JPH055083B2 - - Google Patents

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JPH055083B2
JPH055083B2 JP58108908A JP10890883A JPH055083B2 JP H055083 B2 JPH055083 B2 JP H055083B2 JP 58108908 A JP58108908 A JP 58108908A JP 10890883 A JP10890883 A JP 10890883A JP H055083 B2 JPH055083 B2 JP H055083B2
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JP
Japan
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fluorescence
light
specimen
observation
shutter
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JP58108908A
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Japanese (ja)
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JPS60420A (en
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Akimasa Morita
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Olympus Corp
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Olympus Optical Co Ltd
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Publication date
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Publication of JPS60420A publication Critical patent/JPS60420A/en
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    • GPHYSICS
    • G02OPTICS
    • G02BOPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00Microscopes
    • G02B21/16Microscopes adapted for ultraviolet illumination ; Fluorescence microscopes

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  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Microscoopes, Condenser (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は螢光顕微測光装置に関し、得に螢光標
本を透過光で観察し、標本の位置決めをした後
に、螢光測光をすることができる装置に関する。
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a fluorescence microphotometry device, and more particularly to a device capable of observing a fluorescence specimen with transmitted light and performing fluorescence photometry after positioning the specimen.

従来、螢光測光をする場合、標本の細胞の観察
及び細胞の位置決めは螢光観察で行なつている。
例えば、第1図に示す落射螢光装置が知られてい
る。第1図において、超高圧水銀灯の光源1より
出た光線は、レンズ2を集光され、チヨツパー3
で変調をかけられた後、レンズ4により、ピンホ
ール5を背後から照明する。
Conventionally, when performing fluorescence photometry, observation and positioning of cells in a specimen are performed by fluorescence observation.
For example, an epi-fluorescence device shown in FIG. 1 is known. In Fig. 1, light rays emitted from a light source 1 of an ultra-high pressure mercury lamp are condensed by a lens 2, and are focused by a chopper 3.
After being modulated, the pinhole 5 is illuminated from behind by the lens 4.

上記ピンホール5を出た光は、ダイクロイツク
ミラー6で反射され、対物レンズ7により、ステ
ージ上の標本8上にピンホール5の像を結像す
る。上記ピンホール5を通過した励起光により励
起された標本8から発する螢光は、対物レンズ7
により収れんされ、ダイクロイツクミラー6、吸
収フイルター9および測光フイルター10によ
り、励起光成分を取除かれて、検出器11で測光
される。上記検出器11からの出力信号は増幅器
12によつて増幅されて、演算回路13により所
定の処理を行ない螢光値として出力される。上記
落射螢光装置を使用して、螢光測光を行なうため
に、標本8の中の細胞を選択し、位置決めをする
場合には、ピンホール5を光路から退避させる
か、大きなピンホール5を使用するこにより、標
本8の視野全体を励起し、観察用プリズム14を
光路に挿入して、接眼レンズ15によつて、細胞
の螢光像を観察しながら行なつている。
The light exiting the pinhole 5 is reflected by a dichroic mirror 6, and an objective lens 7 forms an image of the pinhole 5 on a specimen 8 on a stage. Fluorescence emitted from the specimen 8 excited by the excitation light passing through the pinhole 5 is transmitted through the objective lens 7.
The excitation light component is removed by the dichroic mirror 6, the absorption filter 9, and the photometric filter 10, and the light is measured by the detector 11. The output signal from the detector 11 is amplified by an amplifier 12, subjected to predetermined processing by an arithmetic circuit 13, and output as a fluorescence value. When selecting and positioning cells in the specimen 8 for fluorescence photometry using the epifluorescence device described above, the pinhole 5 should be removed from the optical path or a large pinhole 5 should be used. In use, the entire field of view of the specimen 8 is excited, the observation prism 14 is inserted into the optical path, and the fluorescent image of the cells is observed through the eyepiece 15.

