカウントした。結果を表２に示す。表
２の結果からＢＳ−１に抗腫瘍活性があることは明らか
である。Example 3 Next, the antitumor activity of BS-1 obtained in Example 1 was examined using cultured cells. 2 × 10 ^{5 of} established human cancer cells U937 (obtained from National Institute of Health)
/ ML to 10% FCS, 50μM 2-mercaptoethanol was suspended in RPMI1640 medium containing 1mL, and each 1ml was sprinkled on a Petri dish of 35mm diameter, suspended in sterilized water. 10 μl of sterilized water alone was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. in a 5% by volume CO ₂ incubator for 48 hours. Four
After 8 hours, it was diluted 2-fold with 0.2% trypan blue, and the number of viable cells was counted on a counting plate. The results are shown in Table 2. From the results in Table 2, it is clear that BS-1 has antitumor activity.

【００２９】[0029]

【表２】 [Table 2]

【００３０】実施例４ 実施例１で得られたビス（２−ヒドロキシエチル）トリ
スルフィドを試料として、抗腫瘍活性および免疫増強活
性について検討した。 抗腫瘍活性：マウス肥満細胞種Ｐ−８１５（国立衛生試
験所細胞バンクＪＣＲＢ）をＲＰＭＩ １６４０培地
（日水製薬製、１０％牛胎児血清を含む）中、２４穴プ
レートに４×１０⁴ ずつまき、種々の濃度の検体を添加
後、総容量２００μＬとし、炭酸ガス培養器中３７℃で
培養した。２４時間後、各ウエルの生細胞数をトリパン
ブルー染色法により計数した。正常細胞としてＢＡＬＢ
／３Ｔ３（ＪＣＲＢ）をＤＭＥＭ（日水製薬製、１０％
牛血清を含む）中、９６穴プレートに４×１０⁴ ずつま
き、種々の濃度の検体を添加後、総容量１００μＬで同
様に培養した。４８時間後生細胞数をミクロカルチャー
テトラゾリウム法（M.C.Alley et al., Cancer Res.,
48, 589-601(1988) ）により計数した。Example 4 Using the bis (2-hydroxyethyl) trisulfide obtained in Example 1 as a sample, antitumor activity and immunopotentiating activity were examined. Antitumor activity: Mouse mast cell type P-815 (National Institute of Health Sciences Cell Bank JCRB) was seeded on a 24-well plate in 4 × 10 ⁴ cells in RPMI 1640 medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., containing 10% fetal calf serum). After adding samples of various concentrations, the total volume was adjusted to 200 μL and the cells were cultured at 37 ° C. in a carbon dioxide incubator. After 24 hours, the number of viable cells in each well was counted by the trypan blue staining method. BALB as normal cells
/ 3T3 (JCRB) is DMEM (Nissui Pharmaceutical, 10%
In a 96-well plate (containing bovine serum), the cells were seeded at 4 × 10 ⁴ each, and after adding various concentrations of the samples, the cells were similarly cultured in a total volume of 100 μL. The number of living cells after 48 hours was determined by the microculture tetrazolium method (MCAlley et al., Cancer Res.,
48 , 589-601 (1988)).

