JPH0565296A - 新規ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 昆虫成長調節活性または殺虫活性を有する新
規ペプチドを提供する。 【構成】 一般式 化１ 【化１】 〔式中、Ｒはアミノ基または水酸基を表す。〕で示され
る新規ペプチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、害虫防除活性、すなわ
ち、昆虫成長調節活性または殺虫活性を有するペプチド
に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】昆虫機能または成長調節ペプチドとして
は、これまで種々のものが知られている。すなわち、Ｐ
ＴＴＨ（長澤ら、プロシーディングス オブ ザナショ
ナルアカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ユ
ナイテッド ステイツ オブ アメリカ（Proceedings
of the National Academy of Sciences of the Un-ited
States of America) 第83巻, 第5840〜5843頁 (1986
年）〕, ＥＨ〔トルーマンら、ネイチャー（Nature) 第
291巻, 第70〜71頁 (1981年) 〕およびＡＫＨＩ〔スト
ーンら、ネイチャー（Nature) 第 263巻, 第 207〜211
頁 (1976年) 〕等が同定され、機能等が明らかにされて
いる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、昆虫自
体に処理して昆虫の成長を抑制したり、死に至らしめる
ペプチドは未だ知られていない。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、その極微
量を昆虫自体に処理することにより、昆虫の生育を著し
く阻害または死に至らしめる新規ペプチドを見出し、本
発明に至った。

【０００５】すなわち、本発明は、害虫防除活性、すな
わち、昆虫成長調節活性または殺虫活性を有する一般式
化２

【化２】 （式中、Ｒはアミノ基または水酸基を表す。）で示され
るペプチド（以下、本発明ペプチドと称する）に関する
ものである。

【０００６】さらに詳しくは、本発明者らは、カリヤコ
マユバチ（Ａｐａｎｔｅｌｅｓ ｋａｒｉｙａｉ）に寄
生されたアワヨトウ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ ｓｅｐ
ａｒａｔｅ）終令幼虫の体液より得られるＪＨエステラ
ーゼ抑制活性を有する式 化３

【０００７】

【化３】

【０００８】で示されるペプチド（以下、ペプチドＡと
称する）が、優れた昆虫成長調節活性を有することを見
出した。

【０００９】さらに本発明者らは、ペプチドＡと構造類
似の式 化４

【００１０】

【化４】

【００１１】で示されるペプチド（以下、ペプチドＢと
称する）が、優れた殺虫活性を有することを見出し、本
発明を完成した。

【００１２】本発明のペプチドＡは、たとえばカリヤコ
マユバチに寄生されたアワヨトウ終令幼虫の体液を、２
５％エタノールで抽出し、抽出成分をゲルろ過クロマト
グラフィーおよび逆相高速液体クロマトグラフィーに付
すことによって、精製取得することができ、その詳細は
下記のとおりである。

【００１３】すなわち、アワヨトウ終令幼虫（６令）に
カリヤコマユバチ卵を産卵させ、人工飼料にて、飼育４
〜６日後に体液を回収し、それに、終濃度が２５％とな
るように、−２０℃のエタノールを加え凍結乾燥させ
る。

【００１４】ついで逆相カラムクロマトグラフィーで粗
精製した画分を濃縮した後、ＪＨエステラーゼ抑制活性
を指標として、ゲルろ過高速液体クロマトグラフィーお
よび逆相高速液体クロマトグラフィーに付すことによっ
て、ペプチドＡを精製取得することができる。

【００１５】さらに、本発明のペプチドＡおよびペプチ
ドＢは、ペプチド化学の一般的に知られている方法（た
とえば Houben-Weylの Methoden der Organischen Chem
ie (Methods of Organic Chemistry) 、Volume 15/2 を
参照されたい）によって、好適には、たとえば B. Merr
ifield (J. Am. Chem.,Soc. 85、2149 (1963）〕または
R.C. Sheppard (Int. J. Peptide Protein Res. 21、11
8 (1983)〕に記載されているような固相合成によってま
たは同等な既知方法によって製造される。

【００１６】たとえば、ウレタン保護基、たとえば、第
３級ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）またはフルオレ
ニルメトキシカルボニル (Ｆｍｏｃ) 保護基が、α−ア
ミノ保護基として使用される。

【００１７】副反応の防止または特殊なペプチドの合成
に対して必要である場合は、アミノ酸の側鎖の官能基
は、さらに適当な保護基（たとえば T.W. Greene : Pro
tecti-ve Groups in Organic Synthesisを参照された
い) によって保護される。

【００１８】この場合においては、主として Arg(Tos)
、Arg(Mts)、 Arg(Mtr) 、Arg(PMC)、Asp(OBzl) 、Asp
(OBut) 、Cys(4-MeBzl)、Cys(Acm)、Cys(SBut) 、Clu(O
Bzl)、Glu(OBut) 、Lys(Cl-z) 、Lys(Boc)、Met(O)、Se
r(Bzl)、Ser(But)、Thr(Bzl)、Thr(But)、Tyr(Br-z) 、
Tyr(Bzl)または Tyr(But) が使用される。

