JPH05506234A - ワクチン組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、改良された免疫原性を有するワクチン組成物に関する。より詳しくは 、本発明の組成物は、ポリペプチドの免疫原とイムノアジュバントとして長鎖ア ルキル化合物との組み合わせからなる。

発明の背景 ワクチンは病気の予防において重要である。ワクチンは宿主動物を外来物質に暴 露することによってはたらき、この外来物質は免疫系を活性化して、宿主を病気 の危険にさらさないで、その物質に対する免疫性を宿主に付与するように設計さ れている。現在、約２０のワクチンが商業的使用のために開発されている。それ らのワクチンの大部分は、病気を引き起こす有機体、またはその有機体の一部分 を、い（つかの方法、例えば、有機体の特定の無毒の部分の分離の１つによるか 、あるいは有機体の毒性部分を化学物質、熱または遺伝学的弱毒化で処理するこ とにより、無毒化して作られる。無毒化の手順は、しばしば、組成がわからない 毒性の副生物で汚染された異種産生物を産生ずる。その結果、純粋でない無毒化 されたワクチンの免疫原性物質としての有効性は損なわれる。

さらに、不快な、時には永久的に損傷性の副作用を生ずることがある。

よく知られた例は、子供の百日咳のためのワクチンのベースとしての完全な百日 咳菌（Ｂ、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の使用である。米国において現在使用されてい るワクチンは、１９４０年代に導入された本賞的に同一のワクチンである。副作 用は小さい反応から麻痺、永久的脳随害およびさらに死の主張された例まで変化 する。

組み換え技術および他の複雑な化学的技術の出現は、より純粋な、それゆえ安全 なワクチンの開発を促進した。しかしながら、この改良された純度、これはしば しば自然の免疫刺激が温度されていることを意味する、のために、これらの新し いワクチンはしばしば弱いか、あるいは、ことにそれらの先行するものと比較し たとき、免疫原性が劣る。その作用を相殺するために、イムノアジュバントをワ クチンに関連して使用して、増強された抗体の形成を引き出す。

現在、アルミニウム塩およびカルシウム塩のみが商業的ワクチンのためのアジュ バントとして使用されている。しかしながら、アルミニウム塩およびカルシウム 塩は効力のあるイムノアジュバントでない。カルシウム塩は使用が制限されるこ とがわかり、そしてアルミニウム塩は注射部位において一時的または慢性の局所 的肉芽腫を誘発することがある。

Ｌ、　Ｈ，コリア−（Ｃｏｌｌｉｅｒ）が、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）、ｐ、 １３６４−１３６７　（１９７０）において述べているように、破傷風トキソイ ドのワクチンに対する反応の発生および程度は抗原の純度ならびにアルミニウム アジュバントの存在に依存する。アルミニウムのアジュバントの調製は常に再現 性あるというわけではない。そのうえ、アルミニウム単独では、直ちの過敏性反 応の仲介の原因となるＩｇＥ抗体の産生を刺激する。これはＴ、マツハシら、ジ ャーナル・オブ・インフエクシャス・デイジージ（Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　 Ｄｉｓｅａｓｅ）、１４６．２９０　（１９８２）に記載された。

近年、アジュバントとして＊＊化合物の使用が注目された。わずかの有機化合物 のみが商業的に受け入れる無機塩に類似する方法で、すなわち、遅（放出される ベヒクルまたは抗原（ワクチン）の貯蔵所として機能し、これにより抗原は比較 的長い期間にわたって注射部位において放出される。このような有機化合物の例 は、有機界面活性剤および乳化剤、例えば、ＢＡＳＥコーポレーション製のポリ オキシエチレンおよびポリオキシプロピレンの非イオン性コポリマーであるプル ロニクス−（ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ）およびテトロニクス（Ｔｅｔｒｏｎｉｃｓ） である。アジュバントのこのようなゆっくりした放出のメカニズムは、免疫系の 過度の刺激の可能性を減少するので、ヒトの使用のために長い間受は入れてきて いる。免疫系の過度の刺激は、自己免疫の応答、例えば、効力のある免疫刺激剤 、例えば、フロインドアジュバントを使用するとき起こるような応答に導くこと ができる。こうして、ゆっくりした放出のメカニズムは好ましいメカニズムであ る。

有機アジュバントの大部分は効力のある免疫刺激剤であることが示されたが、こ のような高度に活性なアジュバントは毒性であり、したがって、ヒトの使用のた めには受け入れられない。既知の有機アジュバントの例は効力のある免疫刺激剤 であるフロイント完全アジュバントおよびムラミルジペプチドであるが、それら の化合物の両者は毒性を考慮して動物の研究における使用に限定される。アルミ ニウム塩に似る有機アジュバントの多数はアルミニウム塩より毒性である。例え ば、Ｄ、ガル（Ｇａ　Ｉ　Ｉ）　、免疫学（Ｉｍｍｕｎｏ　１ｏｇｙ）　、１１ ．３６９−３８６．１９６６、に記載されている長鎖アルキルアミンは、細胞膜 の構造に対して一般に破壊的である。

種々の組成物の大きい高分子量の異種抗原はアジュバントとして機能する不溶性 有機分子と複合化することが知られている。これは非特異的結合現象であり、抗 原性物質が大きくかつ十分に多様性である場合、それは電荷および極性に無関係 に不溶性有機分子に結合するであろう。有機アジュバントと生物分子との間の複 合化は種々の弱い、非共有結合の力、例えば、Ｂ型肝炎相互作用および水素結合 を通して起こる。

この現象は米国特許第４．４２８．９３２号（Ｏｖｅｒａｌｌ）および米国特許 第４，２５８．０２９４号（Ｍｏｌｏｎｅｙ　ｅｔ　ａｌ、）において見られる 。オベレル（Ｏｂｅｒｅｌｌ）は、アルキルチロシンが異種の多成分の高分子量 のアレルゲン、例えば、ライムギ、草および花粉の抽出物と複合化するとき、ア レルギー性脱感作の治療ためのアジュバントとして機能することを開示している 。モロネイ（Ｍｏｌｏｎｅｙ）らは、異種多成分の高分子量の破傷風トキソイド およびＩ、ＩＩおよびＩＩＩ型ポリオウィルスと複合化するとき、アジュバント としてアミノ酸の長鎖アルコールエステルの使用を教示している。

