JPH05500311A - 細菌個体数を電気化学的に決定する方法 - Google Patents
細菌個体数を電気化学的に決定する方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
細菌個体数を電気化学的に決定する方法先行技術およびその制限
数十年間にわたって、細菌の個体数を決定するための様々な電気化学的方法が提
唱されてきた。基本的な方法は、発明者、エイチ・ピー・シルバーマン(H。
P、Silverman)およびノエイ・エム・ブレイク(J 、 M、B r
a k e )の、「電気化学的分析による微生物個体数、酵素活性および基
質濃度の決定方法(Method of Determining Micro
bial Populations、Enzyme Activities、a
nd 5ubstrate Concentrations by Elelc
trochemical Analysis)Jと称する米国特許第3,506
,544号明細書に開示されている。前記の特許第3.506.544号明細書
は、参考文献として本明細書中に記述される。
引用したノルバーマン/ブレイクの特許には、二段階の反応工程、すなわち、第
一に、細菌または酵素に触媒された酸化/還元反応が生じ、そして第二に、第一
の工程で生成された還元種(還元された形態、状態または物質)の電気化学的酸
化反応を行って、測定可能な電流を生じたことが記載されている。更に詳しく述
べると、細菌または酵素試料を、適当な基質および酸化/還元(レドックス)対
の酸化種双方を含む特別な水基材試薬と混合した。この試薬/試料混合物を、3
種類の電極システム、すなわち、電力電極、参照電極および電流測定用電極が入
っている容器に入れた。対照および測定用システムでは、(a)参照電極に関し
て選択された電位で測定用電極を維持し、(b)細菌または酵素の作用によって
生じた還元レドックス種をその更に高い元の酸化状態まで酸化させ、そして(C
)この電気化学反応から得られる電流を測定した。
酵素的活性化反応(第一の工程)は全流体量全体に生じるので、電気化学的反応
(第二の工程)は測定用電極の表面でのみ生じるが、酵素によって生じた還元種
の電気化学的反応による消耗は、還元種の濃度の増加と比較したところ無視でき
ると考えられた。したがって、還元種の濃度は連続的に増加し、電気化学的に生
じた電流は比例的に増加した。それはンルバーマン/′ブレイク法に対する「鍵
」であり、すなわち、それが決定された電気化学的に生じた電流の増加速度であ
った。重要な変化および問題を除き、この電流の増加速度は還元種の濃度の増加
速度に比例し、それが順に、酵素に触媒された反応の速度に比例し、そしてそれ
が元の試料中の細菌または酵素の濃度に比例した。
したがって、先行技術に示された電気化学的方法は、試料に関係した電流を測定
し、推定された関係、すなわち、
(但し、Kは校正定数(または比例定数)である)を用いることによって細菌個
体数の密度を計算することによって細菌濃度を決定することであった。先行技術
では、二〇Kが一定であると15.定したが、本出願人は、多くの場合、それは
実際的に一定ではないと考えた。
校正定数または比例定数が一定でないことに関する先行技術の主要な限界に加え
て、先行技術のシステムには他の重大な欠点があった。これらには下記がある。
すなわち、
(1)多数の細菌種はそれら自体が表面に付着する性質を有し、モして印加電位
を有する表面(電極上の場合)、特に、コロニーを作るのに好ましい部分に一様
に見出だされることがある。したがって、従来のシステムでは、細菌試料に直接
暴露された電極を各試験後に洗浄し且つ滅菌することが必要であった。これは時
間をa費し且つ費用を要する仕事であった。1回使用の使い捨て電極が開発され
たが、これらは非常に高価であり、試験費用を法外なものにした。更にもっと厄
介なことは、測定用電極に対する細菌の作用であった。細菌はこの電極の特性を
変更し且つその電気化学的活性を試験期間中でささえも有意に変化させることが
あった。言い換えると、先行技術のシステムでの困難な部分は、流体中の電気活
性物質に関する測定用電極の活性の変化によっておよびこのような電極の有効面
積の変化によって引き起こされた。
(2)混入物に関する重要な問題があった。本特許出願の文脈においては、混入
物を、測定用電極で電流を生じる最初の試験試料中の(細菌自体以外の)任意の
物質として定義している。これは前述の「第一の工程」において反応を促進する
混入物に起因することがある(概し、て、この混入物は試験の開始前の細菌に由
来する遊離酵素である)。これは更に(または或いは)、混入物が、用いられた
電位値で測定用電極でそれ自体直接酸化される物質である場合に生じることがあ
る。いずれの作用も、擬似電流および不正確な細菌計数を生じる。試料中に混入
物が存在していることによる基本的な問題に加えて、更に、試料毎の混入物濃度
の偏差およびそれにより、混入物によって引き起こされる電流の偏差が存在する
ことが多い。与えられたシステムによる試料毎の厳密に一定の混入物電流は、試
料の独立プレート計数から誘導される校正定数で補正されると考えられた。しか
しながら、これは希な場合である。
(3)細菌個体数の電気化学的測定の分野に従事している多数の従来の発明者は
、機械的に酷使することによる細菌に対する損傷を防止するための注意を払わな
ければならないということを了解していなかった。細菌が十分な機械的応力を受
ける場合、それらの膜は破壊されて、溶液の触媒能力を顕著に変更してレドック
ス対の還元種を生じる(第一の工程)重大な量の酵素を放出することがある。
見掛上穏やかな妨害でさえも、細菌に対して有意の効果を生じることがある。本
出願人は、従来のシステムにおいて一般的に用いられた急速にスピンし、回転す
る電極は、用いられてきた他の磨耗的または破壊的な機械的方法と同様に、細菌
の膜を破壊することがあると考えている。
(4)先行技術の別の特徴は、電流が広範囲に変動することが多いということで
あった。このような変動電流は、結果を説明することまたは細菌係数を確実にす
ることを困難にした。
先行技術の様々な欠点により、細菌の個体数を決定するための電気化学的システ
ムは実際的有効性が大きいことが証明されていないし、そして商業的重要性も大
きくないものであった。これは特に、少ない個体数の細菌の試験に関して当ては
まった。
本発明の一般的な目的
本発明の(非制限の)目的としては下記がある。すなわち、(a)細菌が試験法
の際に、それらの細胞膜を破壊し、それによって遊離酵素を生じることがある乱
暴な機械的処理を施されないことおよび化学的反応を触媒する細菌の能力を変更
することがあるあまり激しくない妨害を受けないことを確実にすること。(b)
電極表面の任意の細菌混入物なしに電気化学的測定を行うこと。(C)ノく・ツ
クグラウンドによってまたは試料中に存在する任意の混入物によって引き起こさ
れる電流尺度のその部分を決定しまたは補正すること。(d)元の試料中の混入
物の量を最初に減少させることによって、試験前に「精製された」試料を製造す
ること。(e)多数の会社、科学者および専門家によって望まれる細菌計数密度
を正確に、比較的迅速に、そして実際的に得ること。
上記の目的および他の目的は、数種類の方法で達成される。これらをここに記載
する。
発明の要約
第一の新規の且つ改良された方法では、計数される試料から細菌を集めたフィル
ターカートリッジを用いる。試薬流体をこのようなカートリ・ソジを介して移動
させ、細菌によって生じた還元種の電気化学的測定をカートリッジからの濾液中
で行う。次に、細菌計数を流体流量、電気化学的シグナルおよび時間の関数とし
て決定する。(本発明の一つの主要な態様による)方法は、電気化学的シグナル
の直接反応を細菌に対する特徴とするようにし、同時に、混入物を無効にするこ
とであることが強調される。
第二の新規の且つ改良された方法は、流体試料をフィルターを介して容器から移
動さ也同時に、濾液流中で生じた還元種を電気化学的に測定した後、細菌の計数
を、変化する細菌濃度、電気化学的シグナルおよび時間の関数として決定する手
段を含む。この方法の重要な態様は、その方法が、細菌に対して特徴的な電気化
学的シグナルの第二の導関数を作るようにし、同時に混入物を無効にすることで
ある。
本発明の一つの主要な態様により、電気化学的測定は、細菌が存在していなし)
濾液中で、流体および細菌双方を含む室で行われた測定とは区別して行われる。
測定は濾液中で行われるので、測定用電極でまたはそれ以外で細菌を機械的に酷
使するものは有り得ない。更に、測定用電極またはフィルターを越えた装置の他
の部分の細菌汚染の可能性は存在しない。言い換えると、本出願人は、完全な電
極アセンブリーを濾液中に入れることによって顕著な改良が達成されることを発
見し、このような濾液は、元の試料から細菌を集めるのに予め用いられたフィル
−ターカートリランによってかまたは細菌が入っている容器の出口に若しくはそ
こから下流に位置したフィルターによって生成された。
本明細書中で論及される還元種の「電気化学的」測定法としては、定電位での電
