JPH05507850A - sex-determining gene - Google Patents
sex-determining geneInfo
- Publication number
- JPH05507850A JPH05507850A JP91511410A JP51141091A JPH05507850A JP H05507850 A JPH05507850 A JP H05507850A JP 91511410 A JP91511410 A JP 91511410A JP 51141091 A JP51141091 A JP 51141091A JP H05507850 A JPH05507850 A JP H05507850A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fragment
- sry
- chromosome
- sequence
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 277
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 167
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 123
- 101150059736 SRY gene Proteins 0.000 claims description 121
- 210000002593 Y chromosome Anatomy 0.000 claims description 108
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 91
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 85
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 80
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 78
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 67
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 67
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 65
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 62
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 62
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 61
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 56
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 claims description 51
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 47
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 38
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 37
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 37
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 31
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 29
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 23
- 241000289695 Eutheria Species 0.000 claims description 22
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 20
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 claims description 17
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 16
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 claims description 13
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 10
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 10
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 7
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 claims description 6
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 6
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 claims description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 claims 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims 2
- 241000289619 Macropodidae Species 0.000 claims 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims 1
- 241000282335 Procyon Species 0.000 claims 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 claims 1
- 210000002747 omentum Anatomy 0.000 claims 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims 1
- 101000826130 Homo sapiens Sex-determining region Y protein Proteins 0.000 description 106
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 78
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 78
- 102100022978 Sex-determining region Y protein Human genes 0.000 description 77
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 52
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 52
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 40
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 36
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 32
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 30
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 29
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 28
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 28
- 230000008771 sex reversal Effects 0.000 description 28
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 27
- 238000011161 development Methods 0.000 description 27
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 27
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 27
- 239000000047 product Substances 0.000 description 24
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 23
- 230000008859 change Effects 0.000 description 22
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 22
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 21
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 21
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 20
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 19
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 19
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 19
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 18
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 18
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 18
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 18
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 17
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 description 15
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 15
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 14
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 14
- 241000894007 species Species 0.000 description 14
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 13
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 13
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 13
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 102000045589 human SRY Human genes 0.000 description 13
- 230000020509 sex determination Effects 0.000 description 13
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 13
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 12
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 12
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 12
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 11
- 101100053842 Mus musculus Zfy1 gene Proteins 0.000 description 11
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 10
- 230000006870 function Effects 0.000 description 10
- 210000001182 human Y chromosome Anatomy 0.000 description 10
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 10
- 108700010045 sry Genes Proteins 0.000 description 10
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 9
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 230000023508 male gonad development Effects 0.000 description 9
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 9
- 238000011160 research Methods 0.000 description 9
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 8
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 8
- 108700029634 Y-Linked Genes Proteins 0.000 description 8
- 230000009471 action Effects 0.000 description 8
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 8
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 8
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 8
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 7
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 7
- 230000008948 male sex determination Effects 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 6
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 6
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 230000010196 hermaphroditism Effects 0.000 description 6
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 6
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 6
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 6
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 5
- 101100478386 Mus musculus Sry gene Proteins 0.000 description 5
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 5
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 5
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 5
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 102000054584 human Y acceptor Human genes 0.000 description 5
- 108700023876 human Y acceptor Proteins 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 5
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 5
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 5
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 5
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 5
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 5
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 4
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 4
- 101000658545 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Type I restriction enyme HindI endonuclease subunit Proteins 0.000 description 4
- 101710185235 High mobility group protein 1 Proteins 0.000 description 4
- 102100037907 High mobility group protein B1 Human genes 0.000 description 4
- 101710168537 High mobility group protein B1 Proteins 0.000 description 4
- 102100032970 Myogenin Human genes 0.000 description 4
- 108010056785 Myogenin Proteins 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100026123 Pirin Human genes 0.000 description 4
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 4
- 101710188553 Sex-determining region Y protein Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 4
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 4
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 4
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 4
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 4
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 4
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- WQGWDDDVZFFDIG-UHFFFAOYSA-N pyrogallol Chemical compound OC1=CC=CC(O)=C1O WQGWDDDVZFFDIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000005132 reproductive cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000003765 sex chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000021419 vinegar Nutrition 0.000 description 4
- 239000000052 vinegar Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 3
- 102100040428 Chitobiosyldiphosphodolichol beta-mannosyltransferase Human genes 0.000 description 3
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 3
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100022130 High mobility group protein B3 Human genes 0.000 description 3
- 101000891557 Homo sapiens Chitobiosyldiphosphodolichol beta-mannosyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 101001006375 Homo sapiens High mobility group nucleosome-binding domain-containing protein 4 Proteins 0.000 description 3
- 101001045794 Homo sapiens High mobility group protein B3 Proteins 0.000 description 3
- 101100366667 Homo sapiens SRY gene Proteins 0.000 description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100489384 Mus musculus Zfy2 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000287462 Phalacrocorax carbo Species 0.000 description 3
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 3
- 108010067618 Sex Chromatin Proteins 0.000 description 3
- 244000223014 Syzygium aromaticum Species 0.000 description 3
- 235000016639 Syzygium aromaticum Nutrition 0.000 description 3
- 101001081186 Tetrahymena pyriformis High mobility group protein Proteins 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 3
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 3
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 description 3
- 101150026150 mt gene Proteins 0.000 description 3
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 3
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 3
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 210000000671 sex chromatin Anatomy 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 102000008482 12E7 Antigen Human genes 0.000 description 2
- 108010020567 12E7 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100039869 Histone H2B type F-S Human genes 0.000 description 2
- 101001035372 Homo sapiens Histone H2B type F-S Proteins 0.000 description 2
- 101150003028 Hprt1 gene Proteins 0.000 description 2
- 125000002059 L-arginyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])C(=N[H])N([H])[H] 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 206010068052 Mosaicism Diseases 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 2
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 229910052770 Uranium Inorganic materials 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001371 alpha-amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 2
- 238000003975 animal breeding Methods 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 230000002559 cytogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 2
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 2
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 2
- 230000011272 imaginal disc-derived genitalia development Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 210000003794 male germ cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000023386 male meiosis Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 101150009398 ry gene Proteins 0.000 description 2
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000365 steroidogenetic effect Effects 0.000 description 2
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 2
- 238000006257 total synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 2
- UJSHBYQGQRPVNO-LLVKDONJSA-N (9r)-9-hydroxy-8,8-dimethyl-9,10-dihydropyrano[2,3-h]chromen-2-one Chemical compound C1=CC(=O)OC2=C(C[C@H](C(C)(C)O3)O)C3=CC=C21 UJSHBYQGQRPVNO-LLVKDONJSA-N 0.000 description 1
- SVPKNMBRVBMTLB-UHFFFAOYSA-N 2,3-dichloronaphthalene-1,4-dione Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(Cl)=C(Cl)C(=O)C2=C1 SVPKNMBRVBMTLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JEPVUMTVFPQKQE-AAKCMJRZSA-N 2-[(1s,2s,3r,4s)-1,2,3,4,5-pentahydroxypentyl]-1,3-thiazolidine-4-carboxylic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C1NC(C(O)=O)CS1 JEPVUMTVFPQKQE-AAKCMJRZSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WRROLJSGZKCWGR-UHFFFAOYSA-N 3-(4-aminobutylamino)propylazanium;chloride Chemical compound Cl.NCCCCNCCCN WRROLJSGZKCWGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108020004491 Antisense DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000473391 Archosargus rhomboidalis Species 0.000 description 1
- 235000000832 Ayote Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000212384 Bifora Species 0.000 description 1
- 244000201986 Cassia tora Species 0.000 description 1
- 229920002160 Celluloid Polymers 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 108091062157 Cis-regulatory element Proteins 0.000 description 1
- 241000252203 Clupea harengus Species 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 101001017206 Coxiella burnetii (strain RSA 493 / Nine Mile phase I) Histone-like protein Hq1 Proteins 0.000 description 1
- 235000009854 Cucurbita moschata Nutrition 0.000 description 1
- 240000001980 Cucurbita pepo Species 0.000 description 1
- 235000009804 Cucurbita pepo subsp pepo Nutrition 0.000 description 1
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 208000027877 Disorders of Sex Development Diseases 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101000953091 Enterobacteria phage P4 Uncharacterized protein ORF88 Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241000238558 Eucarida Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 102000055341 HMGB2 Human genes 0.000 description 1
- 108700010060 HMGB2 Proteins 0.000 description 1
- 102100022128 High mobility group protein B2 Human genes 0.000 description 1
- 101100297421 Homarus americanus phc-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100313199 Homo sapiens CCT5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001045791 Homo sapiens High mobility group protein B2 Proteins 0.000 description 1
- 241000557133 Hunnemannia fumariifolia Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 241000408495 Iton Species 0.000 description 1
- UJSHBYQGQRPVNO-UHFFFAOYSA-N Jatamansinol Natural products C1=CC(=O)OC2=C(CC(C(C)(C)O3)O)C3=CC=C21 UJSHBYQGQRPVNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- 241001446467 Mama Species 0.000 description 1
- 241001599018 Melanogaster Species 0.000 description 1
- 108091092919 Minisatellite Proteins 0.000 description 1
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 101100165744 Oryza sativa subsp. japonica BZIP23 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100165754 Oryza sativa subsp. japonica BZIP46 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 102100029812 Protein S100-A12 Human genes 0.000 description 1
- 101710110949 Protein S100-A12 Proteins 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 102100029886 T-complex protein 1 subunit epsilon Human genes 0.000 description 1
- 241000255588 Tephritidae Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 101150111300 abf2 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000006578 abscission Effects 0.000 description 1
- YRKCREAYFQTBPV-UHFFFAOYSA-N acetylacetone Chemical compound CC(=O)CC(C)=O YRKCREAYFQTBPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006154 adenylylation Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- -1 and by analogy Proteins 0.000 description 1
- 239000003816 antisense DNA Substances 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 238000010352 biotechnological method Methods 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000000453 cell autonomous effect Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 210000003793 centrosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 210000001726 chromosome structure Anatomy 0.000 description 1
- 210000000078 claw Anatomy 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000004020 conductor Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 210000001608 connective tissue cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 1
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000019975 dosage compensation by inactivation of X chromosome Effects 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000023428 female meiosis Effects 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 231100000502 fertility decrease Toxicity 0.000 description 1
- 238000010304 firing Methods 0.000 description 1
- 210000004186 follicle cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 238000010448 genetic screening Methods 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 230000026109 gonad development Effects 0.000 description 1
- 230000002710 gonadal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 201000005611 hermaphroditism Diseases 0.000 description 1
- 235000019514 herring Nutrition 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004090 human X chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- 210000002414 leg Anatomy 0.000 description 1
- 210000002332 leydig cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000005001 male reproductive tract Anatomy 0.000 description 1
- 210000004997 mammalian reproductive system Anatomy 0.000 description 1
- 230000007758 mating behavior Effects 0.000 description 1
- 230000020938 mating type determination Effects 0.000 description 1
- 230000012092 mating type switching Effects 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 210000005012 myelin Anatomy 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000012978 nondisjunction Diseases 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 210000002380 oogonia Anatomy 0.000 description 1
- 230000017448 oviposition Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000008775 paternal effect Effects 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-M phenolate Chemical compound [O-]C1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940031826 phenolate Drugs 0.000 description 1
- 238000012247 phenotypical assay Methods 0.000 description 1
- NCAIGTHBQTXTLR-UHFFFAOYSA-N phentermine hydrochloride Chemical compound [Cl-].CC(C)([NH3+])CC1=CC=CC=C1 NCAIGTHBQTXTLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 235000015136 pumpkin Nutrition 0.000 description 1
- ZLIBICFPKPWGIZ-UHFFFAOYSA-N pyrimethanil Chemical compound CC1=CC(C)=NC(NC=2C=CC=CC=2)=N1 ZLIBICFPKPWGIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000009711 regulatory function Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000010845 search algorithm Methods 0.000 description 1
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 1
- 210000001625 seminal vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000000717 sertoli cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000032678 sex differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- 238000010512 small scale reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000000920 spermatogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 230000021595 spermatogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 208000001608 teratocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000647 testicular hormone Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 238000012256 transgenic experiment Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000013327 true hermaphroditism Diseases 0.000 description 1
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
- 210000001177 vas deferen Anatomy 0.000 description 1
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 1
- 201000010653 vesiculitis Diseases 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6879—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for sex determination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/15—Humanized animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.
Description
【発明の詳細な説明】 性決定遺伝子 本発明はタンパク質、ポリペプチド、核酸断片、抗体および関連産物、並びにこ れらの医学および農学、例えば診断および治療における用途に関する。さらに特 定すると、本発明は真獣下綱（胎盤性）哺乳動物の胚の性をコントロールする遺 伝子およびその関連産物に関し、並びに細胞、胚および組織の性を確認し、また 商業的に重要な動物の子孫の性をコントロールする上での、それらの用途に関す る。[Detailed description of the invention] sex-determining gene The present invention relates to proteins, polypeptides, nucleic acid fragments, antibodies and related products; Concerning their use in medicine and agriculture, such as diagnosis and therapy. Even more special Accordingly, the present invention relates to genes that control the sex of embryos of eutherian (placental) mammals. regarding genes and their related products, as well as determining the sex of cells, embryos and tissues; Regarding their use in controlling the sex of the offspring of commercially important animals. Ru.
真獣下綱晴乳動物においては、性の決定は精巣の決定と同義であることが確かめ られている（ＭｃＬａｒｅｎ Ａ、、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ、、４：１５３ −１５７．１９８８）、性腺は以下の４つの系統に由来する細胞からなる：支持 細胞、ステロイド産生細胞、結合組繊細胞および生殖細胞である。精巣の形成に おいては、支持細胞系統からのセルトーり細胞（Ｓｅｒｔｏｌｉｃｅｌｌｓ）の 分化が、雄性経路へと続くその他の系統の細胞をもたらすと考えられている（Ｂ ｕｒｇｏｙｎｅ、Ｐ、Ｓ、Ｐｈｉ １．Ｔｒａｎｓ、Ｒ，Ｓｏｃ、Ｌｏｎｄ、、 ３２２ ： ６３−７２．１９８８）。この影響の本質についてはまだ知られて いないが、これがライジッヒ細胞（Ｌｅｙｄｉｇ ｃｅｌｌｓ）の分化、生殖細 胞における減数***停止の誘導、および精巣原型への結合組織と血管の増殖およ び組織化をもたらす。セルトーり細胞自体は急速に増殖して”精巣索”に組織化 されるが、これはマウスでは交尾後約１２．５日（ｄ、ｐ、ｃ）で明瞭となり、 雄の発生における最初の特徴ある兆候である。雌性経路では、精巣索を形成しな いこと以外の最初の形態的特徴は、生殖細胞が減数***に入ることであり（Ｍｃ Ｌａｒｅｎ、Ａ、、Ｐｈｉ １．Ｔｒａｎｓ、Ｒ，Ｓｏｃ、Ｌｏｎｄ、、３２２ ：３−９．１９８８；Ｂｏｒｕｍ、に、、Ｅｘｐｔ、Ｃｅ１ｌ Ｒｅｓ、、２４ ：４９５−５０７．１９６１）、次いで卵胞細胞が分化し、これが卵原細胞の 周りに集まってくる。ステロイド産生細胞系統の細胞は膜細胞となり、結合組繊 細胞の増殖または組織化はほとんどない。生殖細胞がないと卵巣は発生しないの で、これは卵巣の決定が生殖細胞中の遺伝子の作用によることを示唆している（ Ｂｕｒｇｏｙｎｅ、Ｐ、Ｓ、、Ｎａｔｕｒｅ、３４２：８６０−８６２．１９８ ９）。生殖細胞は精巣の発生には必要ではない（Ｍｅｒｃｈａｎｔ、Ｈ，、Ｄｅ ｖｌ、Ｂｉｏｌ、、４４ ： １−２１，１９７５ ；ＭｃＬａｒｅｎ、Ａ、、 ”性の起源および進化” （Ｈａｌｖｏｒｓｅｎ、Ｈ，Ｏ，ａｎｄ Ｍｏｎｏｙ 、Ａ、編集）ｐｐ２８９−３００、Ｌｉ５ｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８５）ｏ 卵巣経路は正常または”怠慢（ｄｅ ｆ ａｕ １ ｔ）”経路と考えることが でき、雄における精巣決定遺伝子の発現の結果が未分化の性腺（生殖隆線）にお ける支持細胞前駆体の運命を、卵胞細胞からセルドーリ細胞へと切り換えるので ある。精巣決定遺伝子は、最初は尿生殖隆線の形成に関与し、次に性腺自体の発 生に関与するその他の調節分子との関係において作用するに違いないことが推定 される。It has been confirmed that in eutherian clear mammals, sex determination is synonymous with testicular determination. (McLaren A, Trends Genet, 4:153 -157.1988), the gonads consist of cells derived from four lineages: support cells, steroidogenic cells, connective tissue cells and reproductive cells. For the formation of testicles In the case of Sertolicells from supporting cell lines, Differentiation is thought to lead to cells of other lineages continuing into the male pathway (B urgoyne, P, S, Phi 1. Trans, R, Soc, Lond,... 322: 63-72.1988). The nature of this effect is still unknown. However, this is the differentiation of Leydig cells and reproductive cells. Induction of meiotic arrest in the cyst and growth and proliferation of connective tissue and blood vessels into the testis prototype. and organization. Certoli cells themselves rapidly proliferate and organize into "testicular cords" However, this becomes evident in mice approximately 12.5 days after mating (d, p, c); It is the first characteristic sign of male development. The female route does not form testicular cords. The first morphological feature other than microorganisms is that the germ cells enter meiosis (Mc Laren, A., Phi 1. Trans, R, Soc, Lond, 322 :3-9.1988;Borum, Ni,, Expt, Ce1l Res,, 24 :495-507.1961), then the follicular cells differentiate, which become oogonia. gather around you. Cells of the steroidogenic cell lineage become membranous cells and have connective tissue. There is little cell proliferation or organization. Ovaries cannot develop without reproductive cells. This suggests that the determination of ovaries is due to the action of genes in germ cells ( Burgoyne, P.S., Nature, 342:860-862.198 9). Germ cells are not required for testicular development (Merchant, H., De vl, Biol, 44: 1-21, 1975; McLaren, A. “The Origin and Evolution of Sex” (Halvorsen, H, O, and Monoy , A., ed.) pp289-300, Li5s, New York, 1985) o The ovarian pathway can be considered a normal or “neglected” pathway. The results of testis-determining gene expression in males are expressed in undifferentiated gonads (genital ridges). It switches the fate of supporting cell precursors from follicle cells to Cerdoli cells. be. Testis-determining genes are initially involved in the formation of the urogenital ridge and then in the development of the gonads themselves. It is presumed that it must act in relation to other regulatory molecules involved in life. be done.
雄としての胚発生をもたらす精巣形成と、これに続いて起こる一連の現象の開始 に関与するのは、通常Ｙ染色体上に見られるただ１つの遺伝子である、と疑われ た時期がある。この遺伝子を同定するために多くの研究がなされ、Ｄ、Ｐａｇｅ ら（Ｃｅｌｌ。Testis formation leading to male embryonic development and the initiation of the chain of events that follows. It is suspected that only one gene, usually found on the Y chromosome, is involved in There was a time when Much research has been done to identify this gene, and D.P. (Cell.
５１：１０９１−１１０４．１９８７）が、”ジンクフィンガー”タンパク質を コードする遺伝子を発見したことをもって、この同定に成功したと主張した。し かしながら、これに続く研究において、この遺伝子はＹ染色体をもつ全ての雄に 存在する訳ではないので、このタンパク質は当初信じられた推定の”精巣決定因 子”テはない、ことが示された（Ｐａ １ｍｅ ｒら、Ｎａｔｕｒｅ。51:1091-1104.1987) has identified “zinc finger” proteins. He claimed that he had succeeded in identifying this by discovering the encoding gene. death However, subsequent studies showed that this gene was found in all males with a Y chromosome. However, this protein is not a putative testis-determining factor, which was initially believed to be It has been shown that there are no offspring (Pamer et al., Nature.
３４２：９３７−９３９．１９８９）。これをさらに詳しく以下に説明する。342:937-939.1989). This will be explained in more detail below.
哺乳動物のＹ染色体は雄の性決定において決定的な役割を演じている。すなわち 、Ｙ染色体をもつ胚は雄として発生し、Ｙ染色体を欠く胚は雌として発生する（ Ｇｏｏｄｆ ｅ １ ｌｏｗ、Ｐ、Ｎ、ａｎｄ Ｄａｒｌｉｎｇ、Ｓ、Ｍ、、Ｄ ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１０２：２５１−２５８．１９８８）。Ｙ染色体上にあ る雄の性決定遺伝子は精巣の発生を誘導し、それに続く雄の性分化は精巣のホル モン生産の結果である（Ｊｏｓｔ、Ａ、ら、Ｒｅｃｅｎｔ Ｐｒｏｇ、Ｈｏｒｍ 、Ｒｅｓ、、２９ ： １−４１．１９７３）。Ｙによってコードされる精巣決 定遺伝子はヒトでは精巣決定因子（ｔｅｓｔｉｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｆ ａｃｔｏｒ：ＴＤＦ）と一般に呼ばれ、マウスではＴｄｙ（精巣決定Ｙ染色体） と呼ばれてきた。雄性、雌性ともに性決定と分化には多くの異なる遺伝子が要求 されるようであるが、精巣決定遺伝子の作用形態を理解することは、哺乳動物に おける発生決定の遺伝的コントロールの一般的モデルを提供するかも知れない。The mammalian Y chromosome plays a crucial role in male sex determination. i.e. , embryos with a Y chromosome develop as males, and embryos lacking a Y chromosome develop as females ( Goodf e 1 low, P, N, and Darling, S, M,, D development, 102:251-258.1988). Located on the Y chromosome Male sex-determining genes induce testis development, and subsequent male sexual differentiation is determined by testicular hormones. (Jost, A., et al., Recent Prog, Horm. , Res, 29: 1-41.1973). Testicular determination coded by Y The constant gene is testis determining factor (testis determining factor) in humans. actor: TDF), and in mice, Tdy (testis-determining Y chromosome) has been called. Many different genes are required for sex determination and differentiation in both male and female sexes However, understanding the mode of action of testis-determining genes will be of great help in mammals. may provide a general model for genetic control of developmental decisions in the human body.
精巣決定遺伝子を同定し、かつクローン化する試みによって、Ｙ染色体の詳しい 地図が明らかとなった。以下の３種の地図が作成された： （ａ）性転換ＸＸ雄 およびＸＹ雌のゲノムを解析することによって作成された欠失地図（Ｖｅｒｇｎ ａｕｄ、Ｇ、ら、Ａｍ、Ｊ、Ｈｕｍ、Ｇｅｎｅｔ、、３８ ：１０９−１２４， １９８５；Ｇｕｅｌｌａｅｎ、Ｇ、ら、Ｎａｔｕｒｅ、３０７：１７２−１７３ ，１９８４；Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ、Ｐ、Ｊ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ、２３４ニア ４０−７４３．１９８６）、（ｂ） ＸおよびＹ染色体によって共有されている 偽書染色体（ｐｓｅｕｄｏ ａ ｕ ｔ ｏ ｓ ｏｍａ Ｉ）の減数***地図 （Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ、Ｐ、Ｊ、ら、上記文献；Ｗｅｉｓｓｅｎｂａｃｈ、Ｊ 、ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、ｌ０ＩＳ：６７−７４．１９８７）および（ｃ ）最初の２つの地図を連結する長い領域の制限酵素地図（Ｐｒｉ ｔｃｈａｒｄ 、Ｃ，Ａ、、Ｇｏｏｄｆｅｌ ｌｏｗ、Ｐ、Ｊ、 ａｎｄ Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏ ｗ、Ｐ、Ｎ、、Ｎａｔｕｒｅ。Efforts to identify and clone the testis-determining gene have led to a detailed understanding of the Y chromosome. The map has been revealed. The following three types of maps were created: (a) transsexual XX male; and a deletion map created by analyzing the genomes of XY females (Vergn aud, G., et al., Am, J., Hum, Genet, 38:109-124, 1985; Guellaen, G. et al., Nature, 307:172-173 , 1984; Goodfellow, P. J., et al., 5science, 234 Near 40-743.1986), (b) shared by the X and Y chromosomes Meiotic map of pseudochromosome (pseudo au t o s oma I) (Goodfellow, P. J., et al., supra; Weissenbach, J. , et al., Development, 10IS:67-74.1987) and (c ) Restriction enzyme map of the long region connecting the first two maps (Pritchard , C, A, , Goodfel low, P, J, and Goodfello w,P,N,,Nature.
３２８：２７３−２７５．１９８７）。328:273-275.1987).
ＸＸ雄の大多数は、ＸおよびＹ染色体間における末端交換によって、精巣決定遺 伝子を含む遺伝的にＹ由来の配列をもっている（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ−Ｓｍｉ ｔ ｈ、Ｍ、Ａ、、Ｌａｎｃｅｔ、ｉｉ、７１１．１９６６） （Ｐｅｔｉｔ、Ｃ， ら、Ｃｅ１ｌ、４９：’５９５−６０２．１９８７）。異なるＸＸ雄に存在する Ｙ断片に基づいた地図では、精巣決定遺伝子を偽書染色体領域に隣接するＹ染色 体の遠位部分のところに配置した。偽書染色体領域の減数***地図は、ＭＩＣ２ がＹ染色体の住持異的部分に最も近い偽書染色体遺伝子座であることを示した。The majority of XX males have testis-determining genes due to end exchange between the X and Y chromosomes. It has a genetically Y-derived sequence containing the gene (Ferguson-Smit h, M. A., Lancet, II, 711.1966) (Petit, C. et al., Ce11, 49:'595-602.1987). Present in different XX males Maps based on Y fragments locate testis-determining genes in Y-stained areas adjacent to pseudochromosomal regions. It was placed at the distal part of the body. The meiotic map of the pseudochromosomal region is MIC2 was shown to be the pseudochromosomal locus closest to the endomorphic portion of the Y chromosome.
ＭＩＣ２にある長い領域の制限酵素地図は、精巣決定遺伝子の候補と注目される ＣｐＧに富む領域を同定した。この遺伝子は後にＺＦＹと命名され、ＣｐＧに富 む領域近傍の１３０ｋｂから始める染色体歩行によって、Ｐａｇｅら（上記文献 ）によりクローニングされた。Restriction enzyme map of a long region in MIC2 attracts attention as a candidate for testis-determining gene CpG-rich regions were identified. This gene was later named ZFY and is CpG-rich. By chromosome walking starting from 130 kb near the region that ) was cloned by.
特定のＸＸ雄（ＬＧＬ ２０３）に存在するがＸＹ雌（ＷＨＴＩ０１３）には存 在しない配列の分析により、精巣決定遺伝子の位置を１４０ｋｂの間隔内に同定 し、ＺＦＹもこの同じ領域内に位置した。ＺＦＹと精巣決定遺伝子との同一性を 裏付けるその他の証拠には、調べた真獣下綱補乳動物の全てのＹ染色体上にＺＦ Ｙ関連配列が見いだされたことが含まれ、すなわち、Ｓｘｒ’ （性を決定する ものとして知られているマウスＹ染色体の最も小さい部分）にＺＦＹ関連遺伝子 であるｚｆｙ−ｔが存在し、また転写因子と共通の多くの特徴を有するＺＦＹコ ード化タンパク質の構造が存在する。しかしながら、多数の子期せぬ知見も得ら れた。Exist in specific XX males (LGL 203) but not in XY females (WHTI013) Analysis of missing sequences identifies the location of testis-determining genes within a 140 kb interval However, ZFY was also located within this same region. Identity of ZFY and testis-determining gene Other supporting evidence includes the presence of a ZF on the Y chromosome in all eutherian complement mammals examined. Y-related sequences were found, i.e., Sxr' (sex-determining The smallest part of the mouse Y chromosome known to contain ZFY-related genes zfy-t exists, and there is also a ZFY component that has many characteristics in common with transcription factors. Structures of encoded proteins exist. However, a large number of unrelated findings were also obtained. It was.
すなわち、ＺＦＹと相同のＺＦＸが真獣下綱のＸ染色体上に存在し、不活性化を 免れており（Ｐａｌｍｅｒら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ 、８７ ：１６８１−１６８５，１９９０ ； ５ｃｈｎｅ ｉｄｅ ｒ−Ｇａ ｄ ｉ ｅｋｅら、Ｃｅ１１．５７：１２４７−１２５８）、後獣下綱（有袋類 ）哺乳動物にはＺＦＹ関連配列がＹまたはＸ染色体上に存在せず、常染色体であ る（Ｓｉｎｃｌａｉｒ、Ａ、Ｈ，ら、Ｎａｔｕｒｅ、３３６：７８０−７８２． １９８８）などの知見である。In other words, ZFX homologous to ZFY exists on the X chromosome of eutherians, and is responsible for inactivation. (Palmer et al., Proc. Natl., Acad, Sci., USA) , 87:1681-1685, 1990; 5chne ide r-Ga d i Eke et al., Ce11.57:1247-1258), Metatherian (Marsupial ) Mammals do not have ZFY-related sequences on the Y or X chromosomes, and are autosomal. (Sinclair, A. H. et al., Nature, 336:780-782. 1988).
最近の報告がさらに雄の性決定におけるＺＦＹの役割に疑問を投げかけた。ＺＦ Ｙのマウス相同体であるＺｆｙ−１およびＺｆＶ−２の発現の研究において（Ｋ ｏｏｐｍａｎ、Ｐ、ら、Ｎａｔｕｒｅ、３４２：９４０−９４２．１９８９）、 その発現は正常な雄の発生には必要とされない細胞種である生殖細胞に限定され 、Ｗ”／Ｗ＠突然変異体マウスではＺ ｆ Ｖ−１およびＺｆｙ−２の発現がな くても精巣の発生が観察された。さらに、遺伝的にＹ由来の配列を受け継ぐが、 遺伝的にＺＦＹを受け継がない４匹の雄が発見された。これらの個体はそのＹ由 来の配列の故に雄性なのであると考えられ、精巣決定遺伝子を偽書染色体境界に すぐ隣接する６０ｋｂに位置付けた。この結果はＸＹ雌の発表された中断点と一 致しくＰａｇｅら、上記文献）、ＺＦＹを精巣決定遺伝子の候補として正式に排 除することとなった（Ｐａ １ｍｅ ｒ、 Ｍ、 Ｓ、ら、Ｎａｔｕｒｅ、３４ ２：９３７−９３９．１９８９）。Recent reports have further cast doubt on the role of ZFY in male sex determination. ZF In studying the expression of Zfy-1 and ZfV-2, the mouse homologues of Y (K oopman, P. et al., Nature, 342:940-942.1989), Its expression is restricted to germ cells, a cell type that is not required for normal male development. , W”/W@ mutant mice lack expression of ZfV-1 and Zfy-2. Testicular development was observed even when Furthermore, although they genetically inherit sequences derived from Y, Four males were discovered that did not genetically inherit ZFY. These individuals are the reason It is thought that it is male due to its original sequence, and the testis-determining gene is located at the pseudochromosomal border. It was located at the immediately adjacent 60kb. This result is consistent with the published break point for XY females. Page et al. (cited above) formally excluded ZFY as a candidate testis-determining gene. (Pa1mer, M, S, et al., Nature, 34 2:937-939.1989).
（この結果は後に覆され、患者の中断点は今では本発明者の精巣決定遺伝子の位 置に関する結果と一致する。）本発明者らは偽書染色体境界近傍のＹ染色体の領 域に研究の的を絞り、成人精巣で発現するが、その他の成人ヒト組織では発現し ないコーディング配列であって、かつ性の決定が起こるときに生殖隆線で発現し 、今日までに調べられた全ての真獣下綱唾乳動物のＹ染色体上に見られる配列と 交差ハイブリダイズする、マウスにおけるコーディング配列と高い相同性を有す るコーディング配列を上記領域内に位置付けた。このコーディング配列の一部は 、Ｍｃタンパク質をコードしかつ接合型決定と***酵母の減数***に必要とされ るシゾサツカロミセス・ボンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐ ｏｍｂｅ）の接合型−またはｍａｔ−遺伝子座に位置付けられるＭｃ遺伝子の一 部と驚くほどの高い相同性を有することが示された。(This result was later reversed, and the patient's break point now lies at the location of the inventor's testis-determining gene. This is consistent with the results regarding location. ) The present inventors investigated the region of the Y chromosome near the boundary of the pseudochromosome. The focus of research has been on the area of cancer that is expressed in the adult testis but not in other adult human tissues. A coding sequence that is not present and is expressed in the genital ridge when sex determination occurs. , the sequence found on the Y chromosome of all eutherian salivary mammals investigated to date. Cross-hybridizes and has high homology to coding sequences in mouse The coding sequence was located within the above region. Part of this coding sequence is , encodes the Mc protein and is required for mating type determination and meiosis in fission yeast. Schizosaccharomyces p. One of the Mc genes located at the mating type- or mat- locus of It was shown to have surprisingly high homology with the part.
本発明は添付の図面を参照して定義され、説明される。The invention will be defined and described with reference to the accompanying drawings.
図１は、ヒトおよびウサギのゲノムＤＮＡ配列と、これに対応する推定ポリペプ チド配列を示す。Figure 1 shows the human and rabbit genomic DNA sequences and their corresponding putative polypeptide sequences. The sequence is shown.
図２は、ヒトＹ染色体の短腕の遠位領域の地図を示す。Figure 2 shows a map of the distal region of the short arm of the human Y chromosome.
図３は、各種のヒトＤＮＡサンプルのＨｉｎｄＩ［Ｉ消化物のサザンプロット分 析を示す。Figure 3 shows Southern plot fractions of HindI[I digests of various human DNA samples. The analysis is shown below.
図４は、各種の真獣下綱補乳動物からのＤＮＡサンプルのＨｉｎｄＩＩ［消化物 のサザンプロット分析を示す。Figure 4 shows HindII [digested products] of DNA samples from various eutherian auxiliary mammals. Southern blot analysis of .
図５は、各種の細胞系からのＤＮＡサンプルのＨｉｎｄＩＩＩ消化物のサザンプ ロット分析を示す。Figure 5 shows Southern samples of HindIII digests of DNA samples from various cell lines. Show lot analysis.
図６は、ヒトおよびウサギＤＮＡセグメントのヌクレオチド配列を示す。Figure 6 shows the nucleotide sequences of human and rabbit DNA segments.
図７は、Ｓ、ｐｏｍｂｅ（７）Ｍｅタンパク質と、図６のＤＮＡ配列に対応する ヒトおよびウサギの推定ポリペプチドとの相同領域のアミノ酸配列を示す。Figure 7 corresponds to the S, pombe (7) Me protein and the DNA sequence of Figure 6. Amino acid sequences of homologous regions with human and rabbit putative polypeptides are shown.
図８は、各種のヒト組織および細胞系からのポリ（Ａａ ＲＮＡのノーザンプロ ット分析を示す。Figure 8 shows Northern profiling of poly(Aa RNA) from various human tissues and cell lines. This shows the cut analysis.
図９は、プローブｐＹ５３．３ （２，Ｉｋｂ）サブクローンの模式図を示す。Figure 9 shows a schematic diagram of the probe pY53.3 (2, Ikb) subclone.
図１０は、ｐＹ５３．３の８０アミノ酸残基の保存性ｍｔ−ボックスの配列およ びその他のタンパク質の対応する配列を示す。Figure 10 shows the sequence and sequence of the 80 amino acid conserved mt-box of pY53.3. The corresponding sequences of and other proteins are shown.
図１１は、３つの異なるプローブで検索したマウスＤＮＡ消化物のサザンプロッ トを示す。Figure 11 shows Southern plots of mouse DNA digests probed with three different probes. Indicates the
図１２は、ファージＬ？、４．１の制限酵素地図を示す。Figure 12 shows Phage L? , 4.1 shows the restriction enzyme map.
図１３は、Ｌ７．４．１から得られた各種のプローブで検索したマウスＤＮＡの サザンプロットを示す。Figure 13 shows mouse DNA searched with various probes obtained from L7.4.1. A Southern plot is shown.
図１４は、ｍｔ−ボックスを含むマウスおよびヒトのＹ一連鎖領域のヌクレオチ ド配列を示す。Figure 14 shows nucleotide sequences of mouse and human Y-linked regions containing the mt-box. shows the code array.
図１５は、マウス胚ｃＤＮＡ上でのポリメラーゼチェインリアクションの結果を 示す。Figure 15 shows the results of polymerase chain reaction on mouse embryonic cDNA. show.
図１６は、相同なヒトおよび酵母の配列と比較した、各種のマウスＤＮＡ領域の アミノ酸残基配列を示す。Figure 16 shows various mouse DNA regions compared to homologous human and yeast sequences. Amino acid residue sequences are shown.
図１７は、図１６の配列間の相同性をまとめて示したものである。FIG. 17 summarizes the homology between the sequences in FIG. 16.
図１８は、ヒト、ウサギおよびマウスのｍｔタンパク質のコーディング配列と、 対応するアミノ酸残基の配列を示す。Figure 18 shows the coding sequences of human, rabbit and mouse mt proteins; The sequences of the corresponding amino acid residues are shown.
図１９は、ＥＭＢＬデータベースおよびＮＣＩＭＢに寄託番号ＮＣＩＭＢ４０３ ０８で寄託されているｐＹ５３．３の配列を示す。Figure 19 shows the EMBL database and NCIMB deposit number NCIMB403. The sequence of pY53.3 deposited in 2008 is shown.
図２０は、実施例３のファージクローンＬ７．４．１からの挿入物ＰＫＳ ７４ １の配列を示す。Figure 20 shows the insert PKS74 from phage clone L7.4.1 of Example 3. 1 is shown.
図２１は、ｐＹ５３．３のオーブンリーディングフレームの模式図およびＳＲＹ の一部とその２つの突然変異体の配列を示す。Figure 21 shows a schematic diagram of the oven reading frame of pY53.3 and SRY The sequences of a portion of and its two mutants are shown.
図２２は、ＳＲＹおよび関連遺伝子の配列の一部を示す。Figure 22 shows part of the sequence of SRY and related genes.
図２３は、実施例５に記載するゲノムＤＮＡ断片を示す。FIG. 23 shows the genomic DNA fragment described in Example 5.
図２４は、性転換した胚の分析結果を示す。Figure 24 shows the results of analysis of sex-reversed embryos.
図２５は、性転換した成熟マウスの分析結果を示す。Figure 25 shows the analysis results of sex-changed adult mice.
図２６は、トランスジェニック雌マウスからの子孫のサザンプロット分析を示す 。Figure 26 shows Southern blot analysis of offspring from transgenic female mice. .
図２７は、トランスジェニックマウスの胚におけるヒトＳＲＹの発現の結果を示 す。Figure 27 shows the results of human SRY expression in transgenic mouse embryos. vinegar.
図１においては、一番上の行は本発明によって同定されたヒトゲノムＤＮＡコー ディング配列の非転写鎖の配列を示す。第２行は、記載している場合には、対応 する推定ポリペプチド配列である。第３行と第４行は、記載している場合には、 各々、対応するウサギゲノムＤＮＡコーディング配列の非転写鎖および推定ポリ ペプチド配列である。ボックスで囲まれた２４０ヌクレオチド配列（ＳＯアミノ 酸残基配列）は、Ｓ、ｐｏｍｂｅのＭｃ核酸（およびタンパク質）に対応する。In Figure 1, the top row is the human genomic DNA code identified by the present invention. The sequence of the non-transcribed strand of the coding sequence is shown. The second line indicates the corresponding This is the deduced polypeptide sequence. The 3rd and 4th lines, if written, the untranscribed strand and putative polynucleotide of the corresponding rabbit genomic DNA coding sequence, respectively. This is a peptide sequence. The boxed 240 nucleotide sequence (SO amino The acid residue sequence) corresponds to the Mc nucleic acid (and protein) of S. pombe.
ボックスで囲まれたＡＡＴＡＡＡ（第１行）およびＡＡＡＴＡＡ （第３行）は ポリアデニル化シグナルである。図１および本明細書を通して国際的に認められ た１文字表記を用いてヌクレオチド塩基配列を示し、図１のアミノ酸残基配列で は国際的に認められた３文字表記が用いられており、３文字表記または国際的に 認められた１文字表記が本明細書を通してアミノ酸配列に用いられている。AATAAA (first line) and AAATAA (third line) surrounded by boxes are It is a polyadenylation signal. Internationally recognized throughout Figure 1 and this specification. Nucleotide base sequences are shown using one-letter notation, and the amino acid residue sequence in Figure 1 is The internationally recognized three-letter notation is used; The accepted one-letter designation is used for amino acid sequences throughout this specification.
***酵母および植物、無を椎動物、およびニワトリなどの鳥類およびとりわけ後 獣下綱哺乳動物およびヒト、並びにウシ、ヒツジ、ウマおよびブタを含む家畜、 およびその他の商業的に重要な真獣下綱哺乳動物などを含むを椎動物などの全て の高等真核生物は、図１のボックスで囲まれた２４０ヌクレオチド配列に似た配 列を含む遺伝子をもっており、その遺伝子産物は接合型または生物の性の決定に 決定的なタンパク質である。fission yeast and plants, vertebrates, and birds such as chickens and especially Infratherian mammals and humans, and domestic animals, including cows, sheep, horses and pigs, All vertebrates, including commercially important eutherian mammals, and other commercially important eutherian mammals. Higher eukaryotes have sequences similar to the 240 nucleotide sequence boxed in Figure 1. sequence, and its gene product is used to determine the mating type or sex of an organism. It is a critical protein.
正確な配列は種により、また同じ種でも個体により、少なくとも核酸レベルで、 そしてしばしばタンパク質レベルででも異なることが理解されるであろう。マウ ス遺伝子の配列は図２０に示しである。図１のボックスで囲まれたタンパク質と 配列において対応する遺伝子またはタンパク質の部分は、これ以後”ｍｔ−ボッ クス”と呼び、ｍｔ−ボックスを含むタンパク質およびその断片、ポリペプチド 、核酸およびその断片およびオリゴヌクレオチドはこれ以後ｍｔ−タンパク質、 ｍｔ−核酸などと呼ぶことにする。The exact sequence varies from species to species and from individual to individual within the same species, at least at the nucleic acid level. And it will be appreciated that they often differ even at the protein level. Mau The sequence of the bus gene is shown in FIG. The proteins enclosed in the boxes in Figure 1 and Parts of the gene or protein that correspond in sequence are hereinafter referred to as "mt-boxes". mt-box-containing proteins, fragments thereof, and polypeptides , nucleic acids and fragments thereof and oligonucleotides hereinafter referred to as mt-proteins, It will be referred to as mt-nucleic acid.
したがって、本発明は以下の条件において、ｍｔ−ボックスまたはその一部を含 むｍｔ＝タンパク質またはその断片またはポリペプチドを提供する。Therefore, the present invention includes an mt-box or a part thereof under the following conditions. mt=Protein or fragment thereof or polypeptide.
本発明はまた、以下の条件において、ｍｔ−ボックスまたはその一部を含むｍｔ −タンパク質またはその断片またはポリペプチドのエピトープのミメトープ（ｍ ｉｍｅｔｏｐｅ）を含むタンパク質またはその断片またはポリペプチドを提供す る。このようなタンパク質、断片およびポリペプチドはこれ以後、ｍｔ−ミメト ープタンパク質またはその断片、およびｍｔ−ミメトーブポリペプチドと呼ばれ る。The present invention also provides an mt-box containing an mt-box or a part thereof under the following conditions. - mimetopes (mimetopes) of epitopes of proteins or fragments thereof or polypeptides imetope) or a fragment or polypeptide thereof. Ru. Such proteins, fragments and polypeptides are hereinafter referred to as mt-mimethane. protein or a fragment thereof, and called mt-mimethobe polypeptide. Ru.
本発明はまた、以下の条件において、ｍｔ−ボックスまたはその一部を含むｍｔ −核酸またはその断片またはオリゴヌクレオチドをも提供する。The present invention also provides an mt-box containing an mt-box or a part thereof under the following conditions. - Nucleic acids or fragments thereof or oligonucleotides are also provided.
特定の態様においては、以下の条件において、本発明は真獣下綱補乳動物のｍｔ −ボックスまたは少なくとも１７の隣接するヌクレオチド塩基または塩基対のそ の一部を含む１本鎖または２本鎖核酸、若しくは真獣下綱哺乳動物のｍｔ−ボッ クスまたは少なくとも１７の隣接するヌクレオチド塩基または塩基対のその一部 とハイブリダイズする１本鎖または２本鎖核酸を提供する。In certain embodiments, the present invention provides mt of a eutherian complement mammal under the following conditions: - that of a box or at least 17 contiguous nucleotide bases or base pairs; a single-stranded or double-stranded nucleic acid containing a portion of or a portion thereof of at least 17 contiguous nucleotide bases or base pairs. provides a single-stranded or double-stranded nucleic acid that hybridizes with.
本発明はさらに、以下の条件において、ｍｔ−ボックスまたはその一部を含むｍ ｔ−タンパク質またはその断片またはポリペプチドまたはｍｔ−ミメトープタン パク質またはその断片またはｍｔ−ミメトーブポリベブチドをコードする核酸ま たはその断片またはオリゴヌクレオチドを提供する。これらの核酸、断片および オリゴヌクレオチドは、他のコドンの使用および／またはミメトーブの他のアミ ノ酸配列をコードするために、ｍｔ−核酸、断片およびオリゴヌクレオチドの配 列とは異なる配列をもつかも知れない しかしながら、Ｓ、ＰｏｍｂｅのＭｃタンパク質およびｍａｔ遺伝子座における Ｓ、Ｐｏｍｂｅ遺伝子、または以下に記載するＨＭＧタンパク質のような、ｍｔ −ボックスを含む既知のタンパク質またはその断片またはポリペプチドまたは核 酸またはその断片またはオリゴヌクレオチドについては、これらのタンパク質ま たは断片、ポリペプチド、核酸または断片またはオリゴヌクレオチドがそれ自体 公知である限り、本発明はこれらのものまで包含するものではない。The present invention further provides mt-boxes or parts thereof under the following conditions. t-protein or a fragment or polypeptide thereof or mt-mimetoptan protein or fragment thereof or a nucleic acid encoding mt-mimethobe polybebutide. or fragments or oligonucleotides thereof. These nucleic acids, fragments and The oligonucleotide may contain other codon usage and/or other amino acids of the mimetobe. arrangement of mt-nucleic acids, fragments and oligonucleotides to encode nucleic acid sequences. may have a different array than the column However, in the Mc protein and mat loci of S, Pombe mt, such as S, the Pombe gene, or the HMG protein described below. - a known protein or fragment thereof or polypeptide or nucleus containing a box; For acids or their fragments or oligonucleotides, these proteins or or fragment, polypeptide, nucleic acid or fragment or oligonucleotide per se. As long as they are known, the present invention does not include these.
ｍｔ−ボックスのアミノ酸配列は多数の公知のＤＮＡ結合性タンパク質のＤＮＡ 結合モチーフと似ており、配列特異的ＤＮＡ結合がｍｔ−タンパク質で得られた 。このことは、本発明のｍｔ−タンパク質が制御機能要求性のＤＮＡ結合を有す ることを示唆している。しかしながら、ｍｔ−ボックスのアミノ酸配列の中には 、少なくともヒト、ウサギおよびマウスｍｔ−タンパク質の間で保存されている が、少なくとも精巣形成の段階で性決定と関連しないＤＮＡ結合性タンパク質の 配列中には保存されていない残基がある。したがって、これらの保存された残基 の１またはそれ以上が本発明のｍｔ−ボックスタンパク質の特徴であると考えら れる。The amino acid sequence of mt-box is based on the DNA of many known DNA-binding proteins. Similar to the binding motif, sequence-specific DNA binding was obtained with mt-proteins. . This indicates that the mt-protein of the present invention has a DNA binding requirement for regulatory functions. This suggests that However, in the amino acid sequence of mt-box, , conserved at least among human, rabbit and mouse mt-proteins However, at least at the stage of testis formation, DNA-binding proteins that are not related to sex determination There are residues in the sequence that are not conserved. Therefore, these conserved residues One or more of these are considered to be characteristic of the mt-box proteins of the invention. It will be done.
