JPH05501267A - Sm―D抗原ペプチド、及び、特に全身性エリテマトーデスを診断するための該ペプチドの使用 - Google Patents
Sm―D抗原ペプチド、及び、特に全身性エリテマトーデスを診断するための該ペプチドの使用Info
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- JPH05501267A JPH05501267A JP3510553A JP51055391A JPH05501267A JP H05501267 A JPH05501267 A JP H05501267A JP 3510553 A JP3510553 A JP 3510553A JP 51055391 A JP51055391 A JP 51055391A JP H05501267 A JPH05501267 A JP H05501267A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
Sm−D抗原ペプチド、及び、特に全身性エリテマトーデスを診断するための該
ペプチドの使用
本発明の目的は、生物体液中、特に全身性エリテマトーデス(SLE)に罹患し
たヒトまたは動物の血清中に存在する抗体によって認識され得るペプチドを提供
することである。
本発明の目的はまた、これらのペプチド及びペプチド含有組成物をヒトSLEの
in vitro診断に使用すること、並びに、診断用セット即ち「キットJを
構成するために使用することである。
本発明の目的は更に、これらのペプチドを、上記疾患に対する免疫原性組成物及
びワクチン組成物を調製するために使用することである。
本発明の目的は最後に、免疫原性であるかまたは免疫原性にされたこれらのペプ
チドによってfn vfvoで誘発され得る抗体を提供すること、これらの抗体
及び抗体含有組成物をヒトSLE患者のin vitro診断に使用すること、
並びに、この疾患に対する医薬を調製することである。
細胞構成成分に対する自己抗体の存在は、全身性エリテマトーデス(SLE)、
強皮症(Sclン、多発性筋炎及び結合組織病(MTCD)のような自己免疫疾
患の一般的特徴である(Morrow et Isenberg、、1987;
T a n他、1988)、これらの患者で同定された多数のタイプの自己抗体
のうちで、Sm抗原と反応する自己抗体は、SLE患者の20〜30%に存在す
るが、その他の全身性自己免疫結合組織病の患者にはめったに存在しないので、
極めて有効なマーカーである。
SmvL原はRNPと呼ばれる特定クラスのリボ核タンパク質に結合する。これ
らのリボ核タンパク質はUl、U2、U4、U5及びU6(Lerner et
5teitz。
1979;Brunet他、1985)と命名された5種類のウリジンに富むR
NAを含有し、各RNA中で7つのタンパク質が同定された。これらのタンパク
質は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動移動度に従って、バンドB′(29Kd
)、バンドB(28Kd)、バンドD(16Kd)、バンドD’ (15,5K
d)、バンドE(12Kd)、バンドF(11Kd)及びバンドG(9Kd)と
命名された。共通様を形成するこれらのタンパク質以外に、Ul−RNA粒子は
、3つの非反復ポリペプチド70Kd、34Kd(A)、22Kd(C)を含有
し、U2−RNP種は、2つの非反復ポリペプチドA′(33Kd)、B″(2
8,5Kd)を含有している。抗RNP抗体または抗U1−RNP抗体は、粒子
U1の構成成分だけを沈殿させ、抗Sm抗体は、粒子U1、U2、U4、U5及
びU6と反応する。
更に、イムノプロット(Immunob 1ot)試験によれば、抗U1−RN
P抗体は、ポリペプチドA、C及び70Kdと反応し、抗Sm抗体は、ポリペプ
チドB′、B及びDと反応することが判明した。抗Sm抗体は更に、ときにはバ
ンドE、F及びGも認識する(Petters−son他、1984;Re1c
hlin et Harley、1987;Hoch、1989;Combe他
。
1989)。
リボ核タンパク質の複数のポリペプチドの配列決定は、組換えDNA法で行なわ
れた(Theissen他。
1986 ;Habets他、1987;5tanford他、1987;Si
l Iekens他、1987,1989;Yamamoto他、1988;
Rokeach他。
1989)、欧州特許出願第295719号は、Sm−D抗原をコードするDN
Aのクローニングを記載している(Rokeach他、1988);この遺伝子
は、複数の塩基性領域を含む119個のアミノ酸から成るポリペプチドをコード