しかしながら、上記従来の装置においては次の
ような欠点を有している。即ち、細胞像を観察し
ながら選択し、位置決めをする際に、螢光用の励
起光を標本に照射するので、螢光測光をする前
に、標本8の螢光染色に退色が生じてしまい、正
確な螢光測光をすることができない。又、螢光像
を観察する場合は、従来慣れている透過観察と見
える像が大巾に異なるので、細胞の選択、位置決
めに手間どり、螢光測光をする場合に抵抗を感じ
る。さらに、透過観察による細胞診の時の判断の
ノウハウが生かされないという欠点を有してい
る。
However, the conventional device described above has the following drawbacks. That is, when selecting and positioning cells while observing the cell image, excitation light for fluorescence is irradiated onto the specimen, so the fluorescence staining of specimen 8 may fade before fluorescence photometry is performed. , it is not possible to perform accurate fluorescence photometry. In addition, when observing a fluorescent image, the image seen is vastly different from the conventional transmission observation, so it takes time to select and position cells, and there is resistance when performing fluorescent photometry. Furthermore, it has the disadvantage that the know-how for making judgments during cytodiagnosis using transmission observation cannot be utilized.

このため、蛍光そつこうを行う場合は、この蛍
光消光により測光精度が減少するのを防止するた
めに、測光時のみ標本に励起光を照射することが
望ましい。
For this reason, when performing fluorescence stimulation, it is desirable to irradiate the sample with excitation light only during photometry in order to prevent photometry accuracy from decreasing due to fluorescence quenching.

そこで、標本を観察する必要性から励起光を含
まない、一般の照明光にて標本を照明するため
に、蛍光照明系の他に透過光観察光学系を設ける
ことにより標本を照明し観察を行う蛍光顕微測光
装置が特開昭53−122471号公報に開示されてい
る。
Therefore, since it is necessary to observe the specimen, in order to illuminate the specimen with general illumination light that does not include excitation light, a transmitted light observation optical system is installed in addition to the fluorescence illumination system to illuminate and observe the specimen. A fluorescence microphotometer is disclosed in Japanese Unexamined Patent Publication No. 122471/1983.

しかしながら、この蛍光顕微測光装置において
は、蛍光観察及び蛍光測光する際に、コンデンサ
レンズに蛍光測光用光源の励起光が入射して蛍光
を発するため、このコンデンサーレンズの自家蛍
光による悪影響が生じて精度の高い蛍光観察及び
蛍光測光をおこなうことができなくなる恐れがあ
る。
However, in this fluorescence microphotometer, when performing fluorescence observation and fluorescence photometry, the excitation light from the light source for fluorescence photometry enters the condenser lens and emits fluorescence, so the autofluorescence of this condenser lens has an adverse effect, resulting in poor accuracy. It may become impossible to perform fluorescence observation and fluorescence photometry with high levels of fluorescence.

本発明は、上記欠点に鑑みてなされたもので、
螢光測光において、蛍光観察及び蛍光測光時に、
コンデンサーレンズの自家蛍光による影響を防止
して精度の高い蛍光観察及び蛍光測光が行える螢
光顕微測光装置を提供することを目的とする。
The present invention has been made in view of the above drawbacks, and
In fluorescence photometry, during fluorescence observation and fluorescence photometry,
An object of the present invention is to provide a fluorescence microphotometer that can perform highly accurate fluorescence observation and fluorescence photometry while preventing the influence of autofluorescence from a condenser lens.

本発明は、標本の選択、位置決めをするために
透過照明系を有する透過光観察光学系と、標本に
励起光を照射する落射励起光照明系及び標本から
の蛍光を測光する受光素子を有する蛍光測光光学
系と、上記透過光観察光学系より上記試料に照射
される光を遮断する透過光用シヤツターと、上記
励起光照明系より上記標本に照射される励起光を
遮断する励起用シヤツターとを備えた蛍光顕微測
光装置において、上記透過光用シヤツターを上記
透過光観察光学系のコンデンサーレンズと試料と
の間に設けたことを特徴とする蛍光顕微測光装置
であり、蛍光観察及び蛍光測光時に透過光用シヤ
ツターを閉じることにより透過光観察光学系へ入
射する励起光を遮断し、コンデンサーレンズの自
家蛍光を阻止することができるものである。
The present invention provides a transmitted light observation optical system that includes a transmitted illumination system for selecting and positioning a specimen, an epi-excitation light illumination system that irradiates the specimen with excitation light, and a fluorescent light receiving element that measures fluorescence from the specimen. a photometric optical system, a transmitted light shutter that blocks light irradiated onto the sample from the transmitted light observation optical system, and an excitation shutter that blocks excitation light irradiated onto the specimen from the excitation light illumination system. The fluorescence microphotometer is characterized in that the transmitted light shutter is provided between the condenser lens of the transmitted light observation optical system and the sample, and the transmitted light shutter is provided between the condenser lens of the transmitted light observation optical system and the sample. By closing the light shutter, excitation light entering the transmitted light observation optical system can be blocked, and autofluorescence of the condenser lens can be prevented.