したがって、改良された免疫原性を有しそして免疫原およびアジュバントの両者 が無毒である、無毒のワクチン−アジュバント組成物が要求されている。

発明の要約 本発明は、均質な免疫原性ポリペプチドおよび無毒長鎖アルキルイムノアジュバ ントからなる、改良されたワクチン組成物に関する。こうして、本発明の１つの 面によれば、均質な免疫原性ポリペプチドおよびそのポリペプチドの免疫原性を 増幅するために有効量で存在する無毒の長鎖アルキル化合物であるアジュバント からなる組成物が提供される。

本発明の他の面によれば、ヒトを包含する温血動物に、有効量の本発明のワクチ ン組成物を投与することからなる、免疫応答を引き出す方法が提供される。

驚（べきことには、本発明によれば、無毒の正に帯電した長鎖アルキル化合物、 とくにアミノ酸またはペプチドのエステルは選択的方法で均質なポリペプチドに 結合することができることが発見された。これは、不溶性エステルの中に存在す るアミノ酸のタイプならびに均質なポリペプチドのタイプに依存する、特別の現 象である。この予期せざる特異性は本発明に従い使用する均質なポリペプチドの 特性であり、そして同様な分子量の多糖類により示されない。また、標準のアル ミニウムを含有するアジュバントをアジュバントとして無毒の長鎖アルキル化合 物、典型的には長鎖アルキルアミノ酸エステルと置換するとき、産生される抗体 のアイソタイプに関する１または２以上の作用が多分起こることができることが 発見された。１つの作用はＩｇＥ抗体の産生に関する。詳しくは、本発明の長鎖 アルキルアジュバント化組成物を使用すると・き、アルミニウムを含有するアジ ュバントを使用するとき［側されるＩｇＥレベルの増加と比較して、ＩｇＥ抗体 のレベルは実賞的に上昇せずそしてアジュバントを使用しないときのレベルに本 質的に止まる。ＩｇＥ抗体は直ちの過敏性反応の仲介の原因となる。アルミニウ ムのアジュバント添加ワクチンを使用する免疫化に対する応答におけるＩｇＥの 産生の結果として、アナフラキシー反応およびなお死の報告が存在した。参照、 前述のマツハシら。したがって、本発明の長鎖アルキルのアジュバントを添加し た組成物で観測されるＩｇＥ形成のレベルの減少は有益な治療学的作用である。

他の作用は、アルミニウムのアジュバントを使用したとき観測される比率と反対 に、ＩｇＧ２ａ抗体／ＩｇＧ１の比がより高いことであり、長鎖アルキルアジュ バントを本発明の組成物の中で使用したとき増加する両者の抗体のアイソタイプ のレベルは増加する。この比の増加は、また、有益な作用である。なぜなら、Ｉ ｇＧ２ａ抗体は、補体の活性化および抗体依存性細胞の細胞障害性メカニズムお よび腫瘍および寄生体に用語「均質な」は、本発明のワクチン組成物において使 用するポリペプチドを定義するためにここで使用するとき、化学的合成または生 物学本質的に成る、免疫原性ポリペプチド種を意味する。１より多いエピトープ が存在する場合、均質な免疫原性ポリペプチドは免疫優性の１また］よ２以上の エピトープからなるであろう。１つのエピトープが存在するとき、化学的合成を 使用するが、１より多いエピトープが存在す４場合、化学的または生物学的合成 を使用することができる。均質なポリペプチドは、無毒でありかつ均質なポリペ プチドの免疫原性に悪影響を及ぼさない、病原性因子の他の部分を含むことがで きる。

無毒のアジュバントは、好ましくは、アミノ酸またはペプチドの正に帯電したエ ステル、とくに１４〜２０個の炭素原子を有するアルキルアルコールおよびアミ ノ酸、ジペプチドまたはトリペプチドのエステルである。

発明の詳細な説明 本発明の組成物において使用する均質な免疫原性ポリペプチドは、宿主において 免疫応答を引き出すことができる。免疫原性ポリペプチドは、エイズ、Ａ型肝炎 、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、破傷風、ポリオ、百日咳（リンパ球増加促進因子（Ｌ　 Ｐ　Ｆ）の毒素）、単純ヘルペス、ＲＳウィルス、麻疹、インフルエンザウィル ス、狂犬病、ラサ熱、ロタウィルス、アデノウィルス、ライノウィルス、足およ び口の病気、ウシおよびネコの白血病ウィルス、牛疫ウィルス、デング熱ウィル ス、ダニ媒介性脳炎ウィルス、マラリアおよびバラインフルエンザウィルスの原 因となる病原性因子から誘導された１または２以上のエピトープから実質的に構 成されている。

多数の場合において、ポリペプチドの免疫原の天然に存在するアミノ酸配列を修 飾して、均質なポリペプチドを、その免疫原性を変化させないようにして、ワク チン組成物においていっそう有用とすることが望ましい。このような変化の例は 、翻訳後の修飾に類似させるか、あるいは免疫原の化学的性質を変更する、アミ ノ酸の側鎖の修飾を包含する。免疫原の生体内の寿命を改良するポリペプチドの 修飾は、また、可能である。そのうえ、ポリペプチドのアミノまたはカルボキシ ル末端にシスティン残基を付加して、ポリペプチドの担体タンパク質への結合を 可能とすることができる。

これらの変化または修飾は、保存的または非保存的の挿入、欠失および置換であ ることができる。このような変化は、タンパク質の合成に使用する天然に存在す るアミノ酸の組み合わせ、例えば、ｇｌｙ％ａｌａ；ｖａｌ、ｉ　Ｉｅ、Ｉｅｕ ；ａｓｐ、ｇｌｕ；ａｓｎｓ　ｇＩｎ：ｓｅｒ。

