JPH05502219A - Stable therapeutic radionuclides and methods of preparing them - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.
Description
【発明の詳細な説明】 安定な治療用放射性核種およびそれを調製する方法発明の技術分野 本発明は、一般に安定な治療用（ｓｔａｂｌｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）放射 性核種−標識組成物に、およびその調製およびその安定化方法に放射線標識組成 物は医学診断および治療において重要な道具である。この組成物は深い静脈血栓 の診断、リンパ節病理学の研究、および新生物の検出、期（ｓｔａｇｉｎｇ）お よび処理を包含する多くの技術に用いられている。インビボ診断または治療適用 についての放射線標識組成物を用いる場合には、放射性核種標的組織に選択的に 局在することが重要である。それ故、一般に、放射性核種か標的剤（ｔａｒｇｅ ｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）に結合して、興味ある特定の細胞または組織により選 択的に結合または吸着させる。[Detailed description of the invention] STABLE THERAPEUTIC RADIONUCLIDE AND METHODS FOR PREPARING THE SAME FIELD OF THE INVENTION The invention generally relates to stable therapeutic radiation. radionuclide-labeled compositions and methods of their preparation and stabilization; objects are important tools in medical diagnosis and treatment. This composition is effective against deep vein thrombosis diagnosis, lymph node pathology studies, and neoplasm detection, staging and It is used in a number of technologies involving reading and processing. In vivo diagnostic or therapeutic applications When using a radiolabeled composition for selectively targeting the radionuclide target tissue, Localization is important. Therefore, generally either the radionuclide or the target agent ting agents) to be selected by specific cells or tissues of interest. selectively bind or adsorb.
一般的に、放射性核種はキレート化剤に結合し、キレート化剤は標的部分（ｔａ ｒｇｅｔｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）に結合して標的細胞または組織の特異集団に選 択的に結合することのできる放射線標識組成物を生成する。Generally, the radionuclide is bound to a chelating agent, and the chelating agent is attached to a targeting moiety (ta). binding to specific populations of target cells or tissues. A radiolabeled composition is produced that is capable of selectively binding.
＊ ＊ ｖａ Ｔ ｃ 、 Ｉコ１ ■、１２コ Ｉ、 Ｉ Ｉ ７ ｍ Ｓｎ 、 ｌ１ｌ（ｎ 、 ＩＩコＩｎ ｓ ｇ７Ｒｕ、７１Ｂｒ、）７Ｂｒ、２１ｐ ｌ、 、＋１）’、 ＠７Ｇａ、 ＊＊Ｚｒおよび＠４ｃｕのような放射性核種 は診断画像化剤（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｉｍａｇｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）とし て用いるのに提案されている。＊ Ｉ ｍＴ ｃは特に有望な１種の診断画像化 剤である。テクネチウム−９９ｍは、生理食塩水をモリブデン含有マトリックス を介して溶離することによって発生器において工業的に作られている。かかる溶 出液において、準安定性テクネチウム同位体は化学的に安定な酸化過テクネチウ ム酸塩形態９９°ＴｃＯ，−で確められている。過テクネチウム酸塩９９ ｍ ’［’ｃは＋７の原子価状態を有しているために、放射性核種組織画像化のため のもっとも一般的に使用されているキャリヤーと複合しない。それ故、 Ｉ ９ ａ Ｔｃ ０４−は、 ′＠“ＴｃＯａ−等優性食塩水と第一錫、第一鉄およ び第一クロム塩のようなテクネチウム還元体および硫酸および塩化水素酸のよう な酸とを混合することによって、 ９９“ＴｃＯ”＋および９９ ｍ Ｔ ｃ Ｏ□“のような低い酸化状態に、一般に還元される。* va Tc, I 1 ■, 12 I, I 7 m Sn , l1l (n, II Ko Ins g7Ru, 71Br,)7Br, 21p Radionuclides such as l, , +1)', @7Ga, **Zr and @4cu are diagnostic imaging agents. It has been proposed for use in *ImTc is a particularly promising type of diagnostic imaging It is a drug. Technetium-99m converts physiological saline into a molybdenum-containing matrix. is produced industrially in a generator by elution through a Such melting In the exudate, the metastable technetium isotope is replaced by the chemically stable technetium peroxide. The mate salt form 99°TcO,- has been identified. Pertechnetate 99m '['c has a valence state of +7, so it is suitable for radionuclide tissue imaging. Not compatible with most commonly used carriers. Therefore, I9 a Tc 04- is ′@“TcOa- isodominant saline and ferrous, ferrous and and technetium reductants such as chromous salts and sulfuric and hydrochloric acids. 99 “TcO” + and 99 m Tc It is generally reduced to a lower oxidation state such as O□“.
２Ｐおよび＋３１１のような治療用（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）放射性核種は真 性赤血球増加性および転移性（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ）甲状腺がん腫のような悪 性腫瘍の治療に用いられている。多くの放射性核種は、α−エミッター（ｅｍｉ ｔｔｅｒｓ）、低い、中間のおよび高い範囲のβ−エミッター、および電子捕獲 および／または内部転移（オージェを子）を介して作用する放射性核種を包含す る治療適用に用いられている。 ２１１ Ａ ｔのようなα−エミッター源は比 較的に限られているけｎども、β−源ははるかに多い。４７ｓｃ、＠７ｃｕ、１ ３１■、＋５２５ｍ、 ＩＱＱｐｄ 、１０５Ｒｈおよびｌ＠ａＲｅを包含する 多くの中間範囲のβ−源は治療適用に提案されている。１３１１は抗体−指向治 療（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｙ）にしばしば用いら れているが、しかし放射した多量の高エネルギーγ−線および脱ハロゲン化のた めに高い非標的毒性を受ける。 １３１１治療用組成物の脱ハロゲン化に関連し た関係は、欧州公告特許第０２０３．７６４号明細書に記載されているようにバ ラ−ヨードフェニル部分の付着によって実質的に減少されている。治療投与に潜 在的に適当な広い範囲のβ−粒子源は２２Ｐ、ｓｏｙおよび１１１１７ｅを含ん ている。また、１８＄１１７ｅおよび１■Ｒｅは、普通のγ−カメラ器機を用い て容易に監視するレニウム放射性薬品の生物分配を与える９９“Ｔｃのγ−放射 と実質的に同じエネルギーでγ−線を放射する。Therapeutic radionuclides such as 2P and +311 are true Diseases such as polycythemia and metastatic thyroid carcinoma It is used to treat sexual tumors. Many radionuclides have α-emitters (emi tters), low, mid and high range β-emitters, and electron capture and/or radionuclides that act via internal transfer It is used for therapeutic applications. α-emitter sources such as 211At are Although relatively limited, β-sources are much more numerous. 47sc, @7cu, 1 Includes 31■, +525m, IQQpd, 105Rh and l@aRe A number of mid-range β-sources have been proposed for therapeutic applications. 1311 is an antibody-directed therapy often used in antibody-directed therapy However, due to the large amount of high-energy γ-rays emitted and dehalogenation, suffer from high non-target toxicity. 1311 Relating to dehalogenation of therapeutic compositions The relationship between the It is substantially reduced by the attachment of the rayodophenyl moiety. treatment administration A wide range of currently suitable β-particle sources include 22P, soy and 11117e. ing. Also, 18$117e and 1■Re use ordinary γ-camera equipment. The gamma-emission of 99"Tc provides biodistribution of rhenium radiopharmaceuticals that is easily monitored. emits γ-rays with substantially the same energy as
β−放射する（ｂｅｔａ ｅｍｉｔｔｉｎｇ）放射性核種を含む治療用組成物は 調製中およびインビトロ貯蔵中に放射分解を受ける。放射分解中、放射性核種か らの放射は分子間−および分子内−分解を生ずる錯体または化合物、または近似 の他の化合物の他の成分を侵す。放射性核種キレート、放射性核種キレート標的 剤結合、または標的剤の特異性付与部分の分解または破壊は非標的放射能を生ず るから、放射線分解崩壊は重大な安全関係を提起する。機能標的剤に結合しない 放射能は非標的組織に蓄積し、および投与前または投与中における放射性核種組 成物の分解は標的ポテンシャルを著しく低下し、このために治療用放射性核種組 成物の毒性を高めることになる。特に、インビボ投与に試みる治療用の放射性核 種調剤に関して、放射性部分を標的部分に安定して結合し、標的剤の特異性を保 護することか重要である。A therapeutic composition comprising a beta-emitting radionuclide undergoes radiolysis during preparation and in vitro storage. Radionuclide during radiolysis? The radiation of attack other components of other compounds. radionuclide chelate, radionuclide chelate target Agent binding, or degradation or destruction of the specificity-conferring moiety of the targeting agent, does not result in non-targeted radioactivity. Therefore, radiolytic decay poses important safety concerns. Does not bind to functional targeting agents Radioactivity accumulates in non-target tissues and radionuclide concentrations before or during administration. Degradation of the components significantly reduces the target potential, which makes it difficult to use therapeutic radionuclide compositions. This will increase the toxicity of the product. In particular, therapeutic radionuclides attempted for in vivo administration. For seed preparations, the radioactive moiety is stably bound to the targeting moiety and the specificity of the targeting agent is maintained. It is important to protect them.
９９′″Ｔｃ、および１Ｉ１６Ｒｅおよびｌｌ５Ｒｅを含む放射性レニウムは■ Ａ族同族体である。レニウムおよびテクネチウムは大きさ、形状、双極子モーメ ント、形式電荷、イオン移動度、親油性などのような多くの物理的特性を共有し ている。例えば、９９ ｍ７ ｃについて開発されたおよび／または使用された 多くのキレート化剤はレニウム放射性核種と用いるのに適当である。しかしなが ら、レニウム放射性核種を含む研究は、まだ比較的予備段階であることから放射 性レニウム治療組成物の特性についてあまり知られていない。高酸化状態に移動 する低酸化状悪の不安定なレニウム錯体の結果として形成する過レニウム酸塩（ Ｒｅ０４− ）はレニウム放射性核種組成物の一次分解生成物である。99'''Tc, and radioactive rhenium containing 1I16Re and ll5Re are ■ It is a group A congener. Rhenium and technetium are large in size, shape, and dipolar share many physical properties such as concentration, formal charge, ionic mobility, lipophilicity, etc. ing. For example, developed and/or used for 99m7c Many chelating agents are suitable for use with rhenium radionuclides. But long Since research involving rhenium radionuclides is still at a relatively preliminary stage, Less is known about the properties of rhenium therapeutic compositions. Move to high oxidation state perrhenate salts (which form as a result of unstable rhenium complexes in low oxide form) Re04-) is a primary decomposition product of the rhenium radionuclide composition.
Ｅ、 Ｄｅｕｔｓｃｈ氏らによる［治療および診断核医学におけるレニウムおよ びテクネチウム元素の同位体の使用に関するレニウムおよびテクネチウムの化学 」と題する文献、ｒ Ｎｕｃｌ、 Ｍｅｄ。E., Deutsch et al. [Rhenium and Diagnostic Nuclear Medicine] Chemistry of rhenium and technetium with respect to the use of isotopes of the element technetium ”, Nucl, Med.
Ｂｉｏｌ、 Ｊ Ｖｏｌ、 １３． Ｎｏ、 ４ 、４６５〜４７７ （１９８ ６）ｌ：は、テクネチウムおよびレニウム放射性核種の比較特性、および治療お よび診断核医学についての適用について記載されている。テクネチウムおよびレ ニウムはいずれもレドックス化学的性質を示し、過テクネチウム酸塩および過レ ニウム酸塩のそれぞれはキレート化剤との化学反応の前に低酸化状態に転換する 必要かある。レニウムの化学的性質はテクネチウムの性質と異なるが、しかしな がらレニウム放射性薬品の開発はしばしば９Ｑ″″Ｔｃ放射性薬品の既知の化学 的および生物学的挙動において断定することができない。極めて関連する化学的 相違点は、レニウム錯体が、過レニウム酸塩の形態において、テクネチウム類似 体より高酸化状態で熱力学的に極めて安定であることである。それ故、レニウム 組成物はそのテクネチウム類似体より還元し難く、および還元レニウム放射性薬 品は類似のテクネチウム放射性薬品より極めて容易に過レニウム酸塩に後方に再 酸化する傾向かあり、還元レニウム放射性薬品は過テクネチウム酸塩に後方に再 酸化する。Biol, J Vol, 13. No, 4, 465-477 (198 6) l: Comparative properties of technetium and rhenium radionuclides, and therapeutic and Applications for nuclear medicine and diagnostic nuclear medicine are described. Technetium and Les Both Ni exhibit redox chemistry and pertechnetate and pertechnetate. Each of the nitrates is converted to a lower oxidation state prior to chemical reaction with the chelating agent. Is it necessary? The chemical properties of rhenium are different from those of technetium, but The development of rhenium radiopharmaceuticals is often based on the known chemistry of 9Q''Tc radiopharmaceuticals. It is not possible to make any conclusions regarding the physical and biological behavior. very relevant chemical The difference is that the rhenium complex is similar to technetium in the perrhenate form. It is thermodynamically extremely stable in a higher oxidation state than the body. Therefore, rhenium The composition is less reducible than its technetium analogs and is a reduced rhenium radiopharmaceutical. The product regenerates backwards into perrhenate much more easily than similar technetium radiopharmaceuticals. Due to its tendency to oxidize, reduced rhenium radiopharmaceuticals are recycled backwards into pertechnetate. Oxidize.
Ｄｅｕｔｓｃｈ氏らにより、 ”’Ｒｅ（Ｓｎ）−ＨＥＤＰ （ＨＥＤＰ＝（１ −ヒドロキシエチルインデン）ジホスホネートおよび（’ ”Ｒｅ（ＤＭＰＥ） ｚ）“、ＣＤＭＰＥ＝１．２−ビス（ジメチルホスフィノ）エタン〕を包含する ＊ ＊ ＠ＴｃＴｃ骨素探索ｏｎｅ−ｓｅｅｋｉｎｇ）用放射性薬品のレニウム 放射性核種類似体を調製している。これらの共役体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）に おいて、放射性核種は無機ジホスホン酸塩標的剤に直接に結合する。研究者はレ ニウム製剤の特性およびそのインビボ生物分配を相当する９ ９ ｖａ Ｔ ｃ 類似体と比較している。レニウム錯体の過レニウム酸塩への分解はテクネチウム 類似体の過テクネチウム酸塩への分解よりはるかに優勢であった。過レニウム酸 塩の存在は最初の合成における過レニウム酸塩の不完全還元、付随的酸素による レニウム錯体の過レニウム酸塩の再酸化、およびレニウム放射性核種錯体の不均 化に帰因した。Ｄｅｕｔｓｃｈ氏らは、レニウム放射性核種調剤のクロマトグラ フ精製が満足な純度レベルを得るのに必要であることを見出している。アスコル ビン酸を酸化防止剤として用いるのに提案されたが、しかし精製調剤は嫌気処理 を必要とし、発生後、できるたけ速やく用いるようにしている。Ｄｅｕｔｓｃｈ 氏らは、準安定な骨かんの診断に用いた０ｓ″Ｔｃ（Ｓｎ） −ＨＥＤＰ放射性 医薬品に類似する骨への転移かんの軽減治療における”’Ｒｅ（Ｓｎ）−ＨＥＤ Ｐ放射性医薬品の好結果の展開はレニウム放射性核種のレドックス特性を制御す る能力に影響することを確めている。Deutsch et al., “’Re(Sn)-HEDP (HEDP=(1 -Hydroxyethylindene)diphosphonate and (’”Re(DMPE) z) “, CDMPE=1,2-bis(dimethylphosphino)ethane] ＊ ＊ ＠Tc Rhenium, a radioactive drug for Tc bone searching (one-seeking) Radionuclide analogues are being prepared. These conjugates In this case, the radionuclide binds directly to the inorganic diphosphonate targeting agent. The researcher 99 va Tc corresponding to the properties of the Nium formulation and its in vivo biodistribution Comparing with analogues. The decomposition of rhenium complexes to perrhenate is performed using technetium. It was far more dominant than the analogue's degradation to pertechnetate. perrhenic acid The presence of the salt is due to incomplete reduction of perrhenate in the initial synthesis, with incidental oxygen. Reoxidation of perrhenate of rhenium complexes and disproportionality of rhenium radionuclide complexes It was attributed to Deutsch et al. chromatographed rhenium radionuclide preparations. We have found that further purification is necessary to obtain satisfactory purity levels. Ascol Vic acid has been proposed to be used as an antioxidant, but the purified preparation must be treated anaerobically. This is necessary and should be used as soon as possible after the occurrence. Deutsch et al. used 0s″Tc(Sn)-HEDP radioactivity for diagnosis of metastable bone bones. 'Re(Sn)-HED in the alleviation treatment of bone metastasis similar to pharmaceuticals The successful development of P radiopharmaceuticals depends on controlling the redox properties of the rhenium radionuclide. It has been confirmed that it affects the ability to
治療用放射性核種の安定化は治療用の放射性核種共役体の分野に繰り返し挑戦さ れている。一般に、放射性組成物の安定化は、他の構造的に類似する化学組成物 の安定化より所望とする特性を失なわないで達成することが極めて困難である。Stabilization of therapeutic radionuclides has been a recurring challenge in the field of therapeutic radionuclide conjugates. It is. Generally, stabilization of radioactive compositions is achieved by stabilizing radioactive compositions with other structurally similar chemical compositions. It is extremely difficult to achieve stabilization without losing the desired properties.
治療用放射性核種組成物は診断用の放射性核種組成物と異なる挙動をし、かつ一 般に安定性が乏しい。Therapeutic radionuclide compositions behave differently than diagnostic radionuclide compositions, and Generally, stability is poor.
治療用放射性核種組成物の分解は、一般に速やがてあり、臨床用の放射性核種製 剤は投与の直前に調製されている。この事は、治療の容易さか実験容易さを有し ており、および当業技術者か放射性核種をキレート化し、かつ放射性核種を標的 部分に共役することを含む放射性材料の取扱いに必要であることを要求している 。さらに、有意な供給源は、治療用放射性核種組成物の精製後、ただちに患者に 与えられるようにする。製剤が汚染され、または純度要件を満たさない場合には 、患者は二回目の製剤についての相当な時間待つか、または外傷を受けるしばら くの間を待つようにする。この遅延は患者に外傷を与え、かつ有効な容易さおよ び個人の力量を浪費することになる。治療用放射性核種組成物の効果的なインビ トロ安定化は治療用の放射性核種組成物の中心的に制御された製剤にし、これに より高純度レベルの治療用組成物に著しく影響をうけやすくする。Degradation of therapeutic radionuclide compositions is generally rapid and The drug is prepared immediately prior to administration. This has ease of treatment or ease of experimentation. and those skilled in the art can chelate and target radionuclides. Requires that it be necessary for the handling of radioactive materials, including conjugation to moieties. . In addition, a significant source of therapeutic radionuclide compositions is immediately available to patients after purification. Let it be given to you. If the drug product becomes contaminated or does not meet purity requirements. , the patient has to wait a considerable amount of time for the second formulation or undergo some trauma. Please wait for a while. This delay is traumatic to the patient and effective It would be a waste of personal ability. Effective in vitro treatment of therapeutic radionuclide compositions Toro stabilization allows centrally controlled formulation of therapeutic radionuclide compositions and significantly more susceptible to higher purity levels of therapeutic compositions.
発明の概要 本発明の方法は有効量の安定剤を加えることによって治療用放射性核種を安定化 することである。治療用放射性核種組成物の効果的なインビトロ安定化は、組成 物をインビボ患者投与に試みる場合に臨界的である。放射性核種組成物の純度レ ベルは、一般に標的に結合した放射性核種対調剤中の全放射性核種の比として測 定する。ヒトに投与できる放射性核種調剤の純度に関する制限は厳格にする。一 般に、調剤は少なくとも９０％純粋にし、少なくとも９５％純粋にするのが好ま しい。勿論、高純度レベルは好ましいが、しかし約９０％以下の純度レベルはイ ンビボヒト投与に適当でない。Summary of the invention The method of the invention stabilizes a therapeutic radionuclide by adding an effective amount of a stabilizer. It is to be. Effective in vitro stabilization of therapeutic radionuclide compositions This is critical when attempting to administer a product to a patient in vivo. Purity level of radionuclide composition Bell is generally measured as the ratio of radionuclide bound to the target to total radionuclide in the preparation. Set. There will be strict limits on the purity of radionuclide preparations that can be administered to humans. one Generally, the preparation will be at least 90% pure, preferably at least 95% pure. Yes. Of course, high purity levels are preferred, but purity levels below about 90% are not acceptable. Not suitable for in vivo human administration.
治療用放射線標識化合物と用いる安定剤は次に示す特性を有するのが好ましい： すなわち、使用条件下で毒物学的に許容しうること；インビボ投与に適当である こと：化合物を標的細胞または組織に与えるのに妨げないこと；および使用前の 調製および貯蔵中の適度な期間において調剤が安定であることである。Preferably, the stabilizer used with the therapeutic radiolabeled compound has the following properties: i.e., toxicologically acceptable under the conditions of use; suitable for in vivo administration. that: do not interfere with delivery of the compound to target cells or tissues; and The formulation should be stable for a reasonable period of time during preparation and storage.
本発明において用いる安定剤の重要な利益の１つは調製し、精製した放射線標識 組成物を少なくとも数時間にわたって、および数日間にわたってインビトロ貯蔵 できると共に、許容しうる純度レベルを維持できることである。One of the important benefits of the stabilizers used in the present invention is the prepared and purified radiolabeled Storing the composition in vitro for at least several hours and for several days and maintain acceptable purity levels.
本明細書において用いられている「治療用放射性核種組成物」とは標的部分と錯 化したまたは結合した治療特性を有する放射性核種を意味する。本発明の治療用 放射性核種組成物はレニウム放射性核種のようなレドックス化学的性質を示す治 療用の放射性核種を組合わせるのが好ましく、および／または過酸化物のような 放射線分解生成物、および１３１１のような遊離基を生ずるように分解する傾向 がある。本発明の治療用放射性核種組成物はｌ＠６Ｒｅ、ｌ１１８Ｒｅなどのよ うなβ−線放射同位体を含むのか好ましく、かかる同位体はキレート化剤のよう な種々の他の成分および標的部分と錯化または結合することかてきる。蛋白質標 的部分に結合するキレート化剤に結合した治療用放射性核種を含む治療用放射線 免疫共役体（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｒａｄｉｏ−ｉｍｍｕｎｏ−ｃｏｎ ｊ ｕｇａｔｅｓ）は特に好ましい。β−およびγ−線を放射するレニウム放射性核 種、１１８Ｒｅおよび１ｇ８Ｒｅは本発明の安定な治療用組成物に用いるのに好 ましい。As used herein, "therapeutic radionuclide composition" refers to means a radionuclide that has conjugated or bound therapeutic properties. For treatment of the present invention Radionuclide compositions include therapeutics that exhibit redox chemistry, such as rhenium radionuclides. Preferably, therapeutic radionuclides are combined and/or radiolysis products, and the tendency to decompose to produce free radicals such as 1311 There is. Therapeutic radionuclide compositions of the present invention include l@6Re, l118Re, etc. Preferably, the isotope contains a β-emitting isotope, such as a chelating agent. It can be complexed or conjugated with various other moieties and targeting moieties. protein marker Therapeutic radiation comprising a therapeutic radionuclide bound to a chelating agent that binds to a target moiety immunoconjugate (therapeutic radio-immuno-conj) ugates) are particularly preferred. Rhenium radioactive nuclei that emit β- and γ-rays The species 118Re and 1g8Re are preferred for use in the stable therapeutic compositions of the present invention. Delicious.
安定剤は、好ましくはヒト患者にインビボ投与するのに適当な水溶液の状態の治 療調剤に導入する。適当な安定剤としては酸化防止剤、例えばアスコルビン酸、 ゲンチシン酸および機能的に類似する化合物、および攻撃剤（ｃｈａｌｌｅｎｇ ｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）、例えばインビボ投与できるＤＴＰＡ （ＤＴＰＡ＝ジ エチレントリアミンペンタアセテート） 、ＥＤＴＡ （ＥＤＴＡ＝エチレンジ アミンテトラアセテート〕などを例示することかできる。一般に、酸化防止剤は 放射性核種をその還元状態に維持するか、攻撃剤は酸化、例えばＦｅ＋３／Ｆｅ ＋２を促進する結合しないまたはゆるく結合した金属を有する錯体を形成する。The stabilizer is preferably in a state of aqueous solution suitable for administration to human patients in vivo. Introduced into medical preparations. Suitable stabilizers include antioxidants such as ascorbic acid, Gentisic acid and functionally similar compounds and challenge agents ing agents), such as DTPA (DTPA=di ethylene triamine pentaacetate), EDTA (EDTA = ethylene diacetate) amine tetraacetate] and the like. Generally, antioxidants are The radionuclide is maintained in its reduced state or the attacking agent is oxidized, e.g. Fe+3/Fe Forms complexes with unbound or loosely bound metals that promote +2.
安定剤を治療調剤の精製中に用いた溶出液に含有する場合に、安定性か高められ ることを観察した。Stability may be enhanced if stabilizers are included in the eluate used during purification of the therapeutic preparation. I observed that.
アスコルビン酸は好ましい安定剤である。また、相容性のアルブミン部分および 血清蛋白質を本発明における安定剤に混合することかできる。酸化防止剤または 攻撃剤と組合わせたＨ３Ａを含む安定剤は、治療用放射性核種組成物を１日また は２日以上にわたる長期間の安定化を与えることができる。Ascorbic acid is a preferred stabilizer. Also, compatible albumin moieties and Serum proteins can be mixed with the stabilizers of the present invention. antioxidant or A stabilizer containing H3A in combination with an attacking agent can be used to stabilize therapeutic radionuclide compositions for one day or more. can provide long-term stabilization over two days or more.
放射性レニウム化合物の既知のまたは予期する特性を考慮して、安定剤、例えば アスコルビン酸、単独または他の安定剤との組合わせは治療用放射性核種組成物 の長期にわたる安定化を与えることは予期しないことである。本発明における安 定剤の使用は、嫌気条件下て結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）および／または精 製を実施し、および精製後たゾちに調剤を使用するきびしい安定化手段を適用す る必要性を除去することかできる。本発明における安定剤は、放射性成分（例え ばＩＬＪｅ、ｌ１ｌＲｅ）を再酸化するおよび放射線分解の作用に帰因する治療 用放射性核種組成物の分解を効果的に減少する。数時間から数日間にわたる長期 インビトロ安定性は本発明による安定剤により得ることかでき、および治療調剤 の有効性および効力を高めると共に、通常の非標的細胞および組織における毒性 を軽減する。Taking into account the known or expected properties of radioactive rhenium compounds, stabilizers, e.g. Ascorbic acid, alone or in combination with other stabilizers, is used in therapeutic radionuclide compositions It is unexpected that the long-term stabilization of Safety in the present invention The use of fixatives allows for conjugation and/or purification under anaerobic conditions. the preparation and the application of severe stabilization measures using preparations immediately after purification. It is possible to eliminate the need to The stabilizer in the present invention is a radioactive component (e.g. Treatments attributable to the effects of reoxidation and radiolysis of ILJe, l1lRe) effectively reducing the decomposition of radionuclide compositions. long-term, lasting from several hours to several days In vitro stability can be obtained with the stabilizers according to the invention and therapeutic formulations increases the effectiveness and potency of the drug while reducing toxicity in normal non-target cells and tissues. Reduce.
本発明の安定な治療用放射性核種組成物は種々の放射線標識組成物を含んでいる 。放射線免疫共役体は、治療用放射性部分（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｒａｄｉ ｏａｃｔｉｖｅ ｍｏｉｅｔｙ）かある標的細胞および／または組織についての 特異性を有する蛋白質標的部分に結合する１種の好ましいクラスの組成物である 。本発明の組成物に用いるのを企図する治療用放射性核種はＩａＪｅ、 ＋８８ Ｒｅ、１５３３ｍ１”Ｙ、１°５Ｒｈ、 １３１工なとのようなβ（およびγ） 放射放射性核種を包含している。また、ランタニド系列の放射性同位体は治療効 果を示し、かつ本発明の治療用放射性核種組成物に適当に使用できることが確め られている。＋７以下の酸化状態を有する＋ ８６ ＲｅおよびＩｓ＊Ｒｅを包 含する還元レニウム放射性核種は本発明の治療用組成物に用いるのに好ましい。The stable therapeutic radionuclide compositions of the present invention include various radiolabeled compositions. . Radioimmunoconjugates contain therapeutic radioactive moieties. oactive moiety) or about certain target cells and/or tissues. One preferred class of compositions that bind to protein target moieties with specificity . Therapeutic radionuclides contemplated for use in the compositions of the invention are IaJe, +88 β (and γ) such as Re, 1533m1”Y, 1°5Rh, 131mm Contains radioactive nuclides. In addition, radioactive isotopes of the lanthanide series have therapeutic efficacy. It has been confirmed that the therapeutic radionuclide composition of the present invention can be used appropriately. It is being Includes +86 Re and Is*Re with an oxidation state of +7 or less. The reduced rhenium radionuclides that include are preferred for use in the therapeutic compositions of the present invention.
本発明の治療用放射性核種組成物に混合する適当な標的部分は蛋白質およびポリ ペプチドを含む標的部分を含んでおり、これらは炭水化物部分、例えば多糖、糖 蛋白質または炭水化物部分を有する他の化合物を含んでいる。好ましい蛋白質標 的剤は抗体、受容体（特に、レクチンのような細胞表面受容体）、酵素（例えば 、繊維素溶解酵素）、生物的応答変性剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃｒｅｓｐｏｎｓｅ ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ） （例えば、インターロイキン、インターフェロン、リン フ才力イン、エリトロポエチン、成長因子、コロ二刺激因子なと）、ペプチドホ ルモンおよびそのフラグメントを包含している。また、徴集台アルブミン（ＭＡ Ａ）などのような徴集台蛋白質（ｍｉｃｒｏａｇｇｒｅｇａｔｅｄ ｐｒｏｔｅ ｉｎｓ）は標的部分として用いることができる。単クローン性抗体またはそのフ ラグメントは特に好ましい蛋白質標的部分である。多くのうち、使用できる上記 単クローン性抗体は抗−ＴＡＣ、または他のインターロイキン−２受容体抗体、 ９．２．２７およびＮＲん化−０５〜２５０キロダルトンのヒト黒色腫−結合 プロテオグリカン、 ＮＲＬＵ−１０〜３７−４０キロダルトンの全がん腫（ｐ ａｎｃａｒｃｉｎｏｍａ）糖蛋白質２クロニ特異性を有するＮＲＣＯ−０２、お よび０ＶＢ−３〜未確認の腫瘍−結合抗原を例示できる。また、既知のまたはま だ分離されていない多くの抗体は本発明において適当に用いることができる。ハ イブリドーマから、または遺伝蛋白質工学技術により誘導した抗体は用いること ができる。Suitable targeting moieties for inclusion in the therapeutic radionuclide compositions of the present invention include proteins and polynucleotides. Contains targeting moieties including peptides, which are carbohydrate moieties, e.g. polysaccharides, saccharides Contains other compounds that have protein or carbohydrate moieties. Preferred protein marker Targeting agents include antibodies, receptors (particularly cell surface receptors such as lectins), enzymes (e.g. , fibrinolytic enzyme), biological response modifier (biological response modifiers) (e.g., interleukins, interferons, phosphorus erythropoietin, growth factors, colodistimulatory factors), peptide phosphatides, etc. Includes Lumon and its fragments. In addition, conscript albumin (MA A) Microaggregated protein such as ins) can be used as a targeting moiety. Monoclonal antibodies or fragments thereof A fragment is a particularly preferred protein targeting moiety. Above many can be used Monoclonal antibodies are anti-TAC, or other interleukin-2 receptor antibodies, 9.2.27 and NR oxidation-05 to 250 kilodalton human melanoma-binding Proteoglycan, NRLU-10 to 37-40 kilodalton all carcinomas (p NRCO-02, which has glycoprotein 2 cloni specificity (ancarcinoma), and 0VB-3 to unidentified tumor-binding antigen. Also, any known or Many antibodies that have not yet been isolated can be suitably used in the present invention. C Antibodies derived from hybridomas or by genetic protein engineering techniques may not be used. Can be done.
標的部分（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｏｉｅｔｉｅｓ）は必要により変えることが でき、意図する治療適用に必要なできるだけ長い生物活性を維持する。例えば、 組変えＲＮＡ技術により生成し、かつ非ヒト源から誘導した特異性決定蛋白質、 およびヒト源から誘導した他の蛋白質を有するキメラ抗体は治療用放射性材料に 共役して本発明による放射線免疫共役体を得ることがてきる。本発明において用 いる抗体は完全な（ｉｎｔａｃｔ）分子、そのフラグメント、またはその機能同 等物（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）を含んでいる。抗体フ ラグメントとしては、例えば普通の方法によって、または遺伝または蛋白質工学 技術によって生成できるＦ（ａｂ’ ）ｚ、Ｆａｂ ’、ＦａｂおよびＦｖフラ グメントを挙げることができる。また、単鎖抗体と称する工業的（ｅｎｇｉｎｅ ｅｒｅｄ）抗体を用いることができる。Targeting moieties can be changed as necessary. and maintain biological activity for as long as necessary for the intended therapeutic application. for example, specificity-determining proteins produced by recombinant RNA technology and derived from non-human sources; Chimeric antibodies with other proteins derived from human sources can be used as therapeutic radioactive materials. The radioimmunoconjugate according to the invention can be obtained by conjugation. Used in the present invention Antibodies may be intact molecules, fragments thereof, or functionally equivalent antibodies. Contains functional equivalents. Antibody filter For example, by conventional methods or by genetic or protein engineering. F(ab’)z, Fab’, Fab and Fv flags that can be produced by technology can be mentioned. In addition, industrial (engine ered) antibodies can be used.
レニウム放射性核種を含む放射線免疫共役体は、一般に放射性核種をキレート化 剤において安定に結合し、次いて放射性核種金属キレートの部分を蛋白質標的部 分に結合することによって生成する。多くの金属キレート化剤はｓ９“Ｔｃのよ うな診断剤をキレート化する技術において知られており、多くのキレート化剤は １８６Ｒｅおよび１ｓｓＲｅなどのような治療用放射性核種をキレート化するの に適当である。窒素および硫黄供与体原子を有する金属キレート化合物、例えば ジチオジアミノカルボン酸およびジチオジアミドカルボン酸（Ｎ＝Ｓ２キレート 化剤として知られている）、およびチオトリアサ キレート化合物（Ｎ３Ｓキレ ート化剤として知られている）が好ましい。次の一般式を有するキレート化合物 が好ましい： 式中： ＴはＨまたは硫黄保護基を示し； ＸはそれぞれＨ２または０を示し： Ｍは放射性核種イオンを示し、これには１または２個の酸素原子を結合すること ができ； Ｒはそれぞれ水素、アルキル、ジェミナル ジアルキル、システィン以外のアミ ノ酸の非アルキル側鎖（Ｒがアルキル基である場合に、アルキル側鎖をおおう） 、および−（ＣＨ２）、 −Ｚを示し； Ｚは−Ｃ００Ｈ１共役基、または標的化合物を示し：ｎは１〜約４の整数を示し ： Ｒ′はＨ２、−（ＣＨ２）。−Ｚ、または１または２個以上の置換極性基を有す るアルキル基を示し；および化合物は、Ｚが共役基または標的化合物である少な くとも１個の−（ＣＨ２）ｎ−Ｚ置換基を示す。Radioimmunoconjugates containing rhenium radionuclides generally chelate radionuclides. The radionuclide metal chelate moiety is then stably attached to the protein target moiety. It is generated by combining the minutes. Many metal chelators, such as s9"Tc, It is known for its technology of chelating diagnostic agents, and many chelating agents are Chelating therapeutic radionuclides such as 186Re and 1ssRe Appropriate for Metal chelate compounds with nitrogen and sulfur donor atoms, e.g. Dithiodiaminocarboxylic acid and dithiodiamidecarboxylic acid (N=S2 chelate ), and thiotriachelate compounds (known as N3S chelating agents); (known as oxidizing agents) are preferred. Chelate compounds with the following general formula is preferred: During the ceremony: T represents H or a sulfur protecting group; X represents H2 or 0, respectively: M indicates a radionuclide ion, to which one or two oxygen atoms may be attached. Can be done; R is hydrogen, alkyl, geminal dialkyl, amino acid other than cysteine, respectively. non-alkyl side chains of noic acids (covering alkyl side chains when R is an alkyl group) , and -(CH2), -Z; Z represents a -C00H1 conjugated group or a target compound; n represents an integer of 1 to about 4; : R' is H2, -(CH2). -Z, or has one or more substituted polar groups represents an alkyl group; and the compound is a conjugated group or a target compound. Indicates at least one -(CH2)n-Z substituent.
共役基は所望の標的部分の基と反応して放射性核種金属キレートを標的剤に結合 する官能基である。蛋白質標的部分は種々の官能基、例えばキレート化剤の適当 な共役基との反応に役に立つカルボン酸（ＣＯＯＨ）または遊離アミン（−ＮＨ ２）基を含んでいる。例えば、キレート化剤の活性エステルは蛋白質のりシン残 基の遊離アミン基と反応してアミド基を形成する。あるいは、また蛋白質および ／またはキレート化剤は付加反応性官能基を露出または付着するように誘導する ことができる。誘導は任意の多くの結合分子を付着することを含んでいる。ある いは、また誘導は、例えばキレート化剤のマレイミド共役基と反応する遊離スル ホヒドリル基を生ずる蛋白質の化学処理を含んでいる。The conjugated group reacts with the desired targeting moiety group to attach the radionuclide metal chelate to the targeting agent. It is a functional group that Protein targeting moieties can be modified to suit a variety of functional groups, e.g. chelating agents. Carboxylic acids (COOH) or free amines (-NH 2) Contains a group. For example, active esters of chelating agents are reacts with the free amine group of the group to form an amide group. Alternatively, also protein and /or the chelating agent induces addition-reactive functional groups to be exposed or attached be able to. Derivation includes attaching any number of binding molecules. be Alternatively, the derivatization may also include free sulfur reacting with the maleimide conjugate group of the chelating agent. It involves the chemical treatment of proteins to produce hohydryl groups.
蛋白質標的剤と反応する好ましい共役基にはエステルが存在する。「Ｚ」で示す 共役基として利用できるエステル水性媒質においてポリペプチドと共有アミド結 合を与えるエステルである。いずれかの反応エステルは、特定の放射性核種によ って、ペプチド化学の技術において知られているような蛋白質、および共役の条 件を与える。使用される一般のエステルとしては〇−オよびｐ−ニトロフェニル 、２−クロロ−４−二トロフェニル、シアノメチル、２−メルカプトピリジル、 ヒドロキシベンズトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシ サクシンイミド、トリクロロ フェニル、テトラフルオロフェニル、チオフェニル、テトラフルオロチオフェニ ル、０−ニトロ−ｐ−スルホフェニル、Ｎ−ヒドロキシフタルイミドなどを挙げ ることかできる。Preferred conjugated groups that react with protein targeting agents include esters. Indicated by "Z" Covalent amide bonds with polypeptides in aqueous medium that can be used as conjugating groups. It is an ester that gives a Either reactive ester is Therefore, proteins and conjugation conditions, as known in the art of peptide chemistry, give the matter. Common esters used are 〇-o and p-nitrophenyl. , 2-chloro-4-nitrophenyl, cyanomethyl, 2-mercaptopyridyl, Hydroxybenztriazole, N-hydroxy succinimide, trichloro Phenyl, tetrafluorophenyl, thiophenyl, tetrafluorothiophenyl , 0-nitro-p-sulfophenyl, N-hydroxyphthalimide, etc. I can do that.
あるいは、また標的剤か炭水化物部分を有する場合には、誘導は炭水化物の化学 処理、例えば糖蛋白質抗体の糖部分を過ヨウ素酸塩により遊離アルデヒド基を生 成するグリコール開裂を含んでいる。抗体の遊離アルデヒド基はキレート化剤の 遊離アミンまたはヒドラジン共役基と反応してこれに放射性核種金属キレートを 結合する。Alternatively, if the targeting agent also has a carbohydrate moiety, the derivatization may be through the carbohydrate chemistry. Treatment of the sugar moieties of glycoprotein antibodies, for example, with periodate to generate free aldehyde groups. Contains glycol cleavage to form The free aldehyde groups of the antibody are bound to the chelating agent. Reacts with free amine or hydrazine conjugated groups to form radionuclide metal chelates. Join.
適当な金属キレート化剤は欧州公開特許第０１８８２５６号および第０２８４０ ７１号明細書、および米国特許出願第０７／３６７、５０２号明細書（１９８９ 年６月１６日出願）に記載されている（これらの文献を引用例としてこ−に加え る。）。また、当業技術において知られている他の金属キレート化剤は本発明の 治療用放射性核種組成物に適当に用いることができる。Suitable metal chelators are described in European Patent Publication Nos. 0188256 and 02840. No. 71, and U.S. Patent Application No. 07/367,502 (1989 (filed on June 16, 2013) (in addition to this, using these documents as cited examples) Ru. ). Additionally, other metal chelators known in the art may be used in conjunction with the present invention. It can be suitably used in therapeutic radionuclide compositions.
キレート化剤は相当する放射性核種金属キレートを形成するように放射線標識し 、次いでキレートを「予備形成キレート手段」において標的部分に付着する。放 射線標識標的部分を作る他の手段は「後形成キレート手段（ｐｏｓｔ−ｆｏｒｍ ｅｄ ｃｈｅｌａｔｅ ａｐｐｒｏ−ａｃｈ） Ｊであり、この場合キレート化 合物を、先づ蛋白質または炭水化物標的分子に付着する。次いで、生成する共役 体（ｃｏｎｊｕ−ｇａｔｅ）を放射性核種金属と反応して標的分子に結合した放 射性核種金属キレートを生成する。The chelating agent is radiolabeled to form the corresponding radionuclide metal chelate. , the chelate is then attached to the target moiety in a "preformed chelating means". release Other means of creating radiolabeled target moieties include "post-form chelation means". ed chelate appro-ach) J, in which case chelation The compound is first attached to a protein or carbohydrate target molecule. Then, the conjugate to generate The conju-gate is reacted with a radionuclide metal to release the radioactive substance bound to the target molecule. Produces radionuclide metal chelates.
放射線標識レニウム免疫共役体を次のようにして作ることかてきる：使用する治 療用放射性核種によるが、多くの技術を放射性核種金属キレートを作るのに利用 することができる。過レニウム酸塩（ＲｅＯ，−）は、一般にキレート化剤と反 応する前にＲｅｄ” 、ＲｅＯ□“などに還元する。本発明の１例において、過 レニウム酸塩は第一錫化合物などと反応して還元し、くえん酸のような転移剤（ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｇｅｎｔ）と反応して弱いくえん酸レニウム錯体を生成す る。次いで、還元レニウム放射性核種くえん酸塩錯体をキレート化剤と反応させ 、放射性核種をリガンド（キレート化剤）に転移する。この反応は活性エステル 部分または他の共役基を有する放射性核種キレート中間体を生成する。Radiolabeled rhenium immunoconjugates can be made as follows: Depending on the therapeutic radionuclide, many techniques are used to make radionuclide metal chelates. can do. Perrhenate (ReO,-) generally reacts with chelating agents. Before responding, it is reduced to Red", ReO□", etc. In one example of the invention, Rheninate reacts with stannous compounds to reduce it and transfer agents such as citric acid ( transfer agent) to form a weak rhenium citrate complex. Ru. The reduced rhenium radionuclide citrate complex is then reacted with a chelating agent. , transfers the radionuclide to the ligand (chelating agent). This reaction is an active ester A radionuclide chelate intermediate with a moiety or other conjugated group is generated.
キレート化反応が完了した後、緩衝剤（ｐＨ９，５〜１０）を導入したキレート 化放射性核種溶液のｐＨを上げる。次いで、標的部分の緩衝溶液をキレート化放 射性核種と混合する。放射性核種金属キレート中間体の活性エステル部分は、一 般に蛋白質標的剤のりシン残留物にアミド結合により結合するが、しかし、また 他のタイプの結合を用いることができる。After the chelation reaction is completed, a buffer (pH 9,5-10) is introduced into the chelate. Raise the pH of the radionuclide solution. The buffer solution of the target moiety is then chelated and released. Mix with radionuclides. The active ester moiety of the radionuclide metal chelate intermediate is Generally, the protein targeting agent binds to the residue of lysine through an amide bond, but also Other types of bonds can be used.
共役反応が完了した後、放射性核種組成物を精製して未反応成分、望ましくない 反応副生物および分解生成物を除去する。After the conjugation reaction is complete, the radionuclide composition is purified to remove unreacted components, which are undesirable. Removal of reaction by-products and decomposition products.
分子量によって分離するゲル透過カラム、および帯電特性によって分離するイオ ン交換クマロトグラフィー、例えばＱＡＥ陰イオン交換を包含する種々の精製技 術を用いることができる。Gel permeation columns that separate by molecular weight, and ion columns that separate by charge characteristics. Various purification techniques including ion-exchange chromatography, e.g. QAE anion exchange. technique can be used.
本発明の好適例を抗体に結合したレニウム放射性核種キレートを含む放射性免疫 共役体について記載したけれども、他のタイプの標的部分を本発明の安定な治療 用放射性核種組成物に用いることかできる。治療用放射性核種は、当業技術にお いて知られている技術を用いて他の蛋白質標的部分に結合することかできる。キ レート化剤および／または既知の結合分子を用いて放射性核種を他の標的剤に結 合することができ、また直接標識技術を用いることができる。A preferred embodiment of the present invention is a radioimmunoassay comprising a rhenium radionuclide chelate conjugated to an antibody. Although conjugates have been described, other types of targeting moieties may be used as stable therapeutics of the present invention. It can be used in radionuclide compositions. Therapeutic radionuclides are within the skill of the art. Other protein targeting moieties can be attached using techniques known in the art. tree Binding of radionuclides to other targeting agents using rate agents and/or known binding molecules Direct labeling techniques can also be used.
放射性ハロゲン標識標的剤を含む放射線免疫共役体は、一般に小さい放射線標識 分子により生成し、次いて小さい放射性ハロゲン化分子を蛋白質標的剤に結合す る。例えば、治療用放射性核種１２１１１は式”ｘ−Ａｒ−Ｒを有する小さい分 子に混入するのか好ましい。この式において、 ９Ｘは放射性ハロゲン（”’Ｉ ）を示し：Ａｒは芳香族またはへテロ芳香族環を示し；およびＲは放射性ハロゲ ンを置換する環Ａｒを著しく活性化しない、および蛋白質標的剤の生物活性を保 護する、ゆるやかな、例えばアシル化条件下で蛋白質標的部分に結合するのに適 当な官能基を有する短鎖の置換基を示す。Ａｒ環としては、例えばベンゼン、ピ リジン、フランおよびチオフェンか好ましい。放射性ハロゲン３Ｘは、放射性ハ ロゲンを脱ハロゲナーセ酵素により異化作用を受けやすくしない、置換基Ｒに関 するＡｒ環のｐ−またはｍ−位が好ましい。Ａｒ環における放射性ハロゲンの炭 素原子への付着は、芳香族またはへテロ芳香族環の炭素−炭素結合の高められた 結合強さのために、アルキル炭素原子に付着するのか好ましい。Ａｒ環の性質は 臨界的てなく、単環、二環式、三環式にすることができ、または多くの環を含む ことができるが、しかじ単環が好ましい。Ａｒ環はすべての炭素原子からなり、 または窒素、酸素または硫黄のようなヘテロ原子を含有することができる。 ” ｘおよびＲを除いて、Ａｒ環におけるニトロ、スルホン酸、カルボン酸またはジ アルキルアミノ基のような極性置換基による置換は水溶液における溶解性を高め るので好ましい。Radioimmunoconjugates containing radiohalogen-labeled targeting agents generally contain small radiolabels. molecule and then attach a small radiohalogenated molecule to a protein targeting agent. Ru. For example, the therapeutic radionuclide 12111 has a small fraction with the formula “x-Ar-R”. It is preferable if it gets mixed in with the child. In this formula, 9X is radioactive halogen (''I ); Ar represents an aromatic or heteroaromatic ring; and R represents a radioactive halogen. does not significantly activate the ring Ar substituting the ring, and preserves the biological activity of the protein targeting agent. protection, suitable for binding to protein target moieties under mild, e.g. acylation conditions. Indicates a short chain substituent with a suitable functional group. As the Ar ring, for example, benzene, pi Lysine, furan and thiophene are preferred. Radioactive halogen 3X is a radioactive halogen. Regarding the substituent R that makes halogen less susceptible to catabolism by dehalogenase enzymes, The p- or m-position of the Ar ring is preferred. Radioactive halogen carbon in Ar ring Attachment to elementary atoms is due to enhanced carbon-carbon bonds in aromatic or heteroaromatic rings. For bond strength, it is preferred to attach to an alkyl carbon atom. The properties of the Ar ring are non-critical, can be monocyclic, bicyclic, tricyclic, or contain many rings However, a monocyclic ring is preferred. The Ar ring consists of all carbon atoms, or may contain heteroatoms such as nitrogen, oxygen or sulfur. ” nitro, sulfonic acid, carboxylic acid or dioxylic acid in the Ar ring, except for x and R. Substitution with polar substituents such as alkylamino groups increases solubility in aqueous solutions. It is preferable because
ｒＲ，＋は次の要件に合った任意の置換基を示す。第１に、Ｒ置換基は、Ａｒ環 を電子性置換基に向は著しく活性にしないようにする。換言すると、Ｒは、Ａｒ に結合した場合に、遊離ヒドロキシまたは第一アミノ置換によって生じた増加の 程度にＡｒの電子密度が増加する置換基にすることができない。第２に、Ｒを短 鎖の置換基にする必要かあり、このために結合しないまたは開裂した放射性ハロ ゲン化分子は腎臓により速やかに除去することができる。それ故、Ｒはアリール 結合と蛋白質共役についての官能基との間にアルキルまたは他のスペーサー鎖（ ｓｐａｃｅｒｃｈａｉｎ）を含めることができるか、しかしこのスペーサー鎖は ５個以下、好ましくは３個以下の直鎖炭素原子を含有することが好ましい。第３ に、Ｒ置換基は、ゆるやかな共役条件下で、蛋白質のアミノ酸または炭水化物残 留物、糖蛋白質、または他の蛋白質標的部分における相当する官能基（または共 役付着位置）に共有付着するのに利用される官能基（こ＼に「Ｑ」と称する）を 有する必要かある。代表的なＲ置換基はイミド エステル、アルキルイミド エ ステル、アミドアルキルイミド エステル、イミダート（ｉｍｉｄａｔｅ）エス テル、アルキルイミダート エステルおよびアミドアルキルイミダート エステ ルを包含している。rR,+ represents any substituent that meets the following requirements. First, the R substituent is an Ar ring The electronic substituents should not be significantly activated. In other words, R is Ar of the increase caused by free hydroxy or primary amino substitution when attached to It cannot be used as a substituent that increases the electron density of Ar to a certain degree. Second, shorten R It is necessary to substituate the chain, and for this reason unbonded or cleaved radioactive halo Generated molecules can be rapidly cleared by the kidneys. Therefore, R is aryl An alkyl or other spacer chain ( spacerchain), but this spacer chain Preferably it contains no more than 5, preferably no more than 3 straight chain carbon atoms. Third Under mild conjugation conditions, the R substituent can bind to amino acid or carbohydrate residues of proteins. Corresponding functional groups (or covalent groups) on distillates, glycoproteins, or other protein targeting moieties The functional group (hereinafter referred to as “Q”) used for covalent attachment to Is it necessary to have one? Typical R substituents are imido ester, alkylimide ester, Stell, amidoalkylimide ester, imidate S Tel, alkylimidate ester and amide alkyl imidate esthetics It includes files.
蛋白質部分への共役のために適当な官能基Ｑはフェノールエステル（例えばｐ− 二トロフェノール）、イミドエステル（例えばスクシンイミド エステル）、イ ミダート エステル、無水物、アシルスクシンイミド、アルデヒド、イソチオシ アネート、チオール、ジアゾ、アミン、ヒドラジン、アルキル ハロゲン化物、 ミハエリ受容体（Ｍｉｃｈａｅｌ ａｃｃｅｐｔｏｒ） ａ 、 β−不不飽和 力水ボニル化合物例えばマレイミド、および分子が蛋白質に共有結合を介して付 着するのに使用できる他の基を包含している。また、Ｒ置換基が官能基Ｑの先駆 物質を有する式■の小さい放射性ハロゲン化分子を与えることができる。適当な 先駆物質はＱかフェノールエステルであるカルボン酸、イミドエステル、無水物 、アシルスクシンイミドまたはマレイミド：Ｑがイミダートエステルであるニト リル：Ｑがアルデヒドであるアルコール、Ｑかイソチオシアネート、チオール、 ヒドラジンまたはアミンであるハロゲン化物；およびＱかジアゾまたはマレイミ ドであるアミンを包含している。Functional groups Q suitable for conjugation to protein moieties include phenolic esters (e.g. p- ditrophenol), imide esters (e.g. succinimide ester), Midate ester, anhydride, acylsuccinimide, aldehyde, isothiocyst Anate, thiol, diazo, amine, hydrazine, alkyl halide, Michaeli receptor a, β-unsaturated Hydrobonyl compounds such as maleimides, and molecules that attach to proteins through covalent bonds, It includes other groups that can be used to attach. In addition, the R substituent is a precursor of the functional group Q. A small radiohalogenated molecule of formula (1) with a substance can be provided. Appropriate Precursors are Q or phenolic esters, carboxylic acids, imidoesters, anhydrides , acylsuccinimide or maleimide: nito in which Q is an imidate ester Ryl: alcohol where Q is aldehyde, Q or isothiocyanate, thiol, Halides that are hydrazine or amines; and Q or diazo or maleimi This includes amines that are
本発明において代表的な小さい放射性ハロゲン化分子は次の式を有する化合物を 包含している： （式中、Ｘは１３１■のような放射性ハロゲン；ｎは整数；およびＱは上述する 官能基を示す） 放射性ハロゲンは芳香族環Ａｒのどこにでも位置することができるが、しかしｐ −またはｍ−置換は、デョーデナーゼ（ｄｅｉｏｄｉｎａｓｅ）酵素によりステ アリンネ安定（ｓｔｅａｒｉｃ １ｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ）および異化作用に影 響されやすくない放射性ハロゲンにするために好ましい。スペーサー成分（ＣＨ ２）、、は１２個まで、好ましくは５個以下の直鎖炭素原子を有する直鎖または 側鎖アルキルまたはヘテロアルキル基にすることができる。もっとも好ましい例 においては、３個以上の直鎖炭素原子が官能基を芳香族環から分離する（すなわ ち、ｎ＝０．１．２または３）。診断画像についてのバックグランド活性を速や かに明確にするために、および生体器官への放射線量を最小にするために、アル キル スペーサ−成分を短くする必要があり、このために非共役および化学的ま たは酵素的に開裂した放射性ハロゲン化化合物は、心臓または肝臓における脂肪 酸分解通路を経由するより、むしろ、腎臓を介して速やかにきれいにすることが できる。他方において、ある適用において、放射線標識アリール環と蛋白質との 間の短いアルキルまたはヘテロアルキル スペーサーか望ましい。In the present invention, representative small radiohalogenated molecules include compounds having the following formula: Contains: (wherein X is a radioactive halogen such as 131; n is an integer; and Q is as described above. (indicates a functional group) The radiohalogen can be located anywhere on the aromatic ring Ar, but p - or m-substitutions are sterilized by the enzyme deiodinase. Affects stearic stability and catabolism. It is preferable to use radioactive halogen that is not easily exposed to radiation. Spacer component (CH 2), , are straight-chain or It can be a side chain alkyl or heteroalkyl group. most preferred example In , three or more straight carbon atoms separate the functional group from the aromatic ring (i.e. n=0.1.2 or 3). Immediate background activation for diagnostic images For clarity and to minimize radiation dose to vital organs, The kill spacer component needs to be short, and for this purpose non-conjugated and chemically or enzymatically cleaved radiohalogenated compounds can cause fat loss in the heart or liver. can be rapidly cleared through the kidneys rather than via the acid-degrading pathway. can. On the other hand, in some applications, the combination of radiolabeled aryl rings and proteins A short alkyl or heteroalkyl spacer in between is preferred.
本発明における小さい放射性ハロゲン化分子を次に例示するが、これに制限され るものでない二Ｎ−スクシンイミジル−３−（４’ −（１３’Ｉ）ヨードフェ ニル）−プロピオネート；メチル−３−（４’ −（＋３’Ｉ）ヨードフェニル ）プロピオイミダート二Ｎ−スクシンイミジル−４−（”’Ｉ）ヨードベンゾエ ート、メチル−４−（”’Ｉ）ヨードベンズゴミダート：Ｎ−スクシンイミジル −４−［： ＋２’Ｉ）ヨードベンズアミドアセテートまたはＮ−スクシンイミ ジル−４−（”’ｒ）ヨードヒブチート（ｉｏｄｏｈｉｐｐｕｒａｔｅ） ；メ チル−４−（”’Ｉ）ヨードベンズアミドアセトイミダート、および４− （” りヨードベンズアミドアセトニトリル。Examples of small radiohalogenated molecules according to the present invention are shown below, but are not limited thereto. 2N-succinimidyl-3-(4'-(13'I)iodophe) methyl)-propionate; methyl-3-(4'-(+3'I)iodophenyl ) Propioimidate 2N-succinimidyl-4-(”’I) iodobenzoe Methyl-4-(”’I) iodobenzgomidate: N-succinimidyl -4- [: +2'I) iodobenzamide acetate or N-succinimide Zyl-4-(”’r) iodohippurate; Chil-4-(”’I) iodobenzamide acetimidate, and 4-(” Riiodobenzamide acetonitrile.
また、式”ｘ −Ａｒ −Ｒを有する化合物を合成する方法について記載する。Also described is a method for synthesizing a compound having the formula "x-Ar-R".
簡単に云うと、以下に記載する方法学を官能基Ｑまたは官能基Ｑについての先駆 物質を有するハロ芳香族誘導体のメタレート任意位置異性体に用いることができ る。メタレーションには５ｎ（ｎ−Ｂｕ）ｚまたはＳｎＭｅｚのようなトリアル キル錫試薬が用いられる。生成アリール錫化合物を位置−特異的反応において、 次の有機水銀または有機硼素試薬、すなわち、ＨｇＸ２、Ｈｇ（ＯＡｃ）２、Ｂ Ｚ３またはＢＺ、 （こ＼にＸはＢｒ、■または好ましくはＣ１を示し、および Ｚはアルキルまたはアルコキシを示す）の１種でトランスメタレート化する（ｔ ｒａｎｓｍｅｔａｌａｔｅｄ）ことができる。スタニル化（ｓｔａｎｎｙｌａｔ ｅｄ）またはメタレート化（ｍｅｔａｌａｔｅｄ）化合物は、好ましくは官能基 Ｑを形成した後、メタレーション反応を介して放射性ハロゲン化する。Briefly, the methodology described below is applied to functional groups Q or precursors for functional groups Q. The metalate of haloaromatic derivatives with substances can be used for any positional isomer. Ru. For metallation, trials such as 5n(n-Bu)z or SnMez are used. A kill tin reagent is used. The produced aryltin compound is subjected to a regio-specific reaction, The following organomercury or organoboron reagents, namely HgX2, Hg(OAc)2, B Z3 or BZ, (where X represents Br, ■ or preferably C1, and Z represents alkyl or alkoxy). transmetalated). stannylat ed) or metalated compounds preferably contain functional groups. After forming Q, it is radiohalogenated via a metalation reaction.
蛋白質剤に結合する小さい放射性ハロゲン化分子は欧州公告特許出願第０２０３ ．７６４および０２８９．１８７号明細書に記載されている（これらの文献を引 用例としてこ＼に加える）。Small radiohalogenated molecules that bind to protein agents are disclosed in European Published Patent Application No. 0203 ．． No. 764 and No. 0289.187 (these documents are cited). Add this as an example).
また、次の式を有する小さいビニル放射性ハロゲン化分子は蛋白質標的剤に結合 することができる：式中、。Ｘは放射性ハロゲン、例えば＋２１１を示し、 Ｃ ＝Ｃは二重結合を示し；Ｒ１およびＲ２は水素原子、アルキルまたは置換アルキ ル基、アリールまたは置換アリール基、ヘテロアルキル基、ヘテロアリール基、 または混合アルキルアリール基を示し；およびＹはＹが水素原子にできない以外 はＲ１およびＲ２についての任意の基を示し、かつ蛋白質の生物活性を保護する 条件下で蛋白質に結合するのに適当な官能基を有する。Additionally, a small vinyl radiohalogenated molecule with the formula Can be: in the formula. X represents radioactive halogen, for example +211, and C =C represents a double bond; R1 and R2 are hydrogen atoms, alkyl or substituted alkyl aryl or substituted aryl group, heteroalkyl group, heteroaryl group, or a mixed alkylaryl group; and Y is a hydrogen atom, except that Y cannot be a hydrogen atom. represents any group for R1 and R2 and protects the biological activity of the protein It has a functional group suitable for binding to proteins under the conditions.
これらの化合物は上述する単クローン性抗体のような蛋白質に結合して診断およ び治療適用についての試薬を得ることかできる。These compounds bind to proteins, such as the monoclonal antibodies mentioned above, for diagnostic and reagents for therapeutic and therapeutic applications.
安定剤は本発明の治療用放射性核種組成物に混合する。適当な安定剤としては、 例えばインビトロ ヒト投与に適当な酸化防止剤および攻撃剤を示すことができ る。酸化防止剤、例えばアスコルビン酸、ゲンチシン酸；その誘導体、例えばそ のニコチンアミド錯体、および機能的に類似する化合物：攻撃剤、例えばＤＴＰ Ａ、ＥＤＴＡなと；および製薬的に許容しうる塩、エステル、アミドおよびその 混合物を含む安定剤が好ましい安定剤である。アスコルビン酸は、適当な高い純 度レベルで入手しやすく、広い濃度範囲にわたってインビボ投与することができ 、治療用放射線標識化合物と化学的または物理的に反応しなく、かつ高レベルの 安定活性が得られるから、特に好ましい安定剤である。Stabilizers are incorporated into the therapeutic radionuclide compositions of the present invention. A suitable stabilizer is For example, antioxidants and attack agents suitable for in vitro human administration can be shown. Ru. Antioxidants such as ascorbic acid, gentisic acid; derivatives thereof such as nicotinamide complexes, and functionally similar compounds: attacking agents such as DTP A, EDTA; and pharmaceutically acceptable salts, esters, amides and their like; Stabilizers containing mixtures are preferred stabilizers. Ascorbic acid has a suitable high purity It is readily available at high concentrations and can be administered in vivo over a wide concentration range. , does not chemically or physically react with therapeutic radiolabeled compounds, and has high levels of It is a particularly preferred stabilizer because it provides stable activity.
本発明の安定組成物は有効量の安定剤を含み、この有効量の安定剤は治療用放射 性核種を還元状態に維持し、かつ蛋白質標的部分に安定結合するのに十分な量の 安定剤を示す。一般に、放射線免疫共役体を含む治療用放射性核種組成物は患者 に約２０〜３０ｍ１の容量で注射することかできる。この調剤は約１〜約１５ｍ ｇ／ｆｆｉの安定剤、例えば酸化防止剤または攻撃剤、特に好ましくは約７〜ｌ ｏｍｇ／ｍｌの安定剤を含めることかできる。それ故、各放射性核種調剤におけ る安定剤全量は約２０〜約５００ｍｇ 、好ましくは約１２０〜約３００ｍｇに することができる。一般に、所望の安定性を得るのに要求される量の安定剤は全 体として高められ、放射性核種の活性を高める。The stable compositions of the invention include an effective amount of stabilizer, the effective amount of stabilizer being a sufficient amount to maintain the sexual nuclide in a reduced state and stably bind to the protein target moiety. Indicates a stabilizer. Generally, therapeutic radionuclide compositions containing radioimmunoconjugates are It can be injected in a volume of about 20-30 ml. This preparation is about 1 to about 15 m g/ffi of stabilizers, such as antioxidants or attacking agents, particularly preferably from about 7 to 1 omg/ml of stabilizer can be included. Therefore, in each radionuclide preparation The total amount of stabilizer used is about 20 to about 500 mg, preferably about 120 to about 300 mg. can do. Generally, the amount of stabilizer required to achieve the desired stability is It is enhanced as a body and increases the activity of radionuclides.
本発明における安定剤は精製後、治療用放射性核種組成物に加えることができる 。しかしながら、好適例によると、精製カラムを放射性核種組成物の溶離前に、 安定剤を含む水溶液で調整し、精製生成物を安定剤を含む溶液て溶離する。一般 に、約１ｍｇ／ｍｌまたはこれ以上、好ましくは約２０ｍｇ／ｍｌの濃度のアス コルビン酸水溶液は精製カラムの調整および溶離に好ましい。The stabilizer according to the invention can be added to the therapeutic radionuclide composition after purification. . However, according to a preferred embodiment, the purification column is used before elution of the radionuclide composition. An aqueous solution containing the stabilizer is prepared and the purified product is eluted with the solution containing the stabilizer. general asium at a concentration of about 1 mg/ml or more, preferably about 20 mg/ml. Aqueous corbic acid solutions are preferred for purification column preparation and elution.
また、ＤＴＰＡおよびＥＤＴＡの水溶液はカラム調整および溶離について約２０ ｍｇ／ｍｌまでの濃度にするのが好ましい。Also, an aqueous solution of DTPA and EDTA is approximately 20 ml for column preparation and elution. Preferably, the concentration is up to mg/ml.
上述する安定剤のほかに、相溶しうるアルブミン部分および／または血清蛋白質 、特にヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を１または２種以上の上述する安定剤と組 合わせて用いる場合に、長時間にわたる安定性を得ることができてる。相溶しつ るアルブミン部分および血清蛋白質は患者に投与する際に、実質的に有害な免疫 応答を誘導しない。適当なアルブミン部分としては、例えば全（天然の）ヒト血 清アルブミン（ＨＳＡ＞ 、および自然源および工業源から誘導した非ヒト ア ルブミン部分：天然の（全またはフラグメント）アルブミン部分に類似するまた は優れている特性を示す変性第１、第２、第３または第４構造を有するアルブミ ン部分；機能的に重要なＨＳＡ ドメインを含むアルブミン誘導体；、および米 国特許出願第０７／４５９．０６８号明細書に記載されているように天然アルブ ミンと異なる第２および／または第３および／または第４構造を有する「再生Ｊ アルブミン部分を挙げることができる。また、多くの血清蛋白質は安定効果を示 し、本発明における安定剤として用いることができる。In addition to the stabilizers mentioned above, compatible albumin moieties and/or serum proteins , especially human serum albumin (HSA) in combination with one or more of the above-mentioned stabilizers. When used together, long-term stability can be achieved. compatible When administered to patients, the albumin moiety and serum proteins present in Do not induce a response. Suitable albumin moieties include, for example, whole (natural) human blood. Clear albumin (HSA) and non-human proteins derived from natural and industrial sources. Lubumin moiety: Similar to the natural (whole or fragment) albumin moiety Albums with modified primary, secondary, tertiary or quaternary structures exhibiting superior properties an albumin derivative containing the functionally important HSA domain; Natural Albums as described in National Patent Application No. 07/459.068 "Regenerated J" having a second and/or third and/or fourth structure different from Min. Mention may be made of the albumin moiety. Additionally, many serum proteins exhibit stabilizing effects. However, it can be used as a stabilizer in the present invention.
ＨＳＡを酸化防止剤または攻撃剤と組合わせることは安定効果を高めることが研 究により確められている。ＨＳＡ 、同様にアスコルビン酸は十分に高い純度レ ベルで入手しゃすく；治療用放射性核種化合物と反応しなく、および広い投与レ ベルにわたって患者にインビボ投与することかできる。調剤について約５０〜約 ５００ｍｇ 、好ましくは約２２０ｍｇの投与レベルか好ましい。ＨＳＡは精製 後、放射性核種組成物と混合するのが好ましい。Combining HSA with antioxidants or attacking agents has been shown to enhance the stabilizing effect. This has been confirmed by research. HSA, as well as ascorbic acid, have a sufficiently high purity level. Available at Amazon; does not react with therapeutic radionuclide compounds and has a wide dosing range. It can be administered to a patient in vivo over a period of time. Approximately 50 to approx. A dosage level of 500 mg, preferably about 220 mg is preferred. HSA is purified It is then preferably mixed with a radionuclide composition.
本発明の治療用放射性核種組成物はヒトまたは他の哺乳類宿主に注射することを 意図している。従って、適当な製造手段およびインビトロ貯蔵手段は適当に無菌 で、発熱物質を含まない組成物を得るようにする。必要としないけれども、製薬 的に許容されうる増量剤または充填剤を用いて安定剤および（随意の）キャリヤ ーを稀釈して必要な少量の上記化合物を簡単に秤量することができる。塩化ナト リウムおよびグリコースは好ましいキャリヤーであり、塩化ナトリウムは等張溶 液が得やすいために、特に好ましい。The therapeutic radionuclide compositions of the invention are suitable for injection into human or other mammalian hosts. Intended. Therefore, suitable manufacturing and in vitro storage means should be suitably sterile. to obtain a pyrogen-free composition. Although not necessary, pharmaceutical stabilizers and (optional) carriers with acceptable extenders or fillers. The necessary small amount of the above compound can be easily weighed by diluting the above compound. sodium chloride Limeium and glycose are preferred carriers, and sodium chloride is an isotonic solution. This is particularly preferred since it is easy to obtain a liquid.
本発明の安定な治療用放射性核種組成物は必要に応じて稀釈し、哺乳類宿主に、 種々の環境に影響するが、静脈内に、動脈内に、腹膜に、腫瘍内に注射すること によって投与することができる。インビボ投与に適当な治療用１ｔ＠Ｒｅ組成物 は約２５〜約６０Ｏｎ＋Ｃｉ活性、一般に約１００〜約３００ｍＣ１活性の放射 能レベルを有するのが好ましい。インビボ患者治療に調製された治療用組成物は 標的部分、一般に抗体（Ａｂ）またはフラグメントに関して約４μＣｉ／μｇ Ａｂ〜約８μＣｉ／μｇ Ａｂの比較的に高い比活性を有するのが好ましい。患 者に投与するのに望ましい調剤の放射能および比活性のレベルは標的部分、物理 的特性、患者の健康、治療条件などを含む多くのファクターに影響される。The stable therapeutic radionuclide compositions of the invention can be diluted as needed and administered to a mammalian host. Affects various environments, but can be injected intravenously, intraarterially, peritoneally, and intratumorally It can be administered by. Therapeutic 1t@Re compositions suitable for in vivo administration is about 25 to about 60 On+Ci activity, generally about 100 to about 300 mC1 activity. Preferably, it has a level of ability. Therapeutic compositions prepared for in vivo patient treatment are Approximately 4 μCi/μg of targeting moiety, typically an antibody (Ab) or fragment It is preferred to have a relatively high specific activity of Ab to about 8 μCi/μg Ab. disease The level of radioactivity and specific activity of the preparation desired for administration to the target moiety, physical It is influenced by many factors, including patient characteristics, patient health, and treatment conditions.
溶離治療用放射性核種組成物の純度は、患者に投与する前に調へて、純度レベル か製薬的に許容しうろことを確める必要かある。純度測定は瞬間薄層クロマトグ ラフィー（ＩＴＬＣ）および高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を包含す る種々の技術によって行うことができる。１２％ＴＣＡ溶剤を用いるＩＴＬＣは 速やかに測定でき、溶液において抗体または他の標的部分に錯化および結合した レニウムの割合を正確に測定することかできる。移動相としてｐＨ７で、０．２ Ｍりん酸緩衝剤を用いるゾルパックス ジオール（Ｚｏｒｂａｘ ｄｉａｌ）に よるＨＰＬＣは不純物および分解生成物を確認するのに、および純度レベルを確 めるのに用いることができる。The purity of elution therapeutic radionuclide compositions is determined by checking the purity level prior to administration to the patient. Is it necessary to confirm that the scale is pharmaceutically acceptable? Purity measurement is done using instantaneous thin layer chromatography. (ITLC) and high pressure liquid chromatography (HPLC). This can be done by various techniques. ITLC using 12% TCA solvent is can be rapidly measured and complexed and bound to antibodies or other target moieties in solution. It is possible to accurately measure the proportion of rhenium. At pH 7 as mobile phase, 0.2 Zorbax dial using M phosphate buffer HPLC is used to identify impurities and decomposition products and to ensure purity levels. It can be used to
実験計画案および結果について次の記載はレニウム放射性核種を抗体に結合して 治療用放射性核種組成物およびこの組成物の安定化を得る放射線標識および共役 技術について説明している。本発明は制限されるものでないが、しかし、むしろ 本明細書の特許請求の範囲を維持する目的のための特定実験計画案および結果に ついて記載している。The following description of the experimental design and results describes the use of rhenium radionuclides conjugated to antibodies. Radionuclide Compositions for Therapeutics and Radiolabels and Conjugates for Stabilization of the Compositions Explains the technology. The invention is not limited, but rather Specific experimental designs and results for purposes of maintaining the scope of the claims herein. It is written about.
＋５ｓＲｅについての放射線標識および共役技術臨床治療適用についての１″Ｒ ｅ放射性核種組成物の調製は次のユニのプロセス段階を含んでいる； （１） ”’Ｒｅリガンド エステルの形成； （２） ”’Ｒｅリガンド エステルの 標的部分への共役：（３） １１Ｒｅ反応混合物の精製：および（４）患者投与 前における最終稀釈および試験。放射性核種の取扱いを含むすべての手順は適当 な遮蔽環境、例えば透明な鉛ガラス煉瓦、鉛煉瓦および鉛シートで遮蔽した層流 フードで行って放射線標識プロセス中、放射線にさらされるのを少なくする。さ らに、調剤はインビボ投与するようにするから、厳格な無菌技術で観察する。Radiolabeling for +5sRe and 1″R for Conjugation Technology Clinical Treatment Applications Preparation of the e-radionuclide composition includes the following process steps: (1) “’Formation of Re ligand ester; (2)”’Formation of Re ligand ester Conjugation to target moiety: (3) Purification of 11Re reaction mixture: and (4) Patient administration Final dilution and testing before. All procedures including handling of radionuclides are properly performed. laminar flow shielded by transparent lead glass bricks, lead bricks and lead sheets Reduce exposure to radiation during the radiolabeling process by performing in a hood. difference Additionally, since the preparations will be administered in vivo, strict aseptic technique will be observed.
一般に約５０〜約８００ｍＣ１の所望活性および約０．０１〜約０．３ｍｇの所 望の質量を有する可溶性過レニウム酸塩の形態の１１′Ｒｅを反応ガラスびんに 移す。可溶性過レニウム酸塩（”’Ｒｅ０４−）はユニバーシティ オブ ミズ ーリ リサーチ リアクターから得ることができる。可溶性過レニウム酸塩は約 １ｍｇの塩化第一錫、２５ｍｇのくえん酸、１ｍｇのゲンチシン酸および７５ｍ ｇのラクトースを含む転移剤組成物と反応する。塩化第−錫還元剤対レニウムの 比はモル基準で約１：１〜約１０：１にして効果的な還元を得るようにし、およ びくえん酸対レニウムの比は約２５コ１〜約５００：１にしてくえん酸塩／レニ ウム中間体を効果的に生ずるようにする。キレート化剤はイソプロパツールのよ うな有機溶剤に溶解し、約２５０〜約８００μｇの量で導入して約１＝１〜約１ ＝１．５、好ましくは約１：１．３のｌｌ６Ｒｅ対キレート化剤提供比を達成す るようにする。キレート化反応混合物を８５〜９５°Ｃに加熱し、反応を約３０ 分間にわたり行う。キレート化反応の所望生成物は活性エステル部分を有するキ レート化放射性核種（１８＄１１７ｅ）である。Generally, a desired activity of about 50 to about 800 mCl and about 0.01 to about 0.3 mg 11'Re in the form of a soluble perrhenate with the desired mass is added to the reaction vial. Move. Soluble perrhenate (”’Re04-) was prepared by the University of Ms. - Can be obtained from the Research Reactor. Soluble perrhenate is approx. 1 mg stannous chloride, 25 mg citric acid, 1 mg gentisic acid and 75 m g of a transfer agent composition containing lactose. Tin-tin chloride reducing agent vs. rhenium The ratio should be from about 1:1 to about 10:1 on a molar basis to obtain effective reduction; The ratio of citrate to rhenium is about 25:1 to about 500:1. to effectively generate the umium intermediate. Chelating agents such as isopropanol It is dissolved in an organic solvent and introduced in an amount of about 250 to about 800 μg to give about 1 = 1.5, preferably achieving a 116Re to chelator delivery ratio of about 1:1.3. so that The chelation reaction mixture was heated to 85-95°C and the reaction Do this for a minute. The desired product of the chelation reaction is a chelate containing an active ester moiety. rated radionuclide (18$117e).
レニウム放射性核種組成物についての１種の好ましいキレート化剤はＭＡＧＧ −ＧＡＢＡと称され、次に示すキレート化活性エステル形態の構造を有している ： 反応混合物のエステル純度はクロマトグラフ技術により定めることができる。One preferred chelating agent for rhenium radionuclide compositions is MAGG. -It is called GABA and has the following structure in the form of a chelated active ester. : The ester purity of the reaction mixture can be determined by chromatographic techniques.
次いで、キレート化放射性核種の活性エステル部分を蛋白質標的部分のリジン残 留物に共役する。約１００μｍの炭酸ナトリウム緩衝剤（ｌ Ｍ、 ｐＨ＝ １ ０．０）を＋８６１１７ｅ−リガンド エステル反応混合物に導入し、標的部分 （一般に全またはフラグメント抗体）の水溶液を導入して約０．１：１〜約２５ ．１、好ましくは約２．１〜約５＝１のレニウム対抗体提供比を得る。付加炭酸 塩緩衝剤を導入して兵役反応混合物のｐＨを約９．０〜９．５に上げる。共役反 応は撹拌しながら室温で約１０〜約１２分間にわたって行う。５０μｍのリジン （２５０μｌ／ｍｌ）を（必要に応じて）加えて共役反応を停止する。次いで、 反応混合物を、例えばセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ） Ｇ −２５カラム を用いるサイズ排除により、またはイオン交換クロマトグラフィーにより精製す る。本発明の好適例により安定な放射性核種組成物を得るために、精製カラムを 安定剤を含む水溶液で予備調整しくｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）、安定化溶 液を精製放射性核種共役体の溶離に用いるのが好ましい。The active ester moiety of the chelated radionuclide is then added to the lysine residue of the protein target moiety. Conjugates to residues. Approximately 100 μm sodium carbonate buffer (lM, pH = 1 0.0) into the +86117e-ligand ester reaction mixture and target moiety (generally whole or fragment antibodies) from about 0.1:1 to about 25% ．． 1, preferably from about 2.1 to about 5=1. additional carbonic acid A salt buffer is introduced to raise the pH of the military reaction mixture to about 9.0-9.5. Conjugate anti The reaction is carried out at room temperature with stirring for about 10 to about 12 minutes. 50μm lysine (250 μl/ml) (if necessary) to stop the conjugation reaction. Then, The reaction mixture is transferred to, for example, a Sephadex G-25 column. Purification by size exclusion using Ru. In order to obtain a stable radionuclide composition according to a preferred embodiment of the invention, a purification column is used. The stabilizing solution is preconditioned with an aqueous solution containing a stabilizer. Preferably, the liquid is used to elute purified radionuclide conjugate.
共役反応混合物を、患者投与のために、必要に応じて稀釈するか、または試験目 的のために数個の部分に分けることができる。The conjugate reaction mixture may be diluted as necessary for patient administration or for test purposes. It can be divided into several parts for the purpose.
例工 ”’Ｒｅ ＭＡＧＧ ＧＡＢＡ ＮＲＣＯ０２Ｆ（ａｂ’ ）２放射線免疫共役 体調剤のインビトロ安定性を全時間にわたって監視した。２種の放射線免疫共役 体調剤を上述する標準放射線標識および共役技術を用いて作った。各放射線標識 免疫共役体調剤をＰＢＳ溶液を用いて溶離し、精製溶離共役体を安定剤として５ ％Ｈ３Ａ溶液（約２２０ｍｇ ＨＳＡ ）を収容したガラスびんに収集した。調 剤■の全活性は約２５ｍＣｉであり、調剤■の全活性は約１００ｍｃｉであった 。Example work ”’Re MAGG GABA NRCO02F(ab’)2 radiation immunoconjugate The in vitro stability of the formulation was monitored over time. Two types of radioimmunoconjugates Conditioning preparations were made using standard radiolabeling and conjugation techniques as described above. Each radiolabel The immunoconjugate preparation was eluted using PBS solution and the purified eluted conjugate was used as a stabilizer for 5 % H3A solution (approximately 220 mg HSA). tone The total activity of Formulation ■ was approximately 25 mCi, and the total activity of Formulation ■ was approximately 100 mCi. .
調剤■を２つのグループに分け、１つのグループの試料を精製し、収集し、４° Ｃに貯蔵し、および他の試料を精製し、収集し、３７°Ｃて貯蔵して温度か放射 線免疫共役体の分解割合に影響するかとうかを調へた。Divide the preparation ■ into two groups, purify and collect the samples of one group, and incubate at 4° and other samples were purified, collected, and stored at 37°C to reduce temperature or radiation. We investigated whether this would affect the degradation rate of the immunoconjugate.
放射性核種調剤の安定性を種々の時間間隔て調へて調剤の純度レベルを監視した 。安定性をＩＴＬＣ（１２％ＴＣＡ溶剤Ｊ） ｉ二より、放射線免疫共役体調剤 に結合を残留する放射能の害Ｉ合としてｆｆ、ｌｌ定した。約９０％以下、好ま しくは約９５％以下の純度レベル（よイ放射線免疫共役体純度 ”Ｉ′Ｒｅ ＭＡＧＧ ＧＡＢＡ ＮＲＣＯ０２Ｆ（ａｂ’ ）２調剤Ｉ＝２５ ｍＣｉ 調剤Ｋ ＝ １００ｍＣ１時間 ４°Ｃ３７°Ｃ時間 ３７°Ｃ 上記結果は、高いレベルの放射能を有する放射線免疫共役体調剤は時間にわたっ て有意に低い安定性を示している。調剤Ｉ（２５ｍＣｉ）は約２４時間までの時 間にわたって満足な安定性を存しているか、調剤ＩＩ （１００ｍＣｉ）は約４ 時間までだけ満足な安定性を示しているだけであった。精製し、収集しかつ４° Ｃおよび３７°Ｃで貯蔵した調剤間には、有意な相違は見られなかった。ＨＳＡ は低い放射能レベルで満足な安定化を与えるか、しかし適度なレベルの安定性を 有する放射性核種組成物（１００ｍＣｉ）は満足な安定性を示さなかった。一般 に、高い全および比活性調剤は極めて著しい分解問題がある。The stability of the radionuclide preparation was measured at various time intervals to monitor the purity level of the preparation. . Stability was determined by ITLC (12% TCA solvent J) from i2 to the radioimmunoconjugate preparation. Binding was determined as the presence of residual radioactivity. Approximately 90% or less, preferably or a purity level of approximately 95% or less (higher radioimmunoconjugate purity). "I'Re MAGG GABA NRCO02F(ab')2 Preparation I=25 mCi Preparation K = 100mC 1 hour 4°C 37°C time 37°C The above results indicate that radioimmunoconjugate preparations with high levels of radioactivity are showed significantly lower stability. Preparation I (25mCi) for up to about 24 hours Formulation II (100 mCi) has a satisfactory stability over time. It only showed satisfactory stability over time. Purify, collect and 4° No significant differences were observed between formulations stored at 37°C and 37°C. HSA gives satisfactory stabilization at low radioactivity levels, but only moderate levels of stability. The radionuclide composition with (100 mCi) did not show satisfactory stability. general Additionally, high total and specific activity formulations have very significant degradation problems.
例■ 安定性を時間にわたって調べた。ＮＲ２ＡＤは非標的特異的（不適切な）単クロ ーン性抗体である。全（最初の）調剤活性は約１３７ｍＣ１、および６．Ｏａｃ ｉ／ μｇ Ａｂの比活性を有する２、６７：１生成共役体を与える”’Ｒｅ ： Ａｂであった。調剤は上述する標準放射線標識および共役技術を用いて作っ た。共役反応混合物を３種の試料に分け、ＰＤ−１０カラムで精製した。Example ■ Stability was investigated over time. NR2AD is a non-target specific (inappropriate) monoclonal It is a synthetic antibody. Total (initial) formulation activity is approximately 137 mC1, and 6. Oac ''Re gives a 2,67:1 generated conjugate with a specific activity of i/μg Ab : It was Ab. Preparations are made using standard radiolabeling and conjugation techniques as described above. Ta. The conjugation reaction mixture was divided into three samples and purified with a PD-10 column.
調剤■は、放射線免疫共役体温合物をＰＢＳて溶離した対照調剤であり、安定剤 は使用しなかった。調剤■は精製放射性核種共役体のカラム調整（ｃｏｌｕｍｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏ旧ｎｇ）および溶離について用いた安定剤として１−０ｍｇ ／ｍｌのアスコルビン酸を用いた。Preparation ■ is a control preparation in which the radioimmunoconjugate mixture was eluted with PBS, and the stabilizer was not used. Preparation ■ is column preparation of purified radionuclide conjugate. 1-0 mg as stabilizer used for condition (formerly ng) and elution. /ml of ascorbic acid was used.
調剤■は精製共役体のカラム調整および溶離についての２０ｍｇ／ｍｌのアスコ ルビン酸溶液を用いた。さら」こ、調剤■は別に調製し、調剤■の条件と同じ条 件下で精製したか、しかし２２０ｍｇのＨ３Ａを収集ガラスびんに加えた。結果 を次の表に示す：放射線標疫共役体純度 ”’Ｒｅ ＭＡＧＧ−ＧＡＢＡ−ＮＲ２ＡＤ時間 調剤■ 調剤■ 調剤■ 調 剤■上記試験結果は、高い濃度のアスコルビン酸（２０ｍｇ／ｍｌは１ｍｇ／ｍ ｌに匹敵する）は高い安定化効果を与え、およびアスコルビン酸およびＨ３Ａの 組合わせは高い長時間安定化効果を示している。精製カラムを調製するのにおよ びカラム溶出液として用いたｉｏｎｇ／ｍｌのアスコルビン酸を含む安定化溶液 は約１８時間まで満足な安定性を示している。調剤■に用いた２０倍の高い濃度 のアスコルビン酸は調剤Ｉおよび■と比べて有意に向上した安定性を示しており 、および調剤■に用いた２０ｍｇ／ｍｌのアスコルビン酸／２２０ｍｇのＨ３Ａ 安定剤は少なくとも９６時間にわたって９５９６以上の放射性核種組成物純度を 維持することを示している。Preparation ■ is a 20 mg/ml Asco for column preparation and elution of the purified conjugate. A rubic acid solution was used. Preparation ■ should be prepared separately and under the same conditions as Preparation ■. Purified under conditions, but 220 mg of H3A was added to the collection vial. result is shown in the following table: Radiolabel conjugate purity ”’Re MAGG-GABA-NR2AD Time Preparation ■ Preparation ■ Preparation ■ Preparation ■The above test results indicate that a high concentration of ascorbic acid (20mg/ml is 1mg/ml) l) gives a high stabilizing effect, and the ascorbic acid and H3A The combination shows a high long-term stabilization effect. It takes a lot of time to prepare a purification column. iong/ml of ascorbic acid used as column eluent. shows satisfactory stability up to about 18 hours. 20 times higher concentration than used in preparation■ Ascorbic acid shows significantly improved stability compared to formulations I and ■. , and 20 mg/ml ascorbic acid/220 mg H3A used in formulation ■ The stabilizer maintains a radionuclide composition purity of 9596 or higher for at least 96 hours. indicates that it will be maintained.
例■ 比較的に高い比活性を有するＩｓ＠Ｒｅ−〜！ＡＧＧ −ＧＡＢＡ −ＮＲＣＯ −０２Ｆ（ａｂ’ ）２放射線免疫共役体を上述する標準放射線標識および結合 技術（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）により調製した。全（ 初期の）調剤活性は約２１６ｍＣ１であり、および比活性は７．３μＣｉ／μｇ Ａｂであった。調剤を２種の試料に分け、安定性を時間にわたって測定するよ うに監視した。調剤■は安定剤を用いて、しかも共役反応混合物をＰＢＳで溶離 した標準対照調剤であり、および調剤■は上述する例■に記載した調剤■に類似 させた。試験結果を次の表に示す： 放射線標疫共役体純度 ”’Ｒｅ ＭＡＧＧ ＧＡＢＡ ＮＲＣＯ０２Ｆ（ａｂ’ ）２時 間 調剤Ｉ 調剤■ 上記結果は、例■において得た結果、すなわち、精製カラムを調整し、かつ収集 ガラスびんに供給したＨ３Ａとの組合わせの放射線免疫共役体温合物を溶離する のに２０ｍｇ／ｍｌのアスコルビン酸溶液を用いる安定化技術が有意に高められ た長期安定性を与えることを確めた。安定剤を含有しない対照調剤は精製後、た だちに限界的に許容しうる程度の純度を示したにすぎなかった。放射線標識免疫 共役体の長時間安定性（はぼ６日）か７．３μＣｉ／μｇ Ａｂの高いＩｕＲｅ 比活性で得られた。Example ■ Is@Re-~! with relatively high specific activity! AGG-GABA-NRCO Standard radiolabeling and conjugation of -02F(ab')2 radioimmunoconjugates as described above. It was prepared by conjugation techniques. all( The initial) formulation activity is approximately 216 mC1, and the specific activity is 7.3 μCi/μg It was Ab. The preparation was divided into two samples and the stability was measured over time. The sea urchins were monitored. Preparation ■ uses a stabilizer and the conjugate reaction mixture is eluted with PBS. is the standard control formulation, and formulation ■ is similar to formulation ■ described in example ■ above. I let it happen. The test results are shown in the following table: Radiolabel conjugate purity ”’Re MAGG GABA NRCO02F (ab’) 2 hours Prescription I Dispensing■ The above results are similar to those obtained in Example ■, i.e., adjusting the purification column and collecting Elute the radioimmunoconjugate complex in combination with H3A supplied in the vial. The stabilization technique using a 20 mg/ml ascorbic acid solution was significantly enhanced. It was confirmed that it provided long-term stability. A control preparation containing no stabilizer was purified after purification. It immediately showed only marginally acceptable purity. radiolabeled immunology Long-term stability of the conjugate (6 days) or 7.3μCi/μg of IuRe with high Ab Obtained by specific activity.
例■ 例■に記載した試験を”’Ｒｅ−ＭＡＧＧ−ＧＡＢＡ−ＮＲＬＬＩ−１０放射線 免疫共役体の安定性を試験するのに繰返し行った。調剤を２種の試料に分け、調 剤Ｉおよび■を例■に記載したように精製した。試験結果を次の表に示す。Example ■ The test described in Example ■ “’Re-MAGG-GABA-NRLLI-10 Repeats were performed to test the stability of the immunoconjugate. Divide the preparation into two types of samples and Agents I and ■ were purified as described in Example ■. The test results are shown in the table below.
放射線免疫共役体純度 ”’Ｒｅ−ＭＡＧＧ−ＧＡＢＡ−ＮＲＬＵ−１０時 間 調剤Ｉ 調剤■ 精製カラムを予備調整し、かつＨＳＡと組合わせの放射線免疫共役体反応混合物 を溶離するのに２０ｍｇ／ｍｌのアスコルピ°ン酸溶液を用いる安定化技術か６ 日までの著しく高められた長時間安定性を示し、および高い初期調剤純度を得ｊ こ。結果（ま調剤１の高い比活性の観点において、特に有意である。Radioimmunoconjugate purity ”’Re-MAGG-GABA-NRLU-10 o’clock Preparation I Preparation■ Precondition the purification column and combine radioimmunoconjugate reaction mixture with HSA. A stabilization technique using a 20 mg/ml ascorpic acid solution to elute It exhibits significantly enhanced long-term stability up to 10 days and obtains high initial formulation purity. child. The results are particularly significant in view of the high specific activity of Formulation 1.
例■ ３種の安定剤、アスコルビン酸、ゲンチシン酸およびＤＴＰＡを類似条件下で試 験して放射線免疫共役体のインビトロ安定イヒ（こついての効力を調べた。 ” ’Ｒｅ−ＭＡＧＧ−ＧＡＢＡ−ＮＲ２ＡＤ放射線免疫共役体を上述する標準放射 線標識および結合技術により作った。調剤は約５．１μＣｉ／μｇ Ａｂの活性 を有していた。各精製カラムを安定剤を含有する調整溶液で処理し、放射線免疫 共役体温合物を安定剤溶液を用いて溶離した。安定剤としては、調剤Ｉては２０ ｍｇ／ｍｌのアスコルビン酸；調剤■では２０ｍｇ／ｍｌのゲンチシン酸：およ び調剤■ては２０ｍｇ／ｍｌのＤＴＰＡを用いた。試験結果を次の表に示す： 放射線免疫共役体純度 ’ ” ’ Ｒｅ −ＭＡＧＧ −ＧＡＢＡ −ＮＲ２ＡＤ時間 調剤工 調剤 ■ 調剤■ （アスコルビン酸） （ゲンチシン酸） （ＤＴＰＡ）上記結果は、アスコルビ ン酸か長時間安定化を与えるか、しかしゲンチシン酸が約２４時間にわたる満足 な安定化を与えることを示している。ＤＴＰＡ調剤は満足な安定性が約４時間に わたる程度であることを示している。各安定剤は、放射線免疫共役体を溶離しお よびＰＢＳで貯蔵した調剤と比べた安定化効果を示している。アスコルビン酸は 好ましい長時間安定剤である。Example ■ Three stabilizers, ascorbic acid, gentisic acid and DTPA, were tested under similar conditions. We investigated the in vitro stability and efficacy of the radioimmunoconjugate. 'Re-MAGG-GABA-NR2AD radiation immunoconjugate as described above. Made by line labeling and bonding techniques. The preparation has an activity of approximately 5.1 μCi/μg Ab It had Treat each purification column with a conditioning solution containing stabilizers and radioimmunize. The conjugate complex was eluted using a stabilizer solution. As a stabilizer, Preparation I is 20 mg/ml ascorbic acid; Preparation ■: 20 mg/ml gentisic acid: and 20 mg/ml DTPA was used in the preparation. The test results are shown in the following table: Radioimmunoconjugate purity ’ ” ’ Re -MAGG -GABA -NR2AD Time Dispensing Work Dispensing ■ Dispensing ■ (Ascorbic acid) (gentisic acid) (DTPA) The above results are based on ascorbic acid. gentisic acid provides long-term stabilization, but gentisic acid provides satisfactory stability for about 24 hours. It has been shown that this provides significant stabilization. The DTPA formulation has satisfactory stability for about 4 hours. This indicates that the level of Each stabilizer elutes the radioimmunoconjugate and and the stabilizing effect compared to formulations stored in PBS. Ascorbic acid is Preferred long-term stabilizers.
例■ アスコルビン酸、ゲンチシン酸およびＤＴＰＡを含む安定剤におけるＨＳＡの効 果を評価するために、例■に記載したと同じ安定化試験を繰返し行った。 ”６ Ｒｅ−ＭＡＧＧ−ＧＡＢＡ−ＮＲＬＵ−１０放射線免疫共役体を上述する標準放 射線標識および結合技術により作った。調剤の比活性は約６．１μＣｉ／μｇ Ａｂであった。調剤工、■および■に用いた安定剤は、例■（「Ａ」欄）に記載 するようにして、ＨＳＡ （２２０ｍｇ）を収集ガラスびんに追加供給した。「 Ｂ欄」はＨＳＡを加えない場合を示している。試験結果を次の表に示す： 放射線免疫共役体純度 ”’Ｒｅ−ＭＡＧＧ−ＧＡＢＡ−ＮＲＬＬＩ−１０時間 調剤工 調剤■ 調剤 ■ （アスコルビン酸）（ゲンチノン酸’） （ＤＴＰＡ）上記結果は、ＨＳＡを他 の安定剤、例えばアスコルビン酸、ゲンチシン酸またはＤＴＰＡと組合わせて用 いた場合に、放射線免疫上述するように、本発明をある好適例について記載して いるが、本発明は追加具体例を実施でき、および本発明の基本原理を逸脱しない かぎり種々変更を加えることができる。Example ■ Efficacy of HSA in stabilizers containing ascorbic acid, gentisic acid and DTPA In order to evaluate the results, the same stabilization test as described in Example 2 was repeated. ”6 Re-MAGG-GABA-NRLU-10 radioimmunoconjugate as described above Made by radiation labeling and bonding techniques. The specific activity of the preparation is approximately 6.1μCi/μg It was Ab. The stabilizers used in compounding process, ■ and ■ are listed in example ■ (column "A") Additional HSA (220 mg) was added to the collection vial as follows. " "Column B" shows the case where HSA is not added. The test results are shown in the following table: Radioimmunoconjugate purity ”’Re-MAGG-GABA-NRLLI-10 Hours Dispensing Work Dispensing■ Dispensing ■ (Ascorbic acid) (gentinonic acid’) (DTPA) The above results indicate that HSA and other in combination with stabilizers such as ascorbic acid, gentisic acid or DTPA. As mentioned above, the invention has been described for certain preferred embodiments. However, the invention may be implemented with additional embodiments without departing from the basic principles of the invention. Various changes may be made.
補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条７の第１項）平成４年 ３月 １９日Copy and translation of written amendment) Submission (Article 184, Paragraph 7, Paragraph 1 of the Patent Act) March 1992 19th
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