JPH05506562A - 固定化酵素によるヘミセルロースの加水分解の方法および固定化ヘミセルロース分解酵素からなる製品 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 固定化酵素によるヘミセルロースの加水分解の方法および固定化ヘミセルロース 分解酵素からなる製品本発明は、固体担体に吸着することにより固定化されたヘ ミセルロース分解酵素による、キシロ−オリゴマーを含有するヘミセルロース基 質の加水分解の方法に関する。本発明はさらに加水分解の本方法を実行するため に固体担体および該担体に固定されたヘミセルロース酵素または酵素の混合物の 併用に関する。この方法はセルロース工業の廃液を含有するキシロ−オリゴマー からの、および蒸気分解植物材（ｓｔｅａｍ−ｅｘｐｌｏｄｅｄ　ｐｌａｎｔ　 ｍａｔｅｒｉａｌ）からのキシロースの製造に非常に都合がよい。

ヘミセルロース分解酵素、即ちヘミセルラーゼは、キシラナーゼ、β−キシロシ ダーゼおよびエステラーゼを含み加水分解によってヘミセルロース性材料を活発 に切断する。これらキシラナーゼおよびエステラーゼの間では、酵素はキシラン および、カンパ材のキシランのアセチル側鎖を切断し、そして残っているキシロ −オリゴマーは未置換でありおよびβ−キシロシダーゼによってのみ加水分解さ れる。さらに幾つかのあまり知られていない付帯の活性かヘミセルロースを加水 分解する酵素配合物中で見出されてきた。ヘミセルロース分解酵素は、例えばア スペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏ ｄｅｒｍａ）　Ｉ！の菌類ようなある微生物の発酵により製造される。培養培地 それ自体またはそこから分離された酵素画分をヘミセルロースの加水分解におけ る酵素製剤として使用できる。

加水分解反応条件では溶液中で遊離のヘミセルロース分解酵素は比較的短期間の みそれらの活性を保っている。

それらは使用するのに費用がかかりおよび再生が困難である。固体担体に固定さ れた酵素は遊離酵素よりも安定であり、およびそれらはまたより容易に再使用が 可能であり、それゆえヘミセルロース分解酵素の固定に対して幾つかの方法が開 発されてきている。

技術的な固定化酵素によるヘミセルロース溶液の加水分解において一つの大きな 問題は溶液の高い塩含量である。イオン性の材料は担体の表層から酵素を解離す る傾向を示し、よってそのカラムはその酵素活性を速やかに失う。

ヘミセルロース分解酵素は例えば、シリカゲル、アルミナまたは鋼鉄で〔オグン チメイン、　Ｇ、　Ｂ、（Ｏｇｕｎｔｉｍｅｉｎ、Ｇ、Ｂ、）、Ｐｒｏｃ、Ａｎ ｎｕ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｅｎｇ、Ｓｙｍｐ、１９７８．ｖｏｌ、８．ｐ、２７− ３７〕、多孔質ガラスで〔ロガスキー、Ｊ、他（Ｒｏｇａｓｋｉ。

Ｊ、ｅｔａｌ、）、Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｃｒｏｂ、Ｔｅｃｈｎｏｌ、　７　（１ ９８５）　Ｎｏ、　８．　ｐ、　２７−３７）、ファイバーで〔タボビロフ、１ ．他（Ｔａｖｏｂｉｌｏｖ、１．ｅｔ　ａｌ。

）Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　１０４　（１９８６）　３（１９２ ４ｎ）またはベンゾキノンシロクロム担体〔バルセア　Ｄ　他（Ｂａｌｃｅｒｅ 　Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、）　；　Ｃｈｍｉｃａｌ　Ａｂｓｔｒａｃｔ　１００　（ １９８４）９９０９８ｆ）で固定化されてきた。シリカゲル担体の使用はまたシ ミズ（Ｓｈｉｍｉｚｕ）（Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎ ｅｅｒｉｎｇ、−礼９（１９８７）ｐ、５６−２４１）およびアレンザら（Ａｌ ｌｅｎｚａｅｔａｌ、）（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇ ｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｓｙｍｐ、Ｎｏ、１７　（１９８６）ジョン　ウィリーおよ びサンズ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆５ｏｎｓ）　１９８７）によって提案され ている。プラス　Ｊ。

ら（Ｐｕｌｓ　Ｊ、ｅｔ　ａｌ）　（Ｔｒａｎｓ、　Ｔｅｃｈ、　Ｓｅｃ　ｔ。

、Ｃａｎ、Ｐｕ１ｐ　Ｐａｐ　Ａｓ５ｏｃ、３　ｐ、６４−７２および米国特許 ４，２７５，１５９号）は多孔性ガラスピーズ、シリカゲルビーズおよび海砂を 担体としてヘミセルラーゼおよびキシラナーゼ画分の固定化に使用している。

すべてのこれらの先行技術での固定化技術では、酵素は添加剤を使用して担体上 で固定され、それは担体の表面で活性化しおよび／または担体および酵素間に共 有結合の形態をとる。上述の米国特許４，２７５，１５９号〔プラス他（Ｐｕｌ ｓ　ｅｔ　ａｌ、）：ｌに記述されているこの方法では主にキシラナーゼを含有 している酵素画分および主にβ−キシロシダーゼを含有している酵素画分は、両 者の場合、固定剤としてグルタルアルデヒド、カルボジイミドまたは四塩化チタ ンを使用した異なる担体に別々に固定化され、ならびに結果的に２種類の酵素配 合物がキシランの加水分解に使用される。