図面を参照して、本発明の一実施例を説明す
る。第1図の部分と同じ部分については、同じ番
号が付けらている。タングステンランプ、ハロン
ゲンランプ等の透過用光源16から発する光は、
レンズ17により集光し、45度に斜設された全反
射ミラー18によつて反射され、コンデンサーレ
ンズ19によつてテージ上に載置されちる標本8
を下方から照射する。20は透過光用シヤツター
で、標本8とコンデンサーレンズ19の間に配置
されており、透過観察の場合には開放されてい
る。上記標本8を透過した光は、対物レンズ7に
よつて収れんされ、ダイクロイツクミラー6、吸
収フイルター9を通り、観察用プリズム14によ
り光路が曲げられて、接眼レンズ15を介して標
本8が観察さる。上記観察用プリズム14は光路
に挿脱自在に配置されており、標本8を観察する
場合のみ光路に挿入され、螢光測光を行なう場合
には、光路から退けられる。21は光源16の制
御電源であり、後述する螢光測光・螢光観察を行
なう場合に検出器11の保護及び消費電力の低減
のために、光源16の明るさを制御することがで
きる。
An embodiment of the present invention will be described with reference to the drawings. The same parts as those in FIG. 1 are given the same numbers. The light emitted from the transmission light source 16 such as a tungsten lamp or a halogen lamp is
The light is focused by a lens 17, reflected by a total reflection mirror 18 installed obliquely at 45 degrees, and placed on a stage by a condenser lens 19.
irradiates from below. Reference numeral 20 denotes a shutter for transmitted light, which is disposed between the specimen 8 and the condenser lens 19, and is opened for transmission observation. The light transmitted through the specimen 8 is converged by the objective lens 7, passes through the dichroic mirror 6 and the absorption filter 9, the optical path is bent by the observation prism 14, and the specimen 8 is observed through the eyepiece 15. Monkey. The observation prism 14 is removably arranged in the optical path, and is inserted into the optical path only when observing the specimen 8, and removed from the optical path when performing fluorescence photometry. Reference numeral 21 denotes a control power source for the light source 16, which can control the brightness of the light source 16 in order to protect the detector 11 and reduce power consumption when performing fluorescence photometry and fluorescence observation, which will be described later.

