JPH05506562A - 固定化酵素によるヘミセルロースの加水分解の方法および固定化ヘミセルロース分解酵素からなる製品 - Google Patents
固定化酵素によるヘミセルロースの加水分解の方法および固定化ヘミセルロース分解酵素からなる製品Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
固定化酵素によるヘミセルロースの加水分解の方法および固定化ヘミセルロース
分解酵素からなる製品本発明は、固体担体に吸着することにより固定化されたヘ
ミセルロース分解酵素による、キシロ−オリゴマーを含有するヘミセルロース基
質の加水分解の方法に関する。本発明はさらに加水分解の本方法を実行するため
に固体担体および該担体に固定されたヘミセルロース酵素または酵素の混合物の
併用に関する。この方法はセルロース工業の廃液を含有するキシロ−オリゴマー
からの、および蒸気分解植物材(steam−exploded plant
material)からのキシロースの製造に非常に都合がよい。
ヘミセルロース分解酵素、即ちヘミセルラーゼは、キシラナーゼ、β−キシロシ
ダーゼおよびエステラーゼを含み加水分解によってヘミセルロース性材料を活発
に切断する。これらキシラナーゼおよびエステラーゼの間では、酵素はキシラン
および、カンパ材のキシランのアセチル側鎖を切断し、そして残っているキシロ
−オリゴマーは未置換でありおよびβ−キシロシダーゼによってのみ加水分解さ
れる。さらに幾つかのあまり知られていない付帯の活性かヘミセルロースを加水
分解する酵素配合物中で見出されてきた。ヘミセルロース分解酵素は、例えばア
スペルギルス(Aspergillus)属またはトリコデルマ(Tricho
derma) I!の菌類ようなある微生物の発酵により製造される。培養培地
それ自体またはそこから分離された酵素画分をヘミセルロースの加水分解におけ
る酵素製剤として使用できる。
加水分解反応条件では溶液中で遊離のヘミセルロース分解酵素は比較的短期間の
みそれらの活性を保っている。
それらは使用するのに費用がかかりおよび再生が困難である。固体担体に固定さ
れた酵素は遊離酵素よりも安定であり、およびそれらはまたより容易に再使用が
可能であり、それゆえヘミセルロース分解酵素の固定に対して幾つかの方法が開
発されてきている。
技術的な固定化酵素によるヘミセルロース溶液の加水分解において一つの大きな
問題は溶液の高い塩含量である。イオン性の材料は担体の表層から酵素を解離す
る傾向を示し、よってそのカラムはその酵素活性を速やかに失う。
ヘミセルロース分解酵素は例えば、シリカゲル、アルミナまたは鋼鉄で〔オグン
チメイン、 G、 B、(Oguntimein、G、B、)、Proc、An
nu、Biochem、Eng、Symp、1978.vol、8.p、27−
37〕、多孔質ガラスで〔ロガスキー、J、他(Rogaski。
J、etal、)、Enzyme Microb、Technol、 7 (1
985) No、 8. p、 27−37)、ファイバーで〔タボビロフ、1
.他(Tavobilov、1.et al。
)Chemical Abstracts 104 (1986) 3(192
4n)またはベンゾキノンシロクロム担体〔バルセア D 他(Balcere
D、 et al、) ; Chmical Abstract 100 (
1984)99098f)で固定化されてきた。シリカゲル担体の使用はまたシ
ミズ(Shimizu)(Biotecnologyand Bioengin
eering、−礼9(1987)p、56−241)およびアレンザら(Al
lenzaetal、)(Biotechnology and Bioeng
ineering、Symp、No、17 (1986)ジョン ウィリーおよ
びサンズ(John Wiley &5ons) 1987)によって提案され
ている。プラス J。
ら(Puls J、et al) (Trans、 Tech、 Sec t。
、Can、Pu1p Pap As5oc、3 p、64−72および米国特許
4,275,159号)は多孔性ガラスピーズ、シリカゲルビーズおよび海砂を
担体としてヘミセルラーゼおよびキシラナーゼ画分の固定化に使用している。
すべてのこれらの先行技術での固定化技術では、酵素は添加剤を使用して担体上
で固定され、それは担体の表面で活性化しおよび/または担体および酵素間に共
有結合の形態をとる。上述の米国特許4,275,159号〔プラス他(Pul
s et al、):lに記述されているこの方法では主にキシラナーゼを含有
している酵素画分および主にβ−キシロシダーゼを含有している酵素画分は、両
者の場合、固定剤としてグルタルアルデヒド、カルボジイミドまたは四塩化チタ
ンを使用した異なる担体に別々に固定化され、ならびに結果的に2種類の酵素配
合物がキシランの加水分解に使用される。
オグンティメインら(OHuntimein et at、) (B i o
