JPH05506148A - Rejuvenating compositions and methods of using them - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 若返り組成物及びそれらの使用方法 関連出願に対するクロスリファレンス この出願は、１９９０年４月９日出願の米国特許出願第０７１５０５６８１号の 一部継続出願である。[Detailed description of the invention] Rejuvenating compositions and methods of using them Cross-reference to related applications This application is based on U.S. Patent Application No. 071505681 filed April 9, 1990. This is a partial continuation application.

産業上の利用分野 この発明は、老化細胞の増殖能を回復させることのできる核酸分子及びそれらの 等価物に関するものである。本発明は、抗老化核酸分子、それらの等価物、並び にそれらの分子を含有する治療的及び非治療的組成物を包含する。この発明は一 部政府の基金によってなされ、政府がこの発明における一定の権利を有する。Industrial applications This invention provides nucleic acid molecules capable of restoring the proliferation ability of senescent cells and their It is about equivalents. The present invention provides anti-aging nucleic acid molecules, their equivalents, and includes therapeutic and non-therapeutic compositions containing these molecules. This invention is one The invention was made with funds from the government, and the government has certain rights in this invention.

発明の背景 ■、インビトロの細胞の老化 正常なヒト二倍体細胞の増殖的成長能には限りがある［Ｌ、ヘイフリック等、エ クスベリメンタル・セル・リサーチ（Ｅｘｐ、Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、）２５巻５８ ５頁（１９６１）；Ｌ、ヘイフリック、エクスベリメンタル・セル・リサーチ（ Ｅｘｐ、Ｃｅｌ　Ｉ　Ｒｅｓ、）３７巻６１４頁（１９６５）］　、事実、イン ビトロにおいて管理された条件の下で培養されたヒトの細胞は、最大で約６０の 累積集団倍化までしか増殖することができない。このような細胞の増殖能は、そ の細胞が受けた累積集団倍化の数の関数であることが判明した［Ｌ、ヘイフリッ ク等、エクスペリメンタル・セル・リサーチ（Ｅｘｐ、　Ｃｅ　Ｉ　Ｉ　Ｒｅｓ 、　）　２５巻５８５頁（１９６１）；Ｌ、ヘイフリック等、エクスペリメンタ ル・セル・リサーチ（Ｅｘｐ、Ｃｅｌ　Ｉ　Ｒｅｓ、）３７巻６１４頁（１９６ ５）］、この能力は、さらにその細胞の提供者のインビボの年齢に逆比例する［ Ｇ、　Ｍ、マーティン等、ラボラトリ−・インベスティゲーション（Ｌａｂ、Ｉ ｎｖｅｓｔ、）２３巻８６頁（１９７９）；Ｓ、　ゴールドシュタイン等、プロ シーディングズ・オブ・ザ・ナノコナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｕ 、　Ｓ、　Ａ、　）　（Ｐｒｏｃ。Background of the invention ■ In vitro cell aging Normal human diploid cells have limited proliferative growth potential [L., Hayflick et al., E. Massive Mental Cell Research (Exp, Ce1l Res,) Volume 25, 58 5 pages (1961); Hayflick, L. Experimental Cell Research ( Exp, Cel I Res, vol. 37, p. 614 (1965)], fact, in Human cells cultured under controlled conditions in vitro can contain up to approximately 60 cells. They can only multiply up to the cumulative population doubling. The proliferative ability of such cells is was found to be a function of the number of cumulative population doublings undergone by cells [L, Hayflip et al. Experimental Cell Research (Exp, Ce II Res , ) Vol. 25, p. 585 (1961); Hayflick et al., Experimenta Le Cell Research (Exp, Cel I Res,) Volume 37, Page 614 (196 5)], this ability is further inversely proportional to the in vivo age of the donor of the cells [ G., M., Martin et al., Laboratory Investigation (Lab, I. nvest, ) vol. 23, p. 86 (1979); S., Goldstein et al., Pro. Seedings of the Nanoconal Academy of Sciences (U , S, A, ) (Proc.

Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）６４巻１５５頁（１９６９）：Ｅ　Ｌ、シュ ナイダー、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ イエンシズ（Ｕ、Ｓ、Ａ、）（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）７３ 巻３５８４頁（１９７６）：ｙ、ルギルティー等、ジェレオントロジア（Ｇｅｒ ｅｏｎｔｏｌｏｇｉａ）１９巻３０３頁（１９７３）］。Nat 1. Acad, Sci.) Vol. 64, p. 155 (1969): E.L., Shu. Neider, Proceedings of the National Academy of Sciences. Enshis (U, S, A,) (Proc, Natl, Acad, Sci,) 73 Vol. 3584 (1976): y, Rugilty et al., Gereontologia (Ger. eontologia), Vol. 19, p. 303 (1973)].

増殖的成長能が涸渇した細胞は、「老化」を受けたと言われる。インビトロでの 細胞老化は形態学的変化によって表わされ、外因性成長因子に対する細胞の不応 答を伴う。したがって、細胞の老化はその細胞の増殖能の損失を表わす。インビ トロの細胞老化現象を説明するための様々な理論が提唱されているが、年齢に依 存する増殖能の損失が遺伝的プログラムの機蝿であり得ることは実験事実が示唆 している［Ｌ、Ｅ、オーシェル、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナシ３ナル・ アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｕ、Ｓ、Ａ、）（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ、Ｓｅｔ、）４９巻５１７頁（１９８３）；Ｒ，デ・ｖ−スｌｉ、ヒｓ−７ ：／−ジエネテイクス（Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔ、）　１５巻８７頁（１９７２ ）；Ｍ。Cells whose capacity for proliferative growth has been depleted are said to have undergone "senescence." in vitro Cellular senescence is manifested by morphological changes and the refractoriness of cells to exogenous growth factors. with an answer. Therefore, senescence of a cell represents a loss of the cell's ability to proliferate. Imbi Various theories have been proposed to explain the phenomenon of cell aging in Toro, but the Experimental evidence suggests that the loss of existing proliferative ability may be a function of the genetic program. [L, E, Orschel, Proceedings of the National Academy of Sciences (U, S, A,) (Proc, Natl, Ac ad, Set,) vol. 49, p. 517 (1983); R. :/-Human Genet, vol. 15, p. 87 (1972) );M.

バックワルド、ミューチージョン・リサーチ（Ｍｕ　ｔ　ａ　ｔ、　Ｒｅ　ｓ、 　）　４４巻４０１頁（１９７７）　；Ｇ、　Ｍ、マーティン等、アメリカン・ ジャーナル・オブ・バソロジ−（Ａｍｅｒ、Ｊ、Ｐａｔｈｏｌ、）７４巻１３７ 頁（１９７４）：Ｊ。Buchwald, Mutition Research ) Vol. 44, p. 401 (1977); G., M., Martin et al., American Journal of Bathology (Amer, J. Pathol,) Volume 74, 137 Page (1974): J.

Ｒ，スミス等、メカニズムズ・オブ・エイジング・アンド・ディベロップメント （Ｍｅｃｈ、Ａｇｅ、Ｄｅｖ、）１３巻３８７頁（１９８０）　；Ｔ、　Ｂ、　 Ｌ、カークウッド等、セオレティカル・バイオロジー（Ｔｈｅｏｒ、Ｂｉｏｌ、 ）５３巻４８１頁（１９７５）］。R. Smith et al., Mechanisms of Aging and Development. (Mech, Age, Dev,) Vol. 13, p. 387 (1980); T, B, Kirkwood et al., Theoretical Biology (Theor, Biol, ) Vol. 53, p. 481 (1975)].

ヒト繊維芽細胞を用いた細胞融合のインビトロでの研究は、細胞老化の静止表現 型が増殖的表現型より優勢であることを証明した［ＯＭ、ペレイラースミス、ツ マティック・セル・ジエネティクス（Ｓｏｍａ　ｔ、　Ｃｅ　ｌ　ｌ　Ｇｅｎｅ 　ｔ、　）８巻７３１頁（１９８２）：Ｔ、Ｈ，ノーウッド等、プロシーディン グズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｕ、Ｓ、　Ａ 、　）　（Ｐｒｏｃ。In vitro studies of cell fusion using human fibroblasts demonstrate the quiescent expression of cellular senescence. [OM, Pereira-Smith, Tus. Matic Cell Genetics (Somat, Ce l l Gene t, ) Vol. 8, p. 731 (1982): T. H. Norwood et al., Procedin. Goods of the National Academy of Sciences (U, S, A , ) (Proc.

Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）７１巻２２３頁（１９７４）；Ｇ、Ｈ，シュ タイン等、エクスペリメンタル・セル・リサーチ（Ｅｘｐ、Ｃｅｌ　ｌ　Ｒｅｓ 、）１３０巻１５５頁（１９７９）］。Nat 1. Acad, Sci.) Vol. 71, p. 223 (1974); Experimental Cell Research (Exp, Cell Res) ), vol. 130, p. 155 (1979)].

老化現象に対する洞察が、老化及び若齢（即ち非老化）細胞を融合させてヘテロ ジカリオンを形成させる研究から得られた。このヘテロジカリオンの「若齢」核 に老化を誘発するため（ＤＮＡ合成の阻害により測定される）、融合に先立ち老 化細胞に蛋白合成が起こらねばならない［Ｇ、　Ｃ，パーマ−等、ジャーナル・ オン・セルラー・バイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）９４巻１８７頁（ １９８２）：ｃ、に、ドレッシャーーリンカーン等、エクスペリメンタル・セル ・リサーチ（Ｅｘｐ、Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、）１４４巻４５５頁（１９８３）；Ｇ 。Insights into the phenomenon of aging have led to the fusion of aged and young (i.e. non-senescent) cells into heterogeneous cells. Obtained from research on forming dicaryon. The “young” nucleus of this heterodicaryon to induce senescence (as measured by inhibition of DNA synthesis) prior to fusion. Protein synthesis must occur in cells [G., C. Palmer et al., Journal. On Cellular Biology (J, Ce11.Biol,) Volume 94, Page 187 ( 1982): c., Drescher-Lincoln et al., Experimental Cell. ・Research (Exp, Ce1l Res,) vol. 144, p. 455 (1983); G .

Ｃ，バーナー等、エクスペリメンタル・セル・リサーチ（Ｅｘｐ、　Ｃｅ　Ｉ　 Ｉ　Ｒｅｓ、）１４５巻７０８頁（１９８３）：Ｃ，に、ドレッシャーーリンカ ーン等、エクスペリメンタル・セル・リサーチ（Ｅｘｐ、Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、） １５３巻２０８頁（１９８４）　コ。C, Burner, etc., Experimental Cell Research (Exp, Ce I I Res, vol. 145, p. 708 (1983): Drescher-linker in C. Experimental Cell Research (Exp, Ce1l Res,) Volume 153, page 208 (1984).

また、老化線維芽細胞のｍＲＮＡの若齢線維芽細胞へのマイクロインジェクショ ンは、その若齢細胞がＤＮＡを合成する能力［Ｃ，Ｋ、　ランプキン等、サイエ ンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３２巻３９３頁（１９８６）］及びその細胞が細胞サ イクルのＳ（静止）相になる能力［Ｃ，Ｋ、ランプキン等、エクスペリメンタル ・セル・リサーチ（Ｅｘｐ、Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、）１６０巻５４４頁（１９８５ ）］の両者を阻害することが見いだされた。In addition, microinjection of mRNA from aged fibroblasts into young fibroblasts The ability of young cells to synthesize DNA [C, K., Lumpkin et al., Sci. Science, Vol. 232, p. 393 (1986)] and its cells are The ability to enter the S (stationary) phase of the cycle [C, K, Lumpkin, etc., experimental ・Cell Research (Exp, Ce1l Res,) Vol. 160, p. 544 (1985 )] was found to inhibit both.

研究者等はインビトロにおいて老化線維細胞絶層で増幅される特異なｍＲＮＡを 同定した［Ａ、Ｋ、　ロイ等、ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリ ー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）２５８巻１０１２３頁（１９８３）　；ｃ、　 ｃ。Researchers have detected a unique mRNA that is amplified in aging fiber cell strata in vitro. Identified [A, K., Roy et al., Journal on Biological Chemistry] - (J, Biol, Chem,) vol. 258, p. 10123 (1983); c, c.

ウェブスター等、メカニズムズ・オン・エイジング・アンド・ディベロップメン ト（Ｍｅｃｈ、Ａｇｅ、Ｄｅｖ、）２４巻３３５頁（１９８４）；Ｅ、ランプ等 、ジャーナル・オン・セル・バイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）１０１ 巻１６９５頁（１９８５）；Ｒ，ウニリンガ−等、ジャーナル・オン・セル・バ イオロジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）３４巻２０３頁（１９８６）：Ｊ、Ｅ 。Webster et al., Mechanisms on Aging and Development Mech, Age, Dev, Vol. 24, p. 335 (1984); E. Lamp et al. , Journal on Cell Biology (J, Ce1l Biol,) 101 Vol. 1695 (1985); R. Unilinger et al., Journal on Cell. Iology (J, Ce1l Biol,) vol. 34, p. 203 (1986): J, E .

フレミング等、プロシーディングズ・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン ・サイエンシズ（Ｕ、Ｓ、Ａ、）（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ）８５巻４０９９頁（１９８８）：Ｍ、Ｄ、ウェスト等、エクスペリメンタル・ セル・リサーチ（Ｅｘｐ、Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、）１８４巻１３８頁（１９８９） ；”ｒ。Fleming et al., Proceedings on the National Academy ・Sciences (U, S, A,) (Proc, Nat 1. Acad, Sci, ) Vol. 85, p. 4099 (1988): M. D. West et al. Cell Research (Exp, Ce1l Res,) vol. 184, p. 138 (1989) ;”r.

ジョルダーノ等、エクスペリメンタル・セル・リサーチ（Ｅｘｐ、　Ｃｅ　Ｉ　 Ｉ　Ｒｅｓ、）１８５巻３９９頁（１９８９）］、例えば、］Ｔ−キニノーゲン 遺伝の発現は老齢ラットの肝臓中で増幅される［Ｆ、シェラ等、モレキュラー・ アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌｅｃ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）９巻５ ６１０頁（１９８９）］。老化ヒト線維芽細胞には、転写レベルにおけるｃ−ｆ ｏｓ発現の抑制を含む、異なった遺伝的プログラムが存在することもまた示唆さ れている［Ｔ、　セシ＋トリ等、サイエンス（Ｓｃ　１ｅｎｃｅ）２４７巻２０ ５頁（１９９０）］。Giordano et al., Experimental Cell Research (Exp, CeI) I Res, vol. 185, p. 399 (1989)], e.g., ] T-kininogen Genetic expression is amplified in the liver of old rats [F., Shera et al., Molecular. and Cellular Biology (Molec, Ce11.Biol,) Volume 9 5 610 pages (1989)]. Aging human fibroblasts have c-f at the transcriptional level. It has also been suggested that a different genetic program exists, including the suppression of os expression. [T, Seshi + Tori et al., Science (Sc 1ence) Volume 247, 20 5 (1990)].

ヒトの二倍体内皮細胞は、これらの線維芽細胞がインビトロの細胞老化に似るた め、細胞老化の研究のための別の細胞型を提供する［Ｔ、マシアグ等、ジャーｆ ルーオン・セルラー・バイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）９１巻４２０ 頁（１９８１）；Ｐ、Ｂ、　ゴートン等、イン・ヒトｏ（Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ）１ ９巻６６１頁（１９８３）；Ａ、　ジョンソン等、メカニズムズ・オン・エイシ ングー７ンド・ディベロップメント（Ｍｅｃｈ、Ａｇｅ、Ｄｅｖ、）１８巻１頁 （１９８２）：Ｓ、Ｃ，ソーントン等、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２２２巻 ６２３頁（１９８３）；ｖ、ｗ、Ｍ、ヴアン・ヒンスバーグ等、ヨーロピアン・ ジャーナル・オン・セル・バイオロジー（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｃｅｌ　Ｉ　Ｂｉｏｌ、 ）４２巻１０１頁（１９８６）：ｗ９ｗ、ニコルス等、ジャーナル・オン・セル ラー・フィジオロジ−（Ｊ、Ｃｅ　Ｉ　１．Ｐｈｙｓ　ｔｏ　１．）１３２巻４ ５３頁（１９８７）］。Human diploid endothelial cells exhibit senescence in humans, as these fibroblasts mimic cellular senescence in vitro. to provide another cell type for the study of cellular aging [T., Massiag et al., Gerf. Luon Cellular Biology (J, Ce11.Biol,) Volume 91, 420 Page (1981); P, B. Gorton et al., In Vitro 1 Vol. 9, p. 661 (1983); Johnson et al., Mechanisms on Asia. Ngu 7nd Development (Mech, Age, Dev,) Volume 18, Page 1 (1982): S., C., Thornton et al., Science, vol. 222. 623 pages (1983); v, w, M, Van Hinsberg et al., European Journal on Cell Biology (Eur, J, Cell I Biol, ) Vol. 42, p. 101 (1986): w9w, Nichols et al., Journal on Cell Ra Physiology (J, Ce I 1. Phys to 1.) Volume 132 4 53 (1987)].

さらにヒト内皮細胞は、様々な機能的且つ可逆的表現型を発現することができる 。内皮細胞は、幾つかの静止及び非終末分化表現型を示す［Ｊ、フォークマン等 、ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）２８８巻５５１頁（１９８０）：Ｔ、７ンアグ等 、ジャーナル・オン・セル・バイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）９４巻 ５１１頁（１９８２）：Ｊ、Ａ、マトリ等、ジャーナル・オン・セル・バイオロ ジー（Ｊ、Ｃｅｌ　Ｉ　Ｂｉｏｌ、）９７巻１５３頁（１９８３）：Ｒ，モンテ ッサーノ、ジャーナル・オン・セル・バイオロジー（Ｊ、Ｃｅｌ　ｌ　Ｂｉｏｌ 、）９９巻１７０６頁（１９８４）：Ｒ，モンテッサーノ等、ジャーナル・オン ・セル・フィジオロジ−（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、）３４巻４６０頁（ １９８８）］。Furthermore, human endothelial cells can express a variety of functional and reversible phenotypes. . Endothelial cells exhibit several quiescent and non-terminally differentiated phenotypes [J, Folkman et al. , Nature, Vol. 288, p. 551 (1980): T, 7 Ngu et al. , Journal on Cell Biology (J, Ce1l Biol,) Volume 94 Page 511 (1982): J. A. Matri et al., Journal on Cell Biology. G (J, Cel I Biol,) vol. 97, p. 153 (1983): R, Monte Sarno, Journal on Cell Biology ) Volume 99, page 1706 (1984): R. Montesano et al., Journal on ・Cell Physiology (J, Ce1l Physiol,) Vol. 34, p. 460 ( 1988)].