次い、螢光測光の光学系について説明する。超
高圧水銀灯の光源1から発する光線は、励起光用
シヤツター22を通り、レンズ2によつて集光さ
れ、チヨツパー3で変調をかけられた後、レンズ
4により、標本8上の励起光による照射面を規制
するためのピンホール5を背後から証明する。上
記ピンホール5を出た光線はダイクロイツクミラ
ー6で反射され、対物レンズ7により、ステージ
上に載置されている標本8上にピンホール5の像
を結像する。このピンホール5により励起された
標本8から発する螢光は対物レンズ7により収れ
んされ、ダイクロイツクミラー6によつて反射さ
れて、励起光を遮断する吸収フイルター9を透過
する。この吸収フイルター9を透過した光線は検
出器用シヤツター23及び測光フイルター10を
通過して、螢光測光を検出する高感度の検出器1
1に入射する。上記検出器11の出力信号は増幅
器12によつて増幅された後、演算回路13によ
つて、所要の処理が行なわれ、螢光値として出力
される。上記励起光用シヤツター22は標本8の
後述する螢光観察及び螢光測光を行なう場合は開
放されており、透過光による標本8の観察の場合
は閉じられている。さらに、上記検出器用シヤツ
ター23は螢光測光を行なう場合のみ開放されて
おり、透過光による標本8の観察及び後述する螢
光観察の場合は閉じられており、高感度の検出器
11が透過光や外来光の入射によつて破損される
のを防いでいる。さらに、螢光観察を行なう場合
について説明する。上記螢光測光の状態で、観察
用プリズム14を光路に挿入することによつて、
標本8の螢光像を接眼レンズ15を介して観察す
ることができる。
Next, the optical system for fluorescence photometry will be explained. The light beam emitted from the light source 1 of the ultra-high pressure mercury lamp passes through the excitation light shutter 22, is focused by the lens 2, is modulated by the chopper 3, and then is irradiated by the excitation light onto the specimen 8 by the lens 4. The pinhole 5 for regulating the surface is verified from behind. The light beam exiting the pinhole 5 is reflected by a dichroic mirror 6, and an objective lens 7 forms an image of the pinhole 5 on a specimen 8 placed on a stage. Fluorescent light emitted from the specimen 8 excited by the pinhole 5 is converged by the objective lens 7, reflected by the dichroic mirror 6, and transmitted through an absorption filter 9 that blocks the excitation light. The light beam transmitted through this absorption filter 9 passes through a detector shutter 23 and a photometric filter 10, and a highly sensitive detector 1 detects fluorescence photometry.
1. The output signal of the detector 11 is amplified by an amplifier 12, then subjected to necessary processing by an arithmetic circuit 13 and output as a fluorescence value. The excitation light shutter 22 is opened when performing fluorescence observation and fluorescence photometry of the specimen 8, which will be described later, and is closed when observing the specimen 8 using transmitted light. Further, the detector shutter 23 is opened only when performing fluorescence photometry, and is closed when observing the specimen 8 using transmitted light and for fluorescence observation described later, so that the highly sensitive detector 11 is opened only when performing fluorescence photometry. This prevents damage due to the incidence of external light. Furthermore, the case of performing fluorescence observation will be explained. By inserting the observation prism 14 into the optical path in the above-mentioned fluorescent photometry state,
A fluorescent image of the specimen 8 can be observed through the eyepiece 15.

上記標本8は螢光測光及び観察用の染色と透過
光による観察のための染色との二種類の染色を施
しておく必要がある。例えば、フオイルゲン染色
のように、螢光側光及び観察用の染色が、可視域
で吸収を持つ場合は、透過光による観察のために
使用することができる。た、透過光による観察を
位相差検鏡にして透過用の染色を省くことも可能
であう。位相差検鏡としては対物外位相差、コン
デンサ外位相差も可能である。
The specimen 8 needs to be subjected to two types of staining: one for fluorescence photometry and observation, and one for observation using transmitted light. For example, when a dye for fluorescent light and observation, such as Fluorgen staining, has absorption in the visible range, it can be used for observation using transmitted light. It may also be possible to use a phase contrast microscope for observation using transmitted light and omit staining for transmission. As a phase difference microscope, an extra-objective phase difference and an extra-condenser phase difference are also possible.

第3図は透過光による観察によつて、標本の選
択、位置決めをしながら、螢光測光に切換える場
合のシヤツター関係の開閉を主としたフローの一
例を示しており、特に高感度の検出器の保護に注
意をしたフローを示している。
Figure 3 shows an example of the flow mainly of shutter-related opening and closing when switching to fluorescence photometry while selecting and positioning a specimen using transmitted light observation. This shows a flow that takes care to protect the data.

