JPH05500311A

JPH05500311A - 細菌個体数を電気化学的に決定する方法

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Publication number: JPH05500311A
Application number: JP50053091A
Authority: JP
Inventors: ロールバック，ギルソン・エイチ; ホルムス，エルモンド・エイ
Original assignee: インフォメトリックス・インコーポレーテッド
Priority date: 1989-11-07
Filing date: 1990-11-02
Publication date: 1993-01-28
Also published as: WO1991006670A1; EP0499624A4; EP0499624A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】細菌個体数を電気化学的に決定する方法先行技術およびその制限数十年間にわたって、細菌の個体数を決定するための様々な電気化学的方法が提唱されてきた。基本的な方法は、発明者、エイチ・ピー・シルバーマン（Ｈ。

Ｐ、Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ）およびノエイ・エム・ブレイク（Ｊ　、　Ｍ、Ｂ　ｒ　ａ　ｋ　ｅ　）の、「電気化学的分析による微生物個体数、酵素活性および基質濃度の決定方法（Ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ、Ｅｎｚｙｍｅ　Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ、ａｎｄ　５ｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｂｙ　Ｅｌｅｌｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ）Ｊと称する米国特許第３，５０６，５４４号明細書に開示されている。前記の特許第３．５０６．５４４号明細書は、参考文献として本明細書中に記述される。

引用したノルバーマン／ブレイクの特許には、二段階の反応工程、すなわち、第一に、細菌または酵素に触媒された酸化／還元反応が生じ、そして第二に、第一の工程で生成された還元種（還元された形態、状態または物質）の電気化学的酸化反応を行って、測定可能な電流を生じたことが記載されている。更に詳しく述べると、細菌または酵素試料を、適当な基質および酸化／還元（レドックス）対の酸化種双方を含む特別な水基材試薬と混合した。この試薬／試料混合物を、３種類の電極システム、すなわち、電力電極、参照電極および電流測定用電極が入っている容器に入れた。対照および測定用システムでは、（ａ）参照電極に関して選択された電位で測定用電極を維持し、（ｂ）細菌または酵素の作用によって生じた還元レドックス種をその更に高い元の酸化状態まで酸化させ、そして（Ｃ）この電気化学反応から得られる電流を測定した。

酵素的活性化反応（第一の工程）は全流体量全体に生じるので、電気化学的反応（第二の工程）は測定用電極の表面でのみ生じるが、酵素によって生じた還元種の電気化学的反応による消耗は、還元種の濃度の増加と比較したところ無視できると考えられた。したがって、還元種の濃度は連続的に増加し、電気化学的に生じた電流は比例的に増加した。それはンルバーマン／′ブレイク法に対する「鍵」であり、すなわち、それが決定された電気化学的に生じた電流の増加速度であった。重要な変化および問題を除き、この電流の増加速度は還元種の濃度の増加速度に比例し、それが順に、酵素に触媒された反応の速度に比例し、そしてそれが元の試料中の細菌または酵素の濃度に比例した。

したがって、先行技術に示された電気化学的方法は、試料に関係した電流を測定し、推定された関係、すなわち、（但し、Ｋは校正定数（または比例定数）である）を用いることによって細菌個体数の密度を計算することによって細菌濃度を決定することであった。先行技術では、二〇Ｋが一定であると１５．定したが、本出願人は、多くの場合、それは実際的に一定ではないと考えた。

校正定数または比例定数が一定でないことに関する先行技術の主要な限界に加えて、先行技術のシステムには他の重大な欠点があった。これらには下記がある。

すなわち、（１）多数の細菌種はそれら自体が表面に付着する性質を有し、モして印加電位を有する表面（電極上の場合）、特に、コロニーを作るのに好ましい部分に一様に見出だされることがある。したがって、従来のシステムでは、細菌試料に直接暴露された電極を各試験後に洗浄し且つ滅菌することが必要であった。これは時間をａ費し且つ費用を要する仕事であった。１回使用の使い捨て電極が開発されたが、これらは非常に高価であり、試験費用を法外なものにした。更にもっと厄介なことは、測定用電極に対する細菌の作用であった。細菌はこの電極の特性を変更し且つその電気化学的活性を試験期間中でささえも有意に変化させることがあった。言い換えると、先行技術のシステムでの困難な部分は、流体中の電気活性物質に関する測定用電極の活性の変化によっておよびこのような電極の有効面積の変化によって引き起こされた。

（２）混入物に関する重要な問題があった。本特許出願の文脈においては、混入物を、測定用電極で電流を生じる最初の試験試料中の（細菌自体以外の）任意の物質として定義している。これは前述の「第一の工程」において反応を促進する混入物に起因することがある（概し、て、この混入物は試験の開始前の細菌に由来する遊離酵素である）。これは更に（または或いは）、混入物が、用いられた電位値で測定用電極でそれ自体直接酸化される物質である場合に生じることがある。いずれの作用も、擬似電流および不正確な細菌計数を生じる。試料中に混入物が存在していることによる基本的な問題に加えて、更に、試料毎の混入物濃度の偏差およびそれにより、混入物によって引き起こされる電流の偏差が存在することが多い。与えられたシステムによる試料毎の厳密に一定の混入物電流は、試料の独立プレート計数から誘導される校正定数で補正されると考えられた。しかしながら、これは希な場合である。

（３）細菌個体数の電気化学的測定の分野に従事している多数の従来の発明者は、機械的に酷使することによる細菌に対する損傷を防止するための注意を払わなければならないということを了解していなかった。細菌が十分な機械的応力を受ける場合、それらの膜は破壊されて、溶液の触媒能力を顕著に変更してレドックス対の還元種を生じる（第一の工程）重大な量の酵素を放出することがある。

見掛上穏やかな妨害でさえも、細菌に対して有意の効果を生じることがある。本出願人は、従来のシステムにおいて一般的に用いられた急速にスピンし、回転する電極は、用いられてきた他の磨耗的または破壊的な機械的方法と同様に、細菌の膜を破壊することがあると考えている。

（４）先行技術の別の特徴は、電流が広範囲に変動することが多いということであった。このような変動電流は、結果を説明することまたは細菌係数を確実にすることを困難にした。

先行技術の様々な欠点により、細菌の個体数を決定するための電気化学的システムは実際的有効性が大きいことが証明されていないし、そして商業的重要性も大きくないものであった。これは特に、少ない個体数の細菌の試験に関して当てはまった。

本発明の一般的な目的本発明の（非制限の）目的としては下記がある。すなわち、（ａ）細菌が試験法の際に、それらの細胞膜を破壊し、それによって遊離酵素を生じることがある乱暴な機械的処理を施されないことおよび化学的反応を触媒する細菌の能力を変更することがあるあまり激しくない妨害を受けないことを確実にすること。（ｂ）電極表面の任意の細菌混入物なしに電気化学的測定を行うこと。（Ｃ）ノく・ツクグラウンドによってまたは試料中に存在する任意の混入物によって引き起こされる電流尺度のその部分を決定しまたは補正すること。（ｄ）元の試料中の混入物の量を最初に減少させることによって、試験前に「精製された」試料を製造すること。（ｅ）多数の会社、科学者および専門家によって望まれる細菌計数密度を正確に、比較的迅速に、そして実際的に得ること。

上記の目的および他の目的は、数種類の方法で達成される。これらをここに記載する。

発明の要約第一の新規の且つ改良された方法では、計数される試料から細菌を集めたフィルターカートリッジを用いる。試薬流体をこのようなカートリ・ソジを介して移動させ、細菌によって生じた還元種の電気化学的測定をカートリッジからの濾液中で行う。次に、細菌計数を流体流量、電気化学的シグナルおよび時間の関数として決定する。（本発明の一つの主要な態様による）方法は、電気化学的シグナルの直接反応を細菌に対する特徴とするようにし、同時に、混入物を無効にすることであることが強調される。

第二の新規の且つ改良された方法は、流体試料をフィルターを介して容器から移動さ也同時に、濾液流中で生じた還元種を電気化学的に測定した後、細菌の計数を、変化する細菌濃度、電気化学的シグナルおよび時間の関数として決定する手段を含む。この方法の重要な態様は、その方法が、細菌に対して特徴的な電気化学的シグナルの第二の導関数を作るようにし、同時に混入物を無効にすることである。

本発明の一つの主要な態様により、電気化学的測定は、細菌が存在していなし）濾液中で、流体および細菌双方を含む室で行われた測定とは区別して行われる。

測定は濾液中で行われるので、測定用電極でまたはそれ以外で細菌を機械的に酷使するものは有り得ない。更に、測定用電極またはフィルターを越えた装置の他の部分の細菌汚染の可能性は存在しない。言い換えると、本出願人は、完全な電極アセンブリーを濾液中に入れることによって顕著な改良が達成されることを発見し、このような濾液は、元の試料から細菌を集めるのに予め用いられたフィル −ターカートリランによってかまたは細菌が入っている容器の出口に若しくはそこから下流に位置したフィルターによって生成された。

本明細書中で論及される還元種の「電気化学的」測定法としては、定電位での電極電流および／または定電流での電極電位の尺度を含む電気化学的測定用の標準法および／または電気化学的活性物質の濃度を決定する他の電圧計または電流計による方法がある。