極電流および/または定電流での電極電位の尺度を含む電気化学的測定用の標準
法および/または電気化学的活性物質の濃度を決定する他の電圧計または電流計
による方法がある。
測定用電極は種々の化学的に不活性で且つ導電性の物質、例えば、白金、パラジ
ウム、金、炭素、黒鉛等から、そして多数の標準的な形状、例えば、回転、固定
、毛管、棒材、線材等のいずれかで製造することができる。2個の電極計測では
、参照電極および電力電極を組合せて、電位を検出し且つ電流を供給する双方に
用いられる標準型の可逆電極にすることができる。3個の電極システムは、測定
用電極、参照電極および電力電極を含み、4個の電極システムは、測定用電極、
電力電極および2個の参照電極を含む。
電気化学的測定を濾液中で行う本発明の態様の様々な形態が存在し、各形態に変
法がある。一つの方法によれば、細菌を試験部位でフィルターカートリッジに集
めた後、そのカートリッジを、細菌計数密度が決定される実験室に運ぶ。決定は
、試薬溶液を細菌含有フィルターカートリッジ中におよびそれを介して通過させ
ることによって、カートリッジ中に存在する細菌が濾液中の実質的な還元種の生
成を引き起こすような方法で行われる。次に、試薬はその還元種と一緒に、電気
化学的測定装置に流れ、そこで、還元種によって生じた電気化学的作用によって
生じた電流が決定される。この電流は、混入物、バックグラウンド電流および電
気化学的装置目盛りに対して調整されて、元の試料の細菌計数密度を生じる。
フィルターカートリッジを介する試薬溶液の平均流量は、細菌が有意の還元種を
生じるように十分に低くされる。好ましくは、一定流量を用いる代わりに、断続
流が存在するような方法を行う。これは、流量を予め決められた時開セロにした
後、特定の流量を一定時間用いることJこよって行われ、電気化学的測定は全操
作中に行われる。
上記の部分について詳細に論じ且つ本発明の別の態様を述べると、試薬を、予め
決められた容量の元の試料からの細菌が入っている容器、すなわち、極めて好ま
しくは、小容量のフィルターカートリッジ中に導入する。試薬をカートリッジ中
で、その中の全部の細菌が十分な還元種の生成を引き起こして電気化学的測定装
置で測定可能な電流を生じるように十分に長い予め決められた時間保持する。
次に、試薬をカートリッジから電気化学的測定装置へ通過させ、測定を濾液中で
行う。更に、同一の試薬であるが、カートリッジ中に導入されなかった試薬を、
カートリッジとは別の電気化学的測定装置に通過させる。別の測定をこの二番口
に挙げた試薬に関して行う。測定値間の差に校正定数を乗じるが、このような定
数は元の試料の一部分についての独立の方法によって決定されたものである。次
に、他の試料に関して操作を繰り返して、記述したのと同じ工程を用い、予め決
定された定数を用いる。
もう一つの形態の方法において、試薬を細菌含有カートリッジを介l、て種々の
低流量で通過させ、各流量に関して電気化学的測定装置で測定を行う。それによ
って、バックグラウンドの影響を補正する。
細菌計数密度を決定する更に別の方法は、通常、前記に示した「カートリッジ」
法の場合よりもはるかに大きい容量を用いることになる。元の試料(好ましくは
、予め濾過することによって生成された精製試料)を、フィルターが室温出路に
ある容器に入れる。室中の細菌用に環境調整時間であって、その間に還元種が生
成される一定時間後に、還元種を室から抜き取り、電気化学的測定装置を介して
通過させる。測定は1.(全く同一の)流体中の実質的に異なる2種類の濃度の
細菌に関して行われる。次に、これらの測定値を用いて細菌個体数を決定するが
、流体中の任意の混入物の存在ゆえに導かれる誤差は存在しない。極めて好まし
くは、2種類の異なる濃度は前記に示した容器からの液体を濾過することによっ
て得られ、次に、電気化学的測定をその濾液中で行う。
更に別の形態による細菌計数の決定法は、流体を濾過し且つ電気化学的測定装置
での測定が実施された後に、その一部分を残してお(ことを含む。次に、その残
しておいたm液によって生じた電気シグナルを決定し且つ電気化学的装置を介す
る最初の通過で最初に生じたシグナルと比較する。次に、混入物が存在している
か否かを確認し、測定された細菌計数に関して補正を行う。
図面の説明
図1は、本発明のバ・子バス法と称することができる方法を実施するための装置
の路線図であり、フィルターハウジングの中心部分は、フィルターを示すために
破断されている。
図2は、本発明のフロースルー法と称することができる方法を実施するための装
置の路線図である。
図3は、本発明の濃度変化法および貯蔵試料法と称することができる方法を実施
するための装置の路線図である。
精製試料の生成
本明細書および請求の範囲を通して、「荒目フィルター」という用語を用いる場
合を除き、「フィルター」という用語はマイクロフィルターを意味する。これは
、濾過において細菌を保持するのに適した多数の商業的に入手可能なマイクロフ
ィルターの一つである。これらのフィルターは無菌であり且つ生物学的に中性で
あり、細胞毒性でも、割線菌性でもまたは段線菌性でもない。
以下に記載した方法を開始する前に、最初の濾過工程を個別に行うのが好適であ
る。これは、多数の工業用システム中に存在する重大な量および種類の混入物の
ためである。例えば、市販のオキシダントは、通常、細菌および藻類の抑制用に
用いられる。塩素、二酸化塩素およびアクロレインはいずれも電気化学的に活性
であり且一つ電気化学的測定装置によって生じた電気化学的シグナルに影響を及
ぼす。多数の他の殺生物剤、除草剤および殺藻類剤は、種々の水質調節剤と同様
に誤差を招く。
化学的処理剤が元の試料中に存在していない場合でさえも、通常、遊離酵素は存
在している。これらは、細菌自体からそれらの細胞膜を介する細菌による酵素分
泌の正常な方法によって生成されている。これらの酵素の存在は細菌計数密度の
読みを高(する。
精製試料は、最初に、原料試料を荒目フィルターを介し、て通過させた後、その
荒目フィルターを廃棄し、次J二、荒目フィルターを介して濾過された濾液を再
度(マイクロフィルターによって)ta過し、そしてこのような二番目に記述し
たフィルター上に細菌を集めることによって生成されるのが好ましい。このよう
な操作から得られる原料濾液を廃棄し、そして以下に記載した操作を開始する。
細菌は生菌のまま、しかも無傷で保持されることが強調される。したがって、例
えば、それらはフィルター上で乾燥されることもないし、それらは機械的にまた
は他の方法で酷使されることもない。最初の濾過後、精製試料は、濾過された元
の試料を採取し7、それを洗浄し、そしてそれを試薬流体と一緒に再構成するこ
とによって生成される。
多くの場合、精製試料は試薬それ自体を用いることによって、前の段落に記述し
た分離工程を行わずに生成することができる9、フィルターカートリッジは、工
業プラントの適当な場所、例えば、テストスピゴットに配置することができる。
プラントからの予め決められた容量の流体をスビゴ、トおよびフィルターカート
リッジを介して通過させる。次に、カートリッジに試薬流体を満たして、細菌が
生菌のまま保持されるようにし、た後、カートリッジの両端に栓をする。カート
リッジを、本方法が行われる試験室(ご運ぶかまたはその方法をプラントのその
場で行ってもよい。
特別な例として、搾乳場での乳汁を、荒目フィルターが中にあるスピゴ・ソトを
介して通過させ、引き続き、フィルターカートリッジを介して徐々に流す。次に
、適当な予め決められた量をこのように流した後、カートリッジを外し、細菌計
数密度を決定する試験を行うための試験室に回収する。
バイパス法の詳細な説明
バイパス法と称することができる方法の説明を助けるものとして、最初に、路線
図1に関して、その方法を実施するのに用いるための装置を記載する。しかしな
がら、図1の装置は電流を測定するが、他の電気化学的シグナル(例えば、電位
)も測定することができることが指摘される。好ましくは、必然的ではないが、
バイパス法では、10で示されるようなフィルターカートリッジを用いることに
なる。これは小容量の密閉容器であり、そこに、典型的に合成樹脂から成形され
且つ細菌の通過を妨げるか、液体の通過を許すように結合されたフィルターFが
密封する関係で張られている。カートリッジの典型的容量は約lccである。
フィルターを介する流れは遅いのが典型的であり、例えば、1分間当りlccま
たはそれ未満である。フィルターカートリッジ10に対しておよび他の成分に対
して連通ずる導管は、内径が小さいのが好ましく、既述のフィルターカートリッ
ジ10を介する遅い流れであっても、電気化学的測定装置に刻して濾液が通過す
るための時間が過剰になることはないということは理解すべきである。
試薬のバッグ(または他の容器)11は、導管を介してポンプ12に対して、そ
して二極−二方向バルブの一部分13に対して連通している。前記のバルブの他
の成分14は第一の成分13に対して、例えば、ソレノイド手段によって連通し
、その結果、双方の成分13および14が同時に作動する。