したがって、ＤＮＡ結合性モチーフをもつが、これらの特徴的アミノ酸残基の全 てを欠くタンパク質は本発明の範囲外である。Therefore, although it has a DNA-binding motif, all of these characteristic amino acid residues are Proteins lacking this are outside the scope of this invention.
特徴的アミノ酸残基は図１６（以下で詳しく説明する）の４６゜６３．６７．７ ４．７５．７６および９８位に示しである。The characteristic amino acid residue is 46°63.67.7 in Figure 16 (described in detail below). It is shown at positions 4, 75, 76 and 98.
ｍｔ−ボックスのヌクレオチド塩基配列は、上記のＤＮＡ結合性タンパク質のＤ ＮＡ結合モチーフをコードする塩基を含む。しかしながら、本発明のｍｔ−核酸 のｍｔ−ボックスの塩基配列はまた、上記の特徴的アミノ酸残基の１またはそれ 以上を特定する１またはそれ以上のコドンをも含み、かつ／またはＸＸ雌または ＸＹ雄の真獣下綱哺乳動物のいかなる常染色体またはＸ染色体配列ともハイブリ ダイズするのを実質的に防ぐ条件下において、ＴＤＦ遺伝子と関連したＹ染色体 特異配列とハイブリダイズすることができるであろう。The nucleotide base sequence of the mt-box is the D of the above-mentioned DNA-binding protein. Contains bases encoding NA binding motifs. However, mt-nucleic acids of the present invention The base sequence of the mt-box of and/or also contains one or more codons specifying XX female or Hybridized with any autosomal or X chromosome sequence of an XY male eutherian mammal Under conditions that substantially prevent soybean production, the Y chromosome associated with the TDF gene It will be able to hybridize with specific sequences.
好ましくは本発明のｍｔ＝核酸は、特徴的アミノ酸残基の１またはそれ以上、好 ましくは全てをコードし、上記のハイブリダイゼーション要求に合致する。Preferably, mt=nucleic acids of the invention contain one or more of the characteristic amino acid residues, preferably or preferably all, and meet the above hybridization requirements.
本発明のｍｔ−核酸の断片は同様に、特徴的残基をコードするコドンに隣接する ＤＮＡ結合モチーフまたはｍｔ−ボックスの少なくとも一部とともに、上記の特 徴的アミノ酸の１またはそれ以上を特定するコドンを含み、かつ／または該断片 は好ましくはＸＸ雌またはＸＹ雄の真獣下綱晴乳動物のいかなる常染色体または Ｘ染色体配列ともハイブリダイズするのを実質的に防ぐ条件下において、ＴＤＦ 遺伝子と関連したＹ染色体特異配列とハイブリダイズすることができるであろう 。Fragments of mt-nucleic acids of the invention are also flanked by codons encoding characteristic residues. With at least part of the DNA-binding motif or mt-box, and/or fragments containing codons specifying one or more of the characteristic amino acids. is preferably any autosomal or TDF under conditions that substantially prevent it from hybridizing also to X chromosome sequences. will be able to hybridize with Y chromosome-specific sequences associated with the gene .
本発明のｍｔ−ボックスまたはその一部を含むオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ結 合モチーフまたはｍｔ−ボックスの隣接残基とともに、上記の特徴的アミノ酸残 基の１またはそれ以上を特定するコドンを含むことができるが、これは必須では ない。しかしながら、本発明のこのようなオリゴヌクレオチドの全ては、好まし くはＴＤＦ遺伝子と関連していないいかなるＹ染色体配列ともハイブリダイズす るのを実質的に防ぐ条件下において、ＴＤＦ遺伝子と関連したＹ染色体特異配列 とハイブリダイズできなければならない。ｍｔ−オリゴヌクレオチドは、好まし くはｘＸ雌またはＸＹ雄の真獣下綱哺乳動物のいかなる常染色体またはＸ染色体 配列ともハイブリダイズするのを実質的に防ぐ条件下において、ＴＤＦ遺伝子と 関連したＹ染色体特異配列とハイブリダイズするであろう。The oligonucleotide containing the mt-box of the present invention or a portion thereof can be used to bind DNA. The characteristic amino acid residues listed above, along with the adjacent residues of the binding motif or mt-box. may include codons specifying one or more of the groups, but this is not required. do not have. However, all such oligonucleotides of the invention are preferably hybridizes with any Y-chromosome sequence not related to the TDF gene. Y-chromosome-specific sequences associated with the TDF gene under conditions that substantially prevent must be able to hybridize with mt-oligonucleotides are preferred Any autosome or X chromosome of a female or male eutherian mammal under conditions that substantially prevent hybridization with the TDF gene. It will hybridize with related Y chromosome specific sequences.
本明細書において″Ｙ染色体特異配列”とは、その配列が真獣下綱補乳動物の野 生型Ｘ染色体またはいかなる野生型Ｘ染色体にも見られない、ＸＹ雄真獣下綱哺 乳動物のＹ染色体に見られるＤＮＡ配列をいう。As used herein, the term "Y chromosome-specific sequence" refers to XY male eutherian mammals not found on the viable X chromosome or any wild type X chromosome Refers to the DNA sequence found on the Y chromosome of mammals.
本明細書において″ＴＤＦ遺伝子”とは、ｍｔ−ボックスを含み、かつ胚発生の 適当な段階で発現した場合には精巣形成とそれに続く雄としての胚の成長をもた らすような機能的精巣決定因子をコードするＹ染色体特異配列をいう。In this specification, "TDF gene" includes mt-box and is involved in embryonic development. When expressed at the appropriate stage, it leads to testis formation and subsequent development of the embryo as a male. A Y-chromosome-specific sequence that encodes a functional testis-determining factor.
本明細書において″ＴＤＦ遺伝子と関連したＹ染色体特異配列“とは、偽書染色 体境界のすぐ近傍にある領域であって、ヒトＹ染色体のＹ特異配列へ３５ｋｂ延 びている領域、またはその他の真獣下綱捕乳動物のＹ染色体の対応する領域に存 在するＤＮＡ配列をいう。As used herein, the term "Y chromosome-specific sequence associated with the TDF gene" refers to pseudograph staining. A region located in the immediate vicinity of the body boundary, extending 35 kb into the Y-specific sequence of the human Y chromosome. or in the corresponding region of the Y chromosome of other eutherian mammals. refers to the existing DNA sequence.
ＴＤＦ遺伝子と関連していないＹ染色体配列、またはＸ染色体および常染色体配 列との好ましくないハイブリダイゼーションを防ぐ上記のハイブリダイゼーショ ン条件は、ある程度は試験すべき本発明の核酸、断片またはオリゴヌクレオチド の長さに依存する。したがって、例えば、好ましくないハイブリダイゼーション を防ぎながら、ＴＤＦ遺伝子と関連したＹ染色体配列とのハイブリダイゼーショ ンを確実にするには、核酸または断片が以下に記載するプローブｐＹ５３．３の ような数千ヌクレオチド塩基対の長さであるときには、数百塩基だけの断片また は１７塩基から数十または数百塩基のオリゴヌクレオチドの場合よりも、より低 い緊縮条件で十分である（例えば、以下に記載する中程度の緊縮条件を参照され たい）。本発明の最小のオリゴヌクレオチドおよび断片を用いるときには、該オ リゴヌクレオチドまたは断片と、ＴＤＦ遺伝子と関連したＹ染色体特異配列との 間の完全な相補性だけがハイブリダイゼーションをもたらすようなハイブリダイ ゼーション条件を用いる。Y-chromosome sequences not associated with the TDF gene, or X-chromosome and autosomal sequences The above hybridization methods prevent unwanted hybridization with columns. The test conditions are, in part, dependent on the nucleic acid, fragment or oligonucleotide of the invention to be tested. depends on the length. Thus, for example, undesirable hybridization Hybridization between the TDF gene and related Y-chromosome sequences while preventing To ensure that the nucleic acid or fragment is fragments of only a few hundred bases or is lower than that for oligonucleotides ranging from 17 bases to tens or hundreds of bases. Moderate stringency conditions are sufficient (see e.g. moderate stringency conditions below) sea bream). When using the smallest oligonucleotides and fragments of the invention, the oligonucleotides or fragments and Y chromosome-specific sequences associated with the TDF gene. hybridization such that only perfect complementarity between using cation conditions.
本発明の好ましい核酸および断片は、少なくとも８０％、例えば、８５．９０ま たは９５％、より好ましくは少なくとも９９％の相補性を要求する条件下で、Ｔ ＤＦ遺伝子と関連したＹ染色体特異配列と選択的にハイブリダイズする。本発明 のさらに好ましい核酸および断片は、以下に記載するプローブｐＹ５３．３また はその０． ９キロベース（ｋ ｂ）のＨｉｎｃｌＩ断片（ｐＹ５３゜３β）の 配列と正確に対応する配列を有するものである。ただし、本発明の核酸または断 片はｐＹ５３．３またはｐＹ５３．３βよりも長くても短くてもよい。本発明の さらに好ましい核酸および断片は、図１１図６、図１４または図１８に示すよう なヒト、ウサギまたはマウス配列と正確に対応する配列を有するものである。Preferred nucleic acids and fragments of the invention have at least 80%, e.g. or 95%, more preferably at least 99% complementarity. It selectively hybridizes with the Y chromosome-specific sequence associated with the DF gene. present invention More preferred nucleic acids and fragments include the probe pY53.3 or is that 0. 9 kilobase (kb) HinclI fragment (pY53゜3β) It has an array that exactly corresponds to the array. However, the nucleic acid or fragment of the present invention The piece may be longer or shorter than pY53.3 or pY53.3β. of the present invention More preferred nucleic acids and fragments are as shown in FIG. 11, FIG. 6, FIG. 14, or FIG. have a sequence that corresponds exactly to a human, rabbit or mouse sequence.
特定の態様においては、本発明は１９９０年７月１２日に寄託番号ＮＣＩＭＢ４ ０３０８のもとにＮＣＩＭＢに寄託されたｐｙ５３．３ （２，２ｋｂ）と呼ば れる核酸、およびそのＨｉｎｃＩＩ消化により得られる０、９ｋｂの断片、ｐＹ ５３．３βを提供する。In certain embodiments, the invention was filed under deposit number NCIMB4 on July 12, 1990. Called py53.3 (2,2kb) deposited with NCIMB under 0308 and the 0.9 kb fragment obtained by its HincII digestion, pY Provides 53.3β.
ｐＹ５３．３の配列はＥＭＢＬ ＤＮＡデータベースとして寄託されている。The sequence of pY53.3 has been deposited as the EMBL DNA database.
本発明は真獣下綱哺乳動物のｍｔ−ボックスの全配列を含み、より好ましくは図 １、図６、図７、図１００図１４、図１６および図１８のいずれか１つに示すよ うなヒト、マウスまたはウサギの全アミノ酸またはヌクレオチド配列を含む、オ リゴヌクレオチド、ポリペプチド、核酸またはタンパク質を提供する。The present invention includes the entire sequence of the mt-box of a eutherian mammal, and more preferably 1. As shown in any one of Figures 6, 7, 100, 14, 16, and 18. containing the entire amino acid or nucleotide sequence of a human, mouse or rabbit. Provided are oligonucleotides, polypeptides, nucleic acids or proteins.
真獣下綱哺乳動物のｍｔ−ボックスとハイブリダイズできる核酸は、以下に定め る中程度の、またはより好ましくは高緊縮条件下でハイブリダイズできることが 好ましい。Nucleic acids that can hybridize with mt-boxes of eutherian mammals are defined below. be able to hybridize under moderate or more preferably high stringency conditions. preferable.
中程度の緊縮条件ニ アニーリング期間： ６−８時間 高緊縮条件： バッファ−： １ｘＳＳＣ 温度二 ６５℃ アニーリング期間： ６−８時間 上記の中程度の緊縮条件は約７５％の相同性に対応する。上記の高緊縮条件は約 ９０％相同性に対応する。ｌ ｘＳＳＣとは、０．１５Ｍ 塩化ナトリウム、０ ．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０である。Moderate austerity conditions Annealing period: 6-8 hours High austerity conditions: Buffer: 1xSSC Temperature 2 65℃ Annealing period: 6-8 hours The moderate stringency conditions described above correspond to approximately 75% homology. The above high austerity conditions are approximately Corresponds to 90% homology. l xSSC means 0.15M sodium chloride, 0 ．． 015M sodium citrate, pH 7.0.
ｍｔ−ボックスに対応するか、またはハイブリダイズできる核酸の部分は好まし くは、少なくとも２０．より好ましくは少なくとも３０．４０または６０、そし て最も好ましくは１００またはそれ以上の長さのヌクレオチド塩基である。Portions of the nucleic acid that correspond to or are capable of hybridizing to the mt-box are preferred. or at least 20. More preferably at least 30.40 or 60, and and most preferably 100 or more nucleotide bases in length.
本発明の核酸は１本または２本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡでありうる。本発明のＤＮ Ａは、ｍｔ−ボックス配列に加えて、コーディングおよび／または非コーディン グ配列および／または転写および／または翻訳開始および／または停止シグナル および／または制御シグナルおよび／またはプロモーター、エンハンサ−のよう な制御配列および／またはポリアデニル化部位、エンドヌクレアーゼ制限部位お よび／またはスプライス供与および／または受容部位を含むことができる。本発 明のＤＮＡには、機能的遺伝子または少なくとも１つのｍｔ−ボックスを含むエ キソンを含むゲノムＤＮＡおよび相補的ＤＮＡ （ｃＤＮＡ）を含む。また、ｌ またはそれ以上のイントロンのような非コーディング配列を含んでいてもよい。Nucleic acids of the invention can be single- or double-stranded DNA or RNA. DN of the present invention A is a coding and/or non-coding sequence in addition to the mt-box sequence. sequence and/or transcription and/or translation initiation and/or stop signals and/or regulatory signals and/or promoters, enhancers, etc. control sequences and/or polyadenylation sites, endonuclease restriction sites and and/or splice donor and/or acceptor sites. Main departure The human DNA contains functional genes or genes containing at least one mt-box. Contains genomic DNA and complementary DNA (cDNA) containing xon. Also, l or more non-coding sequences such as introns.
１本鎖ＤＮＡは転写績または非転写（相補的）鎖でありうる。プラスミドまたは コスミドまたはウィルスゲノム核酸のようなりローニングまたは発現ベクターな どのベクター中に核酸は存在することができる。本発明のＲＮＡはＤＮＡの非プ ロセシングおよびプロセシングされた転写物、ｍｔ−ボックスを含むメツセンジ ャーＲＮＡ （ｍＲＮＡ）およびｍｔ−ボックスと相補的な配列を含むアンチセ ンスＲＮＡを含む。Single-stranded DNA can be the transcribed or non-transcribed (complementary) strand. plasmid or Loning or expression vectors such as cosmids or viral genomic nucleic acids. Nucleic acids can be present in any vector. The RNA of the present invention is a non-proprietary agent of DNA. processing and processed transcripts, including mt-boxes antisense RNA (mRNA) and a sequence complementary to the mt-box. Contains ance RNA.
本発明の別の面では、図１または図６または図１４または図１８に示すヒト、マ ウスまたはウサギｍｔ−核酸配列の少なくとも一部と同じか、あるいはこれと相 同な配列をもつが、ｍｔ−ボックスを含まない核酸を提供する。このような核酸 は、長さが少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、例えば４０．６０また は１００またはそれ以上の連続的核酸塩基の領域にわたり、ヒト、マウスまたは ウサギｍｔ−核酸と少なくとも５０％の相同性、より好ましくは少なくとも７５ ％、例えば８０．８５または９０％、９５または９９％の相同性を有するであろ う。これらの核酸はさらに、***酵母または高等生物、好ましくは真獣下綱哺乳 動物のｍｔ−核酸と、上で定義した中程度の緊縮条件または高緊縮条件下でハイ ブリダイズできるであろう。In another aspect of the invention, the human or mammal shown in FIG. 1 or FIG. 6 or FIG. the same as or compatible with at least a portion of the mouse or rabbit mt-nucleic acid sequence. Nucleic acids having the same sequence but not containing the mt-box are provided. Such a nucleic acid has a length of at least 20, preferably at least 30, such as 40.60 or spans a region of 100 or more contiguous nucleobases, in humans, mice or at least 50% homology with rabbit mt-nucleic acid, more preferably at least 75 %, e.g. 80.85 or 90%, 95 or 99% homology cormorant. These nucleic acids may further be used in fission yeast or higher organisms, preferably in the eutherian mammals. animal mt-nucleic acid and high under moderate or high stringency conditions as defined above. It will be possible to breed it.
本発明の核酸は以下に記載する生物の接合型または性を確認するために行うポリ メラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）のプライマーとして特に有用である。The nucleic acid of the present invention can be used in the following polypeptides to confirm the mating type or sex of organisms. It is particularly useful as a primer for merase chain reaction (PCR).
これらはまた、ｍｔ−タンパク質の全部または一部（ｍｔ−ボックスを含んでい ても、含んでいなくてもよい）に対応するタンパク質または断片またはポリペプ チドを発現するのに、あるいはハイブリダイゼーション実験のプローブとして有 用である。ここでタンパク質に関連して使用する”断片”の語は、タンパク質の 化学合成された部分および組換え部分の両方を言う。They also include all or part of the mt-protein (including the mt-box). proteins or fragments or polypeptides corresponding to Useful for expressing antibodies or as a probe for hybridization experiments. It is for use. The term “fragment” used here in relation to proteins refers to Refers to both chemically synthesized and recombinant parts.
本発明のｍｔ−ボックスまたはその一部を含むｍｔ−タンパク質およびその断片 およびポリペプチドおよびｍｔ−ミメトーブタンパク質およびその断片およびｍ ｔ−ミメトーブポリペプチドは、免疫診断試験に有用であり、またこのような用 途のためのモノクローナル抗体などの抗体を生産するのに有用である。このよう なタンパク質および断片およびポリペプチドに対する抗体、およびこのような抗 体の化学合成断片および組換え断片を含む抗体の断片（この抗体断片は少なくと も１つの抗原結合部位を含む）、並びにこのようなタンパク質または断片に対す る抗体またはその断片を発現することができ、そして好ましくはこれを分泌する ことができる、例えばハイブリドーマなどの真核生物細胞および原核生物の組換 え細胞などの細胞もまた、本発明の一部を形成する。mt-protein and fragment thereof comprising the mt-box of the present invention or a part thereof and polypeptides and mt-mimethobe proteins and fragments thereof and m T-mimethobe polypeptides are useful in immunodiagnostic tests and for such uses. It is useful for producing antibodies such as monoclonal antibodies for industrial purposes. like this antibodies to specific proteins and fragments and polypeptides; Fragments of antibodies, including chemically synthesized fragments and recombinant fragments of the body (these antibody fragments include at least (contains one antigen-binding site), as well as for such proteins or fragments. is capable of expressing, and preferably secretes, an antibody or fragment thereof that recombination of eukaryotic cells and prokaryotes, such as hybridomas, which can Cells such as embryonic cells also form part of the invention.
本発明の核酸はＰＣＲ法またはハイブリダイゼーションプローブを用いて生物か ら回収することによって、全合成またはその組み合わせによって、ｐＹ５３．３ をクローニングすることによって、または組換えＤＮＡ技術の分野における公知 のその他の方法によって得ることができる。The nucleic acid of the present invention can be isolated from living organisms using PCR method or hybridization probe. pY53.3 by total synthesis or a combination thereof. by cloning or known in the field of recombinant DNA technology can be obtained by other methods.
本発明のタンパク質およびその断片およびポリペプチドは、ｍｔ−遺伝子を発現 する生物の細胞から回収するか、あるいは本発明の核酸中に含まれるｍｔ−遺伝 子またはコーディング配列を適当な発現系および宿主中で発現させることによっ て生産するか、あるいは全合成またはその組み合わせによって、またはバイオテ クノロジーの分野における公知の方法によって得ることができる。The proteins and fragments and polypeptides thereof of the invention express the mt-gene. the mt-gene contained in the nucleic acid of the present invention; by expressing the child or coding sequence in a suitable expression system and host. or by total synthesis or a combination thereof, or by biotechnology. can be obtained by methods known in the field of technology.
本発明のタンパク質、その断片およびポリペプチドは天然のし一α−アミノ酸を 含み、またｌまたはそれ以上の非天然のＤ−またはＬ−配置のα−アミノ酸を含 むこともありうる。The proteins, fragments and polypeptides of the invention contain naturally occurring alpha-amino acids. and also contains one or more non-natural D- or L-configured α-amino acids. It is possible that the
抗体は、適当な宿主動物を免疫感作して抗体を回収することによって、適当に免 疫感作した宿主動物から得られた抗体産生細胞を培養することによって、または 適当なｍｔ−タンパク質、断片またはポリペプチドまたはｍｔ−ミメトーブ、タ ンパク質、断片またはポリペプチドでＢ細胞をｉｎ ＶｉｔｒＯ刺激して該細胞 を培養することによって得ることができる。このような細胞は必要ならば例えば ミエローマ細胞と融合することによって不死化することができる。抗体断片は公 知の化学的およびバイオテクノロジー的方法によって得ることができる。Antibodies can be produced by immunizing a suitable host animal and collecting the antibodies. by culturing antibody-producing cells obtained from an immunized host animal, or A suitable mt-protein, fragment or polypeptide or mt-mimetobe, tag. Stimulating B cells in VitrO with proteins, fragments, or polypeptides can be obtained by culturing. If such cells are needed, e.g. Can be immortalized by fusion with myeloma cells. Antibody fragments are publicly available. It can be obtained by known chemical and biotechnological methods.
これら全ての方法はバイオテクノロジーの分野での当業者には公知である。特に よく知られた参考書を挙げると、”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ” ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｅｄｓ Ｓａｍｂｒｏｏｋ。All these methods are known to those skilled in the field of biotechnology. especially A well-known reference book is “Molecular Cloning: A. Laboratory Manual” 2nd Edition (Eds Sambrook.
Ｊ、、 Ｆｒ１ｔｓｃｈ、 Ｅ、Ｆ、 ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｔｓ、 Ｔ、）、 （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｕｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 １９８９）であり、以後”Ｍａｎｉａｔｉｓ”と呼ぶ。J,, Fr1tsch, E, F, and Maniatts, T,), (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989), hereinafter referred to as "Maniatis".
本発明はさらに、***酵母または高等真核生物の細胞または生物の接合型または 性を確認するために、または細胞または生物の接合型または性を確認するのに有 用な核酸を単離するために、また単一の性をもたらす繁殖プログラムを始めるた めに、Ｍｃタンパク質およびＳ、ｐｏｍｂｅの遺伝子またはその他のｍｔ−核酸 またはタンパク質を含む、上で定義したタンパク質、ポリペプチド、抗体または 抗体産生細胞を使用することを提供する。ここで本発明の核酸、タンパク質、ポ リペプチド、抗体およびその断片および抗体産生細胞をこのような使用に用いる のは、バイオテクノロジーの分野における当業者に公知の常法によって実施され る。The present invention further provides mating types or mating types of fission yeast or higher eukaryotic cells or organisms. or useful for determining the mating type or sex of a cell or organism. in order to isolate useful nucleic acids and to start a breeding program that would result in a single sex. for the Mc protein and S, pombe genes or other mt-nucleic acids. or a protein, polypeptide, antibody or protein as defined above, including a protein; Provided are uses for antibody-producing cells. Here, the nucleic acids, proteins, and polymers of the present invention Ripeptides, antibodies and fragments thereof, and antibody-producing cells are used for such uses. is carried out by conventional methods known to those skilled in the field of biotechnology. Ru.
マウスまたはヒト精巣決定遺伝子に関する知識を用いて、その他の哺乳動物から 等価の遺伝子を単離することができる。特定の種から単離した後、この遺伝子と その配列を以下の２つの応用に用いる： １、胚、組織およびその他の核酸を含む生物学的試料に応用することのできる、 配列に基づく性鑑別試験の確立；２、一方の性に統計的に偏った子孫または一方 の性のみの子孫を生産する繁殖システム（単一性繁殖システム）を作りだすため の、哺乳動物の生殖系の遺伝的修飾。from other mammals using knowledge of mouse or human testis-determining genes. Equivalent genes can be isolated. After isolation from a specific species, this gene and Use that array for two applications: 1. Applicable to embryos, tissues and other biological samples containing nucleic acids; Establishment of sequence-based sex differentiation tests; 2. Offspring statistically biased towards one sex or one sex. To create a breeding system that produces offspring of only one sex (monosexual breeding system) , genetic modification of the mammalian reproductive system.
このアプローチの実施は、ヒトＳＲＹ配列を用いて等価なマウスおよびウサギ配 列を単離する、以下の実施例１および２に記載する。ヒト、ウサギおよびマウス のためのＰＣＲ法による性鑑別法もまた以下に記載する。Implementation of this approach uses the human SRY sequence to create equivalent mouse and rabbit The columns are isolated as described in Examples 1 and 2 below. human, rabbit and mouse A sex identification method using the PCR method for the following is also described below.
本発明による細胞または生物の接合型または性の確認のための特に好ましい方法 は、例えば以下に記載するように、ＰＣＨにおけるプライマーとしてオリゴヌク レオチドを使用することを含む：例えば胚から外科的に除去することによって１ 個または複数の細胞を得、界面活性剤の使用または加熱などによる粗溶解法によ ってＤＮＡを放出させる。本発明のプライマーオリゴヌクレオチドを用いて、細 胞からのｍｔ−関連ＤＮＡを増幅するための慣用的ＰＣＲを実施する。ＰＣＲの 生成物をアガロースゲル電気泳動で°分析し、標識プローブを用いて検出する。Particularly preferred methods for determining the mating type or sex of cells or organisms according to the invention can be used as an oligonucleotide as a primer in PCH, e.g. as described below. Including using leotide: 1 by surgically removing it from the embryo, for example. Obtain one or more cells and use a crude lysis method such as using a surfactant or heating. This causes DNA to be released. Using the primer oligonucleotide of the present invention, Conventional PCR is performed to amplify mt-related DNA from the cells. PCR The products are analyzed by agarose gel electrophoresis and detected using a labeled probe.
増幅されたＤＮＡの存在は細胞中におけるｍｔ−遺伝子の存在を示唆しており、 したがってこれは真獣下綱哺乳動物においては細胞が雄であることを示唆するも のである。この技術は、例えば性に関連する病気にかかっている恐れのあるヒト 胚を終結させるべきかの判断をするために、または商業的に効率のよい繁殖スト ックの子孫の性を（繁殖ストックの選択または望ましくない性の動物を屠殺また は終結化することによって）コントロールするために用いることができる。The presence of amplified DNA suggests the presence of the mt-gene in the cell, Therefore, this suggests that cells are male in eutherian mammals. It is. This technology can be used, for example, in humans who may be suffering from sexually related diseases. to determine whether embryos should be terminated or to establish a commercially efficient reproductive strategy. The sex of the offspring of the stock (selecting breeding stock or slaughtering or killing animals of undesirable sex) can be used to control (by terminating)
ある種における性の確認またはコントロールに用いるオリゴヌクレオチドプライ マーはまた、その他の種の動物における性の確認またはコントロールのためのプ ライマーを開発するのに用いることができる。なぜなら、他の種の動物のｍｔ− 遺伝子とのプライマーのハイブリダイゼーションであってもＰＣＲを開始するこ とができ、種特異的配列を増幅することができるからである。Oligonucleotide primers used to confirm or control sex in a species Markers are also used as a test for sex confirmation or control in other species of animals. Can be used to develop limers. Because mt- Even hybridization of primers with genes can initiate PCR. This is because species-specific sequences can be amplified.
このような性決定を実施するための技術は組換えＤＮＡ技術の分野において公知 である。Techniques for carrying out such sex determination are well known in the field of recombinant DNA technology. It is.
ある面においては、本発明は、種の雄からのゲノムライブラリー（好ましくはＹ 染色体、例えばラムダファージ、コスミドまたはＹＡＣライブラリー）または成 体精巣または胎児生殖隆線組織のような発現組織からのＲＮＡから構築したｃＤ ＮＡライブラリーを、上で定義した本発明の核酸、断片またはオリゴヌクレオチ ドと、検出可能な標識とからなるプローブにより高緊縮条件下で検索することか らなる、真獣下綱哺乳動物のＴＤＦ遺伝子と関連したＹ染色体特異配列を単離す るための方法を提供する。In one aspect, the invention provides a genomic library (preferably Y chromosomes, e.g. lambda phages, cosmids or YAC libraries) or synthetic cD constructed from RNA from expression tissues such as corpus testis or fetal genital ridge tissue. The NA library is made up of nucleic acids, fragments or oligonucleotides of the invention as defined above. Can be searched under high stringency conditions with a probe consisting of a compound and a detectable label. Isolate the Y chromosome-specific sequence related to the TDF gene of eutherian mammals. provide a method for
この単離は標準的分子生物学の手法（例えば上記のＭａｎｉａｔｉｓ″）に従い 、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーのいくつかのゲノム等価物を 選択し、中程度または低緊縮条件下で本発明の核酸プローブでスクリーニングす ることによって実施することが好ましい。可能性のあるクローンを単離し、精巣 決定遺伝子に対応する配列をサブクローニングする。This isolation follows standard molecular biology techniques (e.g. Maniatis'', supra). , some genomic equivalents of a genomic or cDNA library. selected and screened with the nucleic acid probes of the invention under moderate or low stringency conditions. Preferably, this is carried out by Isolate potential clones and testis Subcloning the sequence corresponding to the determined gene.
新たに単離されたサブクローンを用いて、高緊縮条件下で決定しようとする種の 雄および雌ＤＮＡでサザンプロットを行い、正しいクローンが単離されたことを 確認する。プローブは強い維持異的シグナルを与えるはずである（その他の雄／ 雌に共通のバンドもより少ない強度で存在する）。標準的手法を用いてサブクロ ーンの配列決定を行い、このように同定された配列からＰＣＲに適したプライマ ーを選択する。Use freshly isolated subclones to determine the species to be determined under high stringency conditions. Perform a Southern blot on male and female DNA to confirm that the correct clone was isolated. confirm. The probe should give a strong maintenance heterologous signal (other males/ Bands common to females are also present with less intensity). Subchrome using standard techniques Sequence the sequence and select primers suitable for PCR from the identified sequence. - Select.
あるいは、′縮重”オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ法のような、精巣決定遺 伝子に関する配列をクローニングするためのその他の方法を用いることもできる （ＰＣＲの手法については、例えば、”ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ −ａ Ｇｕ ｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ″； Ｍ、Ａ 、 Ｉｎｎｆｓ、 Ｄ、Ｈ，Ｇｅ１ｆａｎｄ、 Ｊ、Ｊ、 ５ｎｉｎｓｋｙ、 Ｔ、Ｊ、 Ｗｈｉｔｅ編集；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、参照）０ ヒト、ウサギまたはマウスのための好ましいプローブは、図１または図６または 図１４または図１８に示す配列をもつｐＹ５３．３またはその断片または核酸ま たはその断片またはオリゴヌクレオチドである。ゲノムライブラリーまたはｃＤ ＮＡライブラリーの作成および検索および検出可能な標識の検出およびプローブ によって同定された核酸の単離のための手法はバイオテクノロジーおよび組換え ＤＮＡ操作の分野で公知である。例えばｐＹ５３．３配列のようなヒトの配列を もつプローブを用いて、ウシなどのその他の真獣下綱補乳動物からの対応する配 列を同定し、単離することによって上記方法を実施することができる。次いで、 このように同定された配列を用いて、ウシまたはその他の哺乳動物の個体または 細胞、組織、胚または***の性を確認するために用いることのできるＰＣＲ用ブ ラプライマーることができる。これによって以下に記載するウシまたはその他の 哺乳動物の性を確認したり、性をコントロールした繁殖を行ったりするための実 験が可能になる。Alternatively, testis-determining genes may be used, such as PCR methods using 'degenerate' oligonucleotides. Other methods for cloning gene-related sequences can also be used. (For PCR methods, see, for example, “PCR Protocols-a Gu ide to Methods and Application''; M, A , Innfs, D, H, Ge1fand, J, J, 5ninsky, Edited by T. J. White; Academic Press, Inc.)0 Preferred probes for humans, rabbits or mice are those shown in Figure 1 or Figure 6 or pY53.3 or its fragment or nucleic acid having the sequence shown in Figure 14 or Figure 18. or a fragment or oligonucleotide thereof. Genomic library or cD Creating and searching NA libraries and detecting and probing detectable labels Techniques for the isolation of nucleic acids identified by biotechnology and recombinant It is well known in the art of DNA manipulation. For example, human sequences such as the pY53.3 sequence Corresponding probes from other eutherian mammals such as cattle The above method can be carried out by identifying and isolating the sequence. Then, The sequences thus identified can be used to identify bovine or other mammalian individuals or PCR blocks that can be used to confirm the sex of cells, tissues, embryos or sperm La Primer can be used. This will result in cattle or other cattle as described below. Fruits used to confirm the sex of mammals and to perform sex-controlled breeding. experiment becomes possible.
単離された核酸、断片またはオリゴヌクレオチドを次いで増幅し、必要に応じて クローン化またはサブクローン化する。本発明はさらに、個体、細胞、組織、胚 または***からのＤＮＡを鋳型として用い、また本発明の核酸、断片またはオリ ゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼチェインリアクションを 行うことからなる、真獣下綱哺乳動物個体、または真獣下綱哺乳動物の細胞、組 織、胚、胎児または***の性を検出する方法を提供する。プライマーとして用い る本発明の好ましい核酸、断片またはオリゴヌクレオチドはｐＹ５３．３または その一部であるか、あるいは図１、図６、図１４および図１８のいずれか１つに 示すヒト、ウサギまたはマウス配列と正確に対応する配列またはその一部を有す るか、あるいは性を確認しようとする個体、細胞、組織、胚、胎児または***と 同じ種の真獣下綱哺乳動物のＴＤＦ遺伝子と関連したＹ染色体特異配列である核 酸、断片またはオリゴヌクレオチドである。関与する哺乳動物のＴＤＦと結合し たＹ染色体特異配列は、それ自体上記の単離および増幅またはクローニングの過 程で既に得られたものでありうる。The isolated nucleic acids, fragments or oligonucleotides are then amplified and optionally Clone or subclone. The present invention further provides an individual, a cell, a tissue, an embryo. Alternatively, DNA from sperm can be used as a template, and the nucleic acids, fragments or oligonucleotides of the invention can also be used as templates. Polymerase chain reaction using oligonucleotides as primers An individual eutherian mammal, or a cell or group of a eutherian mammal, consisting of A method for detecting the sex of a tissue, embryo, fetus or sperm is provided. used as a primer Preferred nucleic acids, fragments or oligonucleotides of the invention are pY53.3 or or any one of Figures 1, 6, 14 and 18. has a sequence or part thereof that corresponds exactly to the human, rabbit or mouse sequence shown. or with the individual, cell, tissue, embryo, fetus or sperm whose sex is to be ascertained. A nuclear Y chromosome-specific sequence related to the TDF gene of the same species of eutherian mammals. acids, fragments or oligonucleotides. Binds to the TDF of the mammal involved The Y-chromosome-specific sequences obtained are themselves subject to the isolation and amplification or cloning process described above. This may have already been obtained in the process.
本発明によるＴＤＦ遺伝子の同定はウシ、ヒツジ、ウマ、ブタおよびトリなどの 商業的に重要な動物の子孫の性をコントロールする可能性をもたらす。ウシの牛 肉生産性の系統または品種では雄の子孫のみが望まれ、一方ウシの乳牛品種やニ ワトリの産卵品種では雌の子孫のみが望まれるように、一方の性がより好ましい 性質を有している場合においては、この同定は動物繁殖および農業の多くの面で 価値あるものとなろう。単一の性繁殖プログラムの経済的利益およびこれを実施 するための方法については、例えば、”Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ Ｎｅｗ Ｔｅｃ ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｉｎ Ａｎｉｍａｌ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ； Ｇｅｎｅｔｉ ｃ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ″、 （Ｓｍｉｔｈ、 Ｃ，、Ｋｉｎｇ、 Ｊ、 Ｖｌ、Ｂ、、 ＭｃＫａｙ、 Ｊ、Ｃ，＠集）、 （Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅ ｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、 ０ｘｆｏｒｄ、 １９８８）の中の”ＳｊｎｇＩｅ Ｓｅｘ Ｂｅｅｆ Ｃａｔｔｌｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ″、 Ｔａｙｌｏｒ、 Ｓ Ｌ、Ｃ，Ｓ、、 Ｔｈ１ｅｓｓｅｎ、 Ｒ、Ｂ、、 ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ、 Ａ 、Ｊ、 に記載されている。The identification of the TDF gene according to the present invention can be carried out in cattle, sheep, horses, pigs, birds, etc. It offers the possibility of controlling the sex of offspring of commercially important animals. cow cow For meat-producing lines or breeds, only male offspring are desired, whereas for dairy cow breeds or breeds, only male offspring are desired. One sex is more preferred, as in egg-laying breeds of Watori, only female offspring are desired. This identification is useful in many aspects of animal breeding and agriculture when Be valuable. The economic benefits of and implementation of a single-sex breeding program For methods to do so, see, for example, “Exploiting New Tec hnologies in Animal Breeding; Geneti c Developments'', (Smith, C, King, J, Vl, B,, McKay, J, C, @ collection), (Oxford Unive rsity Press, Oxford, 1988) Sex Beef Cattle Systems'', Taylor, S L, C, S, Th1essen, R, B, and Moore, A , J.
同一または異なる動物種からの精巣決定遺伝子の全部または一部からなる核酸を 、確立されたトランスジェニック手法を用いて、いかなる初期の胚にも導入する ことができる。これには、初期胚の前核または核へのＤＮＡのマイクロインジェ クション、初期胚または胚性幹細胞のいずれかにレトロウィルスを使用すること 、または機能的生殖細胞を発生しうる胚性幹細胞またはその他の細胞へのあらゆ る形質転換法（マイクロインジェクション、エレクトロポレーションまたはキャ リア法を含む）を含む。これらの手法によってトランスジェニック動物個体（） ７ウンダートランスジエニツク：ｆｏｕｎｄｅｒ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ）ま たは導入されたＤＮＡを一部の細胞にもつキメラ動物をもたらすであろう。ファ ウンダートランスジェニック動物またはキメラ動物の機能的生殖細胞が導入され たＤＮＡをもつ場合には、導入されたＤＮＡを子孫に伝達することができ、かつ これらのＤＮＡ配列をもつ動物の系列または系統をもたらすことができる。A nucleic acid consisting of all or part of a testis-determining gene from the same or different animal species. , introduced into any early embryo using established transgenic techniques be able to. This involves microinjection of DNA into the pronuclei or nucleus of early embryos. use of retroviruses on either early embryos or embryonic stem cells , or to any embryonic stem cells or other cells capable of developing functional reproductive cells. Transformation methods (microinjection, electroporation or cavitation) (including the rear method). Transgenic animal individuals () by these techniques 7 under transgenics Alternatively, a chimeric animal may be produced in which some of the cells contain the introduced DNA. Fa Functional germ cells of undertransgenic or chimeric animals are introduced into If you have introduced DNA, you can transmit the introduced DNA to your descendants, and Lines or strains of animals carrying these DNA sequences can be generated.
精巣決定遺伝子のコーディング配列の全部または一部からなる核酸、またはその 誘導体は、それ自体の制御配列（プロモーター／エンハンサ−など）または他の 遺伝子からの制御配列と組み合わせて導入することができ、全体として”構築物 ”を構成し、この構築物が考慮中の動物種における性決定を決める適当な発生段 階および組織部位において発現する。例えば、マウスにおいては尿生殖隆線にお いて交尾後９．５から１３．５日の間であるだろう。A nucleic acid consisting of all or part of the coding sequence of a testis-determining gene, or Derivatives may contain their own regulatory sequences (such as promoters/enhancers) or other It can be introduced in combination with control sequences from a gene, making the entire “construct ” and this construct represents the appropriate developmental stage that determines sex determination in the animal species under consideration. Expressed in scala and tissue sites. For example, in mice, the urogenital ridge This will occur between 9.5 and 13.5 days after mating.
以下に記載するのは、１００％雄から１００％雌までのあらゆる改変された性比 率の子孫を提供するための様々な方法の例である。ＸＸ性染色体構成をもつ雄は 生殖不能であり、またＸＹ性染色体構成をもつ雌は非常に生殖能が低下するらし いことに注意すべきである。しかしながら、***を集めて貯蔵しておき人工受精 や体外受精に用いることができる場合には、所望の遺伝子型の動物を多く生産す る必要はないだろう。子孫に有効な形で遺伝子を伝達することができる適当な繁 殖ストックを同定するためには、トランスフェクション、スクリーニングおよび トランスジェニック動物の選択を繰り返す必要があるだろう。Listed below are all modified sex ratios from 100% male to 100% female. Examples of various ways to provide rate descendants. Males with XX sex chromosome structure They are sterile, and females with an XY sex chromosome structure are likely to have significantly reduced fertility. It should be noted that However, if semen is collected and stored, artificial fertilization is possible. or in vitro fertilization, to produce a large number of animals of the desired genotype. There's probably no need to. Proper breeding that can effectively transmit genes to offspring Transfection, screening and It will be necessary to repeat the selection of transgenic animals.
方法Ａ。Method A.
精巣決定遺伝子を上記の方法（胚またはＥＳ細胞を介する）のいずれかによって 導入する。これにより、Ｙ染色体上の内在遺伝子に加えて、常染色体またはＸ染 色体上に導入された遺伝子である” トランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）″ のコピーをもつＸＹ性染色体構成のファウンダー動物が一定比率で得られるだろ う。testis-determining genes by any of the above methods (via embryos or ES cells) Introduce. In addition to the endogenous genes on the Y chromosome, this allows autosomal or "Transgene", which is a gene introduced onto the chromoplast A certain proportion of founder animals with an XY sex chromosome configuration will be obtained that have copies of cormorant.
もしもこのトランスジーンが常染色体である場合には、局部的効果がその発現を 妨げたり、または減少したりする部位にトランスジーンが組み込まれない限り、 このファウンダー動物の子孫の７５％は雄であり（表１１バート１）；個々の動 物をスクリーニングして、トランスジーンが機能的に組み込まれた個体のみを選 択して用いる。もしもこのトランスジーンがＸ染色体である場合には、子孫の１ ００％が雄である（表１、パート２）。もしもトランスジーンのコピーが１以上 の常染色体部位に組み込まれている場合には、ファウンダーからの雄の子孫の比 率は７５％よりも大きく、１００％に近づく（表１、パート３）。If this transgene is autosomal, local effects may inhibit its expression. Unless the transgene is integrated into a site that prevents or reduces 75% of the offspring of this founder animal are male (Table 11 Bart 1); By screening animals and selecting only individuals with functionally integrated transgenes. Select and use. If this transgene is on the X chromosome, one of the progeny 00% are male (Table 1, Part 2). If there is more than one copy of the transgene If integrated at an autosomal site, the ratio of male progeny from the founder The rate is greater than 75% and approaches 100% (Table 1, Part 3).
定義：Ａ＝常染色体；下付きｌおよび２の数字は異なる常染色体を表す Ｘ＝Ｘ染色体 Ｙ＝Ｙ染色体 上付きＴ；精巣決定トランスジーン 上付きａ＝精巣決定遺伝子の活性を妨げるアンチセンス構築物 １、常染色体におけるトランスジーン ＡＩ”ＡＩ、Ａ２Ａ２． 、 、 、 、 ＸＹ雄×ＸＸ雌↓ ２５％ Ａ、Ａ、、ＸＹ 雄 （生殖能あり）２５％ Ａ Ｉ”Ａ 、、Ｘ Ｙ 雄 （生殖能あり）２５％ Ａ 、”Ａ 、、Ｘ Ｘ 雄 （生殖能なし）２ ５％ Ａ ＋ Ａ １． Ｘ Ｘ 雌 （生殖能なし）２、 Ｘ染色体における トランスジーンＸ１Ｙ雄ｘ ＸＸ雌 ↓ ５０％ＸＹ雄 ５０％ ＸＴＹ 雄＊ （＊トランスジーン発現におけるＸ染色体不活性化の効果による）３、常染色体 におけるトランスジーンの多コピーＡ、”Ａ、”、 ＸＹ雄ｘ ＸＸ雌 ↓ ５０％Ａ 、”Ａ 、、 Ｘ Ｙ雄 ５０％Ａ 、”Ａ Ｉ＋ Ｘ Ｘ雄 方法Ｂ。Definition: A = autosome; subscript l and 2 numbers represent different autosomes X=X chromosome Y = Y chromosome Superscript T; testis-determining transgene Superscript a = antisense construct that interferes with the activity of testis-determining genes 1. Transgenes in autosomes AI"AI, A2A2. , , , , XY male x XX female ↓ 25% A, A,, XY Male (fertile) 25% A, A,, XY Male (fertile) 25% A,”A,,X Male (non-fertile) 2 5% A + A 1. XX Female (non-fertile) 2, on the X chromosome Transgene X1Y male x XX female ↓ 50% XY male 50% XTY male * (*Due to the effect of X chromosome inactivation on transgene expression) 3. Autosomes Multiple copies of transgene in A, “A,”, XY male x XX female ↓ 50%A,”A,,XY male 50% A, “A I + X X male Method B.
胚性幹細胞を用いて、相同染色体中の同じ部位にトランスジーンのコピーを導入 するためにターゲツティングまたは部位特異的組込み（例えば相同的組換えを介 する）を用い、これらの細胞、およびこれらに由来する生殖細胞がトランスジー ンにホモ接合となるようにする。この細胞に由来する子孫は１００％が雄となる 細胞内での翻訳しつるｍＲＮＡを効果的に減少し、またはなくすために、アンチ センスＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡを転写するＤＮＡ構築物を用いることが できる。アンチセンスＲＮＡは、正常な遺伝子に対して逆方向に配置された転写 配列の全部または一部と結合した同種または異種の制御配列を含むＤＮＡ構築物 から作成することができる。このアンチセンス構築物から発現したアンチセンス ＲＮＡは”センス”または正常な転写物と複合体をつくり、遺伝子産物（タンパ ク質）の量を減少し、性転換をもたらす。例えば、アンチセンス構築物の常染色 体またはＸ連鎖コピーをもつＸＹ個体は雌となるであろう。１つの遺伝子座に構 築物のコピーをもつＸＸ動物は７５％の雌子孫を与えるであろう（表２、パー） １）。異なる位置に組み込まれたアンチセンス構築物の複数のコピーは１００％ 雌の子孫を与えるであろう（表２、パート２）。Using embryonic stem cells to introduce a copy of a transgene at the same site in a homologous chromosome targeting or site-specific integration (e.g. via homologous recombination) ), these cells and the germ cells derived from them are transgenic. be homozygous for 100% of the offspring derived from these cells will be male. In order to effectively reduce or eliminate translated mRNA in cells, DNA constructs that transcribe sense or antisense RNA can be used. can. Antisense RNA is a transcript that is placed in the opposite direction to the normal gene. DNA constructs containing homologous or heterologous control sequences combined with all or part of the sequence It can be created from. Antisense expressed from this antisense construct RNA forms a complex with “sense” or normal transcripts and produces gene products (proteins). This decreases the amount of skeletal tissue and causes sex change. For example, autochromatic antisense constructs XY individuals with body or X-linked copies will be female. Structured at one locus XX animals with a copy of the construct will give 75% female offspring (Table 2, par) 1). Multiple copies of antisense constructs integrated at different positions are 100% will give female offspring (Table 2, part 2).