測定用電極は種々の化学的に不活性で且つ導電性の物質、例えば、白金、パラジウム、金、炭素、黒鉛等から、そして多数の標準的な形状、例えば、回転、固定、毛管、棒材、線材等のいずれかで製造することができる。２個の電極計測では、参照電極および電力電極を組合せて、電位を検出し且つ電流を供給する双方に用いられる標準型の可逆電極にすることができる。３個の電極システムは、測定用電極、参照電極および電力電極を含み、４個の電極システムは、測定用電極、電力電極および２個の参照電極を含む。

電気化学的測定を濾液中で行う本発明の態様の様々な形態が存在し、各形態に変法がある。一つの方法によれば、細菌を試験部位でフィルターカートリッジに集めた後、そのカートリッジを、細菌計数密度が決定される実験室に運ぶ。決定は、試薬溶液を細菌含有フィルターカートリッジ中におよびそれを介して通過させることによって、カートリッジ中に存在する細菌が濾液中の実質的な還元種の生成を引き起こすような方法で行われる。次に、試薬はその還元種と一緒に、電気化学的測定装置に流れ、そこで、還元種によって生じた電気化学的作用によって生じた電流が決定される。この電流は、混入物、バックグラウンド電流および電気化学的装置目盛りに対して調整されて、元の試料の細菌計数密度を生じる。

フィルターカートリッジを介する試薬溶液の平均流量は、細菌が有意の還元種を生じるように十分に低くされる。好ましくは、一定流量を用いる代わりに、断続流が存在するような方法を行う。これは、流量を予め決められた時開セロにした後、特定の流量を一定時間用いることＪこよって行われ、電気化学的測定は全操作中に行われる。

上記の部分について詳細に論じ且つ本発明の別の態様を述べると、試薬を、予め決められた容量の元の試料からの細菌が入っている容器、すなわち、極めて好ましくは、小容量のフィルターカートリッジ中に導入する。試薬をカートリッジ中で、その中の全部の細菌が十分な還元種の生成を引き起こして電気化学的測定装置で測定可能な電流を生じるように十分に長い予め決められた時間保持する。

次に、試薬をカートリッジから電気化学的測定装置へ通過させ、測定を濾液中で行う。更に、同一の試薬であるが、カートリッジ中に導入されなかった試薬を、カートリッジとは別の電気化学的測定装置に通過させる。別の測定をこの二番口に挙げた試薬に関して行う。測定値間の差に校正定数を乗じるが、このような定数は元の試料の一部分についての独立の方法によって決定されたものである。次に、他の試料に関して操作を繰り返して、記述したのと同じ工程を用い、予め決定された定数を用いる。

もう一つの形態の方法において、試薬を細菌含有カートリッジを介ｌ、て種々の低流量で通過させ、各流量に関して電気化学的測定装置で測定を行う。それによって、バックグラウンドの影響を補正する。

細菌計数密度を決定する更に別の方法は、通常、前記に示した「カートリッジ」法の場合よりもはるかに大きい容量を用いることになる。元の試料（好ましくは、予め濾過することによって生成された精製試料）を、フィルターが室温出路にある容器に入れる。室中の細菌用に環境調整時間であって、その間に還元種が生成される一定時間後に、還元種を室から抜き取り、電気化学的測定装置を介して通過させる。測定は１．（全く同一の）流体中の実質的に異なる２種類の濃度の細菌に関して行われる。次に、これらの測定値を用いて細菌個体数を決定するが、流体中の任意の混入物の存在ゆえに導かれる誤差は存在しない。極めて好ましくは、２種類の異なる濃度は前記に示した容器からの液体を濾過することによって得られ、次に、電気化学的測定をその濾液中で行う。

更に別の形態による細菌計数の決定法は、流体を濾過し且つ電気化学的測定装置での測定が実施された後に、その一部分を残してお（ことを含む。次に、その残しておいたｍ液によって生じた電気シグナルを決定し且つ電気化学的装置を介する最初の通過で最初に生じたシグナルと比較する。次に、混入物が存在しているか否かを確認し、測定された細菌計数に関して補正を行う。

図面の説明図１は、本発明のバ・子バス法と称することができる方法を実施するための装置の路線図であり、フィルターハウジングの中心部分は、フィルターを示すために破断されている。

図２は、本発明のフロースルー法と称することができる方法を実施するための装置の路線図である。

図３は、本発明の濃度変化法および貯蔵試料法と称することができる方法を実施するための装置の路線図である。

精製試料の生成本明細書および請求の範囲を通して、「荒目フィルター」という用語を用いる場合を除き、「フィルター」という用語はマイクロフィルターを意味する。これは、濾過において細菌を保持するのに適した多数の商業的に入手可能なマイクロフィルターの一つである。これらのフィルターは無菌であり且つ生物学的に中性であり、細胞毒性でも、割線菌性でもまたは段線菌性でもない。

以下に記載した方法を開始する前に、最初の濾過工程を個別に行うのが好適である。これは、多数の工業用システム中に存在する重大な量および種類の混入物のためである。例えば、市販のオキシダントは、通常、細菌および藻類の抑制用に用いられる。塩素、二酸化塩素およびアクロレインはいずれも電気化学的に活性であり且一つ電気化学的測定装置によって生じた電気化学的シグナルに影響を及ぼす。多数の他の殺生物剤、除草剤および殺藻類剤は、種々の水質調節剤と同様に誤差を招く。

化学的処理剤が元の試料中に存在していない場合でさえも、通常、遊離酵素は存在している。これらは、細菌自体からそれらの細胞膜を介する細菌による酵素分泌の正常な方法によって生成されている。これらの酵素の存在は細菌計数密度の読みを高（する。

精製試料は、最初に、原料試料を荒目フィルターを介し、て通過させた後、その荒目フィルターを廃棄し、次Ｊ二、荒目フィルターを介して濾過された濾液を再度（マイクロフィルターによって）ｔａ過し、そしてこのような二番目に記述したフィルター上に細菌を集めることによって生成されるのが好ましい。このような操作から得られる原料濾液を廃棄し、そして以下に記載した操作を開始する。

細菌は生菌のまま、しかも無傷で保持されることが強調される。したがって、例えば、それらはフィルター上で乾燥されることもないし、それらは機械的にまたは他の方法で酷使されることもない。最初の濾過後、精製試料は、濾過された元の試料を採取し７、それを洗浄し、そしてそれを試薬流体と一緒に再構成することによって生成される。

多くの場合、精製試料は試薬それ自体を用いることによって、前の段落に記述した分離工程を行わずに生成することができる９、フィルターカートリッジは、工業プラントの適当な場所、例えば、テストスピゴットに配置することができる。

プラントからの予め決められた容量の流体をスビゴ、トおよびフィルターカートリッジを介して通過させる。次に、カートリッジに試薬流体を満たして、細菌が生菌のまま保持されるようにし、た後、カートリッジの両端に栓をする。カートリッジを、本方法が行われる試験室（ご運ぶかまたはその方法をプラントのその場で行ってもよい。

特別な例として、搾乳場での乳汁を、荒目フィルターが中にあるスピゴ・ソトを介して通過させ、引き続き、フィルターカートリッジを介して徐々に流す。次に、適当な予め決められた量をこのように流した後、カートリッジを外し、細菌計数密度を決定する試験を行うための試験室に回収する。

バイパス法の詳細な説明バイパス法と称することができる方法の説明を助けるものとして、最初に、路線図１に関して、その方法を実施するのに用いるための装置を記載する。しかしながら、図１の装置は電流を測定するが、他の電気化学的シグナル（例えば、電位）も測定することができることが指摘される。好ましくは、必然的ではないが、バイパス法では、１０で示されるようなフィルターカートリッジを用いることになる。これは小容量の密閉容器であり、そこに、典型的に合成樹脂から成形され且つ細菌の通過を妨げるか、液体の通過を許すように結合されたフィルターＦが密封する関係で張られている。カートリッジの典型的容量は約ｌｃｃである。

フィルターを介する流れは遅いのが典型的であり、例えば、１分間当りｌｃｃまたはそれ未満である。フィルターカートリッジ１０に対しておよび他の成分に対して連通ずる導管は、内径が小さいのが好ましく、既述のフィルターカートリッジ１０を介する遅い流れであっても、電気化学的測定装置に刻して濾液が通過するための時間が過剰になることはないということは理解すべきである。

試薬のバッグ（または他の容器）１１は、導管を介してポンプ１２に対して、そして二極−二方向バルブの一部分１３に対して連通している。前記のバルブの他の成分１４は第一の成分１３に対して、例えば、ソレノイド手段によって連通し、その結果、双方の成分１３および１４が同時に作動する。

バルブ成分］３および１４それぞれがある配置にある場合、バッグ１１からの試薬はポンプ１２および成分１３を介してフィルターカットリッジ１０に通過し、そこからバルブ成分１４へ、そして電気化学的測定装置１５へと通過する。フィルターカートリッジが、望ましい場合にカートリッジをシステムから除去することを可能にし且つ望ましい場合に新規のカートリッジを取り付けることを可能にするカップリング１６および１７によってバルブ成分１３および１４と順次に連通していることは理解すべきである。

