JPH05504192A - Method for simultaneously detecting various types of antibodies and/or antigens produced by individual cells - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 個体細胞が生み出す種々のタイプの抗体および／または抗原を同時に検出する方 法 本発明は、個体細胞により分泌および／または放出された抗体および／または抗 原を検出する方法に関する。この方法においては、細胞懸濁液を固形担体と接触 させ、その後または同時に、検出する抗体または抗原を指向しそれと結合する能 力を有する他の抗体を加え、他の抗体には、問題の抗体または抗原を検出するた めの指示薬物質に反応する酵素を具備させる。[Detailed description of the invention] Method for simultaneously detecting various types of antibodies and/or antigens produced by individual cells law The present invention relates to antibodies and/or antibodies secreted and/or released by individual cells. The present invention relates to a method for detecting an origin. In this method, a cell suspension is brought into contact with a solid support. the ability to direct and bind to the antibody or antigen to be detected. Add other antibodies that have the potential to detect the antibody or antigen in question. It is equipped with an enzyme that reacts with the indicator substance.

発明の背景 例えばウィルス感染等の検査室診断は主として患者より採取したサンプル中の感 染を誘発するウィルス自身または抗原と称されるその部分を検出するか、または 、より一般的なウィルスに対抗する患者の血液中の抗体指示のいずれかの方法に 基づいている。抗体検出の一般的な方法は、エライザ（酵素結合免疫吸着検定法 ）である。最近、この方法の変種ＥＬＩＳＰＯＴが開発されている。本来のＥＬ ＩＳＰＯＴ技術によれば、抗体は、アルカリ性リン酸酵素（ＡＰ）　（雑誌く免 疫学的方法＞１８８３．５７゜３０１　：　Ｓｅｄｇｗｉｃｈ他く特異性抗体分 泌細胞を列挙するための固相酵素技術〉）、或いは、ホースラデイシュ（ワサビ ダイコン）／ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）　（雑誌く免疫学的方法〉１９８３、 ６５．１０９　：　ＣｚｅｒＫｉｎｓｋｙ他く特異性抗体分泌細胞を列挙するだ めの固相酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）検定法〉）のいずれかで標識 づけ、対応する色素原物質を用いて抗体生産細胞を検出する。Background of the invention For example, laboratory diagnosis of viral infections is mainly performed using detection of the virus itself or its parts, called antigens, that induce infection; , either way the antibodies in the patient's blood direct against the more common viruses. Based on. A common method for antibody detection is ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). ). Recently, a variant of this method, ELISPOT, has been developed. Original EL According to the ISPOT technology, the antibody is an alkaline phosphate enzyme (AP). Epidemiological methods > 1883.57゜301: Sedgwich et al. specific antibody content solid phase enzyme technique for enumerating secretory cells) or horseradish (wasabi Japanese radish)/Peroxidase (HRP) (Magazine Immunological Methods) 1983, 65.109: CzerKinsky and others list specific antibody-secreting cells. Labeled with one of the following enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assays: and detect antibody-producing cells using the corresponding chromogen.

発明の目的と最も重要な特徴 この発明の目的は少なくとも２種類の抗体および／または抗原を同時に検出する ことを可能にするＥＬＩＳＰＯＴに基づく方法を提供することにある。Purpose and most important features of the invention The purpose of this invention is to simultaneously detect at least two types of antibodies and/or antigens. The object of the present invention is to provide an ELISPOT-based method that enables the following.

本発明によれば、検出すべき少なくとも２種類の異なる抗体に対抗して少なくと も２種類の他の抗体を加え、他の抗体には異なる酵素を具備させ、その後、異な る染色効果を有する指示薬物質を対応量加え、固体担体上に残る指示色斑点を評 価することにより異なる種類の抗体および／または抗原の同時検出を達成した。According to the present invention, at least also add two other antibodies, equip the other antibodies with different enzymes, and then add different antibodies. Add a corresponding amount of an indicator substance with a dyeing effect and evaluate the indicator color spots remaining on the solid support. Simultaneous detection of different types of antibodies and/or antigens was achieved by titration.

図面の説明 本発明につき添付の図面を参照し詳述する。図面は、異なる２種の抗体および／ または抗原の存在を示す異なる色斑点を有するシャーレの略図であり、図中、異 なる色はスポットが満されているか否かで示される。Drawing description The present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings. The figure shows two different types of antibodies and/or or a schematic representation of a Petri dish with different colored spots indicating the presence of antigen; The color is indicated by whether the spot is filled or not.

発明の説明 記述の例では、ＡＰおよびＨＰＲで標識した抗体として上記の２つの指示薬シス テムを組合せ、それに対応する色素体基質と共に、特異なタイプの抗体生産細胞 の同時検出に使用した。Description of the invention In the example described, the two indicator systems described above are labeled as AP and HPR labeled antibodies. together with the corresponding plastid substrate, a unique type of antibody-producing cell. was used for simultaneous detection of

記述の例においては、特異細胞により生産され固体担体に結合した抗体ＴｇＧお よびＩｇＡのゾーンをこれらの異なるタイプのいずれかに対応する青および赤の 班点の形でそれぞれ視覚化した。In the example described, antibodies TgG and and IgA zones with blue and red zones corresponding to either of these different types. Each was visualized in the form of a grid point.

テストを志願した４人の成人にＡタイプおよびＢタイプ（ベイト研究所、パナマ ）の三価インフルエンザウィルスワクチンを筋肉内に注射した。末梢血単核細胞 （ＰＢＭＣ）を免疫化後５日から１２日の間に、即ち、循環中における特異抗原 特発ＡＳＣの周期が最大であると知られている期間に採取した。Types A and B (Bait Institute, Panama) were administered to four adults who volunteered for the test. ) trivalent influenza virus vaccine was injected intramuscularly. peripheral blood mononuclear cells (PBMC) during 5 to 12 days after immunization, i.e., specific antigen in circulation. Samples were taken during the period when the idiopathic ASC period was known to be at its maximum.