（本貫以下余白） 表２゜ ■、常染色体におけるアンチセンス構築物Ａ、“Ａ、、 ＸＸ雌ｘ ＸＹ雄 ↓ ２５％Ａ、”Ａ、、 ＸＸ雌 ２５％Ａ、Ａ、、ＸＸ雌 ２５％Ａ、’Ａ、、 ＸＹ雌 ２５％ＡＩＡ、、ＸＹ雄 ２、常染色体における複数のアンチセンス構築物Ａ＋’Ａ＋”、 ＸＸ雌ｘ Ｘ Ｙ雄 ↓ ５０％Ａ ＋”Ａ ＋、 Ｘ Ｘ雌 ５０％Ａ、’Ａ、、 ＸＹ雌 ３、組み合わせ ＡｌｏＡｔ、 ＸＸ雌ｘ Ａ２”Ａ２． ＸＹ雄↓ （６，２５％の子孫） ＡＩ’Ａ１． Ａ２ＴＡ２． ＸＸ雌ｘ ＡｌＡｌ、 Ａ２”Ａ２． ＸＹ雄↓ （６，２５％の子孫） Ａ ＩＡ Ｉ＋ Ａ ２”Ａ ２”、 Ｘ Ｙ雄ｘ ＸＸ雌↓ ５０％Ａ ２”Ａ ２． Ｘ Ｙ雄 ５０ ％Ａ２ＴＡ２． ＸＸ雄 方法り。(Margins below the main text) Table 2゜ ■, antisense construct A in autosomes, “A,, XX female x XY male ↓ 25% A, “A,, XX female 25% A, A,, XX female 25% A, 'A,, XY female 25% AIA, XY male 2. Multiple antisense constructs A+'A+'' in autosomes, XX female x Y male ↓ 50%A+”A+, XX Female 50% A, 'A,, XY female 3. Combination AloAt, XX female x A2” A2. XY male↓ (6.25% descendants) AI’A1. A2TA2. XX female x AlAl, A2” A2. XY male↓ (6.25% descendants) A IA I + A 2" A 2", X Y male x XX female ↓ 50%A 2”A 2.XY male 50%A2TA2. XX male Method.
変更したタンパク質の発現は正常なタンパク質の作用を妨害して性転換をもたら す。変更したタンパク質を発現する構築物はアンチセンスＲＮＡをコードするも のと同様の産物をもたらし、その用途は本質的に等しい。Expression of the altered protein interferes with the action of the normal protein, resulting in sex reversal. vinegar. The construct expressing the modified protein also encodes antisense RNA. yields similar products and their uses are essentially the same.
方法Ｅ。Method E.
センス（精巣決定）と、アンチセンスまたは変更タンパク質生産性構築物との組 み合わせを用いると、一方または他方に対してホモ接合体である動物を得ること ができる。これらの動物の子孫は全て１つの性となるであろう（表２、パート３ ）。Pairing sense (testis-determined) with antisense or modified protein productivity constructs With mating you can obtain animals that are homozygous for one or the other. Can be done. The offspring of these animals will all be of one sex (Table 2, Part 3 ).
本発明は別の面においては、コーディング配列を含む機能的核酸を動物のゲノム またはその前駆体中に導入することからなる、その子孫が統計的に所望の性に偏 っているか、あるいは一方の性だけである真獣下綱哺乳動物を生産する方法を提 供し、ここで該コーディング配列は該哺乳動物のＴＤＦタンパク質をコードする か、あるいは該哺乳動物のＴＤＦ ｍＲＮＡと相補的な配列をもつアンチセンス ＲＮＡをコードする。In another aspect, the invention provides a method for transducing a functional nucleic acid containing a coding sequence into an animal's genome. or into its precursor so that its progeny are statistically biased towards the desired sex. The present invention proposes a method for producing eutherian mammals of either sex, or of only one sex. wherein the coding sequence encodes a TDF protein of the mammal. Or, an antisense with a sequence complementary to the TDF mRNA of the mammal. encodes RNA.
この方法の１態様においては、常染色体、Ｘ染色体または偽書染色体遺伝子座へ の機能的ＴＤＦ遺伝子の挿入は、胚におけるＴＤＦ遺伝子の発現をもたらし、胚 を雄として発生させることになる。好ましくは、ＴＤＦ遺伝子の複数のコピーを ゲノム中の異なる遺伝子座に挿入し、好ましくは１以上の常染色体遺伝子座に挿 入して、該動物によって生産される全ての配偶子が、ＸまたはＹ染色体を含むか 否かにかかわらず、ＴＤＦ遺伝子のコピーを含むようにする。In one embodiment of this method, to an autosomal, X-chromosomal or pseudochromosomal locus Insertion of a functional TDF gene in the embryo results in expression of the TDF gene in the embryo. will develop as a male. Preferably, multiple copies of the TDF gene inserted into different loci in the genome, preferably into one or more autosomal loci. do all gametes produced by the animal contain an X or Y chromosome? whether or not it contains a copy of the TDF gene.
この方法の別の態様においては、コーディング配列を、アンチセンスＲＮＡへの 遺伝子の転写を確実にするプロモーターやエンハンサ−などの制御配列とともに 挿入する。ここでも、コーディング配列を常染色体、Ｘ染色体または偽書染色体 遺伝子座に挿入することが好ましく、好ましくは複数のコピーを異なる常染色体 遺伝子座に挿入する。胚の中で発現すると、このような配列はアンチセンスＲＮ Ａの生産をもたらし、該アンチセンスＲＮＡは該種の雄となる可能性のある天然 ｍ ＲＮ Ａとアニールしてその翻訳を妨げ、これによって天然ＴＤＦ遺伝子の 発現を妨げて胚が雌として発生することを確実にする。このようなトランスジェ ニック動物を生産する方法はバイオテクノロジーの分野で得られ、慣用的に用い られている。In another embodiment of this method, the coding sequence is converted into antisense RNA. Along with regulatory sequences such as promoters and enhancers that ensure gene transcription. insert. Again, coding sequences can be linked to autosomes, X chromosomes or pseudochromosomes. Preferably, multiple copies are inserted into different autosomal loci. Insert into a genetic locus. When expressed in the embryo, such sequences become antisense RN The antisense RNA results in the production of A, and the antisense RNA is a natural male potential male of the species. mRNA and prevents its translation, thereby inhibiting the natural TDF gene. Preventing expression ensures that the embryo develops as a female. Such a transfection Methods for producing nicked animals are available in the field of biotechnology and are conventionally used. It is being
このようなトランスジェニック動物および動物を用いる単一性の繁殖方法が本発 明の別の面を構成する。以下の参考文献はトランスジェニック法一般をさらに詳 しく説明する：Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ 、 Ｂ、 Ｈｏ１ａｎ、 Ｆ、 Ｃｏｎ５ｔａｎｔｉｎｊ ＆Ｅ、 Ｉ、ａｃｙ 、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 （１９ ８６）； ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＡｎｉｍａｌｓ、 Ｒ，Ｊａｅｎｉｓｃｈ、、 ５ｃｉｅｎｃｅ、 ２４０：１４６８−１４７４．１９８８； Ｔｅｒａｔｏ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｒｃ Ｓｔｅｍ ＣｅＮ５． ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ。Monosexual breeding methods using such transgenic animals and animals are the subject of this invention. It constitutes another aspect of light. The following references provide further information on transgenic methods in general. Explain: Manipulating the Mouse Embryo , B, Ho1an, F, Con5tantinj & E, I, acy , Co1d Spring Harbor Laboratory, (19 86); Transgenic Animals, R. Jaenisch, 5science, 240:1468-1474.1988; Terato carcinomas and Embryonrc Stem CeN5. a practical approach.
Ｅ、Ｊ、 Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編集、 ｒＲＬ Ｐｒｅｓｓ、 ０ｘｆｏｒｄ （１９８７）； Ａｌｔｅｒｒｎｇ ｔｈｅＧｅｎｏｍｅ ｂｙ Ｈｏｍｏｌｏ ｇｏｕｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ、 Ｍ、Ｒ，Ｃａｐｅｃｃｈｉ、 ５ｃ ｉｅｎｃｅ。Edited by E. J. Robertson, rRL Press, 0xford (1987); Alterrng the Genome by Homolo gous Recombination, M, R, Capecchi, 5c ience.
２４４：１２８８−１２９２．１９８９゜３番目および４番目のものがそれぞれ 特に胚性幹細胞の操作および相同的組換えに適切である。アンチセンス法はさら に、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ、 Ｄ、Ａ、 Ｍｅｌｔｏｎ 編集。244:1288-1292.1989゜3rd and 4th ones respectively It is particularly suitable for the manipulation of embryonic stem cells and homologous recombination. Antisense law is more , Antisense RNA and DNA, D, A, Melton edit.
Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８８） に記載されており、この方法の応用はＣｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｒｍａ ｌ Ｂｅｈａｖｉｏｕｒ ｔｏ ５ｈｆｖｅｒｅｒｂｙ Ｍｙｅｌｉｎ Ｂａ５ ｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｃＤＮＡ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅ ｎｆｃ Ｍｉｃｅ。Col1d Spring Harbor Laboratory (1988) Application of this method is described in Conversion of Norma l Behavior to 5hfvererby Myelin Ba5 ic Protein Antisense cDNA in Transge nfc Mice.
Ｍ、Ｋａｔｓｕｍｉ、Ｍ、５ａｔｏ、Ｍ、Ｋｉｍｕｒａ、Ｍ、Ｙｏｋｏｙａｍａ 、Ｋ、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ＆ Ｔ、 Ｎｏｍｕｒａ、 ５ｃｉｅｎｃｅ ２４１ ：５９３−５９５．１９８８に記載されている。M, Katsumi, M, 5ato, M, Kimura, M, Yokoyama. , K. Kobayashi & T. Nomura, 5science 241 :593-595.1988.
その他の慣用的遺伝子操作法を、精巣決定遺伝子を不活性化し、これによって雌 の子孫だけを得るために応用することができる。Other conventional genetic engineering methods are used to inactivate testis-determining genes, thereby It can be applied to obtain only the descendants of .
ここで本発明を添付の図面を参照しながら、以下の実施例（何ら本発明の限定を 意味しない）において説明する。The present invention will now be described by way of the following examples (which are not intended to limit the invention in any way) and with reference to the accompanying drawings. It is explained in (not meaning).
実施例１ ４０ｋｂのＹ染色体のサザンプロット分析一連のオーバーラツプするラムダおよ びコスミドクローンからなる、偽書染色体領域から偽書染色体境界を越えてＹ染 色体の性特異的領域までの前述した染色体歩行からのプローブ（Ｅｌｌｉｓ、 Ｎ。Example 1 Southern blot analysis of the 40 kb Y chromosome. A series of overlapping lambda and Y-staining from the pseudochromosomal region to the pseudochromosomal boundary, consisting of Probes from the previously described chromosome walk to sex-specific regions of the chromoplast (Ellis, N.
Ａ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ ３３７：８１−８４．１９８９）を、Ｔ ＤＦが存在する領域を同定するために、ＸＸ雄のゲノム上で用いた（Ｐａｌｍｅ ｒ、 Ｍ、Ｓ。A, et al., Nature 337:81-84.1989), T In order to identify the region where DF is present, it was used on the genome of XX male (Palme r, M, S.
ｅｔ ａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ ３４２：９３７−９３９．１９８９ ）。et al., Nature 342:937-939.1989).
この実施例では、図２で示すように、同じＺＦＹネガティブなＸＸ雄のゲノム上 でさらに３つのプローブを用いた。図２はヒトＹ染色体の遠位短腕の遺伝子地図 を示すが、ここで左側の斜線部は偽書染色体領域であり、破線は偽書染色体領域 とＹ特異的領域との開の境界である。上部に示すのは、Ｙ染色体に沿った歩行か ら得られた３つのオーバーラツプするラムダクローンであるラムダ５１、ラムダ ４、ラムダ５３およびプラスミドｐＮＢである。In this example, the genome of the same ZFY negative XX male, as shown in Figure 2. Three more probes were used. Figure 2 is a genetic map of the distal short arm of the human Y chromosome. The diagonal line on the left is the pseudochromosomal region, and the broken line is the pseudochromosomal region. This is the open boundary between the Y-specific region and the Y-specific region. Is the image shown at the top walking along the Y chromosome? Three overlapping lambda clones, lambda 51 and lambda 4, lambda 53 and plasmid pNB.
ＸＸ雄の中断点は３５ｋｂの破線によって示される（図３参照）。The XX male breakpoint is indicated by the 35 kb dashed line (see Figure 3).
黒のボックスは単一コピーＹ特異的ヒトＤＮＡ断片を検出するブローブを表し、 （＋）で示す。これらのプローブをウシおよびマウスゲノムからの雄および雌Ｄ ＮＡとハイブリダイズすると、ｐＹ５３．３のみがＹ特異的断片を検出した（＋ ）。ｐＹＨ８を除く全てのプローブがｘＸ雌雄中配列とハイブリダイズした。ｐ Ｙ４、ｌβはＸｘ雄とポジティブであり、プローブｐＹＨ８はネガティブであっ た。第３のＹ特異的プローブであるｐＹＲｏ、４はｐＹ４．１βとｐＹＨ８との 間の配列に由来し、ＸＸ雄における中断点を定義するように思われる。ｐＹＲｏ 、４は正常雄の８゜５ｋｂのＨｉｎｄＩ［［断片を検出するが、２つの関連する 個体であるＸＸ雄（ＴＬ）および両性動物（ｈｅｒｍａｐｈｒｏｄｉ ｔｅ：Ｄ Ｌ）においては４ｋｂの断片のみを検出し、一方第３の関連しないＸＸ雄（ＺＭ ）においては、以下に記載するように６ｋｂの断片を検出したニ ゲノムＤＮＡ （ｌ Ｏｔｔｇ＞をＨｉｎｄｎ［で消化して、９．８％アカロー スゲル上で分離し、Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移し、０．４Ｍ Ｎａ０Ｈ（２０分）で固定した。プローブｐＹＲＯ，４中に存在する反復配列 を抑制するために、これを３２ｐで標識し、５００μｌ （５ｍｇ／ｍｌ−’） の音波処理したヒト胎盤ＤＮＡと共に変性し、ハイブリダイゼーションバッファ ー２ｍｌ中、６５℃で２時間プレハイブリダイゼーションを行った（Ｓｅａｌｙ 、 Ｐ、Ｇ、、 Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ、 Ｐ、Ａ、 ａｎｄ ５ｏｕｔｈｅｒｎ 、 Ｅ、 Ｍ、、 Ｎｕｃｌ。The black box represents a probe that detects a single copy Y-specific human DNA fragment; Indicated by (+). These probes were used to detect male and female D from bovine and mouse genomes. When hybridized with NA, only pY53.3 detected a Y-specific fragment (+ ). All probes except pYH8 hybridized to xX male and female sequences. p Y4 and lβ were positive with Xx males, and probe pYH8 was negative. Ta. The third Y-specific probe, pYRo,4, is a combination of pY4.1β and pYH8. appears to define a break point in the XX male. pYRo , 4 detects the normal male 8°5 kb HindI [[ fragment, but two related Individual XX male (TL) and hermaphrodite (D) In the third unrelated XX male (ZM ), the 6 kb fragment was detected as described below. Genomic DNA (l Ottg ) was digested with Hindn [9.8% akarol] Separate on a gel and transfer to Hybond N+ (Amersham), 0.4M Fixed with NaOH (20 minutes). Repeat sequences present in probe pYRO,4 In order to suppress this, it was labeled with 32p and 500 μl (5 mg/ml-') denatured with sonicated human placental DNA in hybridization buffer. - Prehybridization was carried out in 2 ml at 65°C for 2 hours (Sealy , P, G, , Whittaker, P, A, and 5outhern , E, M,, Nucl.
Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、 １３：１９０５−１９２２） 。このプローブ混合物 （２ｍ ｌ ）を、５ｘＳＳＰＥ、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．５％ ＳＤ Ｓ。Ac1ds Res, 13:1905-1922). This probe mixture (2 ml) in 5x SSPE, 5x Denhardt solution, 0.5% SD S.
変性サケ***ＤＮＡ ２００μｇ ／ ｍ １ 、および１０％の音波処理した 変性ヒト胎盤ＤＮＡからなるバッファー中のフィルターに加えて、６５℃で１６ 時間ハイブリダイズした。フィルターを０．２ｘＳＳＣ，０，２％ ＳＤＳ、６ ５℃でよく洗浄し、６日間オートラジオグラフィーに付した。ＸＸ雄における中 断点は境界から約３５ｋｂの領域に集まっている。Denatured salmon sperm DNA 200μg/m1 and 10% sonicated Add to the filter in a buffer consisting of denatured human placental DNA at 65 °C for 16 min. time hybridized. Filter 0.2xSSC, 0.2% SDS, 6 The cells were thoroughly washed at 5°C and subjected to autoradiography for 6 days. Inside of XX male The break points are concentrated in a region approximately 35 kb from the boundary.
この結果は、ＴＤＦが偽書染色体境界の３５ｋｂ内にある性特異的配列中に位置 することを示唆する。中断点の位置をさらに詳しく特定することは、ｐＹ４．１ β、ｐＹＲＯ，４およびｐＹＨ８の間にある配列の高度な反復性のために不可能 であった。This result indicates that TDF is located in a sex-specific sequence within 35 kb of the pseudochromosomal boundary. suggest that To further pinpoint the location of the breakpoint, pY4.1 impossible due to the highly repetitive nature of the sequences between β, pYRO,4 and pYH8. Met.
この３５ｋｂのＤＮＡ内にあるＴＤＦを見つけるために、以下の方法を採用した 。ＤＮＡを大きさが約４ｋｂの都合のよい断片にサブクローニングし、次いで各 ４ｋｂ断片をＲｓａＩのような”頻繁カッター”である制限酵素で切断して、大 きさが５００ｂｐからｌｋｂまでの範囲のより小さい断片にする。全部で５０プ ローブを試験した。各小断片を放射性標識して以下のものからのＤＮＡのサザン プロットのプローブに用いた：ヒト雄および雌；マウス雄および雌：ウシ雄およ び雌；ならびにヒトＸまたはヒトＹ染色体を含むヒト−ハムスタ一体細胞ハイブ リッド。方法は図４と関連して述べるが、オートラジオグラフィーは一夜であっ た。In order to find TDF within this 35 kb DNA, we adopted the following method. . The DNA was subcloned into convenient fragments of approximately 4 kb in size and then each The 4kb fragment was cut with a “frequent cutter” restriction enzyme such as RsaI to create a large Cut into smaller fragments ranging in size from 500 bp to lkb. 50 pages in total The robe was tested. Radiolabeling each small fragment and Southern analysis of DNA from: Used to probe plots: human males and females; mouse males and females; bovine males and females. and a human-hamster unitary cell hive containing a human X or human Y chromosome; Lid. The method is described in conjunction with Figure 4, but autoradiography can be performed overnight. Ta.
図５は♂（雄セルライン、ＰＧＦ） （Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ、 Ｐ、Ｊ、 ｅ ｔ ａｌ、。Figure 5 shows male (male cell line, PGF) (Goodfellow, P, J, e tal,.
Ａｎｎ、 Ｈｕｍ、 Ｇｅｎｅｔ、 ５３：１５−２２．１９８９ ） ； ４ Ｙ （４９ＸＹＹＹＹセルライン、Ｏｘ ｅ ｎ） （Ｂｉｓｈｏｐ、 Ｃ， Ｅ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ ３０３：８３１−８３２．１９８３） ；♀（雌セルライン、ＷＴ４９） （ＤｅＫｒｅｔｓｅｒ、 Ｔ。Ann, Hum, Genet, 53:15-22.1989); 4 Y (49XYYYY cell line, Ox e n) (Bishop, C, E, et al., Nature 303:831-832.1983) ;♀ (Female cell line, WT49) (DeKretser, T.
Ａ、ｅｔ ａｌ、、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１２：６００−６０６． １９８２ ） ； ４ Ｘ （４ｓ ｘｘｘｘセルライン、ＧＭ １４１６ Ｂ ） （Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅ５ｅ ａｒｃｈ Ｃａｍｄｅｎ、 Ｎ、Ｊ、） ； Ｈ（ハムスター親セルライン、Ｗ ３ ＧＨ） （Ｗｅｓｔｅｒｖｅｌｄ、 Ａ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ、。A, et al., Eur, J. Immunol, 12:600-606. 1982); 4X (4s xxxx cell line, GM 1416B ) (Coriell In5titutefor Medical Re5e arch Camden, N, J,); H (hamster parent cell line, W 3GH) (Westerveld, A, et al, Nature New Biol.
２３４＋２０−２４．１９７１） ； Ｘ （ヒトＸ染色体を含むハムスター− ヒトハイブリッドセルライン、ＣＬ ２ Ｄ） （Ｗｅｓｔｅｒｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ、、前出）：Ｙ（ヒトＹ染色体を含むハムスター−ヒトハイブリッドセル ライン、８５３） （Ｂｕｒｋ、 Ｒ，Ｄ、、 Ｍａ、Ｐ、 ａｎｄ Ｓｍ１ｔ ｈ、Ｋ、Ｄ、、 Ｍ。234+20-24.1971); Human hybrid cell line, CL2D) (Westerfeld et al. al,, supra): Y (hamster-human hybrid cell containing the human Y chromosome line, 853) (Burk, R, D,, Ma, P, and Sm1t h, K, D,, M.
１、 Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、、 ５：５７６−５８１．１９８５）のサザンプロ ットを示し、ここでフィルターはｐＹ５３．３のＨｉｎｃＩＩ断片（０，９ｋｂ ）とハイブリダイズし、この断片は♂、４ＹおよびＹにおける２゜ＩｋｂのＨｉ ｎｄｌＩ［断片を検出し、バンドの強度は存在するＹ染色体のコピー数を反映す る。1, Ce1l Biol, 5:576-581.1985) Southern Pro. The filter shows a HincII fragment of pY53.3 (0.9 kb ), and this fragment hybridizes with 2°Ikb Hi in male, 4Y, and Y. ndlI [fragment detected, the intensity of the band reflects the number of copies of the Y chromosome present. Ru.
反復配列の寄与を抑制するために、全てのプローブを全ヒトＤＮＡとプレハイブ リダイズさせるか、あるいはさせずに試験した（Ｓｅａｌｙ ｅｔ ａｌ、、前 出）。この後者の予防措置にもかかわらず、試験したプローブの大半はヒトゲノ ム中の特異な配列を検出することができなかったが、ゲノム全体に分布する反復 要素と反応した。これらの反復プローブはしばしばウシゲノム中の反復を検出し た。All probes were prehybridized with total human DNA to suppress the contribution of repetitive sequences. tested with or without redization (Sealy et al., supra). out). Despite this latter precaution, the majority of probes tested were Although we were unable to detect any unique sequences in the genome, we were unable to detect any unique sequences in the genome, but Reacted with the elements. These repeat probes often detect repeats in the bovine genome. Ta.
ヒトＤＮＡにおける単一コピーＹ特異的バンドを検出する以下の７つのプローブ が発見された（図２参照）： ｐＹＮＢ （０，７ｋｂ）、ｐＹ５３．３ （２ ，Ｉｋｂ）、ｐＹ５３．Ｉα（０，８ｋｂ）、ｐＹ５３．ｌβ（０，８ｋｂ）、 ｐＹ５３．ｌγ（１゜３ｋｂ）、ｐＹ５３．２ （０，９ｋｂ）よびｐＹ４．１ β（０゜２ｋｂ）。しかしながら、上記７つのプローブのうち、ｐＹ５３．３だ けがマウスおよびウシゲノム中のＹ特異的バンドと反応した。The following seven probes detect single copy Y-specific bands in human DNA. were discovered (see Figure 2): pYNB (0.7 kb), pY53.3 (2 , Ikb), pY53. Iα (0.8 kb), pY53. lβ (0,8kb), pY53. lγ (1°3kb), pY53.2 (0.9kb) and pY4.1 β (0°2 kb). However, among the seven probes mentioned above, pY53.3 It reacted with Y-specific bands in injured mouse and bovine genomes.
図９はｐＹ５３．３ （２，１ｋｂ）サブクローンを示し、矢印の領域はオーブ ンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であり、黒く塗り潰したボックスは８０アミ ノ酸の保存モチーフによって保存される領域であり、これはＳ、ｐｏｍｂｅのＭ ｃタンパク質と、ＨＭＧｌおよびＨＭＧ２と関連するいくつかの非ヒストンタン パク質との相同性を示す。数字は塩基対の番号を表し、ＨｔｎｃｌＩ部位はプロ ーブとして用いられた０、９ｋｂのサブクローンを規定する。Figure 9 shows the pY53.3 (2,1kb) subclone, and the arrowed region is an orb. The black box is the 80 ami reading frame (ORF). This is a region that is conserved by the conserved motif of amino acid, S, M of pombe. c protein and several non-histone proteins associated with HMGl and HMG2. Shows homology with protein. The numbers represent base pair numbers, and the HtnclI site is A 0.9 kb subclone was used as a probe.
ｐＹ５３．３の０．９ｋｂ ＨｉｎｃＩＩサブクローンはヒト、マウスおよびウ シゲノムＤＮＡのＹ特異的断片と最も強くハイブリダイズし、したがってこのサ ブクローンを次の実験のプローブとして用いた。The 0.9 kb HincII subclone of pY53.3 is human, mouse and horse. hybridizes most strongly with the Y-specific fragment of the sigenomic DNA, and therefore The clone was used as a probe in the next experiment.
ｐＹ５３．３の保存性 ｐＹ５３．３の０．９ｋｂ ＨｉｎｃＩＩサブクローンとハイブリダイズした真 獣下綱補乳動物の雄および雌からのＤＮＡを含むアークプロット（Ａｒｋ ｂｌ ｏｔ）を以下のようにして調製したニゲツムＤＮＡ （Ｉ Ｏμｇ）をＨｔｎｄ ｌ［Ｉで消化し、０．８％アガロースゲルで分離し、Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋（Ａｍ ｅｒｓｈａｍ）に移し、０．４Ｍ ＮａＯＨ中で固定した。ｐＹ５３．３を３２ ′Ｐで標識し、５ｘＳＳＰＥ、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、０゜５％ ＳＤＳ、 １０％ 硫酸デキストラン、２００μｇ／ｍｌ変性サケ***ＤＮＡからなるバッ ファー中のフィルターに加え、そして６５℃で１６時間ハイブリダイズした。フ ィルターを１ｘＳＳＣ，０，２％ ＳＤＳ中、６５℃で洗浄し、２日間オートラ ジオグラフィーに付した。結果を図４に示す。プローブは以下の動物における維 持異的断片を検出する：ヒト（２，１ｋｂ）、チンパンジー（−１８ｋｂ）、ウ サギ（４，２ｋｂ）、ブタ（−６゜６ｋｂ）、ウマ（−１０ｋｂ）、ウシ（−１ ，８ｋｂ）およびトラ（−６，６ｋｂ）。Conservation of pY53.3 True hybridized with the 0.9 kb HincII subclone of pY53.3 Arkplot containing DNA from male and female subtherian mammals. ot) prepared as follows, Htndum DNA (I Oμg) Hybond N+ (Am ersham) and fixed in 0.4M NaOH. pY53.3 to 32 'P labeled, 5x SSPE, 5x Denhardt solution, 0°5% SDS, A bag consisting of 10% dextran sulfate and 200 μg/ml denatured salmon sperm DNA. Added to filter in fur and hybridized for 16 hours at 65°C. centre The filters were washed in 1x SSC, 0.2% SDS at 65°C and left in an autotrailer for 2 days. Attached to geography. The results are shown in Figure 4. The probe can be used to improve maintenance in the following animals: Detect unique fragments: human (2.1kb), chimpanzee (-18kb), horse Heron (4,2kb), pig (-6°6kb), horse (-10kb), cow (-1 , 8kb) and Tora (-6,6kb).
ｐＹ５３．３のサブクローンによって検出される配列は保存されており、哺乳動 物の広範囲のスペクトルにおいて維持異的である。低緊縮条件では、雄と雌で共 通に見いだされる断片が他にもあり、これはｐＹ５３．３に関連するＸ染色体ま たは常染色体配列の存在を示唆する。しかしながら、これらの断片はヒトＸ染色 体を唯一のヒト由来物として保持するヒト−げっし類体細胞ハイブリッド中に検 出されなかった（図５）。The sequences detected by subclones of pY53.3 are conserved and mammalian. Maintaining heterogeneity over a wide spectrum of objects. Under low stringency conditions, males and females share There are other commonly found fragments that are associated with the X chromosome or pY53.3. or the presence of an autosomal sequence. However, these fragments were stained with human detected in a human-rodent somatic cell hybrid that retains the body as a uniquely human source. (Figure 5).
異なる哺乳動物種のＹ染色体の間で保存されている配列を見いだすことはまれで あり、知られている唯一の例外はＺＦＹである（Ｐａｇｅ ｅｔ ａｌ、、前出 ）。この結果は真獣下綱哺乳動物のＹ染色体上にある機能的配列と反応するｐＹ ５３．３と一致する。It is rare to find sequences that are conserved between the Y chromosomes of different mammalian species. The only known exception is ZFY (Page et al., supra). ). This result shows that pY reacts with a functional sequence on the Y chromosome of eutherian mammals. 53.3.
ｐＹ５３．３およびその他のＹ特異配列の配列分析ｐＹ５３．３の配列はプライ マー歩行によって決定され、図６の１行目に示しである。Sequence analysis of pY53.3 and other Y-specific sequences The sequence of pY53.3 was It is determined by Mar walking and is shown in the first line of FIG.
プラスミドをｐＵＣ１８ベクター（ＮＥＢ）中にサブクローニングし、合成オリ ゴヌクレオチドプライマーとシークエナーゼ（ＵＳＢ）を用いて、ジデオキシタ ーミネーション法によって２本鎖ＤＮＡとして配列決定した（Ｓａｎｇｅｒ、 Ｆ、、 Ｎ１ｃｋｌｅｎ、 Ｓ、 ａｎｄＣｏｕｌｓｏｎ、Ａ、Ｒ，、Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｊ、 ＵＳＡ、 ７４二５４６３−５４６７゜１ ９７７ ）。ヌクレオチド配列をＥＭＢＬ ＤＮＡデータベースと比較した。Ｅ ＭＢＬ ＤＮＡ配列データベースの検索では、ｐＹ５３．３と関連するいかなる 配列をも見いだすことができながった。しかしながら、ｐＹ５３．３ （２，１ ｋｂ）配列を調べてみると、動源体から偽書染色体境界の方へと、異なるフレー ム５′→３゛にオーバーラツプする２つの長いオーブンリーディングフレームが 明らかとなった。これらのオープンリーディングフレー〉 ムの概念的翻訳を用 いて、同様の検索アルゴリズムによってＰＩＲタンパク質データベースをスクリ ーニングした（Ｓｍｉｔｈ、 Ｔ、Ｆ。The plasmid was subcloned into the pUC18 vector (NEB) and the synthetic origin dideoxyta using oligonucleotide primers and sequencease (USB). The sequence was determined as double-stranded DNA by the chromatography method (Sanger, F., N1cklen, S. and Coulson, A. R., Proc. , Natl, Acad, Scj, USA, 7425463-5467゜1 977). Nucleotide sequences were compared to the EMBL DNA database. E A search of the MBL DNA sequence database revealed that any related to pY53.3 I couldn't even find the sequence. However, pY53.3 (2,1 kb) Examination of the sequence reveals that different frames are observed from the centrosome toward the pseudochromosomal boundary. There are two long oven reading frames that overlap from 5' to 3'. It became clear. Using conceptual translations of these open reading frames The PIR protein database was screened using a similar search algorithm. (Smith, T.F.
ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ、 Ｍ、Ｓ、、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、、 １ ４７：１９５−１９７．１９８１： Ｃａ１ｌｉｎｓ、 Ｊ、Ｆ、、 Ｃｏｕｌ ｓｏｎ、 Ａ、Ｆ、Ｗ、 ａｎｄ Ｌｙａｌｌ、 Ａ、、 ＣＡＢＩＯ５，４： ８７−７１゜１９８８）。第２のオープンリーディングフレームは相同のウサギ Ｙ染色体特異配列と共通である１２０アミノ酸の領域をコードし、これは***酵 母シゾサツカロミセス／ボンベのｍａｔ３−Ｍ遺伝子座にある配列によってコー ドされるＭＣタンパク質と関連することが分かった。（Ｋｅｌｌｙ、 Ｍ、 ｅ ｔ ａｌ、、 ＥＭＢＯＪ、、 ７：１５３７−１５４７゜１９８８）。８０ア ミノ酸の領域にわたって、２つのタンパク質は同じであるか、あるいは保存性の 変更を表す４７残基を共有していた（図７、上の行および真ん中の行参照）。and Waterman, M.S., J., Mo1. Biol,, 1 47:195-197.1981: Calins, J. F., Coul son, A, F, W, and Lyall, A, CABIO5,4: 87-71゜1988). The second open reading frame is the homologous rabbit It encodes a 120 amino acid region that is common to the Y chromosome-specific sequence, and this Codified by sequences at the mat3-M locus of the mother Schizosatucharomyces/Bombe. It was found that this protein is associated with the MC protein that is encoded. (Kelly, M, e tal, EMBOJ, 7:1537-1547゜1988). 80a Across the amino acid region, the two proteins are either identical or conserved. They shared 47 residues representing changes (see Figure 7, top and middle rows).
ｐＹ５３．３における８０残基の保存モチーフもまた、核の非ヒストンタンパク 質であるＨＭＧｌおよび８ＭＧ２に見られるドメインとの相同性を示した。ハイ モビリティ−グループ（Ｈｉ ｇｈ Ｍｏｂｉｌｉｔｙ Ｇｒｏｕｐ：ＨＭＧ） タンパク質１および２は染色体の構造と遺伝子活性においである役割を果たして いると考えられ、一部はＡ＋Ｔに富む１本鎖配列への増強されたＤＮＡ結合を示 す（Ｊａｎｔｚｅｎ、 Ｈ，Ｍ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ ３４４：８ ３０−８３６゜１９９０）。ＨＭＧＩおよび８ＭＧ２は転写に活性なりロマチン （染色質）の領域と関連することが知られている。ＨＭＧｌおよび８ＭＧ２中に は、サツカロミセス・セレビシェの非ヒストン染色体タンパク質ＮＨＰ ６ （ Ｋｏｌｏｄｒｕｂｅｔｚ、 Ｄ、 ＆ Ｂｕｒｇｕｍ、 Ａ、、 Ｊ、 Ｂｉｏ ｌ。The 80-residue conserved motif in pY53.3 is also associated with nuclear non-histone proteins. It showed homology with the domains found in HMGl and 8MG2. Yes Mobility Group (High Mobility Group: HMG) Proteins 1 and 2 play a role in chromosome structure and gene activity. some show enhanced DNA binding to A+T-rich single-stranded sequences. (Jantzen, H, M, et al, Nature 344:8 30-836°1990). HMGI and 8MG2 are transcriptionally active and lomatin It is known to be associated with areas of (chromatin). In HMGl and 8MG2 is the non-histone chromosomal protein NHP 6 of Satucharomyces cerevisiae ( Kolodrubetz, D. & Burgum, A., J. Bio l.
ＣＨｅｍ、、 ２６５：３２３４−３２３９．１９９０） 、酵母ＡＲ３結合タ ンパク質であるＡＢＦ２、およびヒト核転写因子であるｈＵＢＦ （ヒト上流結 合因子：ｈｕｍａｎ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆａ ｃ ｔ ｏ ｒ ） （Ｊａｎｔｚｅｎ、前出）を含むいくっがのタンパク質中に既に見いだ されていたモチーフであるＨＭＧボックスがある。CHem, 265:3234-3239.1990), yeast AR3 binding protein ABF2, a protein, and hUBF, a human nuclear transcription factor (human upstream binding Combined factor: human upstream binding fa c t o r) (Jantzen, supra). There is an HMG box that was a motif.
ｈＵＢＦ産物は配列特異的ＤＮＡ領域と相互作用するＲＮＡポリメラーゼ１転写 因子である。このモチーフはＤＮＡ結合性ドメインの新しいクラスを代表するも のであるかも知れない（Ｊａｎｔｚｅｎ。hUBF products interact with sequence-specific DNA regions of RNA polymerase 1 transcription It is a factor. This motif represents a new class of DNA-binding domains. (Jantzen.
前出）。保存された結合モチーフは、初期ＨＭＧ一様非特異的ＤＮＡ結合構造か ら多分始まる大きな属の配列を代表するものであると思われる。(cited above). Conserved binding motifs represent the initial HMG-like uniform non-specific DNA-binding structure It is thought that this represents the sequence of a large genus that probably begins with .
図１０はｐＹ５３．３ （ヒト）の保存された８ｏアミノ酸（１文字表記で示す ）を、Ｓ、ｐｏｍｂｅのＭＣタンパク質（Ｍｃ）、ヒト上流結合因子（ｈＵＢＦ ）、Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅがらの非ヒストン染色体タンパク質（ＮＨＰ６） およびハイモビリティ−グループタンパク質１ （ＨＭＧＩ）と比較して示す。Figure 10 shows the conserved 8o amino acids (indicated by one letter) of pY53.3 (human). ), S, pombe MC protein (Mc), human upstream binding factor (hUBF ), non-histone chromosomal protein (NHP6) from S. cerevisiae and High Mobility Group Protein 1 (HMGI).
ボックスで囲んだ領域は同じアミノ酸であり、陰影をつけた領域はヒトｐＹ５３ ．３配列に対する保存的アミノ酸変更を示す。The boxed region is the same amino acid, and the shaded region is human pY53. ．． 3 shows conservative amino acid changes to the sequence.
Ｍｅ関連のオーブンリーディングフレームの３゛末端において、ｐｙｓ３．ａ配 列は停止コドンに至る前に６８アミノ酸続く。At the 3' end of the Me-related open reading frame, pys3. a arrangement The string continues for 68 amino acids before reaching the stop codon.
この領域のＤＮＡ配列にはスプライス供与部位となりうるちのが全く見られない が、停止コドンの１３３塩基対下流にポリアデニル化シグナルと推定されるもの が存在する。５′方向には、Ｓ。No potential splice donor sites are found in the DNA sequence of this region. However, there is a presumed polyadenylation signal 133 base pairs downstream of the stop codon. exists. In the 5' direction, S.
ｐｏｍｂｅ ＭＣタンパク質とｐＹ５３．３ Ｍｃ関連配列との間の相同性が崩 れる地点において、ｐＹ５３，３ ＤＮＡ配列中に共通のスプライス受容シグナ ルとなりうるちのが存在する。オーブンリーディングフレームは５°方向にさら に７５アミノ酸続き、この領域内にｐＹ５３．３中の２つの出発コドンとなりう るものが見いだされる。The homology between the pombe MC protein and pY53.3 Mc-related sequences is disrupted. A common splice acceptor signal is found in the pY53,3 DNA sequence at the point where There are some things that can become true. The oven reading frame should be aligned in a 5° direction. followed by 75 amino acids, and within this region are the two potential start codons in pY53.3. You can find what you want.
ｐＹ５３．３中の配列モチーフの保存性および機能的重要性を試験するために、 相同なＹ特異的ウサギ配列をクローン化して配列決定した。図６はｐＹ５３．３ （ヒト）（上の行）およびウサギＹ特異的相同配列（下の行）のヌクレオチド 配列を示す。縦の線は対になる塩基を示し、小文字は塩基の相違を示す。Ｓ、ｐ 。To test the conservation and functional significance of sequence motifs in pY53.3, A homologous Y-specific rabbit sequence was cloned and sequenced. Figure 6 shows pY53.3 (human) (top row) and rabbit Y-specific homologous sequence (bottom row) nucleotides Indicates an array. Vertical lines indicate paired bases, and lowercase letters indicate base differences. S,p .
ｍｂｅのＭｅ領領域の相同性をボックスで囲んだ。Homology of the Me region of mbe is boxed.
図７は、ｐＹ５３．３ （ヒト）（真ん中の行）のアミノ酸配列を、ウサギＹ特 異的相同体（下の行）およびＳ、ｐｏｍｂｅのＭＣタンパク質（上の行）と比較 したものである。印を付けたボックスで囲んであるのは同じアミノ酸を表し、印 を付けていないボックスで囲んだのは保存的アミノ酸変更を示す。アミノ酸配列 の比較はＰＩＲタンパク質データベースに基づいて行った。ウサギ配列は８０ア ミノ酸のうち、４５アミノ酸をＳ、ｐｏｍｂｅ ＭＣタンパク質と共有していた 。保存モチーフ内では、ヒトとウサギＹ特異的配列は、８０アミノ酸のうち６４ を共有しく８０％）、さらに８アミノ酸は保存的変更を示していた（全体で９０ ％の類似性）（図１）。モチーフ以外では、ヒトとウサギは５４％の同一性を示 したのみである。この非常に高度な相同性は、ｐＹ５３、３が遺伝子のコーディ ング配列であることを強く示唆している。Figure 7 shows the amino acid sequence of pY53.3 (human) (middle row), rabbit Y-specific Comparison with heterologous homologues (bottom row) and the MC protein of S. pombe (top row) This is what I did. The marked boxes represent the same amino acids; Boxes without a mark indicate conservative amino acid changes. amino acid sequence The comparison was made based on the PIR protein database. Rabbit array is 80 a Among amino acids, 45 amino acids were shared with S, pombe MC protein. . Within the conserved motif, the human and rabbit Y-specific sequences contain 64 out of 80 amino acids. (80% shared), and an additional 8 amino acids showed conservative changes (90% in total). % similarity) (Figure 1). Other than the motif, humans and rabbits show 54% identity. I just did it. This very high degree of homology indicates that pY53,3 is the gene coder. This strongly suggests that it is a matching sequence.
Ｍｅ−８，ｐｏｍｂｅの相同性が失われる地点の５゛および３゛側双方において も、ヒトｐＹ５３．３とウサギアミノ酸配列との間には部分的相同性がある（図 ６）。Me-8, on both the 5゛ and 3゜ sides of the point where the homology of pombe is lost. There is also partial homology between human pY53.3 and rabbit amino acid sequences (Fig. 6).
最初の検索で見いだされたその他のＹ特有のプローブも配列決定した。ｐＮＢお よびｐＹ５３．２のどちらのプローブもオーブンリーディングフレームの可能性 を示さず、またＥＭＢＬまたはＰＩＲタンパク質データベースにある配列とも関 連しなかった。Other Y-specific probes found in the initial search were also sequenced. pNB Both probes, pY53.2 and pY53.2, are likely open reading frames. is not related to sequences in the EMBL or PIR protein databases. It didn't continue.
プローブｐＹ４．１βは、反復配列によく見られるレトロウィルス逆転写酵素と 関連するオーブンリーディングフレームを含む、より大きな１．２ｋｂのＲｓａ ｌ断片の一部である。プローブｐＹ５３．１はいくつかのオープンリーディング フレームを含む５．６ｋｂの領域を包含するが、これらはいずれもＥＭＢＬ配列 データベースまたはＰＩＲタンパク質データベースに存在する配列と関連するタ ンパク質をコードするとは予測されなかった。可能性のあるコーディング配列を 探すために、Ｙ染色体のうち全部で１０．５ｋｂを配列決定した。ｐＹ５３．３ の配列はＥＭＢＬに寄託しである。Probe pY4.1β is a retroviral reverse transcriptase commonly found in repetitive sequences. The larger 1.2kb Rsa containing the associated open reading frame This is part of the l fragment. Probe pY53.1 has several open readings It encompasses a 5.6kb region including the frame, but both of these are EMBL sequences. database or sequences and associated tags present in the PIR protein database. It was not predicted to encode a protein. Possible coding sequences To find out, a total of 10.5 kb of the Y chromosome was sequenced. pY53.3 The sequence has been deposited with EMBL.
組織分布と発現 ポリ（Ａ”）ＲＮＡヒト組織［卵巣、成人精巣、肺（雄）および腎臓（雄）］で 調製したノーザンプロットを、プローブｐＹ５３．３の０．９ｋｂのＨｉｎｃＩ Ｉ断片とハイブリダイズした（図８）。Tissue distribution and expression Poly(A”) RNA in human tissues [ovary, adult testis, lung (male) and kidney (male)] The prepared Northern blot was plotted using 0.9 kb HincI of probe pY53.3. It hybridized with the I fragment (Fig. 8).
各組織からのＲＮＡを調製しくＧｏｏｄｆｅｌｌｏｗ、 Ｐ、Ｊ、 ｅｔ ａｌ 、、 Ａｎｎ、 Ｈｕｍ、 Ｇｅｎｅｔ、、 ５３：１５−２２．１９８９） 、ｐｏ ｌ ＶＡＴｒ ａ ｃ を単離システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）によってポ リ（Ａ”）ｍＲＮＡを選択した。Goodfellow, P. J., et al. to prepare RNA from each tissue. , Ann, Hum, Genet, 53:15-22.1989) , pol VATr ac by an isolation system (Promega). li (A”) mRNA was selected.
ポリ（Ａ＋）ＲＮＡ （８μｇ）を２．２Ｍ ホルムアルデヒドを含む１％ ア ガロースゲルで分離し、Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ （Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移し、ＵＶ 固定した後、ｐＹ５３．３の３２Ｐ標識した０、９ｋｂ Ｈｉｎｃｎ断片とハイ ブリダイズした。ハイブリダイゼーシーｓンは、２ｘＳＳＣ，５ｘＤｅｎｈａｒ ｄｔ溶液、２００μｇ／ｍｌ変性サケ***ＤＮＡ、６％ ポリエチレングリコー ルおよび０．１％ ＳＤＳからなるバッファー中、６５℃で行った。フィルター を１ｘＳＳＣ，０，２％ ＳＤＳ、６５℃で洗浄し、−７０℃で６日間オートラ ジオグラフィーに付した。Poly(A+) RNA (8 μg) was added to 1% acetate containing 2.2M formaldehyde. Separate on a galose gel, transfer to Hybond N (Amersham), and UV After fixation, hybridization with 32P-labeled 0.9kb Hincn fragment of pY53.3 was performed. Breeded. Hybridization season is 2xSSC, 5xDenhar dt solution, 200 μg/ml denatured salmon sperm DNA, 6% polyethylene glycol The test was carried out at 65°C in a buffer consisting of 1% SDS and 0.1% SDS. filter Washed with 1x SSC, 0.2% SDS at 65°C, and autotransferred at -70°C for 6 days. Attached to geography.
フィルターをβアクチンで再検索する条件は上記と同じであるが、フィルターを ０．１ｘＳＳＣ，０，２％ ＳＤＳ、６５℃で洗浄し、８日間オートラジオグラ フィーに付した。このプローブは成人精巣中の約１．１ｋｂの断片を検出した。The conditions for re-searching the filter with β-actin are the same as above, but the filter is Washed in 0.1x SSC, 0.2% SDS at 65°C and autoradiographed for 8 days. Attached to fee. This probe detected an approximately 1.1 kb fragment in adult testis.
卵巣、肺（雄）、腎臓（雄）、また雄および雌のリンパ芽球セルラインでは何の バンドも検出されなかった。次の３つのリンパ芽球セルライン：（４９ＸＹＹＹ Ｙセルライン、Ｏｘ ｅ ｎ） （Ｂｉｓｈｏｐ ｅｔ ａｌ、、前出）；（４ ６ＸＹセルライン、ＰＧＦ） （Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ、 Ｐ、Ｊ、 ｅｔ ａ ｔ、。ovaries, lungs (male), kidneys (male), and male and female lymphoblastoid cell lines. No bands were detected. The following three lymphoblastoid cell lines: (49XYYY Y cell line, Ox e n) (Bishop et al, supra); (4 6XY cell line, PGF) (Goodfellow, P, J, et a T.