バイパス１８はバルブ成分１３および１４の間に連通し、それらの間にカートリッジ】０とは別に試薬を導匂バルブ成分１３および１４それぞれが他の配置である場合、試薬はバック１１およびポンプ１２からバイパス１８を介して測定装置１５に流れる。

例示した電気化学的測定装置１５は、断熱性ハウジング１９を有し、その中に測定用電極２０が取り付けられている。ここで示した測定用電極は円筒形の炭素電極であり、ハウジング１９内でモーターＭによって徐々に回転され且つハウジング内で比較的近接して嵌め合わされた関係にある。適当なシールで漏れを防止する。ハウジング内部（電極外部）の室の容量は小さく、好ましくはｌｃｃ未満である。

電気化学的測定装置は、更に、電力電極２１および参照電極２２を含み、後者は導電性プラグ２３によるように、測定用電極２０の回りの室から実質的に隔離されている。測定用電極、電力電極および参照電極は、当該技術分野で周知の印加の端子および電流測定装置Ｐに接続され、一つの例が上記に引用した特許第３゜５０６．５４４号明細書に記載されている。ピコ電流計は図示されていないが、装置Ｐに与えられて、測定用電極での電流の流れを測定する。

参照電極２２が実質的に一定の電位を維持し、そしてそれによって測定用電極自体が実質的に一定で且つ選択された電位を維持することができるその測定用電極の電位を監視することは理解すべきである。これは適当な回路によっておよび電力電極２１から測定用電極への電流の適用によって行われる。

例示した電気化学的測定装置１５において、ハウシング１９からの流体は電力電極２１を通過して廃棄される。

方法の説明に次いで進むと、これは、決定される細菌の個体数である既知の細菌が（既知の容量の元の試料から）集められる上流の表面上のフィルターを介して試薬を通過させることを含む。（細菌の種類は特定の工業システム等での経験によってかまたは顕微鏡による若しくは他の分析によって知られている。）回路に（前に記載したように）カートリッジを接続する前にかまたはフィルターを介する試薬の最初の流量によって細菌を洗浄して混入物を除去する。

このように細菌から混入物を洗浄した後の少なくとも望ましい時間中に、ポンプ１２を操作して、フィルターカートリッジ１０を介する試薬の平均流量が十分に低く、カートリッジ中の細菌が十分に還元種を生成し、測定可能な電流が電気化学的測定装置１５で生じるようにする。

更に明確に述べると、既知容量の元の試料を、工業プラントでかま１こは実験室でフィルターカートリッジ１０を介して通過させる。これにより、カートリッツのフィルターＦの上流表面上に細菌が集まる結果となる。次に、カートリッジに適当な流体を満たし、フィルターＦの上流表面上の細菌と一緒にカップリング１６および１７によって回路に入れる。次に、ポンプ１２並びにバルブ成分１３および１４を操作して、バッグ１１からの試薬を、フィルターカートリッジ１０およびバイパス１８を交互に介してポンプで送り、フィルターカートリノンを介する流れ方および流速は種々の試料について繰り返すことができる（そして繰り返される）。

電気化学的測定装置１５を用いて、好ましくは全部の時間の電流を測定し、電流の振幅を比較する。言い換えると、バイパスによって引き起こされた電流を、カートリッジによって引き起こされた電流と比較する。例えば、その条件が、電気化学的測定装置中の流体がカートリッジからのものであるようである場合、電流は、細菌によって生じた効果のために比較的高い。もう一方において、電気化学的測定装置中の流体がバイパス１８からのものである場合、電流は、それがバックグラウンド電流であるために比較的低く、電流はカートリッジ中の細菌の作用を典型的に示すものではない。

ピコ電流計によって測定された電流の振幅が繰り返される時点で、試験を終了することができる。言い換えると、同一の電流振幅が、流体がカートリッジからである度に生じ、そして同一の（更に低い）電流振幅が、流体がバイパスからである度に生じる場合に、試験を終了することができる。更に、カートリッジからの流体に関して唯一の読みを得る必要があり、バイパスからの流体に関するものは、与えられたシステムについての予備試験が十分に行われて、その結果が繰り返されることが知られているならば、交互の読みを続けなければならない。

（本明細書中で用いられる「振幅」という用語は、同じ定義を試験毎に用いる限りは、ピーク、積分、最小平均平方等を意味することができ、すなわち、このようにして導かれた変数はいずれも、下記に示す定数部分である。）その方法は、更に、電気化学的測定装置中の流体がバイパスからのものである場合に生じた電流を、流体がフィルターカートリッジからのものである場合に生じた電流から減じることを含む。次に、この電流の差に定数または比例定数（Ｋ１）を乗じて、このようにして、元の試料における１ミリリットル当りのコロニー形成単位（ｃ　ｆ　ｕ’　ｓ）中の細菌計数密度を読み取る。この定数（Ｋ、）は、試料毎に操作が繰り返される場合に、本方法によって決定された細菌計数に相関するものであり、計数は、元の試料の一部分についての独立手段によって得られた（例えば、プレート計数）。

電気化学的測定装置中の流体がバイパスからのものである場合のそれぞれの場合の（ピコ電流計による）電流読みが読取り毎に極めて一定であるならば、流体がカートリッジからのものである場合に生じるピコ電流計の読みは、たとえこのようなピコ電流計の読みが、液体がバイパスからのものである場合の読みよりも僅かに大きいだけだとしても有意である。一方、「バイパス」の読みが極めて少ない場合、「カートリッジ」の読みが「バイパス」の読みに関する場合よりも極めて大きくなるように試験を実施することが望ましい。後者の場合、「カートリッジ」の読みが、「バイパス」の読みの変化を少な（とも２回または３回生じさせることが望ましいことが多い。

断続流を伴う本バイパス法は、発明者によって考えられた一つの最良の態様である。

カートリッジを介する一定のまたは断続的流量は、バルブ１３および１４が、ポンプ１２からの試薬が（当然ながら）ポンプがオンであるかまたはオフであるかに応じてカートリッジを介して通過するような位置にある場合の全部の時間に用いることができる。バルブ１３および１４の位置を換えて、試薬がカートリッジを介する代わりにバイパス１−８を介して通過するようにする場合、カートリッジを介する流れはゼロである。

バルブ１３および１４をバイパス位置に切り替える時間の長さは、カートリッジ１０を介する流れが存在しないので、好ましくは、既知の方法で、すなわち、試料毎に変化し、すなわち、予想される（または試験の初期段階で決定される）細菌計数に関係する。例えば、細菌計数が低い場合、試薬が流れることなくカートリッジ１０に残される時間の長さは比較的長（なる。一方、細菌計数が高いと予想される場合、試薬がカートリッジ１０に残される時間の長さは比較的短くなる。双方の場合において、その時間は、細菌が十分な還元種を生じて電気化学的測定装置に有意で且つ意義深い測定を行わせるようにある。

電流読みと細菌計数密度とを相関させる種々の定数が存在する。例えば、カートリッジ中の３分間のゼロ流に対する一つの定数およびカートリッジ中の９分間のゼロ流に対するもう一つの定数が存在する。これらの定数は双方とも、９分間および３分間の双方の時間で補正細菌計数密度読みを生じるようなものである。

双方の定数は、前述のように、それらが何度も繰り返されるようになった後に、電流読みと、（例えば）同一容量の試料のプレート計数によって決定される細菌計数密度とを相関させることによって決定される。

ポンプ１２は、システムが１−バイパス」状態にある場合、バイパスからの流れが電気化学的測定装置に達し且つカートリッジからの濾液を有するそれをパージしたら直ちに停止されるのが好ましいことは理解すべきである。この状態は、ピコ電流計が最小電流を読み取ったら直ちに存在することが分かる。逆に、システムが「カートリッジ」状態にある場合、ピコ電流計は次に最大読みを示すので、濾液がバイパスからの試薬を有する電気化学的測定装置にパージしたことが分かる。

上記に記載された特定の電気化学的方法では、細菌個体数を決定するための出カングナルとして電流の測定を用いるが、方法はそれに制限されない。還元種の決定に適し、た任意の他の方法、例えば、電位差測定器を用いる方法で置き換えることができる。

多数の用途において、下記の副題のもとに記載したように、データ処理機を用いるのが好適である。

フロースルー法の詳細な説明フロースルー法は、細菌、すなわち、予め決定された量の元の試料からの細菌の試料が入っているフィルターカートリッジ（または他の容器）を介して試薬を移動させ、モして濾液流中の還元種を測定することを含む。二組のデータ、すなわち、流量対時間および還元種を示す電流対時間をデータ処理機で用いて、細菌計数密度を決定する。