【００３１】免疫増強活性：９６穴プレートに、水上ら
の方法（水上茂樹等、白血球と食作用、講談社、東京,1
979,195頁）に従い調製したエフェクター細胞（カゼイ
ン誘導マウス腹腔マクロファージ）を１００μＬ（４×
１０⁵ ）ずつまき、検体を種々の濃度となるように添加
後、炭酸ガス培養器中３７℃で培養した。２４時間後各
ウエルをＲＰＭＩ１６４０で洗浄し ¹²⁵Ｉ−デオキシウ
リジン（アマシャム製）で標識したＰ−８１５を標的細
胞として２００μＬ（２×１０⁴ ）ずつまき、さらに２
４時間培養した。培養後、プレートをよく攪はんした
後、１０００rpm、４℃、１０分間遠心分離し、各ウエ
ルより培養上清を１００μＬずつガラス試験管にとり上
清中に放出された放射活性をガンマーカウンター（アロ
カ社製）にて測定した。最大放出として、最終濃度０．
５％トリトンと共に培養したものを用い、次式により細
胞障害性（％）を算出した。Immunopotentiating activity: A 96-well plate was subjected to the method of Mizukami et al. (Shigeki Mizukami et al., Leukocyte and phagocytosis, Kodansha, Tokyo, 1
Effector cells (casein-induced mouse peritoneal macrophages) prepared in accordance with
10 ⁵ ) each, and the sample was added so as to have various concentrations, followed by culturing at 37 ° C. in a carbon dioxide incubator. After 24 hours, each well was washed with RPMI1640, seeded with P-815 labeled with ¹²⁵ I-deoxyuridine (manufactured by Amersham) at 200 μL (2 × 10 ⁴ ) as target cells, and further 2
Cultured for 4 hours. After culturing, the plate was thoroughly stirred and then centrifuged at 1000 rpm, 4 ° C. for 10 minutes, and 100 μL of the culture supernatant from each well was placed in a glass test tube to measure the radioactivity released in the supernatant with a gamma counter (aloca). (Manufactured by the company). As a maximum release, a final concentration of 0.
Using the cells cultured with 5% Triton, the cytotoxicity (%) was calculated by the following formula.

【００３２】 [0032]

【００３３】抗腫瘍活性については表３に、免疫増強活
性については図３にそれぞれ示した。The antitumor activity is shown in Table 3, and the immunopotentiating activity is shown in FIG.

【００３４】[0034]

【表３】 [Table 3]

【００３５】表３の結果から明らかなようにビス（２−
ヒドロキシエチル）トリスルフィドは０．１〜２．５μ
ｇ／ｍｌの範囲で濃度依存的に腫瘍細胞Ｐ−８１５の増
殖を抑制し、２．５μｇ／ｍｌではほぼ完全に増殖を抑
制した。一方、正常細胞ＢＡＬＢ／３Ｔ３に対してはほ
とんど増殖抑制作用を示さなかった。ビス（２−ヒドロ
キシエチル）トリスルフィドのＢＡＬＢ／３Ｔ３に対す
るＰ−８１５への選択毒性は６０倍以上であり、既知の
抗腫瘍剤のブレオマイシンおよび５−フルオロウラシル
に比べて明らかに優れた抗腫瘍作用を示した。As is clear from the results of Table 3, bis (2-
Hydroxyethyl) trisulfide is 0.1-2.5μ
In the range of g / ml, the growth of tumor cells P-815 was suppressed in a concentration-dependent manner, and at 2.5 μg / ml, the growth was suppressed almost completely. On the other hand, it showed almost no growth inhibitory effect on normal cells BALB / 3T3. The selective toxicity of bis (2-hydroxyethyl) trisulfide to BALB / 3T3 to P-815 is more than 60 times, and it shows a clear superior antitumor effect to the known antitumor agents bleomycin and 5-fluorouracil. Indicated.

【００３６】また、図３から明らかなように、１〜１０
μｇ／ｍｌの範囲でビス（２−ヒドロキシエチル）トリ
スルフィドは濃度依存的にマクロファージを活性化して
腫瘍細胞Ｐ−８１５障害性を示し、明らかに免疫調節活
性を有することを認めた。As is clear from FIG. 3, 1 to 10
It was confirmed that bis (2-hydroxyethyl) trisulfide activated macrophages in a concentration range of μg / ml in a concentration-dependent manner to show tumor cell P-815 toxicity, and clearly had immunoregulatory activity.