インビトロにおけるヒト内皮細胞の分化経路は、成長因子により誘導される内皮 細胞の増殖をインビトロで阻害する、サイトカインの介在する細胞の静止の誘導 を含むことが示唆された［Ｍ、ジェイ等、サイエンス（Ｓｃ　１ｅｎｃｅ）２２ ８巻８８２頁（１９８５）；Ｊ、Ａ、７ドリ等、イン・ヒトｏ（Ｉｎ　Ｖｉｔｒ ｏ）２３巻３８７頁（１９８７）；Ｙ、　クボタ等、ジャーナル・オン・セル・ バイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）１０７巻１５８９頁（１９８８）： Ｄ。The differentiation pathway of human endothelial cells in vitro is a growth factor-induced endothelial Cytokine-mediated induction of cell quiescence that inhibits cell proliferation in vitro [M., Jay et al., Science (Sc1ence) 22 Vol. 8, p. 882 (1985); o) Vol. 23, p. 387 (1987); Y., Kubota et al., Journal on Cell. Biology (J, Ce1l Biol,) vol. 107, p. 1589 (1988): D.

Ｅ。イングバー等、ジャーナル・オン・セル・バイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂ ｉｏｌ、）１０７巻３１７頁（１９８９）］。E. Ingber et al., Journal on Cell Biology (J, Ce1l B iol, ) vol. 107, p. 317 (1989)].

内皮細胞増殖の阻害物質は、毛細血管様管状内皮細胞表現型の形成を含むインビ トロでの内皮細胞の分化の際に誘導される即時初期転写事象の調節物質としても 機能する［Ｔ、マシアグ、インポータント・アドバンシズ・イン・オンコロジー 　（Ｉｍｐ、Ａｄｖ、０ｎｃｏ１．）（Ｖ、Ｔ、デ・ビータ等編、Ｊ、Ｂ　リツ ビンコット、フィラデルフィア、４２　（１９９０）：Ｄ、ゴールドゲイバー等 、プロシーディングズ・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシ ズ（Ｕ、Ｓ、Ａ、）（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）８６巻７６０ ６頁（１９９０）；Ｔ、　フーラ等、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカ ル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅ ｓ。Inhibitors of endothelial cell proliferation have been linked to the formation of a capillary-like tubular endothelial cell phenotype. Also as a regulator of immediate early transcriptional events induced during endothelial cell differentiation in Toro. Function [T, Maciag, Important Advances in Oncology (Imp, Adv, 0nco1.) (edited by V, T, de Vita et al., J, B Ritz Bincott, Philadelphia, 42 (1990): D. Goldgaber et al. , Proceedings on the National Academy of Sciences (U, S, A,) (Proc, Natl, Acad, Sci,) Volume 86, 760 6 pages (1990); T., Fula et al., Biochemical and Biophysics. Re Research Communications (Biochem, Biophys, Re s.

Ｃｏｍｍｕｎ、）１６７巻６３７頁（１９９０）］、細胞増殖の阻害物質は、１ 、インターロイキン１α（ＩＬ−１α）［Ｒ，モンテツサーノ等、ジャーナル・ オン・セル・バイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）９９巻１７０６頁（１ ９８４）；Ｒ，モンテノサーノ等、ジャーナル・オン・セル・フイジオロジ−（ Ｊ、Ｃｅｌ　ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、）１２２巻４２４頁（１９８５）］　；２　 腫瘍壊死因子［Ｍ、　フレイター−ンユローダー等、プロンーデイングズ・オン ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシズ（Ｕ、Ｓ、　Ａ、　＞　（ Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）８４巻５２７７頁（１９８７）：Ｎ 。Commun,) Vol. 167, p. 637 (1990)], the inhibitor of cell proliferation is 1 , interleukin-1α (IL-1α) [R, Montetusano et al., Journal On Cell Biology (J, Ce1l Biol,) Volume 99, Page 1706 (1 984); R. Montenosano et al., Journal on Cell Physiology ( J, Cell Physiol, Volume 122, Page 424 (1985)];2 Tumor necrosis factor [M, Fraternity-Uroeder et al. ・The National Academy on Sciences (U, S, A, > ( Proc, Natl. Acad, Sci.) vol. 84, p. 5277 (1987): N .

サトー等、ジャーナル・オン・ザ・ナショナル・キャンサー・インステイテユー ト（Ｊ、Ｎａｔｌ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、）７６巻１１１３頁（１９８６） 、Ｊ、Ｐ、プバー、アメリカン・ジャーナル・オン・ノくソロジー（Ａｍｅ　ｒ 、Ｊ。Sato et al., Journal on the National Cancer Institute (J, Natl, Cancer In5t,) Vol. 76, p. 1113 (1986) , J.P., Puber, American Journal on Noxology (Amer , J.

Ｐａｔｈｏｌ、）１３３巻４２６頁（１９８８）：Ｙ、シマダ等、ジャーナル・ オン・セル・フィシオロジ−（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、）１４２巻３１ 頁（１９９０）］　； ３、トランスフォーミング成長因子β［Ａ、ベアド等、／くイオケミカル・アン ド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂ ｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、）１３８巻４７６頁（１９８６）：Ｇ。Pathol, Vol. 133, p. 426 (1988): Y., Shimada et al., Journal. On Cell Physiology (J, Ce1l Physiol,) Volume 142 31 Page (1990)]; 3. Transforming growth factor β [A, Baird et al. Biophysical Research Communications (Biochem, B iophys, Res, Commun,) 138, 476 (1986): G.

ミュリュー等、プロシーデイングズ・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン ・サイエンシズ（Ｕ、Ｓ、Ａ、）（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、） ８４巻５６００頁（１９８７）；　Ｊ、Ａ、メイリ等、ジャーナル・オン・セル ・ノくイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）１０６巻１３７５頁（１９８８ ）］；４、ガンマ−インターフェロン［Ｒ，フリーセル等、ジャーナル・オン・ セル・バイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）１０４巻６８９頁（１９８７ ）；Ｎ。Mullieu et al., Proceedings on the National Academy ・Sciences (U, S, A,) (Proc, Natl, Acad, Sci,) Vol. 84, p. 5600 (1987); J. A. Meili et al., Journal on Cell. ・Nokuiology (J, Ce1l Biol,) Vol. 106, p. 1375 (1988 ); 4, gamma-interferon [R, Freecell et al., Journal on Cell Biology (J, Ce1l Biol,) vol. 104, p. 689 (1987 );N.

ツル才力等、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニ ケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、）１ ５５巻４２９頁（１９８８）］及び、 ５、腫瘍促進物質ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）［Ｒ，モンテ・ツサーノ等 、セル（Ｃｅ　ｌ　１）４２巻４６９頁（１９８５）；ｓ、Ｒ，ドクトロー等、 ジャーナル・オン−セル−バイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）１０４巻 ６７９頁（１９８７）；Ｒモンテッサーノ等、ジャーナル・オン・セルラー・フ ィジオロジ−（Ｊ、Ｃｅ１１．　Ｐｈｙｓｉｏｌ、）１３０巻２８４頁（１９８ ７）：Ｈ、ホン等、ＦＡＳＡＢジャーナル（ＦＡＳＡＢ　Ｊ、）２巻２７９７頁 （１９８８）］、 を包含する。Biochemical and Biophysical Research Community cations (Biochem, Biophys, Res, Commun,) 1 Vol. 55, p. 429 (1988)] and 5. Tumor-promoting substance phorbol myristate (PMA) [R, Monte Tusano et al. , Cell (Cel 1) Vol. 42, p. 469 (1985); S. R. Doctorow et al. Journal on Cell Biology (J, Ce1l Biol,) Volume 104 679 pages (1987); R. Montesano et al., Journal on Cellular F. Physiology (J, Ce11. Physiol,) Vol. 130, p. 284 (198 7): H, Hong et al., FASAB Journal (FASAB J,) vol. 2, p. 2797 (1988)], includes.

■■、内皮細胞の生理学的機能 血管の内層を形成する内皮細胞は、血液成分及びマクロ分子の下部組織への移動 のための選択的障壁の形成、並びに血液及び組織の間の非血栓形成性接点の維持 、といった様々な生理機能に参加している。内皮細胞は、新しい毛細血管及び血 管の発達における重要な構成因子でもある。■■, Physiological functions of endothelial cells Endothelial cells, which form the lining of blood vessels, transport blood components and macromolecules to underlying tissues. formation of selective barriers for and maintenance of non-thrombogenic contacts between blood and tissue It participates in various physiological functions such as. Endothelial cells generate new capillaries and blood It is also an important constituent factor in tube development.

血管の発達（脈管形成）は、脈管系の発達中といったような発達期中に、及び、 乾癖、関節炎、慢性炎症状態、糖尿病性網膜症及び腫瘍の生長のような種々の疾 病状態の病態生理の一部として起こる。The development of blood vessels (angiogenesis) occurs during developmental periods, such as during the development of the vascular system, and various diseases such as psoriasis, arthritis, chronic inflammatory conditions, diabetic retinopathy and tumor growth. Occurs as part of the pathophysiology of a disease state.

脈管形成は、内皮細胞の統制された移動、増殖及び分化を含んでいる。これは脈 管形成刺激に対する内皮細胞の応答によって開始する。この刺激は、細胞の移動 、細胞の増殖及び細胞の分化という３つの事象に分けられ、それにより細胞は管 状構造へと統合される。Angiogenesis involves the controlled migration, proliferation and differentiation of endothelial cells. This is the pulse It begins with the response of endothelial cells to tube-forming stimuli. This stimulus causes cell migration It is divided into three events: cell proliferation and cell differentiation, whereby cells become vascular. integrated into a morphological structure.

ｒｒｒ、有糸***促進物質及びサイトカモン上記の事象はインビトロで、そして より頻繁にインビボで有糸***促進性ポリペプチドによって仲介される。内皮細 胞の移動は、ヘパリン結合成長因子及びアンギオトロピンのような因子によって 誘導される。増殖はヘパリン結合成長因子（以ＩＨＢＧＦと称する）により誘導 され、分化及び細胞の統合は、インターロイキン１（ＩＬ−１）、腫瘍壊死因子 （ＴＮＦ）、ガンマ−インターフェロン、トランスフォーミング成長因子α及び β（各々ＴＧＦ−ａ及びＴＧＦ−Ｂ）及び酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ ）を包含するポリペプチドにより誘導される。rrr, mitogens and cytokamons The above events occur in vitro and More often in vivo it is mediated by mitogenic polypeptides. endothelial thin Migration of the follicles is controlled by factors such as heparin-binding growth factors and angiotropin. be guided. Proliferation is induced by heparin-binding growth factor (hereinafter referred to as IHBGF). differentiation and cell integration are controlled by interleukin 1 (IL-1), tumor necrosis factor (TNF), gamma interferon, transforming growth factor alpha and β (TGF-a and TGF-B, respectively) and phorbol myristate acetate (PMA ).

加齢につれて細胞はＨＢＧＦ−１のような増殖を誘導する有糸***促進物質に不 応となる。ＩＬ−１αのようなサイトカインは細胞の増殖を阻害する。活性化さ れたマクロファージにより産生されるＩＬ−１は様々な生物活性を示す。これら の活性は２種のインターロイキン蛋白、ｒＬ−１α及びＩＬ−１βに存し、これ らは僅かな相同性を共有するのみである［Ｃ，Ｊ、マーチ等、ネイチャー（Ｎａ ｔｕｒｅ）３１５巻６４１頁（１９８５）］。As we age, cells become deficient in mitogens that induce proliferation, such as HBGF-1. It will be a response. Cytokines such as IL-1α inhibit cell proliferation. activated IL-1 produced by isolated macrophages exhibits various biological activities. these The activity of is dependent on two types of interleukin proteins, rL-1α and IL-1β, which share only slight homology [C, J., March et al., Nature (Na. ture), Vol. 315, p. 641 (1985)].

ＩＬ〜１αは内皮細胞の機能の強力な調節物質である。これは内皮細胞の成長を 阻害し、インビトロでその表現型を変える。ＩＬ−１の存在下において内皮細胞 は細長い線維芽細胞様の表現型を呈し、これはインビトロの内皮細胞の分化過程 中、初期の段階に存在する表現型に似ている。ＩＬ−１αは、組織因子凝血促進 活性のような活性の発現を誘導し、プラスミノーゲン活性化物質阻害剤Ｉの活性 を増大させ、そして組織プラスミノーゲン活性化物質の活性を低下させる。これ は血管拡張物質であり且つ血小板凝集の阻害物質であるプロスタサイクリンの産 生を誘導する。IL-1α is a potent regulator of endothelial cell function. This stimulates endothelial cell growth inhibit and alter its phenotype in vitro. Endothelial cells in the presence of IL-1 exhibit an elongated fibroblast-like phenotype, which is consistent with the in vitro endothelial cell differentiation process. The phenotype is similar to that present in the middle and early stages. IL-1α promotes tissue factor coagulation inducing the expression of activities such as plasminogen activator inhibitor I activity. and decrease tissue plasminogen activator activity. this stimulates the production of prostacyclin, a vasodilator and inhibitor of platelet aggregation. induce life.

ＩＬ−１αはＨＢＧＦ−１及びＨＢＧＦ−２といった池の有糸***促進物質と共 通する一定の特徴を有する。ＩＬ−１αの前駆体は分泌のための信号配列を欠き 、ＩＬ−１ａは、核膜を横切る輸送を司る核移動配列を含む。ヌクレオチド配列 を本明細書中の図４に示す［Ｃ，Ｊ、マーチ等、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３ １５巻６４１頁（１９８５）］。IL-1α co-exists with mitogens such as HBGF-1 and HBGF-2. It has certain characteristics that pass through it. The precursor of IL-1α lacks the signal sequence for secretion. , IL-1a contains a nuclear translocation sequence that governs transport across the nuclear membrane. nucleotide sequence is shown in FIG. 4 herein [C, J. March et al., Nature 3 15, p. 641 (1985)].

ＩＶ、要約 このように、ヒト内皮細胞の発達及び分化は種々の有糸***促進物質の添加によ ってインビトロで操作でき、その重要な生理学的役割の故に、そしてこれが形態 学的変化及び有糸***促進物質に対する応答能の損失を伴う最終的寿命を示すが 故に、これは老化の研究のための良好なモデルとなる。IV. Summary Thus, the development and differentiation of human endothelial cells is influenced by the addition of various mitogens. can be manipulated in vitro, and because of its important physiological role, this exhibits a terminal lifespan with chemical changes and loss of ability to respond to mitogens. Therefore, it is a good model for the study of aging.

老化を逆行させ内皮細胞の増殖能を回復させるという期待は多（の分野における 努力と関わっている。老人の疾病の多くはこの能力の損失と関係している。また 、老化の加速を特徴とする悲劇的な疾病である早老症もまた、内皮細胞の増殖能 の損失と関係している。この能力の回復は、この疾病、他の加齢関連疾患、及び 加齢そのものの処置に多大な関連を有するものである。There are many expectations in the field of reversing aging and restoring the proliferative ability of endothelial cells. It has to do with effort. Many of the diseases of the elderly are related to the loss of this ability. Also , progeria, a tragic disease characterized by accelerated aging, also affects the proliferative capacity of endothelial cells. associated with losses. Recovery of this ability is important in this disease, other age-related diseases, and This has great relevance to the treatment of aging itself.

さらに、培養細胞の増殖能の＠１ｙは、医学及び薬学産業に用途を有する。形質 転換されていない細胞を不死とする能力は、ある組織及び細胞の産生物質をも際 限なく供給するために使用することができる。Furthermore, the proliferative ability of cultured cells has applications in the medical and pharmaceutical industry. traits The ability to immortalize untransformed cells also makes certain tissue and cell products extremely It can be used for unlimited supply.

発明の要約 この発明の一つの目的は、細胞の核におけるＩＬ−１αの濃度を低下させること からなる老化細胞の若返りのための方法を提供することである［ここでそのレベ ルは、大体最大限、増殖能を有する若齢細胞の核で観察される程度まで低下させ る］。Summary of the invention One purpose of this invention is to reduce the concentration of IL-1α in the nucleus of cells. To provide a method for the rejuvenation of senescent cells consisting of approximately to the maximum extent observed in the nuclei of young, proliferative cells. ].

詳細には、本発明は、インターロイキンｌαをコードしている遺伝子の発現を損 なうことのできる有効量の物質を細胞に供することからなる、老化細胞を若返ら せる方法を提供する。In particular, the present invention impairs the expression of the gene encoding interleukin lα. rejuvenation of senescent cells, which consists of providing the cells with an effective amount of a substance capable of rejuvenating provide a method to do so.

さらに本発明は、（１）発現が、ＩＬ−１αをコードしているｍＲＮＡの翻訳を 損なうことのできる物質によって損なわれ、または（２）発現が、ＩＬ−１αを コードしているｍＲＮＡ分子の転写を損なうことのできる物質によって損なわれ る、上記方法の態様を提供する。Furthermore, the present invention provides that (1) expression inhibits translation of mRNA encoding IL-1α; or (2) expression is impaired by a substance that can impair IL-1α. is impaired by substances that can impair the transcription of the encoding mRNA molecule. Embodiments of the above method are provided.

さらに本発明は、該物質が、 （ａ）インターロイキン１α（ＩＬ−１α）をコードしているｍＲＮＡに対して 相補的なヌクレオチドの配列を有し：（ｂ）該ｍＲＮＡとハイブリダイズするこ とができ、それにより該ｍＲＮＡの発現を損なうことができる、 という特徴を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、上記方法の態様を 提供する。Furthermore, the present invention provides that the substance is (a) For mRNA encoding interleukin 1α (IL-1α) has a complementary nucleotide sequence: (b) is capable of hybridizing with the mRNA; and thereby impair the expression of the mRNA. An embodiment of the above method, which is an antisense oligonucleotide having the characteristics of provide.

さらに本発明は、インターロイキン１αをコードしている遺伝子の発現を損なう ことのできる物質の有効量の存在下で細胞を培養するこ去からなる、不死でない 細胞のインビトロ組繊細胞培養の方法を提供する。Furthermore, the present invention impairs the expression of the gene encoding interleukin-1α. non-immortal therapy, which consists of culturing cells in the presence of an effective amount of a substance capable of A method for in vitro tissue culture of cells is provided.

さらに本発明は、（１）該物質がＩＬ−１αをコードしているｍＲＮＡの翻訳を 損なうことのできるオリゴヌクレオチドであり、または（２）該物質が細胞中の ＩＬ−１α　ｍＲＮＡをコードしているＤＮＡの転写を特異的に遮断することが できる、上記方法の態様を提供する。Furthermore, the present invention provides that (1) the substance inhibits the translation of mRNA encoding IL-1α; (2) the substance is an oligonucleotide capable of damaging It is possible to specifically block the transcription of DNA encoding IL-1α mRNA. Provided are embodiments of the above method in which the invention can be performed.