ＰＢＭＣをフィコール・ハイバール法（Ｂｏｙｕｎ、１９６８）により遠心分離 によりヘパリン他面から分離した。インターフェイスＰＢＭＣは等張性リン酸緩 衝食塩水（リン酸塩０．０１モル、ＮａＣ１０，１５モル、ｐＨ７，４）　（Ｐ ＢＳ）で洗い、検定用培養基中に適当密度で懸濁させた。培養基はウシ胎児血清 （ＦＢＳ）　（イルビン・サイエンテイフイク社、カリフォルニア州すンタ・ア ナ市）を５％付加したＲＰＭＩ１６４０　（ギブコ社、スコツトランド、グラス コー市）よりなる。PBMCs were centrifuged by the Ficoll-Hybar method (Boyun, 1968). The heparin was separated from the other side. Interface PBMC are isotonic phosphate-relaxed Brine (phosphate 0.01 mol, NaC 10.15 mol, pH 7.4) (P BS) and suspended in an assay culture medium at an appropriate density. Culture medium is fetal bovine serum (FBS) (Irvin Scientific, Inc., Suntaea, California) RPMI 1640 (Gibco, Scotland, Glass) with 5% (Cho City).

Ｘ来 ＡＰまたはＨＲＰを接合し親和精製したヤギの抗ヒトＴｇＡとヤギの抗ヒトＩｇ Ｇの抗体を市販ルートで購入した。５−ブロム−４−りコロ３−インドール・リ ン酸トルイジン塩とｐ−ニトロブルーテトラゾリウム塩化物（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ ）より成るＡＰ色素体基質溶液は、製造者（バイオラット研究所、リッチモンド 、米国）の指示に従い調製した。最初に、１５ｍｇのＢＣＩＰ試薬と３０ｍｇの ＮＢＴ塩を１ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で別個に溶解し、次に、○ 、ＬＭのＮａＨＣＯ，，１ｍＭのＭｇＣＬ、でｐＨ９゜８の溶液１００ｍ１を加 える。ＨＲＰ色素体基質は２５ｍｇの３＝アミノ−９−エチルカルバゾール（Ａ ＥＣ）　（シグマ社、ミズリー州セントルイス市）を２ｍｌのＤＭＦに溶解し０ ．０５Ｍのアセテート緩衝液を９５ｍ　ｌ　、　ｐＨ５，０（±０．２）および ３０％のＨ，Ｏ，を４μｍ加えて調製した。上記の基質溶液をフィルター（０， ４５μｍ）で濾過し微粒子物質を除去した。（濾過後ＡＥＣ／Ｈ，Ｏ，溶液は無 色に成るが、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液は淡黄色が残る。X coming Goat anti-human TgA and goat anti-human Ig conjugated with AP or HRP and affinity purified Antibody G was purchased through a commercial route. 5-brome-4-ricoro 3-indole-ri Toluidine acid salt and p-nitroblue tetrazolium chloride (BCIP/NBT) ) was prepared by the manufacturer (BioRat Laboratories, Richmond). , USA). Initially, 15 mg of BCIP reagent and 30 mg of Dissolve the NBT salt separately in 1 ml of dimethylformamide (DMF) and then Add 100 ml of a solution of pH 9°8 in LM NaHCO, 1mM MgCL. I can do it. The HRP plastid substrate was 25 mg of 3=amino-9-ethylcarbazole (A EC) (Sigma, St. Louis, Missouri) was dissolved in 2 ml of DMF. ．． 95ml of 05M acetate buffer, pH 5.0 (±0.2) and It was prepared by adding 4 μm of 30% H,O. Filter the above substrate solution (0, 45 μm) to remove particulate matter. (After filtration AEC/H, O, solution is free) However, the BCIP/NBT solution remains pale yellow.

）両方の酵素基質溶液は、暗所に４℃の温度で１週間まで保存できた。) Both enzyme substrate solutions could be stored in the dark at a temperature of 4°C for up to one week.

璽足 検定は次の５段階より成る。Seal The test consists of the following five stages.

１）最初に固相の特異的吸着体を調製する。1) First, a solid phase specific adsorbent is prepared.

２）細胞懸濁液を保温培養する。2) Insulate and culture the cell suspension.

３）ＡＰおよびＨＲＰ接合抗体の両方を加える。3) Add both AP and HRP conjugated antibodies.

４）非溶性の青色斑点および赤色斑点をそれぞれ発生させるＡＰおよびＨＲＰ色 素体基質を徐々に添加する。4) AP and HRP colors that produce insoluble blue and red spots, respectively; Gradually add the elemental substrate.

５）班点を算定する。5) Calculate the team score.

標準ＥＲＩＳＰＯＴ検定法を変更し、ポリスチレンの代わりに固体担体としてニ トロセルローズ膜を使用した。ニトロセルローズを底に張った９６個の井戸を持 つミリタイターＨＡプレート（ミリボアー社、マサチューセッツ州　ベッドフォ ード市）の個々の独立井戸に、インフルエンザウィルス血球凝集素（ウェット・ ラボラトリ−）を０．２μｇ含有するＰＢＳを０．０７５−０．１ｍｌ入れる。The standard ERISPOT assay was modified to use Ni as solid support instead of polystyrene. A trocellulose membrane was used. It has 96 wells lined with nitrocellulose. MilliTiter HA plate (Millibore, Bedford, Massachusetts) Influenza virus hemagglutinin (wet Add 0.075-0.1 ml of PBS containing 0.2 μg of laboratory).

吸着されない蛋白質をＰＢＳを用い３回連続して手動洗浄して除去し、プレート をこの緩衝液に５分間漬は込んだ。井戸の洗浄緩衝液を空にし、ニトロセルロー ズ膜の外面を吸収紙タオルで注意深く乾燥させた。固体担体上の残存タンパク質 結合部を飽和させるために０．２＋ｎｌの検定培養基を個々の独立井戸に入れ、 プレートを、ＣＯ８を７％含む湿った雰囲気中で最低３０分間３７℃の温度で培 養した。Unadsorbed proteins were removed by three consecutive manual washes with PBS, and the plate was soaked in this buffer for 5 minutes. Empty the wash buffer from the wells and fill with nitrocellulose. The outer surface of the membrane was carefully dried with an absorbent paper towel. Residual protein on solid support 0.2+nl of assay medium was placed in each independent well to saturate the binding sites. Incubate the plate at a temperature of 37°C for a minimum of 30 minutes in a humidified atmosphere containing 7% CO8. fed.