Ａｎｎ、 Ｈｕｍ、 Ｇｅｎｅｔ、、 ５３：１５−２２．１９８９） ； （ ４６ＸＸセルライン、ＷＴ ４９ ） （ＤｅＫｒｅｔｓｅｒ ｅｔ ａｌ、、 前出）からもポリ（Ａ”） ＲＮＡを調製し、上記のように検索した。このプロ ーブは成人精巣中に約１．１ｋｂの転写物を検出したが、その他のどの組織にも 検出しなかった。βアクチンでフィルターを再検索したところ、サンプル中にポ リ（ＡつＲＮＡの存在を確認した（図８）。この結果は精巣特異的転写物がｐＹ ５３．３Ｙ特特異的列によってコードされることと一致する。Ann, Hum, Genet, 53:15-22.1989); 46XX cell line, WT 49) (DeKretser et al, Poly(A”) RNA was also prepared from (previously mentioned) and searched as above. detected a transcript of approximately 1.1 kb in adult testis, but not in any other tissue. Not detected. When I searched the filter again for β-actin, I found that there was no point in the sample. We confirmed the presence of RNA (Fig. 8). This result indicates that the testis-specific transcript is pY 53.3Y is consistent with being encoded by the specific sequence.
さらに、成人精巣ポリ（Ａ＋）ＲＮＡからの３’ ＲＡＣＥ （ｃＤＮＡ末端の 急速増幅：Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉ。Furthermore, 3' RACE from adult testis poly(A+) RNA (cDNA end Rapid amplification: Rapid Amplificati.
ｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ） ＰＣＲ（Ｆｒｏｈｍａｎ、 Ｍ、Ａ、、 Ｄ ｕｓｈ。n of cDNA Ends) PCR (Frohman, M, A,, D ush.
Ｍ、に、 ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎ、 Ｇ、Ｒ，、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃ ａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、 ８５：８９９８−９００２．１９８８）は、ポリ アデニル化シグナルとなりうるちのから１５塩基下流にポリＡ域の存在を示して おり、さらにこれがＹ特異的転写物の３゛末端であることを示唆している。M, Ni, and Martin, G, R,, Proc, Natl, Ac ad, Sci, USA, 85:8998-9002.1988) This shows the existence of a polyA region 15 bases downstream from the base that can serve as an adenylation signal. This further suggests that this is the 3' end of the Y-specific transcript.
考察 これらの実験によって、その中にＴＤＦが存在しているに違いない偽書染色体境 界のすぐ近傍にあるＹ特異的配列の３５ｋｂ領域を規定した。Ｙ染色体のこの３ ５ｋｂのサザンプロット分析をさらに行うことによって、広範囲の真獣下綱補乳 動物に見られる保存性Ｙ特異的配列を検出するＹ特有のプローブであるｐＹ５３ ．３を明らかにした。以下の実施例２では、雄の性を決定することで知られるマ ウスＹ染色体の最も小さい部分であるＳｘｒ’ （ＭｃＬａｒｅｎ、 Ａ、 ｅ ｔ ａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ ３１２：５５２−５５５．１９８４）中に等価な マウス配列が存在し、雄の性決定機能を喪失した突然変異Ｙ染色体からこれが欠 失されていることを示す。真獣下綱哺乳動物のＹ染色体の間にｐＹ５３．３関連 配列が保存されていることは、これらの配列が機能的役割を果たしていることを 示唆している。ヒトおよびマウスのＹ染色体上におけるｐＹ５３．３関連配列の 位置は雄の性決定における役割と一致している。Consideration These experiments revealed pseudochromosomal boundaries within which TDF must exist. We defined a 35 kb region of Y-specific sequences in the immediate vicinity of the field. These 3 of the Y chromosome Further Southern blot analysis of 5kb revealed that a wide range of eutherian supplements pY53, a Y-specific probe that detects conserved Y-specific sequences found in animals ．． 3 was revealed. In Example 2 below, we will discuss Sxr', the smallest part of the mouse Y chromosome (McLaren, A, e t al, Nature 312:552-555.1984). The mouse sequence exists and is missing from a mutant Y chromosome that has lost the male sex-determining function. indicates that it has been lost. pY53.3 association between Y chromosomes in eutherian mammals The conservation of sequences indicates that these sequences play a functional role. Suggests. pY53.3 related sequences on human and mouse Y chromosomes The location is consistent with its role in male sex determination.
ｐＹ５３．３のヌクレオチド配列は２つのオープンリーディングフレームを含ん でおり、そのうちの第２のものは翻訳されると、酵母Ｓ、ｐｏｍｂｅの接合型遺 伝子座のＭｃタンパク質と関連する。Ｍｅタンパク質は１８１アミノ酸の長さで あるが、ヒト配列の相同性はこのタンパク質の最後の８０アミノ酸にわたるだけ である。同様に、ウサギおよびマウスのＹ染色体に位置する配列は、マウス常染 色体のｃＤＮＡ配列と同様、この領域にわたってＭｅと相同である（実施例２） 。この驚くべき相同は本明細書中でｍｔ−ボックス（ｍａｔｉｎｇ ｔｙｐｅ ｂｏｘ）と呼ばれる保存されたタンパク質モチーフを表すらしい。The nucleotide sequence of pY53.3 contains two open reading frames. The second of these, when translated, is a mating type gene of the yeast S, pombe. Associated with the Mc protein at the gene locus. The Me protein is 181 amino acids long. However, the human sequence homology only spans the last 80 amino acids of this protein. It is. Similarly, sequences located on the Y chromosome of rabbits and mice are Homologous to Me over this region, as is the cDNA sequence of the chromoplast (Example 2) . This surprising homology is herein referred to as mt-box (mating type It seems to represent a conserved protein motif called ``box''.
以後の議論においては、ｐＹ５３．３と同定されたヒトのＹ染色体に位置する遺 伝子をＳＲＹ （Ｓｅｘ−ｄｅ ｔ ｅ ｒｍｉ ｎ ｉ ｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｙ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅからの遺伝子）と呼び、等価なマウ ス遺伝子をＳｒｙと呼ぶ（以前には、ｍａｔ ｉｎｇ ｔｙｐｅ ｂｏｘ Ｙ （ＭＴＹおよびＭｔｙ）という用語が用いられていた）。In the following discussion, we will focus on the gene located on the human Y chromosome, identified as pY53.3. SRY (Sex-de t e rmi i ng region of the Y-chromosome), and the equivalent mouse This gene is called Sry (previously known as mating type box Y). (The terms MTY and Mty were used).
***酵母の接合型遺伝子座ｍａｔ−１には２つの交互対立遺伝子ＭとＰがある。The fission yeast mating type locus mat-1 has two alternating alleles, M and P.
これらの対立遺伝子は、接合型の切り換えの間に、ドナー遺伝子座ｍａｔ３−Ｍ またはｍａｔ２−Ｐのいずれかからｍａｔ−１遺伝子座へと運ばれる。いずれの 遺伝子座も２つの輸送可能な遺伝子（Ｐｃ、ＰｉおよびＭｃ、Ｍｉ）を含み、こ れら４つの遺伝子はいずれも配列中でお互いに関連していない。These alleles are transferred to the donor locus mat3-M during mating type switching. or mat2-P to the mat-1 locus. either The locus also contains two transportable genes (Pc, Pi and Mc, Mi), which None of these four genes are related to each other in sequence.
４つの遺伝子の正確な機能は分かっていないが、接合にはＭｃおよびＰｃが必要 であり、減数***受容能には４つの遺伝千金てが必要である（ＫｅＨｙ ｅｔ ａｌ、、前出）。出芽酵母との類似性から、ｍａｔ−１遺伝子座にある遺伝子は 転写因子として機能することが提案された。この提案はＰｉ中の分岐したホメオ ボックスドメインの発見によって支持されてきた（Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ、、 前出）。ＭＣもまた転写因子であり、かつｍｔ水ボツクスＤＮＡ結合ドメインで あると推測することは魅力的である。しかしながら、この推測を支持する唯一の 構造的証拠はＭｃとｍｔ水ボツクス両方における高いＡｒｇ／Ｌｙｓ含量である 。同様の高いＡｒｇ／Ｌｙ５含量がＳＲＹ関連遺伝子のｍｔ水ボツクスも見られ る。The exact functions of the four genes are unknown, but Mc and Pc are required for mating and four genetic components are required for meiotic competence (KeHy et al. al., supra). Due to its similarity to Saccharomyces cerevisiae, the gene located at the mat-1 locus is It was proposed to function as a transcription factor. This proposal is based on the branched homeostasis in Pi. This has been supported by the discovery of box domains (Kelly et al., (cited above). MC is also a transcription factor and has an mt water box DNA binding domain. It is tempting to speculate that there is. However, the only Structural evidence is high Arg/Lys content in both Mc and mt water boxes. . Similar high Arg/Ly5 content was also observed in the mt water box of SRY-related genes. Ru.
Ｍｃが接合および減数***の両方に二重の機能をもっており、またＳＲＹの転写 物が成人精巣に見られるのに、マウスではＳｒｙが雄生殖隆線と成体精巣で発現 するということは、興味をそそることであるが、おそらくは一致することなので あろう。Mc has dual functions in both conjugation and meiosis, and also plays a role in the transcription of SRY. In mice, Sry is expressed in the male genital ridge and adult testis. To do so is intriguing, but perhaps congruent. Probably.
３° ＲＡＣＥ ＰＣＲからのｃＤＮＡ中に３′停止コドンとポリＡ域が存在す ることは、ｐＹ５３．３中に存在するオープンリーディングフレームがＳＲＹの 最後のエキソンに対応することを示唆している。ＳＲＹのｍｔ水ボツクス列の５ ′末端には、スプライス受容部位となりうるちのが存在するが、ウサギとヒトゲ ノム配列の間の相同がこの部位を通り過ぎるので、これはイントロン／エキラン 境界を表すものではないかも知れない。この疑問はＳＲＹ遺伝子の転写物を単離 して配列決定することによって解決されるであろう。3° RACE There is a 3' stop codon and polyA region in the cDNA from PCR. This means that the open reading frame present in pY53.3 is similar to that of SRY. It is suggested that it corresponds to the last exon. SRY mt water box row 5 There is a splice at the ′ end that can serve as a splice acceptor site, but in rabbits and humans This is an intron/exlan, as the homology between the nom sequences passes through this site. It may not represent a boundary. This question was answered by isolating the transcript of the SRY gene. This will be resolved by sequencing.
偽書染色体境界のすぐ近傍にある３５ｋｂのＹ特異的配列は、反復配列に富んで おり、これが分析を妨げてきた。ｐＹ５３．３に存在するオーブンリーディング フレームが検出することのできた唯一の明確に保存された配列である。The 35 kb Y-specific sequence immediately adjacent to the pseudochromosomal boundary is rich in repetitive sequences. This has hindered analysis. Oven reading present on pY53.3 Frame is the only clearly conserved sequence that could be detected.
ヒトにおけるｐＹ５３．３に対応するマウスＹ染色体からの配列のクローニング について記載する。Cloning of sequences from the mouse Y chromosome that correspond to pY53.3 in humans Describe about.
マウスの遺伝子はヒトの遺伝子に見られるものと相同のオーブン・リーディング ・フレームを含む。これらの遺伝子の予測されたタンパク質産物は、ヒト上流結 合因子（ｈ Ｕ Ｂ Ｆ ） ［Ｊａｎｚｅｎ、前掲コおよび***酵母シゾサツ カロミセス・ボンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ） の接合型遺伝子の１種の産物であるＭｃタンパク質［Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ、 、前掲］を含めて、数種の既知のまたは推定上のＤＮＡ結合タンパク質と相同の 領域により特徴づけられるドメインを含む。マウスにおいて８． ５ｄ、ｐ、ｃ 、に発現される、Ｙ染色体に連鎖していない４つの別の遺伝子がこのタンパク質 ドメイン内でのそれらの密接な相同により見いだされた。遺伝子地図は、マウス Ｙ染色体の性決定領域内にＹ特異的配列を位置づける。さらに、この遺伝子の発 現の発生学的時期および組織はＳｒｙについて予測されたものと一致する。Mouse genes are oven-reading homologous to those found in human genes -Includes frames. The predicted protein products of these genes are Synthesis factor (h U B F) [Janzen, supra and fission yeast Schizosatu Schizosaccharomyces pombe The Mc protein, which is a product of one type of mating type gene [Kelly et al. , supra], homologous to several known or putative DNA-binding proteins, including Contains domains characterized by regions. 8 in mice. 5d, p, c Four other genes not linked to the Y chromosome, expressed in Found due to their close homology within the domain. genetic map mouse Locates the Y-specific sequence within the sex-determining region of the Y chromosome. Furthermore, the expression of this gene The current embryological timing and organization match that predicted for Sry.
サザン分析 性転換変異ＳｘｒはマウスでのＳｒｙの位置を定めるのに役立った。Ｓｘｒは多 分長腕の遠位端に位置する偽書染色体領域へのＹ染色体の小さい短腕の転座によ り生じたものである［Ｃａｔｔａｎａｃｈ、 Ｂ、Ｍ、、 Ｐｏ１ｌａｒｄ、 Ｃ，Ｅ、 ＆ Ｈａｗｋｅｓ、 Ｓ、Ｇ、、 Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、 １ ０．３１８−３３７ （１９７１）、 Ｅｖａｎｓ、 Ｅ、Ｐ、、 Ｂｕｒｔｅ ｎｓｈａｗ、 Ｍ、Ｄ、 ＆ Ｃａｔｔａｎａｃｈ。southern analysis The sex-reversing mutation Sxr served to localize Sry in mice. Sxr is many Translocation of the small short arm of the Y chromosome to a pseudochromosomal region located at the distal end of the long arm [Cattanach, B. M., Pollard, C, E, & Hawkes, S, G, Cytogenetics, 1 0.318-337 (1971), Evans, E.P., Burte nshaw, M. D. & Cattanach.
Ｂ、Ｍ、、 Ｎａｔｕｒｅ、 ３００．４４３−４４５ （１９８２）、 Ｍｃ Ｌａｒｅｎ、 Ａ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｐｒ。B, M., Nature, 300.443-445 (1982), Mc Laren, A. et al., Pr.
ｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ、Ｓ、Ａ、、 ８５．６４４２− ６４４５ （１９８８）、 Ｒｏｂｅｒｔｓ。c, Natl, Acad, Sci, U, S, A, 85.6442- 6445 (1988), Roberts.
Ｃ，ｅｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ、Ｓ 、Ａ、、 ８５．６６４６−６６４９（１９８８）］。雄の減数***中の偽書染 色体領域での無条件的乗りかえにより、このＳｘｒ断片はＸ染色体に転移され、 その結果得られたＸＸ５ｘｒ子孫は雄である。Ｓｒｙのほかに、２つの他の遺伝 子機能がＳｘｒに、結果として短腕に認められる：すなわち、ｓｐｙと呼ばれる ***形成に関与する遺伝子［５ｕｔｃｌｉｆｆｅ、 Ｍ、Ｊ。C, et al, , Proc, Natl, Acad, Sci, U, S , A., 85.6646-6649 (1988)]. Pseudographia during male meiosis Due to unconditional transfer in the chromoplast region, this Sxr fragment is transferred to the X chromosome, The resulting XX5xr progeny are male. Besides Sry, two other genes A child function is found in Sxr and consequently in the short arm: i.e. called spy. Genes involved in spermatogenesis [5utcliffe, M, J.
＆ Ｂｕｒｇｏｙｎｅ、 Ｐ、Ｓ、、 Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、 １０７．３ ７３−３８０ （１９８９）］ 、およびＨ−Ｙ副組織適合性抗原Ｈｙａの発現 を制御する遺伝子［ＳｉｍｐＳｏｎ、 Ｅ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｉｍｍｕｎｏｇ ｅｎｅｔｉｃｓ、 １３．３５５−３５８ （１９８１）］ ＯＳ Ｘｒ′はＳ ｒｙを保持するＳｘｒの変異型である（ＸＸＳｘｒ’動物は雄である）が、Ｈｙ ａおよびＳｐｙを欠失している。従って、Ｓｘｒ’はＳｒｙを含むことが知られ たマウスＹ染色体の最小部分である。& Burgoyne, P.S., Development, 107.3 73-380 (1989)], and expression of H-Y minor histocompatibility antigen Hya. Genes that control [SimpSon, E., et al., Immunog enetics, 13.355-358 (1981)] OS Xr' is S A mutant form of Sxr that retains ry (XXSxr' animals are male), but Hy a and Spy are deleted. Therefore, Sxr' is known to contain Sry. This is the smallest part of the mouse Y chromosome.
マウスＹ染色体の性決定領域に対する保存配列のマツピングＸＸ５ｘｒ’雄（雄 性を付与するＹ染色体の最小部分を保持するマウス）、ＸＹ＊雌（Ｓｒｙに変異 を有するマウス）、および正ｔｘＹ雄およびＸＸＸママウス由来するＥｃｏＲＩ 消化ゲノムＤＮＡのサザンプロットは、次のように３つの異なるプローブに連続 的にハイブリダイズした； ＸＹ＊雌マウマウスここで使用したＸＸおよびＸＹサンプルと同じ系統である、 系統１２９のＹ染色体を保有する。Ｓｘｒ’はＣ５７Ｂ６Ｊバツクグラウンドに 維持された。マウスクローン４゜２．２はＥｃｏＲｒで消化した系統１２９の雄 牌臓ＤＮＡから構築されたサイズ選別ライブラリーより単離された。３．０−４ ゜０ｋｂ（７）サイズ範囲のＤＮＡをＧｅｎｅｃｌｅａｎ （Ｂｆｏ １０１． Ｉｎｃ）上でアガロースゲルから回収し、ラムダＺ ａ ｐＩ Ｉ （Ｓｔｒ ａｔａｇｅｎｅ）に連結し、Ｇｉｇａｐａｃｋ ｇｏｌｄ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｅｘｔｒａｃｔ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて製造者のプロトコールに よりパッケージングした。プラーク形成単位０．５ ｘ １０’は、増幅せずに 、プローブとしてｐＹ５３．３由来の０．９−ｋｂ Ｈｉｎｃｎ断片を使って、 以前に開示された手法（Ｍａｎｉａｔｉｓ）により直接スクリーニングした。ポ ジティブにハイブリダイズするラムダクローン４．２．２をプラーク精製し、挿 入物は製造者の記載の通りにラムダＺａｐｌＩベクターからｉｎ ｖｉｖｏ切除 することによりｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに回収した。３８０ｂｐのＢｇｌＩＩ− Ｐｓｔｌ断片をｐ４．２．２から単離し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクロー ニングした（ｐ４２２．０４）、この断片はｐＹ５３．３に対するあらゆる相同 を含み、反復性でなかった。Mapping of conserved sequences to the sex-determining region of the mouse Y chromosome XX5xr' male (male Mice that retain the smallest portion of the Y chromosome that confers sex), XY* females (mutated to Sry) ), and EcoRI from positive txY male and XXX mam mice. Southern blots of digested genomic DNA are sequentially plotted on three different probes as follows: hybridized; XY* female mouse is the same strain as the XX and XY samples used here, It carries the Y chromosome of lineage 129. Sxr' is in C57B6J background maintained. Mouse clone 4°2.2 is a male of line 129 digested with EcoRr. It was isolated from a size-selected library constructed from spleen DNA. 3.0-4 Geneclean (Bfo 101. Lambda Z a pI I (Str Gigapack gold packaging extract (Stratagene) according to the manufacturer's protocol. Better packaging. Plaque-forming units 0.5 x 10' without amplification , using a 0.9-kb Hincn fragment derived from pY53.3 as a probe. Direct screening was performed by a previously disclosed procedure (Maniatis). Po Lambda clone 4.2.2 that hybridizes to the The vector was excised in vivo from the lambda ZaplI vector as described by the manufacturer. It was recovered into pBluescript by doing this. 380bp BglII- The Pstl fragment was isolated from p4.2.2 and subcloned into pBluescript. (p422.04), this fragment contains any homology to pY53.3. included and was not repeatable.
サザンプロットのために、制限ＤＮＡを０．７％アガロースで電気泳動にかけ、 ０．５Ｍ水酸化ナトリウム、１．５Ｍ塩化ナトリウム中でＨｙｂｏｎｄ Ｎ （ Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移行させた。プローブをＳＩＰで標識し、３ｘＳＳＣバツ フアー、０．１％ビロリン酸ナトリウム、５ ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０． １％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、９％デキストラン硫酸および５０μｇ ／ｍｌ変性ニシン精巣ＤＮＡ中でフィルターに加え、６５℃で１６時間ハイブリ ダイズさせた。このフィルターをマウス特異的プローブについては０．１ｘＳＳ Ｃ，０，１％ＳＤＳ中で、ヒトプローブについては２ｘＳＳＣＳＯ，１％ＳＤＳ 中で６５℃で洗い、オートラジオグラフィーを１−３日間行い、その後実験の間 ０．１％ＳＤ３ １００℃中でストリッピングした。結果は図１１に示してあり 、パネルａはＺｆｙ−１のジンクフィンガードメイン［Ｋｏｏｐｍａｎ ｅｔ ａｌｌ、前掲］を含む１．０−ｋｂ ＨｉｎｄＩ［ｒゲノム断片による検索の結 果を示し、ＸＹ雄ＤＮＡ中の４つのＺｆｙ関連遺伝子のそれぞれに対応するバン ドを示す。これらの遺伝子は全てＸＹ雌ヒトラックも見られる。Ｚｆｙ−１（Ｚ ｆｙ−２ではない）はＸＸ５Ｘｒ′ トラックにおいてＳｘｒ’に認められが、 正常ＸＸ雌にはこの遺伝子ファミリーのＸ染色体性および常染色体性メンバー（ ＺｆａおよびＺｆｘ）が存在するだけである。For Southern blots, the restricted DNA was electrophoresed in 0.7% agarose. Hybond N (in 0.5M sodium hydroxide, 1.5M sodium chloride) Amersham). Label the probe with SIP and 3x SSC Fur, 0.1% sodium birophosphate, 5 x Denhardt solution, 0. 1% sodium dodecyl sulfate (SDS), 9% dextran sulfate and 50 μg /ml denatured herring testis DNA and hybridized for 16 hours at 65°C. I made soybeans. This filter is 0.1x SS for mouse-specific probes. C, 0.2xSSCSO, 1% SDS for the human probe. Autoradiography was carried out for 1-3 days at 65°C, then during the experiment. Stripping was carried out in 0.1% SD3 at 100°C. The results are shown in Figure 11. , panel a shows the zinc finger domain of Zfy-1 [Koopman et al. The results of a search using a 1.0-kb HindI[r genome fragment containing all, supra] The results show the bands corresponding to each of the four Zfy-related genes in the XY male DNA. Indicates the mode. All of these genes are also found in XY female tracks. Zfy-1 (Z fy-2) is recognized as Sxr' in the XX5Xr' track, but Normal XX females have X-chromosomal and autosomal members of this gene family ( Zfa and Zfx) are present.
パネルｂにおいて、プローブはヒト性決定領域ｐＹ５３．３〔実施例１参照〕に 特異な配列であり、ＸＹ雄およびＸＸ５ｘｒ′雄マウス由来のＤＮＡに存在する が、ＸＸ雌およびＸＹ＊雌マウマウス由来ＮＡには存在しない３．５−ｋｂバン ドに強くハイブリダイズする。弱くハイブリダイズする追加のバンドが全てのト ラックに存在し、かくしてＹ一連鎖ではあり得ない。In panel b, the probe is directed to the human sex-determining region pY53.3 [see Example 1]. A unique sequence, present in DNA from XY male and XX5xr' male mice However, the 3.5-kb band is absent in NA from XX female and XY* female mice. Hybridizes strongly with An additional band that hybridizes weakly exists in the rack and thus cannot be a Y-one chain.
パネルＣにおいて、ｐＹ５３．３に相同な配列を含むマウスＹ染色体誘導クロー ンｐ４２２．０２を使用し、これは高緊縮条件下で３．５−ｋｂのＹ一連鎖バン ドにのみハイブリダイズした。In panel C, a mouse Y chromosome-derived clone containing sequences homologous to pY53.3. p422.02, which is a 3.5-kb Y-single-linked protein under high stringency conditions. hybridized only to
数字はＤＮＡのサイズマーカー（ｋ ｂ＞を表す。Numbers represent DNA size markers (k b >).
ＸＹ＊雄およびＸＸＸママウス由来ＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡのサザンプロットでプ ローブとしてｐＹ５３．３またはそれから誘導された０、９ｋｂ ＨｉｎｃＩＩ 断片を使用した場合、両性に存在する数本の弱いバンドに加えて、強くハイブリ ダイズする３、５ｋｂ雄−特異的バンドが検出された。同じ３．５ｋｂバンドが ＸＸ５ｘｒ’雄由来のＤＮＡにも存在していた（図１１ｂ）。Ｙ染色体のＳｘｒ ’領域にある配列はほとんど知られていない。雄生殖細胞発生においてまだ確定 されていない役割を有するｚｆｙ−１［Ｎａｇａｍｉｎｅ、 Ｃ，Ｍ、 ｅｔ ａｌ、、 ５ｃｉｅｎｃｅ、 ２４３．８０−８３ （１９８９）、 Ｍａｒｄ ｏｎ、 Ｇ、 ｅｔ ａｌ、、 ５ｃｉｅｎｃｅ、 ２４３．７８−８０ （１ ９８９）］ （図１１ａ参照）を別にして、Ｂ ｋｍ ［Ｓｉｎｇｈ、 Ｌ、 Ｐｈ１ｌｌｉｐｓ、 Ｃ，＆ Ｊｏｎｅｓ Ｋ。Southern blot analysis of EcoRI-digested DNA from XY* male and XXX mama mice. pY53.3 or 0.9kb HincII derived from it as a lobe When using fragments, in addition to a few weak bands present in both sexes, strongly hybridized A 3.5 kb male-specific band in soybean was detected. The same 3.5kb band It was also present in DNA from XX5xr' males (Fig. 11b). Sxr of Y chromosome ’ sequences are largely unknown. Not yet established in male germ cell development zfy-1 [Nagamine, C, M, et. al., 5science, 243.80-83 (1989), Mard on, G, et al, 5science, 243.78-80 (1 989)] (see Figure 11a), B km [Singh, L, Ph1llips, C, & Jones K.
Ｗ、、 Ｃｅ１ｌ、 ３６．１１１−１２０ （１９８４）］やＳ ｘ ｌ ［ Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ、、前掲］のような反復配列のみがこの領域に認め られる。従って、プローブｐＹ５３．３はマウスとヒトの両方において性を決定 すると判明したＹ染色体の最小断片中の新たな単一コピー配列を規定している。W, Ce1l, 36.111-120 (1984)] and Sxl [ Only repetitive sequences such as Roberts et al., supra] are found in this region. It will be done. Therefore, probe pY53.3 determines sex in both mice and humans. The results define a new single-copy sequence in the smallest fragment of the Y chromosome.
変異型Ｙ染色体を保有する性転換雌マウスの系列から別のデータが得られた。遺 伝性変異がこのようなＸＹ雌ママウス起こる。Additional data were obtained from a line of transsexual female mice carrying a mutant Y chromosome. Legacy An inherited mutation occurs in such XY female mice.
この変異はこれらの雌の子孫の間でもっばらＹ染色体と共に分離する。さらに、 雌減数***の間のＸおよびＹ染色体の頻繁な非分離のために、ＸＹ雌はしばしば ＸＸＹ娘とＸＹＹＹ子をもたらす。This mutation segregates mostly with the Y chromosome among the offspring of these females. moreover, Due to the frequent nondisjunction of the X and Y chromosomes during female meiosis, XY females often Brings XXY daughter and XYYY child.
後者は変異が正常Ｙ染色体により補足され得ることを示す。抜型およびサザンプ ロット分析並びにＹ特異的ＤＮＡプローブによる更なる特性決定は、この変異を 有するＹ染色体の明白な欠失または再配列がなかったことを示唆した。また、こ の変異はＳｘｒ’により完全に補足され得たので、精巣決定の機能を別にしてＹ 特異的遺伝子機能の欠損もなかったようだ。変異の推定位置および表現型のため に、それはＳｒｙ自体に起こったと断定された。かくして、この変異はＳ Ｉ− ｙ ＠ ｌと呼ばれ、それを保有するＹ染色体を略してＹ＊と記すことにする。The latter indicates that the mutation can be complemented by the normal Y chromosome. Cutting die and south amp Lot analysis and further characterization with a Y-specific DNA probe revealed that this mutation It was suggested that there was no obvious deletion or rearrangement of the Y chromosome. Also, this The mutation in Y could be completely complemented by Sxr', so apart from the function of testis determination, There also appeared to be no defects in specific gene function. For the putative location and phenotype of mutations It was determined that it had happened to Sry itself. Thus, this mutation is SI- It is called y@l, and the Y chromosome that carries it will be abbreviated as Y*.
従って、Ｓｒｙの候補配列には５ｒｙ１変異のための分子的根拠が存在しなけれ ばならないようだ。ＺｆＶ−１とその相同体Ｚｆｙ−２は、両遺伝子が正常な構 造を有し、かつ変異体Ｙ＊から正常な発現パターンを示すので、この予測を満た すことができなかった。これらの遺伝子はＸＹ雌ママウス存在する（図１１ａ） 。Therefore, there must be a molecular basis for the 5ry1 mutation in the Sry candidate sequence. It seems like it won't happen. ZfV-1 and its homologue Zfy-2 have normal structures in which both genes are present. This prediction is fulfilled because it has a structure and shows a normal expression pattern from mutant Y*. I couldn't do it. These genes are present in XY female mice (Figure 11a) .
同じフィルターをｐＹ５３．３で検索する場合は、３．５ｋｂのＥｃｏＲＩ雄− 特異的バンドが存在しない（図１１ｂ）。この領域が条里性である場合に期待さ れる追加のバンドが全く存在しないので、この結果はハイブリダイズする配列が ＸＹ＊雌において欠失されていることを示す。この欠失は実際たった６ｋｂの長 さであり、全部のＳｒｙオーブン・リーディング・フレームを欠いている。プロ ーブｐＹ５３．３は変異型Ｙ＊染色体と正常Ｙ染色体を識別し得る最初のプロー ブであり、少なくともＳｒｙに対する最も近接したマーカーであると見なされね ばならない。これは、ｐＹ５３．３により検出された配列が精巣決定遺伝子の部 分であるということと一致する。If you search the same filter with pY53.3, use the 3.5kb EcoRI male- There are no specific bands (Fig. 11b). This is expected if this area is This result indicates that the hybridizing sequence is Indicates deletion in XY* females. This deletion is actually only 6kb long. It is small and lacks the entire Sry oven reading frame. Professional The probe pY53.3 is the first probe that can distinguish between mutant Y* chromosomes and normal Y chromosomes. is considered to be the closest marker to Sry. Must be. This indicates that the sequence detected by pY53.3 is part of the testis-determining gene. This is consistent with the fact that it is a minute.
ｐＹ５３．３のマウス相同体のクローニングいくつかのマウスゲノムファージお よびコスミドライブラリーをｐＹ５３．３でスクリーニングした。数個のクロー ンが単離されたが、それらはどれも３．５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を含まないか、 またはＹ染色体に認められず、これらはおそらく雄および雌ＤＮＡでのサザンプ ロットにおいて見られた弱いバンドの一部に相当するだろう（以下参照）。Ｙ＊ 配列をクローニングすることの困難性は、ゲノムライブラリー中にＹ染色体ＤＮ Ａが十分に現れないこと、または対象のクローンが特に不安定であることによる と思われた。従って、上記の３．５ｋｂのＹ特異的ＥｃｏＲＩ断片を単離するた めに、強制クローニング戦略においてサイズ選別ＤＮＡを使用した。予期された サイズのクローンがいくつか得られ、これらはｐＹ５３．３に強くハイブリダイ ズした。これらのクローンの１つ、ｐ４，２．２をさらに分析し、これはｐＹ５ ３．３との相同を保持する３ ８ ｏ−ｂｐのＢｇｌＩＩ−ＰｓｔＩ制限断片（ クローンｐ４２２．０４）を含むことが分かった。この３８０−ｂｐ断片をゲノ ムサザンプロットにおいて高緊縮条件でプローブとして使用したとき、それは３ ．５ｋｂのＹ特異的ＥｃｏＲＩバンドとのみバイブ＋）ダイズした（図１１ｃ） 。従って、クローンｐ４．２．２はｐＹ５３．３のマウス相同体を含んでいる。Cloning of the mouse homolog of pY53.3 Several mouse genomic phages and and cosmid library was screened with pY53.3. a few claws were isolated, but none of them contained the 3.5 kb EcoRI fragment or or not found on the Y chromosome, these are probably southern samples in male and female DNA. This may correspond to some of the weak bands seen in the lot (see below). Y* Difficulty in cloning sequences is due to the lack of Y-chromosome DNA in genomic libraries. A does not appear in sufficient numbers or the clone in question is particularly unstable. So I thought. Therefore, in order to isolate the 3.5 kb Y-specific EcoRI fragment mentioned above, For this purpose, size-selected DNA was used in a forced cloning strategy. expected Several clones of this size were obtained, and these hybridized strongly to pY53.3. I lost it. One of these clones, p4,2.2, was further analyzed and was found to be pY5 A 38 o-bp BglII-PstI restriction fragment that retains homology with 3.3 ( It was found to contain clone p422.04). This 380-bp fragment was When used as a probe under high stringency conditions in a Musasan plot, it ．． Vib+) soybean only with a 5 kb Y-specific EcoRI band (Fig. 11c) . Therefore, clone p4.2.2 contains the mouse homolog of pY53.3.
ｐＹ５３．３と相同である、クローンｐ４． ２． ２の領域の配列を決定した 。図１４は４７１−１）ｐにわたるマウスおよびヒトＹ一連鎖ヌクレオチド配列 の比較を示し、相同度は６２％である。Clone p4., homologous to pY53.3. 2. The sequence of the second region was determined. . Figure 14 shows mouse and human Y single-linked nucleotide sequences spanning 471-1) p. The degree of homology is 62%.
図１４はマウスおよびヒトＹ一連鎖ヌクレオチド配列の比較を示す。ｐ４． ２ ． ２ （マウスＹ）およびｐＹ５３．３ （ヒトＹ）の配列はそれぞれ上と下 に示しである。ヌクレオチド相同は垂直線で表される。マウス配列における単一 のオープン・リーディング・フレームはヌクレオチド１４−１６ （＊＊＊）の 停止コドンにより５′末端で規定される。このオープン・リーディング・フレー ム内には、２つの可能なスプライス受容部位（＃ ＃ ＃）と１ｎ−ｆ ｒａｍ ｅ翻訳開始コドン（Ｍｅｔ）が存在する。ＭｃをコードするＳ、 ｐｏｍｂｅ遺 伝子とアミノ酸相同の領域はボックスで囲っである。Figure 14 shows a comparison of mouse and human Y single-linked nucleotide sequences. p4. 2 ．． The sequences of 2 (mouse Y) and pY53.3 (human Y) are shown above and below, respectively. This is shown below. Nucleotide homology is represented by vertical lines. single in mouse array The open reading frame of nucleotides 14-16 (***) Defined at the 5' end by a stop codon. This open reading phrase There are two possible splice acceptor sites (###) and 1n-f ram within the RAM. e translation initiation codon (Met) is present. S, which codes for Mc, remains of pombe Regions of amino acid homology with the gene are boxed.
ヌクレオチド位置は５０のブロックごとに番号が付けである。Nucleotide positions are numbered in blocks of 50.
ｐ４．２．２の６つの可能な翻訳フレームのうち、ただ１つがこの領域に長いオ ープン・リーディング・フレームを含んでいた。Of the six possible translation frames in p4.2.2, only one has a long text in this region. It contained an open reading frame.
これはｐＹ５３．３における２つのオープン・リーディング・フレームのうちの １つに対応し、かつウサギＤＮＡ由来の対応するＹ一連鎖配列におけるオーブン ・リーディング・フレームに一致する〔上記実施例Ｉ〕。ｐ４． ２． ２とｐ Ｙ５３．３のオーブン・リーディング・フレーム領域間の高度の進化的保存は、 それが機能遺伝子の部分であることを強く示すものである。この遺伝子をＳｒｙ と呼ぶことにする。This is one of the two open reading frames in pY53.3. 1 and the corresponding Y single-linked sequence derived from rabbit DNA. - Matches the reading frame [Example I above]. p4. 2. 2 and p The high degree of evolutionary conservation between the open reading frame regions of Y53.3 This strongly indicates that it is part of a functional gene. This gene is Sry I will call it.
１）４． ２． ２におけるオーブン・リーディング・フレームはその５′末端 近傍に２つの可能なイントロンスプライス受容部位と、翻訳開始のためのｉｎ− ｆｒａｍｅＡ Ｔ Ｇコドンを含んでいる［Ｋｏｚａｋ、 Ｍ。1)4. 2. The oven leading frame in 2 is at its 5' end Two possible intron splice acceptor sites nearby and an intron splice acceptor site for translation initiation. frame A T G codon [Kozak, M.
、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、 １５．８１２５−８１４８ （ １９８７）］ＯＡＴＧ：Ｉトンの５′側のマウスおよびヒト配列間の乏しい相同 は、機能的制約がこの位置で失われることと一致するが、対応するＡＴＧがヒト 配列には見られない。同様に、ｐ４． ２． ２配列中に存在しうるスプライス 受容部位と同じ部位がｐＹ５３．３には存在しない（図１４）。この相同領域が ヒト遺伝子の最後のエキソンであることの証拠が存在し〔上記実施例１〕、これ は多分Ｓｒｙにおける事例でもあるだろう。マウスおよびヒト配列の徐々の分岐 は相同領域の３′末端に向けて見られ、当該遺伝子のこの部分の機能的重要性の 低下を示唆している。この末端では可能なスプライス供与モチーフが検出されず 、またオーブン・リーディング・フレームの３′限界も規定されなかった。, Nucleic Ac1ds Res, 15.8125-8148 ( 1987)] OATG: Poor homology between mouse and human sequences 5' of Iton. is consistent with a functional constraint being lost at this position, although the corresponding ATG is It is not seen in the array. Similarly, p4. 2. Splices that can exist in two sequences The same site as the acceptor site does not exist in pY53.3 (Figure 14). This homologous region There is evidence that this is the last exon of the human gene [Example 1 above], and this This is probably also the case in Sry. Gradual divergence of mouse and human sequences is found towards the 3' end of the homologous region, indicating the functional importance of this part of the gene. This suggests a decline. No possible splice donor motifs were detected at this end. , nor was the 3' limit of the oven leading frame specified.
ｐ４． ２． ２におけるオーブン・リーディング・フレームの最も顕著な特徴 は、ｐＹ５３．３との相同度が８０％に上る２３７−ｂｐ配列である（ＦＩ！Ｊ １４）。この配列の概念上の翻訳はＭｅタンパク質のＣ末端８０アミノ酸残基と の類似性を示す［Ｋｅｌｌｙ ｅｔａｌ、、前掲］。この相同は酵母と哺乳類と の進化的分岐を示して注目に値し、これらの２３７ｂｐが重要な機能ドメインを 規定することを示している。p4. 2. The most notable features of the oven reading frame in 2 is a 237-bp sequence with a homology of 80% with pY53.3 (FI!J 14). A conceptual translation of this sequence is the C-terminal 80 amino acid residues of the Me protein. [Kelly et al., supra]. This homology exists between yeast and mammals. It is noteworthy that these 237 bp represent important functional domains. It indicates that it is stipulated.
ＸＹ＊雌における欠失中断点 ｐＹ５３．３およびマウス相同体ｐ４． ２． ２にハイブリダイズするＤＮＡ 断片がＸＹ＊雌に存在しないので、この欠失の境界を探すためにマウス由来のよ り大きいゲノム領域をクローニングすることが必要であった。系統１２９雄マウ スの非増幅ゲノムＤＮＡを５ａｕ３ａで部分消化し、製造者のプロトコールにょ リラムダＦＩＸ ＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に連結して、ライブラ リーを構築した。マウスＹ相同体のクローニングの際の問題を克服するために末 端−末端反復を安定化する細菌株ＤＬ８５２を使って、このライブラリーをプレ ートし、記載の通りに（ＭａｎｉａｔｊＳ）ｐ４２２．０４でスクリーニングし た。１０’ クローンから、ｐ４２２．０４との非常に強い相同を示す１つのク ローンが得られた。制限マツピングにより、このクローンＬ７．４．１は４゜２ ．２およびマウスＹ染色体遺伝子座に対応する３、５−ｋｂのＥｃｏＲＩバンド を含むことが確認された。図１２は、Ｌ７，４゜１に含まれるそれぞれのＥｃｏ ＲＩ断片から作られ、がっＸＹ雄、ＸＹ＊雌およびＸＸＸママウス由来ＤＮＡの ゲノムプロットをスクリーニングするために使用されるプローブによる、ファー ジＬ７、 ４． １からの挿入物のＥｃｏＲＩ （Ｅ）および５ａｃｌ（Ｓ）制 限地図を示す。図１２において、Ｌ７． ４． １ （実線）はサザン分析によ り検出されたがＬ７．４．１には存在しないゲノムＤＮＡ （破線）に隣接する １４ｋｂにわたっている。オーブンボックスはプローブとして使用されたＥｃｏ ＲＩ断片（Ａ、Ｂ。Deletion breakpoint in XY* females pY53.3 and the mouse homolog p4. 2. DNA that hybridizes to 2 Since the fragment is not present in XY* females, we used mouse-derived It was necessary to clone a much larger genomic region. Line 129 male mouse The unamplified genomic DNA of the plant was partially digested with 5au3a and Connect to Relambda FIX II vector (Stratagene) to create a library. built lee. In order to overcome the problems in cloning the mouse Y homologue, This library was plated using the bacterial strain DL852, which stabilizes end-to-end repeats. and screened with p422.04 as described (ManiatjS). Ta. From the 10’ clone, one clone showed very strong homology with p422.04. A loan was obtained. Due to limit mapping, this clone L7.4.1 is 4°2 ．． 2 and a 3,5-kb EcoRI band corresponding to the mouse Y chromosome locus. It was confirmed that it contains Figure 12 shows each Eco included in L7,4゜1. Generated from RI fragments, DNA from GAGXY male, XY* female, and XXX mouse mice Due to the probes used to screen the genome plot, Ji L7, 4. EcoRI (E) and 5acl (S) system of inserts from 1 A limited map is shown. In FIG. 12, L7. 4. 1 (solid line) is based on Southern analysis. adjacent to genomic DNA (dashed line) detected in L7.4.1 but not present in L7.4.1 It spans 14kb. The oven box is an Eco used as a probe. RI fragment (A, B.
Ｃ，Ｄｉ、 Ｄ２． Ｅ）の位置を示し、小さな黒のボックスは保存領域である 。点刻ボックスはＸＹ＊雌において検出可能な領域の限界を示し、そして大きい 斜線ボックスはＸＹ雄における共直線性ゲノム領域を示す。縮尺の線はｌｋｂを 表す。C, Di, D2. Indicates the location of E), the small black box is the storage area . The stippled box indicates the limit of the detectable area in the XY* female and is larger Hatched boxes indicate collinear genomic regions in XY males. The scale line is lkb represent.
図１３は、図１１に関して記載したプロトコールを用いてＸＹ雄、ＸＹ＊雌およ びＸＸ雌マウス由莱のＥｃｏＲＩ−または５ａｃＩ−消化ゲノムＤＮＡのサザン プロットを検索した結果を示す。Figure 13 shows that XY males, XY* females and Southern analysis of EcoRI- or 5acI-digested genomic DNA from Yuri and XX female mice. Shows the results of searching for plots.
プローブＡおよびプローブＤ１とＤ２の組合わせはＸＹ雄およびＸＹ＊雌におい て同じ大きさのＹ特異的ＥｃｏＲＩバンドを検出する。しかし、Ｓａｃ Ｉ消化 物はプローブＣにより検出されたバンドのサイズの差を明らかにし、ＸＹ＊雌に おけるこのゲノム領域内の中断点を示す。Probe A and the combination of probes D1 and D2 are XY male and XY*female. Detect a Y-specific EcoRI band of the same size. However, Sac I digestion The object revealed a difference in the size of the bands detected by probe C, indicating that The breakpoints within this genomic region are shown at .
プローブＢは、５ａｃＩ−消化ＤＮＡのサザンプロットを検索するために使用し たとき高度に反復性であることが分かったが、それでもプローブＣと同じ結果を 与えた。関係のあるバンドは図１３に矢印で示してあり、またサイズはｋｂで表 しである。Probe B was used to search Southern blots of 5acI-digested DNA. was found to be highly repeatable, but still produced the same results as probe C. Gave. Related bands are indicated by arrows in Figure 13, and sizes are expressed in kb. It is.
６つのプローブのうち３つ（ＤＩ、Ｄ２およびＡ）はＸＹ＊雌由来のＤＮＡにお いてＹ特異的バンドを検出できなかった。プローブＡは予期された１、５−ｋｂ バンドのほかに正常ＸＹ雄において３．５−ｋｂバンドを検出する。これはプロ ーブＡとＥとに共有された交差ハイブリダイズする配列のためであるらしい。プ ローブＥもＸＹ＊雌由来のＤＮＡにおいて３．５−ｋｂまたは１゜５−ｋｂバン ドを検出できなかった。プローブＤ１、Ｄ２、ＡおよびＥと違って、プローブＣ はＸＹ雄とＸＹ＊雌の両方からのＤＮＡにおいてほぼ同じ大きさのＥｃｏＲＩバ ンドを検出する。ファージ挿入物の一端に対応する隣接プローブＢは、同様にＸ Ｙ雄とＸＹ＊雌の両方からのＤＮＡにおいて同じ大きさのＥｃｏＲＩバンドを検 出する。これらの結果は、中断点がプローブＣとＤＩの間のＥｃｏＲＩ部位に近 接することを示唆している。これは５ａｃｌ−消化ＤＮＡをプローブＣとハイブ リダイズさせることにより確かめた。これはＸＹ雄と比べてサイズの変化したバ ンドをＸＹ＊雌において明らかにした（図１３参照）。Three of the six probes (DI, D2 and A) target DNA from XY* females. No Y-specific band could be detected. Probe A is the expected 1,5-kb In addition to the band, a 3.5-kb band is detected in normal XY males. this is a pro This appears to be due to cross-hybridizing sequences shared by probes A and E. P Lobe E also has a 3.5-kb or 1°5-kb band in DNA from XY* females. could not be detected. Unlike probes D1, D2, A and E, probe C has EcoRI viruses of approximately the same size in DNA from both XY males and XY* females. Detect the command. The adjacent probe B, corresponding to one end of the phage insert, is similarly EcoRI bands of the same size were detected in DNA from both Y males and XY* females. put out These results indicate that the breakpoint is close to the EcoRI site between probe C and DI. It suggests contact. This hybridizes the 5acl-digested DNA with probe C. This was confirmed by redizing. This is a bug whose size has changed compared to the XY male. was revealed in XY* females (see Figure 13).