さらに本発明は、該物質が、 （ａ）インターロイキン１α（［Ｌ−１α）をコードしているｍＲＮＡに相補的 なヌクレオチドの配列を有し； （ｂ）該ｍＲＮＡとハイブリダイズすることができ、それにより該ｍＲＮＡの翻 訳を損なうことができる、 という特徴を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、上記方法の態様を 提供する。Furthermore, the present invention provides that the substance is (a) Complementary to mRNA encoding interleukin 1α ([L-1α) has a sequence of nucleotides; (b) capable of hybridizing with said mRNA, thereby causing translation of said mRNA; can spoil the translation, An embodiment of the above method, which is an antisense oligonucleotide having the characteristics of provide.

さらに本発明は、例えば細胞を有効量の変異ＩＬ−１αポリペプチドの存在下で 培養［ここでその変異はポリペプチドの核移動領域にあり、それによってこの変 異ＩＬ−１αポリペプチドは細胞のレセプターと結合できるが核には移動できな い。また、有効量は、内因性ＩＬ−１αの核移動を損なうのに有効であるコする ことにより、ＩＬ−１α遺伝子の発現産物の移動を損なうことのできる有効量の 物質を細胞に供することからなる、老化細胞を若返らせる方法を提供する。Furthermore, the present invention provides, for example, treating cells in the presence of an effective amount of a mutant IL-1α polypeptide. Culture [where the mutation is in the nuclear translocation region of the polypeptide, thereby Different IL-1α polypeptides can bind to cellular receptors but cannot move to the nucleus. stomach. Additionally, the effective amount is effective to impair nuclear translocation of endogenous IL-1α. of an effective amount capable of impairing the movement of the expression product of the IL-1α gene. A method of rejuvenating senescent cells is provided comprising providing a substance to the cells.

さらに本発明は、インターロイキン１αをコードしている遺伝子の発現を損なう ことのできる有効量の物質によって患者を処置することからなる、患者の加齢関 連疾患の処置方法を提供する。Furthermore, the present invention impairs the expression of the gene encoding interleukin-1α. aging-related treatment of a patient, comprising treating the patient with an effective amount of a substance that can Provides a method for treating related diseases.

さらに本発明は、 （ａ）インターロイキン１α（ＩＬ−１α）をコードしているｍＲＮＡに対して 相補的なヌクレオチドの配列を有し；（ｂ）該ｍＲＮＡとハイブリダイズするこ とができ、それにより該ｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる、 という特徴を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。Furthermore, the present invention (a) For mRNA encoding interleukin 1α (IL-1α) (b) has a complementary nucleotide sequence; (b) is capable of hybridizing with the mRNA; and thereby inhibit translation of the mRNA. Provided is an antisense oligonucleotide having the following characteristics.

本発明にとって特に興味深いのは、配列・５°ＴＴＴ　ＧＧＣＣＡＴ　ＣＴＴＧ ＡＣＴＴＣ３’　またはその等価配列を含むオリゴヌクレオチドである。Of particular interest to the present invention are the arrays 5° TTT GGCCAT CTTG It is an oligonucleotide containing ACTTC3' or its equivalent sequence.

別途定義の無い限り、本明細書中使用される全ての技術的及び科学的用語は、こ の発明が眞する分野における通常の知識を有する者により一般に理解されるのと 同じ意義を有する。本発明の試験の実施に当たっては本明細書に記載される方法 及び材料と類似または同等の物を使用することができるが、好ましい方法及び材 料をここに記載する。以下に述べる刊行物及び特許は全て引用して本明細書の一 部とする。Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein are defined herein. as commonly understood by a person of ordinary skill in the field to which the invention pertains. have the same meaning. The methods described herein for carrying out the tests of the present invention Although similar or equivalent materials can be used, preferred methods and materials The fees are listed here. All publications and patents mentioned below are incorporated herein by reference. Department.

図面の簡単な説明 図１は、インビトロでの若齢および老化ヒト内皮細胞によるシクロオキシゲナー ゼ（ｃｏｘ）及びＩＬ−１αの発現を示す。図ＩＡはＣＯＸ転写物のＩＬ−１α 誘導を示す。図ＩＢはＣＯＸ転写物のＰＭＡ誘導を示す。図ＩＣはヒト内皮細胞 によるＩＬ−１α　ｍＲＮＡの発現を示す。図ＩＤはヒト内皮細胞における■Ｌ −１αによるＩＬ−１αの誘導を示す。図ＩＥは早老症の線維芽細胞及び年齢の 合致した対照ヒト線維芽細胞によるＩＬ−１α　ｍＲＮＡの発現を示す。Brief description of the drawing Figure 1. Cyclooxygenation by young and aged human endothelial cells in vitro. The expression of cox and IL-1α is shown. Figure IA shows the COX transcript IL-1α. Show induction. Figure IB shows PMA induction of COX transcripts. Figure IC is human endothelial cell Figure 2 shows the expression of IL-1α mRNA by. Figure ID is ■L in human endothelial cells. -1α induction of IL-1α. Figure IE shows progeria fibroblasts and age Expression of IL-1α mRNA by matched control human fibroblasts is shown.

図２は、ヒトＩＬ−１αに対して標的付けられたアンチセンスオリゴヌクレオチ ドによるヒト内皮細胞の寿命の延長を示す。Figure 2 shows antisense oligonucleotides targeted against human IL-1α. Figure 2 shows that the lifespan of human endothelial cells is extended by dehydrogenation.

図３は異なった集団倍化におけるヒト内皮細胞の位相差顕微鏡写真を示す。パネ ル（Ａ）はアンチセンスＩＬ−１αオリゴマー処理細胞を示す（ＰＤ８８）。Figure 3 shows phase contrast micrographs of human endothelial cells at different population doublings. panel (A) shows cells treated with antisense IL-1α oligomer (PD88).

パネル（Ｂ）は老化細胞を示す（ＰＤ５０）。パネル（Ｃ）はオリゴマーを培地 から１６日間除去した外は（Ａ）と同一の細胞を示す。倍率は２００倍である。Panel (B) shows senescent cells (PD50). Panel (C) shows oligomers in culture medium. The cells shown are the same as in (A) except that they were removed for 16 days. The magnification is 200x.

図４はＩＬ−１αをコードしているＤＮＡのセンス鎖のヌクレオチド配列を示し ている［Ｃ，Ｊ、　？−チ等、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）３１５巻６４１頁 （１９８５）参照］。Figure 4 shows the nucleotide sequence of the sense strand of the DNA encoding IL-1α. Are you [C, J,? - Chi et al., Nature, vol. 315, p. 641 (1985)].

好ましい態様の記述 本発明は、非増殖（即ち「老化」）細胞の増殖能を、係る細胞中におけるＩＬ− １α遺伝子の発現（即ち転写及び翻訳）を損なうことによって回復することがで きるという認識から一部導かれている。Description of preferred embodiments The present invention improves the proliferative capacity of non-proliferating (i.e., "senescent") cells by detecting IL- can be restored by impairing the expression (i.e. transcription and translation) of the 1α gene. This is partly derived from the recognition that it is possible.

したがって本発明は、成熟した老化細胞の増殖能を回復することのできる化学物 質に関するものである。この、老化細胞における増殖能及びより若齢の増殖細胞 に典型的な表現型の回復を「若返りｊと称する。Therefore, the present invention provides chemical compounds capable of restoring the proliferative ability of mature senescent cells. It's about quality. This ability to proliferate in senescent cells and in younger proliferating cells The typical phenotypic recovery is called ``rejuvenation''.

「増殖能」という語は、成長し***する、またはより若齢の同じ増殖型の細胞の 増殖を誘導する有糸***促進物質に対して応答する、細胞の潜在的能力を意味す る。The term "proliferative capacity" refers to the growth and division of cells of the same proliferative type at younger ages. Refers to the potential of a cell to respond to mitogens that induce proliferation. Ru.

Ａ、ＩＬ−１α 本明細書中使用される四Ｌ−１α」という語は、その配列を図４に開示したＩＬ −１αの生物学的活性および性質を示す任意の蛋白を包含する。これはその対立 遺伝子及び任意の哺乳動物種由来の対応蛋白を包含する。これはその転写物が老 化細胞中高められたレベルで発現されるＩＬ−１αを包含する。A, IL-1α As used herein, the term ``4L-1α'' refers to IL-4L-1α whose sequence is disclosed in FIG. -1α biological activities and properties are included. This is the conflict Includes genes and corresponding proteins from any mammalian species. This means that the transcript is old. including IL-1α, which is expressed at elevated levels in cells.

ｒｌＬ−１α」という語はさらに、インビトロにおける分化の初期段階で一組の 即時初期遺伝子の発現の結果生成する蛋白を包含する。少な（ともこれらの転写 物の一つであるシクロオキシゲナーゼ（ｃｏｘ）ｍＲＮＡの発現を誘導するＩＬ −１αの能力は、その細胞が受けた集団倍化の数に影響を受ける。例えば、若齢 細胞においてはＣＯＸ転写物はＩＬ−１αによって誘導され得る。The term "rlL-1α" further refers to a set of Includes proteins produced as a result of immediate early gene expression. Few (also these transcriptions IL that induces the expression of cyclooxygenase (cox) mRNA, which is one of the The potency of -1α is influenced by the number of population doublings that the cell undergoes. For example, young COX transcripts can be induced by IL-1α in cells.

ヘパリン結合成長因子、ＨＢＧＦ−１及びＨＢＧＦ−２のようなＩＬ−１αは信 号配列を欠くポリペプチドとして発現される［Ｗ、　Ｈ，バージニス等、アニュ アル・レビュー・オン・バイオケミストリー（Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ 。IL-1α, such as heparin-binding growth factors, HBGF-1 and HBGF-2, expressed as a polypeptide lacking the sequence [W, H, Virginis et al. Ann, Rev, Biochem .

）５８巻５７５頁（１９８９）］。固定された依存細胞によるＩＬ−１α及びＨ ＢＧＦ−１の細胞外分泌は尚議論を残している。ＨＢＧＦ−１における液移動配 列についての記載［イマムラ等による米国特許出願第０７１５０５１２４号（１ ９９０年４月４日出願）、これはその全体を引用して本明細書の一部とする］、 並びにＨＢＧＦ　［Ｇ、ブツシユ等、プロシーディングズ・オン・ザ・ナショナ ル・アカデミ−・オン・サイエンシズ（Ｕ、Ｓ、Ａ、）（Ｐｒｏｃ、ＮａｔＬ　 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）８４巻６７７０頁（１９８７）：Ｅ、カーダミ等、シャー ＋ルーオブーセル・バイオｏジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）１０９巻１８６ ５頁（１９８７）］及びＩＬ−１α［Ｓ、　グレンフェル等、バイオケミカル・ ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、）２６４巻８１３頁（１９８９）：Ｂ、Ｍ　 カーティス等、ジャーナル・オン・イミュノロジー（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）１ ４４巻１２９５頁（１９９０）］の核核内ポリペブチとしての同定は、これらの 蛋白が遺伝子発現の細胞内調節物質として機能的であるかも知れないことを示し ている。) Vol. 58, p. 575 (1989)]. IL-1α and H by fixed dependent cells Extracellular secretion of BGF-1 remains controversial. Liquid transfer arrangement in HBGF-1 Description of columns [U.S. Patent Application No. 071505124 (1) by Imamura et al. (filed April 4, 990), which is incorporated herein by reference in its entirety], and HBGF [G, Bushu et al., Proceedings on the Nation] Le Academy on Sciences (U, S, A,) (Proc, NatL) Acad, Sci.) vol. 84, p. 6770 (1987): E., Kardami et al., Shah. +Luobucel Biol (J, Ce1l Biol,) Volume 109, 186 5 (1987)] and IL-1α [S, Grenfell et al., Biochemical Journal (Biochem, J,) Volume 264, Page 813 (1989): B, M Curtis et al., Journal on Immunology (J, Immunol,) 1 44, p. 1295 (1990)] were identified as intranuclear polypeptides. indicates that the protein may be functional as an intracellular regulator of gene expression. ing.

Ｂ、老化細胞の増殖能を回復させることのできる物質細胞を若返らせるのに使用 することのできる化学物質は、（１）オリゴヌクレオチド、（２）核酸結合蛋白 、または（３）その構造がオリゴヌクレオチドまたは核酸結合分子に類似する化 合物（即ち「ペプチド疑似」物質）を含む。特に本発明に係る化学物質は、ＩＬ −１α遺伝子の翻訳を特異的に損なう（即ち低下させまたは妨げる）能力を有す る。B. A substance that can restore the proliferation ability of senescent cells. Used to rejuvenate cells. Chemical substances that can be used include (1) oligonucleotides, (2) nucleic acid binding proteins. , or (3) whose structure resembles an oligonucleotide or nucleic acid binding molecule. compounds (i.e., “peptidomimetic” substances). In particular, the chemical substances according to the present invention are IL -Has the ability to specifically impair (i.e. reduce or prevent) translation of the 1α gene Ru.

オリゴヌクレオチドは本発明に係る好ましい化学物質である。本発明にとって特 に興味深いのは「アンチセンス」オリゴヌクレオチドである。一般に「アンチセ ンスオリゴヌクレオチド」はその配列が標的ｍＲＮＡ分子（またはその対応遺伝 子）に対し相補的な核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）であって、その結果 これは該ｍＲＮＡ分子（または遺伝子）に結合またはハイブリダイズし、それに より該ｍＲＮＡ分子の遺伝子産物への翻訳を損なう（即ち低下させまたは妨げる ）。アンチセンスオリゴヌクレオチドとして挙動するためには、その核酸分子は 標的ｍＲＮＡの翻訳を媒介する標的ｍＲＮＡ分子（または遺伝子）の部分に結合 またはハイブリダイズできなければならない。アンチセンスオリゴヌクレオチド は、欧州特許出願公開第２６３７４０号、第３３５４５１号：及び第３２９８８ ２号、並びにＰＣＴ公開第Ｗ０９０１００６２４号に開示されており、これらの 記載は全て引用して本明細書の一部とする。Oligonucleotides are preferred chemicals according to the invention. Special to the present invention Of particular interest are "antisense" oligonucleotides. In general, “antithesis” oligonucleotides whose sequences are linked to the target mRNA molecule (or its corresponding gene a nucleic acid (either DNA or RNA) that is complementary to It binds or hybridizes to the mRNA molecule (or gene) and to impair (i.e. reduce or prevent) the translation of the mRNA molecule into a gene product. ). In order to behave as an antisense oligonucleotide, the nucleic acid molecule must Binds to a portion of a target mRNA molecule (or gene) that mediates translation of the target mRNA or must be able to hybridize. antisense oligonucleotide European Patent Application Nos. 263740, 335451: and 32988 No. 2, and PCT Publication No. W090100624, and these The entire description is incorporated by reference herein.

本発明は特に、ＩＬ−１α遺伝子産物をコードしているｍＲＮＡ分子に結合また はハイブリダイズすることのできるアンチセンスオリゴヌクレオチドに関係する ものである。The present invention particularly provides methods for binding or binding to mRNA molecules encoding IL-1α gene products. relates to antisense oligonucleotides that can hybridize It is something.

したがってこの発明の一書様においては、ＩＬ−１α　ｍＲＮＡ転写物の翻訳を 特異的に遮断するよう設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを、老化細胞 の若返りに使用することができる。１１−１αの核内または内的レベルを低下さ せ得るその他の手段は、ＩＬ−１α遺伝子の転写を特異的に遮断またはｒＬ−１ αの液移動を損なうことを含むが、これらに限定される訳ではない。Therefore, in one aspect of this invention, the translation of IL-1α mRNA transcript is Antisense oligonucleotides designed to specifically block senescent cells It can be used for rejuvenation. Reduce nuclear or internal levels of 11-1α Other means that can specifically block transcription of the IL-1α gene or including, but not limited to, impairing the liquid transport of α.

さらに本発明は、例えば細胞を有効量の変異ｒＬ−１αポリペプチドの存在下で 培養［ここでその変異はポリペプチドの核移動領域にあり、それによってこの変 異ＩＬ−１αポリペプチドは細胞のレセプターと結合できるが核には移動できな い。また、有効量は、内因性ＩＬ−１αの液移動を損なうのに有効であるコする ことにより、ＩＬ−１α遺伝子の発現産物の移動を損なうことのできる有効量の 物質を細胞に供することからなる、老化細胞を若返らせる方法を提供する。Further, the present invention provides, for example, treating cells in the presence of an effective amount of a mutant rL-1α polypeptide. Culture [where the mutation is in the nuclear translocation region of the polypeptide, thereby Different IL-1α polypeptides can bind to cellular receptors but cannot move to the nucleus. stomach. Additionally, the effective amount is effective to impair fluid transport of endogenous IL-1α. of an effective amount capable of impairing the movement of the expression product of the IL-1α gene. A method of rejuvenating senescent cells is provided comprising providing a substance to the cells.

抗ＩＬ−１αアンチセンスオリゴヌクレオチドがこれらの目的を達成する一つの 方法は、ＩＬ−１α　ｍＲＮＡの翻訳開始領域の配列に相補的であり、且つ■Ｌ −１α遺伝子のｍＲＮＡ転写物とハイブリダイズできる充分な長さを持つ配列に よる方法である。このようなオリゴマーの大きさはこの目的に有効な任意の長さ であってよい。好ましくは該アンチセンスオリゴヌクレオチドは約１０−３０ヌ クレオチドの長さ、最も好ましくは約１５−２４ヌクレオチドの長さである。Anti-IL-1α antisense oligonucleotides are one way to achieve these goals. The method is complementary to the sequence of the translation initiation region of IL-1α mRNA, and A sequence with sufficient length to hybridize with the mRNA transcript of the -1α gene. This is the method. The size of such oligomers can be any length useful for this purpose. It may be. Preferably the antisense oligonucleotide has a length of about 10-30 nucleotides. The length of the cleotide is most preferably about 15-24 nucleotides long.

別法として、短すぎて生理学的インビボの条件下でＩＬ−１α　ｍＲＮＡと安定 にハイブリダイズできない長さのアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用するこ ともできる。このようなオリゴヌクレオチドは長さが約６−１０またはそれ以上 の型のヌクレオチドであり得る。本発明にしたがって使用するためには、このよ うなオリゴヌクレオチドは好ましくはＩＬ−１αをコードしているｍＲＮＡの翻 訳領域の遺伝子座と結合するよう修飾する。係る修飾分子の例は、一本舗ＴＬ− １α　ｍＲＮＡ分子と結合できる抗体（または抗体フラグメント）または他のリ ガンド（例えば二価の架橋剤（例えばトリメチルプソラリン、８−メトキシブソ ラリン等））に結合したオリゴヌクレオチドを包含する。Alternatively, it is too short to be stable with IL-1α mRNA under physiological in vivo conditions. Using antisense oligonucleotides that are too long to hybridize to Can also be done. Such oligonucleotides are about 6-10 or more in length. nucleotides of the type. For use in accordance with the present invention, such The oligonucleotide preferably corresponds to the translation of mRNA encoding IL-1α. Modify to combine with the locus of the translation region. Examples of such modified molecules include Ipponpo TL- 1α Antibodies (or antibody fragments) or other linkages that can bind to mRNA molecules Gund (e.g. divalent crosslinkers (e.g. trimethylpsoraline, 8-methoxybutso) larin, etc.)).