バルブ成分]3および14それぞれがある配置にある場合、バッグ11からの試
薬はポンプ12および成分13を介してフィルターカットリッジ10に通過し、
そこからバルブ成分14へ、そして電気化学的測定装置15へと通過する。フィ
ルターカートリッジが、望ましい場合にカートリッジをシステムから除去するこ
とを可能にし且つ望ましい場合に新規のカートリッジを取り付けることを可能に
するカップリング16および17によってバルブ成分13および14と順次に連
通していることは理解すべきである。
バイパス18はバルブ成分13および14の間に連通し、それらの間にカートリ
ッジ】0とは別に試薬を導匂バルブ成分13および14それぞれが他の配置であ
る場合、試薬はバック11およびポンプ12からバイパス18を介して測定装置
15に流れる。
例示した電気化学的測定装置15は、断熱性ハウジング19を有し、その中に測
定用電極20が取り付けられている。ここで示した測定用電極は円筒形の炭素電
極であり、ハウジング19内でモーターMによって徐々に回転され且つハウジン
グ内で比較的近接して嵌め合わされた関係にある。適当なシールで漏れを防止す
る。ハウジング内部(電極外部)の室の容量は小さく、好ましくはlcc未満で
ある。
電気化学的測定装置は、更に、電力電極21および参照電極22を含み、後者は
導電性プラグ23によるように、測定用電極20の回りの室から実質的に隔離さ
れている。測定用電極、電力電極および参照電極は、当該技術分野で周知の印加
の端子および電流測定装置Pに接続され、一つの例が上記に引用した特許第3゜
506.544号明細書に記載されている。ピコ電流計は図示されていないが、
装置Pに与えられて、測定用電極での電流の流れを測定する。
参照電極22が実質的に一定の電位を維持し、そしてそれによって測定用電極自
体が実質的に一定で且つ選択された電位を維持することができるその測定用電極
の電位を監視することは理解すべきである。これは適当な回路によっておよび電
力電極21から測定用電極への電流の適用によって行われる。
例示した電気化学的測定装置15において、ハウシング19からの流体は電力電
極21を通過して廃棄される。
方法の説明に次いで進むと、これは、決定される細菌の個体数である既知の細菌
が(既知の容量の元の試料から)集められる上流の表面上のフィルターを介して
試薬を通過させることを含む。(細菌の種類は特定の工業システム等での経験に
よってかまたは顕微鏡による若しくは他の分析によって知られている。)回路に
(前に記載したように)カートリッジを接続する前にかまたはフィルターを介す
る試薬の最初の流量によって細菌を洗浄して混入物を除去する。
このように細菌から混入物を洗浄した後の少なくとも望ましい時間中に、ポンプ
12を操作して、フィルターカートリッジ10を介する試薬の平均流量が十分に
低く、カートリッジ中の細菌が十分に還元種を生成し、測定可能な電流が電気化
学的測定装置15で生じるようにする。
更に明確に述べると、既知容量の元の試料を、工業プラントでかま1こは実験室
でフィルターカートリッジ10を介して通過させる。これにより、カートリッツ
のフィルターFの上流表面上に細菌が集まる結果となる。次に、カートリッジに
適当な流体を満たし、フィルターFの上流表面上の細菌と一緒にカップリング1
6および17によって回路に入れる。次に、ポンプ12並びにバルブ成分13お
よび14を操作して、バッグ11からの試薬を、フィルターカートリッジ10お
よびバイパス18を交互に介してポンプで送り、フィルターカートリノンを介す
る流れ方および流速は種々の試料について繰り返すことができる(そして繰り返
される)。
電気化学的測定装置15を用いて、好ましくは全部の時間の電流を測定し、電流
の振幅を比較する。言い換えると、バイパスによって引き起こされた電流を、カ
ートリッジによって引き起こされた電流と比較する。例えば、その条件が、電気
化学的測定装置中の流体がカートリッジからのものであるようである場合、電流
は、細菌によって生じた効果のために比較的高い。もう一方において、電気化学
的測定装置中の流体がバイパス18からのものである場合、電流は、それがバッ
クグラウンド電流であるために比較的低く、電流はカートリッジ中の細菌の作用
を典型的に示すものではない。
ピコ電流計によって測定された電流の振幅が繰り返される時点で、試験を終了す
ることができる。言い換えると、同一の電流振幅が、流体がカートリッジからで
ある度に生じ、そして同一の(更に低い)電流振幅が、流体がバイパスからであ
る度に生じる場合に、試験を終了することができる。更に、カートリッジからの
流体に関して唯一の読みを得る必要があり、バイパスからの流体に関するものは
、与えられたシステムについての予備試験が十分に行われて、その結果が繰り返
されることが知られているならば、交互の読みを続けなければならない。
(本明細書中で用いられる「振幅」という用語は、同じ定義を試験毎に用いる限
りは、ピーク、積分、最小平均平方等を意味することができ、すなわち、このよ
うにして導かれた変数はいずれも、下記に示す定数部分である。)その方法は、
更に、電気化学的測定装置中の流体がバイパスからのものである場合に生じた電
流を、流体がフィルターカートリッジからのものである場合に生じた電流から減
じることを含む。次に、この電流の差に定数または比例定数(K1)を乗じて、
このようにして、元の試料における1ミリリットル当りのコロニー形成単位(c
f u’ s)中の細菌計数密度を読み取る。この定数(K、)は、試料毎に
操作が繰り返される場合に、本方法によって決定された細菌計数に相関するもの
であり、計数は、元の試料の一部分についての独立手段によって得られた(例え
ば、プレート計数)。
電気化学的測定装置中の流体がバイパスからのものである場合のそれぞれの場合
の(ピコ電流計による)電流読みが読取り毎に極めて一定であるならば、流体が
カートリッジからのものである場合に生じるピコ電流計の読みは、たとえこのよ
うなピコ電流計の読みが、液体がバイパスからのものである場合の読みよりも僅
かに大きいだけだとしても有意である。一方、「バイパス」の読みが極めて少な
い場合、「カートリッジ」の読みが「バイパス」の読みに関する場合よりも極め
て大きくなるように試験を実施することが望ましい。後者の場合、「カートリッ
ジ」の読みが、「バイパス」の読みの変化を少な(とも2回または3回生じさせ
ることが望ましいことが多い。
断続流を伴う本バイパス法は、発明者によって考えられた一つの最良の態様であ
る。
カートリッジを介する一定のまたは断続的流量は、バルブ13および14が、ポ
ンプ12からの試薬が(当然ながら)ポンプがオンであるかまたはオフであるか
に応じてカートリッジを介して通過するような位置にある場合の全部の時間に用
いることができる。バルブ13および14の位置を換えて、試薬がカートリッジ
を介する代わりにバイパス1−8を介して通過するようにする場合、カートリッ
ジを介する流れはゼロである。
バルブ13および14をバイパス位置に切り替える時間の長さは、カートリッジ
10を介する流れが存在しないので、好ましくは、既知の方法で、すなわち、試
料毎に変化し、すなわち、予想される(または試験の初期段階で決定される)細
菌計数に関係する。例えば、細菌計数が低い場合、試薬が流れることなくカート
リッジ10に残される時間の長さは比較的長(なる。一方、細菌計数が高いと予
想される場合、試薬がカートリッジ10に残される時間の長さは比較的短くなる
。双方の場合において、その時間は、細菌が十分な還元種を生じて電気化学的測
定装置に有意で且つ意義深い測定を行わせるようにある。
電流読みと細菌計数密度とを相関させる種々の定数が存在する。例えば、カート
リッジ中の3分間のゼロ流に対する一つの定数およびカートリッジ中の9分間の
ゼロ流に対するもう一つの定数が存在する。これらの定数は双方とも、9分間お
よび3分間の双方の時間で補正細菌計数密度読みを生じるようなものである。
双方の定数は、前述のように、それらが何度も繰り返されるようになった後に、
電流読みと、(例えば)同一容量の試料のプレート計数によって決定される細菌
計数密度とを相関させることによって決定される。
ポンプ12は、システムが1−バイパス」状態にある場合、バイパスからの流れ
が電気化学的測定装置に達し且つカートリッジからの濾液を有するそれをパージ
したら直ちに停止されるのが好ましいことは理解すべきである。この状態は、ピ
コ電流計が最小電流を読み取ったら直ちに存在することが分かる。逆に、システ
ムが「カートリッジ」状態にある場合、ピコ電流計は次に最大読みを示すので、
濾液がバイパスからの試薬を有する電気化学的測定装置にパージしたことが分か
る。
上記に記載された特定の電気化学的方法では、細菌個体数を決定するための出カ
ングナルとして電流の測定を用いるが、方法はそれに制限されない。還元種の決
定に適し、た任意の他の方法、例えば、電位差測定器を用いる方法で置き換える
ことができる。
多数の用途において、下記の副題のもとに記載したように、データ処理機を用い
るのが好適である。
フロースルー法の詳細な説明