ｔｈｒ；　ｌｙｓ、ａｒｇ；ｐｈｅＳｔｙｒ；ａｌａＳｓｅｒ；ａｌａ。

Ｖａｌ　：Ａｌａ、ｐｒｏ：Ａｌａ、ｇｌｕ；　Ｉｅｕ、Ｇｉｎ；Ｇｌｙ。

ｐｈｅ；　ｉｃｅ、ｓｅｒ：およびｔｉｅ、ｍｅｔを包含する。

免疫原性均質なポリペプチドは任意の便利な方法により生成することができる。

こうして、ポリペプチドは組み換えまたは合成技術またはそれらの組み合わせに より生成することができる。既知の組み換え技術は、分子クローニング：実験室 のマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ１゜ｎｉｎ、ｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、：＋−ルド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃ ｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ′Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、−７−ルドー スプリングＴハーバ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｔｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）、ニュー＝１ −り州（１９８２）　、Ｔ、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、に記載されて いる。例えば、細胞は所望のポリペプチドをコードする遺伝子を使用するトラン スフエフシコンにより、そのポリペプチドを過度に発現するように設計すること ができる。

適当な化学的合成法は、固体または溶液相のペプチド合成または酵素合成を包含 する。適当な手順は、ペプチドの合成の原理（Ｐｒｆ、ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　 Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）、スブリンガーフェルラーグ（Ｓｐｒｉ ｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ）、１９８４、Ｍ。

ポダンスズキイ（Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ）；固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈ ａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）、第２版、１９８４、ピアース ・ケミカル・カンパニー（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｏｍｐａｎｙ） Ｏシコン・モロウ・スツアート（ＪｏｈｎＭｏｒｒｏｗ　５ｔｕａｒｔ）および ジャニス・ディルラバ・ヤング（Ｊａｎｉｓ　Ｄｉｌｌａｈａ　Ｙｏｕｎｇ）に 記載されている。

ポリペプチドは既知の技術により切頭、伸長または他の方法で修飾することがで きる。そのうえ、ポリペプチドは線状または環状であることができる。

免疫原性ポリペプチドの精製は普通に使用される技術を使用して実施することが できる。他の生物分子または不必要な物質を破壊または除去し、そして所望の免 疫原性ポリペプチドを影響を受けないようにして残す、任意の化学的または生合 成の方法を使用することができる。好ましくは、免疫原性ポリペプチドはクロマ トグラフィー技術により精製される。とくに、クロマトグラフィー技術、例えば 、大きさ排除、イオン交換、親和クロマトグラフィー、最も好ましくは高性能液 体クロマトグラフィーまたはそれらの組み合わせを使用することができる。免疫 原性ポリペプチドの純度はゲル電気泳動により評価することができる。

免疫原性ポリペプチドは、宿主により認識される大きさを有し、そして外来物質 として同定されるべきである。免疫原は通常少なくとも１０゜０００ダルトンの 分子量を有する。ポリペプチドが特定の宿主が認識する臨界的大きさより小さい 場合、ポリペプチドはポリペプチド−担体接合体を免疫原性とする担体に結合し なくてはならない。好ましい担体はタンパク質である。動物の使用のために好ま しい担体はウシ血清アルブミンおよびキーホールリンベットヘモシアニン（ＫＬ Ｈ）である。ヒトの使用に適当な担体は、次のものを包含する：破傷風トキソイ ド、ジフテリアトキソイド、無細胞の百日咳ワクチン（ＬＰＳ）、交差反応性物 質（ＣＲＭ）、これらはバクテリアの毒素に抗原的に類似するが、突然変異によ り無毒である、好ましくはＣＲＭＩ。７、これはバラペンへイマ−（Ｐａｐｐｅ ｎｈｅｉｍｅｒ）ら、ジフテリア毒素の分子の免疫学的研究（Ａｎ　Ｉｍｍｕｎ ｏｌｏｇｉｃａｌ　５ｔｕｄｙ　ｏｆ　ｔｈｅＤｉｐｐｔｈｅｒｉａ　Ｔｏｘｉ ｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌｅ）、免疫化学（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉ　ｓ　ｔｒｙ）９ ．８９１−９０６　（１９７２）、および他のバクテリアのタンパク質の担体、 例えば、髄膜炎外膜タンパク質。好ましくは、担体タンパク質それ自体は免疫原 である。

ポリペプチドは担体にこの分野において知られている任意の便利な方法によって 担体に結合することができる。非対称リンカ−１例えば、アイミデート（例えば 、ジメチルスベリミデート）の使用は本発明の範囲内であるが、ヘテロ２官能性 リンカ−を使用することが好ましい。後者はポリペプチドの担体への結合が、規 定された再現性ある方法で、副反応、例えば、純粋でない異種Ｅｌ製物に導く担 体分子の架橋を回避することによって、起こることを保証する。好ましいヘテロ ２官能性リンカ−の例は、次のものを包含する二Ｎ−スクシニミジル３−（２− ビワジルジチオ）プロピオネート、Ｊ、カールソン（Ｃａｒｌｓｓｏｎ）ら、Ｂ ｉｏＣｈｅｍ、Ｊ、１７３．７２３−７３７　（１９７８）に記載されている、 およびスルホスクシニミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート、Ｊ、 Ｄ、パンゲス（Ｂａｎｇｓ）ら、ジャーナル・オブ・セル・バクテリオロジー（ Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）、１０３．２５５−２６３　（１９８６）。最も好 ましいものはスルホスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサ ン−１−カルボキシレート、Ｓ。

ハシダ（Ｈａｓｈｉｄａ）ら、Ｊ、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍ６．５８− ６３　（１９８４）に記載されている、である。