【００１９】固相重合は、適当な樹脂に対する保護され
たアミノ酸のカップリングを使用して、ペプチドのＣ−
末端においてはじまる。この型の出発物質は、クロロメ
チル、ヒドロキシメチル、ベンズヒドリルアミノ（ＢＨ
Ａ）またはメチルベンズヒドリルアミノ（ＭＢＨＡ) 基
で変性されたポリスチレンまたはポリアクリルアミド樹
脂に対してエステルまたはアミド結合により保護された
アミノ酸を結合させることによって得ることができる。

【００２０】支持物質として使用される樹脂は、商業的
に得ることができる。もし合成されるペプチドがＣ−末
端において遊離アミド基を有することを企図する場合
は、普通ＢＨＡおよびＭＢＨＡ樹脂を使用する。

【００２１】側鎖保護基の脱離は、後に他の適当な試薬
によって実施される。

【００２２】たとえば、Ｂｏｃ保護基の場合において
は、塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸、またはＦｍｏ
ｃ保護基の場合においては、ジメチルホルムアミド中の
ピペリジンの２０％濃度の溶液、のような適当な試薬を
使用して、樹脂にカップリングしたアミノ酸のアミノ保
護基を脱離した後、次に保護されたアミノ酸を順次に所
望する順序でカップリングさせる。中間的に得られたＮ
−末端保護されたペプチド樹脂は、次のアミノ酸誘導体
との結合の前に、前述した試薬によって脱閉鎖する。

【００２３】ペプチド合成に使用されるすべての可能な
活性化試薬、特に、たとえば、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキ
シルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボ
ジイミドまたはＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）−カルボジイミドのようなカルボジイミド
を、カップリング試薬として使用することができる〔た
とえば、 Houben-Weylの Methoden der Organischen Ch
emie (Methods of OrganicChemistry) Volume 15/2を参
照されたい〕。

【００２４】カップリングは、この場合においては、ア
ミノ酸誘導体および活性化試薬ならびにもし必要な場合
は、たとえば、１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール
（ＨＯＢｔ) 〔W.Konig, R. Geiger : Chem. Ber. 103.
708 (1970) 〕または３−ヒドロキシ−４−オキソ−
３，４−ジヒドロベンゾ−トリアジン（Ｈｏｏｂｔ）
〔W.Konig, R. Geiger : Chem. Ber.103. 2054 (197
0)〕のようなラセミ化−抑制添加剤を樹脂に添加するこ
とによって直接実施することができるが、対称な無水物
またはＨＯＢｔもしくはＨＯＯｂｔエステルとしてのア
ミノ酸誘導体の予備活性化を別個に実施し、そして適当
な溶剤中の活性化物質の溶液をカップリングできるペプ
チド樹脂に加えることもできる。

【００２５】前述した活性化試薬の１種によるアミノ酸
誘導体のカップリングまたは活性化は、ジメチルホルム
アミド、Ｎ−メチルピロリドンもしくは塩化メチレンま
たはこれらの溶剤の混合物中で実施することができる。

【００２６】活性化されたアミノ酸誘導体は、慣習的に
１．５〜４倍の過剰で使用される。不完全なカップリン
グが行われる場合においては、カップリング反応は、次
のアミノ酸のカップリングに対して必要なペプチド樹脂
のα−アミノ基の脱閉鎖を予め実施することなしに反復
する。

【００２７】前述した方法でペプチドを合成した後、ペ
プチドは、たとえば、液状弗化水素（好適にはＢｏｃ法
によって製造されたペプチドの場合において)またはト
リフルオロ酢酸 (好適にはＦｍｏｃ法によって合成され
たペプチドの場合において)のような試薬を使用して樹
脂から脱離することができる。これらの試薬は、樹脂か
らペプチドを開裂するばかりでなく、アミノ酸誘導体の
他の側鎖保護基をも開裂する。

【００２８】この方法においては、追加的に、ＢＨＡお
よびＭＢＨＡ樹脂を使用してペプチドが遊離酸の形態で
得られる。ＢＨＡまたはＭＢＨＡ樹脂を使用した場合
に、脱離を、弗化水素またはトリフルオロメタンスルホ
ン酸を使用して実施する場合は、ペプチドは酸アミドと
して得られる。

【００２９】ペプチドアミドを製造する他の方法は、た
とえば、特開昭63-267748 号公報に記載されている。

【００３０】樹脂からのペプチドアミドの脱離は、普
通、ペプチド合成に使用される中程度の強度の酸（たと
えばトリフルオロ酢酸）で処理することによって実施さ
れる。

【００３１】固相合成に慣習的なフェノール、クレゾー
ル、チオクレゾール、アニソール、チオアニソール、エ
タンジチオール、硫化ジメチル、硫化メチルエチルまた
は同様の陽イオンエントレイナーのような陽イオンエン
トレイナー物質（entrainersubstances) が、個々にま
たは２またはそれ以上のこれらの補助剤の混合物として
加えられる。