technol、Bioeng、22 (1980)p、1127−1142)
はアスペルギルス ニガー(Aspergillus niger)から製造さ
れた市販の酵素製剤から精製したβ−キシロシダーゼの10種の異なる担体への
固定化を研究している。固定化を行うことは非常に困難であり、活性および安定
性についての十分な結果はただ四塩化チタンを用いてアルミナに固定した酵素お
よびグルタルアルデヒドを用いた多孔性アルキルアミンシリカゲルに固定された
酵素のみで得られている。
つxyクストレム、L 、(Weckstriim、 L、 )およびレイソラ
、 M、(Leisola、M)(Advances in Biotechn
ology、M、ムーーヤング(Moo−Young)およびC,W、Oビンソ
ン(C0)V、 Robjnson)編、Proc、 6th Inter、
Ferment。
Symp、 London Canada July20−25 1980.P
ergamon Press1981、p、2l−26)は、アスペルギルス
ニガーから製造された酵素および、ゲルタールアルデヒドを用いてフェノールホ
ルムアルデヒド樹脂(デュオライトS 761 (DUOL[T[! S 76
1))に固定化された酵素配合物によって亜硫酸廃液に含まれるキシランの加水
分解を研究している。制御した実験では酵素は固定剤を用いずに担体に吸着され
る。実験はゲルタールアルデヒドは樹脂中に吸着された酵素活性を維持するのに
必要であることを示した。ゲルタールアルデヒドで固定化さた酵素配合物の半減
期は約30日である。
酵素のような両性タンパク質はイオン交換体に吸着されることが可能であること
もまた周知である。この吸着はさまざまな溶液からの精製酵素の単離に使用され
てきた。米国特許第4,188,250号はイオン交換担体に酵素を固定化する
一つの方法を示している。ヨーロッパ特許第222838号〔デービス他(Da
vies et al、)1987) カら強陽イオン交換体へのガンマグロブ
リンの固定は公知である。
ヘミセルロース分解酵素を固定する方法の先行技術の欠点は酵素活性のレベルが
常に十分に長期間に申し分な(保持しないことである:他方、固定化において使
用される固定剤よって、担体の再生は複雑すぎるため工業的方法では適用できな
いことである。
本発明の目的は長期間の間、酵素がその活性を実質的に劣化しないで保持するこ
のような方法による固定酵素によってヘミセルロース溶液を加水分解する方法を
提供することである。担体は再生するのが容易であり、そしてヘミセルロース基
質は例えばセルロース工業からの廃液および蒸気分解植物材の水性抽出物のよう
にイオン性成分の高いレベルを含むヘミセルロース溶液であってよい。
これら目的は本発明に従い、固定剤なしての弱陽イオン交換担体に固定されたヘ
ミセルロース分解酵素または酵素の混合物を使用して行われる。
更に本発明はキシロ−オリゴマーを含んでいるヘミセルロース溶液の加水分解の
方法に関し、その方法は弱酸性の範囲内の値になるようヘミセルロースの溶液の
pHを調整すること、および該溶液を固定剤の添加をすることなく弱陽イオン交
換担体に固定化されたヘミセルロース分解酵素と接触させることを特徴している
。本発明はさらにまたこの方法に育用で弱陽イオン交換担体および固定剤を用い
ずに弱陽イオン交換担体に固定されたヘミセルロース分解酵素または酵素の混合
物からなる酵素製剤に関する。
本発明はヘミセルロース分解酵素、好ましくはβ−キシロシダーゼが、弱陽イオ
ン交換担体にうま(固定化されるという予期しない発見に基づくものである。ゲ
ルタールアルデヒドのような酵素固定剤の使用は必要としない。
本発明において使用に適する弱陽イオン交換担体はマクロポーラスのアクリレー
ト樹脂であるデュオライトC464(DUOL[TE C464)およびポリス
チレンで補強された凝集カルボキシメチルセルロースを包含する。
本発明で使用されるヘミセルロース分解酵素は通常トリコデルマ属の微生物の発
酵によって生成されるヘミセルラーゼ類に属している。この種類の最も重要なキ
シラン分解酵素はキシラナーゼ、β−キシラナーゼ、アセチルエステラーゼおよ
びα−グルクロニダーゼである。これら酵素は硫酸アンモニウム沈澱法または限
外ろ適法のような公知の分画手法で酵素溶液から単離される。微生物の発酵で使
用される培養培地自体またはその溶液から分離された酵素画分を本発明の方法に
使用することが可能である。好ましくは、ヘミセルロース基質中に含まれている
キシランが始めにキシロ−オリゴマーに前加水分解されている場合は、本発明の
方法は菌(fungus) )リコデルマ・ロンジブラチアタム(Tricho
derma longibrachiatum) (品種名トリコデルマ・リー
サイ(Trichodermareesei) )によって製造された酵素の混
合物、またはβ−キシロシダーゼのようなその両分を使用する。