精巣分化におけるＳｒｙの発現 Ｓｒｙは尿生殖***において支持細胞前駆体を卵胞細胞経路からセルトーり細胞 経路へ分岐するように１１． ５ｄ、ｐ、ｃ、付近で作用すると考えられる。高 感度のポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）に基づいたアッセイを 使って、雄性および雌性の胚から単離した尿生殖***においてＳｒｙからの転写 物の存在を探した。保存エキソン中のＳｒｙ配列に特異的なオリゴヌクレオチド ブライマーを用いて、１１．５８目の尿生殖***、成体精巣および成体雄肝臓か らの逆転写ＲＮＡを増幅させた。全ＲＮＡ （１８ｇ）を逆転写酵素（ＲＴ）の 存在下（＋）または不在下（−）で逆転写反応に加えた。開示された通りのＰＣ Ｒ［Ｋ。Expression of Sry in testicular differentiation Sry transfers supporting cell precursors from the follicular cell pathway to celluloid cells in the urogenital ridge. 11. Branch to the route. It is thought that it acts near 5d, p, and c. high Sensitive polymerase chain reaction (PCR)-based assay Transcription from Sry in urogenital ridges isolated from male and female embryos using I searched for the existence of things. Oligonucleotides specific for Sry sequences in conserved exons 11.58 urogenital ridge, adult testis, and adult male liver using a brimer. The reverse transcribed RNA was amplified. Total RNA (18g) was treated with reverse transcriptase (RT). were added to the reverse transcription reaction in the presence (+) or absence (-). PC as disclosed R[K.
ｏｐｍａｎ ｅｔ ａｔ、、前掲コ （ただし、３ｏサイクルおよび５３℃のア ニーリング温度を使用する）は、Ｓｒｙ特異的オリゴヌクレオチドプライ？−（ ５’ −３’ ）ＣＴＧＴＧＴＡＡＧＡＴＣＴＴＣＡＡＴＣおよびＧＴＧＧＴＧ ＡＧＡＧＧＣＡＣＡＡＧＴを使用し、また各試料中のＲＮＡの質および量の対照 としてＨｐｒｔプライマーを含んでいた。上段パネルはエチジウムプロミド染色 アガロースゲルを示し、１４８ｂｐのＰＣＲ産物は成体精巣およびＩＩ。opman et at, the above code (however, 3 o cycles and 53°C temperature) Sry-specific oligonucleotide ply? −( 5'-3') CTGTGTAAGATCTTCAATC and GTGGTG AGAGGCACAAGT and also controls for the quality and quantity of RNA in each sample. The Hprt primer was included as a primer. Upper panels are stained with ethidium bromide. Agarose gel is shown and the 148 bp PCR product is from adult testis and II.
５ｄ、ｐ、ｃ、雄性胚の生殖***（ＧＲ）におけるＳｒｙ転写物に対応する。バ ンドは成体雄肝臓と１１． ５ｄ、ｐ、ｃ、雌生殖***試料には見られなかった 。Ｓｒｙプライマーは単一エキソンから誘導され、かくしてＸＹゲノムＤＮＡお よび逆転写ＳｒｙｍＲＮＡからの配列を増幅することができる。−ＲＴ試料にお ける可視産物の不在は、見られたバンドがＳｒｙｍＲＮＡの存在によるものであ ることを確信させる。いくつかのエキンンにわたっているＨｐｒｔプライマーは 採用した条件下でゲノムＤＮＡからの配列を増幅せず、全ての＋ＲＴ試料におい て予期された３５２ｂｐ産物をもたらした。下段パネルは、プローブｐ４２２． ０４とハイブリダイズした対応するサザンプロットを示す。これは上記のＳｒｙ 発現を確信させる。さらに、低レベルのゲノムＤＮＡ汚染が一部のＲＮＡ試料に 現れたが、これは結果の解釈に影響を及ぼさない。無関係に単離されたＲＮＡ試 料も同様の結果を与えた。5d, p, c, correspond to Sry transcripts in the genital ridge (GR) of male embryos. Ba Adult male liver and 11. 5d, p, c, not found in female genital ridge samples . The Sry primer is derived from a single exon and thus and reverse transcribed Sry mRNA. - for RT samples. The absence of any visible product in the sample indicates that the band seen is due to the presence of Sry mRNA. make sure that Hprt primers spanning several equinnes are Under the conditions employed, no sequences from genomic DNA were amplified and in all +RT samples. yielded the expected 352 bp product. The lower panel shows probe p422. The corresponding Southern plot hybridized with 04 is shown. This is the above Sry Convince manifestation. Additionally, low levels of genomic DNA contamination may be present in some RNA samples. However, this does not affect the interpretation of the results. Independently isolated RNA samples Feeding also gave similar results.
ＰＣＲの結果は図１５に示してあり、そこではＳｒｙバンドが成体精巣と雌尿生 殖***の両方にはっきり見られるが、肝臓や離床生殖***には見られない。逆転 写酵素を加えなかった対照レーンは全くシグナルを示していないので、得られた バンドは試料中の汚染ゲノムまたはプラスミドＤＮＡによるものではない。これ らの結果は、Ｓｒｙが確かに発現遺伝子であることを確信させる。The PCR results are shown in Figure 15, where the Sry band was detected in adult testis and female urine. It is clearly seen on both genital ridges, but not on the liver or the epigenital ridge. Reversal The control lane in which no transcriptase was added did not show any signal, so the obtained The bands are not due to contaminating genomic or plasmid DNA in the sample. this These results confirm that Sry is indeed an expressed gene.
さらに、Ｓｒｙは、それが精巣決定において成る役割を有する時期と一致する時 期に尿生殖***において発現される。In addition, Sry has a role in testicular determination. It is expressed in the urogenital ridge during the period.
相同ｃＤＮＡの単離 いくつかの相補的ＤＮＡライブラリーは、Ｓｒｙに対応するＣＤＮＡを探すため に、初期にはｐＹ５３．３を用いて、比較的最近では９４２２．０４を用いてス クリーニングされた。特に、■１、 ５ｄ、ｐ、Ｃ，雄生殖***（精巣決定遺伝 子が発現されると考えられる時期）から作製した２つのライブラリーのスクリー ニングはハイブリダイズするファージを明らかにすることができなかった。しか しながら、両方のライブラリーは極めて小さいものである［Ｃｕｎ１ｉｆｆｅ、 Ｖ、 ｅｔ ａｌ、、 ＥＭＢＯＪ、、 ９．１９７−２０５ （１９９０） ］。Isolation of homologous cDNA Several complementary DNA libraries are used to search for cDNAs corresponding to Sry. Initially, pY53.3 was used, and relatively recently, 9422.04 was used. Cleaned. In particular, ■1, 5d, p, C, male genital ridge (testis-determining genetic Screening of two libraries prepared from Ning was unable to identify the hybridizing phages. deer However, both libraries are extremely small [Cunliffe, V, et al, EMBOJ, 9.197-205 (1990) ].
かくして、ススクリンを１４． ５６． ｐ、仁および成体精巣ライブラリー、 並びに８．５ｄ、ｐ、Ｃ，全マウス胚ライブラリーにまで延長した。８． ５ｄ 、ｐ、ｃ、マウス金杯ｃＤＮＡライブラリー［Ｆａｈｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ、、 前掲］はｐＹ５３．３のＨｉｎｃＩ［断片によりスクリーニングした。１４の陽 性クローンを精製し、挿入物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎ ｅ）にサブクローニングした。これらのクローンの制限地図およびサザン分析は 、それらがＹ染色体に連鎖していない４つの異なる遺伝子座に対応することを示 した。これらのメツセンジャーのそれぞれについて、ｐＹ５３．３とハイブリダ イズした領域をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングし、Ｔ７ポリメラー ゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使って製造者の指示通りに２本鎖ＤＮＡとして配列 を決定した。配列解析および計算はライスコンシン大学遺伝学コンピュータグル ープの配列解析ソフトウェア″ツケージを使って行った［Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、 Ｊ、、 Ｈａｅｂｅｒｌｉ、 Ｐ、 ＆ Ｓｍ１ｔｈｉｅｓ、 Ｏ，、Ｎｕｃｌ ｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、１２： ３８７−３９５ （１９８４）］。こ れらの４つのサブクローンによりコードされるアミノ酸配列は、関連タンパク質 の対応配列と共に図１６に示しである。精巣ライブラリーはプローブと相同な組 み換え体をもたらさなかったが、８゜５ｄ、ｐ、ｃ、ライブラリーはいくつかの 陽性クローンをもたらした。詳細な制限マツピングは、これらのクローンがい（ つかの別個のクラスに分類されることを示したが、雄および雌ＤＮＡのゲノムサ ザンプロットへのプローブとしてのそれらの個々の使用は、それらがどれもＹ一 連鎖でないことを示した。これらのｃＤＮＡは常染色体遺伝子座に対応すると仮 に見なされるが、それらがＸ染色体性である可能性は排除されていない。これら のｃＤＮＡのそれぞれにおいて、マウスとヒトの両方のプローブに対し強いハイ ブリダイゼーションを示した領域を規定し、かくしてこの領域の配列を決定した 。図１６は次のような種々の相同タンパク質ドメインの配列（−文字表記）を示 す：ｕｂｆ−ｈｍｇ３、このモチーフと最高の相同を共有するｈＵＢＦの第３Ｈ ＭＧボックス［Ｊａｎｔｚｅｎ、前掲］ ； ｐｏｍｂｅ−ｍｅ、Ｓ、ｐｏｍｂ ｅ由来の接合型タンパク質Ｍｃ ［Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ、、前掲］ ；ヒト ーｙ、ＳＲＹ；マウス−ｙ、Ｓｒｙ；およびマウス−ａｌ、マウス−ａ２、マウ ス−ａ３、マウス〜ａ４、Ｙ染色体に連鎖していない遺伝子からの４つの異なる マウスｃ Ｄ Ｎ Ａ ｏ上段の６つの配列間で完全にまたは強く保存されてい る残基はボックスで囲っである。この保存はＳ、 ｐｏｍｂｅ ＭｃまたはｈＵ ＢＦ−ＨＭＧタンパク質にまで広がり、これらの残基もボックスで囲っである。Thus, 14. 56. p, Jin and adult testis library, and an 8.5d, p, C, whole mouse embryo library. 8. 5d , p, c, mouse golden cup cDNA library [Fahrner et al., supra] was screened with the HincI fragment of pY53.3. 14 positives The sexual clones were purified and the inserts were converted into pBluescript (Stratagen e). Restriction maps and Southern analysis of these clones were , showing that they correspond to four different loci that are not linked to the Y chromosome. did. For each of these metsengers, pY53.3 and hybrid The generated region was subcloned into pBluescript, and T7 polymer sequenced as double-stranded DNA using Pharmacia (Pharmacia) according to the manufacturer's instructions. It was determined. Sequence analysis and calculations were conducted by Rice Consin University Genetics Computer Group. This was performed using the sequence analysis software ``Tsage'' [Devereux, J., Haeberli, P. & Sm1thies, O., Nucl. eic Ac1ds Res, 12: 387-395 (1984)]. child The amino acid sequences encoded by these four subclones are related to related proteins. This is shown in FIG. 16 along with the corresponding arrangement. The testis library is a homologous set of probes. Although the 8゜5d,p,c library did not yield any recombinants, several yielded positive clones. Detailed limit mapping is available for these clones ( Although the genome samples of male and female DNA were shown to be classified into several distinct classes, Their individual use as probes to Zamplot suggests that none of them It was shown that there is no chain. These cDNAs are hypothesized to correspond to autosomal loci. However, the possibility that they are X-chromosomal is not excluded. these cDNAs showed strong high response to both mouse and human probes. We defined the region that showed hybridization and thus determined the sequence of this region. . Figure 16 shows the sequences (- letter notation) of various homologous protein domains as follows: : ubf-hmg3, the 3rd H of hUBF that shares the highest homology with this motif. MG Box [Jantzen, supra]; pombe-me, S, pomb Mating-type protein Mc derived from E. [Kelly et al, supra]; human -y, SRY; mouse-y, Sry; and mouse-al, mouse-a2, mouse Sue-a3, mouse ~a4, four different genes from genes not linked to the Y chromosome Mouse c D N A o Is it completely or strongly conserved among the six sequences in the upper row? Residues are boxed. This storage is S, pombe Mc or hU Extending to the BF-HMG protein, these residues are also boxed.
マウスおよびヒト（および実施例１ではウサギ）においてＹ特異的である残基は オープンボックスで示しである。アミノ酸位置はヒト配列に従って５０のブロッ クごとに番号が付けである。新しいタンパク質モチーフを規定する保存領域は上 段配列において残基１１から残基９０まで延びている。The residues that are Y-specific in mice and humans (and rabbits in Example 1) are Shown in open box. Amino acid positions are divided into 50 blocks according to the human sequence. Each block is numbered. The conserved regions defining new protein motifs are It extends from residue 11 to residue 90 in the step sequence.
図１７は、異なる配列間の、保存モチーフ内の、アミノ酸相同のパーセントを示 す。ボックスで囲ってない部分はＳ、 ｐｏｍｂｅ ＭＣ配列とＨＭＧモチーフ （−例としてｈＵＢＦの第３ＨＭＧボックスを使用）の両方とＳｒｙ関連配列と の相同を強調している。Figure 17 shows the percent amino acid homology within conserved motifs between different sequences. vinegar. The parts not surrounded by boxes are S, pombe MC sequence and HMG motif (-using the third HMG box of hUBF as an example) and Sry-related sequences. It emphasizes the homology of
ボックスで囲った部分はマウスａ−ｈａ−２およびａ−３配列間の相同、並びに 遺伝子ファミリーの他のメンバーに対するマウスミー４配列の低度の相同を強調 している。Boxed areas indicate homology between mouse a-ha-2 and a-3 sequences, and Highlighting the low degree of homology of mousemy4 sequences to other members of the gene family are doing.
この方法での配列比較は新たな８０アミノ酸モチーフが規定されるという成果を 有する。これは高比率の塩基性残基（最高２５％）および強いらせん含量を有す る（図１６）。このモチーフでは保存が強く、Ｓｒｙ関連遺伝子間で４２個のア ミノ酸が同一である。アミノ酸比較はＳ、 ｐｏｍｂｅ Ｍｃタンパク質ばかり でなくｈＵＢＦ中の４つのコピーに存在するドメイン［Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ 、、前掲コに対してもこのモチーフの相同を明らかにする。ハイモビリティ−グ ループタンパク質（ｈｊｇｈ ｎｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｐｒｏｔｅｉｎ ）のＨＭＧＩおよびＨＭＧ ２ ［Ｅｉｎｃｋ、 Ｌ、 ＆ Ｂｕｓｔｉｎ、 Ｍ、、 Ｅｘｐｌ、 Ｃｅ１ｌ Ｒｅｓ、、 １５６．２９５−３１０ （１９ ８５）］に対するその相同のためにＨＭＧボックスと呼ばれるこのドメインは、 リポソームＲＮＡ遺伝子プロモーターの上流制御要素に結合して転写を活性化す ることと関係している。明らかに、Ｓｒｙ関連遺伝子に存在するモチーフはＨＭ Ｇボックスに似ているが、これとは異なり、かくして新しい遺伝子ファミリーを 規定する。このファミリーの５つのメンバーがマウスから単離されたが、ｐＹ５ ３．３またはｃＤＮＡを用いて低緊縮条件でサザンプロットを検索したときに見 られたバンドの数は、このファミリーの全てがクローニングされたわけではない ことを示唆する。Sequence comparison using this method resulted in the definition of a new 80-amino acid motif. have It has a high proportion of basic residues (up to 25%) and a strong helical content (Figure 16). This motif is highly conserved, with 42 mutations among Sry-related genes. The amino acids are the same. Amino acid comparisons are all about S, pombe, and Mc proteins. rather than domains present in four copies in hUBF [Kelly et al. , , the homology of this motif to the above-mentioned one is also revealed. high mobility group loop protein (hjgh nobility group protein ) of HMGI and HMG 2 [Einck, L, & Bustin, M,, Expl, Ce1l Res,, 156.295-310 (19 This domain, called the HMG box because of its homology to [85)], Liposomal RNA binds to upstream regulatory elements of gene promoters and activates transcription. It is related to that. Apparently, the motif present in Sry-related genes is HM Similar to, but different from, G-boxes, it is thus possible to create new gene families. stipulate. Five members of this family have been isolated from mice, but pY5 3.3 or when searching Southern blots under low stringency conditions using cDNA. The number of bands identified does not indicate that all members of this family have been cloned. suggests that.
いくつかのアミノ酸残基はＳｒｙ関連遺伝子ファミリーおよびＭｃおよびＨＭＧ 配列を通して同一である（図１６）。これはこの型の全ての遺伝子に共通するタ ンパク質構造または配列認識の制約のためでありうる。マウス遺伝子ファミリー 内で、少なくとも３つのサブファミリーが区別された（図１７）。配列ａ１、ａ ２およびａ３は保存モチーフとほとんど同一である。Ｓｒｙおよびａ４配列はこ のグループから独立して分岐したらしい。いくつかの残基がヒト、マウスおよび ウサギのＹ一連鎖配列にのみ共通している。従って、Ｙ一連鎖遺伝子産物は常染 色体遺伝子産物と機能的に区別され得る。Some amino acid residues are associated with the Sry-related gene family and Mc and HMG Identical throughout the sequence (Figure 16). This is a common trait for all genes of this type. This may be due to protein structure or sequence recognition constraints. mouse gene family Within, at least three subfamilies were distinguished (Figure 17). Array a1, a 2 and a3 are almost identical to the conserved motif. Sry and a4 sequences are here. It seems that it branched off independently from the group. Some residues are present in human, mouse and It is common only to the rabbit Y-linked sequence. Therefore, Y-linked gene products are permanent Can be functionally distinguished from chromoplast gene products.
考察 精巣決定遺伝子の候補配列はいくつかの基準を満たさねばならない。本実施例お よび上記実施例１では、これらの基準にかなう遺伝子の部分の単離および配列が 記載される。第一に、それはＹ染色体の性決定メカニズムを有することが知られ た全哺乳動物のＹ染色体上に保存された配列であるべきである。サザンブロッテ ィングは、この配列の相同体が広範な真獣下綱の動物のＹ染色体に存在すること を明らかにした。第二に、それは雄性を付与することが知られたＹ染色体の最小 部分にマツピングされねばならない。ヒト遺伝子ＳＲＹは、ＸＸ染色体バックグ ラウンドに雄性を付与するのに十分な、偽書染色体境界に隣接する３、５ｋｂの 詳細な研究において見いだされた。マウス相同体Ｓｒｙは性を決定することが知 られたＹ染色体の最小領域−３ｘｒ’にマツピングされることがここに示される 。第三に、候補配列は、遺伝学的に精巣決定遺伝子に突然変異をもっことが分か ったＸＹ＊雌の発生のための分子的根拠が存在するという予測を満たさねばなら ない。Consideration Candidate sequences for testis-determining genes must meet several criteria. This example and Example 1 above, the isolation and sequence of a portion of the gene that meets these criteria was demonstrated. be written. First, it is known to have a Y-chromosome sex-determining mechanism. It should be a conserved sequence on the Y chromosome of all mammals. southern brotte This suggests that homologs of this sequence exist on the Y chromosome of a wide range of eutherian animals. revealed. Second, it is the smallest member of the Y chromosome known to confer maleness. must be mapped to the part. Human gene SRY has XX chromosome background 3 to 5 kb adjacent to the pseudochromosomal border, sufficient to confer maleness on the round. found in detailed research. The mouse homolog Sry is known to determine sex. It is shown here that it maps to the smallest region of the Y chromosome -3xr' . Third, candidate sequences are genetically known to have mutations in testis-determining genes. The prediction that there is a molecular basis for the development of XY* females must be met. do not have.
これらのＳ ｒｙ”ＸＹ＊雌マウマウスいては、高度に保存されたエキソンを含 むＳｒｙの部分が欠失されていることがここに示される。保存エキソンに近接す る１つの欠失中断点の発見はＳｒｙが精巣決定遺伝子であることと一致するが、 この議論は他の中断点が当該遺伝子中にまたはその近傍にあることが見いだされ るならば明らかに強化されるであろう。以前の研究では、Ｚｆｙ−１の構造また は発現に変異が全く見られなかった。これはＳｘｒ’をマツピングすることが知 られたただ１つの他の遺伝子であり、以前には精巣決定遺伝子のよい候補である と考えられていた。These Sry”XY* female mice contain highly conserved exons. It is shown here that the Sry portion has been deleted. Close to conserved exons The discovery of a single deletion breakpoint in Sry is consistent with Sry being a testis-determining gene; This argument does not apply if other breakpoints are found in or near the gene in question. If it were, it would obviously be strengthened. Previous studies have shown that the structure of Zfy-1 or No variation was observed in expression. This is known to map Sxr'. It is the only other gene that has been identified and was previously a good candidate for a testis-determining gene. It was thought that
最後に、精巣決定遺伝子の候補配列はその作用について知られているものと一致 する組織および時期に発現されるべきである。Finally, the candidate sequence of the testis-determining gene is consistent with what is known about its action. It should be expressed in tissues and at the same time.
マウスでは、当該遺伝子は雄と雌の胚形成において最初に認められる差異である 精巣索形成の直前の約１１． ５ｄ、ｐ、ｃ、に尿生殖***において発現される べきである。Ｓｒｙの発現はこの予測にかなっている。１１． ５ｄ、ｐ、ｃ、 尿生殖***に存在した転写物のレベルは非常に低く、予備ＰＣＲデータもＳｒｙ が１０゜５ｄ、ｐ、ｃ、前または胎児生殖腺発生の後期には発現されないことを 示唆する。この低レベルの発現は発生においてスイッチとして作動しうる遺伝子 にとって意外なことではない。In mice, the gene is the first observed difference in male and female embryogenesis. Approximately 11. just before testicular cord formation. 5d, p, c, expressed in the urogenital ridge Should. Expression of Sry meets this prediction. 11. 5d, p, c, The level of transcripts present in the urogenital ridge was very low, and preliminary PCR data also showed that Sry is not expressed before 10°5d, p, c or later in fetal gonadal development. suggest. This low level of expression indicates a gene that can act as a switch in development. This is not surprising.
Ｓｒｙはまた成体精巣でも発現されることが分かった（実施例１）。胚において 発生決定の役割を有すると思われる数種の遺伝子、例えばいくつかのホメオボッ クス含有遺伝子、も成体精巣において発現される。Ｓｒｙは胚において精巣決定 で１つの役割を有し、生後は雄生殖細胞発生において別の役割を有するだろう。Sry was also found to be expressed in adult testis (Example 1). in the embryo Several genes that appear to have developmental roles, such as some homeobots, The cous-containing gene is also expressed in the adult testis. Sry determines testes in the embryo and postnatally may have another role in male germ cell development.
精巣決定におけるＳｒｙの作用機序が何であるのかまだはっきりしていない。Ｓ ｒｙが細胞自律的にセルトーり細胞の分化を促進するということを示唆する証拠 がある。雄発生における更なる段階は直接セルトーり細胞の分化から生じる。従 って、Ｓｒｙは細胞において調節分子として作用しうるタンパク質をコードする ことが期待できる。Ｓｒｙ中の保存タンパク質ドメインは既知のＤＮＡ結合タン パク質に相同であり、これから類推して、Ｓｒｙタンパク質はＤＮＡに結合しか つ転写スイッチとして作用する核タンパク質でありうる。Ｓ、ｐｏｍｂｅのｍａ ｔａ−Ｍ遺伝子座にあるＭｃタンパク質をコードする遺伝子とＳｒｙとの相同に は興味がもてる。酵母の接合型と哺乳動物の性決定とを対比することは好奇心を そそるが、２つの場合に使用されるメカニズム間の進化的関係を支持する理由は 何もない。保存されたモチーフはスイッチを達成するのに必要な制御の型に適切 な機能タンパク質ドメインを表すらしい。It is still unclear what the mechanism of action of Sry in testicular determination is. S Evidence suggesting that ry promotes cell-autonomous cell differentiation There is. A further step in male development directly results from cell differentiation. subordinate Therefore, Sry encodes a protein that can act as a regulatory molecule in cells. We can expect that. Conserved protein domains in Sry contain known DNA-binding proteins. Sry protein is homologous to protein, and by analogy, Sry protein only binds to DNA. It may be a nuclear protein that acts as a transcriptional switch. S, pombe ma Homology between the gene encoding the Mc protein located at the ta-M locus and Sry is interesting. Contrasting yeast mating types and mammalian sex determination is a curiosity. Although tempting, the reasons supporting an evolutionary relationship between the mechanisms used in the two cases are there is nothing. Conserved motifs are appropriate for the type of control required to achieve the switch It seems to represent a functional protein domain.
Ｓｒｙの転写物に対応するｃＤＮＡを単離しようとして、８０アミノ酸の相同領 域を含む少なくとも４つの追加の遺伝子が発見された。異なるｃＤＮＡ開と、異 なる種におけるＹ一連鎖遺伝子間の両方でのこのタンパク質ボックスの高度の保 存は、それが機能ドメインであることを意味する。４つの常染色体遺伝子は全て ８、 ５ｄ、ｐ、ｃ、胚ライブラリーから単離され、他の初期発生決定に関与す るだろう。In an attempt to isolate the cDNA corresponding to the Sry transcript, an 80 amino acid homologous region was isolated. At least four additional genes containing the region were discovered. Different cDNA openings and different The high conservation of this protein box both among Y-linked genes in different species existence means that it is a functional domain. All four autosomal genes 8, 5d, p, c, isolated from embryo libraries and involved in other early developmental decisions. It will be.
結論として、Ｓ、 ｐｏｍｂｅの接合型およびＤＮＡ結合タンパク質ｈＵＢＦに 関係した遺伝子にも存在する、保存アミノ酸ドメインの存在により結びついたマ ウスの新規な遺伝子ファミリーが開示される。この遺伝子ファミリーの１つのメ ンバーはＹ染色体の性決定領域にマツピングされ、精巣決定遺伝子についてなさ れた種々の予測を満足させる。In conclusion, the mating type of S. pombe and the DNA-binding protein hUBF Maps linked by the presence of conserved amino acid domains that are also present in related genes. A novel gene family in mice is disclosed. One member of this gene family The protein is mapped to the sex-determining region of the Y chromosome and is associated with testis-determining genes. satisfy various predictions made.
性決定の全過程は全てのを椎動物で保存されているらしく、性決定のためにＸ Ｘ／Ｘ Ｙ染色体に基づいたシステムを使用しない種においてさえ精巣決定遺伝 子は中心的役割を演じていると考えられる。を椎動物の全ての種において、精巣 決定遺伝子は細胞、組織、胚、胎児、***および個体の性をつきとめ、かつ飼育 動物の子孫の性比をコントロールするために実験の標的となるだろう。The entire process of sex determination seems to be conserved in all vertebrates, and for sex determination Testis-determining genetics even in species that do not use an X/XY chromosome-based system Children are thought to play a central role. In all vertebrate species, the testis Determining genes determine the sex of cells, tissues, embryos, fetuses, sperm, and individuals, and It would be the target of experiments to control the sex ratio of an animal's offspring.
実施例３ 精巣決定の過程に５ＲＹ（マウスでは５ｒｙ）が加わっているとする、興味をそ そる証拠がある。それはＹ染色体上の精巣決定遺伝子の位置に関してなされた全 ての予測を満足させる。かくして、当該遺伝子は雄性を決定することが知られた ヒトおよびマウスＹ染色体の最小領域にマツピングされ、調べた他の全ての真獣 下綱の動物のＹ染色体に保存されている。この遺伝子は調節役割と一致する推定 上のＤＮＡ結合タンパク質をコードする。Ｓｒｙはまた精巣決定での役割と完全 に一致するマウスでの発現パターンを示し、生殖***の体細胞で特異的に、明白 な精巣分化の直前に短期間発現される。Example 3 An intriguing study suggests that 5RY (5ry in mice) is involved in the process of testis determination. There is evidence that it does. It is a complete study of the location of the testis-determining gene on the Y chromosome. Satisfy all predictions. Thus, the gene was known to determine maleness. All other eutherians examined mapped to the smallest region of the human and mouse Y chromosomes. Conserved on the Y chromosome of lower class animals. This gene is putatively consistent with a regulatory role. encodes the above DNA-binding protein. Sry also plays a role in testicular determination and specifically in the somatic cells of the genital ridge, with an expression pattern in mice consistent with It is expressed for a short period just before testicular differentiation.
ＸＹ雌を含む性転換の事例の研究から得られたデータは、ＳＲＹ／Ｓｒｙが正常 な精巣決定のために必要であることを強く示している。かくして、遺伝学的に精 巣決定遺伝子に突然変異を起こしていることが分かったマウスの系列はＳｒｙを 欠失している。Data obtained from studies of sex reassignment cases involving XY females indicate that SRY/Sry is normal. This strongly suggests that it is necessary for testicular determination. Thus, genetically The line of mice that was found to have a mutation in the nest-determining gene was Sry. It is missing.
さらに、ヒトＸＹ雌の無作為試料のＳＲＹ ＤＮＡ配列の試験から、高度に保存 された推定ＤＮＡ結合ドメイン内の遺伝子産物を変更する多数の突然変異が同定 された。Additionally, testing of the SRY DNA sequence of random samples of human XY females revealed that it is highly conserved. Numerous mutations have been identified that alter gene products within putative DNA-binding domains It was done.
これはＳＲＹ／Ｓｒｙが精巣決定遺伝子であることを正式に証明するために解決 すべき１つの問題を残す。すなわち、この遺伝子は十分であるのか？という問題 である。この問題は、当該遺伝子が単独で作用し得ないことは明らかであるので 、条件を必要とする。ＸＹ雌または両性動物が、正常な精巣決定遺伝子の存在に もかかわらず、いくつかの事例に見られる。これらの事例の一部は明らかに非Ｙ 一連鎖遺伝子での突然変異によるものであり、他の事例はＹ染色体変異型と常染 色体遺伝子座の特定の対立遺伝子との不一致を反映している。従って、この問題 は次のように言い換えることができる。すなわち、ＳＲＹは精巣決定に必要とさ れるただ１つのＹ一連鎖遺伝子であるのか？精巣の発生をもたらすヒトＹ染色体 の最小領域は、ＳＲＹを発見するのに役立った性転換を示す４人のＸＸ個体に存 在した約３５ｋｂ領域である。しかしながら、たとえ他の保存配列が見つからな かったとしても、精巣決定に必要とされるこの領域内に別の遺伝子があると考え られる。さらに、Ｙ染色体のより大きな断片をもつ他のＸＸ雄と違って、４人は いずれも完全に正常な離去現型をもっておらず、このことは３５ｋｂの外側の別 の遺伝子も必要であることを示すかもしれない。This was resolved to formally prove that SRY/Sry is a testis-determining gene. One problem remains. In other words, is this gene sufficient? the problem It is. This problem is solved because it is clear that the gene in question cannot act alone. , requires conditions. XY females or hermaphrodites due to the presence of normal testis-determining genes However, it can be seen in some cases. Some of these cases are clearly non-Y This is due to a mutation in a single-linked gene; other cases are Y-chromosome variants and permanent infections. It reflects a mismatch with a specific allele at the chromopolytic locus. Therefore, this problem can be rephrased as follows. In other words, SRY is not required for testis determination. Is this the only Y-linked gene? Human Y chromosome responsible for testicular development The smallest area of This is a region of about 35 kb that was present. However, even if no other conserved sequence is found Even if it were not possible, it is thought that there is another gene within this region that is required for testis determination. It will be done. Furthermore, unlike other XX males with larger fragments of the Y chromosome, four None of them have completely normal isolated phenotypes, which indicates that the outer 35kb This may also indicate that the genes for
ＳＲＹ／Ｓｒｙの機能の最良の試験はそれを単独でＸＸ胚に導入して、それが雄 発生を確実にするか、すなわちそれが性転換をもたらすかを調べることである。The best test of SRY/Sry function is to introduce it alone into XX embryos and ensure that they are male. The objective is to determine whether it occurs, that is, whether it results in sex change.
理論的には、導入したＤＮＡ内に他の遺伝子が存在しないことを確実にするため に、これは一定の異種プロモーターと共に全長ｃＤＮＡを使って行われるべきで ある。しかし、マウスでの胎児生殖腺発生中に観察されたＳｒｙ発現のパターン は、この遺伝子の正確な調節がその作用にとって極めて重要であることを示唆す る。かくして、適切な調節を有することを期待して、我々はヒトまたはマウスＳ ＲＹ／Ｓｒｙ遺伝子を担うゲノムＤＮＡ断片を使ってトランスジェニック実験を 開始した。ヒト遺伝子はマウスにおいて性転換を与えることができないが、１４ ｋｂゲノム断片内に含まれるマウス遺伝子は染色体的に雌のトランスジェニック マウスにおいて明らかに正常な精巣発生を与える（胚期と成熟期の両方に見られ る）ことが分かった。In theory, to ensure that no other genes are present within the introduced DNA. This should be done using a full-length cDNA with a given heterologous promoter. be. However, the pattern of Sry expression observed during fetal gonad development in mice suggests that precise regulation of this gene is crucial for its action. Ru. Thus, in the hope of having appropriate regulation, we used human or mouse S Transgenic experiments using genomic DNA fragments carrying the RY/Sry gene It started. Although human genes cannot confer sex reversal in mice, 14 The mouse genes contained within the kb genome fragment are chromosomally female transgenic. Gives apparently normal testicular development in mice (seen at both embryonic and adult stages) It was found that
（本頁以下余白） 物質および方法 トランスジェニック動物の作製 ＤＮＡ構築物 ＳＲＹまたはＳｒｙ含有断片を適当な制限酵素で消化することによりコスミド、 ファージまたはプラスミドクローンから単離し、その後アガロースゲル電気泳動 により他の断片およびベクター配列から精製した。単離したＤＮＡ断片は製造者 の説明書に従って“ｇｅｎｅ ｃｌｅａｎ”により、またはフェノール抽出によ りおよびセファデックスＧ５０カラムまたはｅｌｕｔｉｐを通過させることによ り、続いてエタノール沈殿により精製した。(Margins below this page) Materials and methods Production of transgenic animals DNA construct By digesting SRY or Sry-containing fragments with appropriate restriction enzymes, cosmids, Isolation from phage or plasmid clones followed by agarose gel electrophoresis purified from other fragments and vector sequences. Isolated DNA fragments are provided by the manufacturer. by “gene clean” or by phenol extraction according to the instructions for and Sephadex G50 column or elutip. and subsequent purification by ethanol precipitation.
１、ヒトＳＲＹ ヒトコスミドｃＡＭＦから２４．６ｋｂのＢａｍＨｌ−Ｓａｌｌ断片を単離した 。これは偽書染色体領域に隣接する１８．６ｋｂのＹ特異的配列と、その境界に 対して遠位の６ｋｂ配列を含んでいる。従って、この断片はＳＲＹと既知エキソ ンの５′側の１２ｋｂ配列を含み（図２０参照）、その結果ＨｕＳＲＹ−Ａと呼 Ｓｒｙと既知エキソンの５′側の約８ｋｂ配列を含むｌ ４ｋｂ断片は、ファー ジクローンＬ７．４．１から直接またはｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔ中のサブクロー ンから５ａｌｌ消化により単離した。この断片はＭｏ５ｒｙ−７４１と呼ばれる 。1. Human SRY A 24.6 kb BamHl-Sall fragment was isolated from human cosmid cAMF. . This includes an 18.6 kb Y-specific sequence adjacent to the pseudochromosomal region and its border. It contains a 6 kb sequence distal to the other. Therefore, this fragment is similar to SRY and known exo. contains a 12 kb sequence on the 5' side of A 4kb fragment containing Sry and approximately 8kb sequence 5' of the known exon was Directly from diclone L7.4.1 or subclone in pBIuescript It was isolated by 5all digestion. This fragment is called Mo5ry-741 .
Ｓｒｙと既知エキソンの５′側の約１．７ｋｂおよび３′側のｌｋｂを含む３． ５ｋｂのＥｃｏＲ１断片はｐ４．２．２．から単離した。3. Containing Sry and approximately 1.7 kb on the 5' side and lkb on the 3' side of the known exon. The 5 kb EcoR1 fragment was p4.2.2. isolated from.
マウスおよび微小操作（マイクロマニピユレーション）３−５週齢（ＣＢＡｘＣ ５７ＢＬ／１０）Ｆｌ雌を過剰***させ、繁殖用のＦ１雄と交配させた。翌日、 膣栓を示す雌の卵管から受精卵を集めた。本質的にＨｏｇａｎ、 Ｃｏｎ５ｔａ ｎｔｉｎｉ ＆ Ｌａｃｙ、”Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ”、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｉ（ａｒｂｏｒ、１９８６に記 載されるように、約２μｇ／ｍｌの濃度で１−２ｐｌのＤＮＡを前核に導入した 。卵をＭ１６またはＴ６培地で一部インキユベートし、２細胞胚を卵管移入によ り偽妊娠レシピエンドに移植した。Mice and micromanipulation 3-5 weeks old (CBAxC 57BL/10) Fl females were superovulated and mated with breeding Fl males. the next day, Fertilized eggs were collected from the oviducts of females exhibiting vaginal plugs. Essentially Hogan, Con5ta ntini & Lacy, “Manipulating the Mouse Embryo”, Co1d Spring I (arbor, 1986) 1-2 pl of DNA was introduced into the pronuclei at a concentration of approximately 2 μg/ml as shown. . Eggs were partially incubated in M16 or T6 medium and 2-cell embryos were transferred by oviduct. The pseudopregnancy recipe was transplanted to the end.
導入した胚は移入の１４日後に検査するか、または妊娠期間を終結させた。１４ 日齢の胚は次の方法で分析した：（ｉ）初めに羊膜細胞において性染色質を染色 することにより染色体の性を決定した（Ｍｏｎｋ ａｎｄ ＭｃＬａｒｅｎ、 １９８１） ｏ （ｉｉ）この時期には通常非常に明瞭な、精巣索の有無を調べ ることにより生殖腺の性を決定した。Transferred embryos were examined 14 days after transfer or the gestation period was terminated. 14 Day-old embryos were analyzed by: (i) initially staining sex chromatin in amniotic cells; The sex of the chromosome was determined by (Monk and McLaren, 1981) o (ii) Check for the presence or absence of testicular cords, which are usually very obvious at this stage. The sex of the gonads was determined by
生殖腺はその後固定し、写真を撮り、そして対象のものは組織検査のために処理 した。（ｉｉｉ）明らかな性転換を示す胚は皮膚線維芽細胞の培養物から抜型を 分析した。（ｉｖ）ゲノムＤＮＡは肢から調製した。（Ｖ）死体の残部は凍結し 、−７０℃で貯蔵した。新生動物は外部観察により性別を判断し、２−３週目に ＤＮＡ調製のために尾バイオプシーを採取した。トランスジェニックであること が判明した動物は繁殖させるために成熟させ、かつ／また内部観察のために犠牲 にした。The gonads are then fixed, photographed, and those of interest are processed for histological examination. did. (iii) Embryos showing obvious sex reversal are removed from skin fibroblast cultures. analyzed. (iv) Genomic DNA was prepared from the limbs. (V) The remains of the corpse are frozen. , and stored at -70°C. The sex of newborn animals is determined by external observation, and at 2-3 weeks Tail biopsies were taken for DNA preparation. being transgenic Animals found to be infected are allowed to mature for breeding and/or are sacrificed for internal observation. I made it.
ＲＮＡ調製のために、トランスジェニック胚がトランスジェニック雄とＦｌ雌と の時を得た交配から得られた。発生期は肢の形態を調べることにより確認した。For RNA preparation, transgenic embryos were separated into transgenic males and Fl females. obtained from timely crosses. The developmental period was confirmed by examining the morphology of the limbs.
結果 ヒトＳＲＹを有するトランスジェニックマウス１、 １−）の確定したＸＸ）− ランスジェニック１４日齢胚が得られた。生殖腺は精巣索形成の徴候を示さなか った。result Confirmed transgenic mouse 1, 1-) with human SRY XX)- Transgenic 14-day-old embryos were obtained. Gonads do not show signs of testicular cord formation It was.
２．３匹の生きて生まれたＸＹトランスジェニック動物、ＨｕＳＲＹ−Ａ６、Ｈ ｕＳＲＹ−Ａ９およびＨｕＳＲＹ−Ａｌ１が得られた。全て正常に見える雄であ った。これらのうち１つ、Ａ１．２は繁殖に失敗した。他の２匹は両方とも生殖 力があり、トランスジーンを約５０％の子孫に伝達した。各系列から少なくとも ４匹のＸＸトランスジェニック動物を詳細に調べたが、性転換の証拠は１３．５ ｄｐｃ胚にも成体にも見られなかった。2. Three live-born XY transgenic animals, HuSRY-A6, H uSRY-A9 and HuSRY-Al1 were obtained. He's a male that looks normal. It was. One of these, A1.2, failed to reproduce. The other two are both reproductive and transmitted the transgene to approximately 50% of their offspring. At least from each series A detailed study of four XX transgenic animals showed no evidence of sex reversal. It was not found in either dpc embryos or adults.
マウスＳｒｙを有するトランスジェニックマウス（ａ）ファージクローンＬ７． ４．１から単離した５ｒｙ１．２つの確定したＸＸトランスジェニック１４日齢 胚、Ｍｏ５ｒｙ−７４１／７． ２２およびＭｏ５ｒｙ−７４１／１０，２が得 られた。これらは両方とも生殖腺全体に精巣索を有し、正常に見える精巣をもっ ていた。トランスジーンをもつ雌性胚は存在しなかった。Transgenic mouse carrying mouse Sry (a) Phage clone L7. 5ry1.2 confirmed XX transgenic 14-day-old isolated from 4.1 Embryo, Mo5ry-741/7. 22 and Mo5ry-741/10,2 were obtained It was done. They both have testicular cords throughout the gonads and normal-appearing testes. was. There were no female embryos carrying the transgene.
２．１匹の生きて生まれたＸＸトランスジェニック、Ｍｏ５ｒｙ−７４１／３３ ．１３が得られ、これは外部生殖器の観察により正常な雄であるように見えた。2. One live born XX transgenic, Mo5ry-741/33 ．． No. 13 was obtained, which appeared to be a normal male by observation of the external reproductive organs.
３．１匹の生きて生まれたＸＹヒトンスジェニック、Ｍｏ８ｒｙ−７４１／ＡＡ Ａ、正常雄が得られた。これはトランスジーンの低級モザイクであり、生殖力は あるが、これまでのところトランスジーンを子孫に伝達できない。3. One live born XY human genetic, Mo8ry-741/AA A, a normal male was obtained. This is a low-grade mosaic of transgenes, and the fertility is However, so far they have been unable to transmit the transgene to their offspring.
４．１匹の生きて生まれたｘＹトランスジェニック、Ｍｏ５ｒｙ−７４１／３２ ．７が得られ、繁殖実験に使用したが、これまでのところトランスジーンの子孫 への伝達に成功していない。4. One live born xY transgenic, Mo5ry-741/32 ．． 7 was obtained and used in breeding experiments, but so far no transgene progeny has not been successfully transmitted.
５．２匹の生きて生まれたＸＸ）ランスジェニックマウス、Ｍｏ３ｒｙ−７４１ ／３２．１０およびＭｏ５ｒｙ−７４１／３３゜２が得られ、外部生殖器の観察 から正常な雌であるように見えたが、同腹の非トランスジェニックマウスよりも やや小さいように見えた。5.2 live born XX) transgenic mice, Mo3ry-741 /32.10 and Mo5ry-741/33゜2 were obtained, and the external reproductive organs were observed. appeared to be a normal female, but was more sensitive than her non-transgenic littermate It seemed a little small.
ファージクローンＬ？、４．１からのＳｒｙを有するトランスジェニックの割合 は、異なる調製方法を試みたにもかかわらず、他のＤＮＡ断片と比べて非常に低 かった。これはＳｒｙ遺伝子に隣接する逆方向反復配列を含むこのゲノム断片の 特殊な構造のためであるだろう。Phage clone L? , the proportion of transgenics with Sry from 4.1 Despite trying different preparation methods, the yield is very low compared to other DNA fragments. won. This is because this genomic fragment contains the inverted repeats adjacent to the Sry gene. This may be due to the special structure.
（ｂ）ｐ４．２．２．から単離した５ｒｙ１、 １つの確定したＸＸトランスジ ェニック１４日齢胚、Ｍｏ５ｒｙ−４２２／ＢＢＢが得られたが、性転換の証拠 はなかった。(b) p4.2.2. 5ry1 isolated from A 14-day-old embryo, Mo5ry-422/BBB, was obtained, but there was no evidence of sex reversal. There was no.
２．２匹の確定したＸＸトランスジェニック成体、Ｍｏ５ｒｙ−４２２／ＣＣＣ およびＭｏ Ｓ ｒ Ｖ −４２２／ＤＤＤが得られたが、どちらの場合も性転 換の証拠はなかった。2.2 confirmed XX transgenic adults, Mo5ry-422/CCC and Mo S r V -422/DDD, but in both cases, sex change There was no evidence of exchange.
３、ＸＹ）ランスジェニック動物も数多く同定された。これらは正常な雄である ようだ。3, XY) Many transgenic animals were also identified. these are normal males It seems so.
考察 これらの実験は、Ｓｒｙを含む１４ｋｂゲノム断片がＸＸトランスジェニック胚 において精巣形成を導き、その後ＸＸトランスジェニック成体において完全な表 現型の性転換を起こさせるのに十分であることを示す。以前のデータはＳＲＹ／ Ｓｒｙが精巣決定にとって通常必要であることを示したが、今日の研究はＳｒｙ が他の点では雌の遺伝子バックグラウンドにおいてこの過程を導くのに十分であ ることを示す。Ｓｒｙは雄発生を起こすのに必要なただ１つのＹ−コード化配列 であるので、Ｓｒｙが精巣決定遺伝子であると断定される。Consideration These experiments showed that a 14 kb genomic fragment containing Sry was used in XX transgenic embryos. leading to orchiogenesis in the XX transgenic adult This is shown to be sufficient to cause a sex change in the current form. Previous data is SRY/ Although we showed that Sry is normally required for testicular determination, today's study shows that Sry is otherwise sufficient in the female genetic background to guide this process. to show that Sry is the only Y-encoded sequence required to initiate male development Therefore, it is concluded that Sry is a testis-determining gene.
Ｓｒｙが存在する唯一のＹ誘導遺伝物質である場合にマウスでの完全な性転換が 可能であるとすれば、これらの結果は３５ｋｂのＳＲＹ含有Ｙ特異的物質を受け 継いだヒトＸＸ個体での類似事例をどのように関係づけるのか？ Ｐａｌｍｅｒ らにより記載されたこのような４個体では、性転換表現型がほんの部分的であり 、個体間で変化した。これは完全に正常な雄表現型を示す以前に記載されたＸＸ 雄（そのＹ誘導成分はより大きかった）と対照的である。Complete sex reversal in mice occurs when Sry is the only Y-inducing genetic material present. If possible, these results would suggest that the 35 kb SRY-containing Y-specific material How do we relate similar cases in inherited human XX individuals? Palmer In the four such individuals described by et al., the sex reversal phenotype was only partial. , varied between individuals. This is a previously described XX showing a completely normal male phenotype. In contrast to males (whose Y-induced component was larger).
これらの観察の１つの解釈は、ＳＲＹを含む３５ｋｂ領域の外側の別の遺伝子（ または遺伝子群）が完全な雄表現型を獲得するのに必要とされるというものであ る。これは、Ｓｒｙが染色体的に雌のマウスにおいて他のＹ特異的遺伝子の不在 下で単独で完全な性転換を起こし得るという事実を考慮するとあり得ないようだ 。One interpretation of these observations is that another gene outside the 35 kb region containing SRY ( or a group of genes) required to acquire a fully male phenotype. Ru. This suggests that Sry is chromosomally absent from other Y-specific genes in female mice. This seems unlikely considering the fact that a complete sex change can occur independently under .