している。上記文献の著者達は、C−末端に局在し9回反復しているグリシン−
アルギニン単位がSm−D抗原の抗原決定基を構成すると考えている。単離DN
Aから推定されたこの配列は、これまでに配列決定された別のポリペプチドとの
類似性をほとんど有していない。
欧州特許出願第295719号は更に、クローニングされたSm−D抗原を使用
したSLEの検出方法を記載している。
出願人は、119個のアミノ酸を含むSm−Dポリペプチドの配列に関して研究
し、このSm−Dポリペプチドから選択されたいくつかのペプチド配列がSLH
の検出に特に重要であることを確信した。出願人は、Sm−Dポリペプチドに由
来のいくつかのペプチドが、SLE患者に存在する抗体によって完全に特異的に
認識されることに注目した。これらのペプチドはSLE以外の自己免疫疾患の患
者に存在する抗体によって認識されない。
このような観察は、上記のごときペプチドがSLEのin vitro診断に有
用であることを示す。
図1は、Sm−Dポリペプチドのペプチド配列を示す。
アミノ酸と文字コードとは以下のごとく対応する。
D アスパラギン酸
E グルタミン酸
■ バリン
W トリプトファン
本発明は、全身性エリテマトーデス患者の生物学的サンプル中に存在するSm−
Dポリペプチドに対する抗体と反応し得る15〜40個のアミノ酸から成るペプ
チドに関する。これらのペプチドは、Sm−Dポリペプチドの配列の一部に対応
するかまたはその変異配列に対応する。
本発明の好ましいペプチドは、式:
%式%(1)
([[)
で示される配列のうちの1つの配列の全部もしくは一部から構成されるか、また
は、その変異配列から構成される装置
上記の式中、
一基Xは、遊離NH2基、または炭素原子数1〜5の1つもしくは2つのアルキ
ル基でアミド化されたNH2基を示すか、または、1〜5個のアミノ酸から成り
N末端アミノ酸自体が遊離NH2基もしくは上記のアミド化N H、基を有して
いるペプチド基を示しており、
−基Zは、遊離OH基、または炭素原子数1〜5のアルキル基を含むアルコキシ
ル基を示すか、または、1〜5個のアミノ酸から成りC末端アミノ酸が遊離OH
基もしくは上記のアルコキシル基を有しているペプチド基を示す。
X及び/またはZが1〜5個のアミノ酸から成るペプチド基を示している場合に
は、これらのペプチド基は、該ペプチド基が除去された後のペプチドの免疫特性
、場合によっては免疫原性を本質的に変化させず、むしろ増進させ得るものであ
る。
本発明の好ましいペプチドは、式(1)、(n)、(I[[)、(IV)、(V
)、(VT)及び(■)で示される配列において、式中のXがNH,基を示し2
がOH基を示すペプチドであるか、または、X及びZの各々が、ペプチドの免疫
特性を本質的に変化させずむしろ増進させるような1〜5個のアミノ酸から成る
基を示すペプチドである。
式中のXが遊離NH2基でありZが遊離OH基である式(1)のペプチドIは、
図1に示すSm−Dポリペプチドの残基1〜20に対応する。
Zが1〜5個のアミノ酸がら成る基を示す式(1)に対応する好ましいペプチド
は、図1のSm−DポリペプチドのC末端が対応する1〜5個のアミノ酸によっ
て延長されたペプチド■である。従ってZは、1〜5個のアミノ酸を含む基N、
NG、NGT、NGTQ、NGTQVがら成るグループから選択されるのが有利
である。
式中のXが遊離NH,基でありZが遊離OH基である式(n)のペプチド■は、
図1に示すSm−Dポリペプチドの残基17〜35に対応する。
X及びZの各々が1〜5個のアミノ酸から成る基を示す式(II)に対応する好
ましいペプチドは、図1のSm−Dポリペプチドの両側が対応する1〜5個のア
ミノ酸によって延長されたペプチド■である。従ってXは、1〜5個のアミノ酸
を含む基T、VT、TVT、ETVT、HETVTから成るグループから選択さ
れるのが有利であり、Zは、1〜5個のアミノ酸を含む基M、MN、MNT、M
NTH,MNTHLから成るグループから選択されるのが有利である。
式中のXが遊MNH2基でありZが遊@OH基である式(III>のペプチド■
は、図1に示すSm−Dポリペプチドの残基33〜51に対応する。
X及びZの各々が1〜5個のアミノ酸を含む基を示す式(III)に対応する好
ましいペプチドは、図1のSm−Dポリペプチドの両側が対応する1〜5個のア
ミノ酸によって延長されたペプチド■である。従ってXは、1〜5個のアミノ酸
を含む基■、GV、TGV、ITGV、TITGVから成るグループから選択さ
れるのが有利であり、Zは、1〜5個のアミノ酸を含む基P、PV、PVQ、P