適当な均質なポリペプチドの例は、肝炎ウィルスの表面抗原と実質的に同一のア ミノ酸配列から本質的に成るもの、例えば、Ｂ型肝炎の表面抗原と実質的に同一 のアミノ酸配列から本質的に成る均質なポリペプチドである。他の例は、肝炎の 表面抗原の１または２以上のエピトープから成る均質なポリペプチドである。他 の例は次の通りである二単純ヘルベスウイルスのｇＤサブユニットの表面抗原と 実質的に同一のアミノ酸配列から本質的に成る均質なポリペプチド、ヒト免疫欠 損ウィルスのｇｐ１２０の１または２以上のエピトープから本質的に成る均質な ポリペブから本質的に成る均質なポリペプチド、またはリンパ球増加促進因子（ Ｌ　Ｐ　Ｆ）と実質的に同一のアミノ酸配列から本質的に成る均質なポリペプチ ド。

長鎖アルキルアジュバントならびに宿主におけるその代謝から生ずる化合物は無 毒であるべきである。長鎖脂肪族アルコールは天然に存在する無毒の物質である ことはよく知られている。例として、オクタデカノールはヒトにおける完全に無 毒であることが発見された。これは１５ｇ／ｋｇより大きい経口的ＬＤ５゜によ り示され、ボッセリン（Ｇｏ、ｓ　ｓ　ｅｌｉｎ）の「商品の臨床的毒物学（Ｃ １ｉｎｉｃａｌ　Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ　Ｐｒｏ ｄｕｃｔｓ）Ｊ、第４版、１９７６゜オクタデシルチロシンは動物において無毒 であることが発見され、そして天然に存在するアミノ酸の大部分は無毒である。

Ｃ，Ｌ。

ペネイ（Ｐ　ｅ　ｎ　ｎ　ｅ　ｙ）ら、ワクチン（Ｖａｃｃ　１ｎｅ）　、４． ９９−１０．１９８６゜したがって、オクタデシルチロシンおよび他のアルコー ルとアミノ酸とのエステルはヒトにおける毒性を示さないであろうことが期待さ れるであろう。

アジュバントは水性媒質中で約１５０μｍ〜１ｍｍ（１８〜１００メツンユ）、 好ましくは約２５０μｍ（６０メツシユ）の大きさを有し、これにより均一なコ ンシスチンシーの懸濁液を生ずるミクロ粒子を形成することができるべきである 。そのうえ、アジュバントのミクロ粒子は免疫原の吸着を可能とし、これにより 宿主の中に免疫原をゆっくり放出することができるべきである。

本発明の好ましい実施態様において、アジュバントは式：式中、Ｃは水素原子、 アミノ酸残基、または１０アミノ酸残基まで（すなわち、デカペプチドまで）を 包含するペプチド残基であり：Ｄは水素原子または製剤学的に許容されつる酸、 例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、酒石酸、乳酸または酢酸であり：Ｅ は４ニル、４−アミノブチル、イソプロピル、メチル、水素または天然に存在す るアミノ酸であり：Ａは（ＣＨｚ）−５酸素またはＣＨ２Ｏであり、モしてＢは （ＣＨ２）、または酸素であり、ここでｎは０〜４であり、ただしＡおよびＢは （ＣＨ２）、および酸素について同一でなく：そしてＲは１２〜２０個の炭素原 子を有するアルキルである： の化合物である。

好ましくは、Ｃは水素、アミノ酸、ジペプチドまたはトリペプチドであることが できる。Ｃがアミノ酸である場合、アジュバントのアミノ酸配列は、例えば、チ ロシルグリシン、グリシルグリシン、グリシルチロノン、またはフェニルアラニ ルグリジンから成る群より選択されることができる。Ｃがジペプチドである場合 、アジュバントのアミノ酸配列はチロシルグリシルグリシンおよびチロシルアラ ニルグリシンから選択されることができる。アミノ酸残基がキシルである場合、 Ｄ一対車体、Ｌ一対掌体またはそれらの混合物を使用することができる。アジュ バントはアルファアミノ酸からなることがとくに好ましい。　。

Ｅは４−ヒドロキシベンジル、ベンジル、４−ヒドロキシフェニル、フェニルお よび水素から選択されることがとくに好ましい。Ｅは最も好ましくは４−ヒドロ キシベンジルである。

ＡがＣＨ，ＯでありかつＢが（ＣＨり、であるとき、化合物はＮ−アミノアシル エタノールアミン−〇−ステアレートである。ＡがＣＨ，０でありかつＢが酸素 であるとき、化合物はカーボネートである。

より好ましくは、アジュバントはアミノ酸エステル塩酸塩であり、ここでＣは水 素であり、Ｄは塩酸であり、Ａは（ＣＨ，）、であり１、ここでｎは０〜４であ り、モしてＢは酸素である。

最も好ましくは、アジュバントはオクタデシルチロシン塩酸塩であり、ここでＣ は水素であり、Ｄは塩酸であり、Ｅは４−ヒドロキシベンジルであり、モしてＲ はオクタデシルであり、Ａは（ＣＨｚ）−であり、ここでｎはゼロであり、モし てＢは酸素である。

一般に、Ｃが水素でないとき、アジュバントの主鎖は実質的にペプチド結合から なり、すなわち、１つのアミノ酸残基のカルボキシレートは隣接する残基のアミ ノに頭尾の方法で直接結合されている。あるいは、ペプチド結合はチオアミドで あることができる。

アジュバントは共有結合法により調製することができる。例えば、アジュバント のアミジエステル部分は確立されたある数の方法の任意の１つ、例えば、ポダン スズキ−（Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ）ら、「ペプチドの合成（Ｐｅｐｉｔｉｄｅ　５ ｙｎｔｈｅｓｉｓ）Ｊ、第２版、ウイリイ（Ｗ　ｉ　１　ｅ　ｙ）　、二ｘ−ヨ ーク、１９７６およびＲ３Ｗ、レスケ（Ｒ。

ｅｓｋｅＬペプチド（Ｐｅｐｉｔｉｄｅｓ）、（Ｎ、　Ｙ、　）　３．１０２　 （１９８１）に記載されている方法、により合成することができる。

と（に好ましい方法は、Ｃ，ペンネイ（Ｐ　ｅ　ｎ　ｎ　ｅ　Ｖ）ら、ジャーナ ル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊ、Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ、）　、５０． １４５７−１４５９　（１９８５）に記載されている、メタンスルホン酸触媒エ ステル化手順である。