無関連抗原、即ち破傷風トキソイド（ＴＴ）　（ウェット）（０゜１μｇ／井戸 ）に曝した井戸を、対照目的のために同様にして準備した。Unrelated antigen, i.e. tetanus toxoid (TT) (wet) (0°1 μg/well ) were similarly prepared for control purposes.

井戸の内容物を、種々のＰＢＭＣを含む細胞懸濁液０，１ｍｌで置換えた。日常 は、３重（ｔｒｉｐｌｉｅｎｔｅ）の井戸を少なくとも３セツ］・使用した。井 戸の各セットは各井戸当り２ｘｌ　Ｏ’。The contents of the wells were replaced with 0.1 ml of cell suspension containing various PBMCs. everyday life At least three sets of triplicate wells were used. well Each set of doors has 2xl O' per well.

１０′および５ｘｌ○４のＰＢＭＣを受け入れた。次に、プレートをＣＯ１培養 器に入れ３７℃の温度で３−４時間放置培養した。10' and 5xl○4 PBMC were received. Next, the plate was incubated with CO1. The cells were placed in a container and incubated for 3-4 hours at a temperature of 37°C.

１つの実験では、ＰＢＭを、種々濃度（５ｘｌ　Ｏ−’Ｍ、１０−’悶。In one experiment, PBM was mixed at various concentrations (5xl O'M, 10'M).

２ｘｌ　Ｏ−”Ｍ）のシクロへキシミド（シグマ社）を用い検定培養基中で３７ ℃の温度で５時間培養し、再度懸濁させ、シクロへキシミドを含む（シグマ社） 培質中でプレートに乗せた。37 in assay culture medium using 2xl O-"M) of cycloheximide (Sigma). ℃ for 5 hours, resuspended, and containing cycloheximide (Sigma). plated in culture.

細胞培養期間終了後、プレートをＰＢＳで３回、（Ｔｗｅｅｎ　２０〉を０．０ ５％含むＰＢＳ　（ＰＢＳ−Ｔ）で３回手動洗浄し、次にＰＢＳ　−Ｔに５分間 浸漬させた。皿の洗浄緩衝液を空にしてから、プレートの外面を第１段階に記述 したように吸取り紙タオルを用い乾燥させた。次に、ＡＰとＨＲＰをそれぞれま たは逆に接合させたヤギ抗ヒト抗体ＩｇＧとヤギ抗ヒト抗体１ｇＡとの混合物と ＦＢＳを１％含むＰＢＳ　−Ｔを０．１．ｍｌ各井戸に加えた。ＡＰおよびＨＲ Ｐで標識した抗グロブリンの最適濃度を予備実験にて決定した。両方のタイプの 酵素接合に対し、０．５μｇ／ｍｌから２゜５μｇ／ｍｌの範囲の濃度を適用し た。プレートを室温で３時間または４℃の温度で一晩培養した。その後皿をＰＢ Ｓで４回洗浄し、顕色させる前に０．０５Ｍのトリス緩衝塩ｐＨ８、Ｏに５分間 浸漬させた。After the cell culture period, the plate was diluted with PBS (Tween 20) 0.0 Manually wash 3 times with 5% PBS (PBS-T), then soak in PBS-T for 5 minutes. Soaked. Empty the washing buffer on the dish and then write the outer surface of the plate in the first step. Dry with blotting paper towels as before. Next, set AP and HRP respectively. or a mixture of reversely conjugated goat anti-human antibody IgG and goat anti-human antibody 1gA. PBS-T containing 1% FBS was added to 0.1. ml was added to each well. AP and HR The optimal concentration of P-labeled antiglobulin was determined in preliminary experiments. of both types For enzyme conjugation, concentrations ranging from 0.5 μg/ml to 2.5 μg/ml were applied. Ta. The plates were incubated for 3 hours at room temperature or overnight at a temperature of 4°C. Then the plate is PB Wash 4 times in S and 0.05 M Tris-buffered saline pH 8, O for 5 min before development. Soaked.

皿の洗浄緩衝液を空にし、前記の通り吸収乾燥させた。それから井戸を０．１ｍ ｌのＢＣＩＰ／ＮＢＴに曝し、青色斑点の現れるのを検査する。これらの反応は 、通常５−１０分間の間に現れた。プレートをさらに５−１０分間顕色させ、そ の後ＰＢＳで洗浄し、吸収乾燥させた。次に、０．１ｍｌのＡＥＣ／Ｈ，０，基 質を各井戸に加えた。１−３分間の間に赤色斑点が現れた。プレートをさらに（ １０分間以内の）任意時間顕色させ、その後水道水で完全に洗浄した。培養時間 が長ずざると過度の背景染色が生じるので、酵素基質の反応期間中（細胞を入れ ていない）対照井戸を監視することが重要である。The dishes were emptied of wash buffer and blotted dry as before. Then open the well 0.1m 1 of BCIP/NBT and inspect for the appearance of blue spots. These reactions are , usually appearing within 5-10 minutes. Let the plate develop for an additional 5-10 minutes and then After that, it was washed with PBS and dried by absorption. Next, 0.1 ml of AEC/H,0, group quality was added to each well. Red spots appeared within 1-3 minutes. Add more plates ( The color was allowed to develop for an arbitrary period of time (within 10 minutes) and then thoroughly washed with tap water. Culture time Excessive background staining will occur if the reaction period is not long; It is important to monitor control wells (not tested).

顕色したプレートを乾燥し個々の独立井戸を青斑点および赤斑点の有無を調べた （図参照）。これらの反応斑点は、低倍率（ｘ４０−ｘ６０）で算定した。低倍 率では、円形でよく個別化し、背景に接近して密集し顆粒状に変色しているもの を正反応斑点と定義した。これらの変色斑点の直径は０゜０５ｍｍから０．２ｍ ｍまでの範囲であった。疎らな粒子は、特に酵素基質のどちらかに対し過度に露 出された時などにたまたま観察出来た。これらの非顆粒状斑点は一般に背景平面 の上方の現れ、真の班点と区別出来た。The developed plate was dried and each individual well was examined for the presence of blue and red spots. (See diagram). These reactive spots were calculated at low magnification (x40-x60). low magnification In terms of percentage, it is circular and well-individualized, densely packed close to the background, and discolored in a granular form. were defined as positive reaction spots. The diameter of these discolored spots is 0.05 mm to 0.2 m. The range was up to m. Loose particles are particularly susceptible to overexposure to either enzyme substrate. I happened to be able to observe it when it was served. These non-granular spots are generally in the background plane The upper appearance of , could be distinguished from the true hama dot.