【００３２】この場合において、トリフルオロ酢酸また
は、たとえば、塩化メチレンのような適当な溶剤によっ
て希釈使用することができる。

【００３３】本発明ペプチドは、好適には固相技術を使
用して２つの一般的な保護基を使用する方法（tactics)
によって合成される。

【００３４】合成は、α−アミノ基の一時的閉鎖に対し
てＢｏｃまたはＦｍｏｃ保護基を使用して、アプライド
バイオシステムスからの自動ペプチドシンセサイザーモ
デル430Ａを使用して実施される。

【００３５】Ｂｏｃ保護基を使用する場合は、装置の製
造業者によって予めプログラムされた合成サイクルを合
成に対して使用する。

【００３６】Ｃ−末端上に遊離カルボキシル基を有する
ペプチドの合成は、アプライドバイオシステムスからの
相当するＢｏｃアミノ酸で官能化された（ヒドロキシメ
チル）フェニルアセトアミドメチルスチレン樹脂（R.B.
Merrifield : J. Org. Chem. 43，2845 (1978) 〕上で
実施される。

【００３７】同じ会社からのＭＢＨＡ樹脂は、ペプチド
アミドの製造に対して使用される。Ｎ，Ｎ’−ジシクロ
ヘキシルカルボジイミドまたはＮ，Ｎ’−ジイソプロピ
ルカルボジイミドが活性化試薬として使用される。

【００３８】活性化は CH₂ Cl₂、CH₂ Cl₂−ＤＭＦ混合
物またはＮＭＰ中において対称な無水物、ＨＯＢｔエス
テルまたはＨＯＯｂｔエステルとして実施される。

【００３９】活性化アミノ酸誘導体の２〜４当量がカッ
プリングに対して使用される。カップリングが不完全に
行われた場合においては、反応を反復する。

【００４０】α−アミノ基の一時的保護に対してＦｍｏ
ｃ保護基を使用する場合は、アプライドバイオシステム
スからの自動ペプチドシンセサイザーモデル 430Ａを使
用して、本発明者ら自身の合成プログラムを合成に対し
て使用する。

【００４１】合成は、適当なアミノ酸を使用して、既知
の方法によってエステル化された（E. Atherton 等 :
J. C. S. Chem. Comm. 1981，336 〕バヘム（Bachem)か
らのｐ−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂（S. W
ang : J. Am. Chem. Soc. 95，1328 (1973)〕上で実施
される。

【００４２】ＨＯＢｔまたはＨｏｏｂｔエステルとして
のアミノ酸誘導体の活性化は、ＤＭＦ中のジイソプロピ
ルカルボジイミドの溶液を、予め計量したアミノ酸誘導
体およびＨＯＢｔまたはＨＯＯｂｔの混合物に添加する
ことによって、装置製造業者によって提供されたアミノ
酸カートリッジ中で直接実施される。

【００４３】Ｆｍｏｃ−アミノ酸−ＯＯｂｔエステル
は、同様に、特開昭62-286978 号公報に記載されている
ようにして使用することができる。

【００４４】Ｆｍｏｃ保護基の脱離は、反応容器中で、
ＤＭＦ中のピペリジンの２０％濃度溶液を使用して実施
される。

【００４５】使用される反応性アミノ酸誘導体の過剰
は、 1.5〜2.5 当量である。もしカップリングが完全で
ない場合は、Ｂｏｃ法におけるように反応を反復する。

【００４６】略号のリスト アミノ酸に対して使用される略号は、Europ. J. Bioche
m.138, 9 (1984) に記載されているようなペプチド化学
において慣習的な３−文字コードに相当する。さらに使
用される略号は以下に示すとおりである。

【００４７】Ａｃｍ アセトアミドメチル Ｂｏｃ 第３級ブチルオキシカルボニル Ｂｕｔ 第３級ブチル Ｂｚｌ ベンジル Ｃｌ−ｚ ４−クロロベンジルオキシカルボニル

【００４８】ＤＭＦ ジメチルホルムアミド Ｆｍｏｃ ９−フルオレニルメトキシカルボニル Ｍｅ メチル ４−Ｍｅｂｚｌ ４−メチルベンジル Ｍｔｒ ４−メトキシ−2,3,6,−トリメチルフ
ェニルスルホニル Ｍｔｓ メシチレン−２−スルホニル ＮＭＰ Ｎ−メチルピロリジン