フロースルー法は、細菌、すなわち、予め決定された量の元の試料からの細菌の
試料が入っているフィルターカートリッジ(または他の容器)を介して試薬を移
動させ、モして濾液流中の還元種を測定することを含む。二組のデータ、すなわ
ち、流量対時間および還元種を示す電流対時間をデータ処理機で用いて、細菌計
数密度を決定する。
フロースルー法は発明者によって考えられたもう一つの最良の態様である。
図2を論及すると、フロースルー法を実施するのに用いるための装置の一つの形
態が示されている。電気化学的測定装置15は、図1に関して記載した装置15
と同一である。図1の場合と同様に、フィルターカートリッジ10は装置15に
連通し、カートリッジはカップリング16および17の存在ゆえに着脱可能であ
る。図2において、試薬ポンプはシリンジ25であると図示され、そのピストン
26はモーター27によって駆動される。モーター27は、モーターおよび/ま
たはピストン位置を検出し、そして流れのデータを28で図示されたデータ処理
装置および細菌読取り装置に伝達する検出手段または他の手段と組合わされる。
装置28は、更に、測定用電極から電流データを供給する。装置28に対する流
れのデータの伝達は矢印29によって示され、それに対する電流データの伝達は
矢印30で示される。図1に関して示した印加装!および電流測定装置Pは、図
2の装置にも直線的にかまたは対等に存在する。例えば、図2で「電気化学的測
定装置」と標識されたボックスは、図1の「印加および電流測定」ボックスを組
み込むこともできる。或いは、例えば、ピコ電流計がデータ処理ブロック28に
与えられてもよい。
カートリッジ10中のフィルターFを介する一定流量の試薬が存在する場合、す
なわち、モーター27を一定速度で操作する場合、細菌計数密度は、電気化学的
測定装置15によって検出され且つデータ処理装置28に伝達された平均電流を
調節する定数に等しい。このような一定の流量は、細菌の濃度が極めて高い場合
、またはポンプを極めて遅い(本副題のもとに下記に記述した実施例の場合より
も明らかに遅い)流れを生じるように操作する場合に用いることができる。
フロースルー法の好ましい形態において、細菌計数の決定は、カートリッジを介
する2種類の異なる流量で測定を行うことによって達成される。
流れが一定であるか、断続的であるかまたは可変的であるかということは、種々
の試料に関して試験毎に繰り返される。更に、全部の状態が試験毎に同じに保持
される。次に、試験の各種類に対しては、すなわち、(流れがコンピューターに
よって決定される場合の)各コンピュータープログラムに対しては、平均電流と
実際の細菌計数密度とを相関させる定数(F2)が知られている。この定数は、
試験の各種類に対して、(例えば)プレート計数を得ることによって誘導される
。
次に、C本発明の全実施態様の)後者の試験に対して、同じ定数を繰り返し用い
る。
カートリッジ中のフィルターを介する流量があらかじめ決定された時間に対して
ゼロであるようにする場合、カートリッジ10中に還元種が蓄積する。次に、流
れが予め決定された時間の最後に開始される場合、その流れは、このようにして
蓄積された還元種を電気化学的測定装置15に対して且つその中に移動させる。
装置15で生じた電流の積分は、装置15に対する特異的蓄積の伝達から結果と
して生じる電流パルス(電流対時間の曲線)に基づく面積である。流れのプログ
ラムを正確に繰り返すことができ且つ試料毎に繰り返す場合、(例えば、データ
処理機28で生じた)曲線に基づくパルスの振幅および面積の間には一定の比率
が存在する。したがって、細菌計数密度は、電流が、カートリッジから受け取っ
た蓄積の存在ゆえに装置15で得られたパルスの振幅である場合には、電流を調
節する定数に等しい。
本フロースルー法と先行技術との根本的な違いは、フロースルー法は細菌個体数
を決定するために電流の変化率を測定しないということである。その代わりに、
本フロースルー法は、一定の平均流量で、測定用電極を流れる平均電流を測定す
る。
フロースルー法の好ましい形態の一つの態様により、特に、細菌密度が低い場合
、試薬を、カートリッジ10中のフィルターを介して、極めて少ない還元種が生
じるように非常に速い速度で通過させる。フィルターから電気化学的測定装置に
通過した大部分の液体は試薬のみであり、還元種ではないという結果となる。
データ処理機に伝達された得られた電流は、適切に、バックグラウンド電流とみ
なされ、洗浄後の細菌中に存在することがある任意の残留混入物を含む説明因子
として考慮されるバックグラウンド電流である。
フロースルー法の例を述べると、フィルターの寸法は、(容量がlccであり、
流量が、例えばlee/分である)試薬の第一のパルスがフィルターカートリッ
ジから残留混入物の大部分を洗い落とすような寸法であることが推定される。次
に、同様にICC11cc/分である第二のパルスはバックグラウンド電流を生
じる。これにより、再度、カートリッジ中の細菌計数密度は、lcc/分で極め
て少ない還元種を生じるように十分に低いということが推定される。次に、これ
らの最初の2種類のパルスの後に、ポンプを停止し、例えば、15分間の遅れを
生じさせる。次に、その遅れの後、ポンプを再度始動して、フィルターを介する
流れを速度lcc/分で引き起こす。これは、濾液のパルス、スラップまたは容
量を電気化学的測定装置15へと前進させる。次に、ピコ電流計またはデータ処
理機28によって示される電流は、実質的還元種を含むこのようなパルスが装置
15に入り始めた時に示され、すなわち、続いて生じたシグナルは還元種の濃度
に関係する。このようなスラップが測定装置を介して通過した場合、シグナルは
、予め測定されたのと本質的に同じバックグラウンド電流に戻る(これがベース
ラインである)。そのとき、細菌計数はスラップをバンクグラウンド電流未満で
保持することによって生じた電流の平均振幅を調節する定数(F2)に等しい。
細菌計数密度は、データ処理機によって、例えば、元の試料の1ミリリットル当
りのコーニー形成単位(cfu’s/ミリリットル)で読み取ることができる。
本方法は、2種類の異なる流体流量で電流測定を行うことを含む。このような2
種類の流量は、全く同一の流体中の2種類の異なる細菌濃度を電気的に測定する
手段を効果的に提供し、これは、フィルターカートリッジ中の有効な細菌濃度が
、その流量に逆比例することによるものである。その関係は2.混入物の影響を
細菌計数の計算された読みから無くすような関係である。
上記のことを言い換えると、(細菌の作用の結果として生じた電流以外の任意の
源から得られる)バックグラウンド電流は、試薬流体をフィルターカートリッジ
を介して2種類の異なる流量で交互に移動させる場合、試験結果から除かれる。
電気化学的測定装置で測定させた2種類の電流を、測定された流量と一緒に用い
て、細菌計数を計算する。
本出願人は、細菌の作用によって生じた電流の成分(rlJ )は2種類の流量
(FlおよびF2)で異なるが、他の源からのバックグラウンド電流成分は全流
量で実質的に一定であることを発見した。したがって、未知数が2個だけの二つ
の方程式を与え且つB(細菌)について解く。
概して、■(測定値)=1(細菌)十■(バックグラウンド)[但し、■(バッ
クグラウンド)は一定である]である。
であり、但し、電流値(L、12)および流量(Fl、F2)は全部の測定され
た量であり、F2は、元の試料の一部分の細菌を計数する独立の方法(例えば、
プレート計数)を用いて誘導された比例定数である。
例えば、lcc/分の平均流量が12.1ナノアンペア読みを生じる場合、1/
10cc/分平均流量は16.8ナノアンペア電流を生じ、F、=0. I L
=16. 8
濃度変化法の詳細な説明
濃度変化法を図3に関して記載し、それによって、このような方法を実施するの
に用いることができる装置の一つの形態を示す。図3の電気化学的測定装置15
を図1のものと同一のものとして示し、同じ参照番号をそれに関して用いる。
同じことが印加および電流測定装置Pにも当てはまる。
大部分の用途においてフィルターカートリッジ10の容量の何倍もの容量を有す
る容器32がベント式キャップ33と一緒に与えられる。試薬容器34、例えば
バッグは、バルブ35を介して容器32に連通ずる。フィルター38は、容器3
2の底部に与えられ、フィルターの上面はこのような容器の内部と直接連通して
いるのが好ましい。フィルター38はフィルターハウジング39に入れられ、そ
れがポンプ37に連通し、それが測定用電極20のハウジング19に連通してい
る。
ガスインジェクター40は、容器32中の流体から酸素を除去し且つそれを攪拌
するために、そのような流体中に不活性で且つ酸素不含のガスを導入する。他の
要素は容器と組合わされ、例えば、機械的攪拌器および洗浄流体を導入するため
の手段である。ガスはガスインジェクター40を介して、そして好ましくは、酸
素不含窒素ガスを含む容器の流体中へと通過させる。試料入口は示されていない
が、容器キャップまたはカバー33に与えられて、試料を導入する場合にそのよ
うなカバーを外す必要をなくすようにする。