固定化は単に担体と緩衝された酵素溶液との混合により行われる。酵素溶液はお
およそ3.5ないし5のpH範囲内で緩衝される。酵素溶液は十分な固定化を確
実にするために1ないし4時間担体と接触される。加水分解がカラム中で行われ
る場合、固定化は使用されるカラムで行うことができる。
得られた酵素配合物は高イオン濃度においてさえも非常に安定である。これは、
塩溶液によって担体から酵素が溶離される先行技術からは非常に予期できないも
のであり;本発明の酵素製剤では、しかしこれらはこの方法で分離され得なかっ
た。
加水分解に使用された固定化酵素が活性を失った後、使用したカラムは再生され
る。好ましくは希水酸化ナトリウム溶液で、消耗した酵素を洗い去る。吸着した
不純物ならびに消耗した酵素は洗浄で除去される。次に担体をその弱酸によって
元の帯電状態に回復させそして最後に水で洗浄する。その後カラムは新たな酵素
液が装填される。
所望ならば担体をより効果的な技術で洗浄することができる。ポリマー性の担体
は化学的に安定であり、高温で強い化学物質で洗浄されうる。殆どの場合では水
酸化ナトリウムでの1回洗浄が担体の回復に十分である。
本発明による固定化酵素製造を使用した場合、担体を数度再生できる。例えば、
6回再生した後にもカラムの特性に、顕著な変化は見られなかった。方法の経済
性としては、担体材料は高価なため、再生は主な利点である。
本発明の方法においては、固定剤を使用しないため再生は容易に行われる。
本発明の加水分解工程は蒸気分解植物材およびセルロース工業の廃液からのキシ
ロース製造によく適合する。
個々の精製酵素画分が酵素の混合液の代わりに使用される場合、個々の固定化酵
素は連続的なカラム中で使用でき、または基質はオリゴ糖の分子量を減らすため
、部分的に遊離の酵素混合物で前加水分解されることも可能である。例えばキシ
ラナーゼおよびエステラーゼで酵素的に前加水分解された蒸気分解カンパ材抽出
物の加水分解において固定化β−キシロシダーセを、使用する場合、優れた結果
が得られる。
以下に続くのは本発明を実施例によってより詳細に説明しようとするものである
。
得られる酵素活性は以下のように分析評価される〔ボータンネン、に、およびプ
ラス、J、トリコデルマ・ジ−サイβ−キシロシダーゼの特徴および可溶性キシ
ランの加水分解へのそれの使用(Poutanen、に、 and Pu1s、
J、。
Characteristics of Tricoderma reesei
β−xylosidase and its use in the hyd
orlysis of 5olubilized xylans)、Appli
ed Microbiology and Biotechnology 19
88;再版47刊(Publication 47) 、テクニカル リサーチ
センター 才ブ フィンランド(Technical Re5earch C
entre of Fjnland) 、 −T−スポー(Espoo) 19
88 、付 4〕:
β−キシロシダーゼ活性は5mM p−ニトロフェニル−β−D−キシロピラノ
シド(PNPX、シグマ(SygrnaN−2132)、0.05Mクエン酸リ
ン酸緩衝液、pH4,5を使用して分析評価される。酵素試料2゜08mを基質
1.8mlと50’Cで10分間インキュベートする。反応をIM炭酸水素ナト
リウム1mlを加えて停止し、遊離したp−ニトロフェニルを400nmで測定
する。活性はカタールで表現される。
キシラナーゼ活性は基質として1%ブナ材キシラン〔エブリンゲロヴア他(Eb
ringerova et al、) 、Ho Izforschung 2±
(1967)p、γ4−77の方法により調整されたもの〕を使用して分析評価
されれる。pH5,3の0.05Mクエン酸〜リン酸緩衝液に粉砕されたキシラ
ンをホモジナイズしおよび温めることによって懸濁する。酵素試料(0,2m1
)を基質溶液1.8mlと50°Cで5分間インキュベートする。
形成された還元糖をDNS−試薬〔サムナー、J、B。
およびソマーズ、G、F、、グルコース用のジニトロサリチル法(Sumner
、J、b、 and Somers、G、F、、Dinitorsalisyl
ic method for glucose、)ラボラトリ−エクスパーリメ
ンツ イン バイオロジカル ケミストリー(Laboratory expe
riments in biological chemistry)、アカデ
ミツク出版、ニューヨーク1949年、p38−39)、を加え、5分間煮沸し
、冷却しモして540nmで吸光度を測定して評価する。対照となる糖はキシロ
ースを使用しそして活性をカタールで表す。
アセチルエステラーゼは基質として1mM α−ナフチルアセテート0.05M
クエン酸緩衝液溶液、pH5゜3を使用して分析評価する。基質を始めにエタノ
ールの少量に溶解する。酵素試料0.2mlを基質溶液1.8mlと共に50°
Cで10分間インキュベートし、その後、pH4,3の20%トゥイーン20