【００４９】Ｐｍｃ 2,2,5,7,8 −ペンタメチ
ルクロマン−６−スルホニル ＴＦＡ トリフルオロ酢酸 Ｔｉｃ 1,2,3,4 −テトラヒドロイソキノリン
−３−イルカルボニル Ｔｒｔ トリチル

【００５０】 、
本発明ペプチドが卓効を発揮する害虫としては、鱗翅目
昆虫があげられ、たとえば、ニカメイガ（Ｃｈｉｌｏ
ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ）、コブノメイガ（Ｃｎａｐ
ｈａｌｏｃｒｏｃｉｓ ｍｅｄｉｎａｌｉｓ）、ノシメ
マダラメイガ（Ｐｌｏｄｉａ ｉｎｔｅｒｐｕｎｃｔｅ
ｌｌａ）等のメイガ科〔Ｐｙｒａｌｉｄｍｏｔｈｓ（Ｐ
ｙｒａｌｉｄａｅ）〕；ハスモンヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐ
ｔｅｒａ ｌｉｔｕｒａ）、アワヨトウ（Ｐｓｅｕｄａ
ｌｅｔｉａ ｓｅｐａｒａｔａ）、ヨトウガ（Ｍａｍｅｓ
ｔｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、タマナギンウワバ（Ａ
ｕｔｏｇｒａｐｈａ ｎｉｇｒｉｓｉｇｎａ）、カブラ
ヤガ（Ａｇｒｏｔｉｓｓｅｇｅｔｕｍ）、タマナヤガ
（Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）、ヘリオティス属
（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｓｐｐ．）等のヤガ科（Ｎｏｃ
ｔｕｉｄａｅ）；モンシロチョウ（Ｐｉｅｒｉｓ ｒａ
ｐａｅ ｃｒｕｃｉｖｏｒａ）等のシロチョウ科（Ｐｉ
ｅｒｉｄａｅ）；Ａｄｏｘｏｐｈｙｅｓ ｓｐｐ．、Ｇ
ｒａｐｈｏｌｉｔａ ｓｐｐ．等のハマキガ科（Ｔｏｒ
ｔｒｉｃｉｄａｅ）；シンクイガ科（Ｃａｒｐｏｓｉｎ
ｉｄａｅ）；ハモグリガ科（Ｌｙｏｎｅｔｉｉｄａ
ｅ）；ホソガ科（Ｇｒａｃｉｌｌａｒｉｉｄａｅ）；キ
バガ科（Ｇｅｌｅｃｈｉｉｄａｅ）；ドクガ科（Ｌｙｍ
ａｎｔｒｉｉｄａｅ）；コナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘ
ｙｌｏｓｔｅｌｌａ）；イガ（Ｔｉｎｅａ ｔｒａｎｓ
ｌｕｃｅｎｓ）、コイガ（Ｔｉｎｅｏｌａ ｂｉｓｓｅ
ｌｌａｉｅｌｌａ）等のヒロズコガ科（Ｔｉｎｅｉｄａ
ｅ）；等の昆虫があげられ、特に幼虫に適用した場合に
卓効を発揮する。

【００５１】たとえば、本発明のペプチドＡは、アワヨ
トウ終令幼虫に適用した場合、ＪＨエステラーゼ抑制活
性を示し、蛹化の遅延を引き起こす効果、すなわち成長
調節効果を示す。また、処理された終令幼虫は、摂食量
が低下し、正常に発育できない。

【００５２】すなわちペプチドＡは、その作用発現は遅
効的であるが、殺虫剤としての効果も期待できる。

【００５３】本発明のペプチドＢは、アワヨトウやハス
モンヨトウの終令幼虫に対して、きわめて強い致死効果
を示し、低薬量で有効な殺虫剤として期待できる。

【００５４】本発明ペプチドを害虫防除剤の有効成分と
して用いる場合は、通常、固定担体、液体担体、餌と混
合するか、必要あれば、界面活性剤、その他の製剤用補
助剤を添加して、乳剤、水和剤、水中懸濁剤・水中乳濁
剤等のフロアブル剤、粒剤、粉剤、ＵＬＶ剤、毒餌等に
製剤して使用する。

【００５５】さらに、遺伝子工学的手法を用いて本発明
ペプチドに対応する遺伝子を核多角体病ウィルス等の昆
虫病原性ウィルスまたは植物に付着する微生物を宿主と
する適当なベクターに組み込み、適当な製剤にして上記
の害虫防除に用いることもできる。