電気化学的測定装置を介して通過する液体は廃棄することになり、すなわち、そ
れは容器32に再循環されない。したがって、バルブ41が廃棄ラインに与えら
れ、濃度変化法の実施中に開いた状態にある。
濃度変化法は、容器32に既知容量の試料を導入する予備工種を含むのが好まし
い。バルブ35が閉じられたままである間は、ポンプ37は、全部の液体が容器
から除かれ且つ廃棄物へと通過するように操作される。したがって、容器中の細
菌はフィルター38の上面に存在する。
次に、ポンプ37を停止し、バルブ35を開き、そして試薬をバッグ34から容
器32へと通過させて、それを望ましい水準まで満たす。次に、バルブ35を閉
じる。ガス注入手段40を単独でかまたは機械的攪拌器と組み合わせて用いて、
酸素を有する試薬をパージし、そして(好ましくは)試薬−細菌混合物を均一に
保持する。装置はここで、細菌計数の試験を開始する用意ができる。
概して、濃度変化法の基本的理論は、全く同一の液体中の細菌の濃度を(フィル
ターを介して容器32から流体を除去することによって)変化させ且つ還元種の
濃度の上昇速度を(適当な電気化学的測定装置によって)測定することである。
したがって、二組のデータが得られ、一つは還元種の濃度対時間であり、もう一
つは細菌の濃度対時間である。これらのデータを用いて単位容量当りの細菌計数
を決定し、洗浄後に残ることがある任意の混入物の影響を無効にする。多数の濃
度プログラム(操作)のいずれか一つを用いてよく、それぞれ、それ自体のデー
タ処理アルゴリズムを有し、それによって、細菌に対して特徴的である機能の二
組のデータを用いる。
細菌の濃縮の好ましい方法は、図3に示したように濾過を用いる。ポンプ32を
始動させて、容器32中の細菌含有試薬の容量を、(Vtと称してよい)初期容
量から(V2として称してよい)実質的に一層少ない容量まで減少させる。予め
決められた時間に、例えば、容器32中の液体の容量がvIであり、(次に)容
量がV2である場合、電気化学的測定装置15を用いて各濃度での電気化学的シ
グナルを読み取る。好ましくは、電気的シグナルは電気化学的測定装置からデー
タ処理機へ伝達され、容量シグナルはポンプ37からまたは容器32に関係した
検出器から前記の処理機へ伝達される。
濃度変化法の好ましい形態では、データ処理機を用い、容量対時間およびシグナ
ル対時間の入力を受け取るように、電気化学的測定装置からおよびポンプもしく
は容器から/グナルを供給する。ポンプ37で、試薬を容器32に対して試薬容
器34から導入後すぐに操作を開始し、電気化学的測定装置で、ポンプが操作し
ている間中、電流を連続的に測定する。
次に、データ処理機で、測定用電極20に存在するノブナルの第二の導関数を決
定する。このような第二の導関数は細菌計数(B)に比例する。シグナルが電流
の尺度である場合、一般式は、
であり、但し、Bは細菌計数であり:に3は、プレート計数等を用いることによ
って(前記に記載した方法で)誘導される比例定数であり:そしてIは測定用電
極の電流である。
任意の望ましい流れのプログラムを用いることができるが、そのプログラムは試
料毎に繰り返さなければならない。前のように、全部の状態を試験毎に同じに保
持しなければならない。
濃度変化法において測定用電極によって生じた読みを細菌計数密度に対して変換
する第二の尺度は下記の通りである。ポンプ37を始動させ、3種類の電流を電
気化学的測定装置によって測定し、電流は等間隔で時間どおりに測定される。
具体的には、容量V1で電流11を測定する。次に、更に流体を容器32を介し
て通過させて容量■2が存在するようにする。次に、電流I2を測定する。I、
およびI2間で記録された時間に対して等間隔の時間で且つ容量がv2のままで
ある間に、電流■3の測定を行う。
次に、細菌計数(B)を下記の方程式によって決定する。
B=Kn (I4+I2 2I3)
前のように、定数に4は、独立の計数法、例えばプレート計数によって、方程式
の結果をcfu/ミリリットルでの実際の細菌計数密度に解釈するように決定さ
れたものである。
上に記載した濃度変化法は、任意の残留混入物を排除する。試薬中の細菌の濃度
は、試薬を容器底部から濾過し且つ廃棄物へとポンプで送るにしたがって上昇す
るが、混入物の濃度が対応して上昇することはないということが指摘される。
混入物の濃度は細菌の濃度が上昇する間中、同じ状態のままである。したがって
、数学的には、混入物を方程式から排除することができるので、細菌によって生
じた影響のみを用いて細菌計数密度を生じる。
貯蔵試料法の詳細な説明
図3を論及すると、貯蔵試料法で用いられる装置は、濃度変化法に関して前に記
載したのと実質的に同一であるといえる。しかしながら、バルブ42は、参照番
号43で示した容器(例えば、バッグ)へと延びるティーに与えられる。
貯蔵試料法は、(前記の精製試料の調製後に残っている)細菌中の任意の残留混
入物の影響を下記の方法で大いに減少させまたは排除する。
方法の最初の部分は、濃度変化法に関して前記したのと同じである。しかしなが
ら、(電気化学的測定装置によって読取りが行われる際の)試験中に電気化学的
測定装置を介して通過する液体は、廃棄物へと通過しないが、その代わりバッグ
43へ通過し、バルブ42が開けられ且つバルブ41が閉じられる。更に、濾液
および試薬がフィルターハウジング39からポンプ37および電気化学的測定装
置を介してバルブ42へと通過する間に、電気化学的測定装置によって測定が行
われる。
したがって、実質的にもっと後に、液体の貯蔵試料を電気化学的測定装置を介し
て再度通過させる。これを、例えば、バルブ42と組合された導管からノく・ソ
ゲ43を分離し且つそのバッグから貯蔵試料をポンプ37中に、そして電気化学
的測定装置へと導入することによって行ってもよい。導入は、示されていないが
、容器32とは別の手段によって行われる。次に、貯蔵試料に第二の電流測定を
実施する。
このようにして、最初の読取りを行った時に、混入物が存在していたか否かを決
定する。最初に測定された電流に等しい第二の通過電流シグナルによって、混入
物が存在していなかったことが実証される。一方、流体の貯蔵試料に関して増加
した電流は、混入物の存在を示す。後者の場合、任意のこのような電流の増加量
は補正計数として用いられる。言い換えると、液体の第二の通過から得られた電
流と、液体の最初の通過から得られた電流との差を計算する。この差を、液体を
電気化学的測定装置を介して最初に通過させた時に測定した電流から減じる。
次に、このように補正した電流を用いて、細菌計数密度を決定する。(その結果
を、プレート計数によって決定された定数と一緒に用いて密度を得る。)試験を
、試料毎に同一の方法で再度繰り返す。
具体例
実施例1、バイパス法の可能性を示す酵素試験トリプシン大豆ブイヨンからの酵
素は、メチレンブルーおよびゲルコースなどのある種のオキシダントと基質との
反応を触媒することが知られている。この特徴を用いて、還元種(この場合は還
元メチレンブルー)の増加に反応する電流を決定することによって、バイパス法
の可能性を試験した。
容量約1/2mlの小型のプラスチック容器に、試薬およびトリプシン大豆ブイ
ヨンの50150混合物を入れた。カートリッジに接続を入力し且つ解除して、
バイパス装置においてフィルターカートリッジの代用品として用いることができ
るようにした(図1)。小型の容器を試験ループに入ね、15分間の待ち時間を
選択して、酵素による触媒作用によって一定濃度の還元メチレンブルーを生成さ
せた。試薬は下記の組成を有した。
H2O75m1
−塩基性リン酸塩 0.4g
K2HPO40,8g
グルコース 0914g
メチレンブルー 0.005g
塩化カリウム 0.35g
トリトリプン大豆ブイヨン記の組成を有した。
H2O100m l
カゼインの膵液消化物 1.7g
大豆ミールのパパイン消化物 0.3gNaC] 0.5g
K2HPO40,25g
デキストロース 0.25g
待ち時間の最後の1分間に、試薬をポンプによってバイパスを介して電気化学的
測定装置に移動させ、そして電流をゼロに合わせた(バックグラウンド電流が流
れていたとしても、ゼロであるようにした)。待ち時間の最後に、試薬流をバイ
パス経路から移動させて、試薬/大豆ブイヨン混合物が入っている容器を介して
流した。プラスチック容器中に保持された停滞した液体のスタックが電気化学的
測定装置を介して通過した時に、120ナノアンペアの(ゼロに合わせたバック
グラウンドまたはベースラインを越える)ピーク電流を記録し、次に、それを戻
して、スタックが通過した時にゼロに合わせた値に近付けた。この試験により、
還元種が生物学的作用によって生成される場合、その還元種の濃度は、電気化学
的測定装置で生じたピーク電流によって容易に測定することができるということ
が確証される。
実施例2:バイパス法の細菌定量試験
この試験では、ナルジェ・カンパニー(Nalge Company)(oチェ
スター、ニューヨーク州)からのシリンジフィルターを用いて細菌を保持した。
セルロースアセテートの滅菌フィルター膜は直径が25mmで、細孔度は0.