アジュバントがジペプチドまたはトリペプチドであるとき、ペプチド結合は前述 の「ペプチドの合成（Ｐｅｐｉｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）Ｊに記載されて いる手順のいずれによっても形成することができる。

さらに、ペプチド結合は固体または溶液相のプロトコルに従い形成することがで きる。アミド、チオアミドまたはチオエステル結合の形成に有用な、多数のプロ トコルおよび試薬が存在する。

アジュバントの調製の間、反応性官能基を一時的に保護ことが望ましいことがあ る。例えば、アミンはウレタン型糖タンパク質により、アルコールはｔ−ブチル またはベンジル糖タンパク質により、酸はエステル基により保護することができ る。適当な保護／脱保護の条件およびプロトコルは「ペプチドの合成（Ｐｅｐｉ ｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）Ｊに記載されている。

アジュバントは前述の技術の任意のものにより精製することができる。

好ましい精製技術はシリカゲルのクロマトグラフィー、とくに「フラッシュ」　 （急速）クロマトグラフィーの技術、例えば、Ｗ、クラーク・スチル（Ｃ１ａｒ ｋ　５ｔｉ１１）ら、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリーＤ、Ｏｒ ｇ、Ｃｈｅｍ、）　、４３．２９２３−２９２５（１９７８）に記載されている 技術である。しかしながら、ＨＰＬＣを包含する他のクロマトグラフィーの方法 をアジュバントの精製に使用できる。結晶化を、また、使用してアジュバントを 精製することができる。

ある場合において、分析的純度の産生物が合成から直接得られるので、精製は必 要がない。

本発明のワクチン組成物は、既知の技術に従い適当な無菌の条件下にアジュバン トを均質な免疫原性ポリペプチドと物理的に混合して、アジュバント化組成物を 生成することによって調製される。上の説明から明らかなように、免疫原性ポリ ペプチドをアジュバントとそのままであるいは適当な担体と結合して混合する。

アジュバントおよび均質なポリペプチドの免疫原の、単独でまたは担体に結合し て、ヒトにおいて免疫応答を引き出すために必要な量は相互に関係するが、普通 のワクチンにおいて一般に使用する範囲内である。

例えば、減少する量の免疫原を使用できる、増加する量のアジュバントおよびそ のその逆を示唆することができる。好ましいアジュバントの量は、組成物の１ｍ ｌ当たり０．０１〜５ｍｇ、例えば、０．０５〜３ｍｇ１好ましくは０．５〜１ ．０ｍｇである。免疫原の好ましい量は約１〜１００μｇ／ｍ１、好ましくは約 ５〜４０μｇ／ｍｌである。投与量はワクチンを受ける宿主ならびに因子、例え ば、宿主の大きさ、重さ、および年令に依存するであろう。

本発明のワクチン組成物は、他の製剤学的ポリペプチド組成物について使用され るものに類似する技術を使用して配合できる。こうして、アジュバントおよび免 疫原は凍結乾燥した形態で貯蔵しそして、投与前に、生理学的に許容されうる賦 形剤の中で再構成して懸濁液を形成することができる。あるいは、好ましい賦形 剤は無菌の溶液、とくに無菌の緩衝液、例えば、リン酸塩緩衝液である。混合物 の免疫反応性を保持する賦賦形剤は保存剤あるいは混合物の貯蔵安定性または効 能を改良する他の添加剤を含有することができる。適当な保存剤は、例えば、チ メロサルを包含する。

本発明のワクチンの単一の投与の体積は変化することができるが、一般に普通の ワクチンにおいて通常使用する範囲内であろう。単一の投与の体積は、前述の免 疫原およびアジュバントの濃度において、好ましくは約０４１〜約１．５ｍｌ、 より好ましくは約０．２ｍｌ〜約０．５ｍｌである。

本発明のワクチン組成物は任意の普通の手段により投与できる。好ましい投与法 は、皮下、筋肉内、皮肉を包含するか、あるいは鼻の供給による。あるいは、混 合物は生物拡散性移植片から放出されることができる。単一の投与を使用するこ とができる。あるいは、１系列の投与を数日または敗退にわたって実施すること ができる。

実施例 次の非限定的実施例によって、本発明をさらに説明する。

実施例　１ この実施例は均質なり型肝炎の表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の！Ｉｉ製を記載する。

組み換えＨＢｓＡｇを、Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原でトランスフェクションし たヒト３７３細胞から分離した。３Ｔ３細胞はマウント・シナイ・スクール・オ ブ・メディシン（Ｍｏｕｎｔ　５ｉｎａｊ　５ｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉ ｎｅ）［セルス（Ｓｅｌｌｓ）ら、クローニングしたＢ型肝炎ウィルスＤＮＡで トランスフェクションしたＨｅｐＧ２細胞の中のＢ型肝炎ウィルス粒子の産生、 プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐ ｒｏｃ、Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）　ＵＳＡ、８４．１００５　 （１９８７）］により提供された。細胞は１０％のＥＣＳ　（Ｇｉｂｃｏ）　、 １ミリモルのピルビン酸ナトリウムおよび０．５％のゲンタマイシンを補充した ＲＰＭＩ媒質（Ｇｊｂｃｏ）の中で成長させた。この時点において、２つの精製 手順、すなわち、密度勾配遠心または免疫親和クロマトグラフィーを使用した。

密度勾配遠心において、細胞の上澄み液を２００Ｏｒｐｍで１０分間遠心して３ Ｔ３全細胞を除去し、次いで抗原を沈澱によりポリエチレングリコール（分子量 ８０００）を使用して１０％（Ｗ／Ｖ）の濃度で精製する。生ずる沈澱をＴＮＥ 緩衝液（ＩＯミリモルのトリスＨＣＩ　（ｐＨ８，ＯＬ　１００ミリモルのＮａ Ｃｌ、１ミリモルのＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０））の中に懸濁させ、そして遠心を ５Ｗ４１ポリアロマ−管中でＴＮＥｉｌ衡液中の２０％〜５０％（ｗ／ｖ）の勾 配で実施する。勾配を３５．００Ｏｒｐｍおよび４℃で６０時間遠心する。分画 を管の底から集め、そして密度をリフラクトメータ−で決定する。ある密度（１ ，３５１〜１．３５８）の分画をプールし、そしてＰＢＳに対して透析し、遠心 し、そして均質なＨＢｓＡｇの濃度についてアボット（Ａｂｂｏｔ）ＲＩＡキッ トにより２０ｎｇ／ｍｌの抗原に対する同等体として陽性の対照を使用して分析 する。