二価の架橋剤の一つの反応基と結合した抗ＩＬ−１αアンチセンスオリゴヌクレ オチド（例えばブソラリン（例えばトリメチルプソラリン、または８−メトキン ブソラリン）付加物）は、３５０−４２０ｎｍのＵＶ光で活性化するとＩＬ−１ α　ｍＲＮＡと架橋することができる。したがってこの光の強度を調節すること により（例えばＬＩＶランプのワット数を変え、または細胞とランプの距離を増 すことにより等）、アンチセンスオリゴヌクレオチド及び細胞のＩＬ−１α　ｍ ＲＮＡの間の結合程度を管理することができる。この事は、受容細胞における■ Ｌ−１α遺伝子発現の低下の程度を管理することをも可能にする。Anti-IL-1α antisense oligonucleotide conjugated to one reactive group of a divalent crosslinker Otide (e.g. busoraline (e.g. trimethylpsoraline, or 8-methquine) When activated with 350-420 nm UV light, IL-1 Can crosslink with α mRNA. Therefore adjusting the intensity of this light (for example, changing the wattage of the LIV lamp or increasing the distance between the cell and the lamp) etc.), antisense oligonucleotides and cellular IL-1α m The degree of binding between RNAs can be controlled. This means that in the recipient cell It also makes it possible to control the degree of reduction in L-1α gene expression.

一般にアンチセンスオリゴマーは、翻訳開始コドンを含み且つ翻訳を遮断するに 充分な数の相補ヌクレオチドを有するＩＬ−１α転写物の一部であるＩＬ−１α 遺伝子のヌクレオチド配列（図４）に従って！Ｉｌ製する。Antisense oligomers generally contain a translation initiation codon and are capable of blocking translation. IL-1α that is part of the IL-1α transcript with a sufficient number of complementary nucleotides According to the nucleotide sequence of the gene (Figure 4)! Manufactured by Il.

図４に示されるように、ＩＬ−１α遺伝子の翻訳遺伝子座は以下の配列：５’、 、、　ＧＡＡ　ＧＴＣＡＡＧ　ＡＴＧ　ＧＣＣＡ＾＾、、、３’を含み、ここで 翻訳はコドンＡＴＧで始まり、翻訳されるコドンは下線を付しである。このＩＩ 、−１α遺伝子の領域は転写されて以下の配列：５′、、、　ＧＡＡ　ＧＵＣＡ ＡＧ　ＡＵＧ　ＧＣＣ＾＾＾、、、３’を有するｍＲＮＡ分子を形成する。As shown in Figure 4, the translation locus of the IL-1α gene has the following sequences: 5', ,, GAA GTCAAG ATG GCCA^^,,, including 3', where Translation begins with codon ATG, and the codon being translated is underlined. This II , -1α gene region is transcribed and has the following sequence: 5', , GAA GUCA AG　AUG　GCC^^^,,, forms an mRNA molecule with 3'.

したがって本発明によれば、配列・ ３’、、、　ＣＴＴ　ＣＡＧ　ＴＴＣＴＡＣＣＧＧ　ＴＴＴ　、、、　５’を有 する抗ＩＬ−１αアンチセンスオリゴヌクレオチドは丁Ｌ−１α　ｍＲＮＡと結 合し、その翻訳を損なうことができるであろう。このアンチセンスオリゴヌクレ オチドは本発明の好ましい化学物質である。上に述べたようにこのアンチセンス オリゴヌクレオチドの長さは、より短くても長くてもよい。このアンチセンスオ リゴヌクレオチドの配列は、得られるオリゴヌクレオチドが上記のｒＬ−１α　 ｍＲＮＡ、またはＩＬ−１α遺伝子自身のいずれかの翻訳遺伝子座と結合または ハイブリダイズすることができるならば、１またはそれ以上の挿入、置換、また は１またはそれ以上のヌクレオチドの欠失を含んでいてよい。Therefore, according to the present invention, the array 3', , CTT CAG TTCTACCGG TTT , , 5' The anti-IL-1α antisense oligonucleotide binds to DingL-1α mRNA. could harm the translation. This antisense oligonucleotide Otide is a preferred chemical of the present invention. This antisense as mentioned above The length of the oligonucleotide can be shorter or longer. This antisense The sequence of the oligonucleotide is that the oligonucleotide obtained is the above rL-1α. binding to the translation locus of either the mRNA or the IL-1α gene itself; One or more insertions, substitutions, or may contain deletions of one or more nucleotides.

本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成するための当分野において 知られるいかなる手段をも用いることができる［ザメチソクら、プロシーディン グズ・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシズ（Ｕ、　Ｓ、　 Ａ。in the art for synthesizing antisense oligonucleotides according to the invention. Any known means can be used [Zamechisoku et al. Goods on the National Academy on Sciences (U, S, A.

）（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）８３巻４１４３頁（１９８６） Ｖ　、グツドチャイルド等、プロシーディングズ・オン・ザ・ナショナル・アカ デミ、　−・オン・サイエンシズ（Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　）　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｆ、）８５巻５５０７頁（１９８８）；ライクスト ロム等、プロシーディングズ・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイ エンシズ（Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　）（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、） ８５巻１ｏ２８頁；Ｊ、Ｔ、ボルト等、モレキュラー・アンド・セルラー・バイ オロジー（Ｍｏ　１．　Ｃｅ　Ｉ　１．　Ｂｊｏｌ、）８巻９６３頁（１９８８ ）；Ａ、Ｍ、ガーウィルッ等、サイエンス（ｓｃ　ｆ　ｅｎｃｅ）２４２巻１３ ０３頁（１９８８）：Ｇ、アンフｔツシ等、プロシーディングズ・オン・ザ・ナ ショナル・アカデミ−→ブ・サイエンシズ（Ｕ。) (Proc, Natl, Acad, Sci,) Vol. 83, p. 4143 (1986) V, Gutsudchild et al., Proceedings on the National Academy Demi, - On Sciences (U, S, A,) (Proc, Na t1. Acad, Scf, vol. 85, p. 5507 (1988); Reikst Rom et al., Proceedings on the National Academy on Sci. Ens (U, S, A,) (Proc, Natl, Acad, Sci,) Vol. 85, p. 1o28; J. T. Bolt et al., Molecular and Cellular Bi. Ology (Mo 1. Ce I 1. Bjol,) Vol. 8, p. 963 (1988 ); A, M, Gerwit et al., Science (scf ence) vol. 242, 13 Page 03 (1988): G., Anft. et al., Proceedings on the Na. National Academy → Bu Sciences (U.

Ｓ、Ａ、）（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）８６巻３３７９頁（１ ９８９）　；Ｄ、　ヘツｆｙ−等、ＥＭＢｏジ＋−ナル（ＥＭＢＯＪ、）８巻３ ６７９頁（１９８９）：これらの記載は全て引用して本明細書の一部とする）。S, A,) (Proc, Natl, Acad, Sci,) Volume 86, Page 3379 (1 989) ;D, Hetsufy-et al., EMBO Digital (EMBOJ,) Volume 8 3 679 (1989): these descriptions are incorporated by reference in their entirety).

この目的に自動核酸合成機を使用することができる。さらに、注文分子を供給す る任意の業者から、任意の配列の所望ヌクレオチドを取得することができる。Automatic nucleic acid synthesizers can be used for this purpose. In addition, supplying the ordered molecules Desired nucleotides of any sequence can be obtained from any commercial vendor.

最も好ましくは、本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、固相「ホス ホアミダイト合成」を使用して製造することができる。この合成は、該オリゴヌ クレオチドの３′−ヒドロキシ末端となるヌクレオチドをもって誘導体化された 固体支持体に結合した伸長するヌクレオチド鎖を用いて実施する。この方法は、 ５゛−ヒドロキシ基が（好ましくは５’−ＤＭＴ　（ジメトキシトリチル）基に よって）遮蔽され、アミノ基がベンゾイル基（シトシン及びアデノシンのアミノ 基について）またはイソブチリル基（グアノシンを保護するため）のいずれかで 遮蔽されているモノマー単位を使用するＤＮＡの環状合成を含む。このような誘 導体を生成させる方法は当分野で良く知られている。本発明に係る好ましいオリ ゴヌクレオチド： ３°　、、ＣＴＴ　ＣＡＧ　ＴＴＣＴＡＣＣＧＧ　ｍ　、、、、　５’を生成さ せるためには、合成サイクルの第一段階は、誘導体化した固体支持体を酸で処理 して、誘導体化された３°末端Ｃのトリチル基を除去することである。Most preferably, the antisense oligonucleotide according to the invention is mounted on a solid phase "host". It can be produced using "phoamidite synthesis". This synthesis Derivatized with a nucleotide that becomes the 3'-hydroxy terminus of the cleotide It is carried out using a growing nucleotide chain attached to a solid support. This method is 5′-hydroxy group (preferably 5′-DMT (dimethoxytrityl) group) Therefore, the amino group is shielded from the benzoyl group (the amino group of cytosine and adenosine). with either the isobutyryl group (to protect the guanosine) It involves the circular synthesis of DNA using masked monomer units. This kind of temptation Methods of producing conductors are well known in the art. Preferred ori according to the present invention Gonucleotide: 3°, , CTT CAG TTCTACCGG m, , , 5' is generated. To achieve this, the first step in the synthesis cycle is to treat the derivatized solid support with an acid. to remove the derivatized trityl group at the 3° terminal C.

これにより付加反応のための５−ヒドロキシ基はｉｌＭとなる。次の段階である 活性化は、このヒドロキシ基と反応する極めて反応性のヌクレオシド誘導体を作 り出す。この中間体は、次のヌクレオチド（即ち好ましい態様における［Ｔ」） のホスホアミダイト誘導体及び弱酸（テトラゾール）を同時に反応容器に加える ことによって作り出す。テトラゾールはホスホアミダイトの窒素をプロトン化し で核的攻撃を受け易くする。この中間体は極めて反応性なので、付加反応は室温 で３０＃！Ｊ）以内に完了する。ホスホアミダイトはＤＭＴ基により５゛ヒドロ キシにおいて遮蔽される。Thereby, the 5-hydroxy group for the addition reaction becomes ilM. is the next step Activation creates highly reactive nucleoside derivatives that react with this hydroxy group. Start out. This intermediate is the next nucleotide (i.e. [T' in a preferred embodiment) phosphoramidite derivative and a weak acid (tetrazole) are simultaneously added to the reaction vessel. Create by. Tetrazole protonates the nitrogen of the phosphoramidite make it vulnerable to nuclear attack. This intermediate is extremely reactive, so addition reactions occur at room temperature. So 30#! J) be completed within. Phosphoramidite is 5゛hydro due to the DMT group. It is shielded in Kishi.

次の工程（キャッピング工程）は、付加を受けなかった任意の鎖を終結させる。The next step (capping step) terminates any chains that have not undergone addition.

この反応は無水酢酸及びジメチルアミノピリジンによって達成する。This reaction is accomplished with acetic anhydride and dimethylaminopyridine.

次いでヌクレオチド間結合を亜燐酸結合からより安定な燐酸結合に変換する（「 酸化工程」）。さらに好ましくは、酸化剤として沃素を用い、酸素供与体として 水を用いる。この反応は３０８１以内に完了する。The internucleotide bond is then converted from a phosphite bond to a more stable phosphate bond (“ oxidation process”). More preferably, iodine is used as the oxidizing agent, and iodine is used as the oxygen donor. Use water. This reaction is completed within 3081 hours.

酸化工程の後、ＤＭＴ基を除去し、鎖の伸長によって好ましい配列のオリゴヌク レオチドが生成するまでこのサイクルを反復する。この時点でオリゴヌクレオチ ドはまだ支持体に結合しており、ホスファ−ト及び塩基Ａ、Ｇ及びＣの環外アミ ン上に保護基を持っている。生物学的に活性なりＮＡを生成させるため、ボスフ ァート上のメチル基をトリフエノールによる３０分間の処理によって除去する。After the oxidation step, the DMT group is removed and the oligonucleotide of the preferred sequence is isolated by chain elongation. This cycle is repeated until leotide is produced. At this point, the oligonucleotide The compound is still attached to the support and the exocyclic amines of the phosphate and bases A, G and C are It has a protecting group on it. Bosph is biologically active and generates NA. The methyl group on the atom is removed by treatment with triphenol for 30 minutes.

次に鎖を濃水酸化アンモニウムで１時間処理することにより支持体から開裂させ る。塩基の環外アミン上の保護基は５５℃における水酸化アンモニウムによる６ −１２時間の処理によって開裂させる。The chains were then cleaved from the support by treatment with concentrated ammonium hydroxide for 1 hour. Ru. The protecting group on the exocyclic amine of the base was protected by ammonium hydroxide at 55°C. - Cleavage by treatment for 12 hours.

合成から得られるオリゴヌクレオチドの収率は、式：ｘ’＝収率［式中、Ｘは各 結合段階の効率（典型的には９５％）であり、ｙは残基の数である］にしたがっ て、オリゴヌクレオチドの長さとともに低下する。好ましいオリゴヌクレオチド についての通算収率はおよそ４０％（０，９５”＝、４０）である。The yield of oligonucleotide obtained from the synthesis is determined by the formula: x' = yield [where X is efficiency of the coupling step (typically 95%), where y is the number of residues] and decreases with the length of the oligonucleotide. Preferred oligonucleotides The total yield for is approximately 40% (0,95''=,40).

Ｃ０本発明に係る若返り物質の使用 本発明物質は老化細胞に対して増Ｎ能を回復させることができるため、これらは 広範囲の治療及び応用に使用することができる。C0 Use of rejuvenating substances according to the invention Since the substances of the present invention can restore the N-enhancing ability to senescent cells, these It can be used for a wide range of treatments and applications.

本発明物質は所望の細胞型の老化を損なうために使用することができる。即ちこ れらを用いて、本発明物質無しでは短期間の増殖生存力しか持たない貴重な型の 細胞（例えば−次組織培養細胞等）を不死とすることができる。本発明物質は、 研究用に使用、または例えば臓器または組織の移植（グラフトまたはトランスプ ラント）のための多数の細胞を蓄積させるために使用することができる。故に一 つの態様においては、臓器または組織培養のための方法を容易にするために、本 発明物質を係る方法と組み合わせて使用することができる。The substances of the invention can be used to impair senescence in desired cell types. That is, this Using these, we can develop valuable types of plants that would only have short-term growth viability without the inventive substance. Cells (eg, secondary tissue culture cells, etc.) can be made immortal. The substance of the present invention is for research purposes or for example organ or tissue transplants (grafts or transplants). can be used to accumulate a large number of cells for a test (runt). Therefore one In one embodiment, the present invention is used to facilitate methods for organ or tissue culture. Invention substances can be used in combination with such methods.

用途は、それが生理的状態を変える場合、治療的であると言う。非治療的用途と は、使用者の外観を変える用途である。A use is said to be therapeutic if it alters a physiological condition. non-therapeutic uses and is used to change the appearance of the user.

本発明物質は例えば皮膚の明暗、色、きめ等に関する加齢の影響を逆転させると いったような非治療的または治療的目的のために局所的に使用することができる 。本発明物質は、組織、特に皮膚の若返りに使用することができる。したがっツ ブ、スキンクリーム、スキンローラ３ン等）または洗浄剤（即ち石鹸、シャンプ ー、リンス等）に使用することができる。The substance of the present invention can reverse the effects of aging on skin brightness, color, texture, etc. Can be used topically for non-therapeutic or therapeutic purposes such as . The substances according to the invention can be used for tissue rejuvenation, especially skin. That's what happened soap, skin cream, skin roller, etc.) or cleaning agents (i.e. soap, shampoo, etc.) It can be used for cleaning, rinsing, etc.).

化粧用調製物は、例えば本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそ の等価物、及び好ましくは適当な溶媒に溶解させた親油性担体または添加物を含 んでいてよい。このような溶媒は例えば水−エタノール混合物（１０％ないし３ ０％Ｖ／Ｖまたはそれ以上のエタノールを含有）であってよい。化粧用調製物は 、軟膏、クリーム、またはローション組成物中０００．１％ないし１．０％のア ンチセンスオリゴヌクレオチドを含有させることができる。適当な化粧品用担体 、添加物及び溶媒はレミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシズ（Ｒ ｅｍｉｎｇｔｏｎ’　ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ） ［１６版、Ａ、オソール編、マツグ、イーストン、ＰＡ　（１９８０）　、この 記載は引用して本明細書の一部とする］に記載されている。Cosmetic preparations may, for example, contain antisense oligonucleotides according to the invention or and a lipophilic carrier or additive, preferably dissolved in a suitable solvent. It's okay to stay there. Such solvents include, for example, water-ethanol mixtures (10% to 3% (containing 0% V/V or more ethanol). Cosmetic preparations are 000.1% to 1.0% in ointment, cream, or lotion compositions. antisense oligonucleotides. Suitable cosmetic carrier , additives and solvents from Remington's Pharmaceutical Sciences (R emington's Pharmaceutical 5 Sciences) [16th edition, edited by A. Osall, Matsugu, Easton, PA (1980), this The description is incorporated herein by reference.

本発明物質は細胞の増殖を刺激するため、創傷の治癒、火傷の回復の促進、また は外科手術後、または萎縮した組織を修復させるため等に使用することができる 。係る態様のためには本発明物質は、局所または全身投与用に抗生物質、抗真菌 物質などと共に処方することができる。The substance of the invention stimulates cell proliferation, thus promoting wound healing, burn recovery, and can be used after surgery or to repair atrophied tissue, etc. . For such embodiments, the substances of the invention may be used as antibiotics, antifungals for local or systemic administration. It can be prescribed with other substances.

本発明物質は、人間または動物において精器細胞の増殖または卵母細胞の成熟を 刺激するために使用することができる。したがって本発明物質を使用して受容者 の生殖能力を高めることができる。The substance of the present invention stimulates sperm cell proliferation or oocyte maturation in humans or animals. Can be used to stimulate. Therefore, using the substance of the present invention, recipients can increase fertility.

本発明物質は細胞を若返らせることができるため、これらは早老症［Ａ、Ｊ。Since the substances of the present invention can rejuvenate cells, they can be used to treat progeria [A, J.