フロースルー法は発明者によって考えられたもう一つの最良の態様である。

図２を論及すると、フロースルー法を実施するのに用いるための装置の一つの形態が示されている。電気化学的測定装置１５は、図１に関して記載した装置１５と同一である。図１の場合と同様に、フィルターカートリッジ１０は装置１５に連通し、カートリッジはカップリング１６および１７の存在ゆえに着脱可能である。図２において、試薬ポンプはシリンジ２５であると図示され、そのピストン２６はモーター２７によって駆動される。モーター２７は、モーターおよび／またはピストン位置を検出し、そして流れのデータを２８で図示されたデータ処理装置および細菌読取り装置に伝達する検出手段または他の手段と組合わされる。

装置２８は、更に、測定用電極から電流データを供給する。装置２８に対する流れのデータの伝達は矢印２９によって示され、それに対する電流データの伝達は矢印３０で示される。図１に関して示した印加装！および電流測定装置Ｐは、図２の装置にも直線的にかまたは対等に存在する。例えば、図２で「電気化学的測定装置」と標識されたボックスは、図１の「印加および電流測定」ボックスを組み込むこともできる。或いは、例えば、ピコ電流計がデータ処理ブロック２８に与えられてもよい。

カートリッジ１０中のフィルターＦを介する一定流量の試薬が存在する場合、すなわち、モーター２７を一定速度で操作する場合、細菌計数密度は、電気化学的測定装置１５によって検出され且つデータ処理装置２８に伝達された平均電流を調節する定数に等しい。このような一定の流量は、細菌の濃度が極めて高い場合、またはポンプを極めて遅い（本副題のもとに下記に記述した実施例の場合よりも明らかに遅い）流れを生じるように操作する場合に用いることができる。

フロースルー法の好ましい形態において、細菌計数の決定は、カートリッジを介する２種類の異なる流量で測定を行うことによって達成される。

流れが一定であるか、断続的であるかまたは可変的であるかということは、種々の試料に関して試験毎に繰り返される。更に、全部の状態が試験毎に同じに保持される。次に、試験の各種類に対しては、すなわち、（流れがコンピューターによって決定される場合の）各コンピュータープログラムに対しては、平均電流と実際の細菌計数密度とを相関させる定数（Ｆ２）が知られている。この定数は、試験の各種類に対して、（例えば）プレート計数を得ることによって誘導される。

次に、Ｃ本発明の全実施態様の）後者の試験に対して、同じ定数を繰り返し用いる。

カートリッジ中のフィルターを介する流量があらかじめ決定された時間に対してゼロであるようにする場合、カートリッジ１０中に還元種が蓄積する。次に、流れが予め決定された時間の最後に開始される場合、その流れは、このようにして蓄積された還元種を電気化学的測定装置１５に対して且つその中に移動させる。

装置１５で生じた電流の積分は、装置１５に対する特異的蓄積の伝達から結果として生じる電流パルス（電流対時間の曲線）に基づく面積である。流れのプログラムを正確に繰り返すことができ且つ試料毎に繰り返す場合、（例えば、データ処理機２８で生じた）曲線に基づくパルスの振幅および面積の間には一定の比率が存在する。したがって、細菌計数密度は、電流が、カートリッジから受け取った蓄積の存在ゆえに装置１５で得られたパルスの振幅である場合には、電流を調節する定数に等しい。

本フロースルー法と先行技術との根本的な違いは、フロースルー法は細菌個体数を決定するために電流の変化率を測定しないということである。その代わりに、本フロースルー法は、一定の平均流量で、測定用電極を流れる平均電流を測定する。

フロースルー法の好ましい形態の一つの態様により、特に、細菌密度が低い場合、試薬を、カートリッジ１０中のフィルターを介して、極めて少ない還元種が生じるように非常に速い速度で通過させる。フィルターから電気化学的測定装置に通過した大部分の液体は試薬のみであり、還元種ではないという結果となる。

データ処理機に伝達された得られた電流は、適切に、バックグラウンド電流とみなされ、洗浄後の細菌中に存在することがある任意の残留混入物を含む説明因子として考慮されるバックグラウンド電流である。

フロースルー法の例を述べると、フィルターの寸法は、（容量がｌｃｃであり、流量が、例えばｌｅｅ／分である）試薬の第一のパルスがフィルターカートリッジから残留混入物の大部分を洗い落とすような寸法であることが推定される。次に、同様にＩＣＣ１１ｃｃ／分である第二のパルスはバックグラウンド電流を生じる。これにより、再度、カートリッジ中の細菌計数密度は、ｌｃｃ／分で極めて少ない還元種を生じるように十分に低いということが推定される。次に、これらの最初の２種類のパルスの後に、ポンプを停止し、例えば、１５分間の遅れを生じさせる。次に、その遅れの後、ポンプを再度始動して、フィルターを介する流れを速度ｌｃｃ／分で引き起こす。これは、濾液のパルス、スラップまたは容量を電気化学的測定装置１５へと前進させる。次に、ピコ電流計またはデータ処理機２８によって示される電流は、実質的還元種を含むこのようなパルスが装置１５に入り始めた時に示され、すなわち、続いて生じたシグナルは還元種の濃度に関係する。このようなスラップが測定装置を介して通過した場合、シグナルは、予め測定されたのと本質的に同じバックグラウンド電流に戻る（これがベースラインである）。そのとき、細菌計数はスラップをバンクグラウンド電流未満で保持することによって生じた電流の平均振幅を調節する定数（Ｆ２）に等しい。

細菌計数密度は、データ処理機によって、例えば、元の試料の１ミリリットル当りのコーニー形成単位（ｃｆｕ’ｓ／ミリリットル）で読み取ることができる。

本方法は、２種類の異なる流体流量で電流測定を行うことを含む。このような２種類の流量は、全く同一の流体中の２種類の異なる細菌濃度を電気的に測定する手段を効果的に提供し、これは、フィルターカートリッジ中の有効な細菌濃度が、その流量に逆比例することによるものである。その関係は２．混入物の影響を細菌計数の計算された読みから無くすような関係である。

上記のことを言い換えると、（細菌の作用の結果として生じた電流以外の任意の源から得られる）バックグラウンド電流は、試薬流体をフィルターカートリッジを介して２種類の異なる流量で交互に移動させる場合、試験結果から除かれる。

電気化学的測定装置で測定させた２種類の電流を、測定された流量と一緒に用いて、細菌計数を計算する。

本出願人は、細菌の作用によって生じた電流の成分（ｒｌＪ　）は２種類の流量（ＦｌおよびＦ２）で異なるが、他の源からのバックグラウンド電流成分は全流量で実質的に一定であることを発見した。したがって、未知数が２個だけの二つの方程式を与え且つＢ（細菌）について解く。

概して、■（測定値）＝１（細菌）十■（バックグラウンド）［但し、■（バックグラウンド）は一定である］である。

であり、但し、電流値（Ｌ、１２）および流量（Ｆｌ、Ｆ２）は全部の測定された量であり、Ｆ２は、元の試料の一部分の細菌を計数する独立の方法（例えば、プレート計数）を用いて誘導された比例定数である。

例えば、ｌｃｃ／分の平均流量が１２．１ナノアンペア読みを生じる場合、１／１０ｃｃ／分平均流量は１６．８ナノアンペア電流を生じ、Ｆ、＝０．　Ｉ　Ｌ＝１６．　８濃度変化法の詳細な説明濃度変化法を図３に関して記載し、それによって、このような方法を実施するのに用いることができる装置の一つの形態を示す。図３の電気化学的測定装置１５を図１のものと同一のものとして示し、同じ参照番号をそれに関して用いる。

同じことが印加および電流測定装置Ｐにも当てはまる。

大部分の用途においてフィルターカートリッジ１０の容量の何倍もの容量を有する容器３２がベント式キャップ３３と一緒に与えられる。試薬容器３４、例えばバッグは、バルブ３５を介して容器３２に連通ずる。フィルター３８は、容器３２の底部に与えられ、フィルターの上面はこのような容器の内部と直接連通しているのが好ましい。フィルター３８はフィルターハウジング３９に入れられ、それがポンプ３７に連通し、それが測定用電極２０のハウジング１９に連通している。

ガスインジェクター４０は、容器３２中の流体から酸素を除去し且つそれを攪拌するために、そのような流体中に不活性で且つ酸素不含のガスを導入する。他の要素は容器と組合わされ、例えば、機械的攪拌器および洗浄流体を導入するための手段である。ガスはガスインジェクター４０を介して、そして好ましくは、酸素不含窒素ガスを含む容器の流体中へと通過させる。試料入口は示されていないが、容器キャップまたはカバー３３に与えられて、試料を導入する場合にそのようなカバーを外す必要をなくすようにする。

電気化学的測定装置を介して通過する液体は廃棄することになり、すなわち、それは容器３２に再循環されない。したがって、バルブ４１が廃棄ラインに与えられ、濃度変化法の実施中に開いた状態にある。

濃度変化法は、容器３２に既知容量の試料を導入する予備工種を含むのが好ましい。バルブ３５が閉じられたままである間は、ポンプ３７は、全部の液体が容器から除かれ且つ廃棄物へと通過するように操作される。したがって、容器中の細菌はフィルター３８の上面に存在する。