免疫親和クロ・マドグラフィー法は、一般に、細胞の上澄み液を２．００Ｏｒｐ ｍで１０分間回転して３Ｔ３全細胞を除去することによって実施する。臭化シア ン活性化したセファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＣＬ４Ｂに抗ＨＢｓＡｇモノ クローナル抗体を共有結合させることによって調製した、抗ＨＢｓＡｇ親和カラ ムをＰＢＳで洗浄する。溶離液の０ＤＩｏ、、、を検査し、そして＜０．０１０ であるべきである。ＣＯＤ２ｍｏ−＝２８０ｎｍにおける光学密度（吸収））。

上澄み液をカラムを通して２回流して、抗原がカラム上に吸収されることを保証 する。次いで、カラムを３回洗浄して、カラムへのタンパク質の非特異的結合を 除去しく検査ＯＤ２．。、、＜Ｑ、０１）　、次いでグリシン／Ｈ（１（ｐＨ２ ，８）で溶離する。各音においてグリシン／ＨＣＩの２ｍｌの分画を中和するた めに十分なトリス緩衝液（ｐＨ１１）を使用して、１０本の管を調製する。１０ 本の管をＯＤ、、ｏ、、によるか、あるいはＲＩＡによりＨＢｓＡｇを測定する ことによって分析する。均質なポリペプチドを含有する分画を一緒にし、そして ＰＢＳに対して透析する。カラムをＰＢＳで３回洗浄する。カラムをＰＢＳ／Ｎ ａアジドの中に貯蔵する。

実施例　２ 均質なポリペプチドを長鎖アルキルアミノ酸エステルのイムノアジュバントと複 合化する一般方法を次に記載する。

長鎖アルキルアミノ酸エステルイムノアジュバント（５０ｍｇ）を、回転棒を有 しそして綿の栓または他のゆるい取り付は物質をもつ、２５ｍ１の体積測定また は小さいエルレンマイヤーフラスコの中に入れた。

塩の形態のイムノアジュバントを、適当な温度の炉内で、融点に従い、２０時間 の間加熱することによって滅菌する。冷却したフラスコに、濾過により滅菌した 、リン酸塩緩衝液（２５ｍｌ）　、＞５０ミリモル、ｐＨ＝６〜７、を添加を添 加した。生ずる懸濁液を３〜２０時間おだやかに撹拌し、栓をガラスの栓と交換 し、そして全体を複合化に必要となるまで４℃で貯蔵する。

イムノアジュバントを均質なポリペプチドで複合化するために、懸濁液を室温に し、よ（撹拌した。要求される体積の懸濁液は広い孔のピペットで等しい体積の ポリペプチド溶液に移し、こうしてイムノアジュバントの最終濃度を１ｍｇ／ｍ ｌとなるようにした。しかしながら、体積の調節はイムノアジュバントの他の所 望の濃度を得るために必要であることがある。イムノアジュバント−ポリペプチ ドの懸濁液を４℃においておだやかに一夜混合した。複合化反応の終わりに、懸 濁液を沈降させ、必要に応じて、遠心し、そして上澄み液の２８０ｎｍにおける 吸収を測定して、結合しないポリペプチドの量を決定する。一般に、３０％〜９ ０％の結合したポリペプチドはすぐれたイムノアジュバント、−ポリペプチドの 免疫原の複合体を表す。

実施例　３ この実施例は、肝炎のための候補のワクチンである、いくつかのオクタデシルア ミノ酸エステルと均質なポリペプチドとのアジュバント性を実証する。

ＢＡＬＢ／ｃマウスを５０ｎｇのＢ型肝炎の表面抗原で、対照でないマウスのた めのアジュバントの存在下におよび対照マウスのためのアジュバントの不存在下 に免疫化した。Ｂ型肝炎の表面抗原は、表面抗原のための遺伝子でトランスフェ クションした３Ｔ３細胞から得た。１００μｇのオクタデシルアミノ酸を実施例 ２に記載するようにポリペプチドで複合化した。この混合物を、Ｏ，１ｍｌの合 計の体積で、第１日に筋肉内のルートで注射し、そしてマウスを第７．１４．２ １．２８．３５．４２および６１日に採血した。マウスを３５ｎｇのポリペプチ ドで第２１日に促進した。

血清の中の抗体の濃度をラジオイムノアッセイにより決定した。抗体の濃度をモ ノクローナル抗体を使用して得られた標準曲線と比較することによって推定した 。結果を表１に表丁。

＊抗ＨＢｓＡｇ抗体濃度、ｎｇ／ｍ＋ アミノ酸１〜２２６についてのＢ型肝炎の表面抗原のアミノ酸配ＰＩＣＨＢｓＡ ｇ−ａｄｗ（Ｓ遺伝子産生物）は次の文献に記載されている：バートナガー（Ｂ ｈａｔｎａｇａｒ）Ｐ、に、ら、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカ デミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｐ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）Ｕ ＳＡ、Ｖｏｌ、７９．４４０−４４０４（１９８２）、特別に引用によって加え る。

表１における結果が示すように、長鎖アルキルアミノ酸エステルおよび免疫原性 ポリペプチド、Ｂ型肝炎の表面抗原の間において観測されるアジュバントの作用 は特異的現象である。これはオクタデシルチロシンおよびオクタデシルリジンの 比較により、およびオクタデシル２オルフ工二シノールおよびオクタデシルフォ ルフェニシンの比較により理解することができる。