VQL、PVQLEから成るグループから選択されるのが有利である。
式中のXが遊離NH2基であり2が遊離OH基である式(■)のペプチド■は、
図1に示すSm−Dポリペプチドの残基44〜67に対応する。
X及びZの各々が1〜5個のアミノ酸から成る基を示す式(IV)に対応する好
ましいペプチドは、図1の5rn−Dポリペプチドの両側が対応する1〜5個の
アミノ酸によって延長されたペプチド■である。従って、Xは、1〜5個のアミ
ノ酸を含む基■、AV、KAV、LKAV、HLKAVから成るグループから選
択されるのが有利であり、Zは、1〜5個のアミノ酸を含む基F、FI、FIL
、FILP、FILPDから成るグループから選択されるのが有利である。
式中のXが遊離NH2基でありZが遊離OH基である式(V)のペプチドVは、
図1に示すSm−Dポリペプチドの残基64〜84に対応する。
X及びZが1〜5個のアミノ酸から成る基を示す式(V)に対応する好ましいペ
プチドは、図1のSm−Dポリペプチドの両側が対応する1へ5個のアミノ酸に
よって延長されたペプチド■である。従ってXは、1〜5個のアミノ酸を含む基
N、GN、RGN、IRGN、5IRGNから成るグループから選択されるのが
有利であり、Zは、1〜5個(7)7ミ/酸を含む基P、PK、PKV、PKV
K、PKVKSから成るグループから選択されるのが有利である。
式中のXが遊離NH,基でありZが遊離OH基である式(W)のペプチド■は、
図1に示すSm−Dポリペプチドの残基77〜96に対応する。
X及びZの各々が1〜5個のアミノ酸から成る基を示す式(Vl)に対応する好
ましいペプチドは、図1のSm−Dポリペプチドの両側が対応する1〜5個のア
ミノ酸によって延長されたペプチド■である。従ってXは、1〜5個のアミノ酸
を含む基り、PL、LPL、5LPL、DSLPLから成るグループから選択さ
れるのが有利であり、Zは、1〜5個のアミノ酸を含む基G、GR,GRG、G
RGR,GRGRGから成るグループがら選択されるのが有利である。
式中のXが遊離NH,基でありZが遊離OH基である式(■)のべ7チド■は、
図1に示すSm−Dポリペプチドの残基97〜119に対応する。
Xが1〜5個のアミノ酸から成る基を示す式(■)に対応する好ましいペプチド
は、図1のSm−DポリペプチドのN末端が対応する1〜5個のアミノ酸によっ
て延長されたペプチド■である。従ってXは、1〜5個のアミノ酸を含む基A、
VA、AVA、EAVA、REAVAから成るグループから選択されるのが有利
である。
変異配列なる用語は、1つまたは複数のアミノ酸の挿入及び/または欠失及び/
またはzmによって修飾された前記ペプチド配列であってその抗原性または免疫
原性が変性していない配列を意味する。特に、前記ペプチド配列の一部分から成
り、Sm−Dポリペプチドと反応する抗体に対する免疫特性、この場合免疫原性
を保持しているような短縮された配列を使用することも可能である。
変異配列なる用語はまた、ペプチド結合(−C〇−NH−)が、構造−C〇−N
(CH、L−1−CF(2−CH2−1−C○−CH2−によって置換された
配列、またはペプチド骨格が基−CH2−1−NH−1−0−のような1つまた
は複数の挿入基を有する配列を意味する。また、不斉炭素を有するD形またはL
形のアミノ酸を含むペプチドも本発明に包含される。
本発明はまた、本発明のペプチドと、生理学的に許容される無毒性の任意の担体
分子との結合によって得られた結合体を提供する。担体分子の例としては、破傷
風アナトキシン、アルブミンまたは血清アルブミンなどの天然タンパク質がある
。
本発明のペプチドは抗原性を有しており、従って、SLE患者の判定または追跡
のための詮所方法で使用され得る。
従って本発明はまた、前記ペプチド、前記ペプチドの混合物、または担体分子に
結合した前記ペプチドを含有しており、SLE患者の血清またはその他の生物体
液中に存在する自己抗体によって認識され得る組成物に関する。ペプチド−抗体
複合体をin vitro検出するためには、ELIZAのような免疫酵素法、
免疫蛍光法、ラジオイムノアッセイ、放射免疫沈降法、またはイムノトランスフ
ァー(イムノプロットまたはドツトプロット)法などで試験する。
これらの試験を行なうために、本発明は、ビオチンまたはその誘導体、ペルオキ
シダーゼのような酵素、フルオレセインのような蛍光ラベル、放射性ラベル、な
どの適当なラベルによって標識されているかまたは非標識の寒冷ペプチドを提供
する。
かかる試験は例えば以下の段階を含む。
一本発明のペプチドもしくはペプチド結合体を含有する所定量の組成物をマイク
ロタイタープレートのウェルに入れるか、または、ニトロセルロースビーズもし