(Tween 20)を含有している1M酢酸緩衝液に溶解した0、01%ファ
ストコーリンス ■ 塩(Past Corinth V 5alt) l m
lを添加する。IQ分後535nmにおける吸光度を読み取る。活性をカター
ルで表す。
本発明の加水分解方法のために固定されるべき適当な酵素は酵素製剤、登録商標
マルチフェクトK (Multifect K)、カルター(Cultor)社
製でキシラナーゼ活性84000nkat/mlを含有する。
以下に続く担体材料は当実施例で使用される:登録商標スペザイム G CD
(Spezyme GCD) ;カルター社製 凝集ジエチルアミノエチルセル
ロース陰イオン交換樹脂、本実施例ではDEAEと略す;ポリスチレンで補強さ
れた凝集カルボキシメチルセルロース、弱陽イオン交換樹脂、本実施例ではCM
Cと略す;
登録商標デュオライト S 761 (DUOLIT巳S 761);デュオラ
イトインターナショナル(Duolite [nternational)社製
、ロームアンドハース(Rohm & Haas)社;吸着樹脂、本実施例では
DOULa d sと略す;登録商標デュオライト E S 562 (DUO
LITE! ES 562);デュオライトインターナショナル社製、ロームア
ンドハース社;陰イオン交換樹脂、本実施例ではDOULaniと略す;
登録商標デュオライト C464(DUOL[TB C464):デュオライト
インターナショナル社製、ロームアンドハース社:弱陽イオン交換樹脂、本実施
例ではDOULCatと略す;
登録商標ジアトマセラス アース スタンダード スーパー セル(Djato
maceous Earth 5tandard 5uper Ce1+) ;
ジョーンズーマンヴイル(Johns−Manville)社製;
粒状活性炭、ケムビロ:/ CP G (Chemviron CGC)社製。
CGC担体の製造
ポリスチレンで補強された廣集カルボキシメチルセルロース担体は米国特許第3
,823,133号および4゜168.250号に示されているように製造でき
る。押出機中でポリマー、精製繊維状セルロース、充填剤(例えば酸化金属また
はケイ酸)および潤滑剤(例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸アル
ミニウム、または適当な油)を混合し、そして混合物を加熱して可塑状態にする
。混合物を次に押出し、そして冷却した製品を粉砕しそして平均粒子サイズ10
0ないし1000μm、好ましくは350ないし850μmの範囲になるよう篩
をかける。カルボキシメチル誘導体を得られたポリスチレンで補強された凝集製
品からクロロ酢酸により誘導し、硫酸ナトリウムを使用して反応混合物における
水活性を減少させる。製造した製品のイオン交換容量は0゜1ないし0.2me
quiv/gである。
カルボキンメチル化を以下に示す実施例によって説明する。
硫酸ナトリウム150gを水335m1に40℃で溶解する。50%NaOH溶
液85gを添加する。ポリスチレンで補強されたおよび350ないし850μm
の粒子サイズをもつ層集セルロース樹脂150gを得られたアルカリ溶液に懸濁
し、懸濁液を70’Cに加熱する。50%クロロ酢酸水溶液75gを1時間かけ
てゆっくり加え、続いて50%NaOH65gを加え、および最後に別の50%
クロロ酢酸75gもまた1時間かけて添加する。懸濁液を次に70°Cでさらに
30分間保ちそして次に40℃に冷却する。スラリーをIM硫酸150m1でp
H6,5まで中和し、上澄みが透明になり、細かい粒子から遊離するまで水を傾
瀉する。生成物を85°Cで水で洗浄して可溶性残渣を溶解するように1夜置き
、再度傾瀉し、溢れさせる。得られた生成品のイオン交換容量は0.16meq
uiv/gである。
実施例1
トリコデルマ・ロンジブラチアタム(Trichoderma l。
ngjbrachiatum) (品種名トリコデル?−リーサイ(Trich
oderma reesei) )培地からの酵素溶液を弱陽イオン交換樹脂で
ある2種類(CMCおよびDUOL c at)の異なる担体に、本発明の方法
に従って固定化する。
使用する酵素溶液の活性は以下の通りである:キシラナーゼ 13865nka
t/mlβ−キシロシダーゼ 4200nkat/mlエステラーゼ 720n
kat/ml
固定化は以下の2つの組成物を使用して行われた。
1、20g 担体材料
96m1 0.05M クエン酸ナトリウム緩衝液(pH5,0)
4ml 酵素溶液
2、20g 担体材料
92mI O,05M クエン酸ナトリウム緩衝液(pH5,0)
8ml 酵素溶液
担体材料を酵素溶液と+4°Cで4時間にわたり混合する。次に混合物をろ過し
、および結合酵素の活性を測定する。
比較のため酵素を幾つかの実験においてゲルタールアルデヒド(2,5%溶液8
0m1)に1時間攪拌により固定する。残留アルデヒドを0.05Mのクエン酸
ナトリウム緩衝液約2リツトルで洗い流す。ゲルタールアルデヒドに固定の後再