第１表に抗原特異ＩｇＧおよびＩｇＡ分泌細胞算定の場合の１色および２色ＥＬ ｉＳＰＯＴ検定法間の比較をして示している。Table 1 shows 1-color and 2-color EL for antigen-specific IgG and IgA-secreting cell counting. A comparison between the iSPOT assay methods is shown.

末梢血単核細胞ＰＢＭＣは１名の志願者からインフルエンザウィルスワクチンで 免疫してから７日後に採取した。数値は４重（ｑｕａｄｒｏｐｌｉｃａｔｅ）検 定井戸のスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数として表示しである。Peripheral blood mononuclear cell PBMC were collected from one volunteer with influenza virus vaccine. The cells were collected 7 days after immunization. The numbers are quadruplicate tested. It is expressed as the number of spot-forming cells (SFC) in a fixed well.

第１表　井戸中のＳＦＣ数／　１０　’ＰＢＭＣＨＲＰ抗１ｇＧ　ＨＲＰＩｇＧ ５０８０　（６２１）　ａ　３７３０　（４７０）ＡＰ抗ＩｇＡ　３９２０　（ ４２０）　ｂＡＰ抗ＩｇＡ　３４４５　（３７６） ａは、ＨＲＰ標識抗ｒｇ抗体とＡＥＣ／Ｈ，Ｏ，色素体基質で顕色させた赤班点 数に対応する上方数値。Table 1 Number of SFC in well/10’ PBMCHRP anti-1gG HRPIgG 5080 (621) a 3730 (470) AP anti-IgA 3920 ( 420) bAP anti-IgA 3445 (376) a: Red spots developed with HRP-labeled anti-rg antibody and AEC/H,O, plastid substrate Upper numerical value corresponding to the number.

ｂは、ＡＰ標識抗Ｉｇ抗体とＢｆｊＰ／ＮＢＴ基質で顕色させた青板点数に対応 する肉太での数字で示した下方数値。b corresponds to the blue plate score developed with AP-labeled anti-Ig antibody and BfjP/NBT substrate. The lower value shown in bold numbers.

この観察により、ＡＰ　−ＢＣＩＰ／ＮＢＴ反応はそれに続＜　ＨＲＰ　−ＡＥ Ｃ／ｌ（、Ｏ，反応に何の認められる影響も与えない。さらに、いずれの酵素基 質システムの感度も、同じ抗イムノグロブリン試料をいずれの酵素で標識し使用 しても検出板点形成細胞（ＳＦＣ）の数が類似であるので匹敵していることは明 らかである。This observation shows that the AP-BCIP/NBT reaction is followed by <HRP-AE C/l (, O, has no appreciable effect on the reaction. Furthermore, neither enzyme group The sensitivity of the quality system is also determined by using the same anti-immunoglobulin sample labeled with either enzyme. However, it is clear that the numbers of platelet-forming cells (SFC) detected are similar, so they are comparable. It is clear.

この２色ＥＬＩＳＰＯＴ検定法において採用した酵素抗体の接合体の質は、二重 （インジゴ）スポットが交差反応抗体を含む接合体と共に現れ得るものとして、 注意して考えねばならない。The quality of the enzyme-antibody conjugate employed in this two-color ELISPOT assay is As (indigo) spots can appear with conjugates containing cross-reactive antibodies, You have to think carefully.

かように、単色（赤または青）班点は、興なる細胞により分泌された抗原的に異 なる生成物を検出する検定法の特異性の理想的な内部監視手段を提供する。さら に、２酵素抗体接合体は等しく特異であるが、同属のイムノグロブリンおよび／ または種々の酵素活性との結合に対し異なる親和性を示し、対応斑点の染色強度 に差をもたらすことが出来る。かような条件において、補正係数（ＨＲＰと接合 した所与の抗体で顕色させた斑点数とＡＰで標識した同じ抗体試料で顕色させた 斑点数の比）を感度における可能な差を調整するために適用すべきである。Thus, monochromatic (red or blue) spots are antigenically distinct secreted by the developing cells. provides an ideal internal monitoring means for the specificity of an assay to detect products that Sara In general, the two-enzyme-antibody conjugate is equally specific, but contains the same immunoglobulin and/or or show different affinities for binding with various enzyme activities, and the staining intensity of the corresponding spots can make a difference. Under such conditions, the correction coefficient (HRP and The number of spots developed with a given antibody and the number of spots developed with the same antibody sample labeled with AP The ratio of speckle numbers) should be applied to adjust for possible differences in sensitivity.

最適条件において、インフルエンザウィルスに対するＰＢＭＣ分泌１分泌１休Ｇ 抗びＰＢＭＣ分泌１分泌１休Ａ抗査された４人の志願者全員において同時に検出 出来た。ウィルス特異抗体分泌細胞ＡＳＣはインフルエンザウィルスワクチンで 全身免疫してから５日後にはすでに検出された。斑点形成細胞（ＳＦＣ）の数は ７日目に最高に達し、９−１２２日目でに著しく減少した（データは示していな い）、、インフルエンザウィルス特異ＩｇＧ　−ＳＦＣおよびＩｇＡ　−ＳＦＣ の反応は類似の運動パターンをとったが規模において異なった。３名の個体にお いて、ＩｇＧ−５ＦＣは優勢であった（５５２０±９８３．７日ＳＦＣ／　１０ ＠ＰＢＭＣ：１４０＋：６９，７ＥＩ　ＩｇＡＳＦＣ／１０’；ｎ＝３）、４人 目ノ志願者の場合は、７日目のインフルエンザウィルス特異１ｇＡ−５ＦＣノ反 応は非常に高＜（３９１０／１０″ＰＢＭＣｆ　４２０ＳＦＣ）　、　ＩｇＧの 反応にほぼ匹敵していた（５０８０±６２１ＳＦＣ／１０″ＰＢ間Ｃ）。Under optimal conditions, PBMC secretion 1 secretion 1 rest G against influenza virus PBMC secretion 1 secretion 1 rest A detected simultaneously in all 4 volunteers tested done. Virus-specific antibody-secreting cells ASC are used in influenza virus vaccines. It was already detected 5 days after systemic immunization. The number of speck forming cells (SFC) is It reached a maximum on day 7 and decreased significantly from days 9 to 122 (data not shown). ), Influenza virus-specific IgG-SFC and IgA-SFC The responses followed similar motor patterns but differed in magnitude. 3 individuals IgG-5FC was predominant (5520±983.7 days SFC/10 @PBMC:140+:69,7EI　IgASFC/10'; n=3), 4 people For second-year volunteers, influenza virus-specific 1gA-5FC reaction on day 7 The response is very high (3910/10″PBMCf 420SFC), IgG The response was almost comparable (5080±621 SFC/C between 10″PB).