【００５６】製剤化の際に用いる固定担体としては、た
とえば、粘土類（カオリンクレー、珪藻土、合成含水酸
化珪素、ベントナイト、フバサミクレー、酸性白土
等）、タルク類、セラミック、その他の無機鉱物（セリ
サイト、石英、硫黄、活性炭、炭酸カルシウム、水和シ
リカ等）、化学肥料（硫安、燐安、硝安、尿素、塩安
等）等の微粉末あるいは粒状物等があげられ、液体担体
としては、たとえば、水、アルコール類（メタノール、
エタノール等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケ
トン等）、芳香族炭化水素類（ベンゼン、トルエン、キ
シレン、エチルベンゼン、メチルナタレン等）、脂肪族
炭化水素類（ヘキサン、シクロヘキサン、灯油、軽油
等）、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、ニト
リル類（アセトニトリル、イソブチロニトリル等）、エ
ーテル類（イソプロピルエーテル、ジオキサン等）、酸
アミド類、（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−
ジメチルアセトアミド等）、ハロゲン化炭化水素類（ジ
クロロメタン、トリクロロエタン、等）、ジメチルスル
ホキシド、大豆油、綿実油等の植物油等があげられる。

【００５７】界面活性剤としては、たとえば、アルキル
硫酸エステル類、アルキルスルホン酸塩、アルキルアリ
ールスルホン酸塩、アルキルアリールエーテル類および
そのポリオキシエチレン化物、ポリエチレングリコール
エーテル類、多価アルコールエーテル類、糖アルコール
誘導体等があげられる。

【００５８】固着剤や分散剤等の製剤用補助剤として
は、たとえば、カゼイン、ゼラチン、多糖類（デンプ
ン、アラビアガム、セルロース誘導体、アルギン酸
糖）、リグニン誘導体、ベントナイト、糖類、合成水溶
性高分子（ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリド
ン、ポリアクリル酸類等）があげられ、安定剤として
は、たとえば、ＰＡＰ（酸性リン酸イソプロピル）、Ｂ
ＨＴ（２−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノー
ル）、ＢＨＡ（２−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メトキシフ
ェノールと３−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メトキシフェノ
ールの混合物）、植物油、鉱物油、界面活性剤、脂肪酸
またはそのエステル等があげられる。

【００５９】毒餌の基材としては、たとえば、穀物粉、
植物精油、糖、結晶セルロース等の餌成分、ジブチルヒ
ドロキシトルエン、ノルジヒドロアセレチック酸等の酸
化防止剤、デヒドロ酢酸等の保存料、トウガラシ末等の
誤食防止剤、チーズ香料、タマネギ香料等の誘引性香料
等があげられる。

【００６０】フロアブル剤（水中懸濁剤または水中乳濁
剤）の製剤は、一般に１〜７５％の化合物を０．５〜１
５％の分散剤、０．１〜１０％の懸濁助剤（たとえば、
保護コロイドやチクソトロピー性を付与する化合物）、
０〜１０％の適当な補助剤（たとえば、消泡剤、防錆
剤、安定化剤、展着剤、浸透助剤、凍結防止剤、防菌
剤、防黴剤等）を含む水中で微小に分散させることによ
って得られる。水の代わりに化合物がほとんど溶解しな
い油を用いて油中懸濁剤とすることも可能である。

【００６１】保護コロイドとしては、たとえば、ゲラニ
ン、カゼイン、ガム類、セルロースエーテル、ポリビニ
ルアルコール等が用いられる。チクソトロピー性を付与
する化合物としては、たとえば、ベントナイト、アルミ
ニウムマグネシウムシリケート、キザンタンガム、ポリ
アクリル酸等があげられる。

【００６２】このようにして得られる製剤は、そのまま
であるいは水等で希釈して用いる。また、他の殺虫剤、
殺ダニ剤、殺線虫剤、土壌害虫防除剤、殺菌剤、除草
剤、植物生長調節剤、共力剤、肥料、土壌改良剤と混合
して、または混合せずに同時に用いることもできる。

【００６３】本発明ペプチドを農業用の害虫防除剤の有
効成分として用いる場合、その施用量は、通常、１０ア
ールあたり０．０１〜１００ｇであり、水和剤、フロア
ブル剤等を水で希釈して用いる場合は、その施用濃度
は、０．５〜５００ｐｐｍであり、粒剤、粉剤等は何ら
希釈することなく、製剤のまま施用する。

【００６４】本発明ペプチドを防疫用の害虫防除剤の有
効成分として用いる場合、通常、水和剤、フロアブル剤
等は水で０．５〜５００ｐｐｍに希釈して施用し、ＵＬ
Ｖ剤、毒餌等についてはそのまま施用する。

【００６５】これらの施用量、施用濃度は、いずれも製
剤の種類、施用時期、施用場所、施用方法、害虫の種
類、被害程度等の状況によって異なり、上記の範囲にか
かわることなく増加させたり、減少させたりすることが
できる。

【００６６】

【実施例】以下に実施例をあげ、本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明がこれらに限定されるものでないこ
とはいうまでもない。

【００６７】まず、製剤例を示す。なお、部は重量部を
表わす。

【００６８】製剤例１ ペプチドＡまたはペプチドＢ２０部をラウリル硫酸ナト
リウム４部、リグニンスルホン酸カルシウム２部、合成
含水酸化珪素微粉末２０部および珪藻土５４部を混合し
た中に加え、ジュースミキサーで攪拌混合してそれぞれ
の２０％水和剤を得る。