オグンティメインら（ＯＨｕｎｔｉｍｅｉｎ　ｅｔ　ａｔ、）　（Ｂ　ｉ　ｏ　 ｔｅｃｈｎｏｌ、Ｂｉｏｅｎｇ、２２　（１９８０）ｐ、１１２７−１１４２） はアスペルギルス　ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）から製造さ れた市販の酵素製剤から精製したβ−キシロシダーゼの１０種の異なる担体への 固定化を研究している。固定化を行うことは非常に困難であり、活性および安定 性についての十分な結果はただ四塩化チタンを用いてアルミナに固定した酵素お よびグルタルアルデヒドを用いた多孔性アルキルアミンシリカゲルに固定された 酵素のみで得られている。

つｘｙクストレム、Ｌ　、（Ｗｅｃｋｓｔｒｉｉｍ、　Ｌ、　）およびレイソラ 、　Ｍ、（Ｌｅｉｓｏｌａ、Ｍ）（Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎ ｏｌｏｇｙ、Ｍ、ムーーヤング（Ｍｏｏ−Ｙｏｕｎｇ）およびＣ，Ｗ、Ｏビンソ ン（Ｃ０）Ｖ、　Ｒｏｂｊｎｓｏｎ）編、Ｐｒｏｃ、　６ｔｈ　Ｉｎｔｅｒ、　 Ｆｅｒｍｅｎｔ。

Ｓｙｍｐ、　Ｌｏｎｄｏｎ　Ｃａｎａｄａ　Ｊｕｌｙ２０−２５　１９８０．Ｐ ｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ１９８１、ｐ、２ｌ−２６）は、アスペルギルス　 ニガーから製造された酵素および、ゲルタールアルデヒドを用いてフェノールホ ルムアルデヒド樹脂（デュオライトＳ　７６１　（ＤＵＯＬ［Ｔ［！　Ｓ　７６ １））に固定化された酵素配合物によって亜硫酸廃液に含まれるキシランの加水 分解を研究している。制御した実験では酵素は固定剤を用いずに担体に吸着され る。実験はゲルタールアルデヒドは樹脂中に吸着された酵素活性を維持するのに 必要であることを示した。ゲルタールアルデヒドで固定化さた酵素配合物の半減 期は約３０日である。

酵素のような両性タンパク質はイオン交換体に吸着されることが可能であること もまた周知である。この吸着はさまざまな溶液からの精製酵素の単離に使用され てきた。米国特許第４，１８８，２５０号はイオン交換担体に酵素を固定化する 一つの方法を示している。ヨーロッパ特許第２２２８３８号〔デービス他（Ｄａ ｖｉｅｓ　ｅｔ　ａｌ、）１９８７）　カら強陽イオン交換体へのガンマグロブ リンの固定は公知である。

ヘミセルロース分解酵素を固定する方法の先行技術の欠点は酵素活性のレベルが 常に十分に長期間に申し分な（保持しないことである：他方、固定化において使 用される固定剤よって、担体の再生は複雑すぎるため工業的方法では適用できな いことである。

本発明の目的は長期間の間、酵素がその活性を実質的に劣化しないで保持するこ のような方法による固定酵素によってヘミセルロース溶液を加水分解する方法を 提供することである。担体は再生するのが容易であり、そしてヘミセルロース基 質は例えばセルロース工業からの廃液および蒸気分解植物材の水性抽出物のよう にイオン性成分の高いレベルを含むヘミセルロース溶液であってよい。

これら目的は本発明に従い、固定剤なしての弱陽イオン交換担体に固定されたヘ ミセルロース分解酵素または酵素の混合物を使用して行われる。

更に本発明はキシロ−オリゴマーを含んでいるヘミセルロース溶液の加水分解の 方法に関し、その方法は弱酸性の範囲内の値になるようヘミセルロースの溶液の ｐＨを調整すること、および該溶液を固定剤の添加をすることなく弱陽イオン交 換担体に固定化されたヘミセルロース分解酵素と接触させることを特徴している 。本発明はさらにまたこの方法に育用で弱陽イオン交換担体および固定剤を用い ずに弱陽イオン交換担体に固定されたヘミセルロース分解酵素または酵素の混合 物からなる酵素製剤に関する。

本発明はヘミセルロース分解酵素、好ましくはβ−キシロシダーゼが、弱陽イオ ン交換担体にうま（固定化されるという予期しない発見に基づくものである。ゲ ルタールアルデヒドのような酵素固定剤の使用は必要としない。

本発明において使用に適する弱陽イオン交換担体はマクロポーラスのアクリレー ト樹脂であるデュオライトＣ４６４（ＤＵＯＬ［ＴＥ　Ｃ４６４）およびポリス チレンで補強された凝集カルボキシメチルセルロースを包含する。

本発明で使用されるヘミセルロース分解酵素は通常トリコデルマ属の微生物の発 酵によって生成されるヘミセルラーゼ類に属している。この種類の最も重要なキ シラン分解酵素はキシラナーゼ、β−キシラナーゼ、アセチルエステラーゼおよ びα−グルクロニダーゼである。これら酵素は硫酸アンモニウム沈澱法または限 外ろ適法のような公知の分画手法で酵素溶液から単離される。微生物の発酵で使 用される培養培地自体またはその溶液から分離された酵素画分を本発明の方法に 使用することが可能である。好ましくは、ヘミセルロース基質中に含まれている キシランが始めにキシロ−オリゴマーに前加水分解されている場合は、本発明の 方法は菌（ｆｕｎｇｕｓ）　）リコデルマ・ロンジブラチアタム（Ｔｒｉｃｈｏ ｄｅｒｍａ　ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）　（品種名トリコデルマ・リー サイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）　）によって製造された酵素の混 合物、またはβ−キシロシダーゼのようなその両分を使用する。

固定化は単に担体と緩衝された酵素溶液との混合により行われる。酵素溶液はお およそ３．５ないし５のｐＨ範囲内で緩衝される。酵素溶液は十分な固定化を確 実にするために１ないし４時間担体と接触される。加水分解がカラム中で行われ る場合、固定化は使用されるカラムで行うことができる。