度酵素活性を測定する。
これらの固定化試験よりの結果を以下の表1ないし3に示す。全ての実験におい
ては酵素活性はゲルタールアルデヒドによる固定化の以前(表中「結合型」)お
よび以後(表中「固定型」)に測定する。
表1ないし3から見られるように、すべての酵素は弱陽イオン交換樹脂に吸着さ
れ(CMCおよびDUOLcat)、および固定化生成品は高い全活性を持つ。
ゲルタールアルデヒドを用いた固定はこの系を改良しない。
実施例2
固定化酵素の加水分解効果をカラム実験において試験する。カラム実験は4本の
実験室規模カラムにおいて行う。カラムのサイズは50m1または100m1で
あ、8酵素は4時間酵素溶液中に担体を浸漬することによりカラム上に固定化さ
れる。担体を次にクエン酸緩衝液溶1−で洗浄する。50m1カラムを他の処理
を行わずに固定化酵素/担体配合物で満たす。100m1カラムには比較として
、酵素の固定のためゲルタールアルデヒド(GA)を用いて処理(1時間)した
酵素/担体配合物で満たす。
固定化で使用された酵素溶液の分析:
β−キシロシダーゼ 552nkat/mlキシラテーゼ 25000nkat
/ml・エステラーゼ 240nkat/ml固定化。
50m1 酵素溶液
350m1 0.05Mクエン酸
緩衝液 pH5
100g 担体
結果得られる固定化系の特徴は以下の表4で明らかになる。
表4
CMCおよびデュオライト0464担体への酵素の固定化
酵素活性(nkat/g担体)
β −キシロノダーゼ キンラt−ゼ エステラーゼCMC担体
酵素添加 520 14700 200酵素吸着 374 9540 150
担体中の活性 346 2970 126GA固定化後の
活性 300 3180 13・7
デユオライト担体
酵素添加 364 10288 140酵素吸着 357 8375 84
担体中の活性 236 3272 68GA固定化後の
活性 250 2413 75
連続的な加水分解のため、上記の酵素配合物を使用して以下のカラムを調整した
。
1.100m1カラムを乾燥酵素/CMC担体組成物19.9gで満たす。ゲル
タールアルデヒドを用いて固定した後の活性は以下のとおりである。
β−キシロシダーゼ 300 n k a t / gキシラナーゼ 3180
nkat/g
エステラーゼ 137 n k a t / g2.100m1カラムを乾燥酵
素/デュオライト組成物26.3gで満たす。ゲルタールアルデヒドを用いて固
定した後の活性は以下のとおりである。
β〜キンロシダーゼ 250 n k a t / gキシラナーゼ 2413
nkat/g
エステラーゼ 75 n k a t / g3.50m1カラムを乾燥酵素/
CMC担体組成物12.5gで満たす。固定化は行われない。活性は以下のとお
りである。
β−キシロシダーゼ 346 n k a t / gキシラナーゼ 2970
n k a t / gエステラーゼ 126 n k a t / g4.
50m1カラムを乾燥酵素/デュオライト担体組成物12.5gで満たす。固定
化は行われない。活性は以下のとおりである。
β−キシロシダーゼ 236 n k a t / gキシラナーゼ 3272
nkat/g
エステラーゼ 68 n k a t / g加水分解される基質はキシロース
l1g/lおよびキシランオリゴマー23g/lを含有する蒸気分解カンパ材抽
出物(蒸気分解条件210″C14分間)である。溶液の総乾物含量は70g/
lであり、およびpHは5に調整する。ろ過された溶液を各々のカラムの底に送
り込みそしてカラム1ないし4内でのその流量はそれぞれ14.4ml/h、1
5.0ml/h、6.9ml/hおよび6.8ml/hである。温度は45°C
にする。溶離液中のキシロースを2日、4日および7B後測定する。
結果を以下の表5に示す。
表5
溶離液中のキシロース量
(溶液1リツトルあたりのグラム数および乾物%)期間 CMC/GA DUO
Lcat/GA CMCDUOLcat日 g/l % g/l % g/l
% g/l %2 29.241.6 33.447.8 25.636.6
35.150.14 26.938.4 31.044.2 24.334,7
32.947.07 22.532.1 33.147.3 25.436,
2 32.446.2結果はカラム活性が7日の実験の間は顕著な劣化の無いこ
とを示す。ゲルタールアルデヒドを用いた固定はカラム安定性に影響を示さない
。
実施例3
固定化酵素を蒸気分解カンパ材からのヘミセルロース溶液の加水分解で試験する
。
固定化は、温度が22°Cであること、ゲルタールアルデヒドを用いた固定が行
われない他は実施例1で記載されたのと同様に行う。
担体:
1、セルロース−ベースのCMCMC担体子粒子サイズ350し850μm;イ
オン交換容量0.15mequiv/ml;密度0.25ないし0.38g/m
l。
2、デュオライト C464;pH3,8;含水量57ないし62%:密度0.