【００６９】製剤例２ ペプチドＡまたはペプチドＢ５部に合成含水酸化珪素微
粉末５部、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム５
部、ベントナイト３０部およびクレー５５部を加え、充
分攪拌混合する。次いで、これらの混合物に適当量の水
を加え、さらに、攪拌し、造粒機で製粒し、通風乾燥し
てそれぞれの５％粒剤を得る。

【００７０】製剤例３ ペプチドＡまたはペプチドＢ１部を適当量のアセトンに
溶解し、これに合成含水酸化珪素微粉末５部、ＰＡＰ
０．３部およびクレー９３．７部を加え、ジュースミキ
サーで攪拌混合し、アセトンを蒸発除去してそれぞれの
１％粉末を得る。

【００７１】製剤例４ ペプチドＡまたはペプチドＢ２０部とソルビタントリオ
レエート１．５部とを、ポリビニルアルコール２部を含
む水溶液２８．５部と混合し、サンドラインダーで微粉
砕（粒径３μｍ以下）した後、この中にキザンタンガム
０．０５部およびアルミニウムマグネシウムシリケート
０．１部を加えて攪拌混合してそれぞれの２０％フロア
ブル剤を得る。

【００７２】次に、実施例を示す。

【００７３】実施例１ ペプチドＡの精製 アワヨトウ終令１日目幼虫に、カリヤコマユバチを産卵
させ、その後人工飼料で飼育した。

【００７４】３〜６日後、血体腔中に、150mM ＫＣｌお
よび 10mM ＥＤＴＡを含む pH 6.0の 0.1Ｍリン酸緩衝
液約0.1mlを注入し、フラッシングアウト法により、体
液を、0.05％フェニルチオウレアを含む 0.2Ｍリン酸緩
衝液 500μl の入った氷冷ポリプロピレン製試験管に集
め、迅速に４℃下で 500 × ｇ、５分間遠心し、上清
を分取した。

【００７５】これに、−20℃エタノールを終濃度25％と
なるように加え、混和し、４℃下で20,000 × ｇ15分
間遠心し、上清を分取した後、凍結乾燥法により濃縮し
てから、６mlの蒸留水で平衝化した３mlのＣ₁₈ extract
ion columm (J.T.Baker Che-mical Co.)にチャージし
た。

【００７６】同カラムを５mlの蒸留水で洗った後、30％
アセトニトリル 2.5mlで溶出した。溶出画分は窒素気流
下で濃縮し、12.5mMリン酸緩衝液 pH6.6で平衝化した S
upe-rose 6 HR 10/30 カラム (Pharmacia LKB Biotechn
ology Inc.) にてゲルろ過した。

【００７７】次に活性画分を集め、逆相高速液体クロマ
トグラフィー用カラムである reve-rsed phase C₈ HPLC
columm (4.6mm×250mm,山村化学研究所製) にチャージ
し、0.1 ％ＣＨ₃ ＣＯＯＨ／Ｈ₂ Ｏ中のアセトニトリル
濃度を18％〜40％まで上昇させて分画した。

【００７８】活性画分を集め、逆相高速液体クロマトグ
ラフィー用カラムである cyanopro-pyl- derived silic
a HPLC column(4.6mm ×250mm,山村化学研究所製) にチ
ャージし、0.1 ％ＣＨ₃ ＣＯＯＨ／Ｈ₂ Ｏ中のアセトニ
トリル濃度を15％〜25％まで上昇させて分画した (図
１）。

【００７９】図１中の太線で示した活性画分を再度同カ
ラムにチャージし、0.05％ＣＦ₃ ＣＦ₂ ＣＦ₂ ＣＯＯＨ
／Ｈ₂ Ｏ中のアセトニトリル濃度を18〜25％まで上昇さ
せて分画した（図２）。

【００８０】図２中の太線で示した活性画分をさらに同
カラムにチャージし、0.075％ＣＦ₃ ＣＦ₂ ＣＦ₂ ＣＯ
ＯＨ／Ｈ₂ Ｏ中のアセトニトリル濃度を20〜25％まで上
昇させて分画した（図３）。

【００８１】図３中太線で示した画分が最終精製画分で
ある。

【００８２】表１に精製時の精製度、回収率等を示し
た。

【００８３】

【表１】

【００８４】実施例２ ペプチドＡの合成 Fmoc-Glu-OPfp (1mmol) を触媒として、ＤＭＡＰ（４−
ジメチルアミノピリジン）（0.2mmol)を用い、ジメチル
ホルムアミド (ＤＭＦ）中、EP-A 322,348に示された構
造式 化５