くはニトロセルロース膜のような別の担体に付着させる、−被検生物体液をウェ
ルに入れるか、または、飽和剤の存在中もしくは活性化した担体を予め飽和した
後で被検生物体液をビーズもしくは膜と共にインキュベートする、−マイクロタ
イタープレートまたはビーズのインキュベーション及び洗浄後に、形成されたペ
プチド−抗体複合体の有無を検出する系をウェルに付着させるかまたはビーズと
共にインキュベートする。
この種の試験の別の実施態様では、一方でSLE患者の血清中に存在する抗体を
認識し他方で別の自己免疫疾患に罹患した患者の血清中に存在する抗体を認識す
るペプチド混合物を使用する。
本発明は更に、本発明のべ1チドに対して形成された抗体を提供する。ポリクロ
ーナル抗体またはモノクローナル抗体から成り得るこの抗体は、抗原によってi
n vitrO活性化された膵臓細胞または本発明のペプチドの1つに対して免
疫された動物に由来の膵臓細胞とミエローマ細胞系の細胞とを従来の方法で細胞
融合させて調製した任意のハイブリドーマから産生される。
本発明のペプチドはSLE患者の抗体に対して特異性を有しているので、これら
のペプチドから調製された抗体はまた、SLEのSm−D抗原の極めて特異的な
プローブを構成する。
更に、本発明のペプチド及び該ペプチドと反応する患者の自己抗体に対して形成
された抗体は、アフイニテイクロマトグラフィーで処理した後に、初期抗原性ペ
プチドの正確なコピーを部分的に構成しており、従ってSLE患者で観察される
自己抗体に結合し得る抗イデイオタイプ抗体を調製するために使用され得る。
従って本発明によれば、これらの抗イデイオタイプ抗体及び該イディオタイプ抗
体含有組成物が提供され、SLEで観察される自己抗体の存在を検出するための
ヒトの1nvitro診断方法で使用される。
最後に本発明は、任意に担体分子に結合した少なくとも1つの本発明のペプチド
または本発明の抗イデイオタイプ抗体を活性成分として含み、該ペプチドに対す
る抗体の産生を誘発し、SLHの病理及び/または発病(mani−festa
tions cliniques)を抑制し得るワクチンの製造に関する。ワク
チンとして使用される本発明の医薬組成物は、本発明のペプチドを10μg /
K g〜100mg/Kgの範囲の用量で投与し得る注射またはその他の経路
で投与可能な溶液または懸濁液から成る。
実施例に関する以下の記載及び添付図面を参照することによって本発明のその他
の特徴及び利点が明らかになるであろう、勿論、本発明の範囲がこれらの実施例
に限定されないことは理解されよう。
11L
ペプードのム び ヤークタリゼーション本発明のペプチドは、従来の固相ペプ
チド合成法によって、例えば、アミノ酸残基を所要順序で順次縮合させるか、複
数のアミノ酸残基を適正順序で既に含むように予め形成したフラグメントにアミ
ノ酸残基を縮合させるか、または、予め調製した複数のフラグメントを縮合させ
ることによって調製され得る。いずれの場合にも、縮合の際に形成されるペプチ
ド結合に関与するアミン官能基及びカルボキシル官能基を除いて、その他のアミ
ノ酸残基またはフラグメントによって担持されたすべての反応性官能基を予め保
護するように配慮する。
本発明のペプチドの好ましい調製方法では、RAM樹脂を使用する。付加される
アミノ酸のアミン官能基はt−ブトキシカルボニル(B o c )基によって
保護されており、三官能アミノ酸の側鎧は例えば、グルタミン酸及びアスパラギ
ン酸ではシクロヘキシル基、トレオニン及びセリンではベンジル基、リシンでは
2−クロロベンジルオキシカルボニル基、チロシンでは2.6−ジクロロベンジ
ル基、アルギニン及びヒスチジンではp−トルエンスルホニル基によって保護さ
れている。メチオニンは、t−ブトキシカルボニル(○)スルホキシドメチオニ
ンの形態で導入され、無水フ・ン化水素酸の作用によって樹脂のペプチドが最終
的に開裂されるときにメチオニンに還元される。Bocアミノ酸は、対称無水物
の形態で導入されるBocヒスチジンを除1)で、ベンゾトリアゾールエステル
の形態で結合する。
結合に要する総時間は約45分である。必要な場合には二重結合から成り得る十
分な結合が得られたことを確認するためにニンヒドリンテストを使用する。
合成の終わりに、最終脱保護段階の後で、樹脂を洗浄し乾燥する。配列中の(○
)メチオニンの有無に応じて、樹脂のペプチドの脱保護及び開裂のためのフ・ン
化水素酸処理を強くしたり弱くしたりする。
凍結乾燥後に粗生成物を10%酢酸に溶解し、中圧クロマトグラフィーで精製す
る0次いで高圧液相クロマトグラフィーでペプチドを特性決定し、質量分析によ
ってそのアミノ酸組成を分析する。
!