実施例　４ この実施例は、肝炎のための候補のワクチンであるポリペプチドとの、投与量の 関数としての、オクタデシルチロシンのアジュバント性を実証する。

プロトコルは前述した通りであるが、ただしマウスを８０ｎｇのＢ型肝炎の表面 抗原で免疫化し、５０ｎｇで促進し、そして第７．１４．２８および３５に採血 した。免疫化を対照でないマウスのためのアジュバントの存在下におよび対照マ ウスのためのアジュバントの不存在下に実施した。結果を表２に表す。

ニー一旦 表面抗原に対する抗体の応答 １０ＩＪｇ　５３　６１１　２３１４　３４２　δ４０３　１０００５＊ＣＰＭ 、採血前の値は１１．５であった０表２の結果が示すように、アジュバントの作 用は組成物の中に存在する長鎖アルキルエステル、オクタデシルチロシンの濃度 に依存する。アジュバントの投与量が増加するにつれて、抗体の力価の比例する 増加は、抗体の力価が増加しない値を越えて、最適な力価の値に到達するまで、 起こる。

実施例　５ この実施例は、ヒト免疫欠損ウィルス、ＨＩＶ−１のエンベロープタンパク質か らのツユ−ジオジェニック（ｆｕｓｉｏｇｅｎｉｃ）配列に相当するポリペプチ ドによる、投与量の関数として、異なる動物における、オクタデシルチロシンの アジュバント性を実証する。

１）ＨＩＶペプチドの配列 ＨＩＶペプチドの配列は次の通りであった：産生物、ＢＣ−１０１ Ｌａｕ−０１Ｖ−＾１＆−八Ｌａ−Ｇｌｙ−！３ｅｒ−５３５分子量３５８５． １４　（主１ｍ） ２）マウスにおける実験 Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｅ　／　ｃマウスを、キーホールリンベットヘモシアニン（ＫＬＨ ）にカップリングした、ＨＩＶ−１の残基５０３−５３５のアミノ酸配列に相当 する、化学的に合成したポリペプチドの１００μｇで免疫化した。

オクタデシルチロシン塩酸塩、１０μｇ〜１００μｇを実施例２に記載するよう にポリペプチドと複合化した。この混合物を、０．　１ｍ、Ｉの合計の体積で、 第１日に注射し、再び第２１日に注射した。マウスを第７．１４．２１．２８お よび３５日に採血した。

血清の中の抗体濃度をラジオイムノアッセイにより決定した。抗体濃度は、ポリ クローナル抗体を使用して得られた標準曲線との比較により推定した。結果を表 ３に表す。

！−一旦 ＊抗ペプチド抗体の濃度、μｇ／ｍ１ 表３の結果が示すように、長鎖アルキルエステル、オクタデシルチロシン、は、 他の免疫原性ポリペプチド、すなわち、ＨＩＶタンパク質ｇｐ４１のアミノ酸５ ０３−５３５から誘導されたポリペプチドと濃度依存性アジュバントの作用を示 す。再び、最適な抗体の力価に到達し、それを越えて力価は増加しない。

３）ヒヒにおける実験 ２頭のヒヒを、キーホールリンペットヘモシアニンにカップリングした、ＨｒＶ −１の残基５０３−５３５のアミノ酸配列に相当する、化学的に合成したポリペ プチドの３００μｇで免疫化した。５００μｇのオクタデシルチロシン塩酸塩を 実施例２に記載するようにポリペプチドと複合化した。この混合物を、１．０ｍ ｌの合計の体積で、第１日に注射し、再び第３５日に注射した。動物を第１４． ３２および４９日に採血した。同一実験を他の２頭のヒヒで実施したが、ＨＩＶ −１のアミノ酸配列５２６−５３５に相当するポリペプチドを使用した。

血清の中の抗体濃度をラジオイムノアッセイにより間接的に測定した。

ペプチド−アルブミン接合体でコーティングしたプレート上で試料をインキュベ ーションし、そしてヨウ素−１２５で標識したウサギ抗サル免疫グロブリンとの 反応により、力価決定を実施した。結果を表４に表す。

表４の結果が示すように、長鎖アルキルエステル、オクタデシルチロシン、およ び免疫原性ＨＩＶポリペプチドの間のアジュバントの作用が高等動物、例えば、 ヒヒにおいて観測される。

実施例　に の実施例は、肝炎のための候補のワクチンについてのアルミニウムアジュバント 化からオクタデシルチロシンアジュバント化への変化において起こる、アイソタ イプの変化を実証する。

プロトコルは実施例５、節２（マウス）に記載する通りであったが、ただし５０ μｇのオクタデシルチロシンを一次および二次（篤２１日）の免疫化の両者につ いて使用した。抗体の応答のアイソタイプはラジオイムノアッセイにより決定し た。トリチウムＳ識した抗マウスアイソタイプ抗体を使用した。免疫親和精製し たＢ型肝炎の表面抗原でコーティングしたプレート上で試料をインキュベーショ ンすることによって、力価を決定した。結合したアイソタイプ抗体の放射能（ｃ ｐｍ）として報告した結果を表５に表す。

表５の結果は、アルミニウムから長鎖アルキルエステル、（オクタデシルチロシ ン−０Ｔ）アジュバント化免疫原性ポリペプチド、Ｂ型肝炎の表面抗原へ行くと き起こる抗体の応答のアイソタイプの変化を示す。

が、オクタデシルチロシン（ＯＴ）を使用するとき、対照を使用して得られたち の比較して、ＩｇＥのレベルの有意の増加は存在しない。

要約書 イムノアジュバントとして長鎖アルキル化合物と均質な免疫原性ポリベブ≦ドと の組み合わせからなる、改良されたワクチン組成物。゛本発明の組成物は、免疫 系を活性化して、予防的方法で免疫原に対する免疫性を宿主に与えるとき有用で ある。