ノヅム、アーカイブズ・オン・ダーマトロジー（Ａｒｃｈ、Ｄｅｒｍａｔｏｌ、 ）１２５巻５４０頁（１９８９）；Ｌ　ハマー等、オーツビーディクス（Ｏｒｔ ｈｏｐｅｄ、）１１巻７６３頁（１９８８）：Ｇ、Ｍ、７−ｆン、ナショナル・ キャンサー・インスティテユート・モノグラフス（Ｎａｔｌ、Ｃａｎｃ、Ｉｎ５ ｔ。Nozum, Archives on Dermatology (Arch, Dermatol, ) Vol. 125, p. 540 (1989); L. Hammer et al., Ort. Hoped, Vol. 11, p. 763 (1988): G, M, 7-fn, National. Cancer Institute Monographs (Natl, Canc, In5 t.

Ｍｏｎｏｇｒ、）６０巻２４１頁（１９８２）：これらの記載は全て引用して本 明細書の一部とする］　；加齢関連疾！！、　［Ｇ、　Ｍ、マーチン、ジーツム （Ｇｅｎ。Monogr.) Vol. 60, p. 241 (1982): All of these descriptions are cited here. It should be part of the specification] ; Age-related diseases! ! , [G, M, Martin, Geetsum (Gen.

ｍｅ）３１巻３９０頁（１９８９）＋Ｄ、Ａ、ロー、クリニクス・イン・ジェリ アトリック・メディスン（ＣＩ　ｉｎ、Ｇｅｒｉａｔｒ、Ｍｅｄ、）６巻３１９ 頁（１９９０）；Ａ、Ｄ、モーラジアン、ジャーナル・オン・ン・アメリカン・ ジェリアトリクス・ソサイアティ−（Ｊ、Ａｍｅｒ、Ｇｅｒｉａｔ、Ｓｏｃ、） ３６巻８３１頁（１９８８）：Ｊ、ｓ、アルパート、アメリカン・ジャーナル・ オン・カーディオロジー（Ａｍｅｒ、Ｊ、Ｃａｒｄｉｏｌ、）６５巻２３Ｊ頁（ １９９０）：これらの記載は全て引用して本明細書の一部とする］　；アルツハ イマー病［Ｒ，Ｄ、テリー、モノグラフス・イン・バソロジー（Ｍｏｎｏｇｒ、 Ｐａｔｈｏｌ、）３２巻４１頁（１９９０）；Ｂ、コスクール等、ファーマコサ イ力イアトリ−（Ｐｈａｒｍａｃｏｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ）２３巻８５頁（１９ ９０）；これらの記載は引用して本明細書の一部とする］　：無力症および悪液 質［Ｒ，Ｂバープリー、ジエリアトリクス（Ｇｅｒｉａｔｒｉｃｓ）４５巻２６ 頁（１９９Ｏ）：これらの記載は引用して本明細書の一部とする］等のような疾 病の処置に治療的に使用することができる。me) Vol. 31, p. 390 (1989) + D. A. Law, Clinic in Geri. Atric Medicine (CI in, Geriatr, Med,) Volume 6, 319 Page (1990); A. D. Moradian, Journal on American Geriatric Society (J, Amer, Geriat, Soc,) Vol. 36, p. 831 (1988): J.S. Alpert, American Journal. On Cardiology (Amer, J, Cardiol), Vol. 65, p. 23J ( 1990): These descriptions are incorporated herein by reference in their entirety]; Immer's disease [R, D, Terry, Monographs in Bathology, Pathol, ) vol. 32, p. 41 (1990); B. Koskour et al., Pharmacosa. Pharmacopsychiatry, Volume 23, Page 85 (19 90); These descriptions are incorporated herein by reference]: Asthenia and cachexia Quality [R, B Barpuri, Geriatrics, Volume 45, 26 Page (199O): these descriptions are incorporated herein by reference], etc. It can be used therapeutically in the treatment of diseases.

本発明物質が細胞増殖及び若返りを仲介する能力は、これらの工程を逆転させる 物質の同定に使用することができる。即ち、例えば細胞をアンチセンスオリゴヌ クレオチド及びアンタゴニスト化合物であると思われる化合物の両者の存在下で インキュベートする。その化合物が、アンチセンスオリゴヌクレオチドの上記作 用のいずれかを仲介する能力を損なうことができるか否かを決定するために、細 胞を監視する。このように、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドのアン タゴニストを同定することのできる「スクリーニング検定」を包含する。The ability of the substances of the invention to mediate cell proliferation and rejuvenation reverses these processes. Can be used for substance identification. That is, for example, cells can be treated with antisense oligonucleotides. in the presence of both cleotide and a compound suspected to be an antagonist compound. Incubate. If the compound is an antisense oligonucleotide, details to determine whether the ability to mediate any of the monitor cells. Thus, the present invention provides an antisense oligonucleotide antibody. Includes "screening assays" that can identify antagonists.

このようなスクリーニング検定の使用により同定し得たアンタゴニスト化合物の 中に、不妊の誘発に使用できる化合物がある。同様に、この検定により、組織の 再生または脈管化を抑制することのできる化合物を同定することができる。係る 化合物は癌の処置に有用であり得る。of antagonist compounds that could be identified through the use of such screening assays. Among them are compounds that can be used to induce infertility. Similarly, this test allows organizations to Compounds that can inhibit regeneration or vascularization can be identified. related The compounds may be useful in treating cancer.

Ｄ、投与方法 本発明物質は、既知の方法に従って配合し薬学上有用な組成物を製造することが でき、それによりこれらの材料またはそれらの機能的誘導体は薬学上許容し得る 担体媒質に添加し混合する。好適な媒質及びそれらの製剤は、池のヒト蛋白、例 えばヒト血清アルブミンを含めて例えばレミントンズ・ファーマシューティヵル ・サイエンシズ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’　ｓ　ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳ ｃｉｅｎｃｅｓ　（１６版、Ａ　オソール編、マクロ、イーストン、ＰＡ（１９ ８０））に記載されている。有効な投与に好適な薬学上許容し得る組成物を形成 するためには、係る組成物は、有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチド、また はその等価物、またはそれらの機能的誘導体を適当量の担体媒質と共に含有する であろう。D. Administration method The substance of the present invention can be blended according to known methods to produce pharmaceutically useful compositions. and therefore these materials or their functional derivatives are pharmaceutically acceptable. Add to carrier medium and mix. Suitable vehicles and their formulations include human proteins, e.g. Remington's Pharmaceuticals, including for example human serum albumin. ・Sciences (Remington's PharmaceuticalS sciences (16th edition, edited by A. Osall, Macro, Easton, PA (19 80)). Forming a pharmaceutically acceptable composition suitable for effective administration To do this, such compositions include an effective amount of an antisense oligonucleotide; contain equivalents thereof, or functional derivatives thereof, together with an appropriate amount of carrier medium. Will.

さらなる薬学的方法を使用して作用の持続を調節することができる。アンチセン スオリゴヌクレオチドまたはその等価物またはそれらの機能的誘導体を吸収する またはそれらと複合体形成するポリマーの使用により、制御放出製剤が達成でき る。デリバリ−の制御は、適当なマクロ分子（ｆＩＩえばポリエステル類、ポリ アミノ酸、ポリビニル、ピロリドン、エチレンヒニルアセタート、メチルセルロ ース、カルホキ／メチルセルロース、または硫酸プロタミン）、及びマクロ分子 の濃度、並びに放出を制御するための混合方法を選択することによって行なうこ とができる。制御放出製剤により作用の持続を制御するもう一つの可能な方法は 、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその等価物またはそれらの機能的誘導 体を、ポリエステル類、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ乳酸またはエチレンビ ニルアセタート共重合体のようなポリマー材料の粒子中に取り込むことである。Additional pharmaceutical methods can be used to modulate the duration of action. antisene absorb oligonucleotides or their equivalents or functional derivatives thereof Controlled release formulations can be achieved by the use of polymers that are or are complexed with them. Ru. Delivery control is achieved by using appropriate macromolecules (such as fII, polyesters, polyesters, etc.). Amino acids, polyvinyl, pyrrolidone, ethylene hynylacetate, methyl cellulose cellulose, calhoki/methylcellulose, or protamine sulfate), and macromolecules This is done by selecting the concentration of the compound and the mixing method to control the release. I can do it. Another possible way to control the duration of action is through controlled release formulations. , antisense oligonucleotides or their equivalents or their functional derivatives Protect your body from polyesters, polyamino acids, hydrogels, polylactic acid or ethylene vinyl. Incorporation into particles of polymeric materials such as nyl acetate copolymers.

別法として、これらの物質をポリマー粒子中に取り込む代わりに、例えば各々ヒ ドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メチルセ ルロ−ス）マイクロカプセルといづたようなコアセルベーション技術または界面 重合により製造したマイクロカプセル中に、または、例えばリポソーム、アルブ ミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、六ノ粒子、及び六ノカプセルもし くはマクロエマルジョンといったコロイド系ドラッグデリバリーシステム中に、 これらの材料を閉じこめることが可能である。このような技術はレミントンズ・ ファーマシューティカル・サイエンシズ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’　ｓ　Ｐｈａｒ ｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ）（１９８０）に開示されている。Alternatively, instead of incorporating these substances into polymer particles, e.g. Droxymethylcellulose or gelatin microcapsules and poly(methylcellulose) coacervation technology or interface such as microcapsules (Lulose) in microcapsules produced by polymerization or, for example, in liposomes, albumen Min Microspheres, Microemulsions, Rokuno Particles, and Rokuno Capsules In colloidal drug delivery systems such as macroemulsions, It is possible to confine these materials. Such technology is Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Phar (1980).

一つの蝮様において本発明に係る組成物は、皮膚への局所投与のためにクリーム 、ローション、軟膏などとして処方することができる。係る組成物は所望により 湿潤剤、乳化及び懸濁化剤、または甘味料、調味料、着色剤または香料を含有さ せることができる。In one aspect, the composition according to the invention can be used as a cream for topical application to the skin. , lotions, ointments, etc. Such compositions may optionally be Contains wetting agents, emulsifying and suspending agents, or sweetening, flavoring, coloring or flavoring agents. can be set.

さらに本発明組成物は、注射、迅速注入、鼻咽腔吸収（経鼻咽腔的に）、または 経皮吸収によって非経口または経口投与用に処方することができる。本組成物は 別法として筋肉内または静脈内投与することもできる。非経口投与のための組成 物は無菌の水性または非水性溶液、懸濁液、及び乳濁液を包含する。非水性溶媒 の−１はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような 植物油、及びオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステル類である。皮膚 透過性を増し吸収を促進させるために、担体、添加物または閉鎖包帯を使用する ことができる。経口投与のための液体投与型は一般に液体投与型を含むリポソー ム溶液からなっていてよい。リポソームを懸濁させる好適な剤型は、当分野で普 通に使用される不活性希釈剤、例えば精製水を含有する乳濁液、懸濁液、溶液、 ／ロノプ、及びエリキシルを包含する。不活性希釈剤の外に、係る組成物は湿潤 剤、乳化及び懸濁化剤、または甘味料、調味料、着色剤または香料を含有するこ ともてきる。Additionally, the compositions of the invention may be administered by injection, rapid infusion, nasopharyngeal absorption (nasopharyngeally), or They can be formulated for parenteral or oral administration by transdermal absorption. This composition is Alternatively, administration can be intramuscular or intravenous. Composition for parenteral administration Products include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, and emulsions. non-aqueous solvent -1 is propylene glycol, polyethylene glycol, olive oil, etc. vegetable oils, and injectable organic esters such as ethyl oleate. Skin Use carriers, additives or occlusive dressings to increase permeability and promote absorption be able to. Liquid dosage forms for oral administration generally include liposomes, including liquid dosage forms. It may consist of a liquid solution. Suitable dosage forms for suspending liposomes are well known in the art. emulsions, suspensions, solutions containing commonly used inert diluents such as purified water; /Lonop, and Elixir. Besides the inert diluent, such compositions containing agents, emulsifying and suspending agents, or sweetening, flavoring, coloring or flavoring agents; It comes with me.

その投与が被投与患者により寛容できるならば、その組成物は「薬理学的に許容 し得る」と言われる。投与される量が生理学的に有意であるならば、係る物質は 「治療的有効量」て投与されると言われる。その存在が被投与患者の生理に検出 され得る変化をもたらすならば、その物質は生理学的に有意である。If the administration is tolerable by the recipient patient, then the composition is "pharmacologically acceptable." It is possible.” If the amount administered is physiologically significant, such substances may A "therapeutically effective amount" is said to be administered. Its presence is detected in the physiology of recipient patients. A substance is physiologically significant if it causes a change that can be made.

一般に、当業者によって定められ得る本組成物の有効量を供するのに必要な用量 は、被投与者の年齢、状態、性、及び疾病があるならばその程度といったような 因子、並びに他の変化要因によって変わるであろう。Generally, the dosage necessary to provide an effective amount of the composition, which can be determined by one of ordinary skill in the art. The patient's age, condition, sex, and severity of disease, if any. will vary depending on factors as well as other variables.

本発明組成物の有効量は用量または投与当りｏ、ｏｉ−ｉｏｏｏμｇ／ｍＩまで 変わり得るが、より少ないまたは多い量を使用することもできる。An effective amount of the composition of the invention may be up to o, oi-ioooμg/mI per dose or administration. Although variable, lower or higher amounts can also be used.

ここに本発明を一般的に説明してきたが、本発明は以下の実施例を参照すること によってより容易に理解できるであろう。これら実施例は例示のために供するも のであって、別途明記の無い限り本発明を限定する意図はない。Having described the invention generally herein, the invention may be understood by reference to the following examples. can be more easily understood by These examples are provided for illustrative purposes only. It is not intended to limit the invention unless otherwise specified.

実施例１ 材料及び細胞培養 組み替えヒトインターロイキン−１α（ＩＬ−１α）をホフマン・う・ロンユ（ ナトレイ、ＮＪ）から入手した。組み替えヒトＨＢＧＦ−１αをアメリカン・レ ッド・クロス（ロックビル、ＭＤ）から入手した。ブタＴＧＦ−８はＲ＆Ｄシス テムズから購入した。Example 1 Materials and cell culture Recombinant human interleukin-1α (IL-1α) was produced by Hoffmann-U Longyu ( Nutley, NJ). Recombinant human HBGF-1α Obtained from Dr. Cross (Rockville, MD). Porcine TGF-8 is R&D system Purchased from Thames.

ヒト屓帯静脈内皮細胞（ｈｕｖｅｃ）の−次培養をバーバード・メディカル・ス クール（ボストン、ＭＡ）から入手し、フィブロネクチン被覆平板上で、１０％ （Ｖ／Ｖ）牛胎児血清（ＦＢＳ）　、１ｘ抗生物質及び抗真菌剤混合物（ＧＩＢ ＣＯ、グランド・アイランド、ＮＹ）を添加したミディアム１９９中で増殖させ た。細胞を分割比１：５で継代培養した。Subcultures of human ulnar vein endothelial cells (HUVEC) were performed at Barbard Medical School. 10% on fibronectin-coated plates obtained from Cool (Boston, MA). (V/V) Fetal bovine serum (FBS), 1x antibiotic and antifungal mixture (GIB Grow in medium 199 supplemented with CO, Grand Island, NY). Ta. Cells were subcultured at a split ratio of 1:5.

ＲＮＡ調製 ５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを加えたミディアム１９９で２０時間飢餓させ、細胞を様 々な化合物（後記）と共にインキュベートしたＨＵＶＥＣの融合性培養物から全 ＲＮＡを取得した。全ＲＮＡをイソチオシアナートグアニジジウム法により単離 し、オリゴｄＴセルロース上の親和クロマトグラフィーによりポリへ十精製した ［Ｔ、　マニアナイス等、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　 Ｃｌｏｎｉｎｇ）ニア・ラボラトリ−・マニュアル（Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 　Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバ−・プレス、ＮＹ　（１９８ ２）］。RNA preparation Cells were starved for 20 hours with medium 199 supplemented with 5% (v/v) FBS. Whole cells were collected from confluent cultures of HUVEC incubated with various compounds (see below). RNA was obtained. Total RNA was isolated by the isothiocyanate guanidium method. and purified to poly by affinity chromatography on oligo-dT cellulose. [T, Mania Nice, etc., Molecular Cloning (Molecular Cloning) Near Laboratory Manual (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Press, NY (198 2)].

ノーザン・プロット分析 全ＲＮＡ（１０μｇ）またはポリＡ′″精製ＲＮＡ　（５μｇ）を、２．２Ｍホ ルムアルデヒドを含む１％アガロースゲル上で電気泳動し、ナイロン膜フィルタ ー（ゼータ−プローブ（商標）膜、バイオラド、ＣＡ）上に毛細管ブロッティン グし、そして所望の３２ｐ−標識プローブで探査した［Ｔ、マニアナイス等、モ レキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）ニア・ラボ ラトリ−・マニュアル（Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、コールド −スプリング・ハーバ−・プレス、ＮＹ　（１９８２）］。このｃＤＮＡプロー ブをランダムプライマー標識キット（ＢＲＬ）を用いて高い比活性（＞１０’Ｃ ｐｍ／μｇ）まで標識し、チャーチーギルバート緩衛液中でフィルターをハイブ リダイズするのに使用した（０５Ｍ燐酸ナトリウム、ｐ７．２．７％ＳＤＳ及び １％牛血清アルブミン、１ｍＭ　ＥＤＴＡ及び２０％ホルムアミド含有、６５℃ で１６−２０時間）。フィルターを高緊縮下で洗浄しく０．　１　ｘ　Ｓ　Ｓ　 Ｃ１６５℃）、コダックＸ−ＡＲフィルムに一８０℃で２４−７２時間露出した 。Northern plot analysis Total RNA (10 μg) or poly A′″ purified RNA (5 μg) was added to 2.2M protein. Electrophoresis was performed on a 1% agarose gel containing luminaldehyde and filtered with a nylon membrane. - Capillary blotting onto (Zeta-Probe™ membrane, Bio-Rad, CA) and probed with the desired 32p-labeled probe [T, Maninais et al., Mo. Molecular Cloning Near Lab Laboratory Manual (A Laboratory Manual), Cold -Spring Harbor Press, NY (1982)]. This cDNA probe High specific activity (>10'C pm/μg) and hive the filters in Churchy-Gilbert buffer solution. used to redize (05M sodium phosphate, p7.2.7% SDS and Contains 1% bovine serum albumin, 1mM EDTA and 20% formamide, 65°C (16-20 hours). Clean the filter under high stringency.　1　x　SS　S (165°C) and exposed to Kodak X-AR film at -80°C for 24-72 hours. .

逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応分析（ＲＴ−ＰＣＲ）必要とされるヒト老化 内皮細胞における所望の転写のレベルが低いため、検出にＲＴ−ＰＣＲ法を用い る必要がある。Reverse transcriptase-polymerase chain reaction analysis (RT-PCR) required for human aging Due to the low levels of the desired transcript in endothelial cells, RT-PCR was used for detection. It is necessary to

ＨＵＶＥＣ由来の全ＲＮＡを上記のように精製し、５０ｍＭトリスＨＣＩ、ｐＨ ８，０，１ｍＭｍナノトレイトール、１５ｍＭ　ＮａＣｌ、３ｍＭ　ＭｇＣｌ２ 、ＲＮＡ５ｉｎ１単位（プロメガ）、０．８ｍＭ　ｄＮＴＰ中のアンチセンスプ ライマー（０，５μｇ）を使用してＭＭＬＶ逆転写酵素（ベセスダ・リサーチ・ ラボラトリーズ、ＭＤ）２００単位で処理することによりｃＤＮＡに変換し、３ ７℃で１時間インキュベーションした。９５℃で５ないし１０分間加熱すること により反応を停止させ、蒸留水で１ｍｌに希釈した。Total RNA from HUVECs was purified as above and purified with 50mM Tris-HCI, pH 8,0,1mMm nanothreitol, 15mM NaCl, 3mM MgCl2 , RNA5in1 unit (Promega), antisense sp in 0.8mM dNTP. MMLV reverse transcriptase (Bethesda Research) using primer (0.5 μg) Laboratories, MD) was converted to cDNA by treatment with 200 units; Incubation was for 1 hour at 7°C. Heat at 95℃ for 5 to 10 minutes The reaction was stopped and diluted to 1 ml with distilled water.

ｃＤＮＡ混合物の１０μｍ等分試料について酵素的増幅を行なった。５０ｍＭト リスＨＣＬ　ｐＨ８，０，１，５ｍＭ　ＭｇＣｌ□、１０ｍＭ　ＫＣＩ、０゜２ ｍＭ　ｄＮＴＰ、各センス及びアンチセンスプライマー０．５μｇ、及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ１単位（シータス、ＣＡ）中でＰＣＲを実施した（サイキ等 、サイエンス（Ｓｃ　ｉ　ｅｎｃｅ）２３９巻４８７−４９１頁（１９８８）、 Ｋ。Enzymatic amplification was performed on 10 μm aliquots of the cDNA mixture. 50mM Squirrel HCL pH 8, 0, 1, 5mM MgCl□, 10mM KCI, 0゜2 mM dNTP, 0.5 μg of each sense and antisense primer, and Taq PCR was performed in 1 unit of DNA polymerase (Cetus, CA) (Saiki et al. , Science (Science), Vol. 239, pp. 487-491 (1988), K.

ミュリス等、コールド・スプリング・ハーバ−・シンボジア・オン・クオンティ タティブＣバイオロジー（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ。Muris et al., Cold Spring Harbor Symbosia on Quantity Tative C Biology (Cold Spring Harbor Symp.

Ｑｕａｎｔ、Ｂｉｏｌ、）５１巻２６３−２７３頁（１９８６）；Ｈ，アーリッ ヒ等、ＥＰ５０４２４：ＥＰ８４７９６；ＥＰ２５８０１７、ＥＦ）２３７３６ ２：に、ミュリス、ＥＰ２０１１８４：に、ミュリス等、ＵＳ４６８３２０２　 ；Ｈ。Quant, Biol, ) 51, pp. 263-273 (1986); H. H et al., EP50424: EP84796; EP258017, EF) 23736 2: Mullis, EP201184: Mullis et al., US4683202 ;H.

アーリソヒ、ＵＳ４５８２７８８　；及びＲ，サイキ等、ＵＳ４６８３１９４） 、これらの記載は引用して本明細書の一部とする。）。反応混合物を９４℃で１ 分間加熱し、５５℃で２分間アニーリングし、指定の回数のサイクル反復のため ７２℃で３分間延長した。Arlisohi, US4582788; and R, Saiki et al. US4683194) , these descriptions are incorporated herein by reference. ). The reaction mixture was heated to 94°C for 1 Heat for 2 min and anneal at 55°C for 2 min and for the specified number of cycle repeats. Extended for 3 minutes at 72°C.

実施例２ ＣＯＸに対する転写物の発現を逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ ）により測定した。この実験の結果を図１に示す。図１は、インビトロでの若齢 及び老化ヒト内皮細胞によるンクａオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）及びＩＬ−１αの 発現を示している。ＩＮＩＡはＣＯＸ転写物のＩＩ、−１α誘導を示している。Example 2 Expression of transcripts for COX was determined by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). ). The results of this experiment are shown in Figure 1. Figure 1 shows young in vitro and inhibition of oxygenase (COX) and IL-1α by aging human endothelial cells. It shows the expression. INIA shows II, -1α induction of COX transcripts.

この実験のために若齢及び老化ヒト内皮細胞（Ｉ（ＵＶＥＣ；　１０’細胞）（ 各々集団倍化数（ＰＤ）２０および５３）をｆＬ−１ａ　（ｌｏｇ／ｍｌ）と共 に４時間インキュベートした。全ＲＮＡを抽出し、マニアナイスの方法を用いて 逆転写してｃＤＮＡ　（１ａｇ）を形成させた［Ｔ、　マニアナイス等、モレキ ュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ＣＩｏｎｉｎｇ）ニア・ラボラト リ−’７ニユアル（Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、−ｙ−ルドー スプリング＋／％−バー・プレス、ＮＹ　（１９８２）］。For this experiment, young and aged human endothelial cells (I (UVEC; 10' cells) Population doubling numbers (PD) 20 and 53) together with fL-1a (log/ml), respectively. The cells were incubated for 4 hours. Extract total RNA and use the maniac method Reverse transcription was performed to form cDNA (1ag) [T, Maninais et al., Molekki et al. Molecular Cloning (Molecular CIoning) Near Laborato Lee'7 Manual (A Laboratory Manual), -y-Rudo Spring +/%-Bar Press, NY (1982)].

ｃＤＮＡフラグメントを水で１：２０に希釈し、１０μｍを４０サイクルのポリ メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した（サイキ等、サイエンス（Ｓｃｉ ｅｎｃｅ）２３９巻４８７−４９１頁（１９８８）　、Ｋ、ミュリス等、コール ド・スプリング・ハーバ−・ンンボジア・オン・クオンティタテイブ・バイオロ ジー　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｉイａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、　Ｑｕａｎｔ、 　Ｂｉ。The cDNA fragments were diluted 1:20 with water and 10 μm were incubated with polypropylene for 40 cycles. Amplified by merase chain reaction (PCR) (Saiki et al., Sci. ence), Vol. 239, pp. 487-491 (1988), K., Mullis et al., Cole. Spring Harbor Nambosia on Quantitative Biolo G (Cold Spring I arbor Symp, Quant, Bi.

ｌ　）５１巻２６３−２７３頁（１９８６）：Ｈ，アーリノヒ等、ＥＰ５０４２ ４　；ＥＰ８４７９６　；ＥＰ２５８０１７、ＥＰ２３７３６１に、ミュリス、 ＥＰ２０１１８４；に、ミュリス等、ＵＳ４６８３２０２　：Ｈ，アーリッヒ、 ＵＳ４５８２７８８　：及びＲ，サイキ等、ＵＳ４６８３Ｌ９４＞　、これらの 記載は引用して本明細書の一部とする。）。増幅生成物を１．２％アガロースゲ ル上で分画し、エチジウムプロミドで染色した。同じＲＮＡ及びＧＡＰＤＨプラ イマーの増幅により、同量のＲＮＡが逆転写されたことが確認された。l) Vol. 51, pp. 263-273 (1986): H, Arinohi et al., EP5042 4 ; EP84796 ; EP258017, EP237361, Muris, EP201184; Mulis et al., US4683202: H, Ehrlich, US4582788: and R, Saiki et al., US4683L94>, these The description is incorporated herein by reference. ). Transfer the amplification product to a 1.2% agarose gel. The cells were fractionated on a tube and stained with ethidium bromide. Same RNA and GAPDH pla Imer amplification confirmed that the same amount of RNA was reverse transcribed.

ＣＯＸに対するセンス及びアンチセンスプライマーの配列は、各々５’−ＧＣＴ 　ＧＧＧ　ＡＧＴ　ＣＴＴ　ＴＣＴ　ＣＣＡ　ＡＣＧ　ＴＧＡ　Ｇ−３’及び５ ’−ＧＧＣＡＡＴ　ＧＣＧ　ＧＴＴ　ＧＣＧ　ＧＴＡ　ＴＴＧ　ＧＡＡ　ＣＴ− ３′である。ＧＡＰＤＨに対するセンス及びアンチセンスプライマーは、各々５ ’−ＣＣＡ　ＣＣＣＡＴＧ　ＧＣ，Ａ　ＡＡＴ　ＴＣＣＡＴＧ　ＧＣＡ−３゛及 び５°−ＴＣＴ　ＡＧＡ　ＣＧＧ　ＣＡＧ　ＧＴＣＡＧＧ　ＴＣＣＡＣＣ−３′ である。図４Ａにおいて第１−２列は若齢細胞について、第３−４列は老化細胞 についての結果を示す。The sequences of the sense and antisense primers for COX are 5'-GCT, respectively. GGG AGT CTT TCT CCA ACG TGA G-3' and 5 '-GGCAAT GCG GTT GCG GTA TTG GAA CT- 3'. The sense and antisense primers for GAPDH were 5 each. '-CCA CCCATG GC, A AAT TCCATG GCA-3 and and 5°-TCT AGA CGG CAG GTCAGG TCCACC-3' It is. In Figure 4A, columns 1-2 are for young cells, and columns 3-4 are for senescent cells. The results are shown below.

図ＩＢは、ｃｏｘ転写物のＰＭＡ誘導を示す。若齢（ＰＤ２０、第１−２列）及 び老化（ＰＤ５３、第３−４列）ＨＵＶＥＣをＰ〜ｉＡ　（２０ｎｇ／ｍｌ）で １時間処理した。ＲＮＡを抽出し、逆転写し、上記のようにＰ（、Ｒによって増 幅したつ このデータは、若齢内皮細胞（図ＩＡ）においてはｃｏｘ　ｍＲＮＡはＩＬ−１ αによって容易に誘導され得るが、ＣＯＸ転写物のレベルは、外因性ＩＬ−１α に暴露されていない老化ヒト内皮細胞において増幅されるように思われる事を証 明している。さらに、老化ヒト内皮細胞集団におけるｃｏｘ　ｍＲＮＡのレベル は、外因性１−１αに応答する変化をしなかった（図ＩＡ）。同様のＣＯＸ発現 のデータが、ＰＭＡに暴露されたヒト内皮細胞についても得られた（図ＩＢ）。Figure IB shows PMA induction of cox transcripts. Young (PD20, rows 1-2) and and aged (PD53, rows 3-4) HUVEC with P~iA (20ng/ml) Treated for 1 hour. RNA was extracted, reverse transcribed, and enriched with P(,R) as described above. wide This data indicates that in young endothelial cells (Figure IA), cox mRNA is Although COX transcript levels can be readily induced by exogenous IL-1α, evidence that appears to be amplified in aged human endothelial cells not exposed to It's clear. Furthermore, the level of cox mRNA in aging human endothelial cell populations did not change in response to exogenous 1-1α (Fig. IA). Similar COX expression Data were also obtained for human endothelial cells exposed to PMA (Figure IB).

実施例３ １Ｌ−１αはインビトロにおいて内皮細胞増殖の強力な阻害物質であることが示 された［Ｒ，モンテッサーノ、ジャーナル・オン・セル・バイオロジー（Ｊ。Example 3 1L-1α has been shown to be a potent inhibitor of endothelial cell proliferation in vitro. [R, Montesano, Journal on Cell Biology (J.

Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）９９巻１７０６頁（１９８４）：Ｒ，モンテッサーノ等 、ジャーナル・オン・セル・フィジオロジー（Ｊ、Ｃｅ　Ｉ　Ｉ　Ｐｈｙｓ　ｉ ｏ　１．　）３４巻４６０頁（１９８８）］、さらにＥＬ−１αはヒト内皮細胞 においてＩＬ−１α転写物の発現を誘導することができるということも示された ［Ｊ、　Ｈ，ピアス等、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）７１巻６８４頁（１９８８）； Ａ、マントバ一二等、イミュノロジー・トウディ（Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｔｏｄａｙ ）１０巻３７０頁（１９８９）］。Ce1l Biol, ) Vol. 99, p. 1706 (1984): R. Montesano et al. , Journal on Cell Physiology (J, Ce II Phys i o1. ), Vol. 34, p. 460 (1988)], and furthermore, EL-1α is expressed in human endothelial cells. It was also shown that IL-1α transcript expression can be induced in [J, H, Pierce et al., Blood, Vol. 71, p. 684 (1988); A, Mantua 12th Class, Immunology Today ) Vol. 10, p. 370 (1989)].

ｃｏｘ　ｍＲＮＡの発現は老化ヒト内皮細胞において増幅されるように思われ、 且つ内皮細胞はＩＬ−１αの転写物を発現できることから、若齢及び老化ヒト内 皮細胞をＩＬ−１α転写物の存在について調べた。cox mRNA expression appears to be amplified in aging human endothelial cells; Furthermore, since endothelial cells can express IL-1α transcripts, both young and aging humans Dermal cells were examined for the presence of IL-1α transcripts.

図ＩＤはヒト内皮細胞におけるＩＬ−１αによるＩＬ−１αの誘導を示している 。この実験のために、若齢細胞（ＰＤ２０）、老化細胞（ＰＤ５３）及びアンチ センスＩＬ−４ａオリゴマー処理（ＰＤ９７）細胞をＩＬ−１ａ　（Ｌｏｎｇ／ ｍｌ）で６時間刺激した。全ＲＮＡを抽出し、逆転写し、上記のようにＰＣＲに より３０サイクル増幅した。第１−２列は若齢細胞についての結果を示している 。Figure ID shows induction of IL-1α by IL-1α in human endothelial cells. . For this experiment, young cells (PD20), senescent cells (PD53) and anti- Sense IL-4a oligomer-treated (PD97) cells were treated with IL-1a (Long/ ml) for 6 hours. Total RNA was extracted, reverse transcribed, and subjected to PCR as above. It was amplified for 30 cycles. Columns 1-2 show results for young cells .

第３−４列は老化細胞についての結果を示している。第５−６列はアンチセンス ＩＬ−１αオリゴマー処理細胞についての結果を示している。Columns 3-4 show results for senescent cells. Columns 5-6 are antisense Results for IL-1α oligomer treated cells are shown.

図ＩＤは、若齢内皮細胞はＩＬ−１αに応答してＩＬ−１α　ｍＲＮＡを発現す ることができたが、老化内皮細胞は高レベルのＩＬ−１α転写物を含んでおり、 ＩＬ−１αに応答しなかったということを示している。Figure ID shows that young endothelial cells express IL-1α mRNA in response to IL-1α. However, senescent endothelial cells contain high levels of IL-1α transcripts; This indicates that it did not respond to IL-1α.

アンチセンスＩＬ−１αオリゴマーに暴露されたヒト内皮細胞におけるＩＬ−１ α　ｍＲＮＡのレベルを調べ、低いということがわかった（図ＩＤ）。さらに、 オリゴマーに暴露された細胞は外因性ＩＬ−１αに応答することがわかった。外 因性ＩＬ−１αの添加の際、ＩＬ−１α転写物の有意な増加が観察された（図Ｉ Ｄ）。この応答は若齢ヒト内皮細胞でも観察されたが、老化集団におけるＩＬ− １α　ｍＲＮＡレベルは上昇したままであり、外因性ＩＬ−１αの添加に対し不 応であった。さらに、老化集団におけるＩＬ−１αポリペプチドのレベルとは対 照的に、アンチセンスＩＬ−１αオリゴマーで処理したヒト内皮細胞の集団にお けるＩＬ−１αポリペプチドの発現は、免疫沈澱法を用いた検出が不可能であっ た。したがって、集団倍化を延長したヒト内皮細胞の集団がＩＬ−１α　ｍＲＮ への高レベルを維持できないということは、これらの細胞中のｒＬ−１αポリペ プチドのレベルが低いことの結果であり得る。IL-1 in human endothelial cells exposed to antisense IL-1α oligomers The level of α mRNA was examined and found to be low (Figure ID). moreover, Cells exposed to oligomers were found to respond to exogenous IL-1α. outside Upon addition of exogenous IL-1α, a significant increase in IL-1α transcripts was observed (Fig. I D). Although this response was also observed in young human endothelial cells, IL- 1α mRNA levels remained elevated and remained insensitive to the addition of exogenous IL-1α. It was a response. Furthermore, levels of IL-1α polypeptide in aging populations In contrast, in a population of human endothelial cells treated with antisense IL-1α oligomers, Expression of IL-1α polypeptide in cells cannot be detected using immunoprecipitation methods. Ta. Therefore, a population of human endothelial cells that has extended population doubling has IL-1α mRNA. The inability to maintain high levels of rL-1α polypeptide in these cells means that It may be the result of low levels of putide.

さらにｌ−１α翻訳生成物は老化ヒト内皮細胞では検出されたが若齢ヒト内皮細 胞では検出されず、この事は、老化ヒト内皮細胞においてｃｏｘ　ｍＲＮＡのレ ベルが高いこと、及び老化ヒト内皮細胞がインビトロで増殖できないことが、高 レベルのｌ−１α　ｍＲＮＡの結果であることを示唆している。Furthermore, l-1α translation products were detected in aged human endothelial cells, but not in young human endothelial cells. This suggests that cox mRNA levels are not detected in aging human endothelial cells. The high levels of cell carcinoma and the inability of aging human endothelial cells to proliferate in vitro This suggests that this is a result of the level of l-1α mRNA.

実施例４ 老化が高レベルのＩＬ−１α　ｍＲＮＡの結果であるか否かを評価するため、Ｉ Ｌ−１αに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し合成した。アンチセ ンスオリゴマーはインビトロにおける翻訳の選択的レプレッサーとして多くの用 途が見いだされた［ザメチック等、プロシーディングズ・イン・ザ・ナシコナル −７カデミー・イン・サイエン／ズ（Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　）　（Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔ　ｌ。Example 4 To assess whether aging is a result of high levels of IL-1α mRNA, I Antisense oligonucleotides against L-1α were designed and synthesized. Antise oligomers have many uses as selective repressors of translation in vitro. A way was found [Zamechik et al., Proceedings in the Nasikonal] -7 Academy in Science/Z (U, S, A,) (Proc, N atl.