【００３７】実施例５ ビス（２−ヒドロキシエチル）トリスルフィド ５０ｇ 乳糖 ９３５ｇ ステアリン酸マグネシウム １５ｇ 上記成分をそれぞれ秤量した後、均一に混合し、混合粉
末をハードゼラチンカプセルに２００ｍｇずつ充填しカ
プセル剤を調製した。Example 5 Bis (2-hydroxyethyl) trisulfide 50 g Lactose 935 g Magnesium stearate 15 g The above ingredients were weighed and mixed uniformly, and 200 mg of the mixed powder was filled into hard gelatin capsules to prepare capsules. did.

【００３８】実施例６ ビス（２−ヒドロキシエチル）トリスルフィド ５ｍｇ ブドウ糖 １００ｍｇ 生理食塩水 １０ｍｌ 上記の混合液をメンブレンフィルターでろ過後再び除菌
ろ過を行い、そのろ過液を無菌的にバイアルに分注し、
窒素ガスを充填した後、密封して静脈内注射薬とした。Example 6 Bis (2-hydroxyethyl) trisulfide 5 mg Glucose 100 mg Physiological saline solution 10 ml The above mixture was filtered through a membrane filter and sterilized again, and the filtrate was aseptically dispensed into a vial. Then
After filling with nitrogen gas, it was sealed to give an intravenous injection drug.

【００３９】[0039]

【発明の効果】本発明の抗腫瘍剤は優れた抗腫瘍活性を
有し、悪性腫瘍の治療剤として有効に用いることができ
る。The antitumor agent of the present invention has excellent antitumor activity and can be effectively used as a therapeutic agent for malignant tumors.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】本発明の有効成分であるビス（２−ヒドロキシ
エチル）トリスルフィドの ¹Ｈ−ＮＭＲの分析図であ
る。FIG. 1 is a ¹ H-NMR analysis chart of bis (2-hydroxyethyl) trisulfide which is an active ingredient of the present invention.

【図２】本発明の有効成分であるビス（２−ヒドロキシ
エチル）トリスルフィドの¹³Ｃ−ＮＭＲの分析図であ
る。FIG. 2 is a ¹³ C-NMR analysis chart of bis (2-hydroxyethyl) trisulfide which is an active ingredient of the present invention.

【図３】本発明の有効成分であるビス（２−ヒドロキシ
エチル）トリスルフィドの免疫増強活性についての説明
図である。FIG. 3 is an explanatory diagram for the immunopotentiating activity of bis (2-hydroxyethyl) trisulfide, which is the active ingredient of the present invention.

Claims (4)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 バチルス・ステアロサーモフイルス（Ba
cillus stearothe- rmophilus ）の培養ろ液を有効成分
とする抗腫瘍剤。1. Bacillus stearothermophilus ( Ba
cillus stearothe - rmophilus ) as an active ingredient. 【請求項２】 バチルス・ステアロサーモフイルス（Ba
cillus stearothe- rmophilus ）の培養ろ液を有効成分
とする免疫増強剤。2. Bacillus stearothermophilus ( Ba
cillus stearothe - rmophilus ) An immunopotentiator containing a culture filtrate as an active ingredient. 【請求項３】 下記の一般式 【化１】 （式中ｎは３〜８、Ｒ₁ 及びＲ₂ は水素原子、アルキ
ル、フェニルまたはフェニルアルキルを示す。）で表さ
れる化合物を有効成分とする抗腫瘍剤。3. The following general formula: (In the formula, n is 3 to 8, and R ₁ and R ₂ are hydrogen atoms, alkyl, phenyl or phenylalkyl.) An antitumor agent comprising a compound represented by the active ingredient. 【請求項４】 下記の一般式 【化２】 （式中ｎは３〜８、Ｒ₁ 及びＲ₂ は水素原子、アルキ
ル、フェニルまたはフェニルアルキルを示す。）で表さ
れる化合物を有効成分とする免疫増強剤。4. The following general formula: (In the formula, n is 3 to 8, and R ₁ and R ₂ are hydrogen atoms, alkyl, phenyl or phenylalkyl.) An immunopotentiator comprising the compound as an active ingredient.