インフルエンザウィルス特異ＩｇＡ　−ＡＳＣおよびＩｇＧ　−ＡＳＣの同時表 示検定の特異性がいくつか観察記録された。先ず、細胞を省略し、抗原を被覆し 、または標識した抗体で、続く班点の顕色を妨害した。次に、無関係の抗原（破 傷風トキソイド）を塗布した井戸内でのＰＢＭＣのメッキにより検出される班点 を無くさせた（第２表）。第３に、投与量に応じた班点形成において、段階的な 量のインフルエンザウィルス抗原とのインフルエンザウィルス免疫細胞の定温培 養を細胞のメッキ期間禁止した（第２表）。かような処理によりＳＦＣ数が減少 しただけでなく残存斑点の径も減少したことに注目すべきである。Simultaneous table of influenza virus-specific IgA-ASC and IgG-ASC Several specificities of the test were observed and recorded. First, omit the cells and coat the antigen. , or labeled antibodies to prevent subsequent development of spots. Next, unrelated antigens (destructive antigens) Spots detected by plating PBMC in wells coated with stout toxoid (Table 2). Third, in the formation of spots depending on the dose, there is a gradual Incubation of influenza virus immune cells with amounts of influenza virus antigens Nutrients were prohibited during the plating period of the cells (Table 2). Such processing reduces the number of SFCs. It should be noted that not only did the size of the remaining spots decrease, but also the diameter of the remaining spots.

対照的に、破傷風トキソイドの添加は何の効果も無かった。In contrast, addition of tetanus toxoid had no effect.

最後に、細胞定温培養以前およびその期間中に、シクロへキシミドで細胞を処理 することにより、インフルエンザウィルス特異ＩｇＧおよびＩｇＡ媒介による班 点形成が明らかに抑制された（第２表）。く二重〉　（バイオ染色）班点は全熱 観察されず、この検定における等級特定試薬として採用した酵素標識抗体試料の 特異性の高いことが確認された。Finally, treat cells with cycloheximide before and during cell incubation. Influenza virus-specific IgG and IgA-mediated infection Spot formation was clearly suppressed (Table 2). KU double〉〉　(Bio dyeing) Spots are all heat of the enzyme-labeled antibody sample used as the grade-specific reagent in this assay. It was confirmed that the specificity was high.

第２表に、インフルエンザウィルス特異ＩｇＡ分泌ＰＢＭＣおよびＩｇＧ分泌Ｐ ＢＭＣを同時に検出する２色ＥＬＩＳＰＯＴ検定法の特異性を示す。末梢血単核 細胞ＰＢＭＣは、インフルエンザウィルスワクチンで免疫してから７日目に一人 の供与から得た。ＰＢＭＣは、ウィルス分泌ＡＳＣの数を算定する２色ＥＬＩＳ ＰＯＴ検定法により検定した。Table 2 shows influenza virus-specific IgA-secreting PBMCs and IgG-secreting PMCs. The specificity of the two-color ELISPOT assay for simultaneous detection of BMC is demonstrated. peripheral blood mononuclear Cellular PBMC were isolated on day 7 after immunization with influenza virus vaccine. Obtained from the donation of PBMC was analyzed using two-color ELIS to calculate the number of virus-secreting ASCs. It was tested using the POT assay method.

ＩｇＧ　−ＳＦＣおよびＩｇＡ　−ＳＦＣはＡＰ接合抗１ｇＧおよびＨＲＰ接合 抗ＩｇＡ、次にＢＣＩＰ／ＮＥＴ　（青）およびＡＥＣ／Ｈ，Ｏ，（赤）の酵素 基質でそれぞれ顕色させた。IgG-SFC and IgA-SFC are AP-conjugated anti-1gG and HRP-conjugated Anti-IgA, then BCIP/NET (blue) and AEC/H,O, (red) enzymes Each was developed using a substrate.

数値は、４重検定井戸／１０’ＰＢＭＣの平均ＳＦＣ数を示す。括弧内のデータ は抑制パーセンテージを示す。Numbers indicate average SFC counts of quadruplicate assay wells/10'PBMC. Data in parentheses indicates the inhibition percentage.

第２表 １５μｇ　１２０（９８％）　０（１００％）３μｇ　１４００（７９％）　４ ５　（８０％）０．６μｇ　２７２０（５９％）　９６　（５７％）０、１２　 μｇ　３８４０　（４２％）　２４０（−１１％）破傷風トキソイド ＋００　ＡＬｇ　６１２０（６，７％）　＋９７（１０，４％）シロへキシミド ＊ ２ｘｌＯ−”Ｍ　７２０（８９％）　２０（９１％）１０−’　Ｍ　２０００　 （６９，５％）　７０　（６８，２％）５ｘｌＯ−’Ｍ　２９６０（５４，８％ ）　１００（５４，５）＊シロへキシミドで処理しても細胞の成育可能性に影響 しないことが、３つの試験薬濃度の全てにおいて（トリバンブルー色素排除試験 で）確かめられた。Table 2 15 μg 120 (98%) 0 (100%) 3 μg 1400 (79%) 4 5 (80%) 0.6 μg 2720 (59%) 96 (57%) 0, 12 μg 3840 (42%) 240 (-11%) Tetanus toxoid +00 ALg 6120 (6,7%) +97 (10,4%) Cyloheximide * 2xlO-”M 720 (89%) 20 (91%) 10-’ M 2000 (69,5%) 70 (68,2%) 5xlO-’M 2960 (54,8% ) 100 (54,5) *Treatment with ciloheximide does not affect cell growth potential was found to not occur at all three test drug concentrations (triban blue dye exclusion test). ) was confirmed.