次に、ポンプ３７を停止し、バルブ３５を開き、そして試薬をバッグ３４から容器３２へと通過させて、それを望ましい水準まで満たす。次に、バルブ３５を閉じる。ガス注入手段４０を単独でかまたは機械的攪拌器と組み合わせて用いて、酸素を有する試薬をパージし、そして（好ましくは）試薬−細菌混合物を均一に保持する。装置はここで、細菌計数の試験を開始する用意ができる。

概して、濃度変化法の基本的理論は、全く同一の液体中の細菌の濃度を（フィルターを介して容器３２から流体を除去することによって）変化させ且つ還元種の濃度の上昇速度を（適当な電気化学的測定装置によって）測定することである。

したがって、二組のデータが得られ、一つは還元種の濃度対時間であり、もう一つは細菌の濃度対時間である。これらのデータを用いて単位容量当りの細菌計数を決定し、洗浄後に残ることがある任意の混入物の影響を無効にする。多数の濃度プログラム（操作）のいずれか一つを用いてよく、それぞれ、それ自体のデータ処理アルゴリズムを有し、それによって、細菌に対して特徴的である機能の二組のデータを用いる。

細菌の濃縮の好ましい方法は、図３に示したように濾過を用いる。ポンプ３２を始動させて、容器３２中の細菌含有試薬の容量を、（Ｖｔと称してよい）初期容量から（Ｖ２として称してよい）実質的に一層少ない容量まで減少させる。予め決められた時間に、例えば、容器３２中の液体の容量がｖＩであり、（次に）容量がＶ２である場合、電気化学的測定装置１５を用いて各濃度での電気化学的シグナルを読み取る。好ましくは、電気的シグナルは電気化学的測定装置からデータ処理機へ伝達され、容量シグナルはポンプ３７からまたは容器３２に関係した検出器から前記の処理機へ伝達される。

濃度変化法の好ましい形態では、データ処理機を用い、容量対時間およびシグナル対時間の入力を受け取るように、電気化学的測定装置からおよびポンプもしくは容器から／グナルを供給する。ポンプ３７で、試薬を容器３２に対して試薬容器３４から導入後すぐに操作を開始し、電気化学的測定装置で、ポンプが操作している間中、電流を連続的に測定する。

次に、データ処理機で、測定用電極２０に存在するノブナルの第二の導関数を決定する。このような第二の導関数は細菌計数（Ｂ）に比例する。シグナルが電流の尺度である場合、一般式は、であり、但し、Ｂは細菌計数であり：に３は、プレート計数等を用いることによって（前記に記載した方法で）誘導される比例定数であり：そしてＩは測定用電極の電流である。

任意の望ましい流れのプログラムを用いることができるが、そのプログラムは試料毎に繰り返さなければならない。前のように、全部の状態を試験毎に同じに保持しなければならない。

濃度変化法において測定用電極によって生じた読みを細菌計数密度に対して変換する第二の尺度は下記の通りである。ポンプ３７を始動させ、３種類の電流を電気化学的測定装置によって測定し、電流は等間隔で時間どおりに測定される。

具体的には、容量Ｖ１で電流１１を測定する。次に、更に流体を容器３２を介して通過させて容量■２が存在するようにする。次に、電流Ｉ２を測定する。Ｉ、およびＩ２間で記録された時間に対して等間隔の時間で且つ容量がｖ２のままである間に、電流■３の測定を行う。

次に、細菌計数（Ｂ）を下記の方程式によって決定する。

Ｂ＝Ｋｎ　（Ｉ４＋Ｉ２　２Ｉ３）前のように、定数に４は、独立の計数法、例えばプレート計数によって、方程式の結果をｃｆｕ／ミリリットルでの実際の細菌計数密度に解釈するように決定されたものである。

上に記載した濃度変化法は、任意の残留混入物を排除する。試薬中の細菌の濃度は、試薬を容器底部から濾過し且つ廃棄物へとポンプで送るにしたがって上昇するが、混入物の濃度が対応して上昇することはないということが指摘される。

混入物の濃度は細菌の濃度が上昇する間中、同じ状態のままである。したがって、数学的には、混入物を方程式から排除することができるので、細菌によって生じた影響のみを用いて細菌計数密度を生じる。

貯蔵試料法の詳細な説明図３を論及すると、貯蔵試料法で用いられる装置は、濃度変化法に関して前に記載したのと実質的に同一であるといえる。しかしながら、バルブ４２は、参照番号４３で示した容器（例えば、バッグ）へと延びるティーに与えられる。

貯蔵試料法は、（前記の精製試料の調製後に残っている）細菌中の任意の残留混入物の影響を下記の方法で大いに減少させまたは排除する。

方法の最初の部分は、濃度変化法に関して前記したのと同じである。しかしながら、（電気化学的測定装置によって読取りが行われる際の）試験中に電気化学的測定装置を介して通過する液体は、廃棄物へと通過しないが、その代わりバッグ４３へ通過し、バルブ４２が開けられ且つバルブ４１が閉じられる。更に、濾液および試薬がフィルターハウジング３９からポンプ３７および電気化学的測定装置を介してバルブ４２へと通過する間に、電気化学的測定装置によって測定が行われる。

したがって、実質的にもっと後に、液体の貯蔵試料を電気化学的測定装置を介して再度通過させる。これを、例えば、バルブ４２と組合された導管からノく・ソゲ４３を分離し且つそのバッグから貯蔵試料をポンプ３７中に、そして電気化学的測定装置へと導入することによって行ってもよい。導入は、示されていないが、容器３２とは別の手段によって行われる。次に、貯蔵試料に第二の電流測定を実施する。

このようにして、最初の読取りを行った時に、混入物が存在していたか否かを決定する。最初に測定された電流に等しい第二の通過電流シグナルによって、混入物が存在していなかったことが実証される。一方、流体の貯蔵試料に関して増加した電流は、混入物の存在を示す。後者の場合、任意のこのような電流の増加量は補正計数として用いられる。言い換えると、液体の第二の通過から得られた電流と、液体の最初の通過から得られた電流との差を計算する。この差を、液体を電気化学的測定装置を介して最初に通過させた時に測定した電流から減じる。

次に、このように補正した電流を用いて、細菌計数密度を決定する。（その結果を、プレート計数によって決定された定数と一緒に用いて密度を得る。）試験を、試料毎に同一の方法で再度繰り返す。

具体例実施例１、バイパス法の可能性を示す酵素試験トリプシン大豆ブイヨンからの酵素は、メチレンブルーおよびゲルコースなどのある種のオキシダントと基質との反応を触媒することが知られている。この特徴を用いて、還元種（この場合は還元メチレンブルー）の増加に反応する電流を決定することによって、バイパス法の可能性を試験した。

容量約１／２ｍｌの小型のプラスチック容器に、試薬およびトリプシン大豆ブイヨンの５０１５０混合物を入れた。カートリッジに接続を入力し且つ解除して、バイパス装置においてフィルターカートリッジの代用品として用いることができるようにした（図１）。小型の容器を試験ループに入ね、１５分間の待ち時間を選択して、酵素による触媒作用によって一定濃度の還元メチレンブルーを生成させた。試薬は下記の組成を有した。

Ｈ２Ｏ７５ｍ１ −塩基性リン酸塩　０．４ｇＫ２ＨＰＯ４０，８ｇグルコース　０９１４ｇメチレンブルー　０．００５ｇ塩化カリウム　０．３５ｇトリトリプン大豆ブイヨン記の組成を有した。

Ｈ２Ｏ１００ｍ　ｌカゼインの膵液消化物　１．７ｇ大豆ミールのパパイン消化物　０．３ｇＮａＣ］　０．５ｇＫ２ＨＰＯ４０，２５ｇデキストロース　０．２５ｇ待ち時間の最後の１分間に、試薬をポンプによってバイパスを介して電気化学的測定装置に移動させ、そして電流をゼロに合わせた（バックグラウンド電流が流れていたとしても、ゼロであるようにした）。待ち時間の最後に、試薬流をバイパス経路から移動させて、試薬／大豆ブイヨン混合物が入っている容器を介して流した。プラスチック容器中に保持された停滞した液体のスタックが電気化学的測定装置を介して通過した時に、１２０ナノアンペアの（ゼロに合わせたバックグラウンドまたはベースラインを越える）ピーク電流を記録し、次に、それを戻して、スタックが通過した時にゼロに合わせた値に近付けた。この試験により、還元種が生物学的作用によって生成される場合、その還元種の濃度は、電気化学的測定装置で生じたピーク電流によって容易に測定することができるということが確証される。

実施例２：バイパス法の細菌定量試験この試験では、ナルジェ・カンパニー（Ｎａｌｇｅ　Ｃｏｍｐａｎｙ）（ｏチェスター、ニューヨーク州）からのシリンジフィルターを用いて細菌を保持した。

セルロースアセテートの滅菌フィルター膜は直径が２５ｍｍで、細孔度は０．　４５ミクロンであった。フィルター上部を除去し且つ新しい上部を加えて、フィルター表面上の空間の容量を約１／２ｍｌまで増加させた。大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）の純粋な培養物（約１ｍ１）を、フィルター膜を介して濾過した。次に、フィルターカートリッジに、前記の実施例（１）で用いたメチレンブルー、／試薬流体を満たし、カートリッジを図１に示したような装置ループに入れた。試薬の導入後に、１５分間の保持時間を用いた。