無JじL吟1」1
U腓11
a−活動性全身性エリテマトーデス(SLE)に罹患した165人の患者を試験
し、強皮症(Scl)に罹患した32人の患者、混合結合組織病(MTCD)に
罹患した14人の患者、多発性筋炎に罹患した2人の患者、サルコイド症に罹患
した13人の患者、シエーグレン症候群に罹患した5人の患者、慢性関節リウマ
チ(RA>に罹患した35人の患者及び若年性慢性関節炎(JCA)に罹患した
86人の患者に比較した。
b−53の健常供血者血清を対照として使用した。
C−また、イムノプロットでSmvc原のバンドを認識する18のヒト血清及び
5つのマウスモノクローナル抗体も使用した。これらの5つの抗体は夫々、バン
ドB′、B及びDと反応するクローンH126(Reuter etLuehr
mannの記載;1986)、及び、ノくンドB′、B、D及びEと反応するク
ローンY12(Petters−son他の記載、1984)、及び、バンドB
1及びBと反応するクローンH57(R,Luehrmannの記載)、及び、
ポリペプチドDと結合するクローン2−73(抗UI RNP)及び7−13(
抗Sm)(B i l l i ngs他の記載、1982及び1985)に由
来のものである。
d〜ペプチド1.n、m、■、■、■及び■を実施例1に記載の方法で合成した
。これらのペプチドの純度は85%ペプチドI、■、■、■、■、■及び■と種
々の血清の抗体との間の免疫反応をEL I SAによって以下の手順で測定し
た。
−pH9,6の0.05Mの炭酸塩バッファ溶液に希釈した1〜2μMの各ペプ
チドを、温度37℃でマイクロタイタープレートのウェルに入れる。0.05%
のTween20を含有するpH7,4のPBSバッファ中に10mg/mlの
ウシ血清アルブミン(BSA)を含む溶液(P B 5−T−BSA)と共に、
プレートを37℃で1時間インキュベートする、
−PBS−Tバッファで3回洗浄後、PBS−T−BSAバッファで1/100
0に希釈した患者の血清をウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートする
、−複数回洗浄後、ヒトIgG特異的ビオチン結合体と共に37℃で1時間のイ
ンキュベーション、次いでペルオキシダーゼ標識したストレプトアビジン結合体
と共に同じく37°Cで1時間のインキュベーションを順次行なって反応を検出
する。
酵素反応の検出は、2,2′−アジノビス(3−エチルベンズチアゾリンスルホ
ネート)(A B ”r S )のごときペルオキシダーゼの基質を37℃で1
時間添加することによって行なう6分光光度計によって405nmの光学密度(
OD)の値を測定する。また、血清のインキュベーション後に、ペルオキシダー
ゼ標識した抗ヒトIgG結合体を添加しく37℃で30分間)、次いで基質(T
MB、3.3′、5’テトラメチルベンジジン)を37℃で15分間添加するこ
とによって1段階で検出してもよい、2MのHCIを添加して反応を阻害し、4
50nmのODを読取る。
試験の陽性閾値を決定するために、53の健常ヒト血清から成る1組のサンプル
を1/1000に希釈し、マイクロタイタープレートのウェルに入れた1μM及
び2μMのペプチド■及び■と共に試験した。405nmの平均吸光度は0.1
0で標準偏差は0.084である。血清のOD値が平均と標準偏差の2倍との和
を上回るとき、即ちODが0.3のとき、血清が陽性であると判定することにす
る。
この閾値を使用すると、健常ヒト血清の1.8%が2つのペプチドについて陽性
であることが判明した(図2)、○D平均債と標準偏差の5倍との和を閾値にと
ると、試験は完全にSLE特異的になる。
3 イムノプロットでバンドDを蛍−る18の、 Δに1
これらの血清のうちの12サンプル、即ち67%はペプチド1と反応しくODが
0.30〜0.81.0D平均値0.47及び標準偏差値0.15)、16サン
プル即ち89%がペプチド■と反応しくODが0.30〜1.20.0D平均値
0.57及び標準偏差値0.25>、6サンプル即ち33%がペプチド■と反応
した(ODが0.30〜0.73;OD平均値0.46及び標準偏差値0.16
)。
ペプチドI及び/またはペプチド■と反応したすべての血清はまた、ペプチド■
とも反応した。これらの血清はいずれもペプチド■、■、■及び■と反応しなか
った。
従って、イムノプロットでバンドDと反応する血清の多くは、ペプチド■だけと
反応させるELISAによって同定される。
更に、イムノプロットでSmvL原のいくつかのバンドと反応するマウスの5つ
のモノクローナル抗体をペプチドI、■、■、■、V、W及び■で試験した。
クローン2−73及び7−13の抗体はELISAでペプチド■と反応した。そ
の他の3つの抗体は7つのペプチドのいずれとも反応しなかった。
4 SLE患 び の のりウマ 生 の ゛の165人のSLE患者のうちの
59%が、ペプチドIと反応し得る抗体<OD値0.30〜1.67 ; OD
平均MO,77)を有し、37%がペプチド■と反応し得る抗体(OD値0.3
0〜0.58.0D平均値0.58)を有し。
165の試験血清以外の2つの血清がペプチド■と反応し、どの血清もペプチド
■、■、■及び■と反応しなかった(図2、表I)。
ペプチドI及び■は、SLE以外のリウマチ性疾患に罹患した患者の血清の抗体
によって認識されることはめったにない、RA患者の血清の6%が、ペプチドI
(OD値0.30〜0.39)及びl’V(OD値0.30〜0.41)の1つ
と反応した。強皮症患者の血清は、6%だけがペプチド■と反応しくOD値0.