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）８３巻４１４３頁（１９８６）；グツドチャイルド等、プ ロシーディングズ・イン・ザ・ナショナル・アカデミ−・イン・サイエンシズ（ Ｕ、Ｓ、Ａ、）（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）　８５巻５５０ ７頁（１９８８）：ライクストロム等、プロシーディングズ・イン・ザ・ナショ ナル・アカデミ−・イン４イｘ　７　シズ（Ｕ、Ｓ、　Ａ、　）　（Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）８５巻１０２８頁、Ｊ、Ｔ、ホルト等、 モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ 、）８巻９６３頁（１９８８）　；Ａ、　Ｍ、ガーウィルツ等、サイエンス（Ｓ ｃｉｅｎｃｅ）２４２巻１３０３頁（１９８８）；Ｇ、アンフォッシ等、プロシ ーデイングズ・イン・ザ・ナショナル・アカデミ−・イン・サイエンシズ（Ｕ、 　Ｓ、　Ａ、　）　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、）８６巻 ３３７９頁（１９８９）：Ｄ、ベラカー等、ＥＭＢＯジャーナル（ＥＭＢＯＪ、 ）８巻３６７９頁（１９８９）；これらの記載は全て引用して本明細書の一部と する］。Acad, Sci.) Vol. 83, p. 4143 (1986); Gutschild et al. Research in the National Academy in Sciences ( U, S, A,) (Proc, Nat 1. Acad, Sci,) Volume 85, 550 7 pages (1988): Reikström et al., Proceedings in the Nation. Naru Academy in 4x7 (U, S, A,) (Proc, Nat 1. Acad, Sci, vol. 85, p. 1028, J. T. Holt et al. Molecular and Cellular Biology (Mo1.Ce11.Biol ), Vol. 8, p. 963 (1988); A., M., Gerwirtz et al., Science (S. science) vol. 242, p. 1303 (1988); -Designs in the National Academy in Sciences (U, S, A,) (Proc, Nat 1. Acad, Sc i,) Volume 86 Page 3379 (1989): D. Beraker et al., EMBO Journal (EMBOJ, ) Vol. 8, p. 3679 (1989); all of these descriptions are incorporated by reference into this specification. do].

配列：ｓ’−”ｒＴ’ｒ　ＧＧＣＣＡＴ　ＣＴＴ　ＧＡＣＴＴＣ−３及びｌ−１ α転写物のＡＴＧ開始コドンの両側に広がる３つのコドンを有するアンチセンス ＡＵＣ；　ＩＬ−１αオリゴヌクレオチドを！ｌｌ製した〔Ｃ，Ｊ、マーチ等、 ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）３１５巻３４０頁（１９８５）：図４コ。Sequence: s'-"rT'r GGCCAT CTT GACTTC-3 and l-1 Antisense with three codons spread on either side of the ATG start codon of the alpha transcript AUC; IL-1α oligonucleotide! ll manufactured [C, J, March, etc. Nature, Vol. 315, p. 340 (1985): Figure 4.

このアンチセンスＩＬ−１αオリゴマーを老齢に近いヒト内皮細胞の集団に毎日 添加したところ、インビトロにおいてヒト内皮細胞の増殖を有意に伸長させた。This antisense IL-1α oligomer was administered daily to a population of near-senile human endothelial cells. When added, it significantly increased the proliferation of human endothelial cells in vitro.

結果を図２及び３に示す。The results are shown in Figures 2 and 3.

図２は、ヒトｒＬ−１αを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドによるヒ ト内皮細胞の寿命の延長を示している。この実験のためには培養したヒト内皮細 胞を上記のアンチセンスオリゴヌクレオチド（５０μｇ／ｍｌ）で毎日処理した 。集団倍化を各経Ａ後に計数した。対照集団（黒丸）、アンチセンスＩＬ−１α オリゴマー集団（白抜きの三角）及びアンチセンスＩＬ−１αオリゴマーの除去 後に生成した集団（黒三角）についての生存細胞数を得た。翻訳を妨害しないヒ トｆＬ−１αの領域に対して相捕的なセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオ チドに細胞が！露された場合は、影響は観察されなかった。Figure 2 shows human rL-1α-targeted human rL-1α-targeted human rL-1α The results show that endothelial cells have a longer lifespan. For this experiment, cultured human endothelial cells were Cells were treated daily with antisense oligonucleotides (50 μg/ml) as described above. . Population doublings were counted after each passage. Control population (black circles), antisense IL-1α Removal of oligomer population (open triangles) and antisense IL-1α oligomers The number of viable cells was obtained for the subsequently generated population (black triangles). Hi that does not interfere with translation sense or antisense oligonucleotides complementary to the fL-1α region There are cells in Chido! No effects were observed when exposed.

図３は、異なった集団倍化におけるヒト内皮細胞の位相差顕微鏡写真を示してい る。細胞はメタノール中で固定しギームザで染色した［Ｔ　マシアグ等、ジャー ナル・イン・セルラー・バイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｊｏｌ、）９１巻４２ ０頁（１９８１）］。パネル（Ａ）はアンチセンスＩＬ−１αオリゴマー処理細 抱ＣＰＤ８８）を示している。パネル（Ｂ）は老化細胞（ＰＤ５０）を示してい る。パネル（Ｃ）は、オリゴマーを１６日間培地から除去した外は（Ａ）と同一 の細胞を示している。倍率は２００倍である。Figure 3 shows phase contrast micrographs of human endothelial cells at different population doublings. Ru. Cells were fixed in methanol and stained with Giemsa [T. Maciag et al. Null in Cellular Biology (J, Ce11. Bjol,) Volume 91 42 0 page (1981)]. Panel (A) shows antisense IL-1α oligomer-treated cells. 88). Panel (B) shows senescent cells (PD50) Ru. Panel (C) is the same as (A) except that the oligomers were removed from the medium for 16 days. cells are shown. The magnification is 200x.

示される通り老化表現型はＢ及びＣに起こり八には起こらない。典型的な若齢ヒ ト内皮細胞のように見える若返ったヒト内皮細胞が第一のパネルに示され、老化 細胞が第二のパネルに、そして若返り、次いでそれが逆転させられた細胞が第三 のパネルに示されている。As shown, the senescent phenotype occurs in B and C but not in VIII. typical young Rejuvenated human endothelial cells that look like human endothelial cells are shown in the first panel, and aging The cells are in the second panel, and the cells that have been rejuvenated and then it has been reversed are in the third panel. shown in the panel.

非処理及びアンチセンスオリゴヌクレオチド処理ヒト内皮細胞を用いて、世代の 数（集団倍化）の関数として細胞密度を測定した。generation of human endothelial cells using untreated and antisense oligonucleotide-treated human endothelial cells. Cell density was measured as a function of number (population doubling).

図２に示されるように、非処理細胞は約４０ないし６０世代後に急速に老化し、 一方処理細胞は９０及びそれ以上の世代の間高い密度を維持した。また、アンチ センスオリゴヌクレオチドを培地から除去すると細胞は老化表現型に逆戻りする ということもわかる。As shown in Figure 2, untreated cells age rapidly after about 40 to 60 generations; The treated cells, on the other hand, maintained high density for 90 and more generations. Also, anti Removal of sense oligonucleotide from culture medium reverts cells to senescent phenotype I also understand that.

対照集団は増殖能が集団倍化５０付近まで減退しく図２）、その結果このヒト内 皮細胞の大きさは増す（図３Ｂ）が、これはヒト内皮細胞の老化表現型に典型的 なものである。これに対してアンチセンスＩＬ−１αオリゴマーを毎日補給する 処理をしたヒト内皮細胞の集団は、集団倍化の正常な限界を超えて増殖を継続し 、インビトロでのヒト内皮細胞の寿命を二倍にすることが可能であった（図２） 。このヒト内皮細胞のインビトロ表現型は集団倍化数の低い内皮細胞集団の表現 型に似ているように見受けられ（図３Ａ）、実験継続中、細胞の大きさの僅かな 増大が観察されるのみであった。In the control population, the proliferation ability decreased to around 50 population doublings (Figure 2), and as a result, this intrahuman The size of the epithelial cells increases (Figure 3B), which is typical of the aging phenotype of human endothelial cells. It is something. For this, antisense IL-1α oligomer is supplemented daily. The treated population of human endothelial cells continues to proliferate beyond the normal limit of population doubling. , it was possible to double the lifespan of human endothelial cells in vitro (Figure 2) . This in vitro phenotype of human endothelial cells represents an endothelial cell population with a low population doubling number. (Fig. 3A), and during the experiment, the cell size slightly changed. Only an increase was observed.

さらに、アンチセンスＩＬ−１αオリゴマーに暴露されたヒト内皮細胞集団の増 殖能の延長及び正常な表現型の維持は、アンチセンスＩＬ−１αオリゴマーの存 在に依存していた。集団倍化レベルの延長されたインビトロヒト内皮細胞集団か らアンチセンスＩＬ−１αオリゴマーを除去すると、その結果、単層の増殖能の 低下（図２）及びヒト内皮細胞集団の大きさの有意な増大（図３Ｃ）が起こった 。Additionally, the increase in human endothelial cell populations exposed to antisense IL-1α oligomers Prolongation of fertility and maintenance of normal phenotype depend on the presence of antisense IL-1α oligomers. depended on existence. In vitro human endothelial cell populations with extended population doubling levels? Removal of antisense IL-1α oligomers results in a decrease in the proliferative capacity of the monolayer. (Figure 2) and a significant increase in the size of the human endothelial cell population (Figure 3C) occurred. .

集団倍化数の延長はアンチセンスＩＬ−１α子リゴマーの除去によって逆転した 。したがってヒト内皮細胞の老化表現型は非終末分化表現型を表わしているのか も知れない。細胞の老化は、よく認識されているサイトカインの潜在的細胞内活 性により調節されている可逆的因子を有する動的過程である。The increase in population doubling numbers was reversed by removal of antisense IL-1 alpha oligomers. . Does the aging phenotype of human endothelial cells therefore represent a non-terminally differentiated phenotype? I don't know. Cellular senescence is influenced by the well-recognized potential intracellular activity of cytokines. It is a dynamic process with reversible factors that are regulated by sex.

実施例５ アンチセンスオリゴヌクレオチドの存在下で生育させたヒト内皮細胞による■Ｌ −１α　ｍＲＮＡの発現を、老化及び若齢内皮細胞中、並びに増殖に成長因子の 添加を必要としない自然形質転換ヒト内皮細胞セルライン中で比較した。Example 5 ■L by human endothelial cells grown in the presence of antisense oligonucleotides -1α mRNA expression in aging and young endothelial cells, as well as in proliferation and growth factors. Comparisons were made in a naturally transformed human endothelial cell line that does not require addition.

この実験は図ＩＣに示す。図ＩＣはヒト内皮細胞による！Ｌ−１α　ｍＲＮＡの 発現を示している。この実験のためにＲＮＡをヒト内皮細胞の融合性培養から調 製した。全ＲＮＡを逆転写しＰＣＨにより３０サイクル増幅した。ＩＬ−１αに 対するセンス及びアンチセンスプライマーの配列は５’−ＧＴＴ　ＣＣＡ　ＧＡ ＣＡＴＧ　ＴＴＴ　ＧＡＡ　ＧＡＣＣＴＧ−３°及び５°−ＴＧＧ　ＡＴＧＧＧ ＣＡＡＣＴＧＡ　ＴＧＴ　ＧＡＡ　ＡＴＡ−３’である。第１列は形質転換され たヒト内皮細胞についての結果を示している。第２列は若齢ヒト内皮細胞（ＰＤ ３０）についての結果を示している。第３列は老化ヒト内皮細胞（ＰＤ５３）に ついての結果を示している。第４列はアンチセンスＩＬ−１αオリゴマー処理Ｈ ＵＶＥＣ（ＰＤ９５）についての結果を示している。This experiment is shown in Figure IC. Figure IC is based on human endothelial cells! L-1α mRNA It shows the expression. For this experiment, RNA was prepared from confluent cultures of human endothelial cells. Manufactured. Total RNA was reverse transcribed and amplified by PCH for 30 cycles. to IL-1α The sequences of the sense and antisense primers are 5'-GTT CCA GA CATG TTT GAA GACCTG-3° and 5°-TGG ATGGG CACTGA TGT GAA ATA-3'. The first row is transformed The results are shown for human endothelial cells. The second column shows young human endothelial cells (PD 30). The third column is aged human endothelial cells (PD53). The results are shown below. 4th column is antisense IL-1α oligomer treatment H Results for UVEC (PD95) are shown.

ＩＬ−１α　ｍＲＮＡは若齢及びオリゴマー処理細胞には観察されなかったが老 化細胞には観察された。自然形質転換細胞にはＩＬ−１α転写物は検出されなか った（図ＩＣ１第１列）。IL-1α mRNA was not observed in young or oligomer-treated cells, but in old cells. observed in cells. No IL-1α transcripts were detected in naturally transformed cells. (Figure IC1, first column).

実施例６ 常染色体性劣性早発加齢疾患であるヒト早老症由来の繊維芽細胞［Ｆ、Ｌ、デバ スク、ジャーナル・イン・ビデイアトリクス（Ｊ、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ）８０ 巻６９７頁（１９７２）：Ｗ、　Ｔ、ブラウン等、モレキュラー・バイオロジー ・イン・エイジング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｊｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ａｇｉｎｇ ）。Example 6 Fibroblasts derived from human progeria, an autosomal recessive premature aging disease [F, L, Deva] Journal in Videotrics (J, Pediatrics) 80 Volume 697 (1972): W. T. Brown et al., Molecular Biology ・Molecular Bjology of Aging ).

Ａ、Ｄ、ウッドヘッド等編、ブレナム・プレス、ＮＹ、３７５頁（１９８４）］ を調べた。A. D. Woodhead et al., eds., Blenheim Press, NY, p. 375 (1984)] I looked into it.

早老症の繊維芽細胞によるＩＬ−１α　ｍＲＮＡの発現を、年齢の合致したヒト 線維芽細胞の対照と比較した。この実験を図ＩＥに示す。全ＲＮＡを逆転写しＰ ＣＲにより３０サイクル増幅した。第１列はｃＤＮＡ産生ヒト線維芽細胞対照を 含み、第２列は早老症の繊維芽細胞からのｃＤＮＡを含む。図ＩＥに示されるよ うに、早老症の繊維芽細胞は、年齢の合致したヒト線維芽細胞対照と異なり極め て高いレベルのＩＬ−１α転写物を含む。IL-1α mRNA expression by progeria fibroblasts was compared with age-matched humans. compared to fibroblast controls. This experiment is shown in Figure IE. Reverse transcribe total RNA and P Amplification was performed by CR for 30 cycles. The first column is the cDNA-producing human fibroblast control. and the second column contains cDNA from progeria fibroblasts. As shown in Figure IE In contrast to age-matched human fibroblast controls, progeroid fibroblasts are extremely contains high levels of IL-1α transcript.

実施例７ 要約すると、老化の生物学的基礎を解明するために、ヒト謄帯静脈の内皮細胞を インビトロで連続的に増殖させた［Ｔ、マシアグ等、ジャーナル・イン・セルラ ー・バイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｊｏｌ、）９１巻４２０頁（１９８１）、 Ｐ、Ｂ、ゴートン等、イン・ビトロ（Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ）１９巻６６１頁（１９ ８３）；Ａ、　ジョンソン等、メカニズムズ・イン・エイジング・アンド・デイ ベ０７ブメント（Ｍｅｃｈ、Ａｇｅ、Ｄｅｖ、）１８巻１頁（１９８２）；ｓ。Example 7 In summary, to elucidate the biological basis of aging, human umbilical vein endothelial cells were Continuously propagated in vitro [T., Massiag et al., Journal in Cellular - Biology (J, Ce11.Bjol,) vol. 91, p. 420 (1981), P. B. Gorton et al., In Vitro, Vol. 19, p. 661 (19 83); A. Johnson et al., Mechanisms in Aging and Day. Mech, Age, Dev, Vol. 18, p. 1 (1982); s.

Ｃ，Ｖ−ントン等、サイエンス（Ｓｃ　１ｅｎｃｅ）２２２巻６２３頁（１９８ ３）：ｖ、　ｗ、　Ｍ、パン・ヒンスバーグ等、ヨーロピアン・ジャーナル・イ ン・セル・バイオロジー（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）４２巻１０１頁 （１９８６）＋Ｗ、Ｗ、ニコルズ等、ジャーナル・イン・セルラー・フィジオロ ジ−（Ｊ、　Ｃｅ１１．Ｐｈｙｓｉｏｌ、）１３２巻４５３頁（１９８７）；、 −れらの記載は全て引用して本明細書の一部とする］。異なった集団倍化を示す 細胞培養をＩＬ−１αに暴露させ、特異的転写物の誘導を逆転写酵素ポリメラー ゼ連鎖反応によって測定した。C., V. Nton et al., Science (Sc 1ence), Vol. 222, p. 623 (198 3): v, w, M, Pan Hinsberg et al., European Journal I Cell Biology (Eur, J, Cell Biol,) Volume 42, Page 101 (1986) + W, W, Nichols et al., Journal in Cellular Physiology. J. Ce11. Physiol, Vol. 132, p. 453 (1987); - The entire description thereof is incorporated by reference into this specification]. exhibiting different population doublings Cell cultures were exposed to IL-1α and induction of specific transcripts was induced using reverse transcriptase polymerase. Measured by enzyme chain reaction.

このデータは、ｃｏｘ　ｍＲＮＡは若齢内皮細胞においてＩＬ−１αにより容易 に誘導可能である（図ＩＡ）が、ＣＯＸ転写物のレベルは外因性ＩＬ−１αに暴 露されていない老化内皮細胞において増幅されるように見受けられることを証明 した。さらに、老化ヒト内皮細胞集団中のｃｏｘｍＲＮＡのレベルは外因性ＩＬ −１αに応答した変化をしなかった（図２Ａ）。同様のＣＯＸ発現データはＰＭ Ａに暴露されたヒト内皮細胞についても得られた（図ＩＢ）。This data indicates that cox mRNA is readily expressed by IL-1α in young endothelial cells. (Fig. IA), but COX transcript levels are resistant to exogenous IL-1α. demonstrated that it appears to be amplified in unexposed senescent endothelial cells. did. Furthermore, levels of cox mRNA in aging human endothelial cell populations are significantly reduced by exogenous IL. -1α did not change in response (Fig. 2A). Similar COX expression data are available in PM Also obtained for human endothelial cells exposed to A (Fig. IB).