実施例（１）の場合のように、保持時間の終り近（で、試薬をバイパスによっておよび電気化学的測定装置を介して移動させて、そこで電流をゼロに合わせた。

次に、試薬流を移動させて、フィルターカートリッジを介して通過させた。滞留した流体のスタックが電気化学的測定装置に達し５た時に、４．５ナノアンペアのピーク電流が観察された。

滞留したスタックをカートリッジから移動させることにより、新たな試薬がフィルターカートリッジに入る結果となった。これを再度１５分間保持し、電流の変化の決定を上記のように繰り返した。、４．６ナノアンペアのピーク電流を記録し、それにより、特定の待ち時間に対して（電気化学的測定装置によって測定される）生じた還元種の濃度が本質的に一定であることが分かった。

ここでフィルター室を占有した新たな試薬溶液を再度保持し、この時間を３０分間にした。この保持時間に対するピーク電流の決定で、１５分間の保持時間に対して見出された電流のほぼ二倍の９．４ナノアンペアであることが分かった。

この試験により、生じる還元種の量はフィルター室中で保持された時間に比例することが分かった。９．　２　（２Ｘ４．６）の予想された値を上回るピーク電流の僅かな増加は、カートリッジ中の同一の細菌試料について３回試験を実施するのに必要な時間中に生じた全細菌数の増加の結果であると考えられる。

実施例３；種々の微生物および種々の試薬組成物に関する定性試験大腸菌以外の細菌が存在した場合および種々のオキシダントおよび基質を有する試薬に関するバイパス法のパルスモードによってピーク電流が生じた場合、２種類の追加の試験で決定を行った。

条件　実施例（１）　実施例（２）微生物、　酵母　ビー・グロビギー（Ｂ、Ｇｌｏｂｉｇｉ　ｉ）オキシダント：メト硫酸フェナジン　メチレンブルー基質：　Ｄ−グルコース　コハク酸ナトリウム緩衝液・　リン酸塩　リン酸塩それぞれの場合の試験で、１５分間の保持時間後に容易に測定可能なピーク電流が示された。

本発明により、還元種の濃度を正確に且つ敏感に測定する能力を考案したが、それによって電気化学的測定が実際的且つ有用となる。好ましい方法では、生じた電流の変化率を測定する先行技術の方法に対して提案されたように、電気化学的測定装置で生じた電流の大きさを直接測定する。更に、本発明では、試薬、混入物および電子ノイズからのバックグラウンド寄与率に対して電流測定値を完全に補正する。これは、オキシダント（酸化された種）および基質を含む試薬を、フィルターカートリッジ中で滞留している細菌を介して、そして次に、電流の大きさを測定する電気化学的測定装置を介して移動させることによって達成される。

引き続き、同じ試薬をバイパスを介してフィルターカートリッジへ移動させることにより、バックグラウンド電流の尺度が与えられ、それをフィルターカートリッジ流路での全電流測定値から減じて、細菌作用のみによって生じた真の電流成分を与える。この電流成分は、順次に、細菌個体数に比例するように予め確立された還元種の濃度に比例することが分かった。したがって、新規の方法に対して、注入プレート計数（プレート計数）の独立の方法によって決定された細菌個体数は、本発明の新規の電気化学的方法と十分な相関関係を示すものであることが予想される。

追加の開示上記に引用したシルバーマン／ブレイクの特許に、印加電圧、ｐＨ１温度、酸素の脱離等のような因子が記載さねているので、（これらの因子のいくつかに関して上記を簡単に参照したことを除き）これらを本明細書中には記載しない。特定の物質等に関するような、引用した特許に記載された他の因子は、それらが引用し、た特許に既に記載さねているので、本明細書中では部分的にのみ論及される。。

本明細書中で特に論及される引用された特許の部分は、細菌の個体数の決定に関するものである。しかしながら、本出願人の本方法は、主として生菌の個体数の決定に対して向けられていることが強調される。

細菌からの可溶性混入物の前記洗浄は、蒸留水で行うのが好ましい。

本出願人がここで用いたピコ電流計は、オハイオ州、クリーブランドの、カイスリー・インスツルメンツ・インコーホレーテッド（Ｋｅｉｔｈｌｅｙ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ、）によって製造された４８５型である。本出願人がここで用いたフィルターカートリッジは、ニューヨーク州、ロチニスターのナルジェ・カンパニーによって製造されたカタログ番号１９０−２０４５である。

本出願人がここで用いた電気化学的測定装置は、電力電極としてステンレス鋼製チューブ２１を含む。ここで用いた且つ好ましい参照電極は、多数の発売元から購入することができる銀／塩化銀参照電極である。他の参照電極、例えば、引用された特許において論及されたカロメル電極を用いることもできる。

好ましい測定用電極２０は、カリフォルニア州、フラートンのファンタム・エレクトロ−ディベロブメント（Ｑｕａｎｔｕｍ　Ｅｌｅｃｔｒｏ　Ｄｅｖｅｌ。

ｐｍｅｎｔ）によって製造される。この測定用電極は、ポリカーボネートから製造された円筒形室１９に収容された黒鉛の回転中実ロッドを含み、ロッドおよび室壁の間の隙間は僅か領　００５インチである。ロッドは長さが１〜７／１６インチであり、直径が約１７２インチである。アセンブリーの保持容量は約１／４ＣＣである。ロッドをその中心に通して、３１６ステンレス鋼の攪拌ロッドヲ収容し、それが封止手段によって駆動軸へと通じる。駆動モーターは、ハウジング室の一端に取り付けられる。電極アセンブリーは円滑に且つ最小の音波ノイズおよび電気ノイズで作動する。電極表面全部を流体全体に正確に同じ速度で回転させ、この速度は先行技術と比較して比較的遅い。電極の好ましい回転速度は４００回毎分である。（黒鉛は、ペンシルバニア州、セント・メジーズのスタックボール・カーボン・カンパニー（Ｓｔａｃｋｐｏｌｅ　Ｃａｒｂｏｎ　Ｃｏｍｐａｎｙ）から得られる。規格値は密度１．８５およびグレード１３３６である。）回転ペドル、線材ループ、滴下液状金属、毛管、平板、ロッド等を含む多数の設計の測定用電極があることが強調される。（前記の）使い捨て装置も用いられた。

本発明では、細菌が測定用電極に接触するのを妨げる工程を用いるので、測定用電極の変化が生じるのが先行技術の場合よりもはるかに少ないと考えられる。

しかしながら、本出願人は、測定用電極が時間毎に試験されることを好んで用いている。したがって、測定用電極が細菌汚染および頻繁な滅菌法から保護されるとしても、測定用電極活性が適当で且つ一定であることを保証する必要がある。

このような保証を与える好ましい正確な方法は、電極活性を時々校正すること、そして細菌計数の最後の計算でこの校正を用いることである。したがって、本出願人は、試験を実施する前後または、その操作が好都合であると考えられる場合はいつでも、電極の感度を測定する手段を用いる。電気化学的測定装置の校正は、細菌計数の際に測定される既知量の特定の還元種によって生じる、電気化学的測定装置で測定された実際の電流を決定することによって全て含めて行うことができる。「標準溶液」をこの試験用に用い、電気化学的校正流体と称することができる。それによって、可変面積、可変流体力学および表面活性は、ある単一の校正定数に（還元レドックス種の１モル当りの電流の単位で）組合されることにな電気化学的測定装百は、それを介して流体を移動させ、その流体には既知の濃度の還元レドックス種が含まれ、そして得られた電流を測定することによって校正されることが強調される。

更に、レドックス（酸化／還元）対は、２種類の酸化状態が平衡状態で存在することができ且つ化学的または電気化学的反応によって一方の状態からもう一方の状態に変化することができる有機化合物、例えば、メチレンブルー、／ルフメチレンブル一対であることが強調される。選択されたレドックス対の酸化種は試薬流体中に存在する。その機能は、通常、どんなオキシダントでも、細菌によってその自然環境中で用いられたものは、その役割があるということである（０２．５０４＝、Ｎ０ｓ−またはＣ０３＝等）。この新規のオキシダント（または媒体）は、（試薬によって更に与えられる）基質と反応して、細菌のための新規のエネルギーサイクルを生じる。

与えられた新規のオキシダントは、（ａ）細菌によってエネルギーサイクルで用いられることおよび（ｂ）電気化学的に容易に再酸化される還元種を生じることができる。多数の物質はオキシダントとして用いることができるしまたは２種類以上のカクテル混合物であることができる。適当なオキシダントは周知の染料媒体、例えば、メチレンブルー、２．６−ジクロロインドフェノール、インジゴ二硫酸塩、フェノサフラニン、メト硫酸フェナジン等から選択することができる。