30〜0.36)、ペプチド■とは全く反応しなかった。
ペプチド■及び■に関する結果を以下の表■に示す。患者の血清を1/1000
に希釈し、マイクロタイタープレートに吸着させた1μMのペプチド■及び2μ
Mのペプチド■と接触させた。数値は、試験血清総数に対する陽性血清のパーセ
ンテージを示す、酵素に結合したヒト抗IgGを該酵素の基質と共に1暗闇イン
キュベートした後のOD値が0.3以上のときくこれは53の健常ヒト血清の○
D平均値と標準偏差の2倍との和に対応する)、血清が陽性であると判定する。
m
LULL mJLIL<1Δつ江L SzJ」LLSLE 165 58.8%
37.0%強皮症 32 6.3 0
混合結合組織病 14 0 0
多発性筋炎 2 0 0
サルコイド症 13 0 0
シ工−グレン症候群 50 0
慢性間節リウマチ 35 5.7 5.7若年性慢性関節炎 86 1.2 1
.2健常者 53 1.8 1.8
添付の図2はこれらの結果を別の表し方で示している。
ELISAにおいてペプチド■に陽性を示す全部の血清がペプチドIに対しても
陽性であるから、ペプチドIを使用するELISAによって全身性エリテマトー
デス患者の約60%を同定し得る。添付の図3は、SLE患者の血清中に存在す
る自己抗体とペプチドI及び■との結合を示す。
支I漣1
ウ ″られる ′の= J び0
1 ′の= 1
ペプチドI、■、■、■、■、■及び■に対する抗血清がウサギで得られる。フ
ロインドアジュバントを存在させた生理食塩水溶液(V/V)に入れた形層で毎
回100μgのペプチドをウサギに注射する。ペプチドあたり2羽のウサギを使
用し、連続皮下注射を毎月2回ずつ4箇月投与する。
3回目の注射以後、各注射の1週間後にウサギの血液を定期的に採取し、血清抗
体レベルをELISAで測定する。
じユL直
ウサギ抗体と7つのペプチドとの結合を前記と同様の方法(実施例2の第2項参
照)と同様の方法によってELISAで測定する。但し、免疫反応を検出するた
めに、ヤギで調製しペルオキシダーゼに結合させたウサギ抗イムノグロブリンを
添加する。
更に、モノクローナル抗体を試験するために、ハイブリドーマの培養上清をPB
S−T−BSAバッファで1150に希釈し、ペプチドと接触させる0反応を検
出するために、ウサギで調製したマウス抗イムノグロブリン及びヤギで調製し前
記同様にペルオキシダーゼに結合させたウサギ抗イムノグロブリンを順次添加す
る。
Cユ1艮
ウサギに対する3回の注射後にペプチドI、II、■、■、■及び■に対する強
力な応答が得られる(115000及び1/10000に希釈した抗血清と共に
基質を60分間インキュベーションした後の405nmのOD値が2.0を上回
る)。
これらの結果は、ペプチド■、■、■及び■が患者の血清と反応できない原因(
前出の表■参照)が、ELrSAプレートにこれらのペプチドが吸着され難いか
らでないことを示す、ペプチド■だけに対してはウサギの応答がもう少し穏やか
である(1/250及び11500に希釈した抗血清と共に60分間インキュベ
ーションした後のOD値が2.0である)。このように抗血清がペプチド■に比
較的弱い反応性を示す原因は、このペプチドがELISAプレートに吸着され難
いからではない。何故なら、モノクローナル抗体2−73及び7−13はこのペ
プチドと強力に反応していた〈実施例2の第3項参照)。
え11先
SLE DNA とボリペブ ドDのペプチドに・ るのヨの に る0
また、ELISAで天然二重鎖DNAと反応する抗体の存在を決定するためにS
LE患者の血清を試験した。抗DNA抗体の存在とペプチド■または■と反応す
る抗体の存在との間にいかなる相関間係も証明できなかった。
東」lIj−
Sm−D の 1 の ゛
使用した方法では、タンパク質の一次構造の短いセグメントの親水性及び移動度
のごときいくつかのパラメータに基づくアルゴリズムを用いる(Van Reg
enmortel et Daney de Marcillac。
1988)。
得られた結果は意外にも、Sm−Dポリペプチドの残基1〜20にわたるペプチ
ドIがポリペプチドの決定エピトープを含むことを示さない。これらの結果を図
4に示す。
以下は前記の説明を補足する図面の説明である。
−図1は、cDNAによるSm−Dポリペプチドの推定配列を示す。
−72は、EL I SAにおけるペプチドI及び■の結合を示す、健常被験者
の53の血清(N HS )、全身性エリテマトーデス(SLE)患者の165
の血清、強皮症(Scl)患者の32の血清、侵性閏節リウマチ(RA)患者の
35の血清で抗IgG−ペプチドの活性を測定する。全部の血清を1/1000
に希釈し、基質を60分面前水分解した後の405nmの光学濃度(OD)単位
で抗体レベルを表す。
−図3は、全身性エリテマトーデス患者の6つの血清(1、n、s、m、r、s
)及び健常被験者の1つの血清(u)がEL r SAでペプチドr(グラフA
及びC)及びペプチド■(グラフB及びD)と結合した結果を示す、グラフA及
びBでは、血清を1/1000に希釈し、種々の濃度のペプチドIと接触させる