75g/ml。
酵素溶液:
β−キシロシダーゼ 5400 n k a t / m 1エステラーゼ 4
00nkat/ml
キシラナーゼ 99100nkat/ml固定化・
1、50m1 酵素溶液
25m1 O,05M クエン酸緩衝液H5
37,5g CMC担体
2、50m1 酵素溶液
25m1 0.05M クエン酸緩衝液各々の実験に対しカラムを固定化酵素で
満たし、カンパ材加水分解物をカラムを通して送り込む。加水分解物の原液は9
.0重量%およびpH5である。組成物はキシロース10g/Iおよびオリゴマ
ー32g/Iを含有する。温度は45℃である。カラムを通して溶液はゆっくり
送り込まれ、そのため総加水分解時間は4時間である。
固定化された酵素の不活性化の可能性の検査のためカラム実験を26日間継続し
、溶液におけるキシロース濃度を測定する。理論的キシロース収量は乾物に基づ
き55%である。
結果を以下の表6に示す。
表6
固定化酵素を利用した継続的な方法によるキシランのキシロースへの加水分解
期間 CMC担体 デュオライト担体
口 乾物のキントス % 乾物のキンロース %交換率は非常に高く、理論値(
遊離酵素を用いて55%)に近い。際立った不活性化は実験期間では見られなか
った。
担体はアルカリ溶液による失活した酵素の洗い流し、酸による活性化、水による
洗浄および新たな酵素をカラムに供給することにより再生される。酵素は担体に
固定化されおよび工程は継続可能である。
実施例4
固定化酵素による加水分解を2種のキシロ−オリゴマー溶液で行う 溶液1はカ
ンパ材加水分解物のクロマトグラフィーによる分離物から得られ、溶液2は遊離
の(固定化されてない)酵素による前加水分解を施された蒸気分解カンパ材抽出
物である。前加水分解以前においては溶液の組成は以下に示す通りである。
溶液1 溶液2
乾物 :重量% 7.0 12.5
pH5,33,3
キシロース :g/l 7.4 16
キシ0− オリゴv−:g/l 42 43導電度 :mS/cm 2. 75
8.0溶液2はポリマーの大きさを減少させるため遊離(固定化されてない)
酵素による前加水分解がなされる。次の固定化の場合と同様の酵素溶液が使用さ
れる;前加水分解温度は40℃でおよびpH5である。基質1gあたり酵素溶液
0.015m1を加える。前加水分解の後、溶液をろ過する。得られた前加水分
解溶液2はキシロース30 g / 1を含有する。
トリコデルマによる発酵によって得られたヘミセルラーゼ酵素はpH5のクエン
酸緩衝液中、室温(=20ないし24℃)で4時間混合することにより、弱陽イ
オン交換樹脂(デュオライト C464)に固定化される。
酵素活性を測定する
キシラナーゼ 47000nkat/gエステラーゼ 174nkat/g
β−キシロシダーゼ 1200 n k a t / gβ−キシロシダーゼ固
定化収量は100%、キシラナーゼ収量76%およびエステラーゼ収量70%で
あった。
加水分解はカラム中、以下に示す条件の下での連続工程として行われる:
カラム容積 10m1
流量 1力ラム容積/h
温度 45℃
カラムを15日間使用した場合の結果:供給溶液 g/l 7.4 30
加水分解後g/l 86 51
グルコース;
加水分解後g/l 2 3
アラビノース;
加水分解後g/l 3 4
ガラクトース;
加水分解後g/l 1 3
オリゴマー;
加水分解後g/l 12 18
15日間の実験においてはカラムの深刻な劣化または消耗はなかった。再生を試
験する目的でカラムを水酸化ナトリウムで洗浄し、酸で活性化し、水で洗浄し、
新たな酵素を入れる。
実施例5
デュオライト C464およびCMC担体を再生実験で使用する。
担体をカラム中で0.5M水酸化ナトリウム(4カラム容量)を使用して50℃
で洗浄する。次に担体を0゜5M硫酸で回復し、水で濯ぎおよびクエン酸緩衝液
でpH5に緩衝する。
新しい酵素をカラムに加えそして固定化する(固定剤は使用しない)。100カ
ラム容量の蒸気分解カンパ材抽出物をカラムに送り込む。
この−巡を6回繰り返す。結果を以下の表7に示す。
表7
繰り返された固定化(カラムの再生)酵素活性n k a t / g担体
β −キシロシダーゼ エステラーゼ キシラナーゼ供体 1936 264
319200結合型 1321 150 163300実験2
供体 2420 330 415800結合型 1092 129 13930
0実験3
供体 1632 192 163800結合型 零 44 零
実験4
供体 2750 155 415800結合型 1367 * 193900
実験5
供体 2750 275 300200結合型 1014 98 21300