予備比較試験において、この発明による方法が、プラスチック表面で実施しＮＢ Ｔで増幅したＢＣＩＰ　（ＡＰシステム）または寒天（ＨＲＰシステム）中のバ ラフェニルジアミン／Ｈ，○、のいずれかで顕色させた原ＥＬｒＳＰＯＴ技法に 比べ感度が少なくとも５倍高いことが明らかとなった。本ＥＬｒＳＰＯＴ検定法 におけるニトロセルローズ膜の高い結合特性と保持特性が、最近紹介されている が（雑誌く免疫学的方法）　１９８５．７９．１９５　：　Ｍｏ１ｌｅｒおよび Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ（試験管内で抗体分泌細胞を検出するためのフィルター免 疫悪疫検定法〉原波法が比較的多量の塗布材を要するのを、最小量にまで節約出 来る。さらに、この改良技法は、ゲルのオーバーレイの使用に頼ることがなく、 プラスチック表面における特定のベルオキシダーゼクロモーゲンに注意しなくて すむので簡易になる。Preliminary comparative tests showed that the method according to the invention was performed on plastic surfaces and BCIP amplified with T (AP system) or buffer in agar (HRP system) Original ELrSPOT technique developed with raphenyldiamine/H, ○, It was revealed that the sensitivity was at least 5 times higher than that of the conventional method. This ELrSPOT test method The high binding and retention properties of nitrocellulose membranes in (Magazine Immunological Methods) 1985.79.195: Moller and Borrebaeck (filter immunology for detecting antibody-secreting cells in vitro) Epidemic testing method〉The original wave method, which requires a relatively large amount of coating material, can be reduced to the minimum amount. come. Additionally, this improved technique does not rely on the use of gel overlays; Be careful with certain peroxidase chromogens on plastic surfaces. It's easier because it's easier.

本発明による方法が、ヒトおよびマウスのいずれのシステムにおいても、他の１ ｇアイソタイプ（ｒｇＭ、ＩｇＧ亜網）を分泌する複数の細胞を同時に検出する 能力があることが確かめられた。この方法は、例えば、リンフ才力イン分泌細胞 のような他のタイプの抗体を生産する細胞の検出、抗原、即ちウィルス自体また はその部分の検出、抗体および抗原の同時検出にも適用出来る。検出される抗体 または抗原は真核細胞、バクテリア、ウィルスまたは寄生菌を起点とするもので ある。The method according to the invention can be used in both human and mouse systems. Simultaneously detect multiple cells secreting g isotypes (rgM, IgG subgroup) It was confirmed that he was capable. This method can be used, for example, in lymphoid secretory cells. Detection of cells producing other types of antibodies such as antigens, i.e. the virus itself or can also be applied to the detection of that part and the simultaneous detection of antibodies and antigens. Antibodies detected or the antigen is of eukaryotic, bacterial, viral or parasitic origin. be.

さらに、例えば、シルバー・イムノゴールド（雑誌く免疫学的方法）１９８７， １０４．２８１　：　ＷａｌｋｅｒおよびＤａｖｅ　（イムノゴールド／シルバ ー染色を用いる抗体分泌細胞の迅速で感度の高い算定〉）のような視覚化システ ムを、多数の免疫反応物質の同時検出にも適用出来る。それにより、二つまたは それ以上の抗原的に明らかに別な生成物が同一または異なる細胞から発生するか 否かを調べることが可能であろう。Furthermore, for example, Silver Immunogold (Magazine Immunological Methods) 1987, 104.281: Walker and Dave (Immunogold/Silva Visualization systems such as - rapid and sensitive enumeration of antibody-secreting cells using staining The system can also be applied to the simultaneous detection of multiple immunoreactive substances. Thereby two or whether further antigenically distinct products arise from the same or different cells; It would be possible to check whether this is the case.

例えば担体に結合した抗原または抗体（抗原を検出する場合）のような受容体は 、検出する異なるタイプの抗体または抗原と反応する１つのシングルタイプであ ってよい。受容体はまた検出する抗体および／または抗原の各１つのタイプと反 応する異なるタイプであってもよい。固体担体は、２枚の対抗するプレートより なり、１つのタイプの抗原または抗体が片方のプレートに結合し、もう１つのタ イプの抗原または抗体が他方の対抗プレートに結合し、細胞懸濁液をプレートの 間に入れる。このようにして、いくつかのタイプの抗原または抗体を同時に検出 することが出来る。例えばホルモンのような特定物質の場合は、これらの物質は 固体担体に直接結合出来るので、固体担体は抗原または抗体を結合させなくても よく、例えば、ニトロセルローズ、ナイロンまたはポリビニール等の本質的に結 合特性を有する材料で製作してよい。For example, a receptor such as an antigen or an antibody (when detecting an antigen) bound to a carrier is , one single type that reacts with different types of antibodies or antigens to be detected. That's fine. The receptor also reacts with each one type of antibody and/or antigen to be detected. It may be of a different type depending on the type. The solid support is separated by two opposing plates. one type of antigen or antibody binds to one plate and the other type of antigen or antibody binds to the other plate. antigen or antibody from one plate binds to the other counterplate and transfers the cell suspension from one plate to the other. Put it in between. In this way, several types of antigens or antibodies can be detected simultaneously You can. For example, in the case of specific substances such as hormones, these substances It can be directly attached to a solid support, so the solid support does not need to be bound to an antigen or antibody. Often, an inherently non-binding material such as nitrocellulose, nylon or polyvinyl It may be made of materials with compatible properties.