得られた酵素配合物は高イオン濃度においてさえも非常に安定である。これは、 塩溶液によって担体から酵素が溶離される先行技術からは非常に予期できないも のであり；本発明の酵素製剤では、しかしこれらはこの方法で分離され得なかっ た。

加水分解に使用された固定化酵素が活性を失った後、使用したカラムは再生され る。好ましくは希水酸化ナトリウム溶液で、消耗した酵素を洗い去る。吸着した 不純物ならびに消耗した酵素は洗浄で除去される。次に担体をその弱酸によって 元の帯電状態に回復させそして最後に水で洗浄する。その後カラムは新たな酵素 液が装填される。

所望ならば担体をより効果的な技術で洗浄することができる。ポリマー性の担体 は化学的に安定であり、高温で強い化学物質で洗浄されうる。殆どの場合では水 酸化ナトリウムでの１回洗浄が担体の回復に十分である。

本発明による固定化酵素製造を使用した場合、担体を数度再生できる。例えば、 ６回再生した後にもカラムの特性に、顕著な変化は見られなかった。方法の経済 性としては、担体材料は高価なため、再生は主な利点である。

本発明の方法においては、固定剤を使用しないため再生は容易に行われる。

本発明の加水分解工程は蒸気分解植物材およびセルロース工業の廃液からのキシ ロース製造によく適合する。

個々の精製酵素画分が酵素の混合液の代わりに使用される場合、個々の固定化酵 素は連続的なカラム中で使用でき、または基質はオリゴ糖の分子量を減らすため 、部分的に遊離の酵素混合物で前加水分解されることも可能である。例えばキシ ラナーゼおよびエステラーゼで酵素的に前加水分解された蒸気分解カンパ材抽出 物の加水分解において固定化β−キシロシダーセを、使用する場合、優れた結果 が得られる。

以下に続くのは本発明を実施例によってより詳細に説明しようとするものである 。

得られる酵素活性は以下のように分析評価される〔ボータンネン、に、およびプ ラス、Ｊ、トリコデルマ・ジ−サイβ−キシロシダーゼの特徴および可溶性キシ ランの加水分解へのそれの使用（Ｐｏｕｔａｎｅｎ、に、　ａｎｄ　Ｐｕ１ｓ、 Ｊ、。

Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ 　β−ｘｙｌｏｓｉｄａｓｅ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｕｓｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｈｙｄ ｏｒｌｙｓｉｓ　ｏｆ　５ｏｌｕｂｉｌｉｚｅｄ　ｘｙｌａｎｓ）、Ａｐｐｌｉ ｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１９ ８８；再版４７刊（Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　４７）　、テクニカル　リサーチ 　センター　才ブ　フィンランド（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃ ｅｎｔｒｅ　ｏｆ　Ｆｊｎｌａｎｄ）　、　−Ｔ−スポー（Ｅｓｐｏｏ）　１９ ８８　、付　４〕： β−キシロシダーゼ活性は５ｍＭ　ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノ シド（ＰＮＰＸ、シグマ（ＳｙｇｒｎａＮ−２１３２）、０．０５Ｍクエン酸リ ン酸緩衝液、ｐＨ４，５を使用して分析評価される。酵素試料２゜０８ｍを基質 １．８ｍｌと５０’Ｃで１０分間インキュベートする。反応をＩＭ炭酸水素ナト リウム１ｍｌを加えて停止し、遊離したｐ−ニトロフェニルを４００ｎｍで測定 する。活性はカタールで表現される。

キシラナーゼ活性は基質として１％ブナ材キシラン〔エブリンゲロヴア他（Ｅｂ ｒｉｎｇｅｒｏｖａ　ｅｔ　ａｌ、）　、Ｈｏ　Ｉｚｆｏｒｓｃｈｕｎｇ　２± （１９６７）ｐ、γ４−７７の方法により調整されたもの〕を使用して分析評価 されれる。ｐＨ５，３の０．０５Ｍクエン酸〜リン酸緩衝液に粉砕されたキシラ ンをホモジナイズしおよび温めることによって懸濁する。酵素試料（０，２ｍ１ ）を基質溶液１．８ｍｌと５０°Ｃで５分間インキュベートする。

形成された還元糖をＤＮＳ−試薬〔サムナー、Ｊ、Ｂ。

およびソマーズ、Ｇ、Ｆ、、グルコース用のジニトロサリチル法（Ｓｕｍｎｅｒ 、Ｊ、ｂ、　ａｎｄ　Ｓｏｍｅｒｓ、Ｇ、Ｆ、、Ｄｉｎｉｔｏｒｓａｌｉｓｙｌ ｉｃ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｇｌｕｃｏｓｅ、）ラボラトリ−エクスパーリメ ンツ　イン　バイオロジカル　ケミストリー（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｅｘｐｅ ｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、アカデ ミツク出版、ニューヨーク１９４９年、ｐ３８−３９）、を加え、５分間煮沸し 、冷却しモして５４０ｎｍで吸光度を測定して評価する。対照となる糖はキシロ ースを使用しそして活性をカタールで表す。

アセチルエステラーゼは基質として１ｍＭ　α−ナフチルアセテート０．０５Ｍ クエン酸緩衝液溶液、ｐＨ５゜３を使用して分析評価する。基質を始めにエタノ ールの少量に溶解する。酵素試料０．２ｍｌを基質溶液１．８ｍｌと共に５０° Ｃで１０分間インキュベートし、その後、ｐＨ４，３の２０％トゥイーン２０　 （Ｔｗｅｅｎ　２０）を含有している１Ｍ酢酸緩衝液に溶解した０、０１％ファ ストコーリンス　■　塩（Ｐａｓｔ　Ｃｏｒｉｎｔｈ　Ｖ　５ａｌｔ）　ｌ　ｍ 　ｌを添加する。ＩＱ分後５３５ｎｍにおける吸光度を読み取る。活性をカター ルで表す。