国際調査報告 ｌ＃、、ＩＩａＨｈｔ＠＠ａ−ｐｃＴ／　Ｃ＾９１１００１４４−惰−＋１−１ ＾−＾−ｍ、ＰｃＴ／ＣＡ　９１１００１４４Ｓ＾　４６９２４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、均質な免疫原性ポリペプチドおよび有効量の式：Ｅ▲数式、化学式、表等が あります▼ 式中、 Ｃは水素、アミノ酸残基、およびペプチド残基から成る群より選択され、 Ｄは水素および製剤学的に許容されうる酸から成る群より選択され、 Ｅは４−ヒドロキシベンジル、ベンジル、４−ヒドロキシフェニル、フェニル、 ４−アミノブチル、イソプロピル、メチル、水素および天然に存在するアミノ酸 の残基から成る群より選択され、Ａは（ＣＨ２）ａ、酸素またはＣＨ２Ｏであり 、そしてＢは（ＣＨ２）ａまたは酸素であり、ここでｎは０〜４であり、ただし ＡおよびＢは（ＣＨ２）ａおよび酸素について同一でなく、そしてＲは１２〜２ ０個の炭素原子を有するアルキルである、の少なくとも１種のアジュバントから なるワクチン組成物。 ２、前記アジュバントはＬ−立体配置を有するアミノ酸からなる、請求の範囲１ 項記載の組成物。 ３、前記アジュバントはＤ−立体配置を有する、請求の範囲１項記載の組成物。 ４、前記アジュバントはＤおよびＬ−立体配置を有するアミノ酸混合物からなる 、請求の範囲１項記載の組成物。 ５、Ｅは４−ヒドロキシベンジル、ベンジル、４−ヒドロキシフェニル、フェニ ル、および４−アミノブチル、イソプロピル、メチル、水素から成る群より選択 される、請求の範囲１項記載の組成物。 ６、Ｅは４−ヒドロキシベンジルである、請求の範囲５項記載の組成物。 ７、Ｃは水素、アミノ酸、および１０アミノ酸残基までを含むペプチド残基から 成る群より選択される、請求の範囲１項記載の組成物。 ８、前記ペプチド残基はジペプチドおよびトリペプチドから選択される、請求の 範囲７項記載の組成物。 ９、Ｃはアミノ酸であり、そしてチロシルグリシン、グリシルグリシン、グリシ ルチロシン、およびフェニルアラニルグリシンから成る群より選択される、請求 の範囲７項記載の組成物。 １０、Ｃはジペプチドであり、そしてチロシルグリシルグリシンおよびチロシル アラニルグリシンから選択される、請求の範囲８項記載の組成物。 １１、製剤学的に許容されうる酸は塩酸、臭化水素、硫酸、酒石酸、乳酸、およ び酢酸から成る群より選択される、請求の範囲１項記載の組成物。 １２、前記アジュバントはα−アミノ酸からなる、請求の範囲１項記載の組成物 。 １３、前記均質なポリペプチドは線状および環状のポリペプチドから成る群より 選択される、請求の範囲１項記載の組成物。 １４、前記均質なポリペプチドは生物学的担体に結合されている、請求の範囲１ 項記載の組成物。 １５、前記担体は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、無細胞の百日咳 ワクチン（ＬＰＳ）、交差反応性物資（ＣＲＭ）およびバクテリアのタンパク質 の担体から成る群より選択される、請求の範囲１４項記載の組成物。 １６、前記ＣＲＭはＣＲＭ１８７である、請求の範囲１５項記載の組成物。 １７、前記均質なポリペプチドは、エイズ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、破 傷風、ポリオ、百日咳（リンパ球増加促進因子（ＬＰＦ）の毒素）、単純ヘルペ ス、ＲＳウィルス、麻疹、インフルエンザウィルス、狂犬病、ラサ熱、ロタウィ ルス、アデノウィルス、ライノウィルス、足および口の病気、ウシおよびネコの 白血病ウィルス、牛疫ウィルス、デング熱ウィルス、ダニ媒介性脳炎ウィルス、 マラリアおよびパラインフルエンザウィルスから選択される状態の原因となる病 原性因子から誘導された１または２以上のエピトープから実質的に構成されてい る、請求の範囲１項記載の組成物。 １８、前記均質なポリペプチドは肝炎ウィルスの表面抗原と実質的に同一のアミ ノ酸配列を有する、請求の範囲１項記載の組成物。 １９、前記均質なポリペプチドは肝炎ウィルスの表面抗原の１または２以上のエ ピトープからなる、請求の範囲１項記載の組成物。 ２０、前記均質なポリペプチドはＢ型肝炎の表面抗原と実質的に同一のアミノ酸 配列を有する、請求の範囲１項記載の組成物。 ２１、前記均質なポリペプチドは単純ヘルペスウィルスのｇＤサブユニットの表 面抗原と実質的に同一のアミノ酸配列を有する、上記第１項記載の組成物。 ２２、前記均質なポリペプチドはヒト免疫欠損ウィルスのｇｐ１２０の１または ２以上のエピトープからなる、請求の範囲１項記載の組成物。 ２３、前記均質なポリペプチドはヒト免疫欠損ウィルスのｇｐ４１の１または２ 以上のエピトープからなる、請求の範囲１項記載の組成物。 ２４、前記均質なポリペプチドはリンパ球増加促進因子と実質的に同一のアミノ 酸配列を有する、請求の範囲１項記載の組成物。 ２５、前記アジュバントは１４〜２０個の炭素原子を有するアルコールおよびア ミノ酸、ジペプチドまたはトリペプチドのエステルである、請求の範囲１項記載 の組成物。 ２６、前記アジュバントはオクタデシルチロシンである、請求の範囲２５項記載 の組成物。 ２７、患者に治療的に有効量の請求の範囲１項記載の組成物を投与する工程から なる、患者において免疫応答を引き出す方法。 ２８、前記組成物を筋肉内、皮下に、皮下に、あるいは鼻への供給により投与す る、請求の範囲２７項記載の方法。 ２９、前記ワクチン組成物はＩｇＥ抗体のレベルを実質的に上昇させず、そして ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１抗体の比を増加する、請求の範囲２７項記載の方法。