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）コウゲン　ドウジ　ケ ンシュラ　ネウ木つまたは抗原を同時に検出する方法 ヴアーレルストラーセ　４３ 国　籍　スイス 正された　許ｒ　の （１）細胞懸濁液を固相免疫吸着剤に接触させて培養し、その後または同時に、 検出する抗体または抗原を指向して結合する能力を有する他の抗体を加え、他の 抗体に問題の抗体また抗原を検出するために指示物質と反応する酵素を具備させ 、該指示物質は個体細胞より分泌および／または放出され固相に結合した抗体及 び／または抗原のゾーンに対応する色班点を現像後発生させる染色効果を有し、 該班点は最終段階において計数評価し、各班点は抗体および／または抗原を分泌 する単一細胞に対応している、ＥＬＩＳＰＯＴ技術による個体細胞より分泌およ び／または放出された抗体及び／または抗原を検出する方法において、細胞懸濁 液を固相免疫吸着剤に加え、その後または同時に、少なくとも２つのタイプの前 記の他の抗体を加え、該他の抗体の各タイプは少なくとも２つの抗原的に異なる タイプの検出すべき抗体の１つのタイプ或は１つのタイプのみと結合し得、前記 の他の抗体を異なる酵素で標識することと、培養し免疫吸着剤を洗浄後、第１の 指示物質を加えて可能な色班点を顕色させることと、免疫吸着剤を洗浄後、第１ の指示物質と比較し染色効果の異なる第２の指示物質を加えて可能な色班点を顕 色させることと、免疫吸着剤を洗浄後、染色効果が互いに異なり、第１および第 ２の指示物質とも異なるさらなる指示物質を可能な限り繰り返し加え、個体細胞 が分泌および／または放出した異な村イブの抗体および／または抗原を細組の免 疫吸着剤上に発現した異なる色の班点を計数評価することにより同時に検出する ことを特徴とする検出方法。Copy and translation of written amendment) Submission (Article 184-8 of the Patent Law) Method for simultaneously detecting neutrophils and antigens Wahlerstrasse 43 Nationality Switzerland corrected permission (1) Cultivate the cell suspension by contacting it with a solid-phase immunoadsorbent, and then or simultaneously, Add the antibody to be detected or other antibody that has the ability to target and bind to the antigen; The antibody is equipped with an enzyme that reacts with an indicator to detect the antibody or antigen in question. , the indicator is secreted and/or released from individual cells and bound to a solid phase, such as an antibody or and/or has a staining effect that causes colored spots to appear after development, corresponding to the antigen zones; The spots are counted and evaluated in the final stage, and each spot secretes antibodies and/or antigens. secretion and secretion from individual cells using ELISPOT technology, which is compatible with single cells. In the method of detecting released antibodies and/or antigens, a cell suspension is solution to the solid-phase immunoadsorbent and then or simultaneously add at least two types of and each type of other antibody has at least two antigenically different types. type of antibody to be detected, or only one type of the antibody to be detected; After labeling other antibodies with different enzymes and incubating and washing the immunoadsorbent, the first After adding an indicator to develop possible color spots and washing the immunoadsorbent, the first By adding a second indicator with a different dyeing effect compared to the previous indicator, possible colored spots are revealed. After coloring and washing the immunoadsorbent, the staining effects are different from each other, and the first and second A further indicator different from the indicator 2 is added as many times as possible to transform individual cells. The antibodies and/or antigens of different antibodies secreted and/or released by Simultaneous detection by counting and evaluating speckles of different colors that appear on the adsorbent. A detection method characterized by:

（２）前記の固相免疫吸着剤が前記の結合した被検出抗体および／または抗原に 対応する抗体および／または抗原を有することを特徴とする請求項の第１項に記 載の方法。(2) The solid-phase immunoadsorbent is attached to the bound antibody and/or antigen to be detected. According to claim 1, characterized in that it has a corresponding antibody and/or antigen. How to put it on.

（３）前記の固相免疫吸着剤に結合した前記の抗体および／または抗原が、少な くとも２つの被検出抗体および／または抗原と反応する能力を有する単一タイプ であることを特徴とする請求項の第２項に記載の方法。(3) The antibody and/or antigen bound to the solid-phase immunoadsorbent is A single type that has the ability to react with at least two detected antibodies and/or antigens A method according to claim 2, characterized in that:

（４）前記の固相免疫吸着剤に結合した前記の抗体および／または抗原が、最低 ２つのタイプの被検出抗体および／または抗原の１つまたは１つだけのタイプと 反応する能力を有する異なるタイプであることを特徴とする請求項の第２項に記 載の方法。(4) The antibody and/or antigen bound to the solid phase immunoadsorbent is at least one or only one type of two types of antibodies and/or antigens to be detected; according to claim 2, characterized in that they are of different types having the ability to react. How to put it on.

（５）同一または異なるタイプの前記の抗体および／または抗原を２個の固相免 疫吸着剤の対抗面に結合し、細胞懸濁液を２個の固相免疫吸着剤間に挾んだこと を特徴とする請求項の第２項に記載の方法。(5) Using the same or different types of the above antibodies and/or antigens on two solid-phase solid-phase immunosorbents, and the cell suspension was sandwiched between two solid-phase immunosorbents. A method according to claim 2, characterized in that:

（６）前記の固相免疫吸着剤が固有の結合特性を有しており、例えば、ニトロセ ルローズ、ナイロンおよびポリビニールのグループから選択された材料製である ことを特徴とする請求項の第１項に記載の方法。(6) The solid-phase immunoadsorbent has unique binding properties, such as nitrocellulose Made of material selected from the group of lurose, nylon and polyvinyl A method according to claim 1, characterized in that:

（７）アルカリ性ホスファターゼとホースラデイシュ・ペロオキシダーゼでそれ ぞれ標識した抗体と対応するクロモーゲン基質を指示システムとして使用したこ とを特徴とする請求項の第１項乃至第６項のいずれかに記載の方法。(7) Alkaline phosphatase and horseradish peroxidase Using individually labeled antibodies and the corresponding chromogen substrate as an indicator system, A method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that:

（８）前記のクロモーゲン基質が５−ブロム−４−クロロ−３−インドリル・リ ン酸トルイジン塩とｐ−ニドコブル−テトラゾリウム塩化物（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ ）と３−アミノ−９−エチル・カルバゾール（ＡＥＣ）より成ることを特徴とす る請求項の第７項に記載の方法。(8) The chromogen substrate is 5-bromo-4-chloro-3-indolyl toluidine salt and p-nidocoblu-tetrazolium chloride (BCIP/NBT) ) and 3-amino-9-ethyl carbazole (AEC). 8. The method according to claim 7.