本測定せず
表7(続き)
n k a t / g担体
β −キシロシダーゼ エステラーゼ キシラナーゼ実験1
供体 962 133 319200
結合型 956 93 144500
実験2
供体 1285 178 2151000結合型 1278 169 2050
00実験3
供体 844 101 84700
結合型 791 57 15700
実験4
供体 1426 80 215600
結合型 1282 47 179900実験5
供体 1419 142 155000結合型 1375 92 134000
実験6
供体 1165 142 186400結合型 本 51 38500
本測定せず
結果よりβ−キシロシダーゼのデュオライト担体への結合は2種の他の酵素の結
合が僅かに劣化したのにも係わらず殆ど変化なく残存することが結果から明らか
である。CMC担体の再生は完全には成功ではないが全ての酵素の結合はある程
度までは劣化する。実験は、吸着力において著しい減少なく固定化を同じ担体で
数回繰り返すことが可能であることを示した。
実施例6
実験は個々のへミセルラーゼ酵素の結合、弱陽イオン交換担体にあるβ−キシロ
シダーゼおよびそのキシロ−オリゴマー加水分解能力の研究のため行われた。
トリコデルマ・ロンジブラチアタムによって製造され、以下の活性を持つ酵素溶
液:
キシラナーゼ 200000nka t/mlアセチルエステラーゼ 1000
nkat/mlβ−キシロシダーゼ 4200nkat/mlを溶液に基づき2
0重量%の硫酸アンモニウムを添加し、軽く掻き混ぜそして+4℃で24時間放
置しておくことによって、2つの画分(AおよびB)に分離する。画分を5分間
、2000rpmの遠心分離により分離する。
β−キシロシダーゼは54%の収量でもって画分A中に濃厚化され、得られた純
度は3.3倍である。この画分における他のキシラン分解酵素の量は非常に少な
い(表8参照)。β−キシロシダーゼはMPIo、000の分離範囲を持つ、A
アミコンウルトラフィルターPMI0 (A Aa+1con ultra
filter PM 10)を用いた塩含有量4%までの溶液Aの限外ろ過(U
P)によってさらに精製される。塩の除去はさらにβ−キシロシダーゼの純化
程度を増加することを包含する(表8参照)。
表8
硫酸アンモニウムを用いたヘミセルラーゼ画分特定活性nkat/mタンパク質
ヘミセルラーゼ 画分 限外ろ過画分
B
キシラナーゼ 1430 130 1680 42β −キシロシダーゼ 30
100 12 195アセチルエステラーゼ 7.5 0.4 9 0.61
時間、25℃およびpH3,7で混合した、限外ろ過した画分A(β−キジロン
ダーゼ 4600nkat/ml)60mlおよび樹脂20m1を使用して、β
−キシロシダーゼをデュオライト C464に固定化する。洗浄した後、樹脂は
結合β−キシロシダーゼ11000nkat/mlを含有する。
そこで固定されたβ−キシロシダーゼを酵素的にキシランおよびアセチル側鎖を
切断するために前加水分解された蒸気分解カンパ材抽出物からのキシロ−オリゴ
マーの加水分解に使用する。前加水分解においては乾物1gあたりの酵素量は:
キシラナーゼ1280nkat、β−キシロシダーゼ25nka tおよびアセ
チルエステラーゼ7nka tであり;加水分解期間は24時間、pH5および
温度45°Cである。前加水分解において使用される抽出物の組成物は:
乾物、% 10
pH4,3
導電率、m S / c m 7
炭水化物 キシロース溶液に基づく重量% 1.3グルコース溶液に基づ(重量
% 0.1オリゴ糖 溶液に基づく重量% 4.5前加水分解された抽出物を担
体を介して以下の条件でカラム容量 10m1
流量 2力ラム量/h
温度 45℃
pH4,3
固定化酵素による加水分解を30日間の連続工程で続ける、その後溶液をそのキ
シロースおよびオリゴ糖量について分析評価する。結果を以下に示す:濃度 g
/10og
キシロース オリゴ糖
蒸気−分解カンパ材抽出物
−そのまま 1. 3 4. 5
−酵素的前加水分解 2. 5 3. 3−更に固定化β−キシロシ
ダーゼを用いて加水分解し
観察期間(30日)中のキシロース収量の減少は最初の値に比べ単に5%であっ
た。
実施例7
固定化へミセルラーゼをボーランドのセルローザ スウィーシー(Ce1ulo
za 5w1ecie)社から得られた副産物からのブナ材前加水分解物に含ま
れるキシロ−オリゴマーの加水分解で試験する。ブナ材前加水分解物のキシロ−
オリゴマーは、固定化へミセルラーゼを用いた加水分解前にクロマトグラフィー