本発明の加水分解方法のために固定されるべき適当な酵素は酵素製剤、登録商標 マルチフェクトＫ　（Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ　Ｋ）、カルター（Ｃｕｌｔｏｒ）社 製でキシラナーゼ活性８４０００ｎｋａｔ／ｍｌを含有する。

以下に続く担体材料は当実施例で使用される：登録商標スペザイム　Ｇ　ＣＤ　 （Ｓｐｅｚｙｍｅ　ＧＣＤ）　；カルター社製　凝集ジエチルアミノエチルセル ロース陰イオン交換樹脂、本実施例ではＤＥＡＥと略す；ポリスチレンで補強さ れた凝集カルボキシメチルセルロース、弱陽イオン交換樹脂、本実施例ではＣＭ Ｃと略す； 登録商標デュオライト　Ｓ　７６１　（ＤＵＯＬＩＴ巳Ｓ　７６１）；デュオラ イトインターナショナル（Ｄｕｏｌｉｔｅ　［ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）社製 、ロームアンドハース（Ｒｏｈｍ　＆　Ｈａａｓ）社；吸着樹脂、本実施例では ＤＯＵＬａ　ｄ　ｓと略す；登録商標デュオライト　Ｅ　Ｓ　５６２　（ＤＵＯ ＬＩＴＥ！　ＥＳ　５６２）；デュオライトインターナショナル社製、ロームア ンドハース社；陰イオン交換樹脂、本実施例ではＤＯＵＬａｎｉと略す； 登録商標デュオライト　Ｃ４６４（ＤＵＯＬ［ＴＢ　Ｃ４６４）：デュオライト インターナショナル社製、ロームアンドハース社：弱陽イオン交換樹脂、本実施 例ではＤＯＵＬＣａｔと略す； 登録商標ジアトマセラス　アース　スタンダード　スーパー　セル（Ｄｊａｔｏ ｍａｃｅｏｕｓ　Ｅａｒｔｈ　５ｔａｎｄａｒｄ　５ｕｐｅｒ　Ｃｅ１＋）　； ジョーンズーマンヴイル（Ｊｏｈｎｓ−Ｍａｎｖｉｌｌｅ）社製； 粒状活性炭、ケムビロ：／　ＣＰ　Ｇ　（Ｃｈｅｍｖｉｒｏｎ　ＣＧＣ）社製。

ＣＧＣ担体の製造 ポリスチレンで補強された廣集カルボキシメチルセルロース担体は米国特許第３ ，８２３，１３３号および４゜１６８．２５０号に示されているように製造でき る。押出機中でポリマー、精製繊維状セルロース、充填剤（例えば酸化金属また はケイ酸）および潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸アル ミニウム、または適当な油）を混合し、そして混合物を加熱して可塑状態にする 。混合物を次に押出し、そして冷却した製品を粉砕しそして平均粒子サイズ１０ ０ないし１０００μｍ、好ましくは３５０ないし８５０μｍの範囲になるよう篩 をかける。カルボキシメチル誘導体を得られたポリスチレンで補強された凝集製 品からクロロ酢酸により誘導し、硫酸ナトリウムを使用して反応混合物における 水活性を減少させる。製造した製品のイオン交換容量は０゜１ないし０．２ｍｅ ｑｕｉｖ／ｇである。

カルボキンメチル化を以下に示す実施例によって説明する。

硫酸ナトリウム１５０ｇを水３３５ｍ１に４０℃で溶解する。５０％ＮａＯＨ溶 液８５ｇを添加する。ポリスチレンで補強されたおよび３５０ないし８５０μｍ の粒子サイズをもつ層集セルロース樹脂１５０ｇを得られたアルカリ溶液に懸濁 し、懸濁液を７０’Ｃに加熱する。５０％クロロ酢酸水溶液７５ｇを１時間かけ てゆっくり加え、続いて５０％ＮａＯＨ６５ｇを加え、および最後に別の５０％ クロロ酢酸７５ｇもまた１時間かけて添加する。懸濁液を次に７０°Ｃでさらに ３０分間保ちそして次に４０℃に冷却する。スラリーをＩＭ硫酸１５０ｍ１でｐ Ｈ６，５まで中和し、上澄みが透明になり、細かい粒子から遊離するまで水を傾 瀉する。生成物を８５°Ｃで水で洗浄して可溶性残渣を溶解するように１夜置き 、再度傾瀉し、溢れさせる。得られた生成品のイオン交換容量は０．１６ｍｅｑ ｕｉｖ／ｇである。

実施例１ トリコデルマ・ロンジブラチアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｌ。

ｎｇｊｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）　（品種名トリコデル？−リーサイ（Ｔｒｉｃｈ ｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）　）培地からの酵素溶液を弱陽イオン交換樹脂で ある２種類（ＣＭＣおよびＤＵＯＬ　ｃ　ａｔ）の異なる担体に、本発明の方法 に従って固定化する。

使用する酵素溶液の活性は以下の通りである：キシラナーゼ　１３８６５ｎｋａ ｔ／ｍｌβ−キシロシダーゼ　４２００ｎｋａｔ／ｍｌエステラーゼ　７２０ｎ ｋａｔ／ｍｌ 固定化は以下の２つの組成物を使用して行われた。

１、２０ｇ　担体材料 ９６ｍ１　０．０５Ｍ　クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，０） ４ｍｌ　酵素溶液 ２、２０ｇ　担体材料 ９２ｍＩ　Ｏ，０５Ｍ　クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，０） ８ｍｌ　酵素溶液 担体材料を酵素溶液と＋４°Ｃで４時間にわたり混合する。次に混合物をろ過し 、および結合酵素の活性を測定する。