これらの個体における部分的性転換表現型についての別の解釈は、ＳＲＹの発現 がその新しい位置によって影響を受けているというものである。雄減数***中の 異常なＸ−Ｙ交換により、ＳＲＹを含む３５ｋｂのＹ特異的ＤＮＡがＸ染色体の １つに転座される。Another interpretation for the partial sex reversal phenotype in these individuals is that expression of SRY is affected by its new position. during male meiosis Due to the abnormal X-Y exchange, 35kb of Y-specific DNA containing SRY is transferred to the X chromosome. translocated into one.
ここで、ＳＲＹはＸ染色体上のその正確な位置および転座されたＹ特異的ＤＮＡ の量に依存してその正常レベルの発現を変える位置効果に付されるだろう。ショ ウジヨウバエにおいて詳細に記載された位置効果変動の現象は、遺伝子発現に対 する位置依存的効果の十分な証拠を提供する。上記効果のほかに、これらの個体 のＳＲＹはＸ不活性化の広がりにより影響されつる。Ｘ：常染色体転座を伴うい くつかの事例では、Ｘ不活性化が隣接配列に広がり、常染色体遺伝子の発現に影 響を及ぼすことが分かった。マウスでは精巣決定に影響を与えるＸ不活性化の先 例がある。精巣決定遺伝子を含むＹ染色体の領域Ｓｘｒが不活性Ｘ染色体にのみ 担持されるようにした場合、得られるＸＸ Ｓｘｒ動物はしばしば雄よりもむし ろ両性動物または雌である。ヒトの場合では、Ｘ不活性化はランダムであり、初 期胚の少数の細胞でしか起こらないので、ＳＲＹを担う不活性Ｘ染色体を有する 細胞の割合は個体間で変化する。発生する生殖腺の大部分の細胞がＳＲＹを担う 不活性Ｘを含んでいた場合は、卵巣または卵巣畢丸が形成されただろう。４人の 患者の間に、彼らが両方とも同じ異常なＸ：Ｙ交換から生じるＹ染色体の同一部 分をもつという事実にもかかわらず、表現型の両極端が子孫によって発現された 。このことはＸ不活性化によるＳＲＹ活性の変化として最も容易に解釈される。Here, SRY indicates its exact location on the X chromosome and the translocated Y-specific DNA. will be subject to position effects that alter its normal level of expression depending on the amount of Show The well-described phenomenon of position-effect fluctuations in the fruit fly melanogaster affects gene expression. provides sufficient evidence of a location-dependent effect. In addition to the above effects, these individuals SRY is affected by the extent of X inactivation. X: Associated with autosomal translocation In some cases, X inactivation spreads to adjacent sequences and affects expression of autosomal genes. It turned out that it had an impact. In mice, what happens after X inactivation affects testicular determination? There is an example. Region Sxr of the Y chromosome containing the testis-determining gene is found only on the inactive X chromosome When left to support, the resulting XXSxr animals are often more resilient than males. is hermaphrodite or female. In humans, X inactivation is random and Because it only occurs in a small number of cells in stage embryos, it has an inactive X chromosome that carries SRY. The proportion of cells varies between individuals. Most cells in the developing gonads carry SRY If it contained inactive X, an ovary or ovary round would have been formed. 4 people between patients, they both have the same part of the Y chromosome resulting from the same abnormal X:Y exchange Despite the fact that both extremes of the phenotype were expressed by the offspring . This is most easily interpreted as a change in SRY activity due to X inactivation.
それは欠失遺伝子によるものではない。ＳＲＹがＤＮＡの短片に担持される場合 は位置効果とＸ不活性化の広がりの両方がより顕著であるので、Ｙ染色体の最小 部分を受け継いだＸＸ雄が部分的性転換を示す連出をこれらの効果から説明でき る。It is not due to a deleted gene. When SRY is carried on a short piece of DNA is the smallest on the Y chromosome, since both the position effect and the spread of X inactivation are more pronounced. These effects can explain why XX males who inherited the partial sex change show a series of partial sex changes. Ru.
ここに提示したトランスジェニックデータは上記ヒトＸＸ雄の部分的性転換のた めのマウスモデルを表している。記載したＸＸトランスジェニックマウスのうち ２匹は明らかに正常な雌であった。これらの事例でＳｒｙが性転換を起こすのに 失敗した理由の最も明解な説明は、トランスジーンの正常な発現が変更されるか または完全に妨げられる染色***置にトランスジーンが組込まれたというもので ある。関与した２匹のマウス系列のＸｘトランスジェニック胚におけるＳｒ７発 現の分析から、この可能性を確認できる。これとは別に、これらの事例のトラン スジーンはＸ染色体に組込まれ、そしてランダムＸ不活性化に付されたという解 釈もできる。これがその事例であるならば、性転換または部分的性転換表現型は 、Ｓｒｙが不活性Ｘ染色体に担持される細胞の割合が少ないトランスジェニック 動物の子孫に現れるか、またはトランスジーンについてホモ接合のマウスを繁殖 させる場合に現れるだろう。The transgenic data presented here is based on the partial sex reversal of the human XX male mentioned above. It represents a mouse model. Of the XX transgenic mice described Two were apparently normal females. Although Sry undergoes a sex change in these cases The most obvious explanation for the failure is whether the normal expression of the transgene is altered. or that the transgene has integrated into a chromosomal location that is completely blocked. be. Sr7 firing in Xx transgenic embryos of the two mouse lines involved. The present analysis confirms this possibility. Apart from this, the transcripts of these cases The theory is that the gene is integrated into the X chromosome and then subjected to random X inactivation. I can also explain it. If this is the case, then the sex reversal or partial sex reversal phenotype is , transgenic cells in which Sry is carried on an inactive X chromosome in a small proportion of cells. Breed mice that appear in the animal's offspring or are homozygous for the transgene It will appear if you let it.
これらの特定のマウスでＳｒｙが作用しなかった他の可能性はタイミングのミス マツチのためであり得る。精巣決定遺伝子の発現開始の時期はその作用にとって 極めて重要であると考えられる。The other possibility that Sry did not work in these particular mice is a timing error. It could be because of Matsuchi. The timing of the start of expression of the testis-determining gene is important for its action. considered to be extremely important.
Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ｐｏｓｃｈｉａｖｉｎｕｓ Ｙ染色体がＣ５７ＢＬ バツクグラウンドにあるときに雄発生を起こすのに失敗した理由は、これらの場 合に精巣決定遺伝子の作用を先取りする、Ｃ５７ＢＬバツクグラウンドと関連し た卵巣決定の初期作用シグナルと関係した、この特定のｄｏｍｅｓ ｔ １ｃｕ ｓ型Ｙ染色体上の精巣決定遺伝子の後期作用対立遺伝子の存在により説明された 。タイミングのミスマツチは、位置効果が胚形成中のＳｒ７発現の開始時期を遅 延させる場合に起こるだろう。かくして、当該遺伝子が発現されるならば、これ らのトランスジェニック動物の系列において発生中のＳｒ７発現の時間的経過を 研究することが重要であるだろう。これらの実験で使用した動物は（ＣＢＡｘＣ ５７ＢＬ）Ｆｌマウス間の交雑により得られたので、性転換に失敗したファウン ダー・トランスジェニック動物は、偶然に、Ｃ５７ＢＬバツクグラウンドと関連 した初期作用卵巣決定シグナルに関係した特定の常染色体対立遺伝子についてホ モ接合であった可能性がある。トランスジーン発現の遅延と関係したこの効果は これらのマウスでの雄発生の失敗を説明できるだろう。これがその事例であるな らば、このバックグラウンドから離れるトランスジーンの繁殖はその活性を現す かもしれない。また、卵巣決定シグナルが作用すると考えられる生殖系列の発生 に対して、精巣決定遺伝子が作用しなければならない生殖***の体細胞部分の発 生を減速させるように、トランスジーンの組込みが遺伝子座を破壊した可能があ る。これもタイミングミスマツチをもたらす効果を有するだろう。このような遅 延効果により引き起こされた性転換の考えはＣａｔｔａｎａｃｈにより当然のこ ととみなされた。最後の可能性は、トランスジーンが組込みの間に再配列された ために、もはや機能しないというものである。詳細なサザン分析は明らかな再配 列を示すだろう。Mus musculus poschiavinus Y chromosome is C57BL The reason for the failure to cause male development when in the background is that these related to the C57BL background, which pre-empts the action of testis-determining genes. This particular domestic t1cu associated with early acting signals of ovarian explained by the presence of late-acting alleles of testis-determining genes on the s-type Y chromosome. . The timing mismatch suggests that position effects delay the onset of Sr7 expression during embryogenesis. This will happen if you postpone it. Thus, if the gene in question is expressed, this The time course of Sr7 expression during development in a line of transgenic animals from It would be important to research. The animals used in these experiments were (CBAxC 57BL) Fawns that failed to undergo sex change because they were obtained by crossbreeding between Fl mice. The transgenic animals happened to be related to the C57BL background. We have identified specific autosomal alleles associated with early-acting ovarian-determining signals. It may have been a mojunction. This effect was associated with a delay in transgene expression. This could explain the failure of male development in these mice. This is a case in point. However, breeding the transgene away from this background reveals its activity. Maybe. In addition, the development of the germline where ovarian decision signals are thought to act On the other hand, the development of the somatic part of the genital ridge on which testis-determining genes must act. Integration of the transgene may have disrupted the locus, slowing down production. Ru. This would also have the effect of causing a timing mismatch. Such slow The idea of sex change caused by the extension effect was taken for granted by Cattanach. was considered to be. A final possibility is that the transgene was rearranged during integration. Therefore, it no longer works. Detailed Southern analysis reveals clear redistribution will show the columns.
これらの実験はヒトＳＲＹがマウスでは機能できないことも示す。精巣形成を促 進できなかった理由を説明する少なくとも３つの可能性がある：（ｉ）ＳＲＹ単 独では十分でない。（ｉｉ）ＳＲＹ遺伝子が全く発現されないか、不適切な時期 に発現される。これは必要な制御要素が導入したＤＮＡに存在しなかったから、 またはＳｒｙ遺伝子発現に必要とされる内因性因子がヒトＳＲＹプロモーター要 素と相互作用するのに失敗したから、であり得る。ヒトＳＲＹ遺伝子がマウス生 殖***および成体精巣において正しく調節されるかどうか調べるために、ヒトＳ ＲＹ遺伝子からの転写を探す研究が進行中である。（ｊｉｉ）ヒトＳＲＹおよび マウスＳｒｙタンパク質の相違が著しく、かくして前者が下流遺伝子と正しく相 互作用できない。Ｂｅｒｔａらのデータは、ＳＲＹタンパク質の明らかに保存さ れた単一アミノ酸の変更がその作用を妨げるのに十分であり、ＸＹ雌ヒト個体を 生じさせることを示唆する。従って、ヒト配列がマウスでその機能を弱めるよう に十分に分岐したとしても驚くにあたらない。ヒトおよびマウスのオープン・リ ーディング、フレームを交換することによりこの仮説を試験することには興味が もてる。These experiments also show that human SRY is unable to function in mice. Promotes testicular formation There are at least three possibilities to explain why progress could not be made: (i) SRY unit Alone is not enough. (ii) SRY gene is not expressed at all or at inappropriate times It is expressed in This is because the necessary control elements were not present in the introduced DNA. Or, the endogenous factors required for Sry gene expression are linked to the human SRY promoter. This could be because it failed to interact with the element. Human SRY gene in mouse To investigate whether it is correctly regulated in the neoplasm and adult testis, human S. Research is underway to search for transcripts from the RY gene. (jii) human SRY and The differences between the mouse Sry proteins are significant, and thus the former is correctly correlated with downstream genes. Cannot interact. The data of Berta et al. show that the SRY protein is clearly conserved. A single amino acid change in the XY female human individual is sufficient to prevent its effect Suggests that it is caused. Therefore, it appears that the human sequence weakens its function in mice. It would not be surprising if they diverged sufficiently. Human and mouse open research It would be interesting to test this hypothesis by swapping frames. Moteru.
性転換を起こすＳｒｙ含有１４ｋｂ断片の能力は、この断片が適切な胚発現に必 要な調節要素を含む全Ｓｒｙ遺伝子を含むことを示唆する。最近、Ｋｏｏｐｍａ ｎらは、Ｓｒ１発現が生殖***分化の時期ごろにｔｉｇｈｔ ｗｉｎｄｏｗで起 こり、生殖***の体細胞成分において発現されると述べた。トランスジェニック 系は、より小さいＳｒｙ含有構築物をマイクロインジェクションで導入すること により、１４ｋｂ断片内にＳｒｙｍ節要素をさらに局在化するために使用するこ とができる。これを行う初期の試みはｐ４． ２． ２（以後４２２）由来の３ ．５ｋｂゲノム断片の使用により始まった。それが当該遺伝子の全構造部分を含 むと仮定して（全長ｃＤＮＡクローンがまだ得られていないので、それは５′ま たは３′末端で非翻訳エキソンを欠失している可能性がある）、この断片が精巣 発生を起こさない理由の最もありそうな説明は、適当なシス作用要素が欠失して いるというものである。これとは別に、４２２のような短い断片は発現の際に組 込み部位効果を非常に受けやすいだろう。そうであるならば、挿入が好適な位置 にあるトランスジェニック動物は性転換を示すことができる。また、Ｓｒｙが十 分でなく、？、４． １には別の遺伝子が存在する可能性もある。それがたった １４ｋｂの長さであり、Ｓｒｙオープン・リーディング・フレームのほかにヒト とマウスの間に他の保存要素がないとすれば、このことはありそうもない。４２ ２についてトランスジェニックの１１．５ｄｐｃＸＸ胚でのトランスジーンから のＳｒ７発現が研究されるであろう。The ability of the Sry-containing 14 kb fragment to undergo sex reversal is due to the fact that this fragment is required for proper embryonic expression. This suggests that it contains the entire Sry gene, including essential regulatory elements. Recently, Koopma n et al. showed that Sr1 expression occurs in a tight window around the time of genital ridge differentiation. He said that it is expressed in the somatic components of the genital ridge. transgenic The system introduces smaller Sry-containing constructs by microinjection. can be used to further localize Srym node elements within a 14 kb fragment. I can do it. An early attempt to do this was p4. 2. 3 derived from 2 (hereinafter 422) ．． It began with the use of a 5 kb genomic fragment. It contains all the structural parts of the gene in question. (Since a full-length cDNA clone has not yet been obtained, it is assumed that the 5' (or an untranslated exon may be deleted at the 3′ end), this fragment may be present in the testis. The most likely explanation for the lack of development is that the appropriate cis-acting elements are missing. There is. Apart from this, short fragments such as 422 are assembled during expression. It will be very susceptible to the crowded site effect. If so, the preferred location for insertion Transgenic animals can exhibit sex reversal. Also, Sry is ten Not minutes? ,4. It is also possible that another gene exists in 1. That's all It is 14kb long, and in addition to the Sry open reading frame, there are This is unlikely given that there are no other storage elements between the mouse and the mouse. 42 From the transgene in 11.5 dpcXX embryos transgenic for 2 The Sr7 expression of will be studied.
Ｓｒ７発現の他の唯一の部位は成体精巣、多分生殖細胞成分である。この１４ｋ ｂ断片が胚生殖腺の体細胞部分での発現から生殖細胞と関連した成体精巣での発 現へのスイッチに必要とされる調節情報をさらに含むかどうか調べることは面白 いだろう。ＸＸトランスジェニック雄は生殖細胞を欠くので、これらのマウスは 成体でのトランスジーン発現の分析にとって有用ではないだろう。The only other site of Sr7 expression is the adult testis, probably a germ cell component. This 14k From the expression of the b fragment in the somatic part of the embryonic gonad to the development in the adult testis associated with germ cells. It would be interesting to see if it contains any further regulatory information required for switching to the current state. Probably. Because XX transgenic males lack germ cells, these mice It will not be useful for analysis of transgene expression in adults.
しかしながら、繁殖によって、ＸＹヒトンスジェニックを得ることはできるだろ う。Ｙ染色体は、それがＳｒｙを欠失し、それ故にもはや雄決定染色体ではない ことを除いて、全ての点で正常に見える。従って、トランスジーンがこの欠陥を 補って雄をもたらすと仮定すると、正常の生殖細胞発生が起こるこれらのマウス の成体精巣でのトランスジーン発現を調べることができるだろう。However, it is possible to obtain XY human genetics through breeding. cormorant. The Y chromosome has lost Sry and is therefore no longer a male-determining chromosome Other than that, everything looks normal. Therefore, the transgene corrects this defect. These mice undergo normal germ cell development, assuming that they complement and produce males. transgene expression in the adult testes of the human body.
実施例４ 精巣決定因子は雄の性決定を開始させるＹ染色体遺伝子によりコードされる。Ｓ ＲＹはヒトＹ染色体の性決定領域にある転写遺伝子である。ＳＲＹが雄の性決定 を開始させるのに関与する精巣決定遺伝子であるならば、いくつかの性転換ＸＹ 雌はこの遺伝子に突然変異を受けていると予測される。ヒトＸＹ雌および正常Ｘ Ｙ雄は１重鎖コンホメーション多型アッセイ（Ｓ Ｓ ＣＰ） ［０ｒｉｔａ、 Ｍ、、 ５ｕｚｕｋｉ、 Ｙ、、 ５ｅｋｉｙａ、 Ｔ、 ａｎｄ ）ｌａｙ ａｓｈｉ、 Ｋ、、 Ｇｅｎｏｍｉｃｓ。Example 4 Testis-determining factors are encoded by Y-chromosome genes that initiate male sex determination. S RY is a transcribed gene located in the sex-determining region of the human Y chromosome. SRY determines male sex If it is a testis-determining gene involved in initiating the Females are predicted to have a mutation in this gene. Human XY female and normal X Y males were subjected to single-chain conformational polymorphism assay (SSCP) [0rita, M,, 5uzuki, Y, 5ekiya, T, and)lay ashi, K., Genomics.
５： ８７４−８７９ （１９８９）； ０ｒｉｔａ、Ｍ、、 ［ｗａｈａｎａ 、Ｈ，、Ｋａｎａｚａｗａ、Ｈ，。5: 874-879 (1989); 0rita, M., [wahana ,H., ,Kanazawa, H.
Ｈａｙａｓｈｉ、 Ｋ、 ａｎｄ ５ｅｋｉｙａ、 Ｔ、、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａ ｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＬＩＳＡ、 ８６： ２７６６−２２７０ （ １９８９）コおよびその後のＤＮＡ配列解析を使って、ＳＲＹの変異について試 験した。１人のＸＹ雌のＳＲＹ遺伝子に新たな突然変異が見つかった。この変異 は患者の正常な父親および兄第には存在しなかった。第２の変異型が別のＸＹ雌 のＳＲＹ遺伝子に見つかったが、この家族では父親が同じ変異を共有していた。Hayashi, K, and 5ekiya, T, Proc, Na tl, Acad, Sci, LISA, 86: 2766-2270 ( (1989) and subsequent DNA sequence analysis to test for mutations in SRY. I tried it. A new mutation was found in the SRY gene in one XY female. This mutation was absent in the patient's normal father and older brother. The second variant is another XY female was found in the SRY gene, but the father in this family shared the same mutation.
家族的事例の変異型は偶然にもその家族と関連するのか、または性転換を起こし やすいのかもしれない。性転換と関係した新たな変異は、ＳＲＹが雄の性決定に 必要であるという興味をそそる証拠を提供する。Is the variant in a familial case coincidentally related to the family member or has sex reassignment? It might be easy. A new mutation associated with sex reversal suggests that SRY plays a role in male sex determination. Provide tantalizing evidence that it is necessary.
性を決定することが知られたヒトＹ染色体の最小部分は、偽書染色体境界に隣接 して存在する３５ｋｂのＹ特異的配列である。The smallest portion of the human Y chromosome known to determine sex is adjacent to the pseudochromosomal boundary It is a 35 kb Y-specific sequence that exists as
この領域内にいくつかのオーブン・リーディング・フレームが見いだされた。こ れらのうちで最大のものが遺伝子ＳＲＹを規定する。相同遺伝子Ｓｒｙはマウス Ｙ染色体の性決定領域に存在し、もはや性決定を行わない突然変異Ｙ染色体から 欠失されている。Several oven reading frames were found within this region. child The largest of these defines the gene SRY. Homologous gene Sry is mouse From a mutant Y chromosome that exists in the sex-determining region of the Y chromosome and no longer determines sex. It has been deleted.
ＳＲＹ遺伝子はさらに、試験した全ての真獣下綱の動物においてＹ染色体の位置 を含めて精巣決定遺伝子に期待される性質の多くを備えており、精巣形成の直前 にマウス生殖***の体細胞において発現される。ＳＲＹが精巣決定遺伝子である という公式の証明は、ＳＲＹの突然変異が性決定に影響を与えることを示すこと により得られる。本研究では、我々は性転換ヒトＸＹ雌におけるＳＲＹを研究し た。The SRY gene is also located on the Y chromosome in all eutherian animals tested. It has many of the properties expected of a testis-determining gene, including It is expressed in the somatic cells of the mouse genital ridge. SRY is the testis-determining gene This official proof shows that mutations in SRY affect sex determination. It is obtained by In this study, we investigated SRY in transsexual human XY females. Ta.
ＸＹ雌での性転換は精巣決定および分化経路の失敗により生じる。性器発育異常 のＸＹ雌は家族的集団に時折または稀に生じる［Ｎａｚａｒｅｔｈ、 Ｍ、Ｒ， Ｓ、 ｅｔ ａｌ、、 Ａｍ、 Ｊ、 Ｍｅｄ、 Ｇｅｎｅｔ、、 ３： １４ ９−１５４（１９７９）； Ｓｉｍｐｓｏｎ、 Ｊ、Ｌ、、 Ｂｌａｇｏｗｉｄ ｏｗ、 Ｎ、 ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎ、 Ａ、、 Ｈｕｍ。Sex reversal in XY females occurs due to failure of testicular determination and differentiation pathways. Abnormal genital development XY females occur occasionally or infrequently in familial groups [Nazareth, M, R, S, et al, Am, J, Med, Genet, 3: 14 9-154 (1979); Simpson, J.L., Blagowid ow, N., and Martin, A., Hum.
Ｇｅｎｅｔ、、 ５８： ９１−９７ （１９８１）コ。一部のＸＹ雌は性染色 体間の末端交換［Ｌｅｖｉｌｌｉｅｒｓ、 Ｋ、、 Ｑｕａｃｋ、 Ｂ、、 Ｗ ｅｉｓｓｅｎｂａｃｈ、 Ｊ、 ａｎｄ Ｐｅｔｉｔ。Genet, 58: 91-97 (1981). Some XY females are sex dyed Interbody terminal exchange [Levilliers, K., Quack, B., W. Eissenbach, J., and Petit.
Ｃ，、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、 ８６： ２２ ９６−２３００ （１９８９）］により、または他の欠失［Ｐａｇｅ、 Ｄ、Ｃ ，、Ｆｉｓｈｅｒ、 Ｂ、Ｍ、Ｃ，、ＭｃＧｉｌｌｉｖａｒｙ、 Ｂ、 ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ、 Ｌ、Ｇ、、 Ｎａｔｕｒｅ、 ３４６： ２７９−２８１ （ １９９０）コにより性決定領域を失っている。時々起こる非欠失事例は精巣決定 遺伝子に起こりうる突然変異と判断され、そして家族的事例は精巣決定遺伝子と 直接または間接的に相互作用する遺伝子の常染色体またはＸ連鎖突然変異と判断 された［Ｇｅｒｍａｎ、 Ｊ、、 ｅｔ ａｌ、、 ５ｃｉｅｎｃｅ、 ２０２ ： ５３−５６ （１９７８）］。C,, Proc, Natl, Acad, Sci, USA, 86: 22 96-2300 (1989)] or by other deletions [Page, D, C , , Fisher, B, M, C, , McGillivary, B, and Brown, L. G., Nature, 346: 279-281 ( (1990) has lost its sex-determining region due to ko. Occasional non-deletion cases are testicularly determined It has been determined that this is a possible mutation in the gene, and familial cases have been linked to the testis-determining gene. Judging to be an autosomal or X-linked mutation in directly or indirectly interacting genes [German, J., et al., 5science, 202 : 53-56 (1978)].
ＳＲＹ配列はＸＹ雌の時々起こる事例と家族的事例および正常雄対照のコレクシ ョンから、ＳＲＹオープン・リーディング・フレーム内に存在するプライマーＸ ＥＳ７およびＸＥＳ２を使ってＰＣＨにより増幅し、６０９ｂｐ断片を増幅した 。プライマー配列は： ＸＥＳ７，５’ ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＣＡＡＴＧＣＡＡＴＣＡＴＡＴＧＣＴ ＴＣＴＧＣ−３’ ；ＸＥＳ２． ５’ −ＣＴＧＴＡＧＣＧＧＴＣＣＣＧＴＴ ＧＣＴＧＣＧＧＴＧ−３’である。ＰＣＲは約ｔｏｏｎｇのゲノムＤＮＡ、 ２ ００ μＭ 各ｄＮＴＰ、０゜５μＭ 各プライマー、１．５ｍＭ ＭｇＣＩ２ ．１０ｍＭ トリス（ｐＨ８，３）、５０ｍＭ ＫＣＩ、０．０１％（ｗ／ｖ） ゼラチン、０．２５０のＴａｑポリメラーゼおよび０，５μｌのＣａ−”Ｐ）ｄ ＣＴＰ （３００ＱＣｉ／ｍｍｏ １．１０ｍＣｉ／ｍｌ）を用いて１０μｍの 容量中で行った。反応は９４℃で１゜２分間、６５℃で１．２分間および７２℃ で２分間行い、これを３５回繰り返した。The SRY sequence is a collection of occasional and familial cases of XY females and normal male controls. Primer X present within the SRY open reading frame Amplified by PCH using ES7 and XES2 to amplify a 609bp fragment. . The primer sequence is: XES7, 5' CCCGAATTCGACAATGCAATCATATGCT TCTGC-3'; XES2. 5’-CTGTAGCGGTCCCGTT GCTGCGGTG-3'. PCR uses about too long genomic DNA, 2 00μM each dNTP, 0゜5μM each primer, 1.5mM MgCI2 ．． 10mM Tris (pH 8,3), 50mM KCI, 0.01% (w/v) gelatin, 0.250 Taq polymerase and 0.5 μl Ca-”P)d 10μm using CTP (300QCi/mmo 1.10mCi/ml) It was done in capacity. The reaction was carried out at 94°C for 1°2 minutes, at 65°C for 1.2 minutes and at 72°C. This was repeated 35 times for 2 minutes.
ＩμＩの生成物は１０μ】の容量中４ｍＭスペルミジン塩酸塩の存在下にＨｉｎ ｆＩとＴａｑＩで消化した。消化ＤＮＡを０９１％ ＳＤＳ、１０ｍＭ ＥＤＴ Ａで１：１０に希釈し、次いで９５％ホルムアミド、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０． ０５％ブロモフェノールブルー、０．０５％キシレンシアツールでｌ：２に希釈 した。１−３μｍの試料を８０℃で５分間加熱してＤＮＡを変性し、その後シー クエンジングーゲル装置を使って６％アクリルアミド、１０％グリセロール非変 性ゲルに負荷した。電気泳動は、冷却装置としてゲルに向けたファンヒーター（ 冷却にセット）を使って、２５ｍＡで行った。乾燥ゲルのオートラジオグラフィ ーを増感スクリーンを使わずに３日間行い、１末鎖□フンホメーション条里ｃｓ ｓ ｃ ｐ）を検出した。全部で１１のＸＹ雌個体を５ＳＣＰで試験した。こ れらの個体（ＰＦ、ＪＡ、ＡＭ、ＲＢ、ＧＭ２５９８、ＡＳ、Ｍ、ＡＡ、ＩＤ、 ＪＮおよびＫＬは全て性器発育異常を有する）は抜型が正常であり、Ｙ偽書染色 体境界およびＺＦＹの両方について陽性である。ＡＡとＪＮは共に純粋な性器発 育異常を有する。５０の正常雄個体を対照として試験し、変異を全く検出しなか った。こうして、３つのパターンが検出された：５０の正常雄対照および患者試 料の大部分に共通する第１のパターン；ＸＹ雌個体（ＡＡ）に関する第２のパタ ーン；およびＸＹ雌（ＪＮ）に関する第３のパターン。（ＡＡ）の父親と正常な 兄第を試験し、対照と同じパターンを与えることが判明し、これは（ＡＡ）が新 たな変異を受けたことを示唆する。これに対して、父親（Ｎ）と彼のＸＹ娘（Ｊ Ｎ）からのＤＮＡは同じパターンを示した。プライマーＸＥＳ−７およびＸＥＳ −２を使って６０９ｂｐ領域を増幅させた。ＰＣＲ産物はｐＵｃ１８ベクター（ ＮＥＢ）にサブクローニングし、合成オリゴヌクレオチドブライマーおよび５ｅ ｑｕｅｎａｓｅ （Ｕ Ｓ Ｂ ）を使ってジデオキシ・チェイン、ターミネー ション法＋７により２本鎖Ｄ Ｎ Ａとして配列決定を行った。増幅産物全体の 配列を決定したが、ＸＹ雌において変化を含む小領域だけを図２１に示してあり 、ゲノムクローンｐ’Ｙ５３．３ （ＳＲＹ）のオーブン・リーディング・フレ ームが３５４ｂｐから１０２２ｂｐまで延びていることが分かる。可能なりＮＡ 結合タンパク質をコードする保存モチーフは５８２ｂｐから８２１ｂｐにまで及 ぶ。破線は示したヌクレオチド配列のオーブン・リーディング・フレーム内の位 置を示す。図２１の上段の配列ラインは矢印で示したＧからＣへの塩基変化を有 するＸＹ雌（ＪＮ）のヌクレオチド配列を示す。中央ラインは正常な雄のＳＲＹ ヌクレオチド配列を示す。下段ラインは矢印で示したＧからＡへの塩基変化を有 するＸＹ雌（ＡＡ）のヌクレオチド配列を示す。The product of IμI was diluted with Hin in the presence of 4mM spermidine hydrochloride in a volume of 10μ. Digested with fI and TaqI. Digested DNA in 091% SDS, 10mM EDT Diluted 1:10 with A, then 95% formamide, 20mM EDTA, 0. 05% bromophenol blue, diluted 1:2 with 0.05% xylene cyatool did. Heat a 1-3 μm sample at 80°C for 5 minutes to denature the DNA, then seal it. 6% acrylamide, 10% glycerol unmodified using a Quenzi Gugel apparatus. loaded onto a sexual gel. Electrophoresis uses a fan heater ( (set to cooling) at 25 mA. Autoradiography of dried gels - was carried out for 3 days without using an intensifying screen, and the 1-terminal chain □ Funhomemation Jori CS scp) was detected. A total of 11 XY females were tested with 5SCP. child These individuals (PF, JA, AM, RB, GM2598, AS, M, AA, ID, JN and KL (all with genital development abnormalities) have normal cutting molds and Y pseudograph staining. Positive for both body border and ZFY. AA and JN both have pure genital origin. Has abnormal growth. 50 normal male individuals were tested as controls and no mutations were detected. It was. Thus, three patterns were detected: 50 normal male control and patient samples. The first pattern common to most of the specimens; the second pattern regarding XY females (AA) and a third pattern for XY females (JN). (AA) father and normal The older brother was tested and found to give the same pattern as the control, indicating that (AA) was the new This suggests that it has undergone several mutations. On the other hand, the father (N) and his XY daughter (J DNA from N) showed the same pattern. Primers XES-7 and XES -2 was used to amplify a 609 bp region. The PCR product was transferred to the pUc18 vector ( NEB), synthetic oligonucleotide primer and 5e Dideoxy chain and termination using quenase (USB) The sequence was determined as a double-stranded DNA using the tion method +7. of the entire amplified product. The sequence was determined, but only the small region containing the change in the XY female is shown in Figure 21. , oven-reading frame of genomic clone p'Y53.3 (SRY) It can be seen that the frame extends from 354 bp to 1022 bp. Possible NA The conserved motif encoding the binding protein extends from 582 bp to 821 bp. Bu. Dashed lines indicate positions within the open reading frame of the indicated nucleotide sequences. Indicates the location. The sequence line in the upper row of Figure 21 has a base change from G to C indicated by an arrow. The nucleotide sequence of the XY female (JN) is shown. The center line is a normal male SRY. The nucleotide sequence is shown. The lower line has the base change from G to A indicated by the arrow. The nucleotide sequence of the XY female (AA) is shown.
図２２には、ヒト−Ｙ、ウサギ−Ｙ１マウス−ＹのＳＲＹおよびマウス常染色体 ＳＲＹ様遺伝子ａＬａ２、ａ３、ａ４のアミノ酸配列が示しである。ボックスで 囲った領域はこれらの種において保存された同一のアミノ酸を示す。ＸＹ雌（Ｊ Ｎ）では、変異がバリンからロイシンへの変化を引き起こすが、ＸＹ雌（ＡＡ） では変異がメチオニンからインロイシンへの変化を引き起こす（図２１）。５Ｓ ＣＰアツセイで予測されたように、（ＡＡ）は彼女の父親および兄弟と共有しな い新たな変異（Ｇ→Ａ）を有する。家族的事例では、変異（Ｇ−＋Ｃ）が（ＪＮ ）と彼女の父親によって共有されていた。これらの観察された塩基変化を除いて 、ＸＹ雌（ＪＮ）および（ＡＡ）は増幅された６０９ｂｐにわたってＳＲＹと完 全に同一の配列を有していた。両家族の父系はミニサテライトプローブを用いた サザンブロッティングにより確認した［Ｗｏｎｇ、 Ｚ、、 Ｗｉｌｓｏｎ、 Ｖ、、 Ｐａｔｅｌ、 １．、 Ｐｏｖｅｙ、 Ｓ、 ａｎｄ Ｊｅｆｆｒｅｙ ｓ、 Ａｊ、、 Ａｎｎ、 Ｈｕｍ、 Ｇｅｎｅｔ、、 ５１： ２６９−２８ ８ （１９７８）； Ｗｏｎｇ、 Ｚ、、 Ｗｉｌｓｏｎ、 Ｖ、、 Ｊｅｆｆ ｒｅｙｓ、 Ａ、Ｊ、 ａｎｄ Ｔｈｅｉｎ、 Ｓ、Ｌ、、 Ｎｕｃ、 Ａｃ１ ｄｓ Ｒｅｓ、。Figure 22 shows human-Y, rabbit-Y1 mouse-Y SRY and mouse autosomes. The amino acid sequences of SRY-like genes aLa2, a3, and a4 are shown. in the box Boxed regions indicate identical amino acids conserved in these species. XY female (J In N), the mutation causes a change from valine to leucine, but in XY females (AA) The mutation causes a change from methionine to inleucine (Figure 21). 5S As predicted in the CP assessment, (AA) will not share with her father and siblings. It has a new mutation (G→A). In familial cases, the mutation (G-+C) is (JN ) and her father. Except for these observed base changes , XY females (JN) and (AA) are complete with SRY over the amplified 609 bp. They had completely identical sequences. The paternal lineage of both families was determined using minisatellite probes. Confirmed by Southern blotting [Wong, Z., Wilson, V., Patel, 1. , Povey, S., and Jeffrey s, Aj, , Ann, Hum, Genet, 51: 269-28 8 (1978); Wong, Z., Wilson, V., Jeff reys, A, J, and Thein, S, L,, Nuc, Ac1 ds Res,.
１４： ４６０５−４６１６ （１９８６）］。14: 4605-4616 (1986)].
（ＡＡ）における新たな変異は、ＳＲＹの推定ＤＮＡ結合モチーフ内にあって全 てのＳＲＹおよびＳＲＹ関連遺伝子において同一である残基メチオニンからイン ロイシンへの保存的変化を起こす（図２２）。新たな変異と新たな表現型とを関 連づけると、表現型と変異が関係しており、推測ではＳＲＹが雄の性決定に必要 であるという証拠が得られる。公式には、Ｙ染色体上の他の遺伝子が性決定に必 要であるとする可能性を排除しないが、以前の研究は、それらが存在するならば 、これらの遺伝子はＳＲＹに近接して、偽書染色体境界に隣接して位置しなけれ ばならないことを示唆する［Ｐａ１ｗ＋ｅｒ、 Ｍ、Ｓ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｎ ａｔｕｒｅ、 ３４２： ９３７−９３９ （１９８９）］。The new mutation in (AA) is within the putative DNA-binding motif of SRY and all from the residue methionine, which is identical in all SRY and SRY-related genes. A conservative change to leucine occurs (Figure 22). The relationship between new mutations and new phenotypes When combined, the phenotype and mutation are related, and it is speculated that SRY is necessary for male sex determination. There is evidence that this is the case. Officially, other genes on the Y chromosome are required for sex determination. Although not excluding the possibility that they are important, previous research suggests that if they exist, , these genes must be located close to SRY and adjacent to pseudochromosomal boundaries. [Pa1w+er, M, S, et al,, N ture, 342: 937-939 (1989)].
家族的事例で見られた変異型はバリンからロイシンへの保存的変化を引き起こす （図２２）。この残基は、マウス常染色体遺伝子（常染色体−４）がこの位置に イソロイシンへの保存的変化を有することを除いて、ＳＲＹおよびＳＲＹ関連配 列の間で保存されている。家族的事例で見られた変異型についての可能な解釈が いくつかある。第一は、この変異型は他の遺伝または環境因子に依存して条件付 き性転換を起こすことがあり得るというものである。同様の観察がマウスの場合 に記載され、その場合、精巣決定遺伝子の一部の対立遺伝子の精巣形成を誘導す る能力が遺伝的バックグラウンドに左右される［Ｅｉｃｈｅｒ、 Ｅ、Ｍ、 ａ ｎｄ Ｗａｓｈｂｕｒｎ、 Ｌ、Ｌ。Variants seen in familial cases cause conservative changes from valine to leucine (Figure 22). This residue is located at this position in a mouse autosomal gene (autosome-4). SRY and SRY-related sequences, except with a conservative change to isoleucine. saved between columns. Possible interpretations of variants seen in familial cases There are several. First, this variant is conditional depending on other genetic or environmental factors. It is possible that a change in sex may occur. A similar observation is made in mice in which some alleles of testis-determining genes induce testis formation. The ability to nd Washburn, L.L.
、 Ａｎｎ、 Ｒｅｖ、 Ｇｅｎｅｔ、、 ２０： ３２７−３６０ （１９８ ６）］。第二は、コノ変異型は常染色体またはＸ連鎖性転換遺伝子について分離 する家族に偶然見られることがあるというものである。最後は、この変異型が性 転換を起こすことがあり得、父親は野生型と変異配列のモザイクであるだろうと いうものである。, Ann, Rev. Genet, 20: 327-360 (198 6)]. Second, the Kono variant segregates for autosomal or X-linked transgenic genes. It is said that it is sometimes seen by chance in a family who does. Finally, this mutant type conversion could occur and the father would be a mosaic of wild type and mutant sequences. That's what I mean.
試験したＸＹ雌の大多数のＳＲＹ遺伝子は５ｓｃｐアツセイで正常なように見え る。これらの個体はこのアッセイにより検出されないＳＲＹの変異をもっている 可能性があり、それらはバンドシフトを起こさないか、または試験した領域の外 側にあるので検出されないと考えられる。また、これらの個体は性決定経路の別 の部分に変異をもつかもしれない。The SRY gene in the majority of XY females tested appeared normal in the 5scp assay. Ru. These individuals have mutations in SRY that are not detected by this assay. They may not undergo a band shift or may be outside the region tested. Since it is on the side, it is thought that it will not be detected. In addition, these individuals have different sex determination pathways. There may be variations in this part.
結論として、遺伝子ＳＲＹにおける新たな変異はＸＹ雌での性転換と関連してい る。これはＳＲＹが精巣形成および雄の性決定に必要であるという興味をそそる 証拠を提供する。In conclusion, new mutations in the gene SRY are associated with sex reversal in XY females. Ru. This raises the intriguing possibility that SRY is required for testis formation and male sex determination. provide evidence.
実施例５ トランスジェニックマウス胚の性転換 受精卵にＳｒｙ遺伝子配列をマイクロインジェクションで導入し、偽妊娠レシピ エンドに移入し、そして得られた胚を、妊娠期間の満了まで発生させることなく 、移入後１４日目に分析した。Example 5 Sex reversal of transgenic mouse embryos Introducing the Sry gene sequence into fertilized eggs by microinjection to create a pseudopregnancy recipe and the resulting embryos are allowed to develop until the end of the gestation period. , analyzed 14 days after transfer.
生殖***からの精巣発生の肉眼で見える最初の徴候はマウスでは１２．４ｄｐｃ ごろの精巣索の形成である。これはセルトーり細胞の分化および生殖細胞を取り 囲む上皮構造へのそれらの整合によるものである［Ｊｏｓｔ、 Ａ、 ＆ Ｍａ ｒｇｅ、 Ｓ、 Ｐｈ１１． Ｔｒａｎｓ、 Ｒ，Ｓｏｃ。The first visible signs of testicular development from the genital ridge occur at 12.4 dpc in mice. This is the formation of the testicular cord. This involves cell differentiation and germ cell differentiation. This is due to their alignment to the surrounding epithelial structures [Jost, A., & Ma. rge, S, Ph11. Trans, R, Soc.
Ｌｏｎｄ、、 ３２２．５５−６１ （１９８８）コ。精巣素形成は発生する精 巣に特徴的な縞模様の外観を与え、これにより胎児卵巣と精巣とを区別し得る。Lond, 322.55-61 (1988). Testicular formation is the sperm that develops. It gives the nest a characteristic striped appearance, which can distinguish the fetal ovary from the testis.
精巣に特徴的な他の形態学的変化はその急速な成長と顕著な脈管構造である。部 分的性転換の場合でさえ精巣索形成が明らかな時期で卵管移入後１４日目ごろの 胎児の検査［Ｅｉｃｈｅｒ、 Ｅ、 Ｍ、 Ｐｈ１１． Ｔｒａｎｓ、 Ｒ，Ｓ ｏｃ、 Ｌｏｎｄ、、 ３２２．１０９−１１８ （１９８８）およびＥｉｃｈ ｅｒ。Other morphological changes characteristic of the testis are its rapid growth and prominent vasculature. Department Even in the case of partial sex reversal, testicular cord formation is obvious, around 14 days after oviduct transfer. Fetal examination [Eicher, E, M, Ph11. Trans, R, S oc, Lond, 322.109-118 (1988) and Eich Er.
Ｅ、Ｍ、ｅｔ ａｌ、、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ、Ｃｅ１１． Ｇｅｎｅｔ、、２８ ． １０４−１１５ （１９８０）コは、表現型性の迅速アッセイにあたる。染 色体性の指標は羊膜細胞テノ性染色質の染色により得られた［Ｍｏｎｋ、 Ｍ ＆ ＭｃＬａｒｅｎ、 Ａ、。E, M, et al., Cytogenet, Ce11. Genet, 28 ．． 104-115 (1980) is a rapid phenotypic assay. dyed An index of chromosomal character was obtained by staining amniotic cell tenochromatin [Monk, M. & McLaren, A.
Ｊ、 Ｅｍｂｒｙｏｌ、 Ｅｘｐ、 Ｍｏｒｐｈ、、 ６３．７５−８４ （１ ９８１）コ。必要な場合は、Ｙ連鎖遺伝子ＺｆＹ−１から誘導されたＤＮＡプロ ーブまたはオリゴヌクレオチドプライマーを使ってサザン分析またはＰＣＨによ り確認した［Ｍａｒｄｏｎ、 Ｇ、 ｅｔ ａｌ、、 ５ｃｉｅｎｃｅ、 ２４ ３．７８−８０ （１９８９）； Ｎａｇａｍｊｎｅ、 Ｃ，Ｍ、 ｅｔ ａｌ 、、 Ｎａｔｕｒｅ、 ２４３．８０−８３ （１９８９）およびＫｏｏｐｍａ ｎ Ｐ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ、 ３４２．９４０−９４２ （１９ ８９）］。J, Embryol, Exp, Morph, 63.75-84 (1 981) Ko. If necessary, a DNA protein derived from the Y-linked gene ZfY-1 by Southern analysis or PCH using probes or oligonucleotide primers. [Mardon, G. et al., 5science, 24] 3.78-80 (1989); Nagamjne, C, M, et al , Nature, 243.80-83 (1989) and Koopma nP, et al, Nature, 342.940-942 (19 89)].
Ｓｒｙの推定ＤＮＡ結合ドメインの５′側の８ｋｂ配列と３′側の５ｋｂ配列を 含むファージクローンＬ７４１から誘導された１４ｋｂ断片（図２３）はベクタ ー配列から精製し、トランスジェニックマウスを作製するために使用した。図２ ３はマウスＳｒｙ断片７４１およびヒトＳＲＹ断片Ａ［コスミドｃＡＭＦから単 離した； Ｅｌｌｉｓ、 Ｎ、Ａ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ、 ３３７ ．８１−８４ （１９８９）］の制限地図を示し、これらは次の制限エンドヌク レアーゼを用いて示される：Ｂ、ＢａｍＨＩ ；Ｅ、ＥｃｏＲＩ ；Ｈ，Ｈｉｎ ｄＩ［およびＳ、５ａｌＩ。断片のサイズはｋｂで示しである。保存されたＳｒ ｙ／ＳＲＹオーブン・リーディング・フレームは陰影を付けたボックスで示され る。オーブン・リーディング・フレームの方向は２つのクローンの上に示しであ る。ヒト偽書染色体境界の位置は矢印で示され、偽書染色体領域はこの地点の右 側である。ＰＣＲ分析に使用したオリゴヌクレオチドブライマーの位置（図２５ および２７に関して記載した）は三角で示される。The 8 kb sequence on the 5' side and the 5 kb sequence on the 3' side of the putative DNA binding domain of Sry were The 14kb fragment (Figure 23) derived from phage clone L741 containing vector - Purified from the sequence and used to generate transgenic mice. Figure 2 3 is mouse Sry fragment 741 and human SRY fragment A [single fragment from cosmid cAMF]. Released; Ellis, N, A, et al, Nature, 337 ．． 81-84 (1989)] and these are the following restriction endpoints. Indicated using lyase: B, BamHI; E, EcoRI; H, Hin dI [and S, 5alI. Fragment sizes are given in kb. Saved Sr The y/SRY oven reading frame is indicated by a shaded box. Ru. The orientation of the oven reading frame is shown above the two clones. Ru. The location of the human pseudochromosomal boundary is indicated by an arrow, and the pseudochromosomal region is to the right of this point. It's on the side. Position of oligonucleotide primers used for PCR analysis (Figure 25 and 27) are indicated by triangles.
５ＲＹ−または５ｒｙ−含有断片を適当な制限酵素での消化によりコスミドまた はファージベクターから放出させ、アガロースゲル電気泳動により単離し、次の ３つの方法の１つでさらに精製した： （ｉ）製造者の説明書に従うＧｅｎｅｃ ｌｅａｎ （Ｂｊｏｌｏｌ）； （Ｈ）フェノール抽出、セファデックス０５０ カラムクロマトグラフイーおよびエタノール沈殿； （ｉｉｉ） Ｇｅｎｅｃｌ ｅａｎとこれに続＜ Ｅｌｕｔｉｐ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ ５ｃｈｕｅ１ １）およびエタノール沈殿。5RY- or 5ry-containing fragments are digested with appropriate restriction enzymes to create cosmids or was released from the phage vector, isolated by agarose gel electrophoresis, and then Further purification was performed in one of three ways: (i) Genec according to manufacturer's instructions; lean (Bjolol); (H) Phenol extraction, Sephadex 050 Column chromatography and ethanol precipitation; (iii) Genecl ean and following this< Elutip(Schleicher & 5chue1 1) and ethanol precipitation.