他の物質、例えば、ベンゾキノンおよびフェロシアニドも有用であることが分かった。

基質は、細菌（またはその酵素）によって触媒される反応においてレドックス対の選択された酸化種と結合して、望ましい還元種を生じる物質である。多数の有機物質が、この目的に対する種々の用途で有用であることが分かった。これらには、単糖、例えば、グルコース、ラクトース、デキストロース、フルクトース等および酸化サイクル中の他の中間物質、例えば、ピルビン酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、−ケトグルタル酸塩、酢酸塩、乳酸塩等がある。酸化種に関するように、２種類以上の基質のカクテル混合物が好都合であることがある。

試薬は、細菌に触媒された反応のためにその細菌によって必要とされる成分ヲ供給して、還元種を生じる特定の溶液である。試薬は有機レドックス対の酸化状態（例えば、レドックス対であるメチレンブルー／ルコメチレンブルーのメチレンブルー）、触媒反応に必要とされる基Ｗ（例えば、グルコース）および望ましいｐＨａ度を維持するのに適当な緩衝成分を含む。試薬は酸素不含で且つ無菌である。

前記の詳細な説明は、単に、図面および実施例によって与えられたように明確に理解されるべきであり、本発明の精神および範囲は添付の請求の範囲によってのみ制限される。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成　４年　５月　７２Ｉ艮１