比較のため酵素を幾つかの実験においてゲルタールアルデヒド（２，５％溶液８ ０ｍ１）に１時間攪拌により固定する。残留アルデヒドを０．０５Ｍのクエン酸 ナトリウム緩衝液約２リツトルで洗い流す。ゲルタールアルデヒドに固定の後再 度酵素活性を測定する。

これらの固定化試験よりの結果を以下の表１ないし３に示す。全ての実験におい ては酵素活性はゲルタールアルデヒドによる固定化の以前（表中「結合型」）お よび以後（表中「固定型」）に測定する。

表１ないし３から見られるように、すべての酵素は弱陽イオン交換樹脂に吸着さ れ（ＣＭＣおよびＤＵＯＬｃａｔ）、および固定化生成品は高い全活性を持つ。

ゲルタールアルデヒドを用いた固定はこの系を改良しない。

実施例２ 固定化酵素の加水分解効果をカラム実験において試験する。カラム実験は４本の 実験室規模カラムにおいて行う。カラムのサイズは５０ｍ１または１００ｍ１で あ、８酵素は４時間酵素溶液中に担体を浸漬することによりカラム上に固定化さ れる。担体を次にクエン酸緩衝液溶１−で洗浄する。５０ｍ１カラムを他の処理 を行わずに固定化酵素／担体配合物で満たす。１００ｍ１カラムには比較として 、酵素の固定のためゲルタールアルデヒド（ＧＡ）を用いて処理（１時間）した 酵素／担体配合物で満たす。

固定化で使用された酵素溶液の分析： β−キシロシダーゼ　５５２ｎｋａｔ／ｍｌキシラテーゼ　２５０００ｎｋａｔ ／ｍｌ・エステラーゼ　２４０ｎｋａｔ／ｍｌ固定化。

５０ｍ１　酵素溶液 ３５０ｍ１　０．０５Ｍクエン酸 緩衝液　ｐＨ５ １００ｇ　担体 結果得られる固定化系の特徴は以下の表４で明らかになる。

表４ ＣＭＣおよびデュオライト０４６４担体への酵素の固定化 酵素活性（ｎｋａｔ／ｇ担体） β　−キシロノダーゼ　キンラｔ−ゼ　エステラーゼＣＭＣ担体 酵素添加　５２０　１４７００　２００酵素吸着　３７４　９５４０　１５０ 担体中の活性　３４６　２９７０　１２６ＧＡ固定化後の 活性　３００　３１８０　１３・７ デユオライト担体 酵素添加　３６４　１０２８８　１４０酵素吸着　３５７　８３７５　８４ 担体中の活性　２３６　３２７２　６８ＧＡ固定化後の 活性　２５０　２４１３　７５ 連続的な加水分解のため、上記の酵素配合物を使用して以下のカラムを調整した 。

１．１００ｍ１カラムを乾燥酵素／ＣＭＣ担体組成物１９．９ｇで満たす。ゲル タールアルデヒドを用いて固定した後の活性は以下のとおりである。

β−キシロシダーゼ　３００　ｎ　ｋ　ａ　ｔ　／　ｇキシラナーゼ　３１８０ ｎｋａｔ／ｇ エステラーゼ　１３７　ｎ　ｋ　ａ　ｔ　／　ｇ２．１００ｍ１カラムを乾燥酵 素／デュオライト組成物２６．３ｇで満たす。ゲルタールアルデヒドを用いて固 定した後の活性は以下のとおりである。

β〜キンロシダーゼ　２５０　ｎ　ｋ　ａ　ｔ　／　ｇキシラナーゼ　２４１３ ｎｋａｔ／ｇ エステラーゼ　７５　ｎ　ｋ　ａ　ｔ　／　ｇ３．５０ｍ１カラムを乾燥酵素／ ＣＭＣ担体組成物１２．５ｇで満たす。固定化は行われない。活性は以下のとお りである。

β−キシロシダーゼ　３４６　ｎ　ｋ　ａ　ｔ　／　ｇキシラナーゼ　２９７０ 　ｎ　ｋ　ａ　ｔ　／　ｇエステラーゼ　１２６　ｎ　ｋ　ａ　ｔ　／　ｇ４． ５０ｍ１カラムを乾燥酵素／デュオライト担体組成物１２．５ｇで満たす。固定 化は行われない。活性は以下のとおりである。

β−キシロシダーゼ　２３６　ｎ　ｋ　ａ　ｔ　／　ｇキシラナーゼ　３２７２ ｎｋａｔ／ｇ エステラーゼ　６８　ｎ　ｋ　ａ　ｔ　／　ｇ加水分解される基質はキシロース ｌ１ｇ／ｌおよびキシランオリゴマー２３ｇ／ｌを含有する蒸気分解カンパ材抽 出物（蒸気分解条件２１０″Ｃ１４分間）である。溶液の総乾物含量は７０ｇ／ ｌであり、およびｐＨは５に調整する。ろ過された溶液を各々のカラムの底に送 り込みそしてカラム１ないし４内でのその流量はそれぞれ１４．４ｍｌ／ｈ、１ ５．０ｍｌ／ｈ、６．９ｍｌ／ｈおよび６．８ｍｌ／ｈである。温度は４５°Ｃ にする。溶離液中のキシロースを２日、４日および７Ｂ後測定する。

結果を以下の表５に示す。

表５ 溶離液中のキシロース量 （溶液１リツトルあたりのグラム数および乾物％）期間　ＣＭＣ／ＧＡ　ＤＵＯ Ｌｃａｔ／ＧＡ　ＣＭＣＤＵＯＬｃａｔ日　ｇ／ｌ　％　ｇ／ｌ　％　ｇ／ｌ　 ％　ｇ／ｌ　％２　２９．２４１．６　３３．４４７．８　２５．６３６．６　 ３５．１５０．１４　２６．９３８．４　３１．０４４．２　２４．３３４，７ 　３２．９４７．０７　２２．５３２．１　３３．１４７．３　２５．４３６， ２　３２．４４６．２結果はカラム活性が７日の実験の間は顕著な劣化の無いこ とを示す。ゲルタールアルデヒドを用いた固定はカラム安定性に影響を示さない 。