45ミクロンであった。フィルター上部を除去し且つ新しい上部を加えて、フィ
ルター表面上の空間の容量を約1/2mlまで増加させた。大腸菌(E、col
i)の純粋な培養物(約1m1)を、フィルター膜を介して濾過した。次に、フ
ィルターカートリッジに、前記の実施例(1)で用いたメチレンブルー、/試薬
流体を満たし、カートリッジを図1に示したような装置ループに入れた。試薬の
導入後に、15分間の保持時間を用いた。
実施例(1)の場合のように、保持時間の終り近(で、試薬をバイパスによって
および電気化学的測定装置を介して移動させて、そこで電流をゼロに合わせた。
次に、試薬流を移動させて、フィルターカートリッジを介して通過させた。滞留
した流体のスタックが電気化学的測定装置に達し5た時に、4.5ナノアンペア
のピーク電流が観察された。
滞留したスタックをカートリッジから移動させることにより、新たな試薬がフィ
ルターカートリッジに入る結果となった。これを再度15分間保持し、電流の変
化の決定を上記のように繰り返した。、4.6ナノアンペアのピーク電流を記録
し、それにより、特定の待ち時間に対して(電気化学的測定装置によって測定さ
れる)生じた還元種の濃度が本質的に一定であることが分かった。
ここでフィルター室を占有した新たな試薬溶液を再度保持し、この時間を30分
間にした。この保持時間に対するピーク電流の決定で、15分間の保持時間に対
して見出された電流のほぼ二倍の9.4ナノアンペアであることが分かった。
この試験により、生じる還元種の量はフィルター室中で保持された時間に比例す
ることが分かった。9. 2 (2X4.6)の予想された値を上回るピーク電
流の僅かな増加は、カートリッジ中の同一の細菌試料について3回試験を実施す
るのに必要な時間中に生じた全細菌数の増加の結果であると考えられる。
実施例3;種々の微生物および種々の試薬組成物に関する定性試験大腸菌以外の
細菌が存在した場合および種々のオキシダントおよび基質を有する試薬に関する
バイパス法のパルスモードによってピーク電流が生じた場合、2種類の追加の試
験で決定を行った。
条件 実施例(1) 実施例(2)
微生物、 酵母 ビー・グロビギー
(B、Globigi i)
オキシダント:メト硫酸フェナジン メチレンブルー基質: D−グルコース
コハク酸ナトリウム緩衝液・ リン酸塩 リン酸塩
それぞれの場合の試験で、15分間の保持時間後に容易に測定可能なピーク電流
が示された。
本発明により、還元種の濃度を正確に且つ敏感に測定する能力を考案したが、そ
れによって電気化学的測定が実際的且つ有用となる。好ましい方法では、生じた
電流の変化率を測定する先行技術の方法に対して提案されたように、電気化学的
測定装置で生じた電流の大きさを直接測定する。更に、本発明では、試薬、混入
物および電子ノイズからのバックグラウンド寄与率に対して電流測定値を完全に
補正する。これは、オキシダント(酸化された種)および基質を含む試薬を、フ
ィルターカートリッジ中で滞留している細菌を介して、そして次に、電流の大き
さを測定する電気化学的測定装置を介して移動させることによって達成される。
引き続き、同じ試薬をバイパスを介してフィルターカートリッジへ移動させるこ
とにより、バックグラウンド電流の尺度が与えられ、それをフィルターカートリ
ッジ流路での全電流測定値から減じて、細菌作用のみによって生じた真の電流成
分を与える。この電流成分は、順次に、細菌個体数に比例するように予め確立さ
れた還元種の濃度に比例することが分かった。したがって、新規の方法に対して
、注入プレート計数(プレート計数)の独立の方法によって決定された細菌個体
数は、本発明の新規の電気化学的方法と十分な相関関係を示すものであることが
予想される。
追加の開示
上記に引用したシルバーマン/ブレイクの特許に、印加電圧、pH1温度、酸素
の脱離等のような因子が記載さねているので、(これらの因子のいくつかに関し
て上記を簡単に参照したことを除き)これらを本明細書中には記載しない。特定
の物質等に関するような、引用した特許に記載された他の因子は、それらが引用
し、た特許に既に記載さねているので、本明細書中では部分的にのみ論及される
。。
本明細書中で特に論及される引用された特許の部分は、細菌の個体数の決定に関
するものである。しかしながら、本出願人の本方法は、主として生菌の個体数の
決定に対して向けられていることが強調される。
細菌からの可溶性混入物の前記洗浄は、蒸留水で行うのが好ましい。
本出願人がここで用いたピコ電流計は、オハイオ州、クリーブランドの、カイス
リー・インスツルメンツ・インコーホレーテッド(Keithley Inst
ruments、Inc、)によって製造された485型である。本出願人がこ
こで用いたフィルターカートリッジは、ニューヨーク州、ロチニスターのナルジ
ェ・カンパニーによって製造されたカタログ番号190−2045である。
本出願人がここで用いた電気化学的測定装置は、電力電極としてステンレス鋼製
チューブ21を含む。ここで用いた且つ好ましい参照電極は、多数の発売元から
購入することができる銀/塩化銀参照電極である。他の参照電極、例えば、引用
された特許において論及されたカロメル電極を用いることもできる。
好ましい測定用電極20は、カリフォルニア州、フラートンのファンタム・エレ
クトロ−ディベロブメント(Quantum Electro Devel。
pment)によって製造される。この測定用電極は、ポリカーボネートから製
造された円筒形室19に収容された黒鉛の回転中実ロッドを含み、ロッドおよび
室壁の間の隙間は僅か領 005インチである。ロッドは長さが1〜7/16イ
ンチであり、直径が約172インチである。アセンブリーの保持容量は約1/4
CCである。ロッドをその中心に通して、316ステンレス鋼の攪拌ロッドヲ収
容し、それが封止手段によって駆動軸へと通じる。駆動モーターは、ハウジング
室の一端に取り付けられる。電極アセンブリーは円滑に且つ最小の音波ノイズお
よび電気ノイズで作動する。電極表面全部を流体全体に正確に同じ速度で回転さ
せ、この速度は先行技術と比較して比較的遅い。電極の好ましい回転速度は40
0回毎分である。(黒鉛は、ペンシルバニア州、セント・メジーズのスタックボ
ール・カーボン・カンパニー(Stackpole Carbon Compa
ny)から得られる。規格値は密度1.85およびグレード1336である。)
回転ペドル、線材ループ、滴下液状金属、毛管、平板、ロッド等を含む多数の設
計の測定用電極があることが強調される。(前記の)使い捨て装置も用いられた
。
本発明では、細菌が測定用電極に接触するのを妨げる工程を用いるので、測定用
電極の変化が生じるのが先行技術の場合よりもはるかに少ないと考えられる。
しかしながら、本出願人は、測定用電極が時間毎に試験されることを好んで用い
ている。したがって、測定用電極が細菌汚染および頻繁な滅菌法から保護される
としても、測定用電極活性が適当で且つ一定であることを保証する必要がある。
このような保証を与える好ましい正確な方法は、電極活性を時々校正すること、
そして細菌計数の最後の計算でこの校正を用いることである。したがって、本出
願人は、試験を実施する前後または、その操作が好都合であると考えられる場合
はいつでも、電極の感度を測定する手段を用いる。電気化学的測定装置の校正は
、細菌計数の際に測定される既知量の特定の還元種によって生じる、電気化学的
測定装置で測定された実際の電流を決定することによって全て含めて行うことが
できる。「標準溶液」をこの試験用に用い、電気化学的校正流体と称することが
できる。それによって、可変面積、可変流体力学および表面活性は、ある単一の
校正定数に(還元レドックス種の1モル当りの電流の単位で)組合されることに
な電気化学的測定装百は、それを介して流体を移動させ、その流体には既知の濃
度の還元レドックス種が含まれ、そして得られた電流を測定することによって校
正されることが強調される。
更に、レドックス(酸化/還元)対は、2種類の酸化状態が平衡状態で存在する
ことができ且つ化学的または電気化学的反応によって一方の状態からもう一方の
状態に変化することができる有機化合物、例えば、メチレンブルー、/ルフメチ
レンブル一対であることが強調される。選択されたレドックス対の酸化種は試薬
流体中に存在する。その機能は、通常、どんなオキシダントでも、細菌によって
その自然環境中で用いられたものは、その役割があるということである(02.