。グラフB及びDでは、種々の濃度の血清を夫々1μM及び2μMのペプチドr
及び■と接触させる。
−74は、以下のスクール、即ち、
A:Parkerff!!(1986)、B:Hopp et Woods(1
981)、C:Karplus et 5chultz(1985)のスケール
に夫々従って構築され!、23 m −Dポリペプチドの抗原性の予測70フイ
ルを示す、これらのスケールは、Van Regenmortel及びDane
y deMarc i I I ac(1988)によって標準化されたもので
ある。4番目の残基とn−3残基との間でグラフをトレースする。SLE患者の
抗体によって認識されるエピトープを太線で示す。
前記の実施例で報告された結果を総合すると、Sm−D抗原に由来のペプチドが
、SLHの極めて高感度の定量的診断試験を行なうために特に有用であることが
はっきりと判る。
得られた結果から判断すると、ペプチドIに関しては、SLE患者の59%がこ
のペプチドを認識するIgG型抗型全体している。他方、ELISAでペプチド
■と反応する割合は、別の自己免疫疾患に罹患した患者の血清の6%であり、健
常被験者の血清の4%未満である。従ってペプチドIは、任意にペプチド■と共
に使用されて、全身性エリテマトーデスの特に有効なプローブを構成する。
はぼ60%にあたるこのパーセンテージは、精製タンパク質に関してこれまでに
記載されていた値を上回っている。
下記の文紋1より彫通省中12引門さ怠たものである:c五Ln Prvgr、
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F 工 L P D S L P L D T 工 R81VDVEPKVK
SKKREAVA97 G RG RG RG RG RG RG RG R1
13G RG G P RR
L区田BE−1
F工GURE 3
L息ヨ■郵=A
八 基
要約
本発明は、全身性エリテマトーデス患者の生物サンプル中に存在するSm−Dポ
リペプチドに対する抗体と反応可能な15〜40個のアミノ酸を含むペプチドに
関する。これらのペプチドはSm−Dポリペプチドの配列の一部に対応する。本
発明は、全身性エリテマトーデスの診断及びワクチン製造に使用される。
国際調査報告
し
丁
す
!!i際調査報告
Claims (15)
- 1.全身性エリテマトーデス患者の生物サンプル中に存在するSm−Dポリペプ チドに対する抗体と反応可能な15〜40個のアミノ酸を含み、Sm−Dポリペ プチドの配列の一部に対応することを特徴とするペプチド。
- 2.式: 【配列があります】(I) 【配列があります】(II) 【配列があります】(III) 【配列があります】(IV) 【配列があります】(V) 【配列があります】(VI) 【配列があります】 (VII) 〔式中、 −基Xは、遊離NH2基、または炭素原子数1〜5の1つもしくは2つのアルキ ル基でアミド化されたNH2基を示すか、または、ペプチドの免疫特性を本質的 に変化させず、場合によっては増進させるような、1〜5個のアミノ酸から成り そのN末端アミノ酸自体が遊離NH2基もしくは上記のアミド化NH2基を有し ているペプチド基を示しており、 −基Zは、遊離OH基、または炭素原子数1〜5のアルキル基を含むアルコキシ ル基を示すか、または、ペプチドの免疫特性を本質的に変化させず、場合によっ ては増進させるような、1〜5個のアミノ酸から成りそのC末端アミノ酸が遊離 OH基もしくは上記のアルコキシル基を有しているペプチド基を示す〕で示され る配列のうちの1つの配列の全部もしくは一部から構成されるか、または、その 変異配列から構成されていることを特徴とする請求項1に記載のペプチド。
- 3.式: 【配列があります】(I) 〔式中、Xは遊離NH2基を示し、Zは、遊離OH基を示すか、または、ペプチ ドの免疫特性を本質的に変化させず場合によっては増進させるような、1〜5個 のアミノ酸を含む基N、NG、NGT、NGTQ、NGTQVから成るグループ から選択されたペプチド基を示す〕の配列の全部または一部またはその変異配列 から成ることを特徴とする請求項1または2に記載のペプチド。
- 4.式: 【配列があります】(II) 〔式中、Xは、遊離NH2基を示すか、または、ペプチドの免疫特性を本質的に 変化させず場合によっては増進させるような、1〜5個のアミノ酸を含む基T、 VT、TVT、ETVT、HETVTから成るグループから選択されたペプチド 基を示し、 Zは、遊離OH基を示すか、または、ペプチドの免疫特性を本質的に変化させず 場合によっては増進させるような、1〜5個のアミノ酸を含む基M、MN、MN T、MNTH、MNTHLから成るグループから選択されたペプチド基を示す〕 の配列の全部または一部またはその変異配列から成ることを特徴とする請求項1 または2に記載のペプチド。