Claims

【特許請求の範囲】

１．細菌個体数を電気化学的に決定する方法であって、細菌個体数が測定される細菌を含む流体の試料を提供し、該試料を瀘過して瀘液を得て、該瀘過工程は該細菌が核瀘液中に存在するのを妨げるように実施され、該瀘液に関する電気化学的測定を、該細菌と接触のない電極手段を用いることによって行い、そして該電気化学的測定の結果を用いて、該試料中の細菌の個体数を決定することを含む前記の方法。
２．前記の細菌が、実質的に酷使されなかった生菌である請求項１に記載の方法。
３．前記の方法が、該電気化学的測定を、レドックス対および、測定用電極を含む電気化学的測定装置を用いることによって行い且つ該装置の該測定用電極を該瀘液に暴露するが該細菌には暴露しないことを更に含む請求項２に記載の方法。
４．前記の細菌が生菌であり、そして前記の方法が、（１）該細菌を洗浄して、そこから混入物を除去し、（２）前記の洗浄された細菌を、レドックス対の酸化種を含む試薬中に存在させ、（３）該細菌に、該酸化種の還元種への漸進的変換を触媒させ、（４）該細菌を該試薬から瀘過し、そして（５）前記の工程（４）から得られた瀘液と接触し且つ該細菌と接触していない電気化学的測定装置を用いて、該電気化学的測定を行うことを更に含む請求項１に記載の方法。
５．前記の方法が、該試薬と接触している該細菌を、充分な該酸化種が還元種に変換され、有意の読取りが該電気化学的測定装置によって行われるのに十分に長い時間維持することを更に含む請求項４に記載の方法。
６．前記の方法が、フィルターを含む小容量のフィルターカートリッジによって該瀘過工程を実施することを更に含む請求項１に記載の方法。
７．前記の方法が、試薬中の該細菌が入っている比較的大きい容量の容器の出口側にフィルターを与え且つ該フィルターを介して該試薬を瀘過することによって該瀘過工程を実施することを更に含む請求項１に記載の方法。
８．前記の方法が、前記の言及した工程を、同じ方法であるが、種々の個体数の細菌を含む種々の試料に関して繰り返し、それによって、前記の種々の試料中の細菌個体数を決定することを更に含み、そして更に、細菌個体数に関する電気化学的測定値を同等にする定数を用いることを含み、該定数は、該試料の一部分に関する細菌の非電気化学的計数を行うことによって決定される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
９．細菌個体数を測定する方法であって、最初の一定量の選択された流体を、容器を介し、そこから、該容器の下流側に与えられたフィルターを介し、そしてそこから、電気化学的測定装置を介して、測定される試料からの細菌が、該フィルターの上流側の前記の最初の量中に存在し且つ該装置側には存在しないような方式で通過させ、第二の一定量の該流体を該容器および該フィルターとは別個に該装置中に、そして該装置に、該フィルターを介して通過した実質的な流体が存在していない時のある時点で導入し、前記の第二の量は細菌を含まないものであり、該装置を用いて、前記の第一の量の少なくとも一部分が該装置に存在する時に少なくとも１回、そして前記の第二の量の少なくとも一部分が該装置に存在する時に少なくとも１回電気化学的測定を行い、そして該細菌の個体数を、該フィルターからの該流体が該装置に存在する場合に該装置によって測定された平均シグナルと、該フィルターからのものではない該流体が該装置に存在する場合に該装置によって測定された平均シグナルとの差から算出する前記の方法。
１０．前記の方法が、該流体の共通の原料を提供し、該細菌を該容器中で提供し、次に、ある時間中に、該原料からの該流体を該容器および該フィルターを介して該装置へ通過させ、そして次に、別の時間中に、該原料からの該流体をバイパスを介して、該容器およびフィルターとは別個に該装置へ通過させることを更に含む請求項９に記載の方法。
１１．前記の方法が、前記の第一の量の流体の該フィルターを介する前記の通過の前に、該細菌を該フィルターの上流表面上に存在させることを更に含む請求項９に記載の方法。１１．前記の方法が、測定される種々の細菌試料に関して前記の方法を正確に繰り返すことを更に含む請求項９に記載の方法。
１２．前記の方法が、該フィルターを含む小容量のカートリッジを該容器として用いることを更に含む請求項９に記載の方法。
１３．前記の方法が、実質的容量を有する容器を該容器として用いることを更に含む請求項９に記載の方法。
１４．前記の方法が、レドックス対の酸化種を含む試薬を該流体として用いることを更に含み、該酸化種が、該細菌によって還元種に漸進的に触媒されるように適合され、該電気化学的測定装置が、該還元種の量に関係した電流を生じるように適合され、前記の方法は、該装置中に該容器およびフィルターを介して通過した該流体が存在する場合に、該装置が有意の電流を生じるように実施され、該装置は、その中に該フィルターを介して通適しなかった該流体が存在する場合にバックグラウンド電流を生じ、そして電流の差を、該試料の一部分に関する非電気的方法によって予め得られた細菌計数に対して前記の差を相関させることによって得られた定数を用いることによって細菌計数に相関させる、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の方法。
１５．前記の方法が、前記の第一の量の流体の少なくとも一部分を該容器中で実質的な時間維持することを更に含み、前記の時間は、該流体の該部分が該フィルターを介して該装置へ通過した後に、該装置が、前記の第二の量からの流体が該装置に存在する場合にそれによって生じたシグナルよりも有意に大きいシグナルを生じるように十分に長い、請求項９に記載の方法。
１６．細菌の個体数を決定する方法であって、細菌の試料を提供し、該試料からの細菌をフィルターカートリッジ中のフィルターの上流側に集め、試薬流体を提供し、該試薬流体を該フィルターカートリッジを介して測定された平均流量で移動させ、前記の最後に言及した工程から得られた瀘液を電気化学的に測定して、該試薬流体に対する細菌作用の結果を決定し、そして前記の最後に言及した工程から得られた電気化学的測定値および前記の測定された平均流量を用いて、該試料中の細菌の個体数を計算することを含む前記の方法。
１７．該試薬流体が、有機レドックス対の酸化種および基質物資を含む氷基流体であり、該基質物質が、該酸化種と該基質との触媒化学反応を誘発することによって該レドックス対の還元種を生じる該細菌によって利用可能である、請求項１６に記載の方法。
１８．前記の方法が、該試薬流体を該フィルターカートリッジを介して連続流として移動させることを更に含む請求項１６に記載の方法。
１９．前記の方法が、該試薬流体を該フィルターカートリッジを介して断続流として移動させることを更に含む請求項１６に記載の方法。
２０．前記の方法が、測定用電極を用いて前記の測定を行うことを更に含み、そして前記の方法が、前記の測定が測定時間中に該測定用電極で生じた積分シグナルであるようにすることを更に含む請求項１６に記載の方法。
２１．前記の方法が、該試薬流体を該フィルターカートリッジを介して種々の流量で移動させることを更に含み、前記の測定が、比較的高い流量の期間中に測定用電極でシグナル振幅を測定することによって行われる、請求項１６に記載の方法。
２２．細菌個体数を決定する方法であって、細菌の試料を提供し、試薬流体を提供し、細菌の該試料を該試薬流体と混合することによって第二の試料を製造し、該第二の試料を、該細菌を保持するフィルターを介して通過させることによって、該第二の試料からの細菌を含まない瀘液を提供し、該瀘液において、該第二の試料中の細菌作用の結果を電気化学的に測定し、そして前記の最後に挙げた工程によって得られた前記の測定を用いて、前記の最初に挙げた試料中の細菌の数を計算することを含む前記の方法。
２３．前記の最初に挙げた試料を、商業用設備で該フィルター上に細菌を沈殿させることによって生成する請求項２２に記載の発明。
２４．前記の方法が、該瀘液を貯蔵し、それを後にもう一度電気化学的に測定することによって、該第二の試料中に混入物が存在する結果得られた電気化学的測定に対する影響を決定することを更に含む請求項２２に記載の方法。
２５．細菌個体数を決定する方法であって、細菌の試料を提供し、有機レドックス対の酸化種と、細菌によって利用可能な基質物質とを含む試薬を提供し、該酸化種および該基質間の触媒化学反応を誘発して該レドックス対の還元種を生成し、電気化学的測定手段を提供し、該試薬および該細菌が、十分な量の該還元種が生成されるような十分な時間互いに接触するようにして、該還元種および該電気化学的測定手段が互いに接触している場合に該電気化学的測定手段において有意のシグナルを生じさせ、該試薬および還元種をフィルターを介して通過させて、該細菌を含まない瀘液を生成し、該瀘液が該電気化学的測定手段と接触するようにし、該電気化学的測定手段によって、それらと該瀘液との前記の接触の結果として生じたシグナルの読取りを行い、次に、該瀘液中に存在する可能性のあるあらゆる混入物が有意の追加量の還元種を生じることができる十分な時間、該瀘液を貯蔵し、次に、前記の貯蔵した瀘液が該電気化学的測定手段と接触するようにし且つ得られたシグナルを読取り、該シグナルの最初に挙げたものと、該シグナルの第二に挙げたものとを相関させ、そして前記の相関の結果を用いて該試料中の細菌の個体数を決定することを含む前記の方法。
２６．細菌個体数を決定する方法であって、細菌試料を提供し、試薬流体を提供し、該試料および該流体を互いに混合して、細菌および流体の第一の混合物を提供し、それは該細菌の該流体中の第一の濃度を有し、該細菌の該流体中の前記の濃度を変化させることによって、全く同一の流体が該細菌の該流体中の第二の濃度を有するようにし、該流体中の細菌作用を該第一の濃度および該第二の濃度で電気化学的に決定し、そして電気化学的測定値の結果を用いて該試料中の細菌の個体数を計算することを含む前記の方法。
２７．該試薬が、有機レドックス対の酸化種および基質物質を含む水基流体であり、該基質物質は該細菌によって利用可能であり、該酸化種と該基質物質との触媒化学反応を誘発して、該レドックス対の還元種を生じ、そして前記の濃度変化が該細菌の瀘過によって行われる、請求項２６に記載の方法。
２８．該電気化学的測定値が、前記の瀘過の結果得られた瀘液中で、該細菌と接触していない電気化学的測定手段によって得られる請求項２７に記載の方法。
２９．細菌個体数を決定するフロースルー法であって、液体をフィルターを介してポンプで送るように適合されたポンプを提供し、該フィルターの下流側に電気化学的測定装置を提供し、細菌の試薬中試料を提供し、該試薬は、有機レドックス対の酸化種と該細菌によって利用可能な基質物質とを含む流体であり、該酸化種と該基質との触媒化学反応を誘発して該レドックス対の還元種を生じ、該ポンプを用いて、該試薬を該フィルターを介して該電気化学的測定装置にポンプで送ることを、前記のポンプ輸送を行っている時間の少なくとも一部分の時間中に、有意の還元種が、該細菌の存在の結果得られた触媒作用によって生成されるような方式で行い、時間対シグナルの曲線を生じ、該シグナルは、該電気化学的測定装置の一部分を形成する測定用電極で存在し、そして前記の曲線を用いて、該試料中の細菌の個体数を決定することを含む前記のフロースルー法。
３０．前記の方法が、該曲線をデータ処理機で生じ且つ該曲線の下方の面積を、細菌個体数を決定する前記の工程で決定することを更に含む請求項２９に記載の方法。
３１．前記の方法が、該試料からの細菌を該フィルターの上流側に集めた後、該細菌を該試薬と接触させることを更に含み、そして更に、該細菌からの混入物を洗浄した後に該細菌に該試薬を接触させることを含む請求項２９に記載の方法。
３２．前記の方法が、該細菌を該フィルターの上流面に集めた後、該細菌に該試薬を接触させることを更に含み、更に、最初の一定量の該試薬を該フィルターを介してポンプで送って、該細菌からの混入物を洗浄することを含み、そして更に、前記の洗浄の結果得られた瀘液によって得られたすべての測定を、前記の細菌個体数の決定において無視することを含む請求項２９に記載の方法。
３３．前記の方法が、追加量の該試薬を該フィルターを介して且つ該電気化学的測定装置にポンプで送り、バックグラウンドシグナルおよびあらゆる残留混入物の結果を示すバックグラウンドまたはベースラインを決定し、そして前記のバックグラウンドまたはベースラインを、該電気化学的測定装置による次の測定値から減じることを更に含み、それによってその結果がバックグラウンドシグナルまたは混入物によって生じたシグナルとは実質的に無関係である、請求項３２に記載の方法。
３４．前記の方法が、追加量の該試薬を該フィルターを介して且つ該電気化学的測定装置にポンプで送り、バックグラウンド電流およびあらゆる残留混入物の結果を示すバックグラウンドまたはベースラインを決定し、そして前記のバックグラウンドまたはベースラインを、該電気化学的測定装置による次の測定値から減じることを更に含み、それによってその結果がバックグラウンドシグナルまたは混入物によって生じたシグナルとは実質的に無関係である、請求項２９に記載の方法。
３５．前記の方法が、該フィルターを介する前記の試薬のポンプ輸送を断続的に行い、そして該試薬を、該電気化学的測定装置の測定用電極が比較的高いシグナルをそこで有するようにするのに十分長い１種類以上の時間中、該細菌と接触したままにすることを含む請求項２９に記載の方法。
３６．前記の方法が、シグナル−時間曲線の下方面積を、細菌個体数の前記の決定において用いることを更に含む請求項３５に記載の方法。
３７．前記の方法が、シグナルのパルスの振幅を用いて、該細菌の個体数を決定することを更に含み、該パルスは、該試薬が、有意の還元種の生成を引き起こすのに充分な実質的な時間、該細菌と接触した状態にあった場合の時間に続いて、該電気化学的測定装置に通過した試薬の結果である、請求項３５に記載の方法。
３８．予め決められた容量の細菌試料中の細菌の個体数を決定する方法であって、電気化学的測定装置を提供し、有機レドックス対の酸化種と、測定される細菌によって利用可能な基質物質とを含む流体である試薬を提供し、該酸化種と該基質との触媒化学反応を誘発して前記のレドックス対の還元種を生成し、該試薬中に測定される細菌を提供し、該細菌が該電気化学的測定装置と接触するのを妨げるが、該細菌の存在によって触媒された還元種を該電気化学的測定装置と接触させ、そして得られたシグナルを該測定装置で用いて、該試料中の細菌の個体数を決定することを含む前記の方法。
３９．細菌個体数を決定する方法であって、予め決められた量の試料からの細菌を工業現場で小容量のフィルターカートリッジ中のフィルターの上流側に集め、該細菌を生菌の酷使されない状態で該カートリッジ中に保持し、該カートリッジおよび含まれた細菌を試験室へ輸送し、試薬流体を、該カートリッジを介して直接該フィルターの該上流側からその下流側へ移動させ、そして前記の予め決められた容量の試料中の細菌の個体数を、前記の最後に論及した工程によって生じた瀘液に関する電気化学的測定を行うことによって電気化学的に決定することを含む前記の方法。
４０．前記の方法が、該カートリッジを介する該試薬の前記の移動の前に、該細菌を洗浄することを更に含む請求項３９の方法。
４１．細菌個体数を電気化学的に決定する方法であって、計数される試料からの細菌が中に集められたフィルター容器を提供し、試薬流体を、該容器を介し且つその中のフィルターを介して移動させ、該容器中の細菌によって生じた還元種の電気化学的測定を行い、該電気化学的測定は、該容器からの瀘液中で行われ、そして該試薬の流量、電気化学的シグナルおよび時間の関数として細菌計数を決定することを含み、上記に論及した工程は、該電気化学的シグナルの直接反応を細菌に対する特徴とするように実施されるが、あらゆる混入物の存在を無効にすることを特徴とする前記の方法。
４２．細菌個体数を電気化学的に決定する方法であって、計数される細菌を含む流体試料を容器中に提供し、該流体試料を、該容器からフィルターを介して移動させ、同時に、瀘液流中に存在する還元種を電気化学的に測定し、そして細菌計数を、変化する細菌濃度、電気化学的シグナルおよび時間の関数として決定することを含み、上記に論及した工程は、電気化学的シグナルの第二の導関数が細菌に対する特徴であるように実施されるが、混入物を無効にすることを特徴とする前記の方法。
４３．細菌個体数を電気化学的に決定する方法であって、細菌個体数が決定される細菌の試料を含む流体を提供し、フィルターを提供し、電気化学的測定手段を提供し、該流体を該フィルターを介して該電気化学的測定手段へと、瀘液が該電気化学的測定手段においてベースラインシグナルのみを生じるように十分に速い速度で移動させ、次に、該流体を該フィルターを介して該電気化学的測定手段へと、該電気化学的測定手段によって生じた得られたシグナルが該流体中の細菌の個体数に関係するように十分に遅い平均速度で移動させ、前記の最初に論及したシグナルを前記の第二の論及したシグナルのためのベースラインとして用い、そして該細菌の個体数を該シグナルの双方の関数として決定することを含