504=、N0s−またはC03=等)。この新規のオキシダント(または媒体
)は、(試薬によって更に与えられる)基質と反応して、細菌のための新規のエ
ネルギーサイクルを生じる。
与えられた新規のオキシダントは、(a)細菌によってエネルギーサイクルで用
いられることおよび(b)電気化学的に容易に再酸化される還元種を生じること
ができる。多数の物質はオキシダントとして用いることができるしまたは2種類
以上のカクテル混合物であることができる。適当なオキシダントは周知の染料媒
体、例えば、メチレンブルー、2.6−ジクロロインドフェノール、インジゴ二
硫酸塩、フェノサフラニン、メト硫酸フェナジン等から選択することができる。
他の物質、例えば、ベンゾキノンおよびフェロシアニドも有用であることが分か
った。
基質は、細菌(またはその酵素)によって触媒される反応においてレドックス対
の選択された酸化種と結合して、望ましい還元種を生じる物質である。多数の有
機物質が、この目的に対する種々の用途で有用であることが分かった。これらに
は、単糖、例えば、グルコース、ラクトース、デキストロース、フルクトース等
および酸化サイクル中の他の中間物質、例えば、ピルビン酸塩、コハク酸塩、リ
ンゴ酸塩、クエン酸塩、−ケトグルタル酸塩、酢酸塩、乳酸塩等がある。酸化種
に関するように、2種類以上の基質のカクテル混合物が好都合であることがある
。
試薬は、細菌に触媒された反応のためにその細菌によって必要とされる成分ヲ供
給して、還元種を生じる特定の溶液である。試薬は有機レドックス対の酸化状態
(例えば、レドックス対であるメチレンブルー/ルコメチレンブルーのメチレン
ブルー)、触媒反応に必要とされる基W(例えば、グルコース)および望ましい
pHa度を維持するのに適当な緩衝成分を含む。試薬は酸素不含で且つ無菌であ
る。
前記の詳細な説明は、単に、図面および実施例によって与えられたように明確に
理解されるべきであり、本発明の精神および範囲は添付の請求の範囲によっての
み制限される。
補正書の翻訳文提出書
(特許法第184条の8)
平成 4年 5月 72I艮1
Claims (43)
- 1.細菌個体数を電気化学的に決定する方法であって、細菌個体数が測定される 細菌を含む流体の試料を提供し、該試料を瀘過して瀘液を得て、該瀘過工程は該 細菌が核瀘液中に存在するのを妨げるように実施され、 該瀘液に関する電気化学的測定を、該細菌と接触のない電極手段を用いることに よって行い、そして 該電気化学的測定の結果を用いて、該試料中の細菌の個体数を決定することを含 む前記の方法。
- 2.前記の細菌が、実質的に酷使されなかった生菌である請求項1に記載の方法 。
- 3.前記の方法が、該電気化学的測定を、レドックス対および、測定用電極を含 む電気化学的測定装置を用いることによって行い且つ該装置の該測定用電極を該 瀘液に暴露するが該細菌には暴露しないことを更に含む請求項2に記載の方法。
- 4.前記の細菌が生菌であり、そして前記の方法が、(1)該細菌を洗浄して、 そこから混入物を除去し、(2)前記の洗浄された細菌を、レドックス対の酸化 種を含む試薬中に存在させ、(3)該細菌に、該酸化種の還元種への漸進的変換 を触媒させ、(4)該細菌を該試薬から瀘過し、そして(5)前記の工程(4) から得られた瀘液と接触し且つ該細菌と接触していない電気化学的測定装置を用 いて、該電気化学的測定を行うことを更に含む請求項1に記載の方法。
- 5.前記の方法が、該試薬と接触している該細菌を、充分な該酸化種が還元種に 変換され、有意の読取りが該電気化学的測定装置によって行われるのに十分に長 い時間維持することを更に含む請求項4に記載の方法。
- 6.前記の方法が、フィルターを含む小容量のフィルターカートリッジによって 該瀘過工程を実施することを更に含む請求項1に記載の方法。
- 7.前記の方法が、試薬中の該細菌が入っている比較的大きい容量の容器の出口 側にフィルターを与え且つ該フィルターを介して該試薬を瀘過することによって 該瀘過工程を実施することを更に含む請求項1に記載の方法。
- 8.前記の方法が、前記の言及した工程を、同じ方法であるが、種々の個体数の 細菌を含む種々の試料に関して繰り返し、それによって、前記の種々の試料中の 細菌個体数を決定することを更に含み、そして更に、細菌個体数に関する電気化 学的測定値を同等にする定数を用いることを含み、該定数は、該試料の一部分に 関する細菌の非電気化学的計数を行うことによって決定される、請求項1〜7の いずれか1項に記載の方法。
- 9.細菌個体数を測定する方法であって、最初の一定量の選択された流体を、容 器を介し、そこから、該容器の下流側に与えられたフィルターを介し、そしてそ こから、電気化学的測定装置を介して、測定される試料からの細菌が、該フィル ターの上流側の前記の最初の量中に存在し且つ該装置側には存在しないような方 式で通過させ、第二の一定量の該流体を該容器および該フィルターとは別個に該 装置中に、そして該装置に、該フィルターを介して通過した実質的な流体が存在 していない時のある時点で導入し、前記の第二の量は細菌を含まないものであり 、該装置を用いて、前記の第一の量の少なくとも一部分が該装置に存在する時に 少なくとも1回、そして前記の第二の量の少なくとも一部分が該装置に存在する 時に少なくとも1回電気化学的測定を行い、そして該細菌の個体数を、該フィル ターからの該流体が該装置に存在する場合に該装置によって測定された平均シグ ナルと、該フィルターからのものではない該流体が該装置に存在する場合に該装 置によって測定された平均シグナルとの差から算出する前記の方法。
- 10.前記の方法が、該流体の共通の原料を提供し、該細菌を該容器中で提供し 、次に、ある時間中に、該原料からの該流体を該容器および該フィルターを介し て該装置へ通過させ、そして次に、別の時間中に、該原料からの該流体をバイパ スを介して、該容器およびフィルターとは別個に該装置へ通過させることを更に 含む請求項9に記載の方法。
- 11.前記の方法が、前記の第一の量の流体の該フィルターを介する前記の通過 の前に、該細菌を該フィルターの上流表面上に存在させることを更に含む請求項 9に記載の方法。 11.前記の方法が、測定される種々の細菌試料に関して前記の方法を正確に繰 り返すことを更に含む請求項9に記載の方法。
- 12.前記の方法が、該フィルターを含む小容量のカートリッジを該容器として 用いることを更に含む請求項9に記載の方法。
- 13.前記の方法が、実質的容量を有する容器を該容器として用いることを更に 含む請求項9に記載の方法。
- 14.前記の方法が、レドックス対の酸化種を含む試薬を該流体として用いるこ とを更に含み、該酸化種が、該細菌によって還元種に漸進的に触媒されるように 適合され、該電気化学的測定装置が、該還元種の量に関係した電流を生じるよう に適合され、前記の方法は、該装置中に該容器およびフィルターを介して通過し た該流体が存在する場合に、該装置が有意の電流を生じるように実施され、該装 置は、その中に該フィルターを介して通適しなかった該流体が存在する場合にバ ックグラウンド電流を生じ、そして電流の差を、該試料の一部分に関する非電気 的方法によって予め得られた細菌計数に対して前記の差を相関させることによっ て得られた定数を用いることによって細菌計数に相関させる、請求項9〜13の いずれか1項に記載の方法。
- 15.前記の方法が、前記の第一の量の流体の少なくとも一部分を該容器中で実 質的な時間維持することを更に含み、前記の時間は、該流体の該部分が該フィル ターを介して該装置へ通過した後に、該装置が、前記の第二の量からの流体が該 装置に存在する場合にそれによって生じたシグナルよりも有意に大きいシグナル を生じるように十分に長い、請求項9に記載の方法。
- 16.細菌の個体数を決定する方法であって、細菌の試料を提供し、 該試料からの細菌をフィルターカートリッジ中のフィルターの上流側に集め、試 薬流体を提供し、 該試薬流体を該フィルターカートリッジを介して測定された平均流量で移動させ 、 前記の最後に言及した工程から得られた瀘液を電気化学的に測定して、該試薬流 体に対する細菌作用の結果を決定し、そして前記の最後に言及した工程から得ら れた電気化学的測定値および前記の測定された平均流量を用いて、該試料中の細 菌の個体数を計算することを含む前記の方法。
- 17.該試薬流体が、有機レドックス対の酸化種および基質物資を含む氷基流体 であり、該基質物質が、該酸化種と該基質との触媒化学反応を誘発することによ って該レドックス対の還元種を生じる該細菌によって利用可能である、請求項1 6に記載の方法。
- 18.前記の方法が、該試薬流体を該フィルターカートリッジを介して連続流と して移動させることを更に含む請求項16に記載の方法。
- 19.前記の方法が、該試薬流体を該フィルターカートリッジを介して断続流と して移動させることを更に含む請求項16に記載の方法。
- 20.前記の方法が、測定用電極を用いて前記の測定を行うことを更に含み、そ して前記の方法が、前記の測定が測定時間中に該測定用電極で生じた積分シグナ ルであるようにすることを更に含む請求項16に記載の方法。
- 21.前記の方法が、該試薬流体を該フィルターカートリッジを介して種々の流 量で移動させることを更に含み、前記の測定が、比較的高い流量の期間中に測定 用電極でシグナル振幅を測定することによって行われる、請求項16に記載の方 法。
- 22.細菌個体数を決定する方法であって、細菌の試料を提供し、 試薬流体を提供し、 細菌の該試料を該試薬流体と混合することによって第二の試料を製造し、該第二 の試料を、該細菌を保持するフィルターを介して通過させることによって、該第 二の試料からの細菌を含まない瀘液を提供し、該瀘液において、該第二の試料中 の細菌作用の結果を電気化学的に測定し、そして 前記の最後に挙げた工程によって得られた前記の測定を用いて、前記の最初に挙 げた試料中の細菌の数を計算することを含む前記の方法。