- 5.式: 【配列があります】(III) 〔式中、Xは、遊離NH2基を示すか、または、ペプチドの免疫特性を本質的に 変化させず場合によっては増進させるような、1〜5個のアミノ酸を含む基V、 GV、TGV、ITGV、TITGVから成るグループから選択されたペプチド 基を示し、 Zは、遊離OH基を示すか、または、ペプチドの免疫特性を本質的に変化させず 場合によっては増進させるような、1〜5個のアミノ酸を含む基P、PV、PV Q、PVQL、PVQしEから成るグループから選択されたペプチド基を示す〕 の配列の全部または一部またはその変異配列から成ることを特徴とする請求項1 または2に記載のペプチド。
- 6.式: 【配列があります】 (IV) 〔式中、Xは、遊離NH2基を示すか、または、ペプチドの免疫特性を本質的に 変化させず場合によっては増進させるような、1〜5個のアミノ酸を含む基V、 AV、KAV、LKAV、HLKAVから成るグループから選択されたペプチド 基を示し、 Zは、遊離OH基を示すか、または、ペプチドの免疫特性を本質的に変化させず 場合によっては増進させるような、1〜5個のアミノ酸を含む基F、FI、FI L、FILP、FILPDから成るグループから選択されたペプチド基を示す〕 の配列の全部または一部またはその変異配列から成ることを特徴とする請求項1 または2に記載のペプチド。
- 7.式: 【配列があります】(V) 〔式中、Xは、遊離NH2基を示すか、または、ペプチドの免疫特性を本質的に 変化させず場合によっては増進させるような、1〜5個のアミノ酸を含む基N、 GN、RGN、IRGN、SIRGNから成るグループから選択されたペプチド 基を示し、 Zは、遊離OH基を示すか、または、ペプチドの免疫特性を本質的に変化させず 場合によっては増進させるような、1〜5個のアミノ酸を含む基P、PK、PK V、PKVK、PKVKSから成るグループから選択されたペプチド基を示す〕 の配列の全部または一部またはその変異配列から成ることを特徴とする請求項1 または2に記載のペプチド。
- 8.式: 【配列があります】(VI) 〔式中、Xは、遊離NH2基を示すか、または、ペプチドの免疫特性を本質的に 変化させず場合によっては増進させるような、1〜5個のアミノ酸を含む基L、 PL、LPL、SLPL、DSLPLから成るグループから選択されたペプチド 基を示し、 Zは、遊離OH基を示すか、または、ペプチドの免疫特性を本質的に変化させず 場合によっては増進させるような、1〜5個のアミノ酸を含む基G、GR、GR G、GRGR、GRGRGから成るグループから選択されたペプチド基を示す〕 の配列の全部または一部またはその変異配列から成ることを特徴とする請求項1 または2に記載のペプチド。
- 9.式: 【配列があります】 (VII) 〔式中、Zは遊離OH基を示し、Xは、遊離NH2基を示すか、または、ペプチ ドの免疫特性を本質的に変化させず場合によっては増進させるような、1〜5個 のアミノ酸を含む基A、VA、AVA、EAVA、REAVAから成るグループ から選択されたペプチド基を示す〕の配列の全部または一部またはその変異配列 から成ることを特徴とする請求項1または2に記載のペプチド。
- 10.請求項1から9のいずれか一項に記載の1つまたは複数のペプチドによっ て認識されることを特徴とするSm−D抗原に対する抗体。
- 11.全身性エリテマトーデス患者の生物体液、特に血清中に存在する自己抗体 を特異的に認識することを特徴とする請求項10に記載の抗体に対して形成され た抗イディオタイア抗体。
- 12.全身性エリテマトーデス患者の生物体液、特に血清中に存在する自己抗体 と免疫的に反応することを特徴とする請求項1から9のいずれか一項に記載のペ プチドを含有する抗原性組成物。
- 13.請求項1から9のいずれか一項に記載の少なくとも1つのペプチドまたは 該ペプチドと担体分子との結合体を含有し、Sm−D抗原を認識し得る抗体の産 生を誘発することを特徴とする免疫原性組成物。
- 14.生物体液中で全身性エリテマトーデスをin vitro診断するために 、 −該生物体液と、請求項1から9のいずれか一項に記載の少なくとも1つのペプ チドまたは該ペプチドと担体分子との結合体または請求項11に記載の抗イディ オタイプ抗体とを、免疫複合体の形成可能条件下に接触させる段階と、−前記生 物体液中の抗原−抗体免疫複合体または抗体−抗イディオタイプ抗体複合体の存 在を物理的または化学的方法によって検出する段階を少なくとも含むことを特徴 とする全身性エリテマトーデスのin vitro診断方法。
- 15.−請求項1から9のいずれか一項に記載の少なくとも1つのペプチド、ま たは該ペプチドと担体分子との結合体、または請求項11に記載の抗イディオタ イプ抗体と、−ペプチドまたは抗イディオタイプ抗体と生物サンプル中に存在し 得る自己抗体との間の免疫的反応に適した媒体を構成する試薬と、 −形成された免疫複合体を検出するための、1つまたは複数のペプチドまたは抗 イディオタイプ抗体と反応し得る任意に標識された1つまたは複数の試薬と、− 任意に、健常被験者の血清のような対照生物媒体とを含むことを特徴とする全身 性エリテマトーデスのinvitro診断用キット。
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