分離によって純化し、およびその組成物は以下のとおりである。
乾物二% 7.3
pH5,4
色〔イクムサ(Icumsa)、pH5) 18400導電率: m S /
c m 4
炭水化物
一キシロース 0.7%1 9.5%”1−グルコース 0.5%″ 7.0%
−一オリゴ糖 3.9%”53.5%一
本 溶液の重量基づき
ネ* 乾物に基づき
固定化は実施例6において記述したヘミセルラーゼ製剤で行われる。固定化にお
いてはヘミセルロースはO15m l / gデュオライトC464担体で使用
され、および結合は25℃、pH4,5における4時間の攪拌によって行われる
。デュオライト 0464への結合量(よキシラナーゼ 78960nkat/
原重量に基づく樹脂g
β−キシロシダーゼ 2050nkat/原重量に基づく樹脂g
アセチルエステラーゼ 250nkat/原重量を二基づ(樹脂g
ブナ材前加水分解物は下記の条件下で連続的なカラムの操作で加水分解される:
カラム容量 10m1
以下に示すキシロース収量はカラム操作の実施空に得られたものである:
実施時間 キシロース キシロース
日 溶液基づく 乾物基づ(
重量% 重量%
6 2.65 36.3
7 2.65 36.3
14 2.65 36.3
1g 2.65 36.3
補正書の翻訳文提出書(特許法第184条の71¥11)
Claims (14)
- 1.ヘミセルロースオリゴ糖および所望によりイオン性成分を含有している水溶 液のpHを弱酸性の範囲内の値に調整し、該溶液を固定剤を添加することなく再 生可能な弱陽イオン交換担体に固定されたへミセルロース分解酵素または該酵素 の混合物と接触させること、ならびに該溶液からのキシロースを回収することを 特徴とする;固定化酵素でキシロオリゴマーを含有するヘミセルロース基質を加 水分解する方法。
- 2.ヘミセルロース加水分解酵素または酵素の混合物がトリコデルマ(Tric hoderma)属の微生物の発酵から得られる酵素の混合物、またはそれらの 画分であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 3.トリコデルマ属の微生物がトリコデルマ・ロンジブラチアタム(Trich odermalongibrachiatum)(品種名トリコデルマ・リーサ イ(Trichodermareesei)〕であることを特徴とする請求項2 に記載の方法。
- 4.弱陽イオン交換担体がポリマーで補強された改質セルロースであることを特 徴とする請求項1ないし3のいずれかに記載の方法。
- 5.ポリマーで補強された改質セルロースがポリスチレンで補強された凝集力ル ポキシメチルセルロースであることを特徴とする請求項4記載の方法。
- 6.弱陽イオン交換担体がデュオライトC464(DUOLITEC464)で あることを特徴とする請求項1ないし3のいずれかに記載の方法。
- 7.キシローオリゴマーを含有するヘミセルロース基質が木材加工業からの廃液 であることを特徴とする請求項1ないし6のいずれかに記載の方法。
- 8.キシローオリゴマーを含有するヘミセルロース基質が蒸気分解植物材(st eam−explodedplantmaterial)であることを特徴とす る請求項1ないし6のいずれかに記載の方法。
- 9.弱陽イオン交換担体および固定剤の添加することなく該担体で固定化された 、ヘミセルロース分解酵素または酵素の混合物からなることを特徴とする再生可 能な担体で固定化された酵素からなる酵素製剤。
- 10.ヘミセルロース分解酵素または酵素の混合物がトリコデルマ(Trich oderma)属の微生物の発酵から得られる酵素の混合物またはそれらの画分 であることを特徴とする請求項9記載の酵素製剤。
- 11.トリコデルマ属の微生物がトリコデルマ・ロンジブラチアタム(Tric hdermalongibrachiatum)〔品種名トリコデルマ・リーサ イ(Trichodermareesei)〕であることを特徴とする請求項1 0に記載の酵素製剤。
- 12.弱陽イオン交換担体がポリマーで補強された改質セルロースであることを 特徴とする請求項9ないし11のいずれかに記載の酵素製剤。
- 13.ポリマーで補強された改質セルロースがポリスチレンで補強された凝集カ ルボキシメチルセルロースであることを特徴とする請求項12記載の酵素製剤。
- 14.弱陽イオン交換担体がデュオライトC464(DUOLITEC464) であることを特徴とする請求項9ないし11のいずれかに記載の酵素製剤。
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