【００８５】

【化５】

【００８６】の結合基で変性されたアミノメチル樹脂上
にエステル結合により導入した。

【００８７】使用したＦｍｏｃ−アミノ酸誘導体（国産
化学製）の側鎖の保護は、Asp(OBut) 、Glu(OBut) , Th
r(But), Ser(But), Tyr(But), Lys(Boc), Arg(Boc), Cy
s(Acm)でペプチド鎖伸長時の各縮合反応はすべてＰｆｐ
（ペンタフルオロフェニル）活性エステル体（2.5eq.)
を用い、触媒としてＨＯＢＴ（１−ハイドロキシベンゾ
トリアゾール）0.2mmol の存在下、ＤＭＦ中で行った。

【００８８】それぞれのＦｍｏｃ基の除去は、２０％ピ
ペリジンのＤＭＦ溶液を用いた。さらにそれぞれのカッ
プリング反応は、ニンヒドリンでモニターした。

【００８９】すべてのカップリング反応終了後、Ｎ末端
に残ったＦｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦにより
除去し、Ｎ末端アミノ基をフリーとし、その後、すべて
の他の保護基の除去と樹脂からペプチドを切り出すため
に、ｍ−クレゾール存在下、ＴＦＡ−チオアニソールで
室温３時間処理し、グラスフィルターでろ過し、樹脂を
除き、ろ液を濃縮し、これにエーテルを加え粉末とし
た。

【００９０】次にヨウ素−メタノールの室温３時間処
理、引きつづいて０℃冷却下、 0.5Ｍチオ硫酸ナトリウ
ム水溶液を加え、反応液を室温で濃縮した。

【００９１】それを集め、 0.1Ｍリン酸緩衝液（pH 8.
6) に溶解し、Sephadex G-25(ファルマシア社製) にか
け、 0.5Ｎ酢酸で溶出させ、脱塩、精製を行った。ゲル
ろ過後のペプチドは、さらにＨＰＬＣで精製した。

【００９２】ＨＰＬＣによる精製分取は、 0.1％ＴＦＡ
中、アセトニトリル10−60％の濃縮勾配で Nucleosil 1
00-5c18 (4.0×150mm)カラム（Ｍ．ナーゲル社製）を流
速１ml／分で流し、210, 260nmにおける紫外吸収でモニ
ターした。

【００９３】実施例３ ペプチドＢの合成 Fmoc-Gln-OPfp (1mmol) を触媒として、ＤＭＡＰ（４−
ジメチルアミノピリジン）（0.2mmol)を用い、ジメチル
ホルムアミド（ＤＭＦ）中、p −アルコキシベンジルア
ルコール樹脂（0.2mmol)（0.35meq. OH/g 、ポリスチレ
ン−１％ジビニルベンゼンコポリマー（国産化学製）上
にエステル結合により導入した。

【００９４】使用したＦｍｏｃ−アミノ酸誘導体（国産
化学製）の側鎖の保護は、Asp(OBut) 、Glu(OBut) , Th
r(But), Ser(But), Tyr(But), Lys(Boc), Arg(Boc), Cy
s(A-cm) でペプチド鎖伸長時の各縮合反応はすべてＰｆ
ｐ（ペンタフルオロフェニル）活性エステル体（2.5e
q.) を用い、触媒としてＨＯＢＴ（１−ハイドロキシベ
ンゾトリアゾール）0.2mmol の存在下、ＤＭＦ中で行っ
た。それぞれのＦｍｏｃ基の除去は、２０％ピペリジン
のＤＭＦ溶液を用いた。さらにそれぞれのカップリング
反応は、ニンヒドリンでモニターした。

【００９５】すべてのカップリング反応終了後、Ｎ末端
に残ったＦｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦにより
除去し、Ｎ末端アミノ基をフリーとし、その後、すべて
の他の保護基の除去と樹脂からペプチドを切り出すため
に、ｍ−クレゾール存在下、ＴＦＡ−チオアニソールで
室温３時間処理し、グラスフィルターでろ過し、樹脂を
除き、ろ液を室温で濃縮し、これにエーテルを加え粉末
を得た。

【００９６】次にヨウ素−メタノールの室温３時間処
理、引きつづいて０℃冷却下、 0.5Ｍチオ硫酸ナトリウ
ム水溶液を加え、反応液を室温で濃縮した。それを集
め、 0.1Ｍリン酸緩衝液（pH 8.6) に溶解し、Sephadex
G-25(ファルマシア社製) にかけ、 0.5Ｎ酢酸で溶出さ
せ、脱塩、精製を行った。ゲルろ過後のペプチドは、さ
らにＨＰＬＣで精製した。

【００９７】ＨＰＬＣによる精製分取は、 0.1％ＴＦＡ
中、アセトニトリル10−60％の濃度勾配で Nucleosil 1
00-5c18 (4.0×150mm)カラム（Ｍ．ナーゲル社製）を流
速１ml／分で流し、210, 260nmにおける紫外吸収でモニ
ターした。目的とするペプチドＢは、保持時間12.9分で
溶出した。得られたペプチドのアミノ酸分析の結果は下
記のとおりであり、理論値と一致する結果を得た。