このような構成によれば、透過観察と蛍光測光
及び観察を切換えて使用することができるので、
透過観察で蛍光標本の選択、位置決めを行つた後
に、蛍光測光をすることができるので、蛍光標本
の退色を防ぐことができる。また、蛍光観察だけ
では得られない形態的情報を透過観察によつて得
ることができるので、従来の透過観察による細胞
診のノウハウを蛍光観察のデータと合わせて活用
することができる、 本発明は上記実施例に限定されるものではな
く、種々の変形が考えられる。観察用プリズムと
して半透過用プリズムを使用すれば、螢光像観察
をしながら、螢光測光も同時に行なうこともでき
る。さらに、励起光用シヤツターもチヨツパー羽
根が光路を遮つた位置で止めるようにすれば、励
起光用シヤツターを省略することもできる。さら
に、螢光用のダイクロイツクミラー及び吸収フイ
ルターを介して透過光による像に色づきが発生す
る場合には、透過光による観察の際には、ダイク
ロイツクミラー及び吸収フイルターを光路から退
けることもできる。さらに本発明の装置は螢光測
光を目的としない場合には、螢光観察と透過観察
を切替えながら観察する目的にも使用できる。さ
らに、上記シヤツターの開閉、光源の制御をマイ
コンを使用して制御するようにすれば、制御も容
易で、誤動作を防ぐこともできる。さらに、ダイ
クロイツクミラーの代りに、光分割部材としてプ
リズムを使用してもよい。
With this configuration, it is possible to switch between transmission observation and fluorescence photometry and observation.
Fluorescence photometry can be performed after selecting and positioning a fluorescent specimen through transmission observation, thereby preventing color fading of the fluorescent specimen. Furthermore, since morphological information that cannot be obtained by fluorescence observation alone can be obtained by transmission observation, the know-how of conventional cytodiagnosis by transmission observation can be utilized in conjunction with fluorescence observation data. The embodiments are not limited to the above embodiments, and various modifications can be made. If a semi-transmissive prism is used as the viewing prism, fluorescence photometry can be performed simultaneously while observing a fluorescence image. Furthermore, if the excitation light shutter is also stopped at a position where the chopper blade blocks the optical path, the excitation light shutter can be omitted. Furthermore, if the image caused by the transmitted light through the fluorescent dichroic mirror and absorption filter is colored, the dichroic mirror and absorption filter can be removed from the optical path during observation using the transmitted light. . Furthermore, when the apparatus of the present invention is not intended for fluorescence photometry, it can also be used for observation while switching between fluorescence observation and transmission observation. Furthermore, if the opening/closing of the shutter and the control of the light source are controlled using a microcomputer, the control is easy and malfunctions can be prevented. Furthermore, a prism may be used as the light splitting member instead of the dichroic mirror.

本発明によれば、蛍光観察及び蛍光測光時に透
過光用シヤツターを閉じることにより、従来問題
とされているコンデンサーレンズの自家蛍光を防
止して精度の高い蛍光観察及び蛍光測光を行うこ
とができる。
According to the present invention, by closing the transmitted light shutter during fluorescence observation and fluorescence photometry, it is possible to prevent autofluorescence of a condenser lens, which has been a problem in the past, and to perform highly accurate fluorescence observation and fluorescence photometry.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]

第1図は従来例の光学系、第2図は本発明の一
実施例の光学系、第3図は第2図の光学系を使用
した操作のフローチヤートである。
FIG. 1 is a conventional optical system, FIG. 2 is an optical system according to an embodiment of the present invention, and FIG. 3 is a flowchart of operations using the optical system shown in FIG.

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] 1 標本の選択、位置決めをするために透過照明
系を有する透過光観察光学系と、標本に励起光を
照射する落射励起光照明系及び標本からの蛍光を
測光する受光素子を有する蛍光測光光学系と、上
記透過光観察光学系より上記標本に照射される光
を遮断する透過光用シヤツターと、上記励起光照
明系より上記試料に照射される励起光を遮断する
励起用シヤツターとを備えた蛍光顕微測光装置に
おいて、上記透過光用シヤツターを上記透過光観
察光学系のコンデンサーレンズと試料との間に設
けたことを特徴とする蛍光顕微測光装置。
1. A transmitted light observation optical system that has a transmitted illumination system for selecting and positioning the specimen, an epi-excitation light illumination system that irradiates the specimen with excitation light, and a fluorescence photometry optical system that has a light receiving element that measures fluorescence from the specimen. a fluorescence shutter comprising: a transmitted light shutter for blocking light irradiated onto the specimen from the transmitted light observation optical system; and an excitation shutter for blocking excitation light irradiated onto the sample from the excitation light illumination system. A fluorescence microphotometer, characterized in that the transmitted light shutter is provided between the condenser lens of the transmitted light observation optical system and the sample.
JP10890883A 1983-06-17 1983-06-17 Fluorescence microphotometric device Granted JPS60420A (en)

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JPS60420A JPS60420A (en) 1985-01-05
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