ヒト内皮細胞はヘパリン結合成長因子（ＨＢＧＦ−１及びＨＢＧＦ−２）に対す る低レベルの転写物を発現するが、ヒト内皮細胞の若齢及び老化集団においてこ れらのｍＲＮＡのレベルに有意な差異はなかった。さらに、ＩＬ−１αの強い阻 害物質のレベルはヒト内皮細胞の異なった集団の間で異なってはいなかった［こ のＩＬ−１αの阻害物質をコードしているＤＮＡのヌクレオチド配列が近年報告 された；ｃ、　Ｈ，ハヌム等、ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）３４３巻３３６頁（ １９９０）；及びｓ、ｐ、アイセンバーブ等、ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）３４ ３巻３４１頁（１９９０）、いずれの記載も引用して本明細書の一部とする］。Human endothelial cells are sensitive to heparin-binding growth factors (HBGF-1 and HBGF-2). However, in young and aging populations of human endothelial cells, this There was no significant difference in their mRNA levels. Furthermore, strong inhibition of IL-1α Levels of toxic substances did not differ between different populations of human endothelial cells [this study] The nucleotide sequence of DNA encoding an inhibitor of IL-1α has recently been reported. c, H, Hanum et al., Nature, Vol. 343, p. 336 ( 1990); and s, p, Eisenbarb et al., Nature 34 Vol. 3, p. 341 (1990), all of which are incorporated herein by reference.]

インビトロでのヒト内皮細胞増殖のもう一つの強い阻害物質であるトランスフォ ーミング成長因子（ＴＧＦ−β）については同様のデータは得られていない［Ａ 。Transfection, another strong inhibitor of human endothelial cell proliferation in vitro. Similar data are not available for the growing growth factor (TGF-β) [A .

ベアド等、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケ ーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、）１３ ８巻４７６頁（１９８６）；ｃ、ミュリュー等、プロシーディングズ・イン・ザ ・ナショナル・アカデミ−・イン・サイエンシズ（Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　）　（Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、）８４巻５６００頁（１９８７）　 ；Ｊ、　Ａ、メイク等、ジャーナル・イン・セル・バイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ 　Ｂｊｏｌ、）１０６巻１３７５頁（１９８８）］が、ＴＧＦ−βはプラスミン による蛋白分解的活性化を必要とする不活性な細胞外前駆体として発現されるた め、老化の間の細胞増殖の阻害物質としてＴＧＦ−βが参加しているとは考えに くい［Ｍ、　ライホー等、ジャーナル・イン・バイオロジカル・ケミストリー（ Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）２６２巻１７４６７頁（１９８７）；Ｈ，Ｌ、　ノ ージズ等、ン＋−−ｔルーイン・セル・フィジオロジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙ ｓｉｏｌ、）５巻１頁（１９８７）；Ｄ、モスケリ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ ｐｈｙｓ、Ａｃｔａ９４８巻６７頁（１９８８）＋Ｏサクセラ等、ジャーナル・ イン・セル・／くイオロジ（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）１１０巻７６７頁（１ ９９０）］。Baird et al., Biochemical and Biophysical Research Communiqué. tions (Biochem, Biophys, Res, Commun,) 13 Vol. 8, p. 476 (1986); c, Mullieu et al., Proceedings in the ・National Academy in Sciences (U, S, A,) (P roc, Nat 1. Acad, Set,) Volume 84, Page 5600 (1987) ; J, A, Make et al., Journal in Cell Biology (J, Ce1l Bjol, ) Vol. 106, p. 1375 (1988)], but TGF-β is plasmin expressed as an inactive extracellular precursor that requires proteolytic activation by Therefore, it is unlikely that TGF-β participates as an inhibitor of cell proliferation during aging. Kui [M, Laiho et al., Journal in Biological Chemistry ( J, Biol, Chem, ) vol. 262, p. 17467 (1987); H, L. Lewin Cell Physiology (J, Ce1l Phys. siol, ) vol. 5, p. 1 (1987); D. Moschelli et al., Biochem, Bio phys, Acta Vol. 948, p. 67 (1988) + O Saxela et al., Journal. In Cell Biol., Vol. 110, p. 767 (1) 990)].

牛脂児血清は比較的高いレベルのプラスミン阻害物質を含み、プラスミノーゲン アクティベーター阻害物質−１の発現は内皮細胞中のＩＬ−］αにより誘導され ることから、もしＴＧＦ−βの発現が老化中に増幅されるならば、この前駆体の 蛋白分解的活性化は起こりそうもない事象である。Tallow serum contains relatively high levels of plasmin inhibitors, and plasminogen Activator inhibitor-1 expression is induced by IL-]α in endothelial cells. Therefore, if TGF-β expression is amplified during aging, this precursor Proteolytic activation is an unlikely event.

さらに、インビトロでの老化ヒト内皮細胞により順化された細胞培地はインビト ロで若齢内皮細胞の増殖能を抑制しない［Ｐ、リビー等、ジャーナル・イン・ク リニカル・インベスティゲーシａン（Ｊ、ＣＩ　ｉｎ、Ｉｎｖｅｓ　ｔ、）７８ 巻１４３２頁（１９８６）：Ｐ、ミオセック等、ジャーナル・イン・イミュノロ ジー（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）１３６巻２４８６頁（１９８６）：Ｄ、Ｍ、スタ ーン等、ジャーナル・イン・エクスペリメンタル・メデイスン（Ｊ、　Ｅｘｐ、 　Ｍｅｄ、）１６２巻１２２３頁（１９８５）＋Ｄ、Ｇ、マローン等、ブラッド （Ｂｌｏｏｄ）７１巻６８４頁（１９８８）：ｌ。Furthermore, cell media conditioned by in vitro aged human endothelial cells are does not inhibit the proliferative ability of young endothelial cells [P., Libby et al., Journal ink. Linical Investigator (J, CI in, Invest,) 78 Volume 1432 (1986): P. Miosek et al., Journal in Immunology. J. Immunol, Vol. 136, p. 2486 (1986): D. M. Sta. Journal of Experimental Medicine (J, Exp, Med, vol. 162, p. 1223 (1985) + D. G. Malone et al., Brad (Blood) Vol. 71, p. 684 (1988): l.

しかしながら、最も重要な知見は老化細胞がＩＬ−１αの増強された発現を示し たという事である。もしＩＬ−１α転写物のレベルが低下すれば、その老化細胞 の増殖能が回復し、細胞は若齢細胞に特徴的な形態及び表現型を示すという事が 判明した。However, the most important finding is that senescent cells show enhanced expression of IL-1α. That is to say. If the level of IL-1α transcript decreases, senescent cells The proliferative ability of the cells is restored, and the cells exhibit morphology and phenotype characteristic of young cells. found.

このように、本発明によれば、ＩＬ−１αの核内レベルを低下させることにより 老化細胞を若返らせる方法が提供される。この低下をもたらすことのできる、当 業者に知られるいかなる方法をも使用することができる。Thus, according to the present invention, by reducing the nuclear level of IL-1α, A method of rejuvenating senescent cells is provided. The current Any method known to those skilled in the art can be used.

本発明をその個別的態様に関連付けて記載してきたが、さらなる修飾が可能であ り、また、この出願は一般に本発明の原理に従い、且つ本発明の属する分野の中 の既知または慣例的実践の範囲内にある本開示からの逸脱及びこれまでに開示さ れた本質的特徴に対して適用され得、以下のように付記されてＬする言冑求項の 範囲内にある逸脱を含む、本発明の任意の変法、用途、また（ま適合を包含する ことを意図していることが理解できるであろう。Although the invention has been described in connection with specific embodiments thereof, further modifications are possible. This application is also filed generally in accordance with the principles of the invention and within the field to which the invention pertains. Deviations from this disclosure that are within the known or customary practice of The term L can be applied to the essential features and is added as follows. Any variations, uses or adaptations of this invention, including deviations within its scope, You can understand what is intended.

Ｆ１Ｇ吹Ｅｌ Ｆ工ＧＵＲＥ　Ｉ ＴＰＡ　−＋−十 Ｆ工ＧＵＲＥ　２ Ｆ工ＧＵＲＥ　３ 要約書 この発明は、核内インターロイキン−■の濃度を低下させることにより老化細胞 の増殖能を回復させる方法を提供するものである。さらにこの発明は、老化細胞 培養に加える時これらの細胞の増殖能を回復させるアンチセンスオリゴヌクレオ チドを提供する。したがってこの発明は細胞を若返らせる手段及び方法を提供す るものである。F1G blowing El F Engineering GURE I TPA -+-10 F Engineering GURE 2 F Engineering GURE 3 abstract This invention aims to treat aging cells by reducing the concentration of nuclear interleukin-■. The present invention provides a method for restoring the proliferation ability of. Furthermore, this invention Antisense oligonucleotides that restore the proliferative potential of these cells when added to culture Provide chido. Therefore, this invention provides means and methods for rejuvenating cells. It is something that

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Claims (34)

【特許請求の範囲】[Claims] １．インターロイキン−１αをコードしている遺伝子の発現を損なうことのでき る物質の有効量を細胞に提供することからなる、老化細胞を若返らせる方法。1. Can impair the expression of the gene encoding interleukin-1α A method of rejuvenating senescent cells, comprising providing the cells with an effective amount of a substance. ２．ＩＬ−１αをコードしているｍＲＮＡの翻訳を損なうことのできる物質によ り該発現を損なう、請求項１に記載の方法。2. by substances that can impair the translation of mRNA encoding IL-1α. 2. The method of claim 1, wherein said expression is impaired. ３．該物質が、 （ａ）インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）をコードしているｍＲＮＡに対し 相補的なヌクレオチド配列を有し； （ｂ）該ｍＲＮＡとハイブリダイズし、それにより該ｍＲＮＡの翻訳を損なうこ とができる、 ことを特徴とするアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１または２の いずれかに記載の方法。3. The substance is (a) For mRNA encoding interleukin-1α (IL-1α) have a complementary nucleotide sequence; (b) hybridize with said mRNA and thereby impair translation of said mRNA; can be done, The antisense oligonucleotide according to claim 1 or 2, which is an antisense oligonucleotide characterized by Any method described. ４．該オリゴヌクレオチドが配列：【配列があります】、またはその等価物を含 む、請求項３に記載の方法。4. The oligonucleotide contains the sequence: [sequence exists], or its equivalent. 4. The method according to claim 3. ５．該オリゴヌクレオチドが本質的に配列；【配列があります】またはその等価 物を有するヌクレオチドから成り立っている、請求項３に記載の方法。5. The oligonucleotide is essentially a sequence; [has a sequence] or its equivalent 4. The method according to claim 3, consisting of nucleotides having a compound. ６．ＩＬ−１αをコードしているｍＲＮＡ分子の転写を損なうことのできる物質 により該発現を損なう、請求項１に記載の方法。6. Substances that can impair transcription of the mRNA molecule encoding IL-1α 2. The method of claim 1, wherein said expression is impaired by. ７．該細胞が内皮細胞または線維芽細胞である請求項１に記載の方法。7. The method according to claim 1, wherein the cells are endothelial cells or fibroblasts. ８．インターロイキン−１αをコードしている遺伝子の発現を損なうことのでき る物質の有効量の存在下で細胞を培養することからなる、非不死細胞のインビト ロ組織細胞培養方法。8. Can impair the expression of the gene encoding interleukin-1α In vitro testing of non-immortal cells consists of culturing the cells in the presence of an effective amount of a substance that B. Tissue cell culture method. ９．該物質が、 （ａ）インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）をコードしているｍＲＮＡに対し 相補的なヌクレオチド配列を有し： （ｂ）該ｍＲＮＡとハイブリダイズし、それにより該ｍＲＮＡの翻訳を損なうこ とができる、 ことを特徴とするアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項８に記載の方 法。9. The substance is (a) For mRNA encoding interleukin-1α (IL-1α) Has a complementary nucleotide sequence: (b) hybridize with said mRNA and thereby impair translation of said mRNA; can be done, The method according to claim 8, which is an antisense oligonucleotide characterized by Law. １０．該オリゴヌクレオチドが配列：【配列があります】、またはその等価物を 含む、請求項８に記載の方法。10. The oligonucleotide has the sequence: [has the sequence], or its equivalent. 9. The method of claim 8, comprising: １１．該オリゴヌクレオチドが本質的に配列：【配列があります】またはその等 価物を有するヌクレオチドから成り立っている、請求項８に記載の方法。11. The oligonucleotide essentially has a sequence: [has a sequence] or the like 9. The method according to claim 8, wherein the method consists of nucleotides having a valence. １２．ＩＬ−１αをコードしているｍＲＮＡ分子の転写を損なうことのできる物 質により該発現を損なう、請求項８に記載の方法。12. Substances that can impair transcription of the mRNA molecule encoding IL-1α 9. The method of claim 8, wherein said expression is impaired by quality. １３．該細胞が内皮細胞または線維芽細胞である請求項８に記載の方法。13. 9. The method according to claim 8, wherein the cells are endothelial cells or fibroblasts. １４．ＩＬ−１α遺伝子の発現産物の移動を損なうことのできる物質の有効量を 細胞に提供することからなる、老化細胞を若返らせる方法。14. An effective amount of a substance capable of impairing the movement of the expression product of the IL-1α gene. A method of rejuvenating aging cells, consisting of providing cells with １５．有効量の変異ＩＬ−１αポリペプチドの存在下で細胞を培養することから なる請求項１４に記載の方法［ここで該変異は該ポリペプチドの核移動領域にお けるものであり、それにより該変異ＩＬ−１αポリペプチドは細胞のレセプター と結合はできるが核に移動することはできず、また該有効量は内因性ＩＬ−１α の核移動を損なうのに有効である］。15. From culturing the cells in the presence of an effective amount of mutant IL-1α polypeptide. 15. The method of claim 14, wherein the mutation is in the nuclear translocation region of the polypeptide. The mutant IL-1α polypeptide is thereby able to interact with cellular receptors. can bind to but cannot move to the nucleus, and the effective amount is limited to endogenous IL-1α. effective in impairing nuclear transfer]. １６．該損瘍が該細胞におけるＩＬ−１αの核移動を損なうことによりもたらさ れる、請求項１４に記載の方法。16. The lesion results from impaired nuclear translocation of IL-1α in the cell. 15. The method of claim 14. １７．患者にインターロイキン１αをコードしている遺伝子の発現を損なうこと のできる物質の有効量を投与することからなる、患者の加齢関連疾患を処置する 方法。17. Impairing the expression of the gene encoding interleukin 1α in the patient treating an age-related disease in a patient, comprising administering an effective amount of a substance capable of Method. １８．該物質が局所的に投与される請求項１７に記載の方法。18. 18. The method of claim 17, wherein the agent is administered locally. １９．該物質が皮膚調節剤である請求項１８に記載の方法。19. 19. The method of claim 18, wherein the substance is a skin conditioner. ２０．該物質が全身的に投与される請求項１７に記載の方法。20. 18. The method of claim 17, wherein the agent is administered systemically. ２１．該全身投与が非経口的である請求項２０に記載の方法。21. 21. The method of claim 20, wherein said systemic administration is parenteral. ２２．該非経口投与が筋肉内または静脈内注射、迅速注入、鼻咽腔吸収、または 経皮吸収によるものである、請求項２１に記載の方法。22. The parenteral administration may be by intramuscular or intravenous injection, rapid infusion, nasopharyngeal absorption, or 22. The method according to claim 21, which is by transdermal absorption. ２３．該全身投与が経腸的である請求項２０に記載の方法。23. 21. The method of claim 20, wherein said systemic administration is enteral. ２４．該経腸投与が経口的である請求項２３に記載の方法。24. 24. The method of claim 23, wherein said enteral administration is oral. ２５．該物質が化粧品または洗浄剤として配合される、請求項１８に記載の方法 。25. 19. A method according to claim 18, wherein the substance is formulated as a cosmetic or cleansing agent. . ２６．該物質が、 （ａ）インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）をコードしているｍＲＮＡに対し 相補的なヌクレオチド配列を有し： （ｂ）該ｍＲＮＡとハイブリダイズし、それにより該ｍＲＮＡの翻訳を損なうこ とができる、 ことを特徴とするアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１７に記載の 方法。26. The substance is (a) For mRNA encoding interleukin-1α (IL-1α) Has a complementary nucleotide sequence: (b) hybridize with said mRNA and thereby impair translation of said mRNA; can be done, The antisense oligonucleotide according to claim 17, characterized in that Method. ２７．該オリゴヌクレオチドが配列：【配列があります】、またはその等価物を 含む、請求項２６に記載の方法。27. The oligonucleotide has the sequence: [has the sequence], or its equivalent. 27. The method of claim 26, comprising: ２８．該オリゴヌクレオチドが本質的に配列：【配列があります】またはその等 価物を有するヌクレオチドから成り立っている、請求項２６に記載の方法。28. The oligonucleotide essentially has a sequence: [has a sequence] or the like 27. The method according to claim 26, wherein the method is comprised of nucleotides having a valence. ２９．（ａ）インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）をコードしているｍＲＮＡ に対し相補的なヌクレオチド配列を有し；（ｂ）該ｍＲＮＡとハイブリダイズし 、それにより該ｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる、 ことを特徴とするアンチセンスオリゴヌクレオチド。29. (a) mRNA encoding interleukin-1α (IL-1α) (b) hybridizes with the mRNA; , thereby being able to inhibit the translation of said mRNA. An antisense oligonucleotide characterized by: ３０．配列：【配列があります】、 またはその等価物を含む、老化細胞、皮膚細胞、または組織を若返らせる請求項 ２９に記載のオリゴヌクレォチド。30. Array: [There is an array], Claims that rejuvenate senescent cells, skin cells, or tissues, including or equivalents thereof. 29. ３１．本質的に配列：【配列があります】、またはその等価物を有するヌクレオ チドから成り立っている、老化細胞、皮膚細胞、または組織を若返らせる請求項 ２９に記載のオリゴヌクレオチド。31. Essentially an array: a nucleo with an array, or its equivalent Claims for rejuvenating aging cells, skin cells, or tissues, consisting of 29. ３２．老化細胞、皮膚細胞、または組織を若返らせるに充分な量の請求項２９に 記載のオリゴヌクレオチド、及び化粧品学的に適当な担体または添加物を含む化 粧品組成物。32. Claim 29 in an amount sufficient to rejuvenate aging cells, skin cells or tissues. Compounds containing the oligonucleotides described and cosmetically suitable carriers or additives. Cosmetic composition. ３３．老化細胞、皮膚細胞、または組織を若返らせるに充分な量の請求項３０に 記載のオリゴヌクレオチド、及び化粧品学的に適当な担体または添加物を含む化 粧品組成物。33. Claim 30 in an amount sufficient to rejuvenate aging cells, skin cells, or tissues. Compounds containing the oligonucleotides described and cosmetically suitable carriers or additives. Cosmetic composition. ３４．老化細胞、皮膚細胞、または組織を若返らせるに充分な量の請求項３１に 記載のオリゴヌクレオチド、及び化粧品学的に適当な担体または添加物を含む化 粧品組成物。34. Claim 31 in an amount sufficient to rejuvenate aging cells, skin cells or tissues. Compounds containing the oligonucleotides described and cosmetically suitable carriers or additives. Cosmetic composition.