実施例３ 固定化酵素を蒸気分解カンパ材からのヘミセルロース溶液の加水分解で試験する 。

固定化は、温度が２２°Ｃであること、ゲルタールアルデヒドを用いた固定が行 われない他は実施例１で記載されたのと同様に行う。

担体： １、セルロース−ベースのＣＭＣＭＣ担体子粒子サイズ３５０し８５０μｍ；イ オン交換容量０．１５ｍｅｑｕｉｖ／ｍｌ；密度０．２５ないし０．３８ｇ／ｍ ｌ。

２、デュオライト　Ｃ４６４；ｐＨ３，８；含水量５７ないし６２％：密度０． ７５ｇ／ｍｌ。

酵素溶液： β−キシロシダーゼ　５４００　ｎ　ｋ　ａ　ｔ　／　ｍ　１エステラーゼ　４ ００ｎｋａｔ／ｍｌ キシラナーゼ　９９１００ｎｋａｔ／ｍｌ固定化・ １、５０ｍ１　酵素溶液 ２５ｍ１　Ｏ，０５Ｍ　クエン酸緩衝液Ｈ５ ３７，５ｇ　ＣＭＣ担体 ２、５０ｍ１　酵素溶液 ２５ｍ１　０．０５Ｍ　クエン酸緩衝液各々の実験に対しカラムを固定化酵素で 満たし、カンパ材加水分解物をカラムを通して送り込む。加水分解物の原液は９ ．０重量％およびｐＨ５である。組成物はキシロース１０ｇ／Ｉおよびオリゴマ ー３２ｇ／Ｉを含有する。温度は４５℃である。カラムを通して溶液はゆっくり 送り込まれ、そのため総加水分解時間は４時間である。

固定化された酵素の不活性化の可能性の検査のためカラム実験を２６日間継続し 、溶液におけるキシロース濃度を測定する。理論的キシロース収量は乾物に基づ き５５％である。

結果を以下の表６に示す。

表６ 固定化酵素を利用した継続的な方法によるキシランのキシロースへの加水分解 期間　ＣＭＣ担体　デュオライト担体 口　乾物のキントス　％　乾物のキンロース　％交換率は非常に高く、理論値（ 遊離酵素を用いて５５％）に近い。際立った不活性化は実験期間では見られなか った。

担体はアルカリ溶液による失活した酵素の洗い流し、酸による活性化、水による 洗浄および新たな酵素をカラムに供給することにより再生される。酵素は担体に 固定化されおよび工程は継続可能である。

実施例４ 固定化酵素による加水分解を２種のキシロ−オリゴマー溶液で行う　溶液１はカ ンパ材加水分解物のクロマトグラフィーによる分離物から得られ、溶液２は遊離 の（固定化されてない）酵素による前加水分解を施された蒸気分解カンパ材抽出 物である。前加水分解以前においては溶液の組成は以下に示す通りである。

溶液１　溶液２ 乾物　：重量％　７．０　１２．５ ｐＨ５，３３，３ キシロース　：ｇ／ｌ　７．４　１６ キシ０−　オリゴｖ−：ｇ／ｌ　４２　４３導電度　：ｍＳ／ｃｍ　２．　７５ 　８．０溶液２はポリマーの大きさを減少させるため遊離（固定化されてない） 酵素による前加水分解がなされる。次の固定化の場合と同様の酵素溶液が使用さ れる；前加水分解温度は４０℃でおよびｐＨ５である。基質１ｇあたり酵素溶液 ０．０１５ｍ１を加える。前加水分解の後、溶液をろ過する。得られた前加水分 解溶液２はキシロース３０　ｇ　／　１を含有する。

トリコデルマによる発酵によって得られたヘミセルラーゼ酵素はｐＨ５のクエン 酸緩衝液中、室温（＝２０ないし２４℃）で４時間混合することにより、弱陽イ オン交換樹脂（デュオライト　Ｃ４６４）に固定化される。

酵素活性を測定する キシラナーゼ　４７０００ｎｋａｔ／ｇエステラーゼ　１７４ｎｋａｔ／ｇ β−キシロシダーゼ　１２００　ｎ　ｋ　ａ　ｔ　／　ｇβ−キシロシダーゼ固 定化収量は１００％、キシラナーゼ収量７６％およびエステラーゼ収量７０％で あった。

加水分解はカラム中、以下に示す条件の下での連続工程として行われる： カラム容積　１０ｍ１ 流量　１力ラム容積／ｈ 温度　４５℃ カラムを１５日間使用した場合の結果：供給溶液　ｇ／ｌ　７．４　３０ 加水分解後ｇ／ｌ　８６　５１ グルコース； 加水分解後ｇ／ｌ　２　３ アラビノース； 加水分解後ｇ／ｌ　３　４ ガラクトース； 加水分解後ｇ／ｌ　１　３ オリゴマー； 加水分解後ｇ／ｌ　１２　１８ １５日間の実験においてはカラムの深刻な劣化または消耗はなかった。再生を試 験する目的でカラムを水酸化ナトリウムで洗浄し、酸で活性化し、水で洗浄し、 新たな酵素を入れる。

実施例５ デュオライト　Ｃ４６４およびＣＭＣ担体を再生実験で使用する。

担体をカラム中で０．５Ｍ水酸化ナトリウム（４カラム容量）を使用して５０℃ で洗浄する。次に担体を０゜５Ｍ硫酸で回復し、水で濯ぎおよびクエン酸緩衝液 でｐＨ５に緩衝する。