トランスジェニックマウスは本質的に“Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍ ｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ ” （Ｈｏｇａｎ Ｂ、、 Ｃｏｎｔａｎｔｉｎ４． Ｆ、 ＆ Ｌａｃｙ、 Ｅ、） （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 １９８６）に記載される通り に作製した。簡単に説明すると、３−５週齢（ＣＢＡｘＣ５７ＢＬ／１０）Ｆｌ 雌を過剰***させ、繁殖用のＦｌ雄と交配させた。Transgenic mice are essentially “Manipulating the M ouse Embryo” (Hogan B,, Contantin4. F, & Lacy, E,) (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1986) It was created in Briefly, 3-5 week old (CBAxC57BL/10) Fl Females were superovulated and mated with breeding Fl males.
翌日、膣栓を示す雌の卵管から受精卵を集めた。約２０ｇ／ｍｌの濃度で１−２ １）ｌのＤＮＡを前核にマイクロインジェクションで導入した。卵をＭ１６また はＴ６培地で一夜インキユベートし、２細胞胚を卵管移入により偽妊娠レシピエ ンドに移植した。この断片の導入後全部で１５８の胚が得られた（以後ｆ７４１ と呼ぶ）。The next day, fertilized eggs were collected from the oviducts of females exhibiting vaginal plugs. 1-2 at a concentration of about 20g/ml 1) 1 of DNA was introduced into the pronucleus by microinjection. M16 eggs were incubated overnight in T6 medium, and 2-cell embryos were transferred into pseudopregnant recipients by oviduct transfer. ported to India. A total of 158 embryos were obtained after introduction of this fragment (hereafter f741 ).
（本頁以下余白） 表１の説明 導入した胚は移入後１４日目に検査した。胚は次の方法で分析した：羊膜細胞に おいて性染色質を染色することにより染色体性（ＸＸまたはＸＹ／ＸＯ）を決定 した［Ｍｏｎｋ、 Ｍ ＆ ＭｃＬａｒｅｎ、 Ａ、。(Margins below this page) Explanation of Table 1 The transferred embryos were examined 14 days after transfer. Embryos were analyzed in the following way: into amniotic cells. Determine chromosomal sex (XX or XY/XO) by staining sex chromatin in [Monk, M. & McLaren, A.
Ｊ、 Ｅｍｂｒｙｏｌ、 Ｒｘｐ、 Ｍｏｒｐｈ、 ６３．７５−８４ （１９ ８１）］。トトランスジーンスはＳｒｙのサザンプロットまたはＰＣＲ検出によ り検定し、Ｙ染色体の有無はＺｆｙ遺伝子配列の同様のアッセイから判定した。J, Embryol, Rxp, Morph, 63.75-84 (19 81)]. Transgenes were detected by Southern blot or PCR detection of Sry. The presence or absence of the Y chromosome was determined from a similar assay of the Zfy gene sequence.
サザン分析用のゲノムＤＮＡは肢から調製した。ＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡのサザン 分析は“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｊｎｇ″（Ｍａｎｉａｔｉｓ、 Ｒ、、 Ｆｒ１ｔｓｃｈ、 Ｅ、Ｆ、 ＆ Ｓａｍｂｒｏｏｋ、 Ｊ、） （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 １９８２）に記載されるように行った。Ｓｒｙについては、Ｓｒｙ保存モチーフ を含むクローン４２２．０４を使ってプロットを検索した。ＺｆＹ遺伝子につい ては、Ｚｆｙ−１ジンクフインガードメインを含む１．９ｋｂのＨｉｎｄＩ［Ｉ ゲノム断片［Ｋｏｏｐｍａｎ、 Ｐ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ、 ３４ ２．９４０−９４２ （１９８９）コをプローブとして使用した。ＰＣＲ分析の 場合は、プロティナーゼに消化を１ｍＭ ＥＤＴＡ中で行い、ＤＮＡをフェノー ル／クロロホルムで１度抽出し、少量の試料をＰＣＲ反応混合物に直接加えた。Genomic DNA for Southern analysis was prepared from the limbs. Southern analysis of EcoRI-digested DNA The analysis was performed using “Molecular Clonjng” (Maniatis, R., Fr1tsch, E, F, & Sambrook, J,) (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (1982). For Sry, the Sry conserved motif Plots were searched using clone 422.04 containing . About ZfY gene The 1.9 kb HindI[I Genome fragment [Koopman, P. et al., Nature, 34 2.940-942 (1989) was used as a probe. PCR analysis If necessary, perform proteinase digestion in 1mM EDTA to phenolate the DNA. Extracted once with L/chloroform and added a small amount of sample directly to the PCR reaction mixture.
ＰＣＲ分析は図２５に関して記載するように行った。表現型性は精巣または卵巣 の発生を評価することにより決定した。結果を以下の表１に示す。ｘＯ子孫の頻 度は以前の研究と一致した［Ｒｕ５ｓｅｌｌ、 Ｌ、Ｂ、、 ”Ｃｈｅｍｉｃａ ｌ ｍｕｔａｇｅｎｓ、 Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆ 。PCR analysis was performed as described with respect to FIG. Phenotypic: testicular or ovarian This was determined by evaluating the occurrence of The results are shown in Table 1 below. Frequency of xO offspring The degree was consistent with previous studies [Ru5sell, L, B,,” l mutagens, Pr1nciples and methods f .
ｒ ｔｈｅｉｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ”、 Ｖｏｌ、 ４ （Ｈｏｌｌａｅｎｄ ｅｒ、 Ａ、編集） ５５−９１ （Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、 Ｎｅｗ Ｙ ｏｒｋ、 Ｌｏｎｄｏｎ １９７６）］。ＸＸトランスジエネシスの４例におい て、Ｓｒｙシグナルと対照雄のそれとの比較はトランスジーンについてモザイク 現象を示した。最後の２つの胚はトランスジェニック胚が得られたことを示す。r their detection”, Vol, 4 (Hollaend er, A, editor) 55-91 (Plenum Press, New Y ork, London 1976)]. In 4 cases of XX transgenesis Therefore, the comparison of the Sry signal with that of control males shows that there is a mosaic for the transgene. demonstrated the phenomenon. The last two embryos indicate that transgenic embryos were obtained.
マウスクローン７４１トランスジエエックスの胚分析データの要約胚。数 性染 色質ｓｔｙ ｚｂ ｍｖｔ！１型 トラン１’）エニｔｌ 表現型性６３ ＋ −２７−／４ＯＮＤ ＸＸ ９２フ ＋ ＋ ＸＹ トロ〕 ♂ ５８ ＮＤ ＮＤ ＸＹ ＮＤ ♂ 胚の大部分は、はぼ等しい割合で、ＸＸ雄またはＸＸ雌であった。しかしながら 、２つの場合（ｍ７．２２およびｍ１０．２）に、性染色質がＸＹ性染色体構成 ではなくＸＸを示した胚に精巣が見られた。サザン分析により、これらは両方と もＺｆｙ配列を欠失し、多コピーのＳｒｙを有するトランスジェニックであるこ とが分かった（図２４ａ）、Ｚｆｙ−１およびＺｆｙ−２を認識するプローブへ のハイブリダイゼーションの欠如はＹ染色体の不存在を示し、一方Ｓｒｙプロー ブへのハイブリダイゼーションの強さはそれらが多コピーのトランスジーンを保 有することを示す。ＸＸ雄およびＸＸ雌の試料は比較のために含まれる。Ｚｆｙ プローブはまたＺｆｘおよびＺｆａも検出し［Ａｓｈｗｏｒｔｈ、 Ａ、 ｅｔ ａｌ、、 ＥＭＢＯ，Ｊ、、 ９．１５２９−１５３４ （１９９０）］ 、 各シレーのＤＮＡ量の対照を提供する。バンドのサイズはｋｂで示しである。Summary embryo of embryo analysis data of mouse clone 741 Transdiex. Number of sexual dyes Color quality sty zb mvt! Type 1 tran 1') any tl phenotypic 63 + -27-/4OND XX 92fu + + XY Toro ♂ 58 ND ND XY ND ♂ The majority of embryos were XX males or XX females in approximately equal proportions. however , in two cases (m7.22 and m10.2), the sex chromatin has an XY sex chromosome configuration. However, testes were found in embryos that showed XX instead. Southern analysis shows that both of these It is also possible that the gene is transgenic, lacking the Zfy sequence and having multiple copies of Sry. (Fig. 24a), to probes that recognize Zfy-1 and Zfy-2. The lack of hybridization indicates the absence of a Y chromosome, while the Sry probe The strength of hybridization to the transgenes indicates that they retain multiple copies of the transgene. Indicates that it has. Samples of XX males and XX females are included for comparison. Zfy The probe also detected Zfx and Zfa [Ashworth, A., et al. al, EMBO, J, 9.1529-1534 (1990)], Provides a control for the amount of DNA in each strain. Band sizes are given in kb.
これら２つの胚からの生殖腺はリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中で全体を写真に撮り 、次いで４％バラホルムアルデヒド中で固定し、エタノール中で脱水し、そして パラフィン中に包埋した。切片（７μｍ）をヘマトキシリンとエオシンで染色し 、共に正常な精巣索の形成を示し、正常なＸＹ兄兄弟からの精巣と区別できなか った（図２４ｂ、ｃ）。The gonads from these two embryos were photographed whole in phosphate buffered saline (PBS). , then fixed in 4% formaldehyde, dehydrated in ethanol, and Embedded in paraffin. Sections (7 μm) were stained with hematoxylin and eosin. , both showed normal testicular cord formation and were indistinguishable from testes from normal XY siblings. (Fig. 24b, c).
図２４ｂは、非トランスジェニックきようだいの単一精巣（左）と卵巣（右）の 間に示された、胚ｍ７．２２（上段）くネル、中央）およびｍｌＯ，２（下段パ ネル、中央）から切除した生殖腺の対を示す。トランスジェニック胚の生殖腺は 精巣索形成と関連した特徴的なストライブを示す。Figure 24b shows a single testis (left) and ovary (right) of a non-transgenic sibling. Embryos m7.22 (top panel, center) and mlO,2 (bottom panel) shown in between. Shown are pairs of gonads excised from a wall (center). The gonads of transgenic embryos are Showing characteristic stripes associated with testicular cord formation.
図２４ｃは、ｍ７．２２（上段パネル）とｍ１０．２（下段パネル）の精巣切片 の組織構造を示す。大きさの明らかな差は切片の平面によるものである。索の形 態は同腹のマウスと類似していた。Figure 24c shows testis sections at m7.22 (upper panel) and m10.2 (lower panel). The organizational structure of The apparent difference in magnitude is due to the plane of the section. shape of rope The condition was similar to that of its littermate mice.
これらの実験から、Ｓｒｙ配列を担う１４ｋｂゲノム断片はマウスにおいて精巣 発生を開始させるのに十分である。These experiments showed that the 14kb genomic fragment carrying the Sry sequence was found in the testis in mice. sufficient to initiate development.
ｆ７４１が性転換を与える頻度を決定するために、雌として評価された全部の胚 はＰＣＲでＳｒｙ配列の存在について調べた。To determine the frequency with which f741 confers sex reversal, all embryos evaluated as female investigated the presence of the Sry sequence by PCR.
２つは確実にトランスジェニックであると同定され、別の４つの胚は、それらが 小割合の細胞にトランスジーンを有するモザイクであることを示唆する弱いシグ ナルを与えた（表１）。全てのＸＸトランスジェニックが性転換を示すわけでは ないという発見は、このようなモザイク現象またはＳｒｙ発現のレベルに対する 位置効果のためであると考えられる（以下参照）。Two were positively identified as transgenic, and another four embryos confirmed that they were Weak signal suggesting mosaicism with transgene in a small percentage of cells (Table 1). Not all XX transgenics exhibit sex reassignment The finding that no such mosaicism or This may be due to a position effect (see below).
性転換トランスジェニックマウスにおける正常成熟離去現型の発生 Ｓｒｙトランスジェニックマウスの成熟表現型を調べるために、ｆ’７４１を導 入した胚の一部は妊娠期間の終結まで発生させた。合計９３匹の動物が生まれた （４９匹の雄と４４匹の雌）。これらのうち５匹はサザンブロツティングにより トランスジェニックであることが判明した。２匹はトランスジーンを伝えなかっ たＸＹ雄であり、こうして性転換に関する情報を与えなかった。Development of normal mature abscission phenotype in sex-reversed transgenic mice To investigate the maturation phenotype of Sry transgenic mice, f'741 was introduced. Some of the implanted embryos were allowed to develop until the end of gestation. A total of 93 animals were born. (49 males and 44 females). Five of these were found by Southern blotting. It turned out to be transgenic. Two animals did not pass on the transgene. He was an XY male and thus did not provide any information regarding his sex change.
トランスジェニックマウスの１つ、Ｍ３３．１３は次のように分析した。ＰＣＲ 分析のために、０． １μｇのゲノムＤＮＡを、１．５ｍＭ 各ｄＮＴＰ、５０ ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ９，１５ｍＭ 硫酸アンモニウム、７ｍＭ ＭｇＣ １２，０，０５％ノニデットＰ−４０，０．５Ｕ Ｔａｑポリメラーゼ（Ａｎｇ ｌ １ａｎＢｊｏｔｅｃ）および５００ｎｇの各オリゴヌクレオチドブライマー を含む５０μｍ反応混合物に加えた。増幅はＴｅｃｈｎｅ ＰＨＣ−２サーモサ イクラ−中での９４℃で５秒間、６５℃で３０秒間および７２℃で３０秒間の３ ０サイクルから成っていた。８μｌのアリコートは２％アガロース−ＴＨＥゲル 上で電気泳動を行った。Ｓｒｙのためのプライマーは（５’−３’）ＴＣＡ Ｔ ＧＡ ＧＡＣＴＧＣＣＡＡ ＣＣＡ ＣＡＧ および ＣＡＴ ＧＡＣＣＡＣＣ ＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＡ（図２３に三角テ示した）であり、ＺｆＹ−１（７）た めのプライマーはＣＣＴ ＡＴＴ ＧＣＡ ＴＧＧ ＡＣ丁 ＧＣＡ ＧＣＴ ＴＡＴ Ｇ およびＧＡＣＴＡＧ ＡＣＡ ＴＧＴ ＣＴＴ ＡＡＣＡＴＣＴＧ Ｔ ＣＣであった。ミオゲニンプライマーはラットｃＤＮＡ配列のヌクレオチド ６５６−６８５および８８２−９０１に相当した［Ｗｒｉｇｈｔ、 Ｗ、Ｅ、、 ｅｔａｌ、、 Ｃｅ１１．５６．６０７−６１７ （１９８９月。ＰＣＲ産物 はそれぞれ４４１．１８０および２４５ｂｐであった。精巣は図２４に関して記 載したように組織検査のために処理された。One of the transgenic mice, M33.13, was analyzed as follows. PCR For analysis, 0. 1μg of genomic DNA, 1.5mM each dNTP, 50 mM Tris-HCl pH 9, 15mM ammonium sulfate, 7mM MgC 12,0,05% Nonidet P-40, 0.5U Taq polymerase (Ang 1anBjotec) and 500ng of each oligonucleotide primer was added to the reaction mixture containing 50 μm. Amplification is Techne PHC-2 thermosa 3 at 94°C for 5 seconds, 65°C for 30 seconds and 72°C for 30 seconds in Icra. It consisted of 0 cycles. 8 μl aliquots were added to a 2% agarose-THE gel. Electrophoresis was performed on the top. The primer for Sry is (5'-3')TCA T GA GACTGCCAA CCA CAG and CAT GACCACC ACCACCACCAA (shown as a triangle in Figure 23), and ZfY-1(7) The primers are CCT, ATT, GCA, TGG, AC, GCA, GCT. TAT G and GACTAG ACA TGT CTT AACATCTG It was TCC. Myogenin primer is a nucleotide sequence of the rat cDNA sequence. 656-685 and 882-901 [Wright, W, E, . etal, Ce11.56.607-617 (1989. PCR product were 441.180 and 245 bp, respectively. The testes are noted with respect to Figure 24. were processed for histological examination as described above.
ＰＣＲおよび精巣検査の結果は図２５に示してあり、ここで図２５ａはＳｒｙお よび対照（ミオゲニン）バンドを示ｔｍ３３．１３からのゲノムＤＮＡ （レー ン３）のＰＣＲ分析を示す。Ｚｆｙ−１に対応するバンドは見られず、このこと はＹ染色体の不存在を示す。この結果はＹ染色体プローブＹ ３５３ Ｂ ［Ｂ ｊｓｈｏｐ、 Ｃ，Ｅ。The results of PCR and testicular testing are shown in Figure 25, where Figure 25a is Genomic DNA (ray) from tm33.13 showing control (myogenin) and control (myogenin) bands. PCR analysis of step 3) is shown. There is no band corresponding to Zfy-1, and this indicates the absence of a Y chromosome. This result shows that the Y chromosome probe Y353B [B jshop, C, E.
ｅｔ ａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ、 ３１５．７０−７２ （１９８５）］および Ｓ ｘ １ ［Ｒｏｂｅｒｔｓ。et al., Nature, 315.70-72 (1985)] and S x 1 [Roberts.
Ｃ，、ｅｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳ Ａ、 ８５．６６４８−６６４９ （１９８８）コを用いたサザンブロッティン グにより確認された。正常ＸＸ雌およびＸＹ雄の同腹のマウス（３３，９，レー ン２および３３．１７．レーンｌ）を比較のために示しである。Ｍ１マーカーバ ンド（１０８１，５１０，３９６，３４４，２９８，２２０，２０１，１５４お よび１３４ｂｐ）。図２５ｂはマウス３３．１７（左）および３３．１３（右） の外部性器を示し、図２５ｃはマウス３３．１７（左）および３３．１３（右） からの精巣切片の組織構造を示す（縮尺線、９０μｍ）。C, et al, Proc, Natl, Acad, Sci, US A, 85.6648-6649 (1988) Southern blotting using Confirmed by Google. Normal XX female and XY male littermates (33,9, 2 and 33.17. Lane l) is shown for comparison. M1 marker cover (1081, 510, 396, 344, 298, 220, 201, 154 and and 134 bp). Figure 25b shows mice 33.17 (left) and 33.13 (right) Figure 25c shows the external genitalia of mice 33.17 (left) and 33.13 (right). (Scale line, 90 μm).
マウスｍ３３．１３は正常ＸＹ同腹のマウスと大きさおよび重さが類似していた 。分娩後約６週でｍ３３．１３は雌（最高２匹／夜）と共にケージに入れた。マ ウスは正常な交尾挙動を示し、６日間で４回交尾した。Mouse m33.13 was similar in size and weight to normal XY littermates. . Approximately 6 weeks postpartum, m33.13 was caged with females (up to 2/night). Ma The mice showed normal mating behavior and mated 4 times in 6 days.
雄マウスにおける２つのＸ染色体の存在は、生殖細胞が前精原細胞を越えて発育 するのを妨げられるので、常に生殖不能をもたらす。この現象はＸ染色体の１つ にＴｄｙを含むＹ誘導配列が存在するために雄であるＸＸ ＳｘｒおよびＸＸ Ｓｘｒ’マウスにおいて証明された［Ｃａｔｔａｎａｃｈ、 Ｂ、Ｍ、、 ｅｔ ａｌ、、 Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ。The presence of two X chromosomes in male mice indicates that germ cells develop beyond prespermatogonia. always resulting in sterility. This phenomenon is one of the X chromosomes XX Sxr and XX are male due to the presence of a Y-inducing sequence containing Tdy in demonstrated in Sxr' mice [Cattanach, B. M., et al. al,, Cytogenetics.
１０、３１８−３３７ （１９７１）； Ｂｕｒｇｏｙｎｅ、 Ｐ、Ｓ、、 ｅ ｔ ａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ、 ３２０゜１７０−１７２ （１９８６）および ５ｕｔｃｌｉｆｆｅ、 Ｍ、Ｊ、 ＆ Ｂｙｒｇｏｙｎｅ、 Ｐ−８，、Ｄｅｖ ｅｌｏｐｍｅｎｔ、 １０７．３７３−３８０ （１９８９）］。従って、性転 換トランスジェニックマウスｍ３３．１３が生殖不能であっても意外ではなかっ た。彼が交尾した４匹の雌はどれも妊娠しなかった。３つの事例において、膣栓 の***の存在について調べたが、どれも存在しなかった。ｍ３３．１３と正常Ｘ Ｙ兄兄弟の唯一の相違は精巣の大きさであった。ＸＹ同腹のマウスの精巣の重さ が７６ｍｇであるのに対して、ｍ３３．１３は１７ｍｇ （ＸＸＳｘｒ’雄に対 して期待された範囲内）である。精巣を組織検査のために処理し、切片からライ ジッヒ細胞、周細管性筋様細胞およびセルドーリ細胞の明らかに規定された正常 集団を伴う細管の存在が示されたが、***形成を行う細胞は全く存在しなかった （図２５０）。10, 318-337 (1971); Burgoyne, P.S., e. tal, Nature, 320°170-172 (1986) and 5utcliffe, M, J, & Byrgoyne, P-8,, Dev elopment, 107.373-380 (1989)]. Therefore, gender change It is not surprising that the transgenic mouse m33.13 is sterile. Ta. None of the four females he mated became pregnant. In three cases, vaginal plugs I investigated the existence of semen, but none of them were found. m33.13 and normal X The only difference between the two brothers was the size of their testicles. Testis weight of mice from XY litter is 76mg, whereas m33.13 is 17mg (for XXSxr' males) (within the expected range). Process the testes for histology and lyse the sections. Clearly defined normality of Zich cells, periticular myoid cells and Serdoli cells The presence of tubules with clusters was shown, but no spermatogenic cells were present. (Figure 250).
ｍ３３．１３の内部検査から、半陰陽の徴候を示さない正常雄の生殖路が明らか になった。これは、セルトーり細胞が抗ミュラー （Ｍｕｌｌｅｒｉａｎ）ホル モン（ＡＭＨ）の生産の点で機能的に正常であり、ライジッヒ細胞がテストステ ロンの生産の点で正常であることを示す。ＡＭＨは雌のミュラー管系（卵管、子 宮および上部膣）の消失に必要であり、テストステロンはウォルフ（Ｗｏｌｆｆ ｉａｎ）管層導体（精管および精嚢のような付属生殖腺）の発生並びに雄の２次 性徴の発現に必要である［Ｊｏｓｔ、 Ａ ＆ Ｍａｇｒｅ、 Ｓ、 Ｐｈ１ｌ 。Internal examination of m33.13 reveals normal male reproductive tract with no signs of hermaphroditism Became. This is due to the fact that cellulose cells are anti-Mullerian hormonal. Leysig cells are functionally normal in terms of production of AMH Indicates normality in terms of Ron's production. AMH is a female Müllerian system (oviduct, offspring) Testosterone is required for the disappearance of the cervix and upper vagina), and testosterone ian) development of tubular conductors (auxiliary gonads such as the vas deferens and seminal vesicles) and male secondary Required for the expression of sexual characteristics [Jost, A & Magre, S, Ph1l .
Ｔｒａｎｓ、 Ｒ，Ｓｏｃ、 Ｌａｎｄ、 ３２２．５５−６１ （１９８８） およびＪｏｓｓｏ、 Ｎ、、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｓｅｘ ｄ４ｆｆｅ ｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ａｎｉｍａｌｓ ａｎｄ ｍａｎ （動物とヒト における性分化のメカニズム） ” （Ａｕｓｔｉｎ、 Ｃ，Ｒ，＆ Ｈｄｗａ ｒｄｓ、 Ｒ，Ｇ、編集） １６５−２０３ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ 、 Ｌｏｎｄｏｎ １９８１）］。・別の２つのＸＸトランスジェニック、ｍ３ ２．ｌＯおよびｍ３３．２は外部雌表現型を示したが、両方ともまだ多コピーの Ｓｒｙを保有していた。これらのマウスは子孫をつくり、このことからそれらが 機能的な生殖管と卵巣をもつことが分かる。これらの動物はさらに、トランスジ ェニックＸＸ雌胎児と共に、ｆ７４１が常に性転換を起こすとは限らないことを 証明した。Ｓｒｙ遺伝子を非機能的にするＳｒｙ遺伝子のわずかな再配列が存在 しつると考えられるが、これが全ての事例で起こる可能性はほとんどないと思え る。より一層確かと思われる他の解釈が２つある。第一は、これらの雌がトラン スジーンについてモザイクであり、はんの小割合の細胞がＳｒｙ遺伝子コピーを 担う生殖***の体細胞部分を構成するにすぎないというものである。ＸＸφＸＹ キメラの分析は、ＸＹ細胞が約３０％より少ない場合に雌または両性動物が発生 することを示唆するＥＥｉｃｈｅｒ、 Ｅ、Ｍ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｃｙｔｏｇ ｅｎｅｔ。Trans, R, Soc, Land, 322.55-61 (1988) and Josso, N., Mechanisms of sex d4ffe Rentation in animals and man (Austin, C, R, & Hdwa) rds, R, G, editor) 165-203 (Academic Press , London 1981)]. -Two other XX transgenics, m3 2. lO and m33.2 showed an ectofemale phenotype, but both were still multicopy It held Sry. These mice produce offspring and this indicates that they It can be seen that it has functional reproductive tubes and ovaries. These animals are also transgenic. Note that with genic XX female fetuses, f741 does not always undergo sex reversal. certified. There is a slight rearrangement of the Sry gene that makes it non-functional Although this may be true, I think it is highly unlikely that this will occur in all cases. Ru. There are two other interpretations that seem more plausible. First, these females are trans The Sry gene is mosaic, with a small proportion of cells carrying a copy of the Sry gene. It is said that it only constitutes the somatic part of the genital ridge that is responsible for this. XXφXY Chimera analysis indicates that females or hermaphrodites occur when there are less than approximately 30% of XY cells. EEicher, E, M, et al, Cytog suggests that enet.
Ｃｅ１ｌ Ｇｅｎｅｔ、、 ２８．１０４−１１５ （１９８０）； ＭｃＬａ ｒｅｎ Ａ、、Ｃｈｉｍｅｒａｓ ｉｎＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｊｏｌ ｏｇｙ（発生生物学におけるキメラ） ” （Ｌｅ Ｄｏｕａｒｉｎ、 Ｎ、 ＆ ＭｃＬａｒｅｎ Ａ、編集） ３８１−３９９ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ ｅｓｓ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＆ Ｌｏｎｄｏｎ、 １９８４）；およびＢｕｒ ｇｏｙｎｅ、 Ｐ、Ｓ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、 １０２ ．４４３−４５０ （１９８８）］。第二は、トランスジーンの発現が組込み部 位により位置効果を受けるというものである。遺伝子座をコントロールする領域 が存在する２、３の事例を除いて、トランスジーンの発現はほとんど常にそれら の染色***置に依存する〔Ｇｒｏｓｖｅｌｄ、 Ｆ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｃｅ１ １．、５１．９７５−９８５ （１９８７）］ 。これら２つの別の解釈は成熟 ＸＸトランスジェニック雌からの繁殖により試験することができる。Ce1l Genet, 28.104-115 (1980); McLa ren A,, Chimeras in Developmental Bjol ogy (chimera in developmental biology)” (Le Douarin, N. & McLaren A, ed.) 381-399 (Academic Pr. ess, New York & London, 1984); and Bur. goyne, P, S, et al, Development, 102 ．． 443-450 (1988)]. Second, transgene expression is at the integration site. This means that there is a position effect depending on the location. Regions that control genetic loci Except for a few cases where there are depending on the chromosomal location of [Grosveld, F. et al., Ce1 1. , 51.975-985 (1987)]. These two alternative interpretations are mature Can be tested by breeding from XX transgenic females.
マウスｍ３２．１０をＦ １ （ＣＢＡｘＣ５７ＢＬ／１０）雄とつがわせ、得 られた子孫の尾生検を３週目に行った。ゲノムＤＮＡの調製とサザン分析は表１ に関して記載する通りに行い、結果を図２６に示す。Ｚｆｙ−１およびＺｆＹ− ２を認識するプローブへのハイブリダイゼーションの欠如はＹ染色体の不在を示 す。Mice m32.10 were mated with F1 (CBAxC57BL/10) males and obtained. Tail biopsies of the offspring were taken at 3 weeks. Genomic DNA preparation and Southern analysis are shown in Table 1. The results are shown in FIG. 26. Zfy-1 and ZfY- Lack of hybridization to a probe that recognizes 2 indicates the absence of a Y chromosome. vinegar.
ファウンダー雌ｍ３２．１０はＳｒｙを認識するプローブへの強いハイブリダイ ゼーションを示して、多コピーのトランスジーンの存在が明らかである。子孫番 号７に同じバンドパターンが見られる。この動物の外部性器の検査は正常な雌表 現型を示した。雄の子孫番号１−５由来のＤＮＡはＺｆｙとＳｒｙプローブの両 方へのハイブリダイゼーションを示す。これらのうち３匹の動物は多コピーのＳ ｒｙを有し、かくしてトランスジェニックである。Founder female m32.10 strongly hybridizes to a probe that recognizes Sry. The presence of multiple copies of the transgene is evident. descendant number The same band pattern can be seen in No. 7. Examination of the external genitalia of this animal shows normal female appearance. The current form was shown. DNA from male progeny numbers 1-5 was tested for both Zfy and Sry probes. This shows hybridization toward the Three of these animals had multiple copies of S ry and is thus transgenic.
バンドのサイズはｋｂで示しである。３３．２はまだトランスジェニック子孫を もたらしていない。しかしながら、３２．１０はトランスジーンを雌の子孫に伝 え（図２６）、これはモザイク現象がこの事例での解釈に当てはまらないことを 示唆する。Band sizes are given in kb. 33.2 still produces transgenic offspring Not brought. However, 32.10 transmits the transgene to female offspring. Eh (Figure 26), this means that the mosaic phenomenon does not fit the interpretation in this case. suggest.
ヒトＳＲＹはマウスにおいて機能しないマウスＳｒｙとヒトＳＲＹは７９アミノ 酸の推定ＤＮＡ結合ドメインの１次構造において高度の類似性を示す。性決定経 路におけるこのタンパク質と他の遺伝子との相互作用の特異性は、おそらくこの ドメインの配列に依存している。しかしながら、２つの遺伝子はこれらのアミノ 酸残基のうち２３信が異なっており、その差異のうち２個だけが保存的である。Human SRY does not function in mice Mouse Sry and human SRY have 79 amino acids The putative DNA binding domains of the acids show a high degree of similarity in the primary structure. sex determination meridian The specificity of the interaction of this protein with other genes in the tract is probably due to this It depends on the arrangement of domains. However, two genes contain these amino acids. Twenty-three of the acid residues differ, and only two of the differences are conservative.
ＸＹ雌において精巣発生を起こさせない単一アミノ酸の置換の発見から、いくつ かの事例では、ＳＲＹタンパク質の明らかに保存的な変異でさえもその作用を破 壊しうることが分かる。さらに、マウスおよびヒト遺伝子のヌクレオチド配列は 推定上のＤＮＡ結合ドメインの外側で著しく分岐している。これらの知見を考慮 すると、ヒトＳＲＹ遺伝子がマウスにおいて性転換を引き起こすのにそのマウス 対応遺伝子と同様の効果を有するかどうか調べることは興味がもてた。The discovery of a single amino acid substitution that prevents testicular development in XY females has led to several In that case, even apparently conservative mutations in the SRY protein disrupted its action. I know it can be broken. Additionally, the nucleotide sequences of mouse and human genes are Significantly divergent outside of the putative DNA-binding domain. Considering these findings Then, although the human SRY gene causes sex reversal in mice, It was interesting to see if it had a similar effect as the corresponding gene.
前核の導入のために使用したＤＮＡはＳＲＹ付近のヒトＹ染色体ＤＮＡに相当す る２５ｋｂのＢａｍＨＩ−３ａｌＩ断片であり、コスミドクローンｃＡＭＦから 単離される［Ｅｌｌｉｓ、 Ｎ、Ａ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ、 ３３ ７．８１−８４ （１９８９）］。この断片はＳＲＹ保存ドメインの５′側の約 １２．５ｋｂのＹ特異的配列と３′側の５ｋｂ配列を含む。残りの６ｋｂがＸお よびＹ染色体に共通した偽書染色体領域からの配列を表す（図２３）。The DNA used to introduce the pronuclei corresponds to human Y chromosome DNA near SRY. It is a 25 kb BamHI-3alI fragment derived from cosmid clone cAMF. isolated [Ellis, N.A. et al., Nature, 33 7.81-84 (1989)]. This fragment is approximately 5′ of the SRY conserved domain. It contains a 12.5kb Y-specific sequence and a 5kb 3' sequence. The remaining 6kb is and the sequence from the pseudochromosomal region common to the Y chromosome (Figure 23).
性転換を起こすヒトＳＲＹの能力は、トランスジーンの３つの独立した組込みを 示す動物を用いて評価した。これらのうち２つはＸＹファウンダー・トランスジ ェニックｈＡ６およびｈＡ９から誘導された系列であった。これらのファウンダ ーはＳＲＹをそれらの子孫の約半数に伝えた。つまり、検定した１７のｈＡ６胚 のうち８つ、および３６のｈＡ９胚のうち１３がトランスジェニックであった。The ability of human SRY to undergo sex reversal depends on three independent integrations of transgenes. Evaluation was performed using the animals shown. Two of these are XY Founder Transdi was a line derived from genetic hA6 and hA9. These founders - passed on SRY to about half of their descendants. In other words, the 17 hA6 embryos tested 8 of these and 13 of 36 hA9 embryos were transgenic.
これらの系列の子孫を１４．５ｄｐｃに分析したとき、ＸＸトランスジェニック 胎児に精巣索形成の徴候は見られず、これはどちらの組込み現象も性転換を引き 起こさなかったことを示す。３番目の組込みは１つのＸＸトランスジェニックフ ァウンダー動物の胚により示されたが、これも表現型的に雌であった。When the progeny of these lines were analyzed at 14.5 dpc, XX transgenic There were no signs of testicular cord formation in the fetus, indicating that neither incorporation event could lead to sex reversal. Indicates that it did not occur. The third integration is one XX transgenic gene. demonstrated by the founder animal embryo, which was also phenotypically female.
ヒトＳＲＹを子孫に伝達するトランスジェニック動物が得られたので、発生する 生殖腺と、他の知られた唯一のＳＲＹ発現部位である成体精巣でのトランスジー ンの発現を試験することができた。マウスＳｒｙが発現される時期の１１．５− １２ｄｐｃにｈＡ６およびｈＡ９から生殖***を切除した。尿生殖***の対から ＲＮＡを抽出し、小規模反応［Ｋｏｏｐｍａｎ、 Ｐ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｎａ ｔｕｒｅ、 ３４２、９４０−９４２ （１９８９）］においてそれぞれの*** 対から得られた量の半分を逆転写酵素の存在下で、半分を逆転写酵素の不在下で 逆転写させた。逆転写はそれぞれのＲＮＡ試料に対して逆転写酵素（ＲＴ）の存 在下（＋）および不在下（−）で行い、観察されたバンドがＳＲＹ転写物の存在 のためであり、汚染ＤＮＡのためではないことを証明した。ＰＣＲ反応にゲノム ＤＮＡまたは逆転写産物を加え、図２５に関して記載したように増幅させた。Ｄ ＮＡ分析において使用したＳＲＹプライマーは（５’ −３’ ）ＧＡＴＣＡＧ ＣＡＡ ＧＣＡ ＧＣＴ ＧＧＧ ＡＴＡ ＣＣＡ ＧＴＧ および ＣＴＧ ＴＡＧ ＣＧＧ ＴＣＣＣＧＴ ＴＧＣＴＧＣＧＧＴ Ｇ であった（３３６ ｂｐ産物、図２３中の黒い三角）。ＲＮＡ分析では、ＣＡＧ ＧＡＧ ＧＣＡ ＣＡＧ ＡＡＡ ＴＴＡ ＣＡＧ ＧＧＣＡＴＧ Ｃおよび ＡＣＡ ＧＴＣＡ ＴＣＣＣＴ ＧＴＡ ＣＡＡ ＣＣＴ ＧＴＴ ＧＴＣＣを使用した（１７４ｂ ｐ産物、図２３中の白い三角）。ゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析（図２７上段）から 、全ての胚（レーン１−１２）がＳＲＹについてトランスジェニックであること が判明した。試料４−６および１０−１２は、ＸＸであった試料１−３および７ −９と違って、それらがＸＹであることを裏付けるＺｆｙ−１に対応するバンド を示した。非トランスジェニック対照（ｎｏｎＴＧ）を右側に示す。ミオゲニン のオリゴヌクレオチドプライマーを対照として各分析に含めである。各レーンの 下には、同−胚の尿生殖***から抽出された逆転写ＲＮＡのＰＣＲ分析が示しで ある（下段パネル）。ＳＲＹ発現に対応するバンドは試料１−９および１１に見 られた。Now that we have obtained transgenic animals that transmit human SRY to their offspring, transzyme in the gonads and adult testis, the only other known site of SRY expression. It was possible to test the expression of 11.5- at the time when mouse Sry is expressed. Genital ridges were excised from hA6 and hA9 at 12 dpc. From pairs of urogenital ridges RNA was extracted and small-scale reactions [Koopman, P. et al., Na ture, 342, 940-942 (1989)]. half the amount obtained from the pair in the presence of reverse transcriptase and half in the absence of reverse transcriptase. Reverse transcribed. Reverse transcription involves determining the presence of reverse transcriptase (RT) for each RNA sample. Performed in the presence (+) and absence (-), the observed bands indicate the presence of SRY transcripts. It was proven that this was caused by contaminating DNA. Genome in PCR reaction DNA or reverse transcripts were added and amplified as described for Figure 25. D The SRY primer used in the NA analysis was (5'-3')GATCAG CAA GCA GCT GGG ATA CCA GTG and CTG TAG CGG TCCCGT TGCTGCGGT G (336 bp product, black triangle in Figure 23). In RNA analysis, CAG, GAG, GCA CAG AAA TTA CAG GGCATG C and ACA GTCA TCCCT GTA CAA CCT GTT GTCC was used (174b p product, white triangle in Figure 23). From PCR analysis of genomic DNA (upper row of Figure 27) , all embryos (lanes 1-12) are transgenic for SRY. There was found. Samples 4-6 and 10-12 were XX Samples 1-3 and 7 -9, the band corresponding to Zfy-1 confirms that they are XY showed that. Non-transgenic control (nonTG) is shown on the right. myogenin oligonucleotide primers were included in each analysis as controls. of each lane Below, PCR analysis of reverse transcribed RNA extracted from the urogenital ridge of the same embryo is shown. Yes (lower panel). Bands corresponding to SRY expression were found in samples 1-9 and 11. It was done.
これらの試料から抽出されたＲＮＡのＰＣＲ分析から、ＳＲＹ転写物が性転換さ れなかったトランスジェニックＸＸ胎児に存在していたことが明らかである（図 ２７）。不思議なことに、ｈＡ６ ＸＹ胎児が全てトランスジーンを発現したわ けではなかった（図２７）。これは発生期における変化によるものかもしれず、 研究中である。生殖***におけるＳＲＹ発現のレベルは内因性Ｓｒｙ遺伝子の数 倍であると見積もられ、トランスジェニックＸＹ成体精巣で見られたレベルより も高かった。PCR analysis of RNA extracted from these samples showed that the SRY transcript was sex-reversed. It is clear that it was present in transgenic XX fetuses that were not affected (Fig. 27). Strangely enough, all hA6XY fetuses expressed the transgene. (Figure 27). This may be due to changes in the developmental period; Currently under research. The level of SRY expression in the genital ridge is determined by the number of endogenous Sry genes. It is estimated to be twice as high as the level seen in transgenic XY adult testes. It was also expensive.
明らかに、生殖***での転写の欠如は、ＳＲＹがマウスにおいて性転換を起こす のに失敗した理由とはなり得ない。ＳＲＹ ｍＲＮＡが正しくプロセッシングま たは翻訳されない可能性がある。また、タンパク質産物がマウス細胞において不 安定であるかもしれない。しかしながら、他の調節タンパク質または標的遺伝子 との相互作用の失敗のために、配列の相違がヒトＳＲＹタンパク質をマウス細胞 内で無能にすることもありそうだ。ヒトとマウスのオーブン・リーディング・フ レームを交換することによりこの仮説を検討することができるだろう。Apparently, the lack of transcription in the genital ridge indicates that SRY causes sex reversal in mice. This cannot be the reason for the failure. SRY mRNA is processed correctly or may not be translated. Also, the protein product is not present in mouse cells. It may be stable. However, other regulatory proteins or target genes Sequence differences cause the human SRY protein to interact with mouse cells. It is likely that he will become incapacitated internally. Human and Mouse Oven Leading Food We can examine this hypothesis by exchanging frames.
考察 これらの実験により、Ｓｒｙを含む１４ｋｂマウスゲノムＤＮＡ断片は、ＸＸト ランスジェニック胚において精巣の形成を誘導し、その後ＸＸトランスジェニッ ク成体において完全な表現型性転換を生じさせるのに十分であることが分かる。Consideration Through these experiments, a 14 kb mouse genomic DNA fragment containing Sry was Inducing testis formation in transgenic embryos followed by XX transgenic embryos It is shown that this is sufficient to cause complete phenotypic sex reversal in adult animals.
ｆ７４１の完全な配列解析、並びにヒトＤＮＡへの交差ハイブリダイゼーション 実験はＳｒｙ以外の遺伝子配列を検出できなかった。以前のデータは精巣決定の 過程にＳｒｙが関与するという興味をそそる証拠を提供したが、最近の研究は、 Ｓｒｙが雄発生を起こすのに必要な唯一のＹ連鎖遺伝子であり、それ故にＳｒｙ が精巣決定遺伝子であると提案している。Complete sequence analysis of f741 and cross-hybridization to human DNA The experiment failed to detect gene sequences other than Sry. Previous data on testicular determination Although recent studies have provided tantalizing evidence of the involvement of Sry in the process, Sry is the only Y-linked gene required to cause male development, and therefore Sry is proposed to be the testis-determining gene.
性転換を起こすＳｒｙ含有１４ｋｂ断片の能力から、この断片は適切な胚発現に 必要な全ての調節要素を含む全Ｓｒｙ遺伝子を含んでいることが示唆される。ト ランスジェニック系を使って、次第に小さくした構築物をマイクロインジェクシ ョンで導入することにより、これらの調節要素を１４ｋｂ断片内に局在化させる ことができる。Ｓｒｙ発現の唯一の他の部位は成体精巣、おそらく生殖細胞成分 である。ｆ７４１によって表された１４ｋｂ断片が胚生殖腺の体細胞部分での発 現から生殖細胞と関連した成体精巣での発現へ切り換えるのに必要な調節情報を さらに含むか否かを調べることは面白いだろう。ヒトＳＲＹ遺伝子がトランスジ ェニックマウスにおいて両時期に発現されるという発見は、この遺伝子に隣接す る２５ｋｂのＤＮＡ内に相応の調節配列が存在することと一致する。また、それ はＳｒＶ／ＳＲＹ発現を調節する機構がヒトおよびマウス間で保存されているこ とを示す。The ability of the Sry-containing 14kb fragment to undergo sex reversal suggests that this fragment is suitable for proper embryonic expression. It is suggested that it contains the entire Sry gene, including all necessary regulatory elements. to microinjection of progressively smaller constructs using transgenic systems. localization of these regulatory elements within a 14 kb fragment by introducing be able to. The only other site of Sry expression is the adult testis, probably a germline component It is. The 14 kb fragment expressed by f741 is expressed in the somatic part of the embryonic gonad. The regulatory information necessary to switch from expression in the adult testis to germ cell-associated expression. It would be interesting to find out whether more is included. The human SRY gene is transgenic. The finding that this gene is expressed at both times in genetic mice suggests that This is consistent with the presence of a corresponding regulatory sequence within the 25 kb DNA. Also, it The mechanism regulating SrV/SRY expression is conserved between humans and mice. and
Ｓｒｙは単独で他のＹ連鎖遺伝子の不在下で精巣発生を促進し得ることが分かっ たが、性転換が常に起こるとは限らない。このことは、Ｓｒｙトランスジーンの 位置効果に対する感受性により説明できる。この可変性はＳＲＹを含むＹ染色体 の小部分を保有するヒトＸＸ個体の場合を反映するだろう。４つのこのような事 例［Ｐａｌｍｅｒ、 Ｍ、Ｓ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ、 ３４２．９ ３７−９３９ （１９８９）コは、それぞれが親のＸ染色体上の約３５ｋｂのＹ 特異的配列を受け継いだが、２つの事例だけが部分的性転換を発現したにすぎな かった。ＸＸ両性動物はＹ染色体の類似の小部分を保有することが知られている 。これらの事例では、ＳＲＹはその新たな染色***置における隣接ＤＮＡ配列の 効果に対してばかりでなく、Ｘ不活性化の広がりに対しても感受性でありうる。It was found that Sry alone can promote testicular development in the absence of other Y-linked genes. However, gender change does not always occur. This suggests that the Sry transgene This can be explained by sensitivity to position effects. This variability is due to the Y chromosome containing SRY. This would reflect the case of human XX individuals carrying a small portion of . four such things Example [Palmer, M.S., et al., Nature, 342.9 37-939 (1989), each of which has approximately 35 kb of Y on the parental X chromosome. Although they inherited specific sequences, only two cases developed partial sex reversal. won. XXHermaphrodites are known to possess a similar small portion of the Y chromosome . In these cases, the SRY is linked to adjacent DNA sequences at its new chromosomal location. It may be sensitive not only to the effect but also to the extent of X-inactivation.
マウスでは後者に関する前例が数多く存在し、例えばＳｘｒ断片が不活性Ｘ染色 体上にある場合は、雄の代わりにしばしば雌または両性動物が発生する［ＭｃＬ ａｒｅｎ、 Ａ、 ＆ Ｍｏｎｋ、 Ｍ、、 Ｎａｔｔ＋ｒｅ、 ３００．４４ ８−４４８ （１９８２）］。位置効果による部分的性転換の同様の事例は、Ｓ ｒｙ発現レベルが臨界的閾値レベルに近い、別のトランスジェニックマウスを分 析したときに見られるだろう。There are many precedents for the latter in mice, for example, Sxr fragments are stained with inactive X. When present on the body, females or hermaphrodites often occur instead of males [McL aren, A, & Monk, M, Natt+re, 300.44 8-448 (1982)]. A similar case of partial sex reversal due to position effects is S Separate another transgenic mouse with ry expression levels close to the critical threshold level. You will see it when you analyze it.
Ｓｒｙは短時間にわたり作用して、精巣発生を開始させる。それは他の遺伝子と の相互作用を介してこれを行わねばならず、これらの他の遺伝子の一部はＳｒｙ の調節に関与し、他はＳｒｙの下流標的であるだろう。これらの他の遺伝子は、 Ｓｒｙがマウスにおいて雄発生をもたらすのに必要な唯一のＹ連鎖遺伝子である ことが分かったので、ゲノムのどこか他のところにマツピングされねばならない 。これらの遺伝子の突然変異はＳＲＹを欠失しているＸＸ個体における雄発生の 事例［Ｐａｌｍｅｒ、 Ｍ、Ｓ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ、 ３４２． ９３７−９３９ （１９８９）コ、およびＳＲＹが無傷である場合のｘｙ雌の事 例［５ｃｈｅｒｅｒ、 Ｇ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｈｕｍ、 Ｇｅｎｅｔ、、 ８ １．２９１−２９４（１９８９）； Ｆｒｅｄｇａ、 Ｋ、、 Ｐｈ１１． Ｔ ｒａｎｓ、 Ｒ，Ｓｏｃ、 Ｌａｎｄ、、 ３２２．８３−９５ （１９８８） ］を説明できるだろう。分子遺伝学的手法を使ってＳｒｙから一歩ずつ研究を進 めることにより、今や、これらの他の遺伝子を同定することが可能であるだろう 。Sry acts over a short period of time to initiate testicular development. It is with other genes and some of these other genes must do this through the interaction of Sry and others may be downstream targets of Sry. These other genes are Sry is the only Y-linked gene required to produce androgenesis in mice Now that we know that, it must be mapped somewhere else in the genome. . Mutations in these genes inhibit male development in XX individuals lacking SRY. Case study [Palmer, M.S., et al., Nature, 342. 937-939 (1989) Ko, and xy female when SRY is intact. Example [5cherer, G, et al, Hum, Genet, 8 1.291-294 (1989); Fredga, K., Ph11. T rans, R, Soc, Land, 322.83-95 (1988) ] can be explained. Progressing research step by step from Sry using molecular genetic methods It would now be possible to identify these other genes by .