（９）前記の被検出抗体が抗原的に異なるタイプのＩｇ−抗体であることを特徴 とする請求項の第１乃至第８項のいずれかに記載の方法。(9) The antibody to be detected is an antigenically different type of Ig-antibody. The method according to any one of claims 1 to 8.

（１０）前記の被検出抗体が真核細胞、バクテリア、ウィルスおよび寄生菌を起 点とする生成物より成ることを特徴とする請求項の第１項乃至第９項のいずれか に記載の方法。(10) The antibody to be detected causes eukaryotic cells, bacteria, viruses, and parasitic fungi. Any one of claims 1 to 9, characterized in that the product consists of The method described in.

国際調査報告 １ｍｍ″″幻−０１“ゞ”＝　ＰＣＴ／ＳＥ　８９１００５６５国際調査報告 ＰＣＴ／ＳＥ　８９１００５６５international search report 1mm″″phantom-01″ゞ=　PCT/SE　89100565 International Search Report PCT/SE 89100565

Claims (10)

【特許請求の範囲】[Claims] （１）細胞懸濁液を固体キャリアに接触させ、その後または同時に、検出する抗 体または抗原を指向し結合する能力を有する他の抗体を加え、他の抗体に問題の 抗体または抗原を検出するために指示物質と反応する酵素を具備させた、個体細 胞より分泌および／または放出される抗体及び／または抗原を検出する方法にお いて、少なくとも２つのタイプの前記の他の抗体を少なくとも２つのタイプの検 出する抗体に向けて追加し、前記の他の抗体に異なる酵素を具備させ、異なる染 色効果を有する指示物質を対応量加え、固体キャリアに残る個別の色の班点を評 価することにより異なるタイプの抗体および／または抗原を同時に検出すること を特徴とする個体細胞より分泌および／または放出される抗体及び／または抗原 を検出する方法。(1) Contact the cell suspension with a solid carrier, and then or simultaneously, Add other antibodies that have the ability to target and bind to the body or antigen; Individual cells equipped with enzymes that react with indicator substances to detect antibodies or antigens. A method for detecting antibodies and/or antigens secreted and/or released from cells. and at least two types of said other antibodies are tested for at least two types of said other antibodies. The other antibodies mentioned above are equipped with different enzymes and different stains. Add a corresponding amount of an indicator substance with a color effect and evaluate the individual color specks remaining on the solid carrier. Detecting different types of antibodies and/or antigens simultaneously by Antibodies and/or antigens secreted and/or released from individual cells characterized by How to detect. （２）前記の固体キャリアが前記の結合し検出される抗体および／または抗原に 対応する抗体および／または抗原を有することを特徴とする請求項の第１項に記 載の方法。(2) The solid carrier binds to the antibody and/or antigen to be detected. According to claim 1, characterized in that it has a corresponding antibody and/or antigen. How to put it on. （３）前記の固体キャリアに結合した前記の抗体および／または抗原が、検出さ れる異なる抗体および／または抗原と反応する能力を有する１つのシングルタイ プであることを特徴とする請求項の第２項に記載の方法。(3) The antibody and/or antigen bound to the solid carrier is detected. One single titer with the ability to react with different antibodies and/or antigens 3. A method according to claim 2, characterized in that the method comprises: （４）前記の固体キャリアに結合した前記の抗体および／または抗原が、検出さ れる抗体および／または抗原のそれぞれ１つのタイプと反応する能力を有する異 なるタイプであることを特徴とする請求項の第２項に記載の方法。(4) The antibody and/or antigen bound to the solid carrier is detected. different types of antibodies and/or antigens that have the ability to react with each type of antibody and/or antigen 3. A method according to claim 2, characterized in that the method is of the type: （５）同一または異なるタイプの前記の抗体および／または抗原を２個の固体キ ャリアの対抗面に結合し、細胞懸濁液を２個のキャリアの間に挾んだことを特徴 とする請求項の第２項に記載の方法。(5) The above-mentioned antibodies and/or antigens of the same or different types are added to two solid molds. The cell suspension is bonded to opposing surfaces of carriers, and the cell suspension is sandwiched between the two carriers. The method according to claim 2. （６）前記の固体キャリアが固有の結合特性を有しており、例えば、ニトロセル ローズ、ナイロンおよびポリビニールのグループから選択された材料製であるこ とを特徴とする請求項の第１項に記載の方法。(6) the solid carrier has unique binding properties, such as nitrocell; Made of material selected from the group of rosewood, nylon and polyvinyl A method according to claim 1, characterized in that: （７）アルカリ性ホスファターゼとホースラディシュ・ペロオキシダーゼでそれ ぞれ標識した抗体と対応するクロモーゲン基質を指示システムとして使用したこ とを特徴とする請求項の第１項乃至第６項のいずれかに記載の方法。(7) Alkaline phosphatase and horseradish peroxidase Using individually labeled antibodies and the corresponding chromogen substrate as an indicator system, A method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that: （８）前記のクロモーゲン基質が５−ブロム−４−クロロ−３−インドリル・リ ン酸トルイジン塩とｐ−ニトロプル−テトラゾリウム塩化物（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ ）と３−アミノ−９−エチル−カルバゾールより成ることを特徴とする請求項の 第７項に記載の方法。(8) The chromogen substrate is 5-bromo-4-chloro-3-indolyl Toluidine acid salt and p-nitropuru-tetrazolium chloride (BCIP/NBT ) and 3-amino-9-ethyl-carbazole. The method described in paragraph 7. （９）前記の検出する抗体が異なるタイプのＩｇ−抗体であることを特徴とする 請求項の第１項乃至第８項のいずれかに記載の方法。(9) The antibody to be detected is a different type of Ig-antibody. A method according to any one of claims 1 to 8. （１０）前記の検出する抗体が真核細胞、バクテリア、ウイルスおよび寄生菌を 起点とする生成物より成ることを特徴とする請求項の第１項乃至第９項のいずれ かに記載の方法。(10) The above-mentioned detecting antibody detects eukaryotic cells, bacteria, viruses, and parasitic fungi. Any one of claims 1 to 9, characterized in that it consists of a product starting from Method described in Crab.