新しい酵素をカラムに加えそして固定化する（固定剤は使用しない）。１００カ ラム容量の蒸気分解カンパ材抽出物をカラムに送り込む。

この−巡を６回繰り返す。結果を以下の表７に示す。

表７ 繰り返された固定化（カラムの再生）酵素活性ｎ　ｋ　ａ　ｔ　／　ｇ担体 β　−キシロシダーゼ　エステラーゼ　キシラナーゼ供体　１９３６　２６４　 ３１９２００結合型　１３２１　１５０　１６３３００実験２ 供体　２４２０　３３０　４１５８００結合型　１０９２　１２９　１３９３０ ０実験３ 供体　１６３２　１９２　１６３８００結合型　零　４４　零 実験４ 供体　２７５０　１５５　４１５８００結合型　１３６７　＊　１９３９００ 実験５ 供体　２７５０　２７５　３００２００結合型　１０１４　９８　２１３００ 本測定せず 表７（続き） ｎ　ｋ　ａ　ｔ　／　ｇ担体 β　−キシロシダーゼ　エステラーゼ　キシラナーゼ実験１ 供体　９６２　１３３　３１９２００ 結合型　９５６　９３　１４４５００ 実験２ 供体　１２８５　１７８　２１５１０００結合型　１２７８　１６９　２０５０ ００実験３ 供体　８４４　１０１　８４７００ 結合型　７９１　５７　１５７００ 実験４ 供体　１４２６　８０　２１５６００ 結合型　１２８２　４７　１７９９００実験５ 供体　１４１９　１４２　１５５０００結合型　１３７５　９２　１３４０００ 実験６ 供体　１１６５　１４２　１８６４００結合型　本　５１　３８５００ 本測定せず 結果よりβ−キシロシダーゼのデュオライト担体への結合は２種の他の酵素の結 合が僅かに劣化したのにも係わらず殆ど変化なく残存することが結果から明らか である。ＣＭＣ担体の再生は完全には成功ではないが全ての酵素の結合はある程 度までは劣化する。実験は、吸着力において著しい減少なく固定化を同じ担体で 数回繰り返すことが可能であることを示した。

実施例６ 実験は個々のへミセルラーゼ酵素の結合、弱陽イオン交換担体にあるβ−キシロ シダーゼおよびそのキシロ−オリゴマー加水分解能力の研究のため行われた。

トリコデルマ・ロンジブラチアタムによって製造され、以下の活性を持つ酵素溶 液： キシラナーゼ　２０００００ｎｋａ　ｔ／ｍｌアセチルエステラーゼ　１０００ ｎｋａｔ／ｍｌβ−キシロシダーゼ　４２００ｎｋａｔ／ｍｌを溶液に基づき２ ０重量％の硫酸アンモニウムを添加し、軽く掻き混ぜそして＋４℃で２４時間放 置しておくことによって、２つの画分（ＡおよびＢ）に分離する。画分を５分間 、２０００ｒｐｍの遠心分離により分離する。

β−キシロシダーゼは５４％の収量でもって画分Ａ中に濃厚化され、得られた純 度は３．３倍である。この画分における他のキシラン分解酵素の量は非常に少な い（表８参照）。β−キシロシダーゼはＭＰＩｏ、０００の分離範囲を持つ、Ａ 　アミコンウルトラフィルターＰＭＩ０　（Ａ　Ａａ＋１ｃｏｎ　ｕｌｔｒａ　 ｆｉｌｔｅｒ　ＰＭ　１０）を用いた塩含有量４％までの溶液Ａの限外ろ過（Ｕ 　Ｐ）によってさらに精製される。塩の除去はさらにβ−キシロシダーゼの純化 程度を増加することを包含する（表８参照）。

表８ 硫酸アンモニウムを用いたヘミセルラーゼ画分特定活性ｎｋａｔ／ｍタンパク質 ヘミセルラーゼ　画分　限外ろ過画分 Ｂ キシラナーゼ　１４３０　１３０　１６８０　４２β　−キシロシダーゼ　３０ 　１００　１２　１９５アセチルエステラーゼ　７．５　０．４　９　０．６１ 時間、２５℃およびｐＨ３，７で混合した、限外ろ過した画分Ａ（β−キジロン ダーゼ　４６００ｎｋａｔ／ｍｌ）６０ｍｌおよび樹脂２０ｍ１を使用して、β −キシロシダーゼをデュオライト　Ｃ４６４に固定化する。洗浄した後、樹脂は 結合β−キシロシダーゼ１１０００ｎｋａｔ／ｍｌを含有する。

そこで固定されたβ−キシロシダーゼを酵素的にキシランおよびアセチル側鎖を 切断するために前加水分解された蒸気分解カンパ材抽出物からのキシロ−オリゴ マーの加水分解に使用する。前加水分解においては乾物１ｇあたりの酵素量は： キシラナーゼ１２８０ｎｋａｔ、β−キシロシダーゼ２５ｎｋａ　ｔおよびアセ チルエステラーゼ７ｎｋａ　ｔであり；加水分解期間は２４時間、ｐＨ５および 温度４５°Ｃである。前加水分解において使用される抽出物の組成物は： 乾物、％　１０ ｐＨ４，３ 導電率、ｍ　Ｓ　／　ｃ　ｍ　７ 炭水化物　キシロース溶液に基づく重量％　１．３グルコース溶液に基づ（重量 ％　０．１オリゴ糖　溶液に基づく重量％　４．５前加水分解された抽出物を担 体を介して以下の条件でカラム容量　１０ｍ１ 流量　２力ラム量／ｈ 温度　４５℃ ｐＨ４，３ 固定化酵素による加水分解を３０日間の連続工程で続ける、その後溶液をそのキ シロースおよびオリゴ糖量について分析評価する。結果を以下に示す：濃度　ｇ ／１０ｏｇ キシロース　オリゴ糖 蒸気−分解カンパ材抽出物 −そのまま　１．　３　４．　５ −酵素的前加水分解　２．　５　３．　３−更に固定化β−キシロシ ダーゼを用いて加水分解し 観察期間（３０日）中のキシロース収量の減少は最初の値に比べ単に５％であっ た。