ヒト チッパノブ−ウサギ ブタ ウマ ウシ トラＦ−１４＋−１１Ｎ： ｍ ； Ｆｎ よ 二 号ａ ｂ ｃ プローブ： ｃ ｃ ｏｉ◆０２ Ａ 成人 １１．５６ｐｃ 胚 Ｙ Ｙ ｉｔ ａ２ ａ３ ａ４ ＜ｅ：ｕＨｔ−ａＬＩＬＩＨ＜Ｍ （’１１（’Ｉ＋（’Ｉｔ （Ｌｉ（Ｌｉ（ ｋごＧじ３ ＝ご巴還足二 ８可８完８阿 ｇ鍔１聞εＨ’＠＜＞ Ｉ−Ｉｋ（ ｋ＜：ｓ （ｊ←０←ｕ ！−＜ ＞＜ ｈ＜ ｃ８；ｉ；Ｓ：５足町売 お止 １１８ン８々ご３３巳８！ 足ミｉ：４ ：３＝ Ｂ ＥＥぼ８巳 ■躇ＩＩＣ ＪＯ，ｉ−＋へ （鴨べ噴ｕｔｐ ｕへ０へ０へ くχにχくミ←−Ｌ＋トｌ− Ｉ旬←−←−く艶く艶υ艶 （艶（勢Ｑ−足病シ艶 Ｅべｔとｙ ８ミ８姐会 足々乏ご足！（Ｊｌ−ｉｆ−＋コ ｕＮ４ｃコυｃ ｔｐｍｏｍｔｐｑ （ＪＯ ＬＩＯＬＩＯ（＼←ａ Ｌｊ＠！−１ｅｒ＜ｆ （）（）（＞ Ｌ）ｋＣＪＬＬ Ｉトドυ−（４←−（（（’３（Ｊ（Ｑ ＵへＱへＱへ←気υ−（コｕｍ＜コ じ惰Ｌｌ’ＭＣＪ−１←ζトζトζく的（ＪＭ （−１ＬＩ−←Φ ８１８１８ 勺 （勢く勢く勢ｕ＜ａ＜ ａｏ ＠＜ｔ−ｍ、ａ ＜５：ｈｕ＞３＞ ＜＜＜ ＜＜＜ｕｙｕｌ−１ｕ的←−トα ト気くり０＼ （フ０コＵセｏａｔｈ−じ′ ：ＳＯΦ（例 く勢＜’ＳｌｊＭ ｈのト・く１（４＜ミ １−ｔ（Ｊ（１／） ｔｊ（ｕ＜Ｌｌ’：ＩＩＪ’−５Ｌｌ’ＪＬ）’−ＩＬＩθＱζ ←コｈａｔ− ＋噴 ０ζＣζじコ トー←唱Ｑ勺乏５ 七！２５ご； ６掻Ｇ３Ｇ し化層８ ５←’ｏ ａｈ＜ｏｔ−ｈ 的 ｕ ｃ＜ ｙｈ ζ ← 気ト 勢ト −（Ｊ Ｍ４Ｃｊ ｈｐ １．＋ｌｊ ＞ （ｋＱＬ）Ａ＜ ｆ （ｈ（Ｍ（ｊＭｕ＜ ｕ＜ｕａ＋ｔ−＋ｕ ＜＜＜！−１＜＜ ｕ＜ｖｚａ。Human Chippanob - Rabbit Pig Horse Cow Tiger F-14+-11N: m ; Fn 2 a b c Probe: c c oi◆02 A Adult 11.56pc embryo Y Y it a2 a3 a4 <e:uHt-aLILIH<M ('11('I+('It)(Li(Li( k Go Gji 3 = Go Tomoe Kansoku 2 8 possible 8 Kan 8 A g Tsuba 1 mon εH’@<> I-Ik ( k＜:s (j←0←u !−＜ ＞＜ h＜ c8;i;S: 5 foot sale stopped 118n8go33mi8! Hesitation foot i: 4: 3 = B EE Bo 8 Mi ■IIC JO, to i-+ (Kamobe spout utp u to 0 to 0 to χ to χ kumi←-L+to l- I season ←-←- Glossy glossy υ glossy (Glossy (force Q-Podiatric glossy Ebet and y 8mi 8e meeting) I don't have enough legs! (Jl-if-+ko uN4ckoυc tpmomtpq (JO LIOLIO (＼←a Lj@!-1er＜f ()()(＞ L)kCJLL I Todo υ-(4←-(('3(J(Q JM (-1LI-←Φ 81818 勺 ＜＜＜ <<<uyul-1u's←-toα To-Kuri 0\ (fu0koUseoath-ji' :SOΦ(Example Kusei<'SljM h's t・ku1(4<mi 1-t(J(1/) tj(u<Ll':IIJ'-5Ll'JL)'-ILIθQζ ←kohat- +Spout 0ζCζjiko ← ShouQ 勺小5 7! 25 Go; 6 scratch G3 G layer 8 5←'o ah<ot-h u c< yh ζ ← Kito force - (J M4Cj hp 1. +lj (kQL)A＜ f (h(M(jMu＜ u<ua+t-+u <<<! −1<< u<vza.
トー Ｑコ＜−（コ（）Ｌｌ（ＬＬ＋艶（セト艶υΦ トΦυＪ： （−１Ｑ −＋ （勢 （ｊ ｋ （ｗ Ｑ Ｌｌ）ｔｌＱ ｕｕｇｈ ｕ０Ｉ３ｔ５０＜ ＬＩＱ：Ｌｌ（ｊｃＪ’ｃト町 ｈａａｕｙ （＼（−ト−←−０−０−υＭ Ｌ）Ｍ （） リーＬ）ｗｕｐｑ （Ｊ Φ０ ΦＱΦｌｊ（ｌｊ（！−ｔ１ −＋ Ｌ５θｌｊ（！（ｊｌ−５ｈ硝←９ト的ｈｔｉ ｕｏｈ＋ａ ａｙ＜ｙｈ ｙ ｕｃｔｕｏ−ｕ気（） ｕｈｕ”−＋ ｔ）ＡｕＺＵｘ： ＧＬ＋ｅＬ＋Ｑ １−＋ト！、 ＣＪｏ４＋５＜ ＜！−Ｉ＜ｈ＜ｈ ？に一！−＋ｉ−＋ｋ（１ −ｔ ｋ６１−＋Ｏ，（コ！＋Ｉ（：Ｌ５＞ ＬＩＭＬＩ”−ＩＬＩＭＵ＠ ｔ −＋−１＜勢 （−１（的Ｃ５’−１１−１噌←勺←鳴ｈｓ ＜＋ｔｓ＜ ｕ、 ｏ＜＜ａｏ ｔ、３＞（３＞＜３＞−炬、： ！−＋ｅＬｌ−←−０旬←Φ ０ Φ０←Ｕ←（匈ＩＪ＠ ｔｊ ＼Ｑ 馬←心 ト一←−←−ＬＩ１．５ ＜＜＜ ＣＱ １−ｔＬＪＩ−ｑＬｌトＩＬ ＜”−＊＜Ｚ＜ＺＬＩｈ ｕコυ−ｔ５Ｃ 口Ｃｌ−＋ｋｇΦＵΦトΦ←−＜ Ｍ ＜ ＞ （−＋ ＜ Ｗ （ｊ Φ ← （ト心ト（（χ ｔ、Ｌ５Ｎｋ υθυＣ（９トヘトヘ←へυΦＱΦＱΦ ←） トいト鴫 Ｑ勢０勢←４←Ｊ：！−＋ 心 ロ −ａｙ＜禰 ロ ＼Ｑ ＼ｈｏ ｉ−＋ｃｔｈｉ ｕ＜ｕ＜ｕ８Ｉ： ｉ−＋ｕｈｕυａｇｕｅ←＠ ＃７０？０ ｆ−ＯＱコ（５３←鵡ト心←−ｃ ｕｙｖｙｕｙ ｈΦ←Φトヘ←へ←へ υＱ ＋ｕへＱへ Ｌｌ’２ｕ’Ｊ＜０＜ ロＣｕｅ ＜ｅｙｅ＜＞ｔｉｌ：＜Ｗｕ’ ｒＬｌ’ｌＣＪ’ＣＪ’−ａ （ｊ’１ｃｊｌ−＋（Ｍ ｈ’ａＵＺｕｃ＆ＵＬ ｔＪｃｋ Ｕ＜＜＜ｔＪ’、３ １．５シ（−ｇｂｇｂｇξ シミ足ミ讐策 ８ 粘８ま←に？ｈ（（←ト←トトト ト的←切 （コにコ（：３ Ｌ５０（５６（ｏ ＜ｔｏ＜ｔ。To Qko<-(ko()Ll(LL+Shin)(Set Shinshi υΦ ToΦυJ: (-1Q -+ (force (j k (w Q Ll) tlQ uugh u0I3t50< LIQ:Ll(jcJ’cto town haauy (＼(−ト−←−0−0−υM L) M () Lee L) wupq (J Φ0 ΦQΦlj (lj(!-t1 -+ L5θlj(!(jl-5h ni←9t hti uoh+a ay<yh y uctuo-u き() uhu”-+ t)AuZUx: GL+eL+Q 1-+to! , CJo4+5<<! -I<h<h? Niichi! −+i−+k(1 -t k61-+O,(ko!+I(:L5> LIMLI”-ILIMU@t -+-1＜force (-1(targetC5'-11-1噌←勺←冐hs +ts＜ u, o<<ao t, 3>(3><3>-Ko, : !-+eLl-←-0shun←Φ 0 Φ0←U←(匈IJ＠tj ＼Q horse←心ト一←−←−LI1.5 ＜＜＜ CQ 1-tLJI-qLl-tIL <”-*<Z<ZLIh ukoυ-t5C Mouth Cl-+kgΦUΦToΦ←-＜ M ＞ (-＋ ＜ W (j Φ ← (Toshinto((χ t, L5Nk υθυC(9tohetohe←toυΦQΦQΦ ←) Toito Shizuku Q group 0 group ← 4 ← J:! -＋ Heart ro -ay＜纰 ro ＼Q ＼ho i-+cthi u<u<u8I: i-+uhuυague←@#70?0 f-OQko (53←Pumpkin heart←-c uyvyuy hΦ←Φtohe←to←to υQ +u to Q Ll’2u’J<0< LoCue <eye<>til:<Wu’ rLl'lCJ'CJ'-a (j'1cjl-+(Mh'aUZuc&UL tJck U<<<tJ', 3 1.5 shi (-gbgbgξ stain foot revenge measure 8 Sticky 8 ←? h((←To←Tototo Toto←cut (Koniko(:3 L50(56(o<to<t.
＜−ｓ＜＋！＜＋Ｌ （Ｊｌ−ＩＣＪ’ａ（Ｊ−υ−Ｑ−ｔｐｕ＋、５ｕｃｕ ｕｏ−ｕｃｂｕｗ ａ＜ ＠＜トｋ＜’ｈ＜１．Ｉ ＣＪ’ｊｕｌ−ｉｕｌｖ ＬｌＯｈ：ＩＵ−ＣＵΦＵ鵡 く＼く＼（−υ−−Φ（ｈｌ−＋Ｃ’ｌ（ｈ ｔ ’トｆｍｈＮ！−’ ＣＪ＆（Ｊｔ−，１←コ←コトコ （−＜勢（頓 ←コＣ コじ！む！じ！ 乏ご乏ご〉ご じ３じ４Ｃ的Ｃ旬Ｏ偽 ａｃ＜ｃｕセ Ｃ切く 頓べ的＜＞＜’ｈ＜＞ （−１（−１（酬 く＼く＼く−＜ｈａ＜Ｑ＜Ｑ ＵＬ ５ＬＩＬ５ｕＬ５ （−，１（−Ｊ（−Ｊｕ：５ｔＪｏ、＋ｊ：Ｉ ロｅｏｃｕ ｃ ｕａｕ＞ｕｅｈ（−＜的（−に−＜−＋＜−＋ ｕＬ１５’ｔｔｊｌｖｕＬ ｐｑ（ｕｕ ｕ＋ｊｕｕｕｃ ｕ＜Ｕ＜ｖ＜と Ｆｉｇ、２０３／７７゜ ４４９０ ４５００ ４５ｉＯ４５２０４５３０４５４０４５５０ＧＣＡ↑ＣＣ τＧτＧ ｆｆｌ！ＧＱ＾ｆｆｉ ｍＡ ＡＡＷ ２ ＣＩ’１ＧＡＧＧτ丁Ａ Ｔ４５６０ ４５フＯ４５１１０４５９０４６００４６１０４６２０人τＧζＸ −リＶ＝Ｔ テテＣコＩｘｘスン；Ｇ 入＾テＮ０ｘＭ：Ｔ ５ ’Ｉ’Ｇフ１ てジばズ；ｔ： Ｃ入テ＾＾＾テＲＯＴ ＴＴ入s６ ４６３０ ４４４０ ４６５０ ４６！Ｏ４６７０４５８０４６９０人、ｍλ＾ ＡＭ ＣテＣＡＣテＧＧＣＣ入’ｒｃａｃｃテＧ＾＾Ｃ＾Ｇ入〒！テＣＣテ Ｃ テテテＣＣＣτテテ ＣＣ＾ＣＡテ＾ａｘ ｍｘ４フ００ ４フ１０ ４７２０ ４７３０ ４７４０ ４７５０ ４ＭＯ丁テフ１て＝＝ｒｎ：Ｃｆｆｌ ＧＴ ｆｆｌ ＪｆｆｌｊＪＩＡＧ！’？？ ｍＡ ＪＬ％？ｆｆｒＡＧＡ ＡＡ？Ｃ Ｃ？Ｔ？Ａ？４フフ０ ４フＳｏ ４７！０ ４１１００ ４８１０ ４１２０ ４＠３０５１９０ ５２００ ５２１０ ５２２０’５２３０ ５２４０ ５ ２５０Ｇ丁ＧτＣ＾ＴτＡ＾ ＾ユＷλλ ＾ＣＣ℃コＸジー；入 τ＾ゴフＩ Ｃ五−Ｊ−ば××二人八へ＾＾＾！入入τＧＣテ ＣＣフ１工１αRＮ：＾ ７９９０ ８０００ ８０１０ ＠０２０ １０３０ ＠０４０ １１０５０（ ｉｉＧＧｃＴｅ ＡＧＧＧＡＧＧＴＣＣｎ ＃ＪＬＡＡＴＡ ｆテテテＣテ丁Ａ ｃＡ ５ＡＡＡ？ ＡｆｆｉＡＡＡＡＴＣＴ！１０６０ ８０７０ ５ｏｌｏ ＠０９０ １１００ １１１１０ ８１２０Ｔ？Ｇτ丁入ＣＡＡＧＣＡＣＡテ丁 テテＧＧ ｔ；ＭｌＮＫ心テテテτＡＧＯテＣ丁丁ＡＣＡＣ丁丁テ＾ＡＧ７丁丁 ガジＶ−−でテＧ丁入テb〒Ｇ〒Ｃ丁 １１１３０ ８１４０ １１１５０ ＠ｘｇｏ ＋ｎ）Ｏ１１ａｏ １！９０Ｑ 真＝℃テσ■ゴσ！にゴσｘ−Ｃ六コ℃ゴαロフαｘ：１丁Ｃ丁σ■ゴσロフＣ Ｋゴ’ｆｆにムチαＭスｉコてゴＧ３２００ ＋１２１０ ８２２０ ＆２３０ １２４０ ８２５０ ８２１ｉ０＋ＧＧ？ ？ＧＣＡＡ？ＣＡＴＡ ＡテテＣ ｔｉＣＣ入？ ？Ａ丁Ｇ丁テＣＡＧＣＡｆｆＴＣ為ＧｋＴＣＴ〒ＧＡＴｆｆｆｆ Ａ ＧテＧテテbＡＧＱ： ８２７０ １２８０ ＠２９０ ８３００ １３１０ １３２０ ６３３０８４ １０ ８４２０ １４３０ ＠４４０ １４５０ ｓｕｅ １１４７０ＧＧＣＣ ＣＡＧＣＡＧ ｋｋＴｃαシリ℃Ａｉχ講んりＳＭ： ＡＧＪＬＧ＆ｉコーＣ入 献にλＯ＝に心ＧＡｉχ講α万℃Ｃυｖ五〇ズー１１１４１１０ ８４９０ １ １５００ ８ＳＬＯ５１５２０８５３０８５４０ＡＣＡＧＡＡＧＣＣＧ ＾講ｊ Ｊリリｕン＝ＣＣＣテフ１１１ｘズ二〜コ ＧｋＧ（にシＶシν；＾ＣａＡＴＴ ＧｋｋｌＪ−Ｔ ＣＣテＡＣ`ＣＡＧＡ ＧＡＧＭ）ＸＴＡＣＣ １１５５０８５６０１＋５フＯ８５１１０１１５９０１１６００８６１０Ｃ入ム ＡＣＴＡ？ＡＡ ＡＴＡＴｃＡＱｃＣＴ ＣＡＴＣＡＣａＱＣｄ５ ＣＴｈｋ） ａＴＧＴｃ λＣＭａｈＧａＧＴ ＧＧＣＡＴＴＴτ`ＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧ？ ８６２０ ５ｇ３ｏ ｌＨ４０１１６５０８６６０１１６７０８６８０丁ＧＣＣ ？ＣＡＡＣＡ ＭＡＣＴＧＴＡＣＡ ＡＣＣ？ＴＣ？ＧＣＡ ＧτＧＧＧＡＣＡ ＧＧ ＭＣＣＣＡＣＡＴＧ ＣＣＡ〒ＣＡＣＪ？Ａ@ＣＡＧＧＣＡＡＧＡＣ ＠７６０ １フ７０ １１７８０ １１７９０ １１８００ １１８１０ ８８ ２０＄９フ０ ８９１１０ ８８９０ ９０００ ９ＣｎＯ１１０２０９０３０ ＡＧＧＡＧＣＡＧＣＡσｒに℃入ＴＧＡＣαＩｆｆλ０シｇ ！ ＧＴ’１ＣＣ ｋＴＧＡＣ！ ！９０４０ ９０５０ ｓａｇｏ ５ｏ７ｏ ５ｏｓｏ ５ｏｓ ｏ ｓｚｏ。<-s<+! ＜+L (Jl-ICJ’a(J-υ-Q-tpu+, 5ucu uo-ucbuw a<@<tk<’h<1. I CJ’jul-iulv LlOh:IU-CUΦU鵡 く＼く＼(−υ−−Φ(hl−+C’l(h t 'tofmhN! −’ CJ&(Jt-, 1←KO←Kotoko (-<force(ton ←KOC Koji! nothing! character! Poor poverty〉Goji 3ji 4C C seasonal O fake ac<cu se C cut Tonbe's <><'h<> (-1 (-1 5LIL5uL5 (-,1(-J(-Ju:5tJo,+j:I roeocu c uau>ueh(-<target(-ni-<-+<-+ uL15'ttjlvuL pq(uu u+juuuc u<U<v< and Fig, 203/77° 4490 4500 45iO4520453045404550GCA↑CC τGτG ffl! GQ^ffi mA AAW 2 CI’1GAGGτdingA T4560 45fuO451104590460046104620 people τGζX -RiV=T TeteCkoIxxsn;G Enter^teN0xM:T 5 'I'G F1 Tejibazu;t: C entry te^^^te ROT TT entry s6 4630 4440 4650 46! O467045804690 people, mλ^ AM〒C te CAC te GGCC enter'rcacc teG^^C^G enter〒! Te CC Te C Tete CCCτ Tete CC^CA Te^ax mx4fu00 4fu10 4720 4730 4740 4750 4MO dingtef1te==rn:Cffl GT ffl JffljJIAG! '? ? mA JL%? ffrAGA AA? C C? T? A? 4fufu 0 4fuSo 47!0 41100 4810 4120 4@305190 5200 5210 5220'5230 5240 5 250G Ding GτC＾TτA＾ ＾YWλλ ＾CC℃こ C5-J-Baxx Futari to Hachi ^^^! Entry τGCte CCfu1tech1αRN: ^ 7990 8000 8010 @020 1030 @040 11050 ( iiGGcTe AGGGAGGTCCn #JLAATA f Tete C Te Ding A cA 5AAA? AffiAAAATCT! 1060 8070 5olo @090 1100 11110 8120T? Gτ-in CAAGCACA-te-ding Tete GG t; MlNK heart tete τAGO teC ding ding ACAC ding ting te^AG7 ding Gazi V--de te G cho in te b 〒G 〒C cho 11130 8140 11150 @xgo +n) O11ao 1!90Q Shin=℃teσ■goσ! nigo σx-C6ko ℃Go αrov αx: 1choCchoσ■GoσrovC K Go'ff ni Whip αM Suiko Tego G3200 +1210 8220 &230 1240 8250 821i0+GG? ? GCAA? CATA A Tete C Enter tiCC? ? A Ding G Ding Te CAGC AffTC For GkTCT〒GATffff A G te G te bAGQ: 8270 1280 @290 8300 1310 1320 633084 10 8420 1430 @440 1450 sue 11470GGCC CAGCAG kkTcα Siri ℃Aiχ Lecture SM: AGJLG & iCoC To give λO=to mind GAi 1500 8SLO5152085308540ACAGAAGCCCG ＾Lecture j J Ririn = CCC Tef 111x Zuji~ko GkG GkklJ-T CCTE AC`CAGA GAGM) XTACC 1155085601+5F O8511011590116008610C input ACTA? AA ATATcAQcCT CATCACaQCd5 CThk) aTGTc λCMahGaGT GGCATTTτ`CAGCCTGCAG? 8620 5g3o lH40116508660116708680 GCC ? CAACA MACTGTACA ACC? TC? GCA GτGGGACA GG〒MCCCACATG〒CCA〒CACJ? A@CAGGCAAGAC @760 1f 70 11780 11790 11800 11810 88 20$9fu0 89110 8890 9000 9CnO110209030 ℃ into AGGAGCAGCAσr TGACαIffλ0sig! GT’1CC kTGAC! ! 9040 9050 sago 5o7o 5oso 5os o szo.
ＧコーＣルｘコΩαＭｌｋＧＴ’ＩＣＣＡｉシＶ−Ａ（：ＣＡ αコロご猷−１ ａ αＭｔルア１℃ｃ Ａ？ＧＪＣＣＮｘ講ＣＣＡＣＣＡＣbＡ１ Ｃ＾ＧＣ＾ＧＣＡＧＣＡＧ丁テＣＣＡ？（！ ！ Ｗ ＡＧ’！’ＴＣＣＡＭＡ ！ ＣＡＧＣＡＧＣＡＴＣ人ＧテテＣｃＡ↑Ｇ八 ＣへＡＣＣｅＣＣ＾Ｇ Ｗ ＡＧＴ？ＣＣＡＴＧＡ Ｃ（ＪＣＣ５ｍ ＡＧ？？ＣｅＡ？ＧＡ９２５０ ９ ２６０ ！２７０ ９２６０ ９２９０ ９３００ ９３＠０αシ（℃Ｎｘコｔ αＭにλ０コ１ＣλフＩＧα献にスａ”ｒｒｃｃツゴωに口に口ＣＣＭにλシ１ ＧＣ献ｔλσｉ℃Ｃλ買２９３２０ ９３３０ ９３４０ ９３５０ １３ｇ０ ９３７０ タ３１１０ＣＡＣＣＡｅｃＡＧｃａ ｅｉ−εＷ ！ ｅ気−４ｍ ９３９０ ９４００ ９４１０ ９４２０ ！４３０ シ１４０ ９４５０ＡＧ ＣＡＧＣ＾Ｇｅ＾ＧＣ＾ＧＣ為ＧＣＡＧＣＡＧＣ＾ＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ？丁Ｃ Ｃ＾ＣＧＡＣＣＡＧＣＡＧ Ｃ〒テＡＣＣテＡＣテ テ`ＣテＡＡＣＡＧＣ １１７７０ １１７！ｔｏ ｕ１９０ １１８００ １１８１０ １１１２０ １１８３０τ真シ匡℃テＧ丁ＡＣＣテ＾ＣτテＧＣ丁ＸＣＸ丁入ＴＣｉｉＣＣｉ ＝■ｉてゴＣＣ〒ＣＣ？（ズコｍテＣＣ真ズコ工＝テテＣ？丁ＣＣτＣeＣＣ １１８４０ｌｌ＠Ｓｏ １１８６０ １１８７０ １１８１１０ １１１９０ １１９００ｍｅｃ ｅｃ ｉズ７ＣＣ？ＣＣ？ ＣＣ？ＣＣ？ＣＣ？Ｃ２＋ Ｃ ＴＣ？Ｃσｒ■シ。G code C code x code Ωα MlkGT'ICCAi a αMt Lua 1℃c A? GJCCNx course CCACCACbA1 C^GC^GCAGCAGdingteCCA? (! W AG’!’TCCAMA ! CAGCAGCATC person G tete CcA↑G8 C to ACCeCC^G W AGT? CCATGA C (JCC5m AG??CeA?GA9250 9 260! 270 9260 9290 9300 93@0αshi(℃Nxkot αM to λ0 ko 1 C λ to IG GC donation tλσi℃Cλ purchase 29320 9330 9340 9350 13g0 9370 ta3110CACCAecAGca ei-εW! e-ki-4m 9390 9400 9410 9420! 430 shi140 9450AG CAGC^Ge^GC^GC for GCAGCAGC^GCAGCAGCAG? Ding C C^CGACCAGCAG C 11770 117! to u190 11800 11810 11120 11830τAccess ACCTe＾CτGC =■i tego CC〒CC? (Zuko mte CC Mazuko Kou = Tete C? Ding CCτCeCC 11840ll@So 11860 11870 118110 11190 11900mec ec is 7CC? CC? CC? CC? CC? C2+C TC? Cσr■shi.
１１９１０ １１９２０ １１９３０ １１９４０ １１！５０ ｕ９６０ １ １９７０丁ＣτＴｉＣＴＧＣＡ ＣＡＩ１ｍＡＧＴＡ！ ｍ ＧＡＧＣＴＴ？Ｃ ＧＡ Ｇ丁テＡ入ｆｌＧｃテテＧＮＡＴ丁丁 丁ＧＣＩＡ＾ＧＣＡＧH Ｇ丁丁ＣテＧＣＣ丁Ａ Ａｌ！ｆｆ１ｌＴＡＴ ＡＣＣｆｆＴＡＧＣ＆ ２ Ｔ ＧＴ’ＴＣＡＣ丁ＣＧ ＡＣτＡｅ 丁ｍ１２０５０ １２０＆０ １２０７０ ｍ２０８０ １２０９０ １２１００ １２１１０ＧＴＧＣＴＧＧＧＡ〒τＧ ＧテＧＣａｋＴ２ＣＴＣＡＴＧＡＧＡＴＧＣＴｅ’Ｉ’Ｇ’Ｔ？ＡＱＪ１．’ｌ ’ＧＣＣ」４１コ＝ｅＡ１２１２０ １２１３０ １２ｉ４０ １２１５０ １ ２１ｇ０ １２１７０ １２ｉ１１゜ＣＡＣＡＣ１？ＡＣＣ？Ｃ？ＧＣＴｌａ？ Ａ ｆｌＡ ！ Ａｉ冨ズズ工講ＣＡｏコυＷ講１ｉｃｃｖμＣＣｖ−Ｇ１２Ｘ ９Ｇ １２２００ １２２１０ １２２２０ １２２３０ １２２４０ １２２ ５０ｃＡｃ＋ｒＧＮｘＭ：Ｎズ講Ｃロリ３Ａ ｉ−℃Ｇ■Ｖ論λＪＣＴＴＣｒｈ Ｑ）Ａ Ｃ）ＡＴＧＧＴＧ）４０Ｍ−りｃｃｃｒｒｍ１２２Ｇ０ １２２７０ １２２１１０ ｍ２２９０ １２３００ １２３１０ １２３２０人Ｃ入ＧＣτ ＣＪＡＧＧ入Ｇ？ＣＣｔＧＡ＆ 入！！ ＣＴＡＣＣＭｍＣＣＡ 入Ｃテテ丁丁 ムへτＧ τ丁テテ入ＧＡＧＣＡ λ）ｄＪＡ■モ汲sｋ ｉ２３３０ １２３４０ ｕ３５０ １２３１ｉ０ Ｌ２コア０ １２３ａｏ １２３９０ＴテＡＡＧＧ＾ＧＧ入 Ｗ入轟ＧＣλλ入ＴテＧＣ＾丁 Ｃ入Ｇ入ｉ τＷ入Ｃ丁ＧＡ入＾入ＴＣ丁ＡＡＡＣズＡＧＡＣ入ＧＧＡゴ＾Ａ入ＧＧ`Ｃ １２４００ｍ２４１０ １２４２０ １２４３０ １２４４０ １２４５０ １ ２４６０人ＡτＧ丁入Ａ＾τ＾（ａυ−ｉＡＴ ！ ！ τ■ｔテ１１ゴテτテ ＧＴｒ門℃ぼテ’！”１’Ｇ？ＪＬ？’ｌ’ＣＣＣｌ３１７０ １３１１１０ １３１９０ １３２００ １３２１０ １３２２０ １３２３０１３２４０ １ ３２５０ １３２６０ １３２７０ １３２６０ １３２９０ ！３３００Ｑ− ）Ｃ入τに℃＾Ｔ賀ｚ■ｉＣ＾Ｃルンジリ２λ〒丁テＣテルスジリ函ＧＣＣＴＴ ンｍＴｉズコ℃丁Ａ丁ＧＣ＾０献χ：−テＧＡ１３３１０ Ｌ：！３２０ １３ ３３０ １３３４０ １３３５０ １３３６０ １３３７０１３４５０ １３４ ６０ １３４７０ １３４８０ １３４１０ １３５００ １３５１Ｏ人ＣＣＣ ＡＡＡ丁ＧＡ ＧＧＣ？Ｗ ｍ ＴＧＡＧＡＡＧＧＣＡ ＡＴＣＡＡＧＡＧＣＡ ？Ｇ五１１ｘ−リ：λ？ ？ＴＣ−てジＶス：入H １３５２０ １３５３０ １３５４０ １３５ＳＯ１３Ｓ６０ １３５７０ １ ３５１１０Ｌ３６６０ １３１ｉ７０ １３６８０ １３６９０ ｍ３７００ １３７１０ １３７２０丁丁ＣごＮｐりにフ Ｃ！ｅ門ｍ 〒１献コロー℃丁Ｇ 入Ｑに一υり詰１Ｃ入ＧτＧτテＡ１３８τＧ？ｌココリばｍフＣ〜ン−１にを ０ＴＬ３７３０ １３７４０ １３７５０ １３Ｍ０ １３７７０ １３１１１ ０ １３７９０ｍ’ｒａコーｉＧ ！ Ａ！テＭａｔに℃テＧＣＣＭ丁Ｇ丁Ｃ！ ＾ＧＧＡＩコＩＡＡＴＣＡ（ゴαンズ請Ｇ丁ＣＣ丁Ｌ３８００ １３ａｌｏ ｍ ３８２０ １３８３０ １３８４０ １３８５０ １３１１６０丁τＧＣＣＣＣ ＡＴＧ ＴＡ−シーχに℃）ＴＴＣＴＴＧＣＴ）Ａ ＣＴＣＣＴＣ工１＾＾丁Ｃ ＣλＭ丁八〇ＧＧテへルア肛ｔぼＧＡＧＧＧ`τＴＣτ０ Ｇ為五１１ニー１；λλ ｃ’ｔｖｒ＾ＣＣＡｆｆｌ ｆｌシー：ｉＡＴ ＧＣ ＣＡＧＧＣ（：’ｒＧ ＧＧＧ丁ｅ 丁！Ｇ ＧＡｍＡＧＧ`Ｇ １３９４０ １３９ＳＯ１３９６０１３９７０１３９８０１３９９０１４０００ １４０Ｘｏ １４０２０ １４０３０ １４０４０ １４０５０ １４０６０ １４０フＯＣ丁Ｇ＾ンＣ＾ＡＧＣ入＾Ｃ入丁ＧτＡＣテ ＧＣ丁＾ＧＣＡＧＣテ 入↑Ｃ＾丁入τ丁ＣＣ九へへ口Ｃ＾Ｃλ丁ＣテＣ＾入テＣテＣ？Ｇ 噤O入＾ ＣテＧ入Ａ丁 Ｘ４０ａＯ１４０１１０１４１００１４１１０１４１２０１４１３０１４１４０ １４２２０１４２３０１４２４０１４２５０１４２６０１４２フ０ １４２１１ ０Ｃ＾Ｃ＾Ｃ入丁入Ｃ入ＣＡＣＡＣＡＣ入１：Ａ（ＪＣＡｅ＾Ｃ＾Ｃ講、ＣλＣ 入Ｃ入ＣＡＣ入 Ｃ入Ｃ＾Ｃ＾Ｃ＾Ｃ＾ Ｃ入ＣＡＣ＾Ｃ＾ＣO ＣＡＣＡＣＡ Ｃ入τＧ 人λｍλＧ入τＡＧＡＧＧＧ丁ＧＡＣＡ 入丁ＣテＧ入＾＾ＧＧＣＡτＡ＾ＣＡ ＧＧ丁 ＡＪＬＣ）Ｇ入面ＡＧＧ 入Ｇ入＾＾丁＾＾＾Ａ fＣ入八へ入Ｇテλ 丁 テ＾ＡＧテＣ丁ＴＧＧ ？ＧＴＧＧ？Ａ？ＡＡ ＧＧ？ｍＧ ？ＡＣＣＡＡＧＧ ＧＧ ＧＡＪＩＡＡ＾＾ＧＱＡ ＣＴＡ？ＣＣ？Ａｆｆｉ HＣＡＧＧ？ＡＧＧ Ａ １４４３０ １４４４０ １４４５０ １４４ｇ０ １４４７０ １４４Ｂ０ ．１４４９０＾Ｇ＾ＧＣ入ＧＧＣフ 丁子ＧＡＧＡＣＡＣＡ ｍ ＣＡＧＧＣ） ＬＴＴＡＧ ＧＣＣ？ＣＡＧＴ（ｆＴ ＧＧＡＡＴ？ＣＪＴＣＴＧＷｆｆ窒bＣ １４５）０ １４５８０ ０５９０ １４６００ １４６１０ １４ｇ２０ １ ４６３０丁ＧＡＧＡＡＧＧＣＴ ？ＪＩＡ入ｋＴＧ＾ＡＣＴＧＧＧＧＴＴＧＧＧ ＧＧＧＧＧＧＧ？ＡＧ Ｇ丁ＣＣ入丁入λ＾ＡＧ入丁ＡＧＧＧＡＧf ＧＧ丁 丁子ＧτＧＧ丁 １４６４０ １４６５０ １４１ｉ６０ １４６７０ １４６Ｂ０ １４６９０ １４７００τＡＧＴＧＧＧ？ＧＡ ＧＧＧ入入丁ＧＡ丁丁丁子？Ｃ丁ＣｋＧＧ ＴＧ ＧＧ丁ＣＣ入丁ＣＧＡ Ｇ丁ＣＧへｃｃｃｃｃ ｃ丁＾丁ＡＧ丁Ｇ`Ｇ 丁ＣＧ丁ＡＴ丁＾Ｇへ ＧＣテＣ１ （ＪＮ） （ＡＡ） ２．３ ２Ｂ ３．５ ２．８ −く 偽常染色体境界 Ｆ：ｉｎ ７りｒ 要約 本発明は、真獣下綱（胎盤）＠乳類の胚の性をコントロールする遺伝子をコード するＤＮＡを提供する。核酸断片、タンパク質、ポリペプチド、抗体および関連 産物並びに医療および農業でのそれらの使用が提供される。本発明は、診断にお いて、または商業上重要な動物の子孫の性をコントロールするために使用するこ とができる。11910 11920 11930 11940 11!50 u960 1 1970th CτTiCTGCA CAI1mAGTA! m GAGCTT? C GA G Ding Te A fl Gc Te Te GNAT Ding GCIA＾GCAGH G Ding Ding C Te GCC Ding A Al! ff1lTAT ACCffTAGC&2T GT’TCAC Ding CG ACτAe Ding m12050 120 & 0 12070 m2080 12090 12100 12110GTGCTGGGGA〒τG GTEGCakT2CTCATGAGATGCTe’I’G’T? AQJ1. 'l 'GCC' 41 pieces = eA12120 12130 12i40 12150 1 21g0 12170 12i11゜CACAC1? ACC? C? GCTla? A flA! Ai Tomizuzu Engineering Course CAo CoυW Course 1iccvμCCv-G12X 9G 12200 12210 12220 12230 12240 122 50cAc+rGNxM: N's lecture C loli 3A i-℃G■V theory λJCTTCrh Q) A C) ATGGTG) 40M-ricccrrm122G0 12270 122110 m2290 12300 12310 12320 people C-in GCτ CJAGG entering G? CCtGA& enter! ! CTACCMmCCA Enter C Tete Ding Ding Muhe τG τDing Tete enter GAGCA λ) dJA■Mo sk i2330 12340 u350 1231i0 L2 core 0 123ao 12390T TeAAGG^GG entering W entering Roaring GCλλ entering T TeGC^ding C entering G entering i τW enters C block GA enters TC block AAACs AGAC enters GGA go^A enters GG`C 12400m2410 12420 12430 12440 12450 1 2,460 people AτG into A＾τ＾ (aυ-iAT! ! τ■tte 11 pieces GTr gate ℃bote’! “1’G?JL?’l’CCCl3170 131110 13190 13200 13210 13220 1323013240 1 3250 13260 13270 13260 13290! 3300Q- )C in τ℃^Tgaz■iC^Crunjiri2λ〒dingteCtersujiriboxGCCTT m Ti Zuko ℃ Ding A Ding GC^0 donation χ:-TEGA13310 L:! 320 13 330 13340 13350 13360 1337013450 134 60 13470 13480 13410 13500 1351O peopleCCC AAA Ding GA GGC? W m TGAGAAGGCA ATCAAGAGCA ? G511x-Li: λ? ? TC-Teji Vs: Enter H 13520 13530 13540 135SO13S60 13570 1 35110L3660 131i70 13680 13690 m3700 13710 13720 C! e-mon m One υ packed into the input Q 1C input GτGτte A138τG? l cocoli ba m f C~n-1 ni 0TL3730 13740 13750 13M0 13770 13111 0 13790m’rako iG! A! te Mat ℃te GCCM ding G ding C! ^GGAIKO IAATCA 3820 13830 13840 13850 131160 τGCCCC ATG TA-Cchi ℃) TTCTTGCT) A CTCCTC 1^^ Ding C CλMcho 80GG Teherua anal tobo GAGGG`τTCτ0 G Tamego 11 knee 1; λλ c’tvr^CCAffl fl sea: iAT GC CAGGC(:’rG GGG ding e ding! G GAmAGG`G 13940 139SO1396013970139801399014000 140Xo 14020 14030 14040 14050 14060 140fu OC ding G^n C^AGC entering ^C entering GτAC te GC ding^GCAGC te Enter↑C＾Ding enter τ Ding CC 9 to the mouth C^Cλ Ding C teC^Enter teC teC? G 噤O enter ＾ C te G in A cho X40aO1401101410014110141201413014140 1422014230142401425014260142fu0 14211 0C^C^C entered into C into CACACAC into 1: A (JCAe^C^C course, CλC Input C Input CAC Input C C^C^C^C^C Input CAC^C^CO CACACA C-in τG Person λmλG entering τAGAGGGding GACA entering entering CTEG ^^GGCAτA^CA GG Ding AJLC) G entering side AGG entering G ^^ Ding ^^^^ A fC entering eight entering G Teλ Ding Te^AGteCdingTGG? GTGG? A? AA GG? mG? ACCAAGG GG GAJIAA^^GQA CTA? CC? Affi HCAGG? AGG A 14430 14440 14450 144g0 14470 144B0 ．． 14490＾G＾GC enter GGC clove GAGACACA m CAGGC) LTTAG GCC? CAGT(fT GGAAT? CJTCTGWff NibC 145) 0 14580 0590 14600 14610 14g20 1 4630 GAGAAGGCT? JIA entry kTG＾ACTGGGGTTGGG GGGGGG? AG GG CC GG Clove GτGG Ding 14640 14650 141i60 14670 146B0 14690 14700τAGTGGG? GA GGG entering GA ding ding clove? C-choCkGG TG GG Ding CC entered CGA G Ding CG ccccc c Ding ＾ Ding AG Ding G`G To Ding CG Ding AT Ding^G GC Te C1 (JN) (AA) 2.3 2B 3.5 2.8 −ku pseudoautosomal boundaries F:in 7rir summary The present invention encodes a gene that controls the sex of a eutherian (placental) @mammalian embryo. Provide the DNA for Nucleic acid fragments, proteins, polypeptides, antibodies and related Products and their uses in medicine and agriculture are provided. The present invention is useful for diagnosis. used to control the sex of offspring of commercially important animals. I can do it.
補正書の写しく翻訳文）提出書 （特許法 第１８４条の８） 平成４年１２月２８日Copy and translation of written amendment) Submission form (Patent Law Article 184-8) December 28, 1992
Claims (40)
Applications Claiming Priority (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB909014446A GB9014446D0 (en) | 1990-06-28 | 1990-06-28 | Gene |
| GB9014446.0 | 1990-06-28 | ||
| GB9015488.1 | 1990-07-13 | ||
| GB909015488A GB9015488D0 (en) | 1990-07-13 | 1990-07-13 | Gene |
| GB9110085.9 | 1991-05-09 | ||
| GB919110085A GB9110085D0 (en) | 1991-05-09 | 1991-05-09 | Sex determining gene |
| PCT/GB1991/001057 WO1992000375A1 (en) | 1990-06-28 | 1991-06-28 | Sex determining gene |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05507850A true JPH05507850A (en) | 1993-11-11 |
Family
ID=27265163
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP91511410A Pending JPH05507850A (en) | 1990-06-28 | 1991-06-28 | sex-determining gene |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0536213A1 (en) |
| JP (1) | JPH05507850A (en) |
| AU (1) | AU670229B2 (en) |
| CA (1) | CA2085102A1 (en) |
| WO (1) | WO1992000375A1 (en) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU4225593A (en) * | 1992-05-01 | 1993-11-29 | Genzyme Corporation | Method for identifying transgenic preimplantation embryos |
| US6103886A (en) * | 1997-04-11 | 2000-08-15 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Genes in the non-recombining region of the Y chromosome |
| ATE326228T1 (en) | 1997-07-01 | 2006-06-15 | Vicam Lp | METHOD FOR SEX DETERMINATION OF MAMMAL OFFSPRING |
| GB9926161D0 (en) * | 1999-11-04 | 2000-01-12 | Pig Improvement Company Uk Lim | Methods |
| EP2141049A1 (en) | 2008-07-04 | 2010-01-06 | Arno Martin Sauer | Holding device for a registration plate |
| CN101792802B (en) * | 2010-02-10 | 2012-06-27 | 四川大学华西医院 | SRY specificity TaqMan probe primer pair and real-time fluorescent SRY gene detection kit |
| HUE041584T2 (en) * | 2014-06-26 | 2019-05-28 | Regeneron Pharma | Methods and compositions for targeted genetic modifications and methods of use |
| CN112481308B (en) * | 2019-09-11 | 2023-04-25 | 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 | Novel sex-determining gene HAKAI, its regulation and control effect and application |
| CN113122539B (en) * | 2021-04-15 | 2023-12-05 | 石河子大学 | RNA interference fragment of donkey Zfy gene, expression vector and application thereof |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1988001300A1 (en) * | 1986-08-12 | 1988-02-25 | The Australian National University | Sex determination in ruminants using y-chromosome specific polynucleotides |
| WO1989002440A2 (en) * | 1987-09-21 | 1989-03-23 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Y-specific dna hybridization probes and uses therefor |
-
1991
- 1991-06-28 AU AU80931/91A patent/AU670229B2/en not_active Ceased
- 1991-06-28 WO PCT/GB1991/001057 patent/WO1992000375A1/en not_active Application Discontinuation
- 1991-06-28 CA CA002085102A patent/CA2085102A1/en not_active Abandoned
- 1991-06-28 EP EP91911788A patent/EP0536213A1/en not_active Withdrawn
- 1991-06-28 JP JP91511410A patent/JPH05507850A/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0536213A1 (en) | 1993-04-14 |
| AU670229B2 (en) | 1996-07-11 |
| AU8093191A (en) | 1992-01-23 |
| WO1992000375A1 (en) | 1992-01-09 |
| CA2085102A1 (en) | 1991-12-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU756620B2 (en) | Mutations in the myostation gene cause double-muscling in mammals | |
| Heisterkamp et al. | Human bcr-abl gene has a lethal effect on embryogenesis | |
| Osborn et al. | Tissue-specific and insulin-dependent expression of a pancreatic amylase gene in transgenic mice | |
| RU2262229C2 (en) | Method for selecting animals by signs inherited according to parental imprinting mechanism | |
| KR20170058985A (en) | Materials and methods for producing animals with short hair | |
| Hobbs et al. | Removing the vertebrate-specific TBP N terminus disrupts placental β2m-dependent interactions with the maternal immune system | |
| Sasaki et al. | Loss of maternal ANNEXIN A10 via a 34-kb deleted-type copy number variation is associated with embryonic mortality in Japanese Black cattle | |
| JPH05507850A (en) | sex-determining gene | |
| AU2016222909A1 (en) | Transgenic mice | |
| US20100107265A1 (en) | Double-muscling in mammals | |
| AU712016B2 (en) | Ikaros transgenic cells and animals | |
| CN107937439B (en) | Application of gene and construction method of animal model | |
| JP4749541B2 (en) | Nucleic acids involved in responder phenotypes and their applications | |
| CN104388560A (en) | Method for marking Y chromosome and application thereof | |
| JP2005500835A (en) | PERV screening method and use thereof | |
| Fujiwara et al. | Analysis of the flanking regions of the human α-lactalbumin gene responsible for position-effect independent expression | |
| Culp | Random DNA integrations as an approach to insertional mutagenesis in the zebrafish (Brachydanio rerio) | |
| AU629169B2 (en) | Method of creating new breeds of mammals | |
| JP2004065040A (en) | Murine nanos-like gene | |
| WO2018085967A1 (en) | Genetically humanized mammals expressing human serum albumin and uses thereof | |
| Rumley | Development of an inducible transgenic overexpression line for Zebrafish brd2a | |
| Farahmand | Isolation and characterisation of the GnRH1 gene in Tilapia (Oreochromis niloticus)-with a view of producing transgenic sterile fish | |
| Gubbay | A molecular genetic analysis of testis determination in the mouse | |
| BAKER et al. | Evidence that testicular differentiation in the marsupial, Monodelphis domestica, begins, but does not proceed, in utero | |
| Wößner | The influence of Igκ [Ig-kappa] locus genomic sequences on RS recombination and immunoglobulin light chain isotype expression |