【００９８】Asp(2)2.01, Thr(2)1.94, Ser(1)0.94, Gl
u(2)1.99, Pro(2)2.01, Gly(4)4.01, Ala(1)1.01, 1/2C
ystine(2)1.81, Val(1)0.95, Met(1)0.98, Tyr(2)1.95,
Phe(2)2.01, Lys(1)1.00, Arg(2)2.02, NH₃(3)3.23.
(カッコ内の数字は理論値)

【００９９】実施例４ ペプチドＡの生理活性 ペプチドＡのアワヨトウ終令幼虫の生育に与える効果を
調べるため、ペプチドＡをアワヨトウ幼虫終令０日目、
１日目および２日目に７pmole 注射し、人工飼料にて飼
育を続け、３日目までの体重変化を調べた。その結果、
図４に示すように、対照では０日目から３日目までほぼ
直線的に体重が増加し、 2.5倍以上になるのに対し、ペ
プチドＡを注射した幼虫はわずかしか体重増加を示さな
かった。

【０１００】実施例５ ペプチドＡのＪＨエステラーゼ
抑制活性 精製したペプチドＡをリンゲル液に溶解し、非寄生のア
ワヨトウ終令幼虫の１日目と２日目とに、所定量注射
し、さらに人工飼料で飼育し、終令３日目に体液を採取
し、４℃の温度条件下、 500 × ｇ５分間遠心し、上
清をＪＨエステラーゼ活性測定画分とした。活性測定の
基質としては、（１０^{- 3} Ｈ）ＪＨＩを用い、ＪＨエス
テラーゼによって生じた生成物のＪＨ酸の比率からＪＨ
の代謝活性を推定した。

【０１０１】その結果、図５に示したようにペプチドＡ
は、濃度依存的にＪＨエステラーゼ活性を抑制した。

【０１０２】実施例６ 昆虫成長調節活性 精製したペプチドＡをリンゲル液に溶解し、非寄生のア
ワヨトウ終令幼虫の１日目と２日目とに７pmol注射し、
24時間ごとに幼虫、前蛹、蛹、死亡に分けて観察し、そ
れぞれの個体数を記録した。なお、対照にはリンゲル液
を注射した。その結果、表２に示したように、ペプチド
Ａ処理幼虫は、対照に比し、前蛹化は２日、蛹化はそれ
以上遅れることが示された。

【０１０３】

【表２】

【０１０４】実施例７ ペプチドＢの生理活性 ペプチドＢのアワヨトウ終令幼虫に対する殺虫活性を調
べるため、リンゲル液に溶解したペプチドＢをアワヨト
ウ幼虫終令０日目に４pmol注射したところ、表３に示す
ように１００％の致死率を示した。

【０１０５】

【表３】

【０１０６】実施例８ ペプチドＢの生理活性 ペプチドＢのハスモンヨトウ終令幼虫に対する苦悶活性
を調べるため、リンゲル液に溶解したペプチドＢをハス
モンヨトウ幼虫終令０日目に３６pmol注射したところ、
表４に示すように７５％の苦悶率を示した。

【０１０７】

【表４】

【０１０８】

【発明の効果】本発明により得られる新規ペプチドは、
昆虫成長調節効果または殺虫効果を有するすぐれたペプ
チドである。

【０１０９】

【図面の簡単な説明】

【図１】粗精製ペプチドＡを、 cyanopropyl-derivedsi
lica HPLC columnにて、逆相クロマトグラフィーに付し
て得た時間像グラフである。

【図２】図１の太線の活性画分を、 cyanopropyl-deriv
ed silica HPLC columnにて、再度クロマトグラフィー
に付して得た時間像グラフである。

【図３】図２の太線の活性画分を、 cyanopropyl-deriv
ed silica HPLC columnにて、再度クロマトグラフィー
に付して得た時間像グラフである。太線画分が精製ペプ
チドＡを示す。

【図４】ペプチドＡをアワヨトウ終令幼虫に注射した後
の幼虫の体重変化を表すグラフである。白丸印は、ペプ
チドＡを終令０日目、１日目および２日目に７pmol注射
したときの幼虫体重の値を、また黒丸印は、リンゲル液
を終令０日目、１日目および２日目に注射したときの幼
虫体重の値をそれぞれ示す。

【図５】所定量のペプチドＡを、アワヨトウ終令幼虫１
日目と２日目とに注射し、終令３日目に、体液中のＪＨ
エステラーゼ活性を測定した結果をグラフにしたもので
ある。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】一般式 化１ 【化１】 （式中、Ｒはアミノ基または水酸基を表す。）で示され
   るペプチド。