実施例７ 固定化へミセルラーゼをボーランドのセルローザ　スウィーシー（Ｃｅ１ｕｌｏ ｚａ　５ｗ１ｅｃｉｅ）社から得られた副産物からのブナ材前加水分解物に含ま れるキシロ−オリゴマーの加水分解で試験する。ブナ材前加水分解物のキシロ− オリゴマーは、固定化へミセルラーゼを用いた加水分解前にクロマトグラフィー 分離によって純化し、およびその組成物は以下のとおりである。

乾物二％　７．３ ｐＨ５，４ 色〔イクムサ（Ｉｃｕｍｓａ）、ｐＨ５）　１８４００導電率：　ｍ　Ｓ　／　 ｃ　ｍ　４ 炭水化物 一キシロース　０．７％１　９．５％”１−グルコース　０．５％″　７．０％ −一オリゴ糖　３．９％”５３．５％一 本　溶液の重量基づき ネ＊　乾物に基づき 固定化は実施例６において記述したヘミセルラーゼ製剤で行われる。固定化にお いてはヘミセルロースはＯ１５ｍ　ｌ　／　ｇデュオライトＣ４６４担体で使用 され、および結合は２５℃、ｐＨ４，５における４時間の攪拌によって行われる 。デュオライト　０４６４への結合量（よキシラナーゼ　７８９６０ｎｋａｔ／ 原重量に基づく樹脂ｇ β−キシロシダーゼ　２０５０ｎｋａｔ／原重量に基づく樹脂ｇ アセチルエステラーゼ　２５０ｎｋａｔ／原重量を二基づ（樹脂ｇ ブナ材前加水分解物は下記の条件下で連続的なカラムの操作で加水分解される： カラム容量　１０ｍ１ 以下に示すキシロース収量はカラム操作の実施空に得られたものである： 実施時間　キシロース　キシロース 日　溶液基づく　乾物基づ（ 重量％　重量％ ６　２．６５　３６．３ ７　２．６５　３６．３ １４　２．６５　３６．３ １ｇ　２．６５　３６．３ 補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の７１￥１１）

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．ヘミセルロースオリゴ糖および所望によりイオン性成分を含有している水溶 液のｐＨを弱酸性の範囲内の値に調整し、該溶液を固定剤を添加することなく再 生可能な弱陽イオン交換担体に固定されたへミセルロース分解酵素または該酵素 の混合物と接触させること、ならびに該溶液からのキシロースを回収することを 特徴とする；固定化酵素でキシロオリゴマーを含有するヘミセルロース基質を加 水分解する方法。
2. ２．ヘミセルロース加水分解酵素または酵素の混合物がトリコデルマ（Ｔｒｉｃ ｈｏｄｅｒｍａ）属の微生物の発酵から得られる酵素の混合物、またはそれらの 画分であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. ３．トリコデルマ属の微生物がトリコデルマ・ロンジブラチアタム（Ｔｒｉｃｈ ｏｄｅｒｍａｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）（品種名トリコデルマ・リーサ イ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）〕であることを特徴とする請求項２ に記載の方法。
4. ４．弱陽イオン交換担体がポリマーで補強された改質セルロースであることを特 徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載の方法。
5. ５．ポリマーで補強された改質セルロースがポリスチレンで補強された凝集力ル ポキシメチルセルロースであることを特徴とする請求項４記載の方法。
6. ６．弱陽イオン交換担体がデュオライトＣ４６４（ＤＵＯＬＩＴＥＣ４６４）で あることを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載の方法。
7. ７．キシローオリゴマーを含有するヘミセルロース基質が木材加工業からの廃液 であることを特徴とする請求項１ないし６のいずれかに記載の方法。
8. ８．キシローオリゴマーを含有するヘミセルロース基質が蒸気分解植物材（ｓｔ ｅａｍ−ｅｘｐｌｏｄｅｄｐｌａｎｔｍａｔｅｒｉａｌ）であることを特徴とす る請求項１ないし６のいずれかに記載の方法。
9. ９．弱陽イオン交換担体および固定剤の添加することなく該担体で固定化された 、ヘミセルロース分解酵素または酵素の混合物からなることを特徴とする再生可 能な担体で固定化された酵素からなる酵素製剤。
10. １０．ヘミセルロース分解酵素または酵素の混合物がトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈ ｏｄｅｒｍａ）属の微生物の発酵から得られる酵素の混合物またはそれらの画分 であることを特徴とする請求項９記載の酵素製剤。
11. １１．トリコデルマ属の微生物がトリコデルマ・ロンジブラチアタム（Ｔｒｉｃ ｈｄｅｒｍａｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）〔品種名トリコデルマ・リーサ イ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）〕であることを特徴とする請求項１ ０に記載の酵素製剤。
12. １２．弱陽イオン交換担体がポリマーで補強された改質セルロースであることを 特徴とする請求項９ないし１１のいずれかに記載の酵素製剤。
13. １３．ポリマーで補強された改質セルロースがポリスチレンで補強された凝集カ ルボキシメチルセルロースであることを特徴とする請求項１２記載の酵素製剤。
14. １４．弱陽イオン交換担体がデュオライトＣ４６４（ＤＵＯＬＩＴＥＣ４６４） であることを特徴とする請求項９ないし１１のいずれかに記載の酵素製剤。