- 23.前記の最初に挙げた試料を、商業用設備で該フィルター上に細菌を沈殿さ せることによって生成する請求項22に記載の発明。
- 24.前記の方法が、該瀘液を貯蔵し、それを後にもう一度電気化学的に測定す ることによって、該第二の試料中に混入物が存在する結果得られた電気化学的測 定に対する影響を決定することを更に含む請求項22に記載の方法。
- 25.細菌個体数を決定する方法であって、細菌の試料を提供し、 有機レドックス対の酸化種と、細菌によって利用可能な基質物質とを含む試薬を 提供し、該酸化種および該基質間の触媒化学反応を誘発して該レドックス対の還 元種を生成し、 電気化学的測定手段を提供し、 該試薬および該細菌が、十分な量の該還元種が生成されるような十分な時間互い に接触するようにして、該還元種および該電気化学的測定手段が互いに接触して いる場合に該電気化学的測定手段において有意のシグナルを生じさせ、該試薬お よび還元種をフィルターを介して通過させて、該細菌を含まない瀘液を生成し、 該瀘液が該電気化学的測定手段と接触するようにし、該電気化学的測定手段によ って、それらと該瀘液との前記の接触の結果として生じたシグナルの読取りを行 い、 次に、該瀘液中に存在する可能性のあるあらゆる混入物が有意の追加量の還元種 を生じることができる十分な時間、該瀘液を貯蔵し、次に、前記の貯蔵した瀘液 が該電気化学的測定手段と接触するようにし且つ得られたシグナルを読取り、 該シグナルの最初に挙げたものと、該シグナルの第二に挙げたものとを相関させ 、そして 前記の相関の結果を用いて該試料中の細菌の個体数を決定することを含む前記の 方法。
- 26.細菌個体数を決定する方法であって、細菌試料を提供し、 試薬流体を提供し、 該試料および該流体を互いに混合して、細菌および流体の第一の混合物を提供し 、それは該細菌の該流体中の第一の濃度を有し、該細菌の該流体中の前記の濃度 を変化させることによって、全く同一の流体が該細菌の該流体中の第二の濃度を 有するようにし、該流体中の細菌作用を該第一の濃度および該第二の濃度で電気 化学的に決定し、そして 電気化学的測定値の結果を用いて該試料中の細菌の個体数を計算することを含む 前記の方法。
- 27.該試薬が、有機レドックス対の酸化種および基質物質を含む水基流体であ り、該基質物質は該細菌によって利用可能であり、該酸化種と該基質物質との触 媒化学反応を誘発して、該レドックス対の還元種を生じ、そして前記の濃度変化 が該細菌の瀘過によって行われる、請求項26に記載の方法。
- 28.該電気化学的測定値が、前記の瀘過の結果得られた瀘液中で、該細菌と接 触していない電気化学的測定手段によって得られる請求項27に記載の方法。
- 29.細菌個体数を決定するフロースルー法であって、液体をフィルターを介し てポンプで送るように適合されたポンプを提供し、該フィルターの下流側に電気 化学的測定装置を提供し、細菌の試薬中試料を提供し、該試薬は、有機レドック ス対の酸化種と該細菌によって利用可能な基質物質とを含む流体であり、該酸化 種と該基質との触媒化学反応を誘発して該レドックス対の還元種を生じ、該ポン プを用いて、該試薬を該フィルターを介して該電気化学的測定装置にポンプで送 ることを、前記のポンプ輸送を行っている時間の少なくとも一部分の時間中に、 有意の還元種が、該細菌の存在の結果得られた触媒作用によって生成されるよう な方式で行い、 時間対シグナルの曲線を生じ、該シグナルは、該電気化学的測定装置の一部分を 形成する測定用電極で存在し、そして前記の曲線を用いて、該試料中の細菌の個 体数を決定することを含む前記のフロースルー法。
- 30.前記の方法が、該曲線をデータ処理機で生じ且つ該曲線の下方の面積を、 細菌個体数を決定する前記の工程で決定することを更に含む請求項29に記載の 方法。
- 31.前記の方法が、該試料からの細菌を該フィルターの上流側に集めた後、該 細菌を該試薬と接触させることを更に含み、そして更に、該細菌からの混入物を 洗浄した後に該細菌に該試薬を接触させることを含む請求項29に記載の方法。
- 32.前記の方法が、該細菌を該フィルターの上流面に集めた後、該細菌に該試 薬を接触させることを更に含み、更に、最初の一定量の該試薬を該フィルターを 介してポンプで送って、該細菌からの混入物を洗浄することを含み、そして更に 、前記の洗浄の結果得られた瀘液によって得られたすべての測定を、前記の細菌 個体数の決定において無視することを含む請求項29に記載の方法。
- 33.前記の方法が、追加量の該試薬を該フィルターを介して且つ該電気化学的 測定装置にポンプで送り、バックグラウンドシグナルおよびあらゆる残留混入物 の結果を示すバックグラウンドまたはベースラインを決定し、そして前記のバッ クグラウンドまたはベースラインを、該電気化学的測定装置による次の測定値か ら減じることを更に含み、それによってその結果がバックグラウンドシグナルま たは混入物によって生じたシグナルとは実質的に無関係である、請求項32に記 載の方法。
- 34.前記の方法が、追加量の該試薬を該フィルターを介して且つ該電気化学的 測定装置にポンプで送り、バックグラウンド電流およびあらゆる残留混入物の結 果を示すバックグラウンドまたはベースラインを決定し、そして前記のバックグ ラウンドまたはベースラインを、該電気化学的測定装置による次の測定値から減 じることを更に含み、それによってその結果がバックグラウンドシグナルまたは 混入物によって生じたシグナルとは実質的に無関係である、請求項29に記載の 方法。
- 35.前記の方法が、該フィルターを介する前記の試薬のポンプ輸送を断続的に 行い、そして該試薬を、該電気化学的測定装置の測定用電極が比較的高いシグナ ルをそこで有するようにするのに十分長い1種類以上の時間中、該細菌と接触し たままにすることを含む請求項29に記載の方法。
- 36.前記の方法が、シグナル−時間曲線の下方面積を、細菌個体数の前記の決 定において用いることを更に含む請求項35に記載の方法。
- 37.前記の方法が、シグナルのパルスの振幅を用いて、該細菌の個体数を決定 することを更に含み、該パルスは、該試薬が、有意の還元種の生成を引き起こす のに充分な実質的な時間、該細菌と接触した状態にあった場合の時間に続いて、 該電気化学的測定装置に通過した試薬の結果である、請求項35に記載の方法。
- 38.予め決められた容量の細菌試料中の細菌の個体数を決定する方法であって 、 電気化学的測定装置を提供し、 有機レドックス対の酸化種と、測定される細菌によって利用可能な基質物質とを 含む流体である試薬を提供し、該酸化種と該基質との触媒化学反応を誘発して前 記のレドックス対の還元種を生成し、該試薬中に測定される細菌を提供し、 該細菌が該電気化学的測定装置と接触するのを妨げるが、該細菌の存在によって 触媒された還元種を該電気化学的測定装置と接触させ、そして得られたシグナル を該測定装置で用いて、該試料中の細菌の個体数を決定することを含む前記の方 法。
- 39.細菌個体数を決定する方法であって、予め決められた量の試料からの細菌 を工業現場で小容量のフィルターカートリッジ中のフィルターの上流側に集め、 該細菌を生菌の酷使されない状態で該カートリッジ中に保持し、該カートリッジ および含まれた細菌を試験室へ輸送し、試薬流体を、該カートリッジを介して直 接該フィルターの該上流側からその下流側へ移動させ、そして 前記の予め決められた容量の試料中の細菌の個体数を、前記の最後に論及した工 程によって生じた瀘液に関する電気化学的測定を行うことによって電気化学的に 決定することを含む前記の方法。
- 40.前記の方法が、該カートリッジを介する該試薬の前記の移動の前に、該細 菌を洗浄することを更に含む請求項39の方法。
- 41.細菌個体数を電気化学的に決定する方法であって、計数される試料からの 細菌が中に集められたフィルター容器を提供し、試薬流体を、該容器を介し且つ その中のフィルターを介して移動させ、該容器中の細菌によって生じた還元種の 電気化学的測定を行い、該電気化学的測定は、該容器からの瀘液中で行われ、そ して該試薬の流量、電気化学的シグナルおよび時間の関数として細菌計数を決定 することを含み、上記に論及した工程は、該電気化学的シグナルの直接反応を細 菌に対する特徴とするように実施されるが、あらゆる混入物の存在を無効にする ことを特徴とする前記の方法。
- 42.細菌個体数を電気化学的に決定する方法であって、計数される細菌を含む 流体試料を容器中に提供し、該流体試料を、該容器からフィルターを介して移動 させ、同時に、瀘液流中に存在する還元種を電気化学的に測定し、そして細菌計 数を、変化する細菌濃度、電気化学的シグナルおよび時間の関数として決定する ことを含み、上記に論及した工程は、電気化学的シグナルの第二の導関数が細菌 に対する特徴であるように実施されるが、混入物を無効にすることを特徴とする 前記の方法。
- 43.細菌個体数を電気化学的に決定する方法であって、細菌個体数が決定され る細菌の試料を含む流体を提供し、フィルターを提供し、 電気化学的測定手段を提供し、 該流体を該フィルターを介して該電気化学的測定手段へと、瀘液が該電気化学的 測定手段においてベースラインシグナルのみを生じるように十分に速い速度で移 動させ、 次に、該流体を該フィルターを介して該電気化学的測定手段へと、該電気化学的 測定手段によって生じた得られたシグナルが該流体中の細菌の個体数に関係する ように十分に遅い平均速度で移動させ、前記の最初に論及したシグナルを前記の 第二の論及したシグナルのためのベースラインとして用い、そして 該細菌の個体数を該シグナルの双方の関数として決定することを含む前記の方法 。
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