JPH05502098A - Agglutination assay - Google Patents

Agglutination assay

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JPH05502098A
JPH05502098A JP2513474A JP51347490A JPH05502098A JP H05502098 A JPH05502098 A JP H05502098A JP 2513474 A JP2513474 A JP 2513474A JP 51347490 A JP51347490 A JP 51347490A JP H05502098 A JPH05502098 A JP H05502098A
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sample
assay
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JP2513474A
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ヒルヤード，カーメル　ユーディス
リラット，デニス　ブライアン
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エージェン　リミテッド
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 凝　集　検　定 技術分野 本発明は、人間や動物の血液のようなサンプル中の抗原、抗体またはその他の分 析対象を凝集検定により検出するための試薬ならびに方法に関するものである。[Detailed description of the invention] Collection examination Technical field The present invention provides a method for detecting antigens, antibodies or other components in samples such as human or animal blood. The present invention relates to reagents and methods for detecting an analysis target by an agglutination assay.

また、本発明は前記試薬を含むキットおよび試薬の製造方法にも関するものであ る。The present invention also relates to a kit containing the reagent and a method for producing the reagent. Ru.

発明の背景 背景となる技術の説明 放射免疫検定法（ＲＩＡ）や酵素免疫検定法（ＥＩＡ）などの技術が導入される ようになって以来、免疫学的検定法（及び類似の特異的結合検定法）はヒトの診 断薬や家畜用薬品の分野に革命的な変化をもたらした。放射免疫検定法はＹａｌ ｏｗとＢｅｒｓｏｎによって最初に報告された（ｒＮａｔｕｒｅＪ　１８４　： 　１６４８（１９５９年））ものであり、酵素免疫検定法は８ｎｇｖａｌｌ　、 　Ｐｅｒ１ｍａｎ両名による論文（ｒＩｍｍｕｎｏｃｈｅａ＋Ｊ　８：８７１（ １９７を年））とＶａｎ　Ｗｅｅｍａｎ、　５ｃｈｕｕｒｓの論文（ｒＦ［＋ｆ ｌｌＢｓ　Ｌｅｔｔ、　Ｊ　１５：２３２（１９７１年））により初めて発表さ れている。Background of the invention Explanation of the background technology Technologies such as radioimmunoassay (RIA) and enzyme immunoassay (EIA) are introduced. Since its inception, immunoassays (and similar specific binding assays) have been widely used in human diagnosis. It brought about revolutionary changes in the fields of drug withdrawal and livestock medicine. Radioimmunoassay is Yal ow and Berson (rNatureJ 184: 1648 (1959)), and the enzyme immunoassay method is 8ngvall. Paper by both Per1man (rImmunochea+J 8:871 ( 197)) and the paper by Van Weeman, 5chuurs (rF[+f First published by Lett, J 15:232 (1971). It is.

免疫学的検定法により、被検者の血液中に含まれる特定物質についての精妙な測 定が可能になり、ホルモンのレベルや、血液中に非常に低い濃度（例えばピコモ ル／リットル）で存在する薬物その他の化合物を測定することができるようにな った。このような検定は、抗体／抗原の相互作用に基づくもので、通常、複雑な 検出システムが必要となる。検定に使用される試薬は、通常、特定の酵素もしく は放射性同位元素などによって標識された抗原、抗体、もしくはそれらの複合体 であり、特定の基質を用いて保温され、滴定の終点の色を肉眼で見るか、比色計 を用いて測定するか、あるいは放射線測定装置によって放射性物質の崩壊を測定 して検定対象となる物質の存在を検出するという手続が必要になる。さらに、上 記のような検定には、洗浄という手順が数回関わってくる。血液中の特定物質を 検出するために現在用いられている免疫学的検定はほとんど、以上のようなもの である。Immunological assays allow precise measurements of specific substances contained in a subject's blood. It is now possible to determine the level of hormones and very low concentrations in the blood (e.g. It is now possible to measure drugs and other compounds present in It was. Such assays are based on antibody/antigen interactions and typically involve complex A detection system is required. The reagents used in the assay are usually specific enzymes or is an antigen, antibody, or a complex thereof labeled with a radioactive isotope, etc. is incubated using a specific substrate and the color at the end of the titration can be observed with the naked eye or with a colorimeter. or by measuring the decay of radioactive substances with a radiation measuring device. A procedure is required to detect the presence of the substance to be tested. Furthermore, on A test like the one described above involves several washing steps. specific substances in the blood Most immunoassays currently used to detect It is.

さらに、上記のような検定は非常に微妙な性質のものであり、時間がかかる上、 さまざまな手続や高価な設備が必要とされる。Furthermore, the above-mentioned tests are very delicate in nature, time-consuming, and Various procedures and expensive equipment are required.

ＲＩＡやＥＩＡのような検定の代わりに、凝集を利用した免疫学的検定を用いる ことができる。この検定は、ｃｕｐｔａらがｒＪ、　［ｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔ ｈ、　Ｊ誌の８０：１７７−１８７　（１９８５年）に発表した論文で説明して いるようなタイプのものである。前記の論文には、赤血球や抗赤血球抗体を用い た標識システムが示されている。典型的な例でいえば、このような免疫学的検定 にはヒツジの赤血球など種の異なる動物の赤血球が用いられる。この分析技術の 分野においては直接凝集検定、間接凝集検定の双方が知られている。抗原を検定 するための従来の直接凝集検定においては、赤血球を抗体で覆ってサンプルと反 応させる方法かとられている。多機能抗原が被覆された赤血球の間の架橋子とし て作用し、凝集を生じさせる。間接凝集検定においては、赤血球を抗原で覆い、 これに溶性の抗体ならびにサンプルをそれぞれ接触させる。サンプル中の抗原は 、抗体により敏感になった赤血球が結び付こうとする作用に逆らってこれを妨げ 、その結果凝集が生じる。Use immunoassays that utilize agglutination instead of assays such as RIA and EIA be able to. This test was performed by Cupta et al. h, as explained in a paper published in J. 80:177-187 (1985). It's the type of thing you would expect. The above paper uses red blood cells and anti-erythrocyte antibodies. A signage system is shown. A typical example is an immunoassay like this Red blood cells from different species of animals, such as sheep red blood cells, are used for this purpose. This analysis technique Both direct and indirect agglutination assays are known in the art. Assay antigen In traditional direct agglutination assays, red blood cells are coated with antibodies and then reacted with the sample. It is said that this is a way to make people respond. As a cross-linker between red blood cells coated with multifunctional antigens and cause aggregation. In indirect agglutination assays, red blood cells are coated with antigen; A soluble antibody and a sample are brought into contact with this. The antigen in the sample is , which counteracts and prevents the binding of red blood cells that have become more sensitive to antibodies. , resulting in agglomeration.

凝集検定には、上記以外の凝集性粒子が用いられることもある。例えば、Ｃａ５ ｔｅｌａｎらの論文（ｒＪ、ｃｌｉｎ、　Ｐａｔｈｏｌ、　Ｊ　２１：６３８　 （１９６８）に掲載）やＳｉｎｇｅｒらの論文ＣｒＡｔａｅｒ、　Ｊ、　Ｍｅｄ 、　Ｊ　［１９５６（Ｄｅｃ）］：８８８）ではラテックスによる凝集検定が示 されている。Aggregating particles other than those mentioned above may be used in the agglutination assay. For example, Ca5 Telan et al.'s paper (rJ, clin, Pathol, J 21:638 (1968)) and Singer et al.'s paper CrAtaer, J., Med. , J [1956 (Dec)]: 888) showed an agglutination assay using latex. has been done.

Ｍｏ１ｉｎａｒｏは米国特許４．１３０．６３４号の中で、外来性の赤血球を予 め抗体で包んで用いた凝集検定について説明している。抗赤血球抗体による赤血 球の無差別的な凝集という問題については、Ｃｚｉｓｍａｓが米国特許３．６３ ９．５５８号において指摘している。Ｃｚｉｓｍａｓは、赤血球細胞をタンパク で覆うことによって、赤血球上に自然に抗原の部位が発生しないようにすること を提案している。Ｃｈａｎｇは米国特許４．４３３．０５９号において、外来性 の赤血球細胞を電子対の共有によって「テール・トウ・テール（尻尾どうしが結 び付（こと）」の形で結合した抗赤血球抗体（通常１価）によって覆うという方 法を示している。抗赤血球抗体は異種二価性結合剤によって抗−被検出物質の抗 体に結合される。Ｓｍ１ｔｈによる国際特許０８８１０５９３１号、Ｇｉｂｂｏ ｎｓによる米国特許４．３２９．０１１号、Ｓｍ４ｔｈ、ＩＩＩによる米国特許 ４．９００．６８５号なども参照されたい。米国特許４．９００．６８５号では 、凝集される赤血球はサンプルと同一の出処を持つものである。Ｈｉｌｌｙａｒ ｄ、　Ｒｙｌａｔｔ、　Ｋｅｃｐ。Molinaro, in U.S. Pat. No. 4,130,634, This paper describes an agglutination assay using a pre-coated antibody. Red blood due to anti-erythrocyte antibodies Regarding the problem of indiscriminate agglomeration of spheres, Czismas reported in U.S. Pat. This is pointed out in No. 9.558. Czismas converts red blood cells into protein to prevent antigen sites from naturally occurring on red blood cells by covering them with is proposed. Chang, in U.S. Pat. No. 4.433.059, By sharing electron pairs, the red blood cells in Those who cover it with anti-erythrocyte antibodies (usually monovalent) bound in the form of shows the law. Anti-erythrocyte antibodies are used to bind the anti-analyte to the target substance using a heterobivalent binding agent. connected to the body. International Patent No. 088105931 by Sm1th, Gibbo U.S. Patent No. 4.329.011 by ns, U.S. Patent by Sm4th, III See also No. 4.900.685. In U.S. Patent No. 4.900.685 , the red blood cells to be agglutinated are of the same origin as the sample. Hillyar d, Rylatt, Kecp.

Ｂｕｎｄｅｓｅｎによる米国特許４．８９４．３４７号は、サンプルと同一の出 処に由来する赤血球を標識分子として用い、赤血球結合分子を検定対象物質と結 合可能な分子（直接凝集検定の場合）もしくは検定対象物質の類似化合物（間接 凝集検定の場合）のいずれかと接合（共役結合）させた凝集剤を使用した血液（ 全血）サンプルのための凝集免疫検定について示している。この特許は、たとえ 赤血球結合分子が多価であっても、それがグリコホリンのような豊富に供給され る膜組織の構成物質として認識された場合には、無差別凝集が回避できるという 点に着目したものである。U.S. Pat. No. 4.894.347 by Bundesen, Using red blood cells originating from the Molecules that can be combined (in the case of direct agglutination assay) or similar compounds of the substance to be assayed (indirect Blood (for agglutination assay) using a flocculant conjugated (conjugated) with either Figure 2 shows an agglutination immunoassay for whole blood samples. This patent applies even if Even if the red blood cell-binding molecule is multivalent, it can be It is said that indiscriminate aggregation can be avoided if it is recognized as a component of the membrane structure. It focuses on points.

本書の名義人と同一人による米国特許４．８９４．３４７号においては、抗原に 由来する物質が２つの抗体分子を同時に結合するに充分なほどの大きさを持って いるがエピトープ（抗原決定基）の反復を欠いている場合、その抗原物質を検出 するための凝集検定において、凝集を生じさせるためには、抗原は免疫反応試薬 と相互作用し、少なくともいくつかの抗原分子が近在する赤血球の間の架橋子と して作用するようにしなければならないことが指摘されている。そのためには、 ２つ以上の異なる接合体を含む試薬（ＡＢＭＩ／Ｅ！ＢＭ　＋ＡＭＢ２／ＥＢＭ など）を使用するという方法が考えられる。前記のｒＥＢＭＪとは、赤血球結合 分子を意味し、ｒＡＢＭｌ」ならびにｒ　ＡＢＭ２Ｊは検定対象物質結合分子を 表しており、該分子は検定対象物質の異なる非重複性、非反復性エピトープに特 異的である。このタイプの凝集検定は図１　（ｂ）に示されている。U.S. Pat. The derived material is large enough to bind two antibody molecules simultaneously. detects antigenic substances when the antigenic substance lacks repeats of epitopes (antigenic determinants) In agglutination assays for agglutination, the antigen must be used as an immunoreactive reagent to cause agglutination. and at least some antigen molecules act as cross-linkers between nearby red blood cells. It has been pointed out that it is necessary to make it work by for that purpose, Reagents containing two or more different conjugates (ABMI/E!BM + AMB2/EBM ) could be used. The rEBMJ mentioned above refers to red blood cell binding. "rABMl" and rABM2J refer to the analyte binding molecule. The molecule is unique to different non-redundant, non-repetitive epitopes of the analyte. It's different. This type of agglutination assay is illustrated in Figure 1(b).

しかしながら、前述の方法には欠陥があり、特に検定対象物質の濃度が低い場合 （例えばＨＣＧが１０ナノメートル以下の場合）にその欠点が顕著となる。ＡＢ ＭＩ／　［ｌＢＭの分子とＡＢＭ２／　ＥＢＭの分子が一度に一つの赤血球しか 結合できないというのがその欠点である（図１（Ｃ）参照）。However, the aforementioned methods have deficiencies, especially when the concentration of the analyte is low. (For example, when HCG is 10 nanometers or less), the disadvantage becomes noticeable. AB MI/[lBM molecules and ABM2/EBM molecules only contain one red blood cell at a time. Its disadvantage is that it cannot be combined (see FIG. 1(C)).

そのため、結合された検定対象物質の分子は近在する赤血球の間の架橋子として 作用することができず、凝集が促進されない。Ｓｍ１ｔｈによる米国特許４．５ ７８．３６０号ならびに同４．４０１．７６４号には、赤血球結合分子と標識子 結合分子との接合体についての説明がなされている。また、Ｃｈｕによる米国特 許４．４９３．７９３号では、電子対の共存により結合したレクチン抗体もしく はレクチン抗原の接合体を作り出すという方法が示されている。Ｓｅｇａｌによ る米国特許４．６７６、９８０号は、抗体−抗原免疫療法的な接合体を生じさせ て、標的（１１瘍など）の細胞と細胞毒性効果を持つ細胞とを結合させるという ものである。Ｆｒｅｙｔａｇによる米国特許４．５１７．３０３号では、検定対 象物質の類似化合物と細胞溶解素（メリチンなど）との接合体による免疫学的分 解検定が説明されている。Ｉｊによる米国特許４．６６１．４４１号は、検定対 象物質結合抗体と検定対象物質の一部の遺伝子型と結合する特定の抗体との接合 に言及している。Therefore, the bound analyte molecules act as bridges between nearby red blood cells. cannot act and aggregation is not promoted. US Patent 4.5 by Sm1th No. 78.360 and No. 4.401.764 describe red blood cell binding molecules and markers. Conjugates with binding molecules are described. Also, the US special by Chu No. 4.493.793 discloses that lectin antibodies or has been shown to produce lectin antigen conjugates. By Segal No. 4,676,980, which produces antibody-antigen immunotherapeutic conjugates. It is said that it combines target cells (such as 11 tumors) with cells that have a cytotoxic effect. It is something. No. 4,517,303 to Freytag, the test vs. Immunological isolation using a conjugate of a compound similar to a chemical substance and a cytolysin (such as melittin) The solution test is explained. U.S. Pat. No. 4,661,441 by I.J. Conjugation of an antibody that binds to a target substance with a specific antibody that binds to some genotypes of the target substance is mentioned.

Ｗａｒｄｌａｗの米国特許４．６９５．５５３号、Ｇｕｅｓｄｏｎの米国特許４ ．６６８．９３７は、「普遍的」な抗赤血球抗体に関連したものである（　Ｍｃ Ｌａｕｇｈｌｉｎの米国特許４．６８３．１９６号も併せて参照のこと）。他方 、特定タイプ専用の抗体について述べた特許には、Ｌｌｏｙｄの米国特許４．６ ７８．７４７号、Ｇｒａｈａｍ　Ｊｒ、による同４．３５８．４３６号、Ｌｕに よる同４．５５０．０１７号、Ｓｔｅｐｌｅｗｓｋｉによる同４．６０７．００ ９号、Ｌｅｎｎｏｘによる国際特許ＷＯ３３１０３４７７号などがある。また、 ＢｉｇｔｅｅとＭｏ１ｅｃの論文（ｒＭｏｌｅｃ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｊ　２ ０：１３５３−１３６２（１９８３年）に掲載）は、抗グリコホリンモノクロー ナル抗体の製造と検定について説明したものである。Ｗａｒｄｌａｗは、血液（ 全血）を遠心分離機にかけて得たサンプル中の赤血球と白血球の間のインタフェ ースを明らかにするために抗グリコホリン抗体の使用を提案している。以上の参 考文献は、いずれも、赤血球結合分子を他の物質の結合分子とを「テール・トウ ・テール」で接合させる方法については開示していない。Wardlaw U.S. Pat. No. 4.695.553, Guesdon U.S. Pat. ．． 668.937 is related to the “universal” anti-erythrocyte antibody (Mc See also Laughlin, US Pat. No. 4,683,196). on the other hand , patents describing specific types of antibodies include Lloyd U.S. Pat. No. 78.747, by Graham Jr., No. 4.358.436, to Lu. 4.550.017 by Steplewski, 4.607.00 by Steplewski No. 9, and International Patent WO33103477 by Lennox. Also, Bigtee and Molec paper (rMolec, Immunol, J2 0:1353-1362 (1983)) is an anti-glycophorin monochrome. This paper describes the production and assay of null antibodies. Wardlaw is blood ( The interface between red blood cells and white blood cells in a sample obtained by centrifuging whole blood proposed the use of anti-glycophorin antibodies to reveal the origin of the disease. The above reference All of the literature describes the relationship between red blood cell binding molecules and binding molecules of other substances by "tail tow". ・The method for joining by "tail" is not disclosed.

本発明の関連技術分野においては、血液サンプルを一定分量ずつ複数に分割し、 後に別々に検定を行って異なる検定対象物質を検出することが可能であることは よく知られている。しかし、血液サンプルを分割し、分割された一定量のサンプ ルを異なる凝集試薬に反応させ、その後にサンプルを再び合成することによって 単一の検定対象物質に対する感度を一層高めるという方法について教示もしくは 示唆した文献は発見できなかった。In the technical field related to the present invention, a blood sample is divided into multiple aliquots, It is possible to perform separate assays later to detect different substances to be assayed. well known. However, it is possible to divide a blood sample and obtain a fixed amount of the divided sample. by reacting the sample with different agglutination reagents and then resynthesizing the sample. Teach or teach methods to further increase sensitivity to a single substance The suggested document could not be found.

Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｕｌｏｓ　（米国特許４．３４２．５６６号）　、Ｄｕｅ ｒｍｅｙｅｒ（同４．２９２．４０３号）　、　Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ　（同４ ．３３１．６４７号）らは、免疫学的検定において抗体全体を使用する代わりに 抗原結合能力のある抗体の破片を使用するという方法を提言している。異種二価 抗体の使用を示唆しているのはＡｕｄｉｔｏｒｅ−Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓの特許 （米国特許４．４４６．２３３号）である。Ｐａｕｌｕｓ　（米国特許４．４４ ４．８７８号）　、Ｒｅａｄｉｎｇ（同４．４７４．８９３号）　、Ｍｏｃｈｉ ｄａ　（同４，２００，４３６　）らは、１価抗体もしくはその抗原結合能力の ある破片をある種の免疫学的検定に使用する方法を開示している。Ｐｏｒｒｅｓ ｔによる米国特許４．６５９．６７８号）は、１価抗体は抗体と結び付いても二 量体以上の複合体を形成することができないと指摘し、そのような１価の抗原− 抗体凝集体は抗原−抗体複合体の結合が固体相の形成に至るのを妨げることがで きると述べている。Theofilopoulos (U.S. Pat. No. 4.342.566), Due rmeyer (4.292.403), Goldenberg (4.292.403), Goldenberg (4.292.403), ．． 331.647) et al. instead of using whole antibodies in immunoassays. They propose a method that uses fragments of antibodies that have antigen-binding ability. Heterogeneous bivalent Auditore-Hargreaves patent suggests the use of antibodies (U.S. Pat. No. 4,446,233). Paulus (U.S. Patent 4.44 4.878), Reading (No. 4.474.893), Mochi da (4,200,436) et al. Discloses methods for using certain fragments in certain immunoassays. Porres U.S. Pat. No. 4,659,678) by T. He points out that such monovalent antigens cannot form complexes with more than one molecule. Antibody aggregates can prevent antigen-antibody complex binding from forming a solid phase. It states that it can be done.

従来の赤血球凝集検定は、一般に放射免疫検定（ＲＩＡ）や酵素免疫検定（ＥＩ Ａ）よりも迅速に行うことができるが、精度はより劣る。米国特許４．８９４． ３４７号に示されているような自己由来の赤血球細胞を凝集させる技術を採用す ることで、赤血球凝集検定の速度と精度を高めることが可能である。前記の技術 の長所は、血液を分離する必要がないことと、１本の指から採取した血液だけで 検定サンプルが充分作れることである。エピトープの反復を含む分子量の大きな 物質を検出したい場合には、前記のような検定法で充分な精度を実現することが でき本発明者等は、関連技術分野において、自家凝血検定の精度向上に対するニ ーズがあること、特にヒトの妊娠の初期段階で分泌される絨毛性性腺刺激ホルモ ン（ＨＣＧ）のようなホルモンの検出のためには自家凝血検定の精度向上が必要 とされていることを認識している。自家凝血検定の精度が一層向上すれば、小さ な分子に対する免疫検定の際にも抑制検定の代わりにこの方法を用いることがで きる。抑制検定は本質的に直接検定よりも精度が低く、終点の定義もより困難で ある。Traditional hemagglutination assays are generally radioimmunoassays (RIA) and enzyme immunoassays (EI). A) is faster, but less accurate. U.S. Patent 4.894. 347, which employs a technique to agglutinate autologous red blood cells. The speed and accuracy of the hemagglutination assay can be increased by The above technology The advantage is that there is no need to separate the blood, and only blood collected from one finger is required. It is possible to make enough test samples. Large molecular weight molecules containing repeat epitopes If you want to detect a substance, the above-mentioned assay method can achieve sufficient accuracy. The present inventors have discovered the need for improving the accuracy of autologous coagulation assays in the related technical field. chorionic gonadotropin, which is secreted during the early stages of human pregnancy. In order to detect hormones such as HCG (HCG), it is necessary to improve the accuracy of autologous blood coagulation assays. I am aware that this is said to be the case. If the accuracy of autologous blood coagulation assays is further improved, small This method can also be used in place of inhibition assays when performing immunoassays for specific molecules. Wear. Suppression tests are inherently less precise than direct tests, and endpoints are more difficult to define. be.

本書に示されている参考文献は必ずしも先行技術として引用されたものではない 。また、文献はすべて引用により本書に編入される。References provided herein are not necessarily cited as prior art. . Additionally, all references are incorporated into this book by citation.

発明の概要 本発明の目的は、前述したような技術の不充分な点を克服することである。本発 明は、反復決定子のない抗原が低い濃度で存在している場合の検定に役立つもの である。発明者等は、前記のような検定対象物質を直接検定するための方法をこ こに提供するものである。特に、本書においては、検定対象物質の分子と１個の 凝集性粒子との間に多数の「架橋子」を形成することによって精度が失われる恐 れなしに、反復性のない２つのエピトープを有する物質を検出することが可能な 凝集検定についての説明がなされている。Summary of the invention The aim of the invention is to overcome the inadequacies of the technology as mentioned above. Main departure The brightness is useful for assays when antigens without repeat determinants are present at low concentrations. It is. The inventors have developed this method for directly testing the substance to be tested as described above. This is what we provide here. In particular, in this book, the molecule of the test substance and one There is a risk of loss of accuracy due to the formation of many "crosslinkers" with cohesive particles. It is possible to detect substances with two non-repetitive epitopes without The agglutination test is explained.

本発明の第１の実施態様によれば、サンプル中の特定物質検出のための直接凝集 検定が可能となっている。この検定では、検定対象となる物質は第一、第二の２ つのエピトープ（反復性はない）を含んでいる。検定の手順は以下の通りである ： （ａ）凝集可能な粒子と前記検定対象物質の非反復性のエピトープとに同時に結 合する能力を持った、第−及び第二の２つの一次凝集試薬を供給する。前記第− 及び第二の２つの試薬はそれぞれ、前記検定対象物質中に含まれる別々の、重複 しないエピトープに結合する：（ｂ）サンプルの一部（第一分割量）、前記第一 試薬、前記第一試薬と結合する凝集粒子の第一混合物を作る：（Ｃ）サンプルの 別の一部（第二分割量）、前記第二試薬、前記第二試薬と結合する凝集性粒子の 混、金物を作る：（ｄ）前記第−混合物及び第二混合物を混合して第三の混合物 を作る； ここで、第三の混合物における凝集はサンプル中に検定対象物質が存在すること を示す。According to a first embodiment of the invention, direct agglutination for detection of specific substances in samples Testing is possible. In this test, the substances to be tested are the first and second substances. Contains two epitopes (non-repetitive). The test procedure is as follows. : (a) Simultaneous binding of agglutinable particles and non-repetitive epitopes of the substance to be assayed; Two primary agglutination reagents, a first and a second, are provided that have the ability to combine. Said No.- and a second two reagents, each of which is a separate, overlapping component contained in the substance to be assayed. (b) a portion of the sample (first aliquot), said first reagent, forming a first mixture of aggregated particles that binds said first reagent: (C) of the sample; another portion (second aliquot), the second reagent, and the agglomerative particles that bind to the second reagent. Making a mixture and hardware: (d) mixing the first mixture and the second mixture to form a third mixture; make; Here, aggregation in the third mixture indicates the presence of the analyte in the sample. shows.

本発明の第２の実施態様においては、サンプル中の特定物質検出のための直接凝 集検定が可能となっている。In a second embodiment of the invention, direct coagulation for the detection of specific substances in samples is provided. Collection test is possible.

この検定では、検定対象となる物質は第一結合部位を含んでいる。検定の手順は 以下の通りである：（ａ）凝集可能な粒子と前記検定対象物質のエピトープとに 同時に結合し、前記物質のエピトープが結合された時点で第二のエピトープを形 成する能力を持った、第一の一次凝集試薬を供給する； （ｂ）サンプルの一部（第一分割量）、前記第一試薬、前記第一試薬と結合する 凝集粒子の第一混合物を作る＝（Ｃ）凝集可能な粒子と前記第二エピトープを同 時に結合する能力を持った、第二の一次凝集試薬を供給する；（ｄ）サンプルの 別の一部（第二分割量）、前記第二試薬、前記第二試薬と結合する凝集粒子、前 記第二試薬と結合する前記第二エピトープの第二混合物を作る；（ｅ）前記第− 混合物及び第三混合物を混合して第三の混合物を作る： ここで、第三の混合物における凝集はサンプル中に検定対象物質が存在すること を示す。In this assay, the substance to be assayed contains a first binding site. The test procedure is (a) between the agglutinable particles and the epitope of the substance to be assayed; bind simultaneously and form a second epitope at the time the epitope of the substance is bound. providing a first primary agglutination reagent capable of; (b) Combine with a portion of the sample (first aliquot), the first reagent, and the first reagent. Creating a first mixture of agglomerated particles = (C) agglutinable particles and said second epitope are the same (d) supplying a second primary agglutination reagent with the ability to bind to the sample; Another part (second divided amount), the second reagent, the aggregated particles that bind to the second reagent, (e) forming a second mixture of said second epitope that binds said second reagent; Mixing the mixture and a third mixture to form a third mixture: Here, aggregation in the third mixture indicates the presence of the analyte in the sample. shows.

本発明の第３の実施態様においては、サンプル中の２つの異なる検定対象物質を 検出するための２部位置接凝集検定が可能となっている。この検定では、検定対 象となる物質は第一、第二の２種類あり、それぞれが少なくともひとつの検定結 合部位を含んでいる。検定の手順は以下の通りである。In a third embodiment of the present invention, two different test substances in a sample are A two-part agglutination assay is possible for detection. In this test, the test vs. There are two types of substances, the first and the second, each of which has at least one test result. Contains a joint part. The test procedure is as follows.

（ａ）凝集可能な粒子と前記第一検定対象物質とに同時に結合する能力を持った 、第一の一次凝集試薬を供給する：（ｂ）凝集可能な粒子の同一のもしくは異な るエピトープと、前記第二検定対象物質とに同時に結合する能力を持った、第二 の一次凝集試薬を供給する。(a) has the ability to simultaneously bind to agglutinable particles and the first assay target substance; , providing a first primary agglutination reagent: (b) identical or different agglutinable particles; a second assay target substance having the ability to simultaneously bind to the epitope and the second assay target substance; Supply the primary agglutination reagent.

（Ｃ）前記第−及び第二の一次凝集試薬と結合する凝集可能な粒子がサンプル中 に既に存在していない場合には、そのような粒子を加える。(C) agglutinable particles that bind to the first and second primary agglutination reagents are present in the sample; If it does not already exist, add such a particle.

（ｄ）サンプルの一部（第一分割量）、前記第一試薬、結合される凝集粒子との 第一混合物を作り、第一検定対象物質：第一試薬：凝集粒子の複合体を得る；（ ｅ）サンプルの別の一部（第二分割量）、前記第二試薬、結合される凝集粒子と の第二混合物を作り、第一検定対象物質：第一試薬：凝集粒子の複合体を得る： （ｆ）前記第一複合体と第二複合体とに同時に結合する能力を持つ二次凝集試薬 を供給する。いずれの場合も、この試薬は前記検定対象物質が本来有するエピト ープもしくは一次凝集試薬による結合によって形成されたエピトープのいずれか に対応したものでなければならないが、同一の検定対象物質の持つ２つのエピト ープに結合するものであってはならない； （ｇ）前記第一混合物、第二混合物、二次凝集剤を混合して第三の混合物を作る ； ここで、前記第三混合物における凝集は前記第一検定対象物質と第二検定対象物 質がサンプル中に同時に存在することを示す。(d) a portion of the sample (first aliquot), the first reagent, and the aggregated particles to be combined; Make a first mixture to obtain a complex of first test target substance: first reagent: aggregated particles; ( e) another portion of the sample (second aliquot), the second reagent, and the aggregated particles to be combined; Create a second mixture of and obtain a complex of first assay target substance: first reagent: aggregated particles: (f) a secondary agglutination reagent capable of simultaneously binding to the first complex and the second complex; supply. In either case, this reagent will epitope formed by binding with a primary agglutination reagent However, two epitopes of the same substance to be analysed, must not be connected to a group; (g) Mix the first mixture, second mixture, and secondary flocculant to form a third mixture. ; Here, the aggregation in the third mixture is between the first assay target substance and the second assay target substance. indicates that both qualities are present simultaneously in the sample.

本発明の第４の実施態様においては、サンプル中の特定物質検出のための直接凝 集検定が可能となっている。In a fourth embodiment of the present invention, direct coagulation for detection of specific substances in samples is provided. Collection test is possible.

この検定では、検定対象となる物質は第一、第二の２つのエピトープ（瓦復性は ない）を含んでいる。検定の手順は以下の通りである： （ａ）凝集可能な粒子と前記検定対象物質の非反復性のエピトープ１個に同時に 結合する能力を持った第一の一次凝集試薬を供給する： （ｂ）サンプルの一部（第一分割量）、前記第一試薬、前記第一試薬と結合する 凝集粒子の混合物を作る；（ｃ）　！１！二の一次凝集試薬と凝集される分子の 複合体とから成る一次廣集剤を供給する。前記第二試薬は前記検定対象物質の非 反復性のエピトープと結合する能力を有し、第−及び第二の２つの試薬はそれぞ れ、前記検定対象物質中に含まれる別々の、重複しないエピトープに結合する； （ｄ）前記第一混合物、前記−次層薬剤、前記第一試薬と結合する分子を混合し て第二の混合物を作る；ここで、第二の混合物における凝集はサンプル中に検定 対象物質が存在することを示す。In this assay, the substance to be assayed has two epitopes, the first and the second. (not included). The testing procedure is as follows: (a) At the same time, agglutinable particles and one non-repetitive epitope of the substance to be assayed are Provide a first primary agglutination reagent with the ability to bind: (b) Combine with a portion of the sample (first aliquot), the first reagent, and the first reagent. Create a mixture of agglomerated particles; (c)! 1! The second primary agglutination reagent and the molecules to be agglutinated A primary aggregation agent consisting of a complex is supplied. The second reagent is a non-container of the substance to be assayed. The first and second two reagents each have the ability to bind to repetitive epitopes. and bind to separate, non-overlapping epitopes contained in the substance to be assayed; (d) mixing molecules that bind to the first mixture, the second layer drug, and the first reagent; to make a second mixture; where the agglutination in the second mixture is Indicates the presence of the target substance.

本発明のｊｌ！５の実施態様においては、サンプル中の特定物質検出のための直 接凝集検定が可能となっている。jl of the present invention! In embodiment 5, the direct method for detecting a specific substance in a sample is Aggregation assay is possible.

この検定では、検定対象となる物質は第一結合部位を含んでいる。検定の手順は 以下の通りである：（ａ）凝集可能な粒子と前記検定対象物質のエピトープに同 時に結合し、前記物質のエピトープに結合した時点で第二のエピトープを形成す る能力を持った、第一の一次凝集試薬を供給する。In this assay, the substance to be assayed contains a first binding site. The test procedure is (a) the agglutinable particles and the epitope of the substance to be assayed are identical; At the time of binding to the epitope of the substance, a second epitope is formed. The first primary agglutination reagent has the ability to

（ｂ）サンプルの一部（第一分割量）、前記第一試薬、前記第一試薬と結合する 凝集粒子の混合物を作る；（Ｃ）第二の一次凝集試薬と凝集される分子との複合 体とから成る一次凝集剤を供給する。前記第二試薬は前記第二エピトープに結合 する能力を有する。(b) Combine with a portion of the sample (first aliquot), the first reagent, and the first reagent. Creating a mixture of aggregated particles; (C) complexing a second primary aggregation reagent with molecules to be aggregated; supplying a primary flocculant consisting of the second reagent binds to the second epitope have the ability to

（ｄ）前記第一混合物と前記−次層薬剤を混合して第二の混合物を作る： ここで、第二の混合物における凝集はサンプル中に検定対象物質が存在すること を示す。(d) mixing the first mixture and the second layer agent to form a second mixture; Here, aggregation in the second mixture indicates the presence of the analyte in the sample. shows.

本発明の第６の実施態様においては、サンプル中の２つの異なる検定対象物質を 検出するための２部位置接凝集検定が可能となっている。この検定では、検定対 象となる物質は第一、第二の２種類あり、それぞれが少なくともひとつの検定結 合部位を含んでいる。検定の手順は以下の通りである： （ａ）凝集可能な粒子と前記第一検定対象物質とに同時に結合する能力を持った 、第一の一次凝集試薬を供給する；（ｂ）前記の第一の一次凝集試薬と結合する 凝集可能な粒子がサンプル中に既に存在していない場合には、そのような分子を 加える： （Ｃ）サンプルの一部（第一分割量）、前記第一試薬、結合される寮集粒子との 混合物を作り、第一検定対象物質：第一試薬：凝集粒子の複合体を得る；（ｄ） 第二の一次凝集試薬と凝集される分子の複合体とから成る一次凝集剤を供給する 。前記第二試薬は第二の検定対象物質を結合して第二の複合体を形成する能力を 存する； （ｅ）前記第一複合体と第二複合体とに同時に結合する能力を持つ二次凝集試薬 を供給する。いずれの場合も、この試薬は前記検定対象物質が本来有するエピト ープもしくは一次凝集試薬による結合によって形成されたエピトープのいずれか に対応したものでなければならないが、同一の検定対象物質中の２つの複合体を ともに結合するものであってはならない； （ｆ）前記第一混合物、−次凝集剤、二次凝集剤を混合して第二の混合物を作る ： ここで、前記第二混合物における凝集は前記第一検定対象物質と第二検定対象物 質がサンプル中に同時に存在することを示す。In a sixth embodiment of the present invention, two different test substances in a sample are A two-part agglutination assay is possible for detection. In this test, the test vs. There are two types of substances, the first and the second, each of which has at least one test result. Contains a joint part. The testing procedure is as follows: (a) has the ability to simultaneously bind to agglutinable particles and the first assay target substance; , providing a first primary agglutination reagent; (b) binding with said first primary agglutination reagent; If agglutinable particles are not already present in the sample, such molecules are Add: (C) A portion of the sample (first aliquot), the first reagent, and the aggregate particles to be combined. Create a mixture to obtain a complex of first assay target substance: first reagent: aggregated particles; (d) Supplying a primary aggregating agent comprising a second primary aggregating reagent and a complex of molecules to be aggregated . The second reagent has the ability to bind a second analyte to form a second complex. exist; (e) a secondary agglutination reagent having the ability to simultaneously bind to the first complex and the second complex; supply. In either case, this reagent will epitope formed by binding with a primary agglutination reagent However, if two complexes in the same substance to be analysed, shall not be joined together; (f) Mix the first mixture, secondary flocculant, and secondary flocculant to form a second mixture. : Here, the aggregation in the second mixture is between the first assay target substance and the second assay target substance. indicates that both qualities are present simultaneously in the sample.

本発明の第７の実施態様においては、サンプル中に２つの異なる検定対象物質が 同時に存在していることを確認するための２部位置接凝集検定が可能となってい る。In a seventh embodiment of the present invention, two different test substances are present in the sample. A two-part positional agglutination assay is now possible to confirm the simultaneous presence of Ru.

この検定では、検定対象となる物質は第一、第二の２種類あり、それぞれが少な くともひとつの検定結合部位を含んでいる。検定の手順は以下の通りであるら成 る第一の一次凝集剤を供給する。前記第一試薬は第一の検定対象物質を結合して 第一複合体を形成する能力を存する； （ｂ）第二の一次凝集試薬と凝集される分子の複合体とから成る第二の一次凝集 剤を供給する。前記第二試薬は第二の検定対象物質を結合して第二複合体を形成 する能力を有する； （ｅ）前記第一複合体と第二複合体とに同時に結合する能力を持つ二次凝集試薬 を供給する。いずれの場合も、この試薬は前記検定対象物質が本来前するエピト ープもしくは一次凝集試薬による結合によって形成されたエピトープのいずれか に対応したものでなければならないが、同一の検定対象物質中の２つの複合体を ともに結合するものであってはならない； （ｆ）前記サンプル、前記第−及び第二の一次凝集剤、二次凝集試薬を混合して 第一の混合物を作る：ここで、前記第一混合物における凝集は前記第一検定対象 物質と第二検定対象物質がサンプル中に同時に存在することを示す。In this test, there are two types of substances to be tested, the first and second, each with a small amount. Contains at least one assay binding site. The test procedure is as follows. A first primary flocculant is supplied. The first reagent binds a first substance to be assayed. having the ability to form a first complex; (b) a second primary aggregation comprising a second primary agglutination reagent and a complex of molecules to be aggregated; supply the agent. The second reagent binds a second assay target substance to form a second complex. have the ability to; (e) a secondary agglutination reagent having the ability to simultaneously bind to the first complex and the second complex; supply. In either case, this reagent is used to epitope formed by binding with a primary agglutination reagent However, if two complexes in the same substance to be analysed, shall not be joined together; (f) mixing the sample, the first and second primary flocculants, and the secondary flocculating reagent; Make a first mixture: Here, the aggregation in the first mixture is the target of the first assay. Indicates that the substance and the second analyte are present simultaneously in the sample.

本発明の第８の実施態様においては、サンプル中に３つの異なる検定対象物質が 同時に存在していることを確認するための２部位置接凝集検定が可能となってい る。In an eighth embodiment of the present invention, three different test substances are present in the sample. A two-part positional agglutination assay is now possible to confirm the simultaneous presence of Ru.

この検定では、検定対象となる物質は３種類あり、それぞれが少なくともひとつ の検定結合部位を含んでいる。In this test, there are three types of substances to be tested, each with at least one substance. Contains assay binding sites for.

検定の手順は以下の通りである： （ａ）第一凝集粒子と第一検定対象物質に同時に結合する能力を有する第一凝集 試薬を供給する；（ｂ）第二凝集粒子と第二検定対象物質に同時に結合する能力 を存する第二凝集試薬を供給する：（Ｃ）第−及び第二の一次凝集試薬と結合す る凝集可能な粒子がサンプル中に既に存在していない場合には、それぞれの試薬 によって凝集可能な第−及び第二の凝集粒子を加える； （ｄ）サンプルの一部（第一分割量）、前記第一試薬、結合される凝集粒子との 混合物を作り、第一検定対象物質：第一試薬　ｍ集粒子の複合体を得る；（ｅ） サンプルの別の一部（第二分割量）、前記第二試薬、結合される凝集粒子との混 合物を作り、第一検定対象物質：第一試薬・凝集粒子の複合体を得る：（ｆ）前 記第一複合体と第三の検定対象物質とに同時に結合する能力を持つ第一の二次凝 集試薬と、前記第二複合体と第三の検定対象物質に同時に結合する能力を持つ第 二の二次凝集試薬を供給する： （ｇ）前記の第−及び第二混合物と第−及び第二の二次凝集試薬とを混合して第 三の混合物を作る；ここで、前記第三混合物における凝集は、第一、第二及び第 三の検定対象物質がサンプル中に同時に存在することを示す。The testing procedure is as follows: (a) A first agglomerate having the ability to simultaneously bind to the first agglomerate particles and the first substance to be assayed. supplying a reagent; (b) the ability to simultaneously bind to the second aggregated particles and the second analyte; (C) supplying a second agglutination reagent comprising: (C) a first and second agglutination reagent; If no agglutinable particles are already present in the sample, each reagent adding first and second agglomerated particles capable of agglomeration by; (d) a portion of the sample (first aliquot), the first reagent, and the aggregated particles to be combined; Make a mixture and obtain a complex of first assay target substance: first reagent m collection particles; (e) Another portion of the sample (second aliquot), said second reagent, mixed with the aggregated particles to be bound. Make a compound and obtain a complex of the first assay target substance: the first reagent and the aggregated particles: (f) before a first secondary condensate having the ability to simultaneously bind to the first complex and the third substance to be assayed; a second complex having the ability to simultaneously bind to the second complex and the third analyte; Supply two secondary agglutination reagents: (g) mixing the first and second mixtures and the second and second agglutination reagents; where the agglomeration in said third mixture is the first, second and third mixture; Indicates that three analyte substances are present simultaneously in the sample.

本発明の第９の実施態様においては、サンプル中に異なる検定対象物質が同時に 存在していることを確認するための２部位置接凝集検定が可能となっている。こ の検定では、検定対象となる物質は複数あり、それぞれが少なくともひとつの検 定結合部位を含んでいる。検定の手順は以下の通りである： （ａ）第一凝集粒子と第一検定対象物質に同時に結合する能力を有する第一凝集 試薬を供給する；（ｂ）第二凝集粒子と第二検定対象物質に同時に結合する能力 を有する第二凝集試薬を供給する：（Ｃ）第−及び第二の一次凝集試薬と結合す る凝集可能な粒子がサンプル中に既に存在していない場合には、それぞれの試薬 によって凝集可能な第−及び第二の凝集粒子を加える； （ｄ）サンプルの一部（第一分割量）、前記第一試薬、結合される凝集粒子との 混合物を作り、第一検定対象物質：第一試薬：凝集粒子の複合体を得る；（ｅ） サンプルの別の一部（第二分割量）、前記第二試薬、結合される凝集粒子との混 合物を作り、第一検定対象物質：第一試薬：凝集粒子の複合体を得る；（ｆ）前 記第一複合体と第三の検定対象物質とに同時に結合する能力を持つ第一の二次凝 集試薬と、前記第二複合体と第四の検定対象物質に同時に結合する能力を持つ第 二の三次凝集試薬を供給する； （ｇ）前記第三検定対象物質と第一の追加検定対象物質（この例では第五の検定 対象物質となる）とにともに結合する能力を有する第一の三次凝集試薬、前記第 四検定対象物質と第二の追加検定対象物質（この例では第六の検定対象物質とな る）とにともに結合する能力を有する第二の三次凝集試薬・・・・・・というよ うにして、２つの異なる第ｎの追加検定対象物質に同時に結合する能力を有する 第（ｎ＋１　）の三次凝集試薬を加える（ｎは２以上の整数）； （ｈ）前記第一混合物、第二混合物、第−及び第二凝集粒子、第（ｎ＋１　）三 次凝集試薬を合わせて第三の混合物を作る； ここで、前記第三混合物における凝集は複数の異なる検定対象物質がサンプル中 に同時に存在することを示す。In a ninth embodiment of the present invention, different test substances are present in the sample at the same time. A two-part agglutination assay is now possible to confirm its presence. child In this test, there are multiple substances to be tested, and each substance requires at least one test. Contains constant binding sites. The testing procedure is as follows: (a) A first agglomerate having the ability to simultaneously bind to the first agglomerate particles and the first substance to be assayed. supplying a reagent; (b) the ability to simultaneously bind to the second aggregated particles and the second analyte; (C) providing a second agglutination reagent having: If no agglutinable particles are already present in the sample, each reagent adding first and second agglomerated particles capable of agglomeration by; (d) a portion of the sample (first aliquot), the first reagent, and the aggregated particles to be combined; Create a mixture to obtain a complex of first assay target substance: first reagent: aggregated particles; (e) Another portion of the sample (second aliquot), said second reagent, mixed with the aggregated particles to be bound. Prepare a compound and obtain a complex of first assay target substance: first reagent: aggregated particles; (f) before a first secondary condensate having the ability to simultaneously bind to the first complex and the third substance to be assayed; a second complex having the ability to simultaneously bind to the second complex and the fourth analyte; supplying the second tertiary agglutination reagent; (g) The third test target substance and the first additional test target substance (in this example, the fifth test target substance) a first tertiary agglutination reagent having the ability to bind together with the target substance); The four test substances and the second additional test substance (in this example, the sixth test substance) A second tertiary agglutination reagent that has the ability to bind together with has the ability to simultaneously bind to two different nth additional analyte substances. Add the (n+1)th tertiary agglutination reagent (n is an integer of 2 or more); (h) the first mixture, the second mixture, the -th and second agglomerated particles, the (n+1)th third Next, combine the agglutination reagents to form a third mixture; Here, aggregation in the third mixture means that a plurality of different test substances are present in the sample. indicates that they exist simultaneously.

前記ｎの値は通常２から１００である。The value of n is usually between 2 and 100.

本発明の第１Ｏの実施態様においては、粒子を含むサンプル中から３個以上の結 合部位を持つ検定対象物質の検出を行うための凝集検定が可能である。検定内容 は以下の通りである： 粒子結合分子を含む第一接合体と、粒子を含む第一のサンプルから検定対象物質 上の第−及び第二の結合部位に結合する能力を有する検定対象物質結合分子とを 合わせて第一混合サンプルを作り出す； 粒子結合分子を含む第二接合体と、粒子を含む第二のサンプルから検定対象物質 上の第二及び第二の結合部位に結合する能力を存する検定対象物質結合分子とを 合わせて第二混合サンプルを作り出ｒ： 第一混合サンプルと第二混合サンプルとをさらに混合する。さらに混合されたサ ンプル中の凝集は、第一の粒子含有サンプル中に検定対象物質が存在しているこ とを示す。In the first O embodiment of the present invention, three or more particles are detected in a sample containing particles. It is possible to perform an agglutination assay to detect substances to be assayed that have binding sites. Exam content is as follows: A first conjugate containing particle-bound molecules and a substance to be assayed from a first sample containing particles. an analyte binding molecule having the ability to bind to the first and second binding sites on the Combine to create a first mixed sample; A second conjugate containing particle-bound molecules and a substance to be assayed from a second sample containing particles. an analyte binding molecule that has the ability to bind to the second and second binding sites above; Create a second mixed sample by combining: The first mixed sample and the second mixed sample are further mixed. Further mixed samples Agglomeration in the sample indicates the presence of the analyte in the first particle-containing sample. and

本発明の第１１の実施態様においては、血液（全血）サンプル中から特定の抗原 に反応する［ｇＢ抗体を検出するための検定が可能である。検定の手順は以下の 通りである： （ａ）前記血液サンプルが採取された種のＩＲＥに特異的である、［ｇ１１分子 のひとつの部位のみに結合する能力を育する異種二重特異性を持つ抗−赤血球、 抗−１ｇＢ抗体を供給する； （ｂ）前記１ｇＢ抗体と結合する多価抗原を既知量加える；（Ｃ）前記血液サン プルを前記の異種二重特異性を持つ抗体ならびに前記抗原と反応させる： これにより、前記抗原を多価的に結合するＩｇＥ抗体が存在している場合に限り 、前記血液サンプルと同じ由来を持つ赤血球が凝集を起こす。In an eleventh embodiment of the present invention, a specific antigen is detected from a blood (whole blood) sample. Assays are available to detect gB antibodies that react with [gB antibodies]. The test procedure is as follows. That's right: (a) the [g11 molecule is specific for the IRE of the species from which the blood sample was taken; a heterobispecific anti-erythrocyte that develops the ability to bind to only one site of supplying anti-1gB antibodies; (b) adding a known amount of a multivalent antigen that binds to said 1gB antibody; (C) said blood sample; Reacting the pull with the heterobispecific antibody and the antigen: As a result, only when there is an IgE antibody that multivalently binds the antigen, , red blood cells having the same origin as the blood sample undergo agglutination.

本発明の第１２の実施態様においては、血液（全血）サンプル中から特定の抗原 に反応するＩｇＭ抗体を検出するための検定が可能である。検定の手順は以下の 通りである： （ａ）前記血液サンプルが採取された種のＩｇＭに特異的である、１ｇＭ分子の ひとつの部位のみに結合する能力を有する異種二重特異性を持つ抗−赤血球、抗 −ＩｇＭ抗体を供給する： （ｂ）前記１ｇ１４抗体と結合する多価抗原を既知量加える；（Ｃ）前記血液サ ンプルを前記の異種二重特異性を持つ抗体ならびに前記抗原と反応させる： これにより、前記抗原を多価的に結合するＩ［ｉＭ抗体が存在している場合に限 り、前記血液サンプルと同じ由来を持つ赤血球が凝集を起こす。In a twelfth embodiment of the invention, specific antigens from a blood (whole blood) sample are Assays are possible to detect IgM antibodies that react with . The test procedure is as follows. That's right: (a) of 1 gM molecule specific for IgM of the species from which said blood sample was taken; Heterogeneous bispecific anti-erythrocyte, anti-erythrocyte with the ability to bind to only one site - Supplying IgM antibodies: (b) Adding a known amount of multivalent antigen that binds to the 1g14 antibody; (C) Adding a known amount of the multivalent antigen that binds to the 1g14 antibody; (C) Reacting the sample with the heterospecific bispecific antibody and the antigen: This allows only the presence of I[iM antibodies that multivalently bind the antigen. As a result, red blood cells having the same origin as the blood sample cause agglutination.

一般に、第一接合体と第一サンプル、第二接合体と第二サンプルとの混合は通常 １−２分で完了する。第一混合サンプルと第二混合サンプルの混合に要する時間 も通常１−２分である。強い陽性の場合には１０−２０分間に凝集が生じる。Generally, the first conjugate and the first sample, and the second conjugate and the second sample are usually mixed. Completes in 1-2 minutes. Time required to mix the first mixed sample and the second mixed sample It is also usually 1-2 minutes. In case of strong positivity, agglutination occurs within 10-20 minutes.

本発明の第１の実施態様においては、サンプルを２つに分けて使用する。この実 施例では、まず凝集標識分子と検定対象物質の持つ第一の非反復性エピトープと に同時に結合する能力を存する第一の一次凝集試薬（Ｒ１）を分割されたサンプ ルの第一の部分ならびに標識分子（サンプルと同一由来のものであっても外来の ものであってもよい）と混ぜ合わせる。さらに、検定対象物質の持つ第二の非反 復性エピトープに結合するという点を除けば第一の一次凝集試薬と同一の機能を 有する第二の一次凝集試薬（Ｒ２）を分割されたサンプルの第二の部分ならびに 標識分子と混ぜ合わせる。反応の化学量論からいえば、分割されたサンプルのい ずれの部分にも複合していない検定対象物質が基本的に存在しないことになる。In the first embodiment of the invention, the sample is divided into two parts. This fruit In the example, we will first identify the first non-repetitive epitope of the aggregation label molecule and the substance to be assayed. A first primary agglutination reagent (R1) having the ability to simultaneously bind to the first part of the sample as well as the labeled molecule (even if it is from the same source as the sample or foreign (can be mixed with other ingredients). Furthermore, the second non-reactive property of the substance to be tested is It has the same function as the first primary agglutination reagent except that it binds to the reactivating epitope. a second portion of the split sample with a second primary agglutination reagent (R2); and Mix with labeled molecules. In terms of reaction stoichiometry, the split sample Basically, there is no uncompounded substance to be tested in the area of deviation.

また、余分な凝集試薬は分子（Ｐ）に結合される（Ｐ−Ｒ１もしくはＰ−Ｒ２） 。Also, excess agglutination reagent is bound to molecule (P) (P-R1 or P-R2) .

次に２つに分割されたサンプルを再び混ぜ合わせる。Next, the two divided samples are mixed together again.

分子−第一凝集試薬−検定対象物質の複合体においては第二エピトープは結合さ れていないため、第二凝集試薬−分子（Ｐ−１７２）複合体と反応する。分子− 第二凝集試薬−検定対象物質の複合体においては第一エピトープは拘束されてい ないため、第−凝集試薬一分子（Ｐ−Ｒ１）複合体と反応する。それぞれの試薬 の分子は既に（分割サンプルの一方に由来する）１種類の分子に結合されている が、（分割サンプルの他の一方に由来する）他の分子と結合した検定対象物質の 分子１個のみと結合することができる。１個の分子と検定対象物質の分子との間 に多数の架橋が生じるという事態はこうして回避される。In the molecule-first agglutination reagent-analyte complex, the second epitope is not bound. Because it is not aggregating, it reacts with the second agglutination reagent-molecule (P-172) complex. molecule- In the second agglutination reagent-analyte complex, the first epitope is not restricted. Therefore, it reacts with the first agglutination reagent molecule (P-R1) complex. each reagent molecules are already bound to one type of molecule (from one of the split samples) of the analyte bound to other molecules (from the other part of the split sample). Can only bind to one molecule. Between one molecule and the molecule of the substance to be assayed This avoids the occurrence of a large number of crosslinks.

本発明の第２の実施態様は、検定対象物質が当初から単一の、非反復性エピトー プを持っている場合に採用されるものである。この実施態様は、第一試薬と検定 対象物質とが構成する免疫複合体が、試薬または検定対象物質が単独で存在する 場合には見られないエピトープを有するという事実を利用したものである。第二 試薬は、検定対象物質が本来備えているエピトープではなく、前述のようにして 新たに形成されたエピトープに結合する。A second embodiment of the invention provides that the analyte has a single, non-repetitive epitope from the beginning. This will be adopted if the applicant has a This embodiment includes a first reagent and an assay. The immune complex formed by the target substance is present only when the reagent or target substance is present alone. This takes advantage of the fact that it has an epitope that is not found in other cases. second The reagent is not an epitope inherent in the substance to be assayed, but is Binds to newly formed epitope.

本発明の第３の実施態様においては、第三の試薬として二次凝集試薬が用いられ ている。この試薬は検定対象物質を含む第一複合体（分割されたサンプルの第一 の部分に由来する）と接合し、第一試薬によって結合されなかった分子を結合し 、また、検定対象物質を含む第二複合体（分割されたサンプルの第二の部分に由 来する）と接合し、第二試薬によって結合されなかった分子と結合する。第三の 試薬の原子価は、検定対象物質が本来持っているエピトープに特異的であっても 、検定対象物質−第一試薬もしくは検定対象物質−第二試薬の複合体により形成 されるエピトープに特異的であってもよい。In a third embodiment of the present invention, a secondary agglutination reagent is used as the third reagent. ing. This reagent contains the first complex (the first complex of the split sample) containing the substance to be analysed. ) and bind molecules not bound by the first reagent. , and also a second complex containing the analyte (derived from the second part of the split sample). (coming) and binds to molecules not bound by the second reagent. Third The valence of the reagent is determined even if it is specific to the epitope inherent in the substance to be assayed , formed by a complex of the substance to be assayed and the first reagent or the substance to be assayed and the second reagent. may be specific to the epitope being treated.

第三の試薬として、第−複合体−第一複合体、第二複合体−第二複合体の接合を 不可能にするような特異性を持つ試薬を使用すれば、既に同一の粒子に接合して いる検定対象物質の２つの分子が接合することは不可能になり、従って、目的と する凝集がいっそう効率よ（なされることになる。As the third reagent, the conjugation of the first complex-first complex and the second complex-second complex is performed. If we use a reagent with such specificity that it is impossible to It becomes impossible for the two molecules of the analyte to join together, thus achieving the objective The agglomeration that occurs will be made more efficient.

本発明の第１３の実施態様においては、粒子を含むサンプル中から１種類の検定 対象物質を検出するための直接凝集検定に使用する検定キットが提供される。前 記検定キットの内容は以下のようなものである：（ａ）粒子結合分子と、検定対 象物質上の第一結合部位に結合する能力を有する第一検定対象物質結合分子から 成る第一接合体；および （ｂ）粒子結合分子と、検定対象物質上の第二結合部位に結合する能力を有する 第二検定対象物質結合分子から成る第一接合体。In a thirteenth embodiment of the present invention, one type of assay is performed from a sample containing particles. An assay kit for use in a direct agglutination assay for detecting a target substance is provided. Before The contents of the assay kit are as follows: (a) a particle-binding molecule and an assay pair; from the first assay target substance-binding molecule that has the ability to bind to the first binding site on the target substance. a first zygote consisting of; and (b) has the ability to bind to a particle-binding molecule and a second binding site on the substance to be assayed; A first conjugate comprising a second analyte binding molecule.

本発明の第１４の実施態様においては、粒子を含むサンプル中から１個の結合部 位を有する検定対象物質を検出するための直接凝集検定に使用する検定キットが 提供される。前記検定キットの内容は以下のようなものである。In a fourteenth embodiment of the present invention, one binding site is selected from a sample containing particles. The assay kit used for direct agglutination assay to detect the target substance with provided. The contents of the assay kit are as follows.

（ａ）粒子結合分子と、検定対象物質の唯一の結合部位に結合する能力を有する 第一検定対象物質結合分子から成る第一接合体：および （ｂ）粒子結合分子と、検定対象物質に結合している第一検定対象物質に結合す る能力を有する第二検定対象結合分子から成る第一接合体。(a) has the ability to bind to a particle-binding molecule and a unique binding site of the substance to be assayed; A first conjugate comprising a first analyte binding molecule: and (b) Particle-bound molecules and binding to the first assay target substance that is bound to the assay target substance. a first conjugate comprising a second assayed binding molecule having the ability to

本発明の第１５の実施態様においては、粒子を含むサンプル中から２個以上の結 合部位を存する検定対象物質を検出するための２部位置接凝集検定に使用する検 定キットが提供される。前記検定キットの内容は以下のようなものである： （ａ）粒子結合分子と、検定対象物質上の第一結合部位に結合する能力を存する 第一検定対象物質結合分子から成る第一接合体； （ｂ）粒子結合分子と、検定対象物質上の第二結合部位に結合する能力を有する 第二検定対象物質結合分子から成る第二接合体；および （ｃ）検定対象物質上の第三結合部位に結合する能力を有する二量体の検定対象 物質結合分子を含む、架橋子となる試薬。In a fifteenth embodiment of the present invention, two or more particles are detected in a sample containing particles. A test used in a two-part contact agglutination assay to detect a target substance that has a binding site. A fixed kit will be provided. The contents of the assay kit are as follows: (a) has the ability to bind to the particle binding molecule and the first binding site on the substance to be assayed; a first conjugate comprising a first assay target substance-binding molecule; (b) has the ability to bind to a particle-binding molecule and a second binding site on the substance to be assayed; a second conjugate comprising a second analyte binding molecule; and (c) Dimeric assay target that has the ability to bind to the third binding site on the assay target substance A crosslinking reagent containing a substance-binding molecule.

本発明の第１６の実施態様においては、粒子を含むサンプル中から２個以上の結 合部位を有する検定対象物質を検出するための２部位置接凝集検定に使用する検 定キットが提供される。前記検定キットの内容は以下のようなものである： （ａ）粒子結合分子と、検定対象物質上の第一結合部位に結合する能力を有する 第一検定対象物質結合分子から成る第一接合体。In a sixteenth embodiment of the present invention, two or more particles are detected in a sample containing particles. A test used in a two-part contact agglutination assay to detect test substances that have a binding site. A fixed kit will be provided. The contents of the assay kit are as follows: (a) has the ability to bind to the particle-binding molecule and the first binding site on the substance to be assayed; a first conjugate comprising a first assay target substance-binding molecule;

（ｂ）粒子結合分子と、検定対象物質上の第二結合部位に結合する能力を有する 第二検定対象物質結合分子から成る第二接合体、および （Ｃ）検定対象物質上の第三及び第四の結合部位に結合する能力を有する２価の ハイブリッド検定対象物質結合分子を含む、架橋子となる試薬。(b) has the ability to bind to a particle-binding molecule and a second binding site on the substance to be assayed; a second conjugate comprising a second analyte binding molecule; and (C) a divalent compound capable of binding to the third and fourth binding sites on the substance to be assayed; A reagent that serves as a crosslinker and contains a hybrid assay target substance binding molecule.

本発明の第１７の実施態様においては、粒子を含むサンプル中から２個以上の結 合部位を有する検定対象物質を検出するための２部位置接凝集検定に使用する検 定キットが提供される。前記検定キットの内容は以下のようなものである： （ａ）粒子結合分子と、検定対象物質上の第一結合部位に結合する能力を有する 第一検定対象物質結合分子から成る第一接合体； （ｂ）粒子結合分子と、検定対象物質上の第二結合部位に結合する能力を有する 第二検定対象物質結合分子から成る第二接合体；および （ｃ）検定対象物質上の第三結合部位及び第一検定対象物質結合分子もしくは第 二検定対象物質結合分子の結合によって生じた新たな結合部位に結合する能力を 有する２価のハイブリッド検定対象物質結合分子を含む、架橋子となる試薬。In a seventeenth embodiment of the present invention, two or more particles are detected in a sample containing particles. A test used in a two-part contact agglutination assay to detect test substances that have a binding site. A fixed kit will be provided. The contents of the assay kit are as follows: (a) has the ability to bind to the particle-binding molecule and the first binding site on the substance to be assayed; a first conjugate comprising a first assay target substance-binding molecule; (b) has the ability to bind to a particle-binding molecule and a second binding site on the substance to be assayed; a second conjugate comprising a second analyte binding molecule; and (c) the third binding site on the assay target substance and the first assay target substance binding molecule or third binding site on the assay target substance; 2) The ability to bind to a new binding site created by the binding of the target substance binding molecule. A cross-linking reagent containing a divalent hybrid assay target substance-binding molecule.

本発明の第１８の実施態様においては、粒子を含むサンプル中から２個以上の結 合部位を有する検定対象物質を検出するための２部位置接凝集検定に使用する検 定キットが提供される。前記検定キットの内容は以下のようなものである： （ａ）粒子結合分子と、検定対象物質上の第一結合部位に結合する能力を有する 第一検定対象物質結合分子から成る第一接合体； （ｂ）粒子結合分子と、検定対象物質上の第二結合部位に結合する能力を有する 第二検定対象物質結合分子から成る第二接合体；および （Ｃ）第一検定対象物質結合分子の結合によって生じた新たな結合部位と第二検 定対象物質結合分子の結合によって生じた新たな結合部位において検定対象物質 に結合する能力を有する２価のハイブリッド検定対象物質結合分子を含む、架橋 子となる試薬。In an eighteenth embodiment of the present invention, two or more particles are detected in a sample containing particles. A test used in a two-part contact agglutination assay to detect test substances that have a binding site. A fixed kit will be provided. The contents of the assay kit are as follows: (a) has the ability to bind to the particle-binding molecule and the first binding site on the substance to be assayed; a first conjugate comprising a first assay target substance-binding molecule; (b) has the ability to bind to a particle-binding molecule and a second binding site on the substance to be assayed; a second conjugate comprising a second analyte binding molecule; and (C) New binding site generated by the binding of the first assay target substance binding molecule and the second assay target substance binding molecule The analyte is detected at the new binding site created by the binding of the analyte binding molecule. a cross-linked compound containing a divalent hybrid analyte-binding molecule with the ability to bind to Child reagent.

本発明の第１９の実施態様においては、粒子を含むサンプル中から２個以上の結 合部位を有する検定対象物質を検出するための２部位置接凝集検定に使用する検 定キットが提供される。前記検定キットの内容は以下のようなものである。In a nineteenth embodiment of the present invention, two or more particles are detected in a sample containing particles. A test used in a two-part contact agglutination assay to detect test substances that have a binding site. A fixed kit will be provided. The contents of the assay kit are as follows.

（ａ、）粒子結合分子と、検定対象物質上の第一結合部位に結合する能力を有す る第一検定対象物質結合分子から成る第一接合体： （ｂ）粒子結合分子と、検定対象物質上の第二結合部位に結合する能力を有する 第二検定対象物質結合分子から成る第二接合体；および （Ｃ）検定対象物質上の第−結合部位及び第二結合部位に結合する能力を有する ２価の／）イブリッド検定対象物質結合分子を含む、架橋子となる試薬。(a,) having the ability to bind to the particle-binding molecule and the first binding site on the substance to be assayed; A first conjugate consisting of a first analyte binding molecule: (b) has the ability to bind to a particle-binding molecule and a second binding site on the substance to be assayed; a second conjugate comprising a second analyte binding molecule; and (C) Has the ability to bind to the first binding site and the second binding site on the substance to be assayed. A cross-linking reagent containing a divalent/) hybrid assay target substance-binding molecule.

本発明の第２０の実施態様においては、粒子を含むサンプル中から２個以上の結 合部位を有する検定対象物質を検出するための２部位置接凝集検定に使用する検 定キットが提供される。前記検定キットの内容は以下のようなものである： （ａ）粒子結合分子と、検定対象物質上の第一結合部位に結合する能力を存する 第一検定対象物質結合分子から成る第一接合体； （ｂ）粒子結合分子と、検定対象物質上の第二結合部位に結合する能力を育する 第二検定対象物質結合分子から成る第二接合体；および （ｃ）検定対象物質上の第二結合部位及び第二結合部位における第二検定対象物 質結合分子の結合によって生じた新たな結合部位に結合する能力を有する２価の ハイブリッド検定対象物質結合分子を含む、架橋子となる試薬。In a twentieth embodiment of the present invention, two or more particles are detected in a sample containing particles. A test used in a two-part contact agglutination assay to detect test substances that have a binding site. A fixed kit will be provided. The contents of the assay kit are as follows: (a) has the ability to bind to the particle binding molecule and the first binding site on the substance to be assayed; a first conjugate comprising a first assay target substance-binding molecule; (b) Developing the ability of particle-bound molecules to bind to a second binding site on the analyte a second conjugate comprising a second analyte binding molecule; and (c) a second binding site on the substance to be assayed and a second analyte at the second binding site; A divalent compound that has the ability to bind to a new binding site created by the binding of a binding molecule. A reagent that serves as a crosslinker and contains a hybrid assay target substance binding molecule.

本発明の第２１の実施態様においては、粒子を含むサンプル中から１個以上の結 合部位を有する２種類の検定対象物質を同時に検出するための２部位置接凝集検 定に使用する検定キットが提供される。前記検定キットの内容は以下のようなも のである・ （ａ）粒子結合分子と、第一検定対象物質上の第一結合部位と結合する能力を育 する第一検定対象物質結合分子から成る第一接合体； （ｂ）粒子結合分子と、第二検定対象物質上の第二結合部位と結合する能力を有 する第二検定対象物質結合分子から成る第二接合体；および （Ｃ）第一検定対象物質上の第三結合部位ならびに第二検定対象物質上の第四結 合部位に結合する能力を存する、二量体の検定対象物質結合分子を含む、架橋子 となる試薬。In a twenty-first embodiment of the invention, one or more particles are detected in a sample containing particles. Two-part contact agglutination test for simultaneously detecting two types of test substances that have binding sites An assay kit for regular use is provided. The contents of the test kit are as follows. It is... (a) Cultivate the ability to bind particle-binding molecules to the first binding site on the first assay target substance; a first conjugate comprising a first analyte binding molecule; (b) has the ability to bind to a particle-binding molecule and a second binding site on a second assay target substance; a second conjugate comprising a second analyte binding molecule; and (C) The third binding site on the first substance to be assayed and the fourth binding site on the second substance to be assayed. a cross-linker comprising a dimeric analyte-binding molecule that has the ability to bind to a binding site; reagent.

本発明の第２２の実施態様においては、粒子を含むサンプル中から１個以上の結 合部位を存する２種類の検定対象物質を同時に検出するための２部位置接凝集検 定に使用する検定キットが提供される。前記検定キットの内容は以下のようなも のである； （ａ）粒子結合分子と第一、検定対象物質上の第一結合部位と結合する能力を有 する第一検定対象物質結合分子から成る第一接合体； （ｂ）粒子結合分子と、第二検定対象物質上の第二結合部位と結合する能力を有 する第二検定対象物質結合分子から成る第二接合体；および （ｃ）第一検定対象物質上の第三結合部位ならびに第二検定対象物質に第二検定 対象物質結合分子が結合した結果新たに発生した第二検定対象物質上の第四の結 合部位に結合する能力を存する２価のハイブリッド検定対象物質結合分子を含む 、架橋子となる試薬。In a twenty-second embodiment of the invention, one or more particles are detected in a sample containing particles. Two-part contact agglutination test for simultaneously detecting two types of test substances that have a binding site An assay kit for regular use is provided. The contents of the test kit are as follows. It is; (a) a particle-binding molecule and a first substance having the ability to bind to the first binding site on the substance to be assayed; a first conjugate comprising a first analyte binding molecule; (b) has the ability to bind to a particle-binding molecule and a second binding site on a second assay target substance; a second conjugate comprising a second analyte binding molecule; and (c) A second assay is applied to the third binding site on the first assay target substance and the second assay target substance. A fourth bond on the second test target substance newly generated as a result of the binding of the target substance binding molecule. Contains a bivalent hybrid analyte binding molecule that has the ability to bind to the binding site. , a reagent that serves as a crosslinker.

本発明の第２３の実施態様においては、粒子を含むサンプル中から１個以上の結 合部位を有する２種類の検定対象物質を同時に検出するための２部位置接凝集検 定に使用する検定キットが提供される。前記検定キットの内容は以下のようなも のである： （ａ）粒子結合分子と、第一検定対象物質上の第一結合部位と結合する能力を有 する第一検定対象物質結合分子から成る第一接合体； （ｂ）粒子結合分子と、第二検定対象物質上の第二結合部位と結合する能力を有 する第二検定対象物質結合分子から成る第二接合体；および （ｃ）第一検定対象物質に第一検定対象物質結合分子が結合した結果新たに生じ た第三結合部位ならびに第二検定対象物質結合分子が第二検定対象物質に結合し た結果新たに生じた第四結合部位に結合する能力を有する２価のハイブリッド検 定対象物質結合分子を含む、架橋子となる試薬。In a twenty-third embodiment of the invention, one or more particles are detected in a sample containing particles. Two-part contact agglutination test for simultaneously detecting two types of test substances that have binding sites An assay kit for regular use is provided. The contents of the test kit are as follows. It is: (a) has the ability to bind to the particle-binding molecule and the first binding site on the first assay target substance; a first conjugate comprising a first analyte binding molecule; (b) has the ability to bind to a particle-binding molecule and a second binding site on a second assay target substance; a second conjugate comprising a second analyte binding molecule; and (c) Newly generated as a result of binding of the first test target substance binding molecule to the first test target substance The third binding site and the second assay target substance-binding molecule bind to the second assay target substance. A bivalent hybrid assay with the ability to bind to the newly generated fourth binding site A reagent that acts as a crosslinker and contains a molecule that binds the target substance.

本発明の第２４の実施態様においては、粒子を含むサンプル中から１個以上の結 合部位を有する２種類の検定対象物質を同時に検出するための２部位置接凝集検 定に使用する検定キットが提供される。前記検定キットの内容は以下のようなも のである： （ａ）粒子結合分子と、第一検定対象物質上の第一結合部位と結合する能力を有 する第一検定対象物質結合分子から成る第一接合体： （ｂ）粒子結合分子と、第二検定対象物質上の第二結合部位と結合する能力を存 する第二検定対象物質結合分子から成る第二接合体；および （ｃ）第−及び第二のそれぞれの検定対象物質上に存在する第三の結合部位に結 合する能力を有する２僅の検定対象物質結合分子を含む、架橋子となる試薬。In a twenty-fourth embodiment of the invention, one or more particles are detected in a sample containing particles. Two-part contact agglutination test for simultaneously detecting two types of test substances that have binding sites An assay kit for regular use is provided. The contents of the test kit are as follows. It is: (a) has the ability to bind to the particle-binding molecule and the first binding site on the first assay target substance; A first conjugate consisting of a first analyte binding molecule that: (b) possesses the ability to bind to the particle-binding molecule and the second binding site on the second assay target substance; a second conjugate comprising a second analyte binding molecule; and (c) binding to the third binding site present on each of the first and second assay target substances; A reagent that serves as a crosslinker and contains only two analyte binding molecules that have the ability to combine.

本発明の第２５の実施態様においては、粒子を含むサンプル中から３個以上の結 合部位を持つ検定対象物質を検出するための直接凝集検定に使用する検定キット が提供される。前記検定キットの内容は以下のようなものである： （ａ）粒子結合分子と、検定対象物質上の第−及び第二結合部位と結合する能力 を存する検定対象物質結合分子から成る第一接合体：および （ｂ）粒子結合分子と、検定対象物質上の第三結合部位と結合する能力を有する 検定対象物質結合分子から成る第二接合体。In a twenty-fifth embodiment of the present invention, three or more particles are detected in a sample containing particles. Assay kit used for direct agglutination assay to detect assay target substances with binding sites is provided. The contents of the assay kit are as follows: (a) Ability to bind to the particle-binding molecule and the first and second binding sites on the substance to be assayed. a first conjugate comprising a analyte binding molecule having: and (b) has the ability to bind to a particle-binding molecule and a third binding site on the substance to be assayed; A second conjugate comprising analyte binding molecules.

本発明の第２６の実施態様においては、粒子を含む第一サンプル中から、第−及 び第二の２個の結合部位を有するＩｌｌ類の検定対象物質を検出するための直接 凝集検定に使用する検定キットが提供される。前記検定キットの内容は以下のよ うなものである： （ａ）第一粒子結合分子と、検定対象物質上の第一結合部位に結合する能力を有 する検定対象物質結合分子から成る第一接合体：および （ｂ）粒子を含む第二サンプルを、第二結合部位に結合する能力を有する検定対 象物質結合分子を含む第二接合体及び第二粒子結合分子と混合／反応させること によって作られた試薬。In a twenty-sixth embodiment of the present invention, from the first sample containing particles, and a second binding site for detecting a substance to be analysed. Assay kits for use in agglutination assays are provided. The contents of the test kit are as follows. It is something like: (a) has the ability to bind to the first particle-binding molecule and the first binding site on the substance to be assayed; a first conjugate consisting of a analyte binding molecule that (b) an assay pair capable of binding a second sample containing particles to a second binding site; mixing/reacting with a second conjugate containing a particle-binding molecule and a second particle-binding molecule; reagent made by.

本発明の第２７の実施態様においては、粒子を含む第一サンプル中から、１個の 結合部位を有する１種類の検定対象物質を検出するための直接凝集検定に使用す る検定キットが提供される。前記検定キットの内容は以下のようなものである： （ａ）第一粒子結合分子と、検定対象物質上の結合部位に結合して第二結合部位 を形成する能力を存する検定対象物質結合分子から成る第一接合体；および（ｂ ）粒子を含む第二サンプルを、第二結合部位に結合する能力を存する検定対象物 質結合分子を含む第二接合体及び第二粒子結合分子と混合／反応させることによ って作られた試薬。In a twenty-seventh embodiment of the invention, from the first sample containing particles, one Used in direct agglutination assay to detect one type of assay target substance that has a binding site. A test kit is provided. The contents of the assay kit are as follows: (a) A first particle-binding molecule and a second binding site that binds to a binding site on the substance to be assayed. a first conjugate comprising an analyte binding molecule capable of forming; and (b ) an assay analyte capable of binding a second sample containing particles to a second binding site; by mixing/reacting with a second conjugate containing a particle-binding molecule and a second particle-binding molecule. A reagent made by

本発明の第２８の実施態様においては、粒子を含む第一サンプル中から、２個以 上の結合部位を有する１種類の検定対象物質を検出するための２部位置接凝集検 定に使用する検定キットが提供される。前記検定キットの内容は以下のようなも のである： （ａ）第一粒子結合分子と、検定対象物質上の第一結合部位に結合する能力を有 する第一検定対象物質結合分子から成る第一接合体； （ｂ）粒子を含む第二サンプルを、第二結合部位に結合する能力を有する検定対 象物質結合分子を含む第二接合体及び第二粒子結合分子と混合／反応させること によって作られた試薬、および （ｃ）架橋子となる試薬。In a twenty-eighth embodiment of the present invention, two or more particles are selected from the first sample containing particles. Two-part contact agglutination test for detecting one type of assay target substance with the above binding site An assay kit for regular use is provided. The contents of the test kit are as follows. It is: (a) has the ability to bind to the first particle-binding molecule and the first binding site on the substance to be assayed; a first conjugate comprising a first analyte binding molecule; (b) an assay pair capable of binding a second sample containing particles to a second binding site; mixing/reacting with a second conjugate containing a particle-binding molecule and a second particle-binding molecule; reagents made by, and (c) A reagent that serves as a crosslinker.

架橋子となる試薬としてはい（つかの形態が考えられる。そのひとつは、検定対 象物質上の第三結合部位に結合する能力を有する二量体の検定対象物質結合分子 を含む試薬である。There are several possible forms of cross-linking reagents, one of which is the assay pair. A dimeric analyte-binding molecule that has the ability to bind to a third binding site on a target substance. It is a reagent containing.

別の形態として、検定対象物質上の第三結合部位及び第四結合部位に結合する能 力を有する２価のハイブリッド検定対象物質結合分子を含む試薬である。Alternatively, the ability to bind to the third binding site and the fourth binding site on the substance to be analysed. This is a reagent containing a bivalent hybrid assay target substance-binding molecule that has a strong binding property.

さらに、検定対象物質上の第三結合部位と、第一検定対象物質結合分子が検定対 象物質上の第一結合部位に結合（もしくは第二検定対象物質結合分子が検定対象 物質上の第二結合部位に結合）することによって形成された新たな結合部位とに 結合する能力を有する２価のハイブリッド検定対象物質結合分子を含む試薬も考 えられる。Furthermore, the third binding site on the assay target substance and the first assay target substance binding molecule are connected to the assay target. binds to the first binding site on the target substance (or the second assay target substance-binding molecule binds to the first binding site on the target substance) to a new binding site formed by binding to a second binding site on a substance Reagents containing a bivalent hybrid analyte binding molecule with the ability to bind may also be considered. available.

また、検定対象物質上の第一結合部位と同じく検定対象物質上の第二結合部位に 結合する能力を存する２価のハイブリッド検定対象物質結合分子を含む試薬も使 用できる。In addition, the second binding site on the test substance is the same as the first binding site on the test substance. Reagents containing divalent hybrid analyte binding molecules that have the ability to bind may also be used. Can be used.

さらに別の形態として、検定対象物質上の第二結合部位と、第二検定対象物質結 合分子が第二結合部位に結合することによって生じた新たな結合部位とに結合す る能力を存する２価のハイブリッド検定対象物質結合分子を含む試薬がある。In still another form, a second binding site on the test substance and a second binding site on the test substance are combined. The compound binds to a new binding site created by binding to the second binding site. There are reagents that contain bivalent hybrid analyte binding molecules that have the ability to bind.

本発明の第２９の実施態様においては、粒子を含む第一サンプル中から、それぞ れ１個以上の結合部位を育する２種類の検定対象物質を同時に検出するための２ 部位置接凝集検定に使用する検定キットが提供される。前記検定キットの内容は 以下のようなものである。In a twenty-ninth embodiment of the invention, each of the particles in the first sample containing particles is 2 for simultaneous detection of two types of test substances that develop one or more binding sites. Assay kits are provided for use in site-contact agglutination assays. The contents of the above test kit are It is as follows.

（ａ）第一粒子結合分子と、第一検定対象物質上の第一結合部位に結合する能力 を存する第一検定対象物質結合分子から成る第一接合体： （ｂ）粒子を含む第二サンプルを、第二結合部位に結合する能力を有する検定対 象物質結合分子を含む第二接合体及び第二粒子結合分子と混合／反応させること によって作られた試薬；および （ｃ）架橋子となる試薬。(a) Ability to bind to the first particle binding molecule and the first binding site on the first assay target substance. A first conjugate consisting of a first assay target substance-binding molecule having: (b) an assay pair capable of binding a second sample containing particles to a second binding site; mixing/reacting with a second conjugate containing a particle-binding molecule and a second particle-binding molecule; a reagent made by; and (c) A reagent that serves as a crosslinker.

架橋子となる試薬としてはいくつかの形態が考えられる。そのひとつは、第一検 定対象物質上の第三結合部位ならびに第二検定対象物質上の第四結合部位に結合 する能力を有する２価のハイブリッド検定対象物質結合分子を含む試薬である。There are several possible forms of the crosslinking reagent. One of them is the first Binds to the third binding site on the analyte and the fourth binding site on the second analyte. This is a reagent containing a bivalent hybrid assay target substance-binding molecule that has the ability to

別の形態として、第一検定対象物質上の第三結合部位ならびに第二検定対象物質 結合分子が第二検定対象物質に結合することによって新たに生じた第四結合部位 に結合する能力を存する２価のハイブリッド検定対象物質結合分子を含む試薬で ある。Alternatively, the third binding site on the first analyte and the second analyte A fourth binding site newly created when the binding molecule binds to the second assay target substance A reagent containing a divalent hybrid analyte binding molecule that has the ability to bind to be.

さらに、第一検定対象物質に第一検定対象物質結合分子が結合することによって 新たに生じた第三結合部位ならびに第二検定対象物質結合分子が第二検定対象物 質に結合することによって新たに生じた第四結合部位に結合する結合する能力を 有する２価のハイブリッド検定対象物質結合分子を含む試薬も考えられる。Furthermore, by binding the first assay target substance binding molecule to the first assay target substance, The newly generated third binding site and the second assay target substance-binding molecule become the second assay target substance. The ability to bind to the newly created fourth binding site by binding to the protein A reagent containing a bivalent hybrid assay target substance-binding molecule with

また、第−及び第二の検定対象物質上にそれぞれ存在する第三の結合部位に結合 する能力を存する２価の検定対象物質結合分子を含む試薬も使用できる。In addition, it binds to the third binding site present on the first and second test target substances, respectively. Reagents containing divalent analyte binding molecules that possess the ability to bind to the analyte can also be used.

本発明の第３０の実施態様においては、粒子を含む第一サンプル中から、３個以 上の結合部位を有する１種類の検定対象物質を検出するための直接凝集検定に使 用する検定キットが提供される。前記検定キットの内容は以下のようなものであ る： （ａ）第一粒子結合分子と、検定対象物質上の第−及び第二結合部位に結合する 能力を有する検定対象物質結合分子から成る第一接合体：および （ｂ）粒子を含む第二サンプルを、検定対象物質上の第三結合部位に結合する能 力を有する検定対象物質結合分子を含む第二接合体及び第二粒子結合分子と混合 ／反応させることによって作られた試薬。In a thirtieth embodiment of the present invention, three or more particles are selected from among the first sample containing particles. Used for direct agglutination assay to detect one type of assay target substance with the above binding site. An assay kit for use is provided. The contents of the test kit are as follows. Ru: (a) Binds to the first particle-binding molecule and the first and second binding sites on the substance to be assayed. a first conjugate comprising a analyte binding molecule capable of binding the analyte; and (b) the ability to bind a second sample containing particles to a third binding site on the substance to be assayed; Mixed with a second conjugate containing a binding molecule of the substance to be assayed and a second particle binding molecule having a force. / Reagent made by reacting.

通常、本発明の第２６〜３０の実施態様においては、第二の粒子含存サンプル中 の粒子は第一のサンプル中に含まれる粒子とは異なる。また、一般に、粒子含存 サンプルとしては血液（全血）、***、ハイブリドーマ細胞（融合雑種腫瘍細胞 ）の培養物、微生物発酵や組織培養によって得られたサンプルなどが用いられる 。また、炭水化物、ラテックス（天然もしくは合成のゴムもしくはプラスチック ）、ガラスピーズ、炭水化物（セルロース）、リボゾーム、金属酸化物分子など の合成（もしくは人工的な）粒子を含むものであってもよい。Typically, in embodiments 26 to 30 of the invention, in the second particle-containing sample The particles of are different from the particles contained in the first sample. Additionally, particle-containing Samples include blood (whole blood), semen, and hybridoma cells (fused hybrid tumor cells). ), samples obtained by microbial fermentation or tissue culture are used. . Also, carbohydrates, latex (natural or synthetic rubber or plastic) ), glass peas, carbohydrates (cellulose), ribosomes, metal oxide molecules, etc. It may also include synthetic (or artificial) particles.

図面の簡単な説明 図１（ａ）は、Ｈｊｌｌｙａｒｄの特許において説明されている凝集検定の構成 要素３つ（すなわち、多数のエピトープを持つ粒子、２つの異なる非反復性のエ ピトープを持つ検定対象物質、２種類の一次凝集試薬）を示したものである。２ 種類の凝集試薬はいずれも粒子と結合するが、異なるエピトープにおいて検定対 象物質と結合することはない。Brief description of the drawing Figure 1(a) shows the configuration of the agglutination assay described in the Hjllyard patent. Three elements (i.e., particles with multiple epitopes, two different non-repetitive epitopes) This figure shows two types of primary agglutination reagents, a test substance with a pitope. 2 All types of agglutination reagents bind particles, but at different epitopes. It does not combine with imaginary substances.

ＩＮＩ（ｂ）は、前記の反応要素の連続した（も’Ｌ＜は同時の）結合によって 形成される凝集を示したものである。INI(b) can be obtained by successive (simultaneous) combinations of the above-mentioned reaction elements. It shows the agglomerates that form.

図１（ｃ）は、検定対象物質の分子１個と１個の赤血球との間に多数の架橋子が 形成されることによってどれほど精度が低下しつるかを示したものである。Figure 1(c) shows that there are many crosslinkers between one molecule of the substance to be assayed and one red blood cell. This figure shows how much the accuracy decreases due to the formation of

図２は、本発明を説明したものである。サンプルは２つに分割され、それぞれが 粒子ならびに２種類の一次凝集試薬のうちのいずれかと反応する。これらの分割 された２つの部分を再び混合させたときに形成されるのは、「粒子間」の架橋子 のみである。FIG. 2 illustrates the invention. The sample is divided into two parts, each with Reacts with particles and one of two primary agglutination reagents. These divisions When the two parts are mixed again, a crosslinker between particles is formed. Only.

図３は、前項の発明の一変形を示したものである。この場合、検定対象物質はた だひとつの非反復性のエピトープを持つものでなければならない。左側に示され ている反応において、第一試薬が検定対象物質と結合して新たなエピトープを作 り出し、分割されていたサンプルが再び混合されたときに３右側に示されている 第二試薬がこの新たなエピトープを識別する。FIG. 3 shows a modification of the invention described in the previous section. In this case, the substance to be tested is It must have a single, unique epitope. shown on the left In this reaction, the first reagent binds to the substance to be assayed and creates a new epitope. 3. Shown on the right when the sample that had been extracted and split is mixed again. A second reagent identifies this new epitope.

図４は、二次凝集試薬の使用について説明したものである。この図中においては 、試薬によって識別されるエピトープは第一試薬接合体の形成によって発生した エピトープであるが、必ずしもこのエピトープである必要はない（次回参照）。FIG. 4 illustrates the use of the secondary agglutination reagent. In this figure , the epitope identified by the reagent was generated by the formation of the first reagent conjugate. An epitope, but not necessarily this epitope (see next time).

図５は、二次凝集試薬が２種類の検定対象物質と結び付くさまざまな方法につい て示したものである。すなわち、（ａ）−次試薬によって識別されたのと同一の エピトープに結合する、（ｂ）それぞれの検定対象物質上の第三のエピトープに 結合する、（Ｃ）それぞれの検定対象物質上の第三及び第四のエピトープに結合 する、（ｄ）第三のエピトープと接合体によって形成されたエピトープに結合す る、（ｆ）−次試薬によって識別された１個のエピトープと、検定対象物質が他 の一次試薬と接合した際に形成されたエピトープとに結合する、などの形が考え られる。Figure 5 shows the various ways in which the secondary agglutination reagent binds the two analytes. This is what is shown. i.e. (a)-identical to that identified by the next reagent; (b) to a third epitope on each analyte; (C) bind to the third and fourth epitopes on each assay target substance; (d) bind to the epitope formed by the conjugate with a third epitope; (f) - One epitope identified by the next reagent and the other substance to be assayed. One idea is to bind to the epitope formed when conjugated with the primary reagent. It will be done.

図６は、２種類の検定対象物質について同時測定を行う検定の場合を示したもの である。Figure 6 shows the case of a test in which two types of test target substances are measured simultaneously. It is.

図７は、前に説明したように第一の一次試薬を粒子結合分子とともに使用し、粒 子結合分子に第二の一次試薬の代わりを務めさせるやり方を示したものである。Figure 7 shows that using the first primary reagent with particle binding molecules as previously described, It shows how a child binding molecule can act as a second primary reagent.

図８は、ＰＢＭ−ＡＢＭ試薬を第一試薬として用いた、抗体のための検定を図示 したものである。この場合、検定対象物質結合分子は検定対象物質である抗体に 特異的に結合する抗原であり、第二試薬は抗−免疫グロブリンに結合するキャリ ヤー粒子である。抗−免疫グロブリンはキャリヤー粒子によって共有結合されて もよ（（図参照）、あるいは、粒子結合部分（赤血球の場合には抗−免疫グロブ リン抗体の一部分）を通じて共役結合されてもよい。Figure 8 illustrates an assay for antibodies using PBM-ABM reagent as the first reagent. This is what I did. In this case, the analyte-binding molecule binds to the antibody, which is the analyte. an antigen that specifically binds, and the second reagent is a carrier that binds to anti-immunoglobulin. Yar particles. The anti-immunoglobulin is covalently linked by a carrier particle. (see figure) or particle-binding moiety (in the case of red blood cells, anti-immunoglobulin (a portion of a phosphoantibody).

図９及び図１０は、特定の免疫グロブリンの亜類型（［ｇＭや特定抗原に対して 特異性を持つＩｇＥ　）を検出するための検定について示したものである。この 検定方法を用いることによって、大型の抗原に対して特異性を持つＩｇＧ抗体の 検出も可能になる（この抗体は抗−赤血球抗体とは直接に結合しにくい）。ＢＢ Ｍは赤血球上の同一の部位に結合しても、別々の部位に結合してもよい。Figures 9 and 10 show specific immunoglobulin subtypes ([gM and This shows an assay for detecting specific IgE. this By using the assay method, we can develop IgG antibodies that have specificity for large antigens. Detection is also possible (this antibody is unlikely to bind directly to anti-erythrocyte antibodies). BB M may bind to the same site on red blood cells or to separate sites.

図９は、特定抗原に対して特異性を持つＩｇ［＋を検出するための検定を図示し たものである。接合体は、二重特異性を持つ抗−赤血球一抗−１ｇＥ抗体から成 り、ＩｇＨのひとつの部位のみに結合する。多価部分としての抗原を追加する。Figure 9 illustrates an assay for detecting Ig[+ with specificity for a particular antigen. It is something that The conjugate consists of a bispecific anti-erythrocyte and anti-1gE antibody. It binds to only one site on IgH. Add antigen as a multivalent moiety.

抗原は単独で加えてもよく、ラテックスやタンパク質のようなキャリヤーに結合 させて加えてもよい。Antigens can be added alone or conjugated to carriers such as latex or proteins. You can also add it.

特定抗原に対して特異性を持つ［ｇＢ抗体がサンプル中に存在すれば凝集が生じ る。specific for a particular antigen [if gB antibodies are present in the sample, agglutination will occur] Ru.

図１０は、特定抗原に対して特異性を持つＩｇＭを検出するための検定を図示し たものである。接合体は、二重特異性を持っ抗−赤血球一抗−ＩｇＭ抗体から成 り、［ｇＭのひとつの部位のみに結合する。多価部分としての抗原を追加する。Figure 10 illustrates an assay for detecting IgM with specificity for a particular antigen. It is something that The conjugate consists of a bispecific anti-erythrocyte and anti-IgM antibody. binds to only one site on [gM]. Add antigen as a multivalent moiety.

抗原は単独で加えてもよく、ラテックスやタンパク質のようなキャリヤーに結合 させて加えてもよい。Antigens can be added alone or conjugated to carriers such as latex or proteins. You can also add it.

特定抗原に対して特異性を持つＩｇＭ抗体がサンプル中に存在すれば凝集が生じ る。Agglutination occurs if IgM antibodies specific for a particular antigen are present in the sample. Ru.

本発明を実施するための最良の形態及びその他の形態本書でいう「エピトープ」 とは、抗体によって識別される結合部位のみに限らず、結合分子が特異的に識別 するターゲット分子上のひとつの結合部位をいうものとする。Best Mode and Other Modes for Carrying Out the Invention "Epitope" as used herein is not limited to the binding site identified by the antibody, but also the binding site that is specifically identified by the binding molecule. A single binding site on a target molecule.

凝集性標識粒子 検出可能な凝集を形成する程度の凝集能力を持ち、特定の粒子結合分子が存在し つるような形状をとりうる粒子であれば、本書で述べられている凝集検定に使用 することができる。この粒子は生物に由来する分子でも無生物に由来する分子で もよく、天然のものでも人工のものでもよい。天然のものの場合、検定に使用す るのに適するよう適当な調整を加えてもよい。また、人工のものの場合、その配 列が育種的であっても無機的であってもよい。ラテックス、炭、カオリナイト、 ベントナイトなどの粒子や、微生物の細胞、赤血球などさまざまな粒子が凝集の キャリヤーとして用いられている（Ｍｏｃｈｉｄａによる米国特許４．３０８． ０２６号を参照されたい）。異なるサイズもしくは異なる種類の粒子を使用する ことも可能であり、分割されたサンプルの異なる部分において標識分子として異 なる粒子を使用することもできる。視覚によって認知しやすいようにするため、 粒子に着色や蛍光処理を施してもよい。本来サンプル中にあった粒子を用いても よく、サンプル中には本来存在しない粒子を加えてもよい。サンプル中にない粒 子を加える場合、サンプルを分割する前に加えても、分割中もしくは分割後に加 えてもよく、凝集試薬を加える前に加えても凝集試薬とともに加えても、凝集試 薬を加えた後に加えても構わない。Agglomerative labeled particles The presence of specific particle-binding molecules that have sufficient agglutination ability to form detectable aggregates. Particles that can take on a vine-like shape can be used in the agglutination assay described in this book. can do. These particles can be molecules that originate from living things or non-living things. It can be either natural or artificial. In the case of natural products, the Appropriate adjustments may be made to suit your needs. Also, if it is artificial, its arrangement The rows may be breeding or inorganic. latex, charcoal, kaolinite, Various particles such as bentonite, microbial cells, and red blood cells can be aggregated. used as a carrier (U.S. Pat. No. 4.308. by Mochida). 026). Use different sizes or types of particles It is also possible to differentiate labeled molecules in different parts of the split sample. It is also possible to use particles of To make it easier to recognize visually, The particles may be colored or fluorescently treated. Even if the particles originally in the sample are used, Often particles may be added that are not naturally present in the sample. Grain not in sample When adding children, you can add them before splitting the sample, or add them during or after splitting the sample. The agglutination reagent can be added before or with the agglutination reagent. You can add it after adding the medicine.

ｐａｔｅｌ　（米国特許３．８８２．２２５号）は標識分子として赤血球を使用 することを厳に戒めている。標識分子となる赤血球の標準化が困難であるという のがその理由である。Patel (U.S. Pat. No. 3,882,225) uses red blood cells as a labeling molecule. I am strictly prohibited from doing so. It is said that it is difficult to standardize the red blood cells that serve as the labeling molecules. This is the reason.

しかしそれでもなお、赤血球は標識分子として好適な物質である。サンプルが血 液である場合、特にサンプルと同一の由来を持つ赤血球を標識分子として使用す るのが望ましい。However, red blood cells are nevertheless suitable substances as labeling molecules. sample is blood If the sample is a liquid, it is especially important to use red blood cells of the same origin as the sample as the labeling molecule. It is desirable to

サンプルと同一の由来を持つ標識分子には、外来の標識分子と比較して有利な点 がいくつかある。第一に、サンプルと同一の由来を持つ赤血球の場合、事前の処 理が必要ない。米国特許４．４３３．０５９号に示されている方式では血液型○ のＲｈ細胞を使用しているが、その場合、血液を遠心分離機にかけた上で抗体の 接合体と１５−３０分間反応させ、さらに遠心分離による選別を３回行わなけれ ばならない。また、羊の赤血球を使用した米国特許４．６６８゜６４７号の方式 では、羊の血液を選別処理してＰＢＳ　（リン酸塩緩衝食塩水）中に保管してお き、固体床の上で抗体と反応させなければならない。第二に、サンプルを遠心分 離機で処理する必要がないという利点がある。血清や血漿の代わりに、全血（抗 凝血物質が存在していても）を使用できるからである。そのため、より医療現場 に適した検定が可能になる。この他にも標識分子としてサンプルと同一由来の赤 血球を使用するメリットはいくつかあり、それらは旧１１ｙａｒｄによる米国特 許４．８９４．３４７号に示されている。Label molecules that have the same origin as the sample have advantages over foreign label molecules. There are several. First, in the case of red blood cells of the same origin as the sample, prior treatment is necessary. There is no need for logic. In the system shown in U.S. Patent No. 4.433.059, blood type ○ In this case, the blood is centrifuged and then the antibodies are extracted. The conjugate must be reacted with the conjugate for 15-30 minutes and then screened by centrifugation three times. Must be. Also, the method of U.S. Patent No. 4.668゜647 using sheep red blood cells Now, sheep blood is sorted and stored in PBS (phosphate buffered saline). must be prepared and reacted with the antibody on a solid bed. Second, centrifuge the sample It has the advantage that it does not need to be separated from the machine. Whole blood (antibiotics) can be used instead of serum or plasma. This is because it can be used even if clotting substances are present. Therefore, it is easier to use in medical settings. It becomes possible to carry out tests suitable for In addition, as a labeling molecule, red There are several advantages to using blood cells, and they are as described in the US special by former 11yard. No. 4.894.347.

粒子結合部分もしくは粒子結合分子（ＰＢＭ）本発明の理想的な実施例において は、粒子は赤血球であるため、赤血球と結合する部分もしくは分子を粒子結合部 分もしくは粒子結合分子として用いるのが望ましい。In an ideal embodiment of the invention, a particle binding moiety or particle binding molecule (PBM) Since the particles are red blood cells, the part or molecule that binds to red blood cells is the particle binding part. It is preferable to use it as a component or particle-binding molecule.

赤血球の細胞膜はさまざまなタンパク質を含んだ脂質の二重層である。タンパク 質のうち、いくつかは細胞膜の外側にしか存在しない。その他のタンパク質は疎 水性の部分を含んでいるため、これらは細胞膜全体に存在し、もしくは細胞膜中 を移動することが可能である。細胞膜を通過することのできるタンパク質は経膜 タンパク質（トランスメンプランプロティン）と呼ばれ、その一部は細胞内もし くは細胞質に入り込んでいる。グリコホリンＡは経膜タンパク質の一例である。The cell membrane of red blood cells is a bilayer of lipids containing various proteins. protein Some of these substances exist only outside the cell membrane. Other proteins are sparse. Because they contain an aqueous portion, they are present throughout or within the cell membrane. It is possible to move the Proteins that can cross cell membranes are transmembrane It is called a protein (transmembrane protein), and some of it is inside the cell. The cells enter the cytoplasm. Glycophorin A is an example of a transmembrane protein.

赤血球細胞膜（血液型はかっこ内に示す）に存在することが知られているタンパ ク質としてはグリコホリン八（ＭＮ、　Ｂｎａ　、　Ｗｒｂ　）　、グリコホリ ンＢ　（Ｓｓ、　’Ｎ’　、Ｕ）などの他、インテグラルメンプランプロティン １　（Ｒｈ）、グリコプロティンＣ４に付随する膜（Ｃｈｊｄｏ＆Ｒｏｄｇｅｒ ｓ　）、インテグラルメンプラングリコプロティン（陰イオン透過路）、アンキ リン、スペクトリン、プロティン４，１、Ｆ−アクチンなど膜の構成要素となっ ているタンパク質がある。以上のような膜タンパク質に結合しているのがグリコ リピド＝糖脂質（Ｌｅｗｉｓ　）　、グリコスフィンゴリピド（ＡＢＨ、Ｈ，Ｐ 　、　Ｔｋ）である。Proteins known to be present in red blood cell membranes (blood types are shown in parentheses) Glycophorin eight (MN, Bna, Wrb), glycophorin In addition to B (Ss, 'N', U), integral menplan protein 1 (Rh), membrane associated with glycoprotein C4 (Chjdo & Rodger s), integral membrane glycoprotein (anion permeation path), Anki Membrane components such as phosphorus, spectrin, protein 4,1, and F-actin There are proteins that are Glycos are bound to the membrane proteins mentioned above. Lipid = glycolipid (Lewis), glycosphingolipid (ABH, H, P , Tk).

細胞膜、特に赤血球細胞膜についての基礎情報を示している出版物で、一般に参 照可能なものとしては、Ｓ、　Ｂ。Publications that provide basic information about cell membranes, especially red blood cell membranes, and are commonly referred to. Things that can be compared are S and B.

５ｈｏｎｅｔ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｔｈｅ　Ｒｅｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ 、Ｉｎ＋Ｈｅｍａｔａｌｏｇｙ、　３ｒｃｌ　ｅｄ、　Ｅｄｓ、　Ｗｉｌｌｉａ ｍｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３；　Ｍａｒｃｈｅｓｉ、　Ｖ、Ｔ、　Ｔｈｅ　 Ｒｅｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　５ｋｅｌｅｔｏｎ、　Ｂｌｏｏｄ　６１ ：　１−１１、　１９８３などがあげられる。5honet et al,, The Red Ce1l Membrane , In+Hematology, 3rcl ed, Eds, Willia ms et al, 1983; Marchesi, V, T, The Red Ce1l Membrane 5 keleton, Blood 61 : 1-11, 1983, etc.

標識分子として赤血球を用いる場合、抗体、レクチンその他の赤血球結合タンパ ク質を初め、赤血球結合分子（ｆ！ＢＭ）として使用できる物質は数多くある。When using red blood cells as label molecules, antibodies, lectins, and other red blood cell binding proteins can be used. There are many substances that can be used as red blood cell binding molecules (f!BM), including proteinaceous substances.

赤血球細胞膜には、タンパク質、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質など、 抗原として働くさまざまな膜構成物質が含まれている。これらの構成物質を識別 する抗体は、細胞膜やその純化された成分を免疫原として用いて、既存の技術に よって作り出すことができる。これらの抗体は、本来的にモノクローナルなもの であっても、ポリクローナルなものであってもよい。未処理の抗体もしくは特定 の抗原に結合する抗体の断片を赤血球結合分子（［ｌＢＭ）として使用すること もできる。抗体もしくは抗体の断片は多価、２価、１価のいずれであってもよい 。The red blood cell membrane contains proteins, glycoproteins, glycolipids, lipoproteins, etc. Contains various membrane constituent substances that act as antigens. Identify these constituents Antibodies can be developed using cell membranes or purified components as immunogens, using existing technologies. Therefore, it can be created. These antibodies are monoclonal in nature or polyclonal. Untreated antibodies or specific The use of a fragment of an antibody that binds to an antigen as a red blood cell binding molecule ([lBM)] You can also do it. Antibodies or antibody fragments may be multivalent, divalent, or monovalent. .

ＢＢＭとして理想的なのはグリコホリンを識別する抗体（もしくは特異的に抗原 と結合する抗体の断片）である。The ideal BBM would be an antibody that recognizes glycophorin (or a specific antigen). A fragment of an antibody that binds to

この分子は１３１個のアミノ酸とオリゴ糖の１６本の鎖から構成されている。赤 血球の細胞膜からシアロ糖ペプチドを抽出すると、その大部分（全体のおよそ７ ５％）はグリコホリンである。すなわち、グリコホリンは赤血球中に豊富に含ま れている成分なのであり、赤血球細胞を凝集させなくても抗体はグリコホリンに 結合することが可能である。このような抗体は比較的純粋な形で（Ｓｉｇｍａ　 Ｃ８ｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙなどの販売元から）市販されている（参考文 献：　Ｈ，Ｆｕｒｔｈｍａｙｒ　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、　Ｒｅｓ。This molecule is composed of 131 amino acids and 16 chains of oligosaccharides. red When sialoglycopeptides are extracted from the cell membrane of blood cells, most of them (approximately 7 5%) is glycophorin. In other words, glycophorin is abundantly contained in red blood cells. glycophorin is a component of glycophorin, so antibodies can react to glycophorin without agglutinating red blood cells. It is possible to combine. Such antibodies are available in relatively pure form (Sigma It is commercially available from vendors such as C8emical Company (reference text). Credit: H, Furthmayr et al, + Biophys, Bioc hem, Res.

Ｃｏ＋ｎｍ、　６５：１１３−１２２（１９７５）　）。Co+nm, 65:113-122 (1975)).

赤血球結合抗体と検定対象物質結合抗体との接合体の考案とその使用が制約され ていたのは、「自家凝血ｊを避ける必要があったためである。これは、単独で２ 個以上の赤血球に同時に作用して結合し、また赤血球に架橋して凝集させるとい う試薬の能力に帰すべき問題である。There are restrictions on the design and use of conjugates of red blood cell-binding antibodies and assay target substance-binding antibodies. This was because ``it was necessary to avoid autologous blood clots.'' It acts on and binds to more than one red blood cell at the same time, and also cross-links and agglutinates red blood cells. This problem should be attributed to the ability of the reagent used.

当該技術分野における一般常識によれば、「自家凝血」を避けるためには１価の 赤血球結合分子を使用するしかないとされている（　Ｃｈａｎｇによる米国特許 ４．５３３．０５９号などの文献を参照されたい）。驚くべきことに、ある種の 抗体、特に抗グリコホリンｍＡｂは、何の処理も施していない（すなわち２価も しくは多価の）状態で使用してもさほどの「自家凝血Ｊを引き起こさない。抗グ リコホリン抗体が「自家凝血」を引き起こさないのは原子の空間的配置によるも のと考えられる。未処理の抗グリコホリン抗体の抗原結合部位は、同一の赤血球 の近接するエピトープのみに結合するか（２個の赤血球間の距離にまで結合範囲 が広がらない）、２つの抗原結合部位のうち１度にグリコホリンと結合可能なの はひとつだけであるか、そのいずれかの理由により、この抗体は「自家凝血ノを 生じさせないのであろう。According to common knowledge in the technical field, monovalent blood It is believed that the only option is to use red blood cell binding molecules (U.S. patent by Chang 4.533.059). Surprisingly, some kind of Antibodies, particularly anti-glycophorin mAbs, should be prepared without any treatment (i.e. with no bivalent It does not cause significant autocoagulation even when used in a polyvalent or multivalent state. The reason why lycophorin antibodies do not cause "self-coagulation" is due to the spatial arrangement of atoms. it is considered as. The antigen-binding site of untreated anti-glycophorin antibodies is (Binding range extends to the distance between two red blood cells) (does not spread), and can bind to glycophorin in one of the two antigen-binding sites. Either there is only one antibody, or for one of these reasons, this antibody "prevents autologous blood clots". Probably not.

赤血球結合分子（ＥＢＭ）が多価の場合（通常の抗体はこれに該当する）、赤血 球の細胞膜に豊富に含まれ、随所に存在する成分をひとつだけ識別するような分 子を用いるのが望ましい。分子の結合部位は、細胞間に架橋することかできない ような空間的配置になっていなければならない。そうすれば、赤血球の早まった 凝集を防ぐことができるからである。あるいは、細胞膜中に大量に存在する表面 構成物質を識別するようなＥＢＭを選ぶことによって、細胞間の架橋を避けるこ ともできる。この場合、エピトープがＥＢＭの結合部位の充分近くに存在するた め、分子はひとつの赤血球とだけ結合するからである。If the red blood cell binding molecule (EBM) is multivalent (which is the case for normal antibodies), red blood A component that is abundant in the cell membrane of the sphere and identifies only one component that is present everywhere. It is preferable to use children. Molecule binding sites can only cross-link between cells The spatial arrangement must be as follows. This will speed up red blood cell production. This is because aggregation can be prevented. Alternatively, surfaces present in large quantities in cell membranes Avoid cross-linking between cells by choosing an EBM that discriminates between constituents. Can also be done. In this case, the epitope is close enough to the EBM binding site that This is because the molecule binds to only one red blood cell.

本発明のひとつの側面として、自家凝血を起こさせないような抗−赤血球抗体（ もしくは赤血球と結合する抗体の多価の断片）を未処理のまま、接合体の形で用 いて赤血球凝血反応による免疫学的検定を行うということがある。前記のような 抗体を使用することによるメリットは、接合体が簡単に大量生産できることと、 Ｐａｂ　／Ｆａｂ’の断片を作る必要がないことである。Ｆａｂ　／Ｐａｂ’の 断片は、凝血を引き起こす抗体を含んだ混合物の状態から必要な純度にまで精製 することが困難である。One aspect of the invention provides anti-erythrocyte antibodies that do not cause autocoagulation ( or a multivalent fragment of an antibody that binds to red blood cells) is used unprocessed in the form of a conjugate. In some cases, an immunoassay using red blood cell coagulation reaction is performed. as mentioned above The advantages of using antibodies are that conjugates can be easily mass-produced; There is no need to create a Pab/Fab' fragment. Fab/Pab’ The fragments are purified to the required purity from a mixture containing antibodies that cause blood clots. difficult to do.

本来自家凝血作用を持たない赤血球結合抗体の１価の派生物を使用することも、 本発明の特許請求範囲に含まれる。赤血球に結合する１価の断片を得る材料とし て自家凝血作用を持たない抗体を使用する方が有利なのは、Ｆ（ａｂ）２とＰａ ｂ’の混合物からＦ（ａｂ）２の断片に汚染されていないＰａｂ’を取り出すの が困難だからである。さらに、Ｐａｂの１価の断片からＦ（ａｂ）２の二量体が 形成されてしまうこともある。It is also possible to use monovalent derivatives of red blood cell-binding antibodies that do not inherently have autocoagulant properties. It is within the scope of the claims of the present invention. As a material for obtaining monovalent fragments that bind to red blood cells It is advantageous to use antibodies that do not have an autocoagulant effect when F(ab)2 and Pa To extract Pab' that is not contaminated with F(ab)2 fragments from the mixture of b'. This is because it is difficult. Furthermore, a dimer of F(ab)2 is generated from the monovalent fragment of Pab. It may even form.

抗体が未処理の状態で自家凝血作用を持つとすれば、Ｐａｂ’に少しでもＰ（ａ ｂ）２が含まれていれば凝血が生じるため、検定の精度は低下することになる。If the antibody has an autocoagulant effect in its untreated state, P(a b) If 2 is present, blood clots will occur, which will reduce the accuracy of the assay.

しかしながらこの問題は、自家凝血作用を持たない抗体だけを用いてＦａｂ゛の 断片を得るという本書に示した方法で解決することができる。However, this problem can be solved by using only antibodies that do not have autocoagulant properties. This can be solved using the method shown in this book, which involves obtaining fragments.

さらに、赤血球表面にある糖タンパク質、糖脂質その他の炭水化物の構造は、レ クチンと呼ばれるタンパク質によって識別される。レクチンは特定のサツカライ ド（糖質）と親和性があるため、本発明において企図されているように、これを ＢＢＭとして使用することも可能である。その他の分子でも、赤血球表面の成分 に対して特異性及び親和性を持つものは、これをＢＢＭとして使用することがで きる。細胞膜の脂質二重層に対して親和性のある分子も８８Ｍとして用いること が可能である。そのような分子の例としては、プロタミン、ミツバチの毒液中の 細胞膜結合部分、メリチン、その他の非常に基本的なペプチド類が挙げられる。Furthermore, the structures of glycoproteins, glycolipids, and other carbohydrates on the surface of red blood cells are It is identified by a protein called cutin. Lectins are specific As contemplated in the present invention, it has an affinity for carbohydrates. It is also possible to use it as a BBM. Other molecules are also components of the surface of red blood cells. If it has specificity and affinity for BBM, it can be used as BBM. Wear. Molecules with affinity for the lipid bilayer of cell membranes may also be used as 88M. is possible. An example of such a molecule is protamine, found in bee venom. These include cell membrane binding moieties, melittin, and other very basic peptides.

本出願人は、さらに、新たな種類の凝集試薬を発見している。この試薬の赤血球 結合部分は、ミチバチの毒液から派生した非免疫グロブリンのペプチド、メリチ ンである。従って、本発明はメリチン７−２６その他のペプチドと、検定対象物 質結合分子を備えた、やはり非溶菌性で１価の赤血球結合物質との接合体を提供 するものである。Applicants have also discovered a new class of agglutination reagents. Red blood cells in this reagent The binding moiety is a non-immunoglobulin peptide derived from the venom of the road bee. It is. Therefore, the present invention provides melittin 7-26 and other peptides and an assay target. Provides a conjugate with a monovalent red blood cell binding substance that is also non-lytic and has a substance binding molecule. It is something to do.

この接合体は、直接凝集検定の試薬として使用することができる。抗−赤血球抗 体に比べてメリチン７−２６は、化学合成技術もしくは遺伝子組替え技術を用い ることによりはるかに容易に、かつ安価に合成することが可能である。しかしな がら、本発明は８８Ｍを製造するだめの特定の方法に限定されるものではない。This conjugate can be used as a reagent in direct agglutination assays. anti-erythrocyte anti Compared to the human body, melittin 7-26 is produced using chemical synthesis technology or genetic recombination technology. It can be synthesized much more easily and at a lower cost. However However, the present invention is not limited to any particular method of manufacturing 88M.

本発明のための理想的なりＢＭは、サンプル中のすべての、もしくはほとんどす べての赤血球に含まれる細胞膜成分を識別するため、血液サンプルと同一白米の 赤血球を凝集分子として使用することができる。前記の細胞膜成分の中には「パ ブリック抗体」と称される成分が含まれる。An ideal BM for the present invention would be to cover all or most of the sample. In order to identify the cell membrane components contained in all red blood cells, blood samples and the same white rice were used. Red blood cells can be used as agglutinating molecules. Among the cell membrane components mentioned above are It contains a component called "brick antibody."

既知の血液型の持つ特性は通常、膜タンパク質と結合している炭水化物もしくは 糖脂質の部分によって与えられる。このことを本発明に即して考えれば、ＢＢＭ は細胞膜を構成する糖タンパク質から特定の種の赤血球に共通するタンパク部分 を識別するか、やはり種に共通のそれ以外の構造を識別するのが望ましい。２価 のＥＢＭの赤血球凝集能力は、分子の可動性や脂質二重層に対する結合部位の相 対位置などの立体構造に依存している。Characteristics of known blood types usually consist of carbohydrates or It is given by the glycolipid part. Considering this in accordance with the present invention, BBM is a protein part common to red blood cells of certain species from glycoproteins that make up cell membranes. It is desirable to identify other structures that are also common to the species. Bivalent The hemagglutination ability of EBM depends on the mobility of the molecules and the phase of the binding sites to the lipid bilayer. It depends on the tertiary structure such as counterposition.

本発明においては、単一のＢＢＭを用いてほとんどすべての赤血球を識別させる のが望ましいが、必ずしもそうする必要があるわけではない。いくつかのＥＢＭ を同一の試薬の中で、もしくは別々の試薬の中で使用することもできる。この場 合、それぞれの［！ＢＭが特定の赤血球グループを識別することになるが、全体 としてはほぼすべての赤血球が識別されるわけである。ＢＢＭは赤血球に天然に 含まれる表面成分を識別するのが望ましいが、ＩＥＢＭによって識別されるリガ ンド（配位子）で赤血球を覆うか、赤血球に適当な処理を施して通常は表面に出 ていないリガンドを露出させてもよい。赤血球以外の粒子に赤血球と似た機能を 与え、抗体その他の結合分子に結合させることも可能である。In the present invention, a single BBM is used to identify almost all red blood cells. Although it is desirable, it is not necessary. Some EBM can be used in the same reagent or in separate reagents. this place If the respective [! Although BM identifies specific red blood cell groups, overall This means that almost all red blood cells can be identified. BBM is naturally found in red blood cells Although it is desirable to identify the surface components involved, the triggers identified by IEBM The red blood cells are coated with ligands (ligands), or the red blood cells are treated with a suitable treatment so that they are normally exposed to the surface. Ligands that are not present may be exposed. Providing particles other than red blood cells with functions similar to those of red blood cells It is also possible to give the antibody and attach it to an antibody or other binding molecule.

サンプルと分析 サンプルは生物的液体、非生物的液体のいずれであってもよい。生体から得られ る生物的液体の例としては、血液（全血）、分離された血液の一部、尿、***、 唾液、髄液、羊水、腹水、肋膜滲出液、嚢液、膿汁、組織抽出液などが挙げられ る。生体外で得られる生物的液体の例としては、ハイブリドーマ細胞（融合雑種 腫瘍細胞）などの組織培養物の上滑、微生物発酵の培養液などがある。Sample and analysis The sample may be a biological or non-biological liquid. obtained from living organisms Examples of biological fluids include blood (whole blood), separated blood parts, urine, semen, Examples include saliva, cerebrospinal fluid, amniotic fluid, ascites, pleural exudate, sac fluid, pus, and tissue extracts. Ru. Examples of biological fluids obtained in vitro include hybridoma cells (fused hybrids). These include culture fluids for tissue cultures such as tumor cells, and culture fluids for microbial fermentation.

さらに、非生物的液体としては、飲料水、廃水、地下水を初め、水以外の液体も 検定に供せられる。サンプルは、凝集標識分子として用いることのできるような 粒子を含んでいることが望ましい。適当な粒子が本来のサンプルに含まれていな い場合には、適当な粒子をサンプルに添加して「粒子含有サンプル」を作り出す ことができる。このような粒子の添加は、本書において説明した通り、−次凝集 試薬を加える前に行っても後に行ってもよく、−次凝集試薬と同時に粒子を添加 してもよい。Furthermore, non-living liquids include drinking water, wastewater, groundwater, and liquids other than water. It will be submitted for examination. The sample is an aggregation label that can be used as a Preferably, it contains particles. The appropriate particles are not present in the original sample. If the sample contains particles, add appropriate particles to the sample to create a “particle-containing sample.” be able to. The addition of such particles can lead to -order agglomeration, as explained in this paper. Particles can be added at the same time as the second agglutination reagent, which can be done before or after adding the reagent. You may.

本発明の用途は特定の検定対象物質の検出のみに限定されないが、特に反復性の ないエピトープを持つ物質に対しては本発明が役立つ。このような検定対象物質 は通常血液中に見られるもので、血液タンパクやホルモンなどがこれに該当する が、薬物（治療薬や麻薬）などの人体以外に由来するサンプルにも見られること がある。前記のような検定対象物質の例としては、ホルモン（ＨＯＧ　。Although the application of the present invention is not limited to the detection of a specific analyte, it is particularly The present invention is useful for substances with epitopes that do not exist. Such substances to be tested are normally found in the blood, including blood proteins and hormones. However, it can also be seen in samples derived from sources other than the human body, such as drugs (therapeutic drugs and narcotics). There is. An example of the substance to be tested is hormone (HOG).

ＬＨ，ＰＳＴＩ、インシュリン等）、酵素（アミラーゼ、トリプシン、ＣＫイソ ホルム等）、ミオグロビンなどのペプチド、ステロイド（性ホルモン、コルチコ ステロイド、タンパク質同化ステロイド等）、薬物（テオフィリン、ダイオキシ ン、パラセタモール、バルビッール剤、カンナピノイド、オピオイド等）、毒液 、抗体（ｒｇＧ　、　ＩｇＢ　。LH, PSTI, insulin, etc.), enzymes (amylase, trypsin, CK iso (form, etc.), peptides such as myoglobin, steroids (sex hormones, corticosteroids, steroids, anabolic steroids, etc.), drugs (theophylline, dioxy drugs, paracetamol, barbyl drugs, cannapinoids, opioids, etc.), poisonous liquids , antibodies (rgG, IgB.

ＩｇＭ等のクラス）などがある。classes such as IgM).

検定対象物質結合部分もしくは検定対象物質結合分子検定対象物質に対して適当 な親和性を存する物質ならすべて、検定対象物質結合部分もしくは検定対象物質 結合分子（ＡＢＭ）として使用できる。このようなＡＲＭの例、　とじては１価 もしくは多価の抗体、レクチン、酵素を初め、検定対象に結合しうるタンパク質 または物質（もしくはそれらの結合部分）が挙げられる。検定対象物質が抗原で ある場合、一般に抗体もしくはその抗原結合部分（Ｐ（ａｂ’）２　、Ｐａｂ　 １Ｐｖ、　ＶＨ等）がＡＢＭとして用いられる。Suitable for the assay target substance binding part or assay target substance binding molecule Any substance that has a certain affinity with the test substance binding part or the test substance Can be used as a binding molecule (ABM). An example of such an ARM is monovalent or proteins that can bind to the assay target, including multivalent antibodies, lectins, enzymes, etc. or substances (or their binding parts). The test substance is an antigen. In some cases, antibodies or antigen-binding portions thereof (P(ab')2, Pab 1Pv, VH, etc.) are used as ABM.

検定対象物質が抗体の場合、一般にその抗体によって識別される抗原もしくは部 分抗原（ハブテン）がＡＢＭとして用いられるが、検定対象である抗体の免疫グ ロブリンイソタイプに対抗する第二の抗体が用いられることもある。When the substance to be assayed is an antibody, the antigen or moiety identified by the antibody is generally used. Antigen (Habten) is used as ABM, but the immunoglobulin of the antibody to be assayed is A second antibody directed against the Robulin isotype may also be used.

第−及び第二の一次凝集試薬（ＰＢＭ−ＡＢＭ　）本発明に従った検定は、粒子 結合部分もしくは粒子結合分子（ＰＢＭ　）　、特に赤血球結合分子（ＥＢＭ） と、検定対象物質結合部分もしくは検定対象物質結合分子（ＡＢＭ）との接合体 を使用する。この接合体は粒子結合部分と検定対象物質結合部分とを備えたただ ひとつの分子であっても、２個以上の分子による複合体であってもよい。以下、 本書においては「分子」という語は前記の分子ならびに部分の双方を表すものと する。また「接合体」という語は２つの結合部分を備えたただひとつのハイブリ ッド分子ならびにそれぞれが特定の結合作用を持つ２つの分子の共役結合の双方 を表すものとする。本発明の実施例１においては、前記の接合体はＥＢＭ　（も しくはＰＢＭ　）をＡＢＭと結合させて得られたものである。First and second primary agglutination reagents (PBM-ABM) The assay according to the invention Binding moiety or particle binding molecule (PBM), especially red blood cell binding molecule (EBM) and a conjugate with an assay target substance binding portion or assay target substance binding molecule (ABM) use. This conjugate has a particle-binding portion and an assay target substance-binding portion. It may be a single molecule or a complex of two or more molecules. below, In this book, the word "molecule" refers to both the above-mentioned molecules and parts. do. The word "zygote" also refers to a single hybrid with two bonding parts. both molecules and conjugated bonds between two molecules, each with a specific binding effect. shall represent. In Example 1 of the present invention, the above-mentioned conjugate is EBM (also In other words, it is obtained by combining PBM) with ABM.

共有結合もしくは非共有結合（もしくはその組合せ）によって、ＰＢＭとＡＢＭ を直接的／間接的に互いに結合させることできる。当該技術分野において知られ ている共有結合方式を用いて作られた試薬名とそれらの試薬について開示した参 考文献をいくつか、下記に掲げておく。PBM and ABM by covalent or non-covalent bonding (or a combination thereof) can be directly/indirectly coupled to each other. known in the technical field Names of reagents made using covalent bonding methods and references disclosing those reagents. Some of the references are listed below.

１　、５ＰＤＰ　（Ｎ−スクシンイミジル−３，２−（ピリジルジチオ）プロピ オネート） Ｎａｕｒａｔｈ　ｅｔ　ａｌ、、　１９７６、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　Ｍｅｔｈ、 　３：１５５−１６５２、　ＭＢＳ　（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロ キシスクシンイミドエステル） Ｋｉｔａｇａｗａ　ｅｔ　ａｌ、　１９７６、　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　７９： ２２３−２３６３、Ｓ［ＡＢ（Ｎ−スクシンイミジル−４−ヨードアセチルアミ ノベンゾエート） Ｗｅｌｔｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９８３．　Ｂｉｏ、　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ 　１：１４８−１５２本選択的２価性試薬 Ｐ−イソチオシアナトベンゾイルクロリド（米国特許４．６８０．３３８号） ネ２価性試薬 １　、８ＳＯＣＯＩＩ！Ｓ−ビス〔２−スクシンイミドオキシカルボニルオキシ ）エチル〕スルホン Ｚａｒｌｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、１９８０．Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１２４：９１ ３−９２０２、ＢＳ−ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート５ｔａｒｏｓ 、　１９８２．　Ｂｉａｃｈｅｍｉｓｔｏｒｙ　２１：３９５０−３９５５本そ の他の試薬 １、グルタルアルデヒド Ａｖｒａｍｅａｓ、　１９６９．　１ｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、　６：４３２、ベリ オデート酸化 Ｎａｋａｎｅ　ｅｔ　ａｌ、　１９７４．　Ｊ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅ＋＋＋、　Ｃ ｙｔｏｃｈｅｍ、２２：３、カルボジイミド ４、ジスルフィド交換 ＰＢＭとＡＢＭを共有結合以外の方法によって結合させることもできる。例えば （ａ）一方にビオチン、他方にアビジン（もしくはストレブタビジン）を付着さ せる、（ｂ）一方に抗−抗体を付着させ、他方に結合させる、（Ｃ）　一方にプ ロティンＡを付着させ、他方のＰｃ部分に結合させる、（ｄ）一方に糖類を、他 方にそれに対応したレクチンを付着させる、などの方法が考えられる。1, 5PDP (N-succinimidyl-3,2-(pyridyldithio)propyl Onate) Naurath et al., 1976, J. Virol, Meth. 3:155-1652, MBS (m-maleimidobenzoyl-N-hydro xysuccinimide ester) Kitagawa et al., 1976, J.Biochem, 79: 223-2363, S[AB(N-succinimidyl-4-iodoacetylamide) nobenzoate) Weltman et al., 1983. Bio, Techniques 1:148-152 selective bivalent reagent P-isothiocyanatobenzoyl chloride (U.S. Pat. No. 4.680.338) Nebivalent reagent 1, 8SOCOII! S-bis[2-succinimidoxycarbonyloxy )ethyl]sulfone Zarling et al., 1980. J. Immunol. 124:91 3-9202, BS-bis(sulfosuccinimidyl) suberate 5taros , 1982. Biochemistry 21:3950-3955 other reagents of 1. Glutaraldehyde Avrameas, 1969. 1mmunochem, 6:432, Veri odate oxidation Nakane et al., 1974. J, Histoche+++, C ytochem, 22:3, carbodiimide 4. Disulfide exchange PBM and ABM can also be bonded by methods other than covalent bonding. for example (a) Biotin is attached to one side and avidin (or strebavidin) is attached to the other side. (b) Attach anti-antibody to one and bind to the other; (C) Attach anti-antibody to one and bind to the other. Attach lotin A and bind to the other Pc moiety; (d) sugar to one and the other Possible methods include attaching a lectin corresponding to the target.

ＰＢＭとＡＢＭとを結合させるにあたっては、結合特性の変化を最小限に抑えな ければならない。ＰＢＭとＡＢＭとの間にスペーサーとなる部分を設け、立体構 造上の障害を減少させてもよいだろう。When combining PBM and ABM, changes in the binding characteristics must be minimized. Must be. A spacer is provided between the PBM and the ABM to create a three-dimensional structure. Architectural obstacles may also be reduced.

ＰＢＭ　／ＡＢＭ接合体はハイブリッド抗体であってもよい。The PBM/ABM conjugate may be a hybrid antibody.

そのような接合体を作り出す方式としては、以下のようなものがある： （ａ）ペプシンの消化作用によって使用する抗体の断片Ｆ（ＡＢ）’　２を作り 出す； （ｂ）上記の断片をエルマン試薬によって給小処理し、前記抗体の断片Ｐａｂ’ を作り出す： （Ｃ）検定対象物質に対して特異性を有する抗体もしくは抗−赤血球抗体をチオ ール化する： （ｄ）チオール化した断片Ｆａｂ’をエルマン試薬で処理した断片Ｐａｂ’と結 合させて抗赤血球抗体と抗原特異性を持つ抗体とのハイブリッド接合体を生成す る。Methods for creating such zygotes include: (a) Create antibody fragment F(AB)'2 to be used by pepsin digestion put out; (b) The above fragment is treated with Ellman's reagent to obtain a fragment of the antibody Pab'. Produce: (C) Antibodies or anti-erythrocyte antibodies that have specificity for the substance to be assayed Convert to: (d) Combination of thiolated fragment Fab' with fragment Pab' treated with Ellman's reagent. When combined, a hybrid conjugate of an anti-erythrocyte antibody and an antibody with antigen specificity is produced. Ru.

キメラ抗体の形で［１８Ｍ　／ＡＢＭ接合体を作り出す方法としては、以下のよ うなものが考えられる：（ａ）ｍＡＢを生成する抗赤血球ハイブリドーマと、同 じ＜ｍＡＢを生成する抗原特異性を持つハイブリドーマを、著しい部位特異性を 持つ高分子生合成不可逆阻害剤によって処理する。この阻害剤は、エメチン、ア クチノマインンＤ１オキシ尿素、ウワバイン、ンクロへキシミド、ニブイン、ス パルソマイシンのグループから選択するのが望ましい； （ｂ）ｍＡＢを生成する２種類のハイブリドーマをブリエチレングリコールによ って融合させる； （Ｃ）ソフトアガロース内での隔離培養法や希釈制限法など、各種クローン化方 式のいずれかを用いて、融合した細胞をクローン化する； （ｄ）それぞれの抗体に適したスクリーニング検定によって、抗原特異性を持つ キメラ抗赤血球抗体を分泌するクローン化ヘテロハイブリドーマを選別する：（ ｅ）適当な精製によって生成された抗原を純化し、非キメラ抗体を除去する。か くして本発明によるハイブリ。The method for producing [18M　/ABM conjugate in the form of a chimeric antibody is as follows. Possible causes include: (a) anti-erythroid hybridomas producing mAB; Hybridomas with antigen specificity that produce the same treated with irreversible polymer biosynthesis inhibitors. This inhibitor is emetine, a Cutinomain D1 oxyurea, ouabain, ncloheximide, nibin, Preferably selected from the group of palsomycins; (b) Two types of mAB-producing hybridomas were treated with ethylene glycol. to fuse; (C) Various cloning methods such as isolation culture method in soft agarose and limited dilution method cloning the fused cells using one of the formulas; (d) Antigen specificity determined by screening assays appropriate for each antibody. Selecting cloned heterohybridomas secreting chimeric anti-erythrocyte antibodies: ( e) Purify the generated antigen by appropriate purification to remove non-chimeric antibodies. mosquito Thus, the hybrid according to the present invention.

ド抗体もしくはキメラ抗体は、２つの「半分子」を持つことになる。このうち一 方は赤血球に対して特異性を持ち（ＢＢＭの部分）、他方は検定対象物質に対し て特異性を持つ（ＡＢＭの部分）。この場合、抗体自らのジスルフィド結合によ りＡＢＭとＥＢＭが結合され、適当な接合体を形成することになる。A double or chimeric antibody will have two "half molecules." One of these One has specificity for red blood cells (BBM part), and the other has specificity for the substance to be assayed. It has specificity (ABM part). In this case, the disulfide bond of the antibody itself The ABM and EBM will then be combined to form a suitable joint.

先行技術が明らかにしているように、上記のようなハイブリッド抗体には、「テ ール・トウ・テール」で結合した接合体に比べて青刈な点がある。［テール・ト ウ・テール」の接合体は２価性の結合剤によって結合され、抗−検定対象物質の 抗体と抗赤血球抗体の１価の断片が共役したものである。ハイブリッド抗体の長 所としては、生成が容易であること、化学量論的／立体化学的な意味で正確に双 方の抗体が保たれ、それぞれの断片の結合親和性が保たれていること、などであ る。As the prior art makes clear, hybrid antibodies such as those described above have a Compared to a zygote that is joined by "rule-to-tail", it has a certain advantage. [Tail To The conjugate of ``Tail'' is bound by a bivalent binder, and the anti-analyte conjugate is It is a conjugate of an antibody and a monovalent fragment of an anti-erythrocyte antibody. hybrid antibody length In particular, it is easy to produce and has exactly the same composition in a stoichiometric/stereochemical sense. one antibody is preserved, the binding affinity of each fragment is preserved, etc. Ru.

検定対象物質結合分子がペプチドもしくはタンパク質である場合、赤血球との結 合にペプチドを用いることによるメリットがある。２価性の結合剤を使わずに接 合体全体を作り出すことができるからである。結合剤を使用しなくても、赤血球 結合ペプチドと検定対象物質結合ペプチドとはひとつの転写ユニットとしてＤＮ Ａ配列によりコード化され、目的とする接合体は、単一のペプチド結合により連 結された２つの部分または適当な長さのペプチドスペーサーを存する融合タンパ クの形で表現される。ＤＮＡ配列によるコード化の特に理想的な例としては、赤 血球結合抗体の断片（単に結合部位だけの断片でよ（、完全なＰａｂである必要 はない）と検定対象物質である抗体（これも結合部位だけの断片でよく、完全な Ｐａｂである必要はない）もしくは抗原がひとつの転写ユニットとして提供され 、目的の接合体が単一のペプチド結合により連結された２つの部分または適当な 長さのペプチドスペーサーを育する融合タンパクの形で表現される場合がある。If the analyte-binding molecule is a peptide or protein, the binding with red blood cells is There are advantages to using peptides in these cases. Connection without using divalent binders This is because it is possible to create a whole union. Red blood cells without the use of binding agents The binding peptide and the analyte binding peptide are DN as one transcription unit. encoded by the A sequence, the desired conjugate is linked by a single peptide bond. A fusion protein consisting of two parts joined together or a peptide spacer of appropriate length. It is expressed in the form of ku. A particularly ideal example of coding by DNA sequence is the red Fragment of blood cell-binding antibody (simply a fragment of the binding site (but does not need to be a complete Pab) ) and the antibody to be assayed (this can also be a fragment of only the binding site; Pab) or the antigen is provided as one transcription unit. , the conjugate of interest consists of two moieties connected by a single peptide bond or a suitable It may be expressed in the form of a fusion protein that grows long peptide spacers.

また、直接キメラ合成を行うことによって２価ペプチドを作り出すことも可能で ある。It is also possible to create divalent peptides by direct chimera synthesis. be.

本書の趣旨に従って考えれば、検定されるサンプル中に存在する（もしくは本発 明の方式に従ってサンプルに添加される）粒子は複数の結合部位を持っている。According to the purpose of this book, the presence in the sample being tested (or The particles (added to the sample according to the Ming method) have multiple binding sites.

第−及び第二の２つの凝集試薬は、粒子表面にある同一の結合部位（エピトープ ）を識別するようにしてもよく、別々の結合部位を識別するようになっていても よい。The first and second two agglutination reagents have the same binding site (epitope) on the particle surface. ), or separate binding sites. good.

また、２つの凝集試薬は同一の手順によって作られたものでも、異なる手順で作 られたものでもかまわない。Furthermore, even if two agglutination reagents are made by the same procedure, they may be made by different procedures. It doesn't matter if it's given to you.

二次凝集試薬（ＣＢＭ−ＣＢＭ） 前に述べたように、二次凝集試薬は、第一複合体（サンプルの第一分割量中の粒 子と検定対象物質、ならびに第一の一次凝集試薬によって形成される）と第二複 合体とを共役結合させるものである。そのため、二次凝集試薬は２個の複合体結 合部分もしくは複合体結合分子（０８Ｍ）を持っている。Secondary agglutination reagent (CBM-CBM) As mentioned earlier, the secondary agglutination reagent is used to collect the first complex (the particles in the first aliquot of the sample). (formed by the first primary agglutination reagent) and the second primary agglutination reagent. This is to form a conjugate bond with the coalescence. Therefore, the secondary agglutination reagent can bind two complexes. It has a binding moiety or complex binding molecule (08M).

２個のＣＢＭは同一であっても異なっていてもよく、検定対象物質が本来持って いるエピトープに結合するものでも、ＡＢＭ−ＰＢＭ接合体の結合によって生じ たエピトープに結合するものでもよい。結合されるエピトープはＥＢＭ−ＡＢＭ が識別するのと同一のものであっても別のものであってもよい。二次凝集試薬を 作り出すのに一次凝集試薬と同一の手順を用いることも可能である。The two CBMs may be the same or different, and the two CBMs may be the same or different. Even those that bind to the epitope produced by the binding of the ABM-PBM conjugate It may also be one that binds to a specific epitope. The epitope bound is EBM-ABM may be the same as or different from the one identified by. Secondary agglutination reagent It is also possible to use the same procedure to create the primary agglutination reagent.

テストキット 本発明に使用されるテストキットには、前述したような第−及び第二の２つの［ ！ＢＭ−ＡＢＭ接合体が含まれており、オプションによって第三の試薬をキット に含めることもできる。test kit The test kit used in the present invention includes the first and second [ ! Kit includes BM-ABM conjugate and optional third reagent It can also be included in

検定フォーマット 理想的な実施態様においては、本発明の企図する直接凝集検定は以下のような内 容のものである；（ａ）サンプルを第一分割量と第二分割量の２つに分ける。Certification format In an ideal embodiment, the direct agglutination assay contemplated by the present invention would include the following: (a) Divide the sample into two, a first aliquot and a second aliquot.

（ｂ）粒子結合分子（ＰＢＭ）と、検定対象物質の第一結合部位に結合する検定 対象物質結合分子（ＡＢＭＩ）を１個ずつ含む第一の一次凝集試薬、サンプルの 第一分割量、凝集粒子を混ぜて第一混合物を作る； （Ｃ）粒子結合分子（もしくは粒子結合部分）、検定対象物質の第二結合部位に 結合する検定対象物質結合分子（もしくは検定対象物質結合部分、ＡＢＭ２）を １側ずつ含む第二の一次凝集試薬、サンプルの第二分割量、凝集粒子を混ぜて第 二混合物を作る； （ｄ）第一混合物と第二混合物を混合して第三混合物を得る； ここで、第三混合物における凝集はサンプル中に検定対象物質が存在することを 示す。(b) Particle binding molecule (PBM) and assay that binds to the first binding site of the assay target substance a first primary agglutination reagent containing one target substance binding molecule (ABMI); Mix a first divided amount of agglomerated particles to form a first mixture; (C) Particle-binding molecule (or particle-binding portion), at the second binding site of the substance to be assayed. The analyte binding molecule (or analyte binding moiety, ABM2) to be bound is Mix the second primary agglutination reagent containing one side each, the second aliquot of the sample, and the agglutinated particles. Make two mixtures; (d) mixing the first mixture and the second mixture to obtain a third mixture; Here, aggregation in the third mixture indicates the presence of the analyte in the sample. show.

驚くべきことに、前述の実施態様に従って２つの接合体を別々にサンプルと混合 することにより、検定の精度は２種類の接合体を同時に単一の血液サンプルと混 合した場合（オーストラリア特許出願２４１８２／８８号、米国特許４、８９４ ．３４７号にはこのような方法が示されている）に比べて２０−３０倍にも高ま る。Surprisingly, the two conjugates were mixed separately with the sample according to the previously described embodiments. The accuracy of the assay is increased by mixing the two conjugates simultaneously with a single blood sample. (Australian Patent Application No. 24182/88, US Pat. No. 4,894) ．． This method is 20-30 times higher than that shown in No. 347). Ru.

この実施態様は、検出しようとする抗原分子の数に比べてＰＢＭの数の方が多い という前提に依拠したものである。ＰＢＭは粒子表面に豊富に存在するエピトー プを識別するものでなければならない。In this embodiment, the number of PBMs is greater than the number of antigen molecules to be detected. It is based on the premise that. PBM is an epitope that exists abundantly on the particle surface. must identify the group.

血液サンプル中に存在する検定対象物質の濃度がどの程度かを考えれば、相互作 用の親和性はさほど大きなファクターとは思われない。２スポツトシステムによ り精度が著しく向上した理由は、化学量論的なものであろうと考える方が妥当で あろう。本書に例示した検定においては、１０ｕｇ／ｍＬの抗−赤血球抗体が用 いられ、赤血球表面にはおよそ７００．０００個のグリコホリンが存在していた 。Considering the concentration of the test substance present in the blood sample, the interaction Affinity for use does not seem to be a very big factor. With 2 spot system It is more reasonable to think that the reason for the remarkable improvement in accuracy is stoichiometric. Probably. In the assay exemplified herein, 10 ug/mL anti-erythrocyte antibody is used. Approximately 700,000 glycophorins were present on the surface of red blood cells. .

測定されたｈｃｇの総量は２５−１．００．０００団几　（２，５−１０，００ ０ｍｇ／Ｌ）のオーダーであった。）ＩＣＧの分子量はおよそ５０ｋＤａ　、接 合体の分資料はおよそ１００ｋＤａである。それゆえ、血液サンプル中に存在す るＨＣＧ分子よりもはるかに多くの接合体分子が赤血球表面に結合していたこと になる。The total amount of hcg measured was 25-1,00,000 tons (2,5-10,00 It was on the order of 0 mg/L). ) The molecular weight of ICG is approximately 50 kDa, The coalescence fraction is approximately 100 kDa. Therefore, the presence of There were far more conjugate molecules bound to the red blood cell surface than HCG molecules. become.

相互作用の親和性もいくばくかの影響を及ぼしたかも知れない。抗体接合体のＨ ＣＧとの親和性を変化させつつ一連の分析を行ったところ、親和性が低下すると 精度も低下することがわかった。The affinity of the interaction may also have had some influence. H of antibody conjugate When we conducted a series of analyzes while changing the affinity with CG, we found that when the affinity decreased, It was found that the accuracy also decreased.

抗赤血球抗体の親和性はＩ　Ｘ　１０”　、ＨＣＧの親和性は最高で５．９Ｘ１ ０”であった。The affinity of anti-erythrocyte antibody is IX10", and the affinity of HCG is up to 5.9X1 It was 0".

本書においてＱｘ（つかの成分の混合物の形成について述べる場合、それぞれの 成分を順番に混合しても、すべての成分を同時に混合してもよい。In this book, Qx (when talking about the formation of a mixture of several components, each The components may be mixed sequentially or all components may be mixed simultaneously.

形成された混合物のひとつの成分が１組の凝集性粒子であり、他の成分がサンプ ルの一部であるという場合、その粒子はサンプルと同一由来のものであると理解 されたい。そのため、実際にはサンプル中の検定対象物質と粒子は同時に残りの 反応成分と混合されるわけである。One component of the mixture formed is a set of cohesive particles and the other component is the sample. When referring to a particle as part of a sample, it is understood that the particle is of the same origin as the sample. I want to be Therefore, in reality, the analyte substance and particles in the sample are simultaneously absorbed into the remaining particles. It is mixed with the reaction components.

粒子は外来のものであってもよく、その場合に外来の粒子をサンプルの分割が行 われる前に添加しても、後に添加しても、または上述した混合物形成のいかなる 段階で添加してもかまわない。The particles may be of foreign origin, in which case the foreign particles may be removed by sample segmentation. Whether added before, after, or in any of the above-mentioned mixture formations. It may be added in stages.

薬物やステロイドなどエピトープを一つしか持たないハブテン（部分抗原）の測 定の場合、２種類の接合体を使用することができる。そのうちの一方は抗赤血球 抗体と抗ハブテン抗体の組合せによる接合体であり、他方は抗赤血球抗体とハブ テン、抗ハブテン免疫複合体に対する抗体の接合体である。Measurement of habten (partial antigen) that has only one epitope, such as drugs and steroids. In certain cases, two types of conjugates can be used. One of them is anti-erythrocyte The conjugate is a combination of an antibody and an anti-Habten antibody, while the other is an anti-erythrocyte antibody and a Habten antibody. Ten, a conjugate of antibodies against anti-Habten immune complex.

この場合、検定は以下のような手順で行われる＝（ａ）サンプルを第一分割量と 第二分割量の２つに分ける：（ｂ）粒子結合分子と、検定対象物質の結合部位に 結合して第二結合部位を形成する検定対象物質結合分子を含む一次凝集試薬、サ ンプルの第一分割量、凝集性粒子を混ぜて第一混合物を作る； （Ｃ）粒子結合分子と、検定対象物質の第二結合部位に結合する検定対象物質結 合分子を１側ずつ含む第二の一次凝集試薬、サンプルの第二分割量、凝集性粒子 を混ぜて第二混合物を作る； （ｄ）第一混合物と第二混合物を混合して第三混合物を得る； ここで、第三混合物における凝集はサンプル中に検定対象物質が存在することを 示す。In this case, the test is carried out as follows = (a) The sample is divided into the first aliquot and Divide into two parts: (b) particle-bound molecules and the binding site of the substance to be assayed. A primary agglutination reagent containing analyte binding molecules that bind together to form a second binding site; mixing a first aliquot of the sample with cohesive particles to form a first mixture; (C) particle binding molecule and the assay target substance binding to the second binding site of the assay target substance; a second primary agglutination reagent containing polymer molecules on one side, a second aliquot of the sample, and agglutinable particles; to form a second mixture; (d) mixing the first mixture and the second mixture to obtain a third mixture; Here, aggregation in the third mixture indicates the presence of the analyte in the sample. show.

第二結合部位（第二のエピトープ）は、第一検定対象物質結合分子が結合した第 一エピトープの少な（とも一部を含むものであっても、第一検定対象物質結合分 子が結合した結果起こった検定対象物質分子上の配座転換によって生じたもので あってもよい。The second binding site (second epitope) is the second binding site to which the first analyte binding molecule is bound. Even if one epitope is small (or contains only part of it), the amount of binding to the first assay target substance is This is caused by a conformational change on the molecule of the test substance that occurs as a result of the binding of molecules. There may be.

以上２つの基本的な実施態様をさらに拡大して、第一混合物と第二混合物とに二 次凝集試薬を混合することもできる。二次凝集試薬を使用することにより、重複 しないエピトープを多数含む凝集分子を使用することがさほど重要ではなくなる 。このような検定に使用することのできる６種類の二次試薬を以下に掲げておく ：（１）検定対象となる分子の第一結合部位に結合する能力を存する二重体の検 定対象物質結合分子；（２）検定対象物質分子の第三及び第四の結合部位に結合 する能力を有する２価のハイブリッド検定対象物質結合分子； （３）ひとつの検定対象分子上の第三結合部位と他の検定対象分子上の結合部位 に検定対象物質結合分子が結合することによって生じた第四結合部位とに結合す る能力を有する２価のハイブリッド検定対象物質結合分子：（４）（第一の一次 試薬中の）第一検定対象物質結合分子が第一検定対象分子に結合することによっ て生じた結合部位と、第二検定対象物質結合分子が第二検定対象分子に結合する ことによって生じた結合部位とに結合する能力を有する２価のハイブリッド検定 対象物質結合分子：（５）検定対象物質の第一結合部位と検定対象物質の第二結 合部位とに結合する能力を有する２価のハイブリッド検定対象物質結合分子； （６）検定対象物質の第二結合部位と第二検定対象物質結合分子が第二結合部位 に結合した結果生じた新たな結合部位とに結合する能力を有する２価のハイブリ ッド検定対象物質結合分子。Further expanding the above two basic embodiments, the first mixture and the second mixture are A secondary agglutination reagent can also be mixed. Duplication by using secondary agglutination reagents It becomes less important to use aggregate molecules that contain many epitopes that do not . Listed below are six types of secondary reagents that can be used in such assays. :(1) Detection of a duplex that has the ability to bind to the first binding site of the molecule to be assayed. (2) Binds to the third and fourth binding sites of the analyte molecule; a bivalent hybrid assay target substance-binding molecule having the ability to (3) Third binding site on one assay target molecule and binding site on another assay target molecule The fourth binding site created by the binding of the analyte binding molecule to (4) (first primary When the first analyte binding molecule (in the reagent) binds to the first analyte molecule, The binding site generated by the second assay target substance binding molecule binds to the second assay target molecule. A bivalent hybrid assay with the ability to bind to the binding site created by Target substance binding molecule: (5) First binding site of the test target substance and second bond of the test target substance a bivalent hybrid assay target substance-binding molecule having the ability to bind to a binding site; (6) The second binding site of the test target substance and the second test target substance binding molecule are the second binding site A bivalent hybrid that has the ability to bind to a new binding site created as a result of binding to molecule that binds the substance to be assayed.

別の実施態様においては、本発明は、粒子を含むサンプル中に２種類の検定対象 物質が同時に存在するか否かを調べるための２部位置接凝集検定に用いられる。In another embodiment, the present invention provides two analytes in a sample containing particles. It is used in a two-part agglutination assay to determine whether substances are present at the same time.

第−及び第二の２種類の検定対象物質はそれぞれ１個以上の結合部位を有するも のとする。この検定は以下のような手順で行われる （ａ）サンプルを第一分割量と第二分割量の２つに分ける；（ｂ）粒子結合分子 と、第一検定対象物質上の第一結合部位に結合する能力を存する第一の一次凝集 試薬、サンプルの第一分割量、凝集性粒子を混ぜて第一混合物を作る；（ｃ）粒 子結合分子と、第二検定対象物質上の第二結合部位に結合する能力を有する第二 の一次凝集試薬、サンプルの第二分割量、凝集性粒子を混ぜて第二混合物を作る ：（ｄ）第一混合物、第二混合物、第二凝集試薬を混合する。The first and second two types of substances to be tested each have one or more binding sites. To be. This test is performed in the following steps (a) Divide the sample into two aliquots, a first aliquot and a second aliquot; (b) Particle-bound molecules and a first primary aggregation agent having the ability to bind to a first binding site on a first substance to be assayed. Mixing the reagent, a first aliquot of the sample, and the cohesive particles to form a first mixture; (c) particles; a second binding molecule capable of binding to a second binding site on a second analyte; Mix the primary agglutination reagent, a second aliquot of sample, and the agglutinable particles to form a second mixture. :(d) Mixing the first mixture, the second mixture, and the second agglutination reagent.

ここで、二次凝集試薬を加えて得られた混合物における凝集は、サンプル中に第 −及び第二の２種類の検定対象物質が存在することを示す。Here, the agglutination in the mixture obtained by adding the secondary agglutination reagent is - and the second two types of substances to be tested are present.

この実施ｆｉ様においては、二次凝集試薬は異種二重特異性を持つものでなけれ ばならない。一般に、第一接合体を第一のサンプルに混合してから、第二接合体 を第二のサンプルに混合するまでに１−２分の間隔をあけるものとする。第一の 混合サンプルと第二の混合サンプルを混ぜ合わせる時間は通常１−２分間である 。強い陽性の場合、１０−２０秒間で凝集が観察できる。In this implementation, the secondary agglutination reagent must have heterospecific bispecificity. Must be. Generally, the first conjugate is mixed into the first sample and then the second conjugate is mixed into the first sample. There shall be an interval of 1-2 minutes before mixing with the second sample. first The time to mix the mixed sample and the second mixed sample is usually 1-2 minutes. . In case of strong positivity, agglutination can be observed in 10-20 seconds.

本発明の企図する直接凝集検定の別の実施態様においては、血液を第一のＡＢＭ ４８Ｍ接合体と混合したものに、赤血球に結合するＥＢＭと検定対象物質の異な る結合部位に結合するＡＢＭとからなる接合体に結合する粒子（外来の赤血球な ど）を含んだ二次試薬を加える。二次試薬は、ラテックスや外来の赤血球など、 検定対象物質の異なる部位に結合する粒子を化学結合したものであってもよい。In another embodiment of the direct agglutination assay contemplated by the present invention, blood is collected from a first ABM. Mixed with the 48M conjugate, EBM that binds to red blood cells and the substance to be assayed are different. A particle (such as a foreign red blood cell) that binds to a conjugate consisting of ABM that binds to the binding site of Add a secondary reagent containing Secondary reagents include latex and foreign red blood cells. The particle may be chemically bonded to particles that bind to different sites of the substance to be assayed.

粒子／　ＡＢＭおよび粒子：　ＥＢＭ　ＡＢＭの機能であり、検定対象物質のビ スーアービス（対面）結合であると理解されるであろう。Particles/ABM and particles: EBM is a function of ABM and is a function of the particle of the substance to be analysed. It will be understood to be a sous ervis (face-to-face) connection.

Ｈｉｌｌｙａｒｄの特許に示されているような抗体を検定対象とする凝集検定に おいては、検定対象物質（ならびに標識分子として用いられる検定対象と同一由 来の赤血球）を含む血液（全血）サンプルはＥＢ＆！−ＡＢＭ接合体と反応する 。この場合、ＡＢＭは通常、検定対象物質の抗体が結合する特定の抗体、もしく は検定対象物質である抗体の個特異的抗原に対する第二の抗体である。粒子なら びに（検定対象物質である抗体に結合する）ＩＫ二の抗体を追加することにより 、上記の検定の精度は向上することがわかっている。このような第二の抗体の検 定対象物質結合部分は通常抗Ｆｃ抗体である。この抗体は、自らのＰｃを利用し た共有結合によって検定対象物質に結合することも、それと共役結合している粒 子結合部分によって結合することも可能である。サンプル中の検定対象物質がす べて一次試薬によって結合されている場合、二次試薬は検定対象物質と結合する ことにより新たな分子間結合を形成する。For agglutination assays using antibodies as shown in Hilliard's patent, In this case, the substance to be assayed (as well as the same source as the assay target used as the labeled molecule) Blood (whole blood) sample containing red blood cells) is EB&! -Reacts with ABM conjugate . In this case, the ABM is usually a specific antibody to which the antibody of the assay target substance binds, or is a second antibody against the individual specific antigen of the antibody that is the substance to be assayed. If it is a particle By adding IK2 antibody (which binds to the antibody that is the substance to be assayed) , it has been found that the accuracy of the above test is improved. Detection of such a second antibody The target substance binding moiety is usually an anti-Fc antibody. This antibody uses its own Pc It can also be bonded to the substance to be assayed through covalent bonds, or particles that are conjugated with it. It is also possible to combine by means of child binding parts. The test substance in the sample is The secondary reagent binds the analyte if both are bound by the primary reagent. This results in the formation of new intermolecular bonds.

反復性のエピトープを有する物質に関する検定には１種類のＰＢＭ−ＡＢＭ試薬 しか必要とされないが、標識分子と検定対象物質との間に多数の架橋がなされる と検定の精度は低下するように思われる。検定対象物質の持つ反復されるエピト ープを意図的に無視し、その代わりに２種類の非反復性のエピトープを識別もし くは提供することにより、本発明による方式を上記のような検定に応用すること ができる。One type of PBM-ABM reagent for assays for substances with repetitive epitopes only a large number of crosslinks are formed between the labeled molecule and the analyte. The accuracy of the test seems to decrease. Repeated epitopes of the test substance It is also possible to deliberately ignore a single epitope and instead identify two nonrepetitive The method according to the present invention can be applied to the above-mentioned test by providing Can be done.

さらに、稀にしか反復が見られないエピトープを育する物質の検定も、本発明に よる方式を適用することにより精度を向上させることができるが、その場合精度 の向上は前記の例よりも目だだない。Furthermore, the present invention can also be used to assay substances that develop epitopes that are rarely repeated. The accuracy can be improved by applying the following method, but in that case the accuracy The improvement is more noticeable than in the previous example.

本発明の別の実施態様においては、特定の免疫グロブリンイソタイプの抗体（Ｉ ｇＭなど）を検出する方法が提供される。このような検定に本発明を適用するこ とで、抗赤血球抗体と直接結合させることが困難もしくは不可能な、大型の抗原 に対応する抗体（ＩｇＭや特定アレルゲンに対して特異性を持つＩｇＥ　）を検 出することができる。In another embodiment of the invention, antibodies of a particular immunoglobulin isotype (I gM, etc.) is provided. Applying the present invention to such tests and large antigens that are difficult or impossible to bind directly to anti-erythrocyte antibodies. Detects antibodies (IgM and IgE that have specificity for specific allergens) that correspond to can be released.

この場合、ＥＢＭは赤血球細胞上の同一の部位に結合しても、異なる部位に結合 してもよい。In this case, even if EBM binds to the same site on red blood cells, it binds to different sites. You may.

ひとつの試薬は、赤血球（もしくはその他の粒子）とＩｇＢ抗体とに対する二重 特異性を持つもので、Ｉｇｇ分子上のひとつの部位に結合する。もうひとつの試 薬は多価のアレルゲンで、単独で添加しても、ラテックス分子やタンパクなどキ ャリヤーとなる物質に結合させた状態で添加してもよい。アレルゲンに特異的な ＩｇＥ抗体がサンプル中に存在する場合に凝集は起こる。One reagent contains dual antibodies against red blood cells (or other particles) and IgB antibodies. It has specificity and binds to one site on the IgG molecule. another try Medications are multivalent allergens, and even if added alone, they may contain chemicals such as latex molecules and proteins. It may be added in a state bound to a carrier substance. allergen specific Aggregation occurs when IgE antibodies are present in the sample.

同様に１１ｇＭ特異性を有する抗体を検出する際にも、赤血球とＩｇＭとに対す る二重特異性を持つ試薬（１ｇＭ分子のひとつの部位に結合する）と、多価の抗 原性試薬（単独で添加しても、ラテックス分子やタンパクなどキャリヤーとなる 物質に結合させた状態で添加してもよい）とが用いられる。この検定では、特定 のアレルゲンに対して特異性を持つｆｇＭ抗体がサンプル中に存在する場合にの み凝集が生じる。Similarly, when detecting antibodies with 11gM specificity, a bispecific reagent (binds to one site on a 1 gM molecule) and a multivalent antibody. Genomic reagents (even when added alone, as carriers such as latex molecules and proteins) may be added in a state bound to a substance). In this test, specific when fgM antibodies with specificity for the allergen are present in the sample. agglomeration occurs.

以上、本発明について一般的な説明を行ってきたが、以下の実例を参照すること により、この発明をいっそうよく理解することが可能になるものと思われる。た だし、以下の例は説明の便宜を図るためのものであって、特にその旨の記述がな い限り、本発明の範囲を限定することを企図したものではない。The present invention has been described in general terms above, but please refer to the following examples. It is believed that this will enable a better understanding of this invention. Ta However, the following examples are for convenience of explanation, and there is no particular description to that effect. It is not intended to limit the scope of the invention insofar as possible.

実施例１ 赤血球結合分子（ＥＢＭ）：抗グリコホリン抗体の調製マウスにヒトの赤血球に 対する免疫を施し、かつ、マウスのミエローマ（骨髄腫）細胞に対して免疫を施 された動物の牌臓細胞を融合することによって作られたｍＡｂによる免疫を施す 。ハイブリドーマの上滑を、スピン凝集検定及び酵素免疫検定（ＥＩＡ）の２つ の方法によりスクリーニングし、目的とする抗体を得る。この抗体においては、 グリコホリンはマイクロタイター（マイクロ滴定量）プレート中のポリスチレン と結合している。Example 1 Erythrocyte binding molecule (EBM): Preparation of anti-glycophorin antibodies on mouse and human red blood cells immunization against myeloma cells in mice, and immunization against myeloma cells in mice. Immunization with mAbs created by fusing spleen cells from infected animals . Two methods are used to determine the appearance of hybridomas: spin agglutination assay and enzyme immunoassay (EIA). The antibody of interest is obtained by screening using the method described above. In this antibody, Glycophorin is contained in polystyrene in microtiter plates. is combined with

Ｗｙａ　ｔ　ｔ　らの論文（Ａｕｓｔ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｌａｂ、　ｓｃｉ、 　４：４８−５０（１９乃に示されている方法によってスピン凝集を行う。Wyat et al.'s paper (Aust, J, Med, Lab, sci, 4:48-50 (perform spin agglomeration by the method shown in 19).

細胞培養液の上滑５０ｕ１をマイクロタイタープレート中の赤血球懸濁液の１％ 溶液５０ｕｌと混合する。グリコホリンと結合していながら凝集を起こさない抗 体が採取される。Add 50 μl of cell culture medium to 1% of the red blood cell suspension in a microtiter plate. Mix with 50ul of solution. Antibody that binds to glycophorin but does not cause aggregation The body is harvested.

ＥＩＡを行うには、マイクロタイターププレートをヒトのグリコホリン（発売元 ：　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｃｕｔ。To perform an EIA, place a microtiter plate with human glycophorin (sold by : Sigma Chemical Co, Cut.

Ｎｏ、　Ｇ−７３８９１）　１０ｕｇ／ｍｌで被覆し、洗浄した後、ｍＡｂ　Ｏ ）希釈液の濃度を徐々に変化させながら培養を行う。その後もう一度洗浄を行い 、酵素で標識づけした第二の抗体（マウスの免疫グロブリンに対して特異性を持 つもの）を添加した後、酵素の基質（酵素の作用を受ける物質）を添加すること により、結合した抗体が存在するかどうかを判定する。抗体の滴定量は、バック グラウンドより０．１７ユニツト以上大きな吸収（人４２０）を示すバイブリド ーマ上清の最大希釈率により決定される。No. G-73891) After coating with 10ug/ml and washing, mAb O ) Culture is carried out while gradually changing the concentration of the diluent. Then wash again , a second enzyme-labeled antibody (specific for mouse immunoglobulins) Add the enzyme substrate (substance that is acted upon by the enzyme) after adding the enzyme to determine whether bound antibody is present. Antibody titer is back Vibrids exhibiting an absorption 0.17 units or more greater than ground (person 420) determined by the maximum dilution of the supernatant.

３８４個のウェルから４０個の一次クローンを選抜する。40 primary clones are selected from 384 wells.

これらのクローンはすべて３つのカテゴリー（スピン凝集検定の結果が陽性のも の、ＥＩＡ検定においてグリコホリンに結合していたもの、もしくはその双方を 兼ね備えたもの）のいずれかに属する。All of these clones fall into three categories (including those with positive spin agglutination assay results). , which was bound to glycophorin in the EIA assay, or both. It belongs to one of the following.

表　１ ＥＩＡ　スピン凝集　クローン数 グリコホリン領域によって識別されるｍＡｂが赤血球表面に露出していることを 確認するため、さらに吸収に関する検定を行う。Table 1 EIA spin agglomeration clone number mAb identified by the glycophorin region is exposed on the red blood cell surface. To confirm, further absorption tests will be performed.

望ましい反応性を備えたｍＡｂを生成するハイブリドーマ細胞をマウス体内の腹 膜に注入し、当該技術分野において既に知られている方式に従って培養する。目 的とするｍＡｂを含む腹水は、遠心分離機とスクリーニングによって不純物を除 去する。Hybridoma cells producing mAbs with the desired reactivity are placed in the abdomen of a mouse. The membranes are injected and cultured according to methods already known in the art. eye The ascites containing the target mAb is purified by centrifugation and screening. leave

さまざまなｍＡｂを含んだ腹水のスクリーニング検定の結果を、以下の表２に示 す。The results of the ascites screening assay containing various mAbs are shown in Table 2 below. vinegar.

ＲＡＴ　ＩＤ３／１６７　５１２０００　＜１０００　Ｐ４−ｎＲＡＴ　３Ｄ６ １５　６４００　１０２１１０００　Ｆ％十１ＲＡＴ　ｌｃ３／８６　＜１００ ０　１０２４０００　ｐ％　ｎＲＡＴ　３Ｂ１／１７２　２５６０００　２００ ０　Ｐ４−５ｆＲＡ、Ｔ　３Ｄ３／２２　４０００　１０２４０００　）４＋１ ＲＡＴ　３Ｄ５／６１　１２８０００　１０２４０００　Ｑ−ｉｉＲＡＴ　ＩＣ ３／８６　＜１０００　２５６０００　ＡＶＲＡＴ　２に２７１８１　＜１００ ０　１２８０００　１４＋１ＲＡＴ　ＩＤ３／１６７　＜１０００　１２８００ 　Ｒｉｎ’ｔＬＲＡ、Ｔ　１ｃ４１５　＜１０００　１２８０００　１％−ＨＲ ＡＴ　４Ｃ３／Ｄ　＜１０００　１２８０００　ｐｌ−ＨＲＡＴ　３Ｂ１／７０ 　＜１０００　５１７０００　％％　Ｆ隻ＲＡＴ　ＩＣ３／８６が選抜され、１ ９８８年９月７日、ブダペスト条約に基づいてアメリカン・タイプ・カルチャー ・コレクション（住所：　１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏ ｃｋｖｉｌｌｅ　ＭＤ、　２０８５２　）に委託された。この細胞系統は「Ｇ２ ６゜４４Ｃ３／８６」の名称を持ち、ＡＴＣＣ加入番号はＨＢ９８６３である。RAT ID3/167 512000 <1000 P4-nRAT 3D6 15 6400 10211000 F% 11RAT lc3/86 <100 0 1024000 p% nRAT 3B1/172 256000 200 0 P4-5fRA, T 3D3/22 4000 1024000) 4+1 RAT 3D5/61 128000 1024000 Q-iiRAT IC 3/86 <1000 256000 AVRAT 2 to 27181 <100 0 128000 14+1RAT ID3/167 <1000 12800 Rin’tLRA, T 1c415 <1000 128000 1%-HR AT 4C3/D <1000 128000 pl-HRAT 3B1/70 <1000 517000%% F ship RAT IC3/86 was selected and 1 American Type Culture on September 7, 988 under the Treaty of Budapest ・Collection (Address: 12301 Parklawn Drive, Ro ckville MD, 20852). This cell lineage is “G2 6°44C3/86" and its ATCC accession number is HB9863.

腹水から採取されたｍＡｂは、ハイドロオキシアパタイト（を椎動物の結合組織 によって形成される硬組織中の無機成分）を用いたクロマトグラフィーによって 、均質な状態になるまで純化されている。mAbs collected from ascites are derived from hydroxyapatite, a vertebrate connective tissue. by chromatography using inorganic components in hard tissues formed by , purified to a homogeneous state.

実施例２ キメラ抗体（抗グリコホリン／抗ｈＣＧ（ヒトのコリオゴナドトロピン））の生 成とｈＣＧ検定への利用当該技術分野においてよく知られている方法によって、 ｈＣＧのベータ・サブユニットと完全な１０６分子の双方に反応するモノクロー ナル抗体を作り出す。ハイブリドーマ上清をスクリーニングし、酵素免疫検定を 施して、目的とする抗体が存在するかどうかを判定する。この場合、実施例１で 示したのとほぼ同じように、ｈＣＧのベータ・サブユニット、アルファ・サブユ ニットならびに完全な１０６分子は、マイクロタイタープレート中でポリスチレ ンに結合している。Example 2 Production of chimeric antibody (anti-glycophorin/anti-hCG (human choriogonadotropin)) composition and use in hCG assays by methods well known in the art. A monochrome that reacts with both the hCG beta subunit and the complete 106 molecule. produces null antibodies. Screen hybridoma supernatants and enzyme immunoassay to determine whether the antibody of interest is present. In this case, in Example 1 In much the same way as shown, the beta and alpha subunits of hCG The knit as well as the complete 106 molecules were grown on polystyrene in a microtiter plate. is connected to the

各種のｍＡｂを含む腹水をスクリーニング検定した結果を、以下の表３に示す。The results of screening ascites containing various mAbs are shown in Table 3 below.

ＨＣＧ　２λ１／６７　＜１０００　１０２８００００　５１２０００ＨＣＧ　 ２Ｃ１／４　＜１０００　４０００　６４０００ＨＣＧ　３Ｄ２／３４　＜１０ ００　１２８０００　１２８０００ＥＣＧ　ＩＣ３／８６　＜１０００　５１２ ０００　５１２０００ＨＣＧ　２Ｂ５／３４　＜１０００　１０００　１２８０ ００ＥＣＧ　２Ｂ４／９８　く１０００　＜１０００　２５６０００腹水から採 取されたｍＡｂは、ハイドロオキシアパタイト（を椎動物の結合組織によって形 成される硬組織中の無機成分）を用いたクロマトグラフィーによって、均質な状 態になるまで純化されている（参考文献・５ｔａｎｋｅｒｅｔ　ａｌ　、　Ｊ、 　［ｏ＋ｍｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈ、　７６１５７１９８５　）。HCG 2λ1/67 <1000 10280000 512000HCG 2C1/4 <1000 4000 64000HCG 3D2/34 <10 00 128000 128000ECG IC3/86 <1000 512 000 512000HCG 2B5/34 <1000 1000 1280 00ECG　2B4/98　1000　＜1000　256000 Collected from ascites The extracted mAb is derived from hydroxyapatite (formed by vertebrate connective tissue). By chromatography using inorganic components in hard tissues, a homogeneous (References: 5 tankeret al, J, [o+muno1. Meth, 761571985).

Ｈａｃｋｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８１．　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　１５ ．４２９−４３６の論文で述べられているように、モノクローナル抗体ｒＲＡＴ 　ＩＣ３／８６Ｊ　（ヒトの赤血球に対する抗体）及びｒ　ＨＣＧ−２Ａ・１／ ６７ＪならびにｒＨＣＧ−ＩＡ３／６３Ｊ　（ヒトのＨＣＧに間する抗体）は、 本質的にはペプシンにより分解され、ｒ　ＴＳＫ−３０００ＳＷ　Ｊ　をカラム とするクロマトグラフィーによって精製される。０．１Ｍの酢酸、７０ｍＭの塩 化ナトリウムを含んだ緩衝液（ｐＨ３，５）中で、１％（重量比）のペプシンが 「ＲＡＴ　ＩＣ３／８６Ｊ　２ｍｇを分解するのに要する時間はおよそ４５分、 同じ緩衝液中で１％（重量比）のペプシンが２ｍｇのｒ　）ＩｃＧ−２Ａ１／６ ７」ならびにｒ　）ＩｃＧ−ＩＣ３／８６」を分解するのに要する時間はおよそ ２時間である。トリス（中性領域の緩衝剤溶塩基化合物）１．５Ｍを添加してｐ Ｈを８まで上げると反応は停止する。Ｆ（ａｂ）ｚの断片はｒＴＳＫ−３０００ ＳＷ　Ｊをカラムとするゲル濾過クロマトグラフィーによって精製される。Hackman et al., 1981. Immunology, 15 ．． The monoclonal antibody rRAT as described in the paper 429-436 IC3/86J (antibody against human red blood cells) and rHCG-2A・1/ 67J and rHCG-IA3/63J (antibody to human HCG), Essentially, it is decomposed by pepsin, and r　TSK-3000SW　J　column It is purified by chromatography. 0.1M acetic acid, 70mM salt In a buffer solution (pH 3.5) containing sodium chloride, 1% (weight ratio) pepsin is “The time required to decompose 2mg of RAT IC3/86J is approximately 45 minutes. 2 mg of 1% (by weight) pepsin in the same buffer) IcG-2A1/6 The time required to decompose ``7'' and ``IcG-IC3/86'' is approximately It is 2 hours. Add 1.5M Tris (a neutral range buffer soluble compound) to p The reaction stops when H is raised to 8. F(ab)z fragment is rTSK-3000 It is purified by gel filtration chromatography using SWJ as a column.

Ｐ（ａｂ）ｔの還元とそれに続いて起こるＰａ、ｂ断片のブロッキングについて は、Ｂｒｅｎｎａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５．５ｃｉｅｎｃｅ　２２９、８ １−８３の論文に述べられている。精製された３ＩＩＩｇ／ｌＩＤ１のＦ（ａｂ ）ｔにヒ酸ナトリウム１１０１ｎを加え、温度を２５°Ｃに保ちつつ、メルカブ トエチラミン１ｍＭで１６時間にわたって処理する。Ｆａｂ断片は、２５℃の温 度で３時間にわたり「５．５−ジオチオビス、（２−ニトロ安息香酸）」（エル マン試薬）との反応により安定化させる。次にＦａｂ断片をｒＴＳＫ−３ｏＯｏ 　ＳＷ　Ｊをカラムとするゲル濾過クロマトグラフィーによって精製する。Reduction of P(ab)t and subsequent blocking of Pa,b fragments Brennan et al., 1985.5science 229, 8 1-83. Purified 3IIIg/lID1 F(ab ) Add 1101n of sodium arsenate to t, and while keeping the temperature at 25°C, melt Treat with toethyramine 1mM for 16 hours. Fab fragments were incubated at 25°C. "5,5-Diothiobis, (2-nitrobenzoic acid)" (El. It is stabilized by reaction with Mann's reagent). Next, the Fab fragment was rTSK-3oOo Purify by gel filtration chromatography using SW J as a column.

チオールの形態をとったｒＨＣＧ　２Ａ１／６７ノおよびｒＨｃＧＩＡ３／６３ 　Ｊは、ｌ０ｍＭのメルカブトエチラミンを加えて２５℃の温度で３０分間反応 させる。余分の試薬はゲル濾過クロマトグラフィーによって除去する。チオール の形をしたそれぞれの）ＩＣＧ抗体とエルマン試薬で処理したｒＲＡＴ−ＩＣ３ ／８６ＪをＢｒｅｎｎａｒｌらの論文に示されている通りの方法で、温度を２５ ℃に保ちつつ１６時間別々に培養する。最終的には、ｒ　ＴＳＫ〜３０００　Ｓ Ｗ　Ｊをカラムとするゲル濾過クロマトグラフィーによってキメラ抗体が精製さ れる。rHCG in thiol form 2A1/67 and rHcGIA3/63 In J, add 10mM mercabutoethyramine and react for 30 minutes at a temperature of 25°C. let Excess reagents are removed by gel filtration chromatography. thiol rRAT-IC3 treated with Ellman's reagent and respective ICG antibodies in the form of /86J at a temperature of 25 Incubate separately for 16 hours while keeping at ℃. In the end, r　TSK~3000　S The chimeric antibody was purified by gel filtration chromatography using WJ as a column. It will be done.

実施例３ ＨＯＧのための１２滴」凝集検定 試薬１　：　ＢＳＡ　１　ｍｇ／ｍｌと０．０１Ｑ　％（７）アジ化ナトリウム を含むＰＢＳ　、　Ｉ］Ｈ７，４中の接合体Ａ（赤血球に結合する抗体の「半分 Ｊ　、ＲＡＴ　ＩＣ３／８６、ＨＣＧ　Ｇ：対し”ＣＩＲＩＡ性ヲ持つ抗体Ａの 「半分」から構成されるハイブリッド抗体）１゜ｕｇ／ｍｌ。Example 3 12 drops for HOG' agglutination assay Reagent 1: BSA 1 mg/ml and 0.01Q% (7) sodium azide Conjugate A (half of the antibody that binds to red blood cells) in PBS, I] H7,4 J, RAT IC3/86, HCG G: Antibody A with CIRIA properties Hybrid antibody composed of “half”) 1゜ug/ml.

試薬２　：　ＢＳＡ　１　ｍｇ／ｍｌと０．０１０％のアジ化ナトリウムを含む ＰＢＳ　、　ｐＨ７，４中の接合体Ｂ（赤血球に結合する抗体の「半分Ｊ　、　 ＲＡＴ　ＩＣ３／８６、ＨＣＧ　ｊｌ：対して特ａ性を持つ抗体Ｂの「半分Ｊか ら構成されるハイブリッド抗体）ｌＱｕｇ／ｍｌ　ａ 方法 この方法による検定では、２滴の血液が必要である。Reagent 2: Contains BSA 1 mg/ml and 0.010% sodium azide Conjugate B (half J of the antibody that binds to red blood cells) in PBS, pH 7.4 RAT IC3/86, HCG jl: "Half J?" of antibody B with characteristic a against (hybrid antibody composed of) lQug/ml a Method Assays using this method require two drops of blood.

そのうち１滴はまず接合体１と混合され、他の１滴は接合体２と混合される（こ れらの血液は、前述した「サンプルの第一分割量と第二分割量」に相当する）。One drop is first mixed with conjugate 1, and the other drop is mixed with conjugate 2 (this These blood correspond to the "first and second aliquots of the sample" described above).

一定期間保温を行った後、２滴の血液を混ぜ合わせる。血液サンプル全体から５ ｕｌのサンプルを２回にわたって採取し、スライド上におよそ１０ＩＩｌ離して 配置する。一方に試薬１を１０ｕｌ加え、小型のかき混ぜ棒（楊子など）を用い て混ぜ合わせ、小さな円状に広げる。第二のサンプルには試薬２を加え、同様な 方法で混ぜ合わせる。After keeping it warm for a certain period of time, two drops of blood are mixed together. 5 from the entire blood sample Samples of ul were taken in duplicate and placed approximately 10 ul apart on the slide. Deploy. Add 10ul of Reagent 1 to one side and use a small stirring stick (toothpick, etc.) Mix together and spread into a small circle. Add reagent 2 to the second sample and do the same. Mix by method.

接合体が赤血球と結合する前に誤って２つのサンプルが混ざってしまうと、検定 の精度は低下する。If the two samples are accidentally mixed before the conjugate binds to the red blood cells, the assay The accuracy of is reduced.

次に凝集プレートを３０秒はど静かに揺すぶり、試薬を加えた２つのサンプルを 楊子などで混ぜ合わせる。そうして作られた混合物をさらに２分はど静かに揺す って、凝集の広がりを測定する。Next, shake the agglutination plate gently for 30 seconds and mix the two samples with reagents. Mix with Yangzi. Shake the mixture gently for another 2 minutes. to measure the spread of aggregation.

当然ながら、この方法は自動化（もしくはそれ専用の装置を使用）することが可 能である。「２滴」のサンプルを用いた検定と「１滴」のサンプルの希釈度を変 えて用いた検定とを比較すると、「２滴検定」によって検定されたそれぞれのサ ンプルでは目に見える凝集が起こっており、その反応は「１滴検定」の場合より もはるかに強いことがわかる。Of course, this method can be automated (or using specialized equipment). It is Noh. Assay using “2 drops” sample and varying dilution of “1 drop” sample When compared with the test used by the ``two-drop test,'' Visible agglutination occurs in the sample, and the reaction is more pronounced than in the “one drop test”. Turns out it's much stronger too.

実施例４ ＨＣＧのための「１滴」粒子キャリヤー検定試薬：　０．０１０％のアジ化ナト リウムを含むＰＢＳ中の接合体Ａ（実施例３と同じもの）　１０ｕｇ／ｍｌ　、 　ＨＣＧに特異性を持つ抗体Ｂで被覆したラテックス粒子（プリスチレン、直径 ０．８ｕｍ）の０．５％懸濁液。Example 4 “One Drop” Particle Carrier Assay Reagent for HCG: 0.010% Sodium Azide Conjugate A (same as Example 3) in PBS containing 10 ug/ml, Latex particles (pristyrene, diameter: 0.5% suspension of 0.8 um).

方法 この方法による検定では血液サンプルは１滴しか必要なく、実施例３の検定と同 様の精度が得られる。血液１０ｕ１に対して２５ｕ１の試薬を加え、小型のかき 混ぜ棒で混合させ、さらに２分間静かに揺さぶり、凝集が起こるかどうかを確認 する。Method The assay using this method requires only one drop of blood sample and is similar to the assay in Example 3. Accuracy can be obtained. Add 25 u1 of reagent to 10 u1 of blood, and Mix with a mixing rod and shake gently for another 2 minutes to see if agglomeration occurs. do.

実施例５ その他のＥＢＭとして使用されるメリチンの調製ミツバチの毒液から抽出された ペプチド「メリチン」（アミノ酸配列：　ＣＶＬＴＴＧＬＰＡＩ、ｌ５ＷＩＫＲ ＫＩ？ＱＱ）は、赤血球に結合するｍＡｂの代わりに眉いられる。このペプチド は赤血球細胞を溶解させることなく、Ｗ胞表面と結合することができる（参考文 献：　ｄｅ　Ｇｒａｄｏ、　’／１．Ｐ、ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ａｍｅｒ。Example 5 Other Preparations of Melittin Used as EBM Extracted from Bee Venom Peptide “melittin” (amino acid sequence: CVLTTGLPAI, l5WIKR KI? QQ) is substituted for the mAb that binds to red blood cells. This peptide can bind to the W cell surface without lysing red blood cells (Ref. Dedicated to: de Grado, '/1. P, et al., J. Amer.

Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　１０３：６７９−８１　（１９８１））　、また、この ペプチドはメリフィールドの手順（参考文献：　Ｈｏｄｇｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、 　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　６５：２４１　（１９７５）　）によって合 成することが可能である。Chem, Soc, 103:679-81 (1981)), and this Peptides were prepared using the Merrifield procedure (References: Hodges et al. Anal, Biochem, 65:241 (1975)). It is possible to accomplish this.

メリチンをＩＥＧＭとして使用するメリットのひとつは、メリチンとペプチド− タイプＡＢＭをひとつのユニットとして合成できることである。こうして合成さ れた２つのペプチドは、それぞれ赤血球結合作用と検定対象物質結合作用を備え ている。One of the advantages of using melittin as an IEGM is that melittin and peptide- Type ABM can be synthesized as one unit. This is how it is synthesized The two peptides obtained have the ability to bind red blood cells and the substance to be assayed, respectively. ing.

本発明についての説明は以上の通りであるが、関連技術分野に精通した人物であ れば、本発明の趣旨を逸脱することなく、かつ不当に困難な実験を行う必要もな しに、広範なパラメータ、濃度、条件に従って本発明が実施できることを理解さ れることだろう。Although the present invention has been explained above, it is important to note that the explanation of the present invention is as follows. If so, it is not necessary to conduct unreasonably difficult experiments without departing from the spirit of the present invention. However, it is understood that the invention can be practiced according to a wide variety of parameters, concentrations, and conditions. I'm sure it will.

本発明は特定の実施例に関して説明されているが、本発明の実施にあたって本書 に記された実施例を変更することが可能である。本書は、本発明の原理一般に従 った発明の変更、用途、調整についても適用されるものである。また、関連技術 分野の内部で既に知られている、あるいは実施されている手法を取り入れてなさ れた本書の開示に基づく変更も、本特許出願の対象となる。さらに、以下の請求 の範囲に記されている基本的特徴はすべて本特許出願の対象となるものとする。Although the invention has been described with respect to specific embodiments, this document is not intended for practicing the invention. It is possible to modify the embodiment described in . This document is written in accordance with the general principles of the invention. This also applies to modifications, uses, and adjustments of the invention. Also, related technology Do not incorporate methods already known or practiced within the field. Modifications based on the disclosures herein are also covered by this patent application. In addition, the following claims All essential features mentioned in the scope shall be covered by this patent application.

キー°、。Key °,.

国際調査報告 ＩＩＩｔｅｒｎ−１＋６１１＠ＩＡｏｏｔｌｅｅｔｌｏ＊ＩＩｓ、ＰＣｒｌ＾Ｉ ＩＥ１１００ｅ〆′international search report IIItern-1+611@IAootleetlo*IIs, PCrl^I IE1100e〆'

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．非反復性の第一エピトープ及び非反復性の第二エピトープを有する検定対象 物質をサンプル中に検出するための直接凝集検定であって、 （ａ）凝集性粒子と前記検定対象物質の非反復性のエピトープとに同時に結合す る能力を持ち、前記検定対象物質の異なる非重複性のエピトープに結合する、第 一及び第二の一次凝集試薬を供給し、 （ｂ）サンプルの一部、前記第一試薬、及び前記第一試薬と結合し得る凝集性粒 子からなる第一混合物を形成し、 （ｃ）サンプルの別の一部、前記第二試薬、及び前記第二試薬と結合し得る凝集 性粒子からなる第二混合物を形成し、 （ｄ）前記第一混合物及び第二混合物を混合して第三混合物を形成することから なり、 ここで、前記第三混合物における凝集はサンプル中に検定対象物質が存在するこ とを示す、上記検定。 ２．前記サンプルが全血である請求項１記載の検定。 ３．前記第一及び第二試薬が、抗赤血球抗体もしくはそれらの特異的結合性断片 である凝集性粒子結合性分子を含む請求項２記載の検定。 ４．前記抗体が抗グリコホリン抗体もしくはそれらの特異的結合性断片である請 求項８記載の検定。 ５．凝集性粒子がサンプルと同一の由来を持つ請求項１記載の検定。 ６．凝集性粒子がサンプルと異なる由来を持つ請求項１記載の検定。 ７．前記サンプルが全血、血液から分離された成分、尿、***、唾液、髄液、羊 水、腹水、肋膜滲出液、■液、膿汁及び組織抽出液からなる群から選択される請 求項１または５記載の検定。 ８．凝集性粒子が、ラテックス、炭、カオリナイト、ベントナイト、微生物細胞 及び赤血球細胞からなる群から選択される請求項６記載の検定。 ９．第一の一次凝集試薬が、凝集性粒子上で第二の一次凝集試案が結合するエピ トープとは異なるエピトープに結合する請求項１記載の検定。 １０．第一の結合部位を有する検定対象物質をサンプル中に検出するための直接 凝集検定であって、（ａ）濃集住粒子と前記検定対集物質のエピトープとに結合 し、前記対象物質のエピトープに結合された場合に第二のエピトープを形成する 能力を持った、第一の一次凝集試薬を供給し、 （ｂ）サンプルの一部、前記第一試薬、及び前記第一試薬と結合し得る凝集性粒 子からなる第一混合物を形成し、 （ｃ）凝集性粒子と前記第二エピトープとに結合する能力を持った、第二の一次 凝集試薬を供給し、（ｄ）サンプルの別の一部、前記第二試薬、前記第二試薬と 結合する凝集性粒子、前記第二試薬と結合し得る前記第二エピトープからなる第 二混合物を形成し、（ｅ）前記第一混合物及び第二混合物を混合して第三混合物 を形成することからなり、 ここで、前記第三混合物における凝集はサンプル中に検定対象物質が存在するこ とを示す、上記検定。 １１．前記サンプルが全血である請求項１０記載の検定。 １２．前記第一試薬と第二試薬が同一の凝集性粒子結合性分子を持つ請求項１ま たは１０記載の検定。 １３．前記第一試薬と第二試薬が異１なる凝集性粒子結合性分子を持つ請求項１ または１０記載の検定。 １４．前記検定対象物質のエピトープ及び一次試薬が前記検定対象物質に結合し た際に生じたエピトープからなる群から選択されるエピトープに特異的である各 々の結合部位を有する二重特異性の二次凝集試薬と第三混合物とを反応させる手 順をさらに含む請求項１記載の検定。 １５．前記検定対象物質のエピトープ及び一次試薬が前記検定対象物質に結合し た際に生じたエピトープからなる群から選択されるエピトープに特異的である各 々の結合部位を有する二重特異性の二二次雄凝試薬と第三混合物とを反応させる 手順をさらに含む請求項５記載の検定。 １６．凝集性粒子がサンプルと同一の由来を持つ請求項１０記載の検定。 １７．凝集微粒子がサンプルと異なる由来を持つ請求項１０記載の検定。 １８．前記サンプルが全血、血液から分離された成分、尿、***、唾液、髄液、 羊水、腹水、肋膜滲出液、■液、膿汁及び組織抽出液からなる群から選択される 請求項１０または１６記載の検定。 １９．凝集性位子が、ラテックス、炭、カオリナイト、ペントナイト、徴生物細 胞及び赤血球細胞からなる群から選択される請求項１７記載の検定。 ２０．第一の一次凝集試薬が、凝集微粒子上で第二の一次凝集試薬が結合するエ ピトープとは異なるエピトープに結合する請求項１記載の検定。 ２１．サンプル中から、それぞれが１個以上の検定対象物質−結合部位を含む第 一及び第二の２つの異なる検定対象物質の存在を同時に検出するための２部位直 接凝集検定であって、 （ａ）凝集性粒子と前記第一検定対象物質とに同時に結合する能力を持った、第 一の一次凝集試薬を供給し、（ｂ）凝集性粒子の同一または異なるエピトープと 、前記第二検定対象物質とに同時に結合する能力を持った、第二の一次凝集試薬 を供給し、 （ｃ）前記第一及び第二の一次凝集試薬と結合する凝集性粒子がサンプル中に既 に存在していない場合には、そのような粒子を供給し、 （ｄ）サンプルの一部、前記第一凝集試薬、及び結合可能な凝集性粒子からなる 第一混合物を形成し、第一検定対象物質：第一凝集試薬：粒子の複合体を得、（ ｅ）サンプルの別の一部、第二の一次凝集試薬、及び結合可能な凝集性粒子から なる第二混合物を形成し、第二検定対象物質：第二試薬：粒子の複合体を得、（ ｆ）前記第一複合体と第二複合体とに同時に結合する能力を備え、前記検定対象 物質が本来有するエピトープもしくは前記検定対象物質への一次凝集試薬の結合 によって形成されたエピトープのいずれかに対して特異性を持つが、同一の検定 対象物質の２つの複合体と結合する能力を持たない二次凝集試薬を供給し、（ｇ ）前記第一混合物、第二混合物、及び二次凝集試薬からなる第三混合物を形成す ることからなり、ここで、前記第三混合物における凝集は前記第一検定対象物質 と第二検定対象物質がサンプル中に同時に存在することを示す、上記検定。 ２２．非反復性の第一エピトープと非反復性の第二エピトープを有する検定対象 物質をサンプル中に検出するための直接凝集検定であって、 （ａ）凝集性粒子と前記検定対象物質の非反復性エピトープに同時に結合する能 力を持った第一の一次凝集試薬を供給し、 （ｂ）サンプルの一部、前記第一試薬、及び前記第一試薬と結合し得る凝集性粒 子からなる第一混合物を形成し、 （ｃ）第二の一次凝集試薬と凝集性位子の複合体から成る一次凝集剤を供給し、 前記第二の一次凝集試薬は前記検定対象物質の非反復性のエピトープと結合する 能力を有し、第一及び第二の試薬はそれぞれ、前記検定対象物質の異なる非重複 性エピトープと待合し、（ｄ）前記第一混合物、前記凝集剤、及び前記第一試薬 と結合し得る凝集性粒子からなる第二混合物を形成することからなり、 ここで、第二混合物における凝集はサンプル中に検定対象物質が存在することを 示す、上記検定。 ２８．第一結合部位を有する検定対象物質をサンプル中に検出するための直接凝 集検定であって、（ａ）凝集性粒子と前記検定対象物質のエピトープに結合し、 前記対象物質のエピトープと結合した場合に第二のエピトープを形成する能力を 持った、第一の一次凝集試薬を供給し、 （ｂ）サンプルの一部、前記第一試薬、及び前記第一試薬と結合し得る凝集性粒 子からなる第一混合物を形成し、 （ｃ）第二の一次凝集試薬と凝集性粒子との複合体から成る一次凝集剤を供給し 、前記第二の一次凝集試薬は前記第二エピトープと結合する能力を有し、（ｄ） 前記第一混合物と前記凝集剤を混合して第二混合物を形成することからなり、 ここで、第二混合物における凝集はサンプル中に検定対象物質が存在することを 示す、上記検定。 ２４．一次凝集剤の凝集性粒子が、ラテックス、炭、カオリナイト、ベントナイ ト、徴生物細胞及び赤血球細胞からなる群から選択される請求項２２または２３ 記載の検定。 ２５．前記サンプルが血液、血液から分離された成分、尿、***、唾液、髄液、 羊水、腹水、肋膜滲出液、■液、膿汁及び組織抽出液からなる群から選択される 請求項２２または２３記載の検定。 ２６．それぞれが１個以上の検定対象物質−結合部位を持つ第一及び第二の２つ の異なる検定対象物質をサンプル中に同時に検出するための２部位直接凝集検定 であって、 （ａ）凝集性粒子と前記第一検定対象物質とに同時に結合する能力を持った、第 一の一次凝集試薬を供給し、（ｂ）前記の第一の一次凝集試薬と結合する凝集性 粒子がサンプル中に既に存在していない場合には、そのような粒子を供給し、 （ｃ）サンプルの一部、前記第一凝集試薬、結合可能な凝集性粒子との第一混合 物を形成し、第一検定対象物質：第一凝集試薬：粒子の複合体を得、（ｄ）第二 の一次凝集試薬と粒子の複合体から成る一次獲集荊を供給し、前記第二の一次凝 集試薬は第二の検定対象物質に結合して第二の複合体を形成する能力を有し、 （ｅ）前記第一複合体と第二複合体とに同時に結合する能力を備え、前記検定対 象物質が本来有するエピトープもしくは前記検定対象物質への一次凝集試薬の結 合によって形成されたエピトープに対して特異性を持つが、同一の検定対象物質 の２つの複合体と結合する能力を持たない二次凝集試薬を供給し、 （ｆ）前記第一混合物、一次凝集剤、及び二次凝集試薬からなる第二混合物を形 成することからなり、ここで、前記第二混合物における凝集は前記第一検定対象 物質と第二検定対象物質がサンプル中に同時に存在することを示す、上記検定。 ２７．それぞれが１個以上の検定対象物質−結合部位を持つ第一及び第二の２つ の異なる検定対象物質をサンプル中に同時に検出するための２部位直接凝集検定 であって、 （ａ）第一の一次凝集試薬と粒子の複合体から成る第一の一次凝集剤を供給し、 前記第一の一次凝集試薬は第一の検定対象物質に結合して第一複合体を形成する 能力を有し、 （ｂ）第二の一次凝集試薬と粒子の複合体から成る第二の一次凝集剤を供給し、 前記第二の一次凝集試薬は第二の検定対象物質に結合して第二複合体を形成する 能力を有し、 （ｅ）前記第一複合体と第二複合体とに同時に結合する能力を備え、前記検定対 象物質が本来有するエピトープもしくは前記検定対象物質への一次試薬の結合に よって形成されたエビトープに対して特異性を持つが、同一の検定対象物質の２ つの複合体と結合する能力を持たない二次凝集試薬を供給し、 （ｆ）前記サンプル、前記第一及び第二の一次凝集剤、二次凝集試薬からなる第 一混合物を形成することからなり、 ここで、前記第一混合物における凝集は前記第一検定対象物質と第二検定対象物 質がサンプル中に同時に存在することを示す、上記検定。 ２８．それぞれ１個以上の検定対象物質結合部位を持つ３つの異なる検定対象物 質をサンプル中に同時に検出するための２部位直接凝集検定であって、（ａ）第 一凝集性粒子と第一検定対象物質に同時に結合する能力を有する第一の一次凝集 試薬を供給し、（ｂ）第二凝集性粒子と第二検定対象物質に同時に結合する能力 を有する第二の一次凝集試薬を供給し、（ｃ）第一及び第二の一次凝集試薬と結 合する凝集性粒子がサンプル中に既に存在していない場合には、それぞれの試薬 と結合し得る第一及び第二の凝集性粒子を供給し、 （ｄ）サンプルの一部、前記第一の一次凝集試薬、及び第一の凝集性粒子からな る第一混合物を形成し、第一検定対象物質：第一の一次凝集試薬：第一粒子の複 合体を得、 （ｅ）サンプルの別の一部、前記第二の一次凝集試薬、及び第二の凝集性粒子か らなる第二混合物を形成し、第二検定対象物質：第二の一次凝集試薬：第二粒子 の複合体を得、 （ｆ）前記第一複合体と第三の検定対象物質とに同時に結合する能力を持つ第一 の二次凝集試薬と、前記第二複合体と第三の検定対象物質に同時に結合する能力 を持つ第二の二次凝集試薬を供給し、 （ｇ）前記の第一及び第二混合物と第一及び第二の二次凝集試薬とからなる第三 混合物を形成することからなり、 ここで、前記第三混合物における凝集は、第一、第二及び第三の検定対象物質が サンプル中に同時に存在することを示す、上記検定。 ２９．各々が１つ以上の検定対象物質結合部位を有する多数の異なる検定対象物 質をサンプル中に同時に検出するための２部位直接凝集検定であって、（ａ）第 一凝集性粒子と第一検定対象物質に同時に結合する能力を有する第一の一次凝集 試薬を供給し、（ｈ）第二凝集性粒子と第二検定対象物質に回持に結合する能力 を有する第二の一次凝集試薬を供給し、（ｃ）第一及び第二の一次凝集試薬と結 合する凝集性粒子がサンプル中に既に存在していない場合には、それぞれの試薬 と結合し得る第一及び第二の凝集性粒子を供給し、 （ｄ）サンプルの一部、前記第一の一次凝集試薬、及び第一の凝集性粒子からな る第一混合物を形成し、第一検定対象物質：第一の一次凝集試薬：第一粒子の複 合体を得、 （ｅ）サンプルの別の一部、前記第二の一次凝集試薬、及び第二の凝集性位子か らなる第二混合物を形成し、第二検定対象物質：第二の一次凝集試薬：第二粒子 の複合体を得、 （ｆ）前記第一複合体と第三の検定対象物質とに同時に結合する能力を持つ第一 の二次凝集試薬と、前記第二複合体と第四の検定対象物質に同時に結合する能力 を持つ第二の二次凝集試薬を供給し、 （ｇ）前記第三検定対象物質と第一の追加検定対象物質とに結合する能力を有す る第一の三次凝集試薬、及び前記第四検定対象物質と第二の追加検定対象物質と に結合する能力を有する第二の三次凝集試薬というように、２つの異なる第（ｎ ）の追加検定対象物質に同時に結合する能力を有する第（ｎ＋１）の三次凝集試 薬を供給し（ｎは２以上の整数）、 （ｈ）前記第一混合物、第二混合物、第一及び第二凝集性粒子、及び第（ｎ＋１ ）の三次凝集試薬からなる第三混合物を形成することからなり、 ここで、前記第三混合物における凝集は多数の異なる検定対象物質がサンプル中 に同時に存在することを示す、上記検定。 ３０．全血中にアレルゲン特異的ｌｇＥ抗体を検出するための検定であって、 （ａ）前記全血が採取された種のｌｇＥに特異的である、ｌｇＥ分子のひとつの 部位のみと結合する能力を有する異種二重特異性を持つ抗−赤血球、抗−ｌｇＥ 抗体を供給し、 （ｂ）前記ｌｇＥ抗体と結合する多価アレルゲンを既知量供給し、 （ｃ）前記全血サンプルを前記の異種二重特異性を持つ抗体ならびに前記アレル ゲンと反応させることからなり、 これにより、前記アレルゲンを多価的に結合するｌｇＥ抗体が存在している場合 に限り、前記全血サンプルに由来する赤血球が凝集を起こす、上記検定。 ３１．全血中にアレルゲン特異的ｌｇＭ抗体を検出するための検定であって、 （ａ）前記血液サンプルが採取された種のｌｇＭに特異的である、ｌｇＭ分子の ひとつの部位のみと結合する能力を有する異種二重特異性を持つ抗−赤血球、抗 −ｌｇＭ抗体を供給し、 （ｂ）前記ｌｇＭ抗体と結合する多価アレルゲンを既知量供給し、 （ｃ）前記全血サンプルを前記の異種二重特異性を持つ抗体ならびに前記アレル ゲンと反応させることからなり、 これにより、前記アレルゲンを多価的に結合するｌｇＭ抗体が存在している場合 に限り、前記全血サンプルに由来する赤血球が凝集を起こす、上記検定。 ３２．凝集性粒子の少なくとも一部がサンプルに本来念まれている請求項１記載 の検定。 ３３．凝集性粒子の少なくとも一部がサンプルに添加される請求項１記載の検定 。 [Claims] 1. A direct agglutination assay for detecting in a sample a substance to be assayed having a non-repetitive first epitope and a non-repetitive second epitope, comprising: (a) non-repetitive nature of the agglutinable particles and the substance to be assayed; simultaneously binds to the epitope of (b) providing a portion of the sample, the first reagent, and the first agglutination reagent, the first and second primary agglutination reagents having the ability to Cohesive particles that can bind to reagents (c) forming a second mixture comprising another portion of the sample, said second reagent, and agglomerated particles capable of binding to said second reagent; and (d) forming a second mixture comprising said second reagent. mixing the first mixture and the second mixture to form a third mixture, where aggregation in said third mixture indicates the presence of the substance to be assayed in the sample. The above test shows that. 2. The assay according to claim 1, wherein said sample is whole blood. 3. 3. The assay of claim 2, wherein the first and second reagents include an agglutinating particle-binding molecule that is an anti-erythrocyte antibody or a specific binding fragment thereof. 4. The claim that the antibody is an anti-glycophorin antibody or a specific binding fragment thereof Test as stated in requirement 8. 5. The assay according to claim 1, wherein the agglomerated particles have the same origin as the sample. 6. 2. The assay according to claim 1, wherein the agglomerative particles have a different origin than the sample. 7. The sample may be whole blood, components separated from blood, urine, semen, saliva, spinal fluid, sheep A sample selected from the group consisting of water, ascites, pleural exudate, liquid, pus, and tissue extract. Test as described in requirement 1 or 5. 8. 7. The assay of claim 6, wherein the agglutinable particles are selected from the group consisting of latex, charcoal, kaolinite, bentonite, microbial cells, and red blood cells. 9. The first primary agglutination reagent is attached to an epitaxial layer on the agglutinable particles to which the second primary agglutination reagent binds. 2. The assay of claim 1, which binds to an epitope different from the tope. 10. A direct agglutination assay for detecting in a sample an assay target substance having a first binding site, the method comprising: (a) binding to a concentrated particle and an epitope of the assay target substance; (b) capable of binding to a portion of a sample, said first reagent, and said first reagent; cohesive grains (c) providing a second primary agglutination reagent capable of binding to the agglutinable particles and the second epitope; (d) another portion of the sample; forming a second mixture consisting of the second reagent, cohesive particles that bind to the second reagent, and the second epitope that can bind to the second reagent; (e) mixing the first mixture and the second mixture; to form a third mixture, where aggregation in said third mixture indicates the presence of the analyte in the sample. The above test shows that. 11. 11. The assay according to claim 10, wherein the sample is whole blood. 12. Claim 1 or 2, wherein the first reagent and the second reagent have the same aggregating particle-binding molecule. Or the test described in 10. 13. 11. The assay according to claim 1, wherein the first reagent and the second reagent have different aggregating particle binding molecules. 14. The epitope of the substance to be assayed and the primary reagent bind to the substance to be assayed. each epitope specific for an epitope selected from the group consisting of epitopes generated when A procedure for reacting a bispecific secondary agglutination reagent having different binding sites with a third mixture. The assay according to claim 1, further comprising: 15. The epitope of the substance to be assayed and the primary reagent bind to the substance to be assayed. each epitope specific for an epitope selected from the group consisting of epitopes generated when 6. The assay of claim 5, further comprising reacting the third mixture with a bispecific secondary male clotting reagent having different binding sites. 16. 11. The assay according to claim 10, wherein the agglomerated particles have the same origin as the sample. 17. The assay according to claim 10, wherein the aggregated fine particles have a different origin from the sample. 18. Claim 10 or 16, wherein the sample is selected from the group consisting of whole blood, components separated from blood, urine, semen, saliva, cerebrospinal fluid, amniotic fluid, ascites, pleural exudate, fluid, pus, and tissue extract. Tests listed. 19. Cohesive molecules can be used in latex, charcoal, kaolinite, pentonite, and microorganisms. 18. The assay of claim 17, wherein the assay is selected from the group consisting of red blood cells and red blood cells. 20. The first primary aggregation reagent binds to the second primary agglutination reagent on the agglomerated fine particles. 2. The assay of claim 1, which binds to an epitope different from the pitope. 21. A two-site direct detection method for simultaneously detecting the presence of two different analytes, a first and a second, each containing one or more analyte-binding sites, in a sample. agglutination assay, comprising: (a) supplying a first primary agglutination reagent capable of simultaneously binding to agglutinable particles and the first substance to be assayed; supplying a second primary agglutination reagent that has the ability to simultaneously bind to an epitope and the second assay target substance; Already inside (d) forming a first mixture consisting of a portion of the sample, said first agglutination reagent, and agglutinable particles capable of binding; (e) forming a second mixture consisting of another portion of the sample, a second primary agglutination reagent, and the agglutinable particles capable of binding; Obtain a complex of the substance to be assayed: second reagent: particle, (f) having the ability to simultaneously bind to the first complex and the second complex, and having the ability to simultaneously bind to the epitope inherent in the substance to be assayed or the substance to be assayed; Binding of the primary agglutination reagent to a secondary agglutination reagent that has specificity for one of the epitopes formed by the binding but does not have the ability to bind to the two complexes of the target substance in the same assay ( g) forming a third mixture consisting of the first mixture, the second mixture, and the secondary agglutination reagent; wherein said aggregation in said third mixture indicates that said first assay target substance and said second assay target substance are simultaneously present in the sample. 22. A direct agglutination assay for detecting in a sample a substance to be assayed having a non-repetitive first epitope and a non-repetitive second epitope, comprising: (a) non-repetitive nature of the agglutinable particles and the substance to be assayed; Ability to bind to epitopes simultaneously (b) a portion of the sample, the first reagent, and cohesive particles capable of binding with the first reagent; (c) providing a primary agglutination agent comprising a complex of a second primary agglutination reagent and an agglutinable molecule, said second primary agglutination reagent comprising a non-repeat mixture of said substance to be assayed; (d) the first mixture, the flocculant, and the first forming a second mixture of agglomerated particles capable of binding with a reagent, wherein aggregation in the second mixture indicates the presence of the analyte in the sample. 28. direct coagulation for detecting analytes in a sample that have a first binding site; (a) a first primary aggregate having the ability to bind to an epitope of the aggregating particle and the substance to be assayed, and to form a second epitope when bound to the epitope of the substance to be assayed; (b) a portion of the sample, the first reagent, and cohesive particles capable of binding with the first reagent; (c) providing a primary aggregating agent comprising a complex of a second primary aggregating reagent and an agglutinable particle, said second primary aggregating reagent binding to said second epitope; (d) mixing said first mixture and said flocculant to form a second mixture, where flocculation in the second mixture indicates the presence of the analyte in the sample; The above test shows . 24. The cohesive particles of the primary flocculant are mixed with latex, charcoal, kaolinite, bentonite 24. The assay according to claim 22 or 23, wherein the assay is selected from the group consisting of red blood cells, symptomatic cells, and red blood cells. 25. 24. The sample is selected from the group consisting of blood, components separated from blood, urine, semen, saliva, cerebrospinal fluid, amniotic fluid, ascites, pleural exudate, fluid, pus, and tissue extract. Test of. 26. first and second two, each having one or more assay target substance-binding sites; A two-site direct agglutination assay for simultaneously detecting different substances to be assayed in a sample, the method comprising: (a) a first primary particle having the ability to simultaneously bind to aggregating particles and the first substance to be assayed; (b) providing an agglutinating particle that binds to said first primary agglutinating reagent, if such particles are not already present in the sample; part, the first agglutination reagent, and a first mixture with bindable agglutinable particles. (d) supplying a second primary aggregation agent consisting of a complex of a first agglutination reagent and particles; primary condensation (e) the collecting reagent has the ability to bind to the second assay target substance to form a second complex; (e) has the ability to simultaneously bind to the first complex and the second complex; versus The binding of the primary agglutination reagent to the epitope inherent in the target substance or the target substance to be assayed. (f) providing a secondary agglutination reagent that has specificity for the epitope formed by the reaction, but does not have the ability to bind to two complexes of the same substance to be assayed; form a second mixture consisting of a secondary agglutination agent, and a secondary agglutination reagent. wherein aggregation in the second mixture indicates that the first analyte and the second analyte are simultaneously present in the sample. 27. first and second two, each having one or more assay target substance-binding sites; A two-site direct agglutination assay for simultaneously detecting different assay target substances in a sample, the method comprising: (a) supplying a first primary agglutination agent comprising a complex of a first primary agglutination reagent and particles; the first primary agglutination reagent has the ability to bind to the first assay target substance to form a first complex; (b) the second primary agglutination reagent is composed of a complex of the second primary agglutination reagent and particles; the second primary agglutination reagent has the ability to bind to a second assay target substance to form a second complex; with the ability to simultaneously bind the said assay pair. binding of the primary reagent to the epitope inherent in the target substance or the target substance to be assayed. (f) providing a secondary agglutination reagent that has specificity for the evitope thus formed but does not have the ability to bind to two complexes of the same analyte; a first mixture consisting of a second primary agglutinant and a second agglutination reagent, wherein the agglutination in the first mixture is caused by the formation of the first substance to be assayed and the second substance to be assayed. The above test shows that the qualities are simultaneously present in the sample. 28. Three different analytes each with one or more analyte binding sites a two-site direct agglutination assay for simultaneously detecting a substance in a sample, the method comprising: (a) providing a first primary agglutination reagent capable of simultaneously binding to a first aggregating particle and a first analyte; (b) supplying a second primary agglutination reagent having the ability to simultaneously bind to the second agglutinating particles and the second assay target substance; (c) combining the first and second primary agglutination reagents; (d) providing a first and second agglutinable particles capable of binding with the respective reagents, if no agglutinable particles to be combined are already present in the sample; A primary agglutinating reagent, and a first agglutinating particle. A mixture of a first substance to be assayed, a first primary agglutination reagent, and a first particle is formed. (e) another portion of the sample, said second primary agglutination reagent, and a second agglutinable particle; forming a second mixture consisting of a second substance to be assayed: a second primary agglutination reagent: a second particle; (f) simultaneously binding to the first complex and a third substance to be assayed; (g) supplying a first secondary agglutination reagent having the ability to bind to the second complex and a third substance to be assayed simultaneously; and forming a third mixture consisting of the second mixture and the first and second secondary agglutination reagents, where the agglutination in the third mixture is the first, second and third assay target. The above assay indicates that the substances are simultaneously present in the sample. 29. A large number of different analytes, each having one or more analyte binding sites a two-site direct agglutination assay for simultaneously detecting a substance in a sample, the method comprising: (a) providing a first primary agglutination reagent capable of simultaneously binding to a first aggregating particle and a first analyte; (h) supplying a second primary agglutination reagent having the ability to bind to the second aggregating particles and the second assay target substance in a retentive manner; (d) providing a first and second agglutinable particles capable of binding with the respective reagents, if no agglutinable particles to be combined are already present in the sample; A primary agglutinating reagent, and a first agglutinating particle. A mixture of a first substance to be assayed, a first primary agglutination reagent, and a first particle is formed. (e) another portion of the sample, said second primary agglutination reagent, and a second agglutinating molecule; forming a second mixture consisting of a second substance to be assayed: a second primary agglutination reagent: a second particle; (f) simultaneously binding to the first complex and a third substance to be assayed; (g) supplying a second secondary agglutination reagent having the ability to simultaneously bind to the second complex and the fourth assay target substance; has the ability to bind to the target substance and the first additional test target substance. and a second tertiary agglutination reagent having the ability to bind to the fourth assay target substance and the second additional assay target substance. The (n+1)th tertiary agglutination assay that has the ability to simultaneously bind to the target substance supplying a drug (n is an integer of 2 or more); (h) forming a third mixture consisting of the first mixture, the second mixture, the first and second aggregating particles, and the (n+1)th tertiary agglutinating reagent; wherein aggregation in the third mixture indicates that a number of different assay substances are simultaneously present in the sample. 30. An assay for detecting allergen-specific IgE antibodies in whole blood, the assay comprising: (a) determining the ability of the whole blood to bind to only one site on the IgE molecule that is specific for IgE of the species from which it was collected; (b) providing a known amount of a polyvalent allergen that binds to the IgE antibody; (c) treating the whole blood sample with the Antibodies with heavy specificity and the alleles said allergen, thereby causing red blood cells from said whole blood sample to agglutinate only in the presence of an IgE antibody that multivalently binds said allergen. 31. An assay for detecting allergen-specific IgM antibodies in whole blood, comprising: (a) determining the ability to bind to only one site on an IgM molecule that is specific for IgM of the species from which said blood sample was taken; (b) providing a known amount of a multivalent allergen that binds to the IgM antibody; (c) treating the whole blood sample with the Antibodies with heavy specificity and the alleles said allergen, thereby causing red blood cells from said whole blood sample to agglutinate only in the presence of an IgM antibody that multivalently binds said allergen. 32. 2. The assay of claim 1, wherein at least a portion of the cohesive particles are present in the sample. 33. 2. The assay of claim 1, wherein at least a portion of the cohesive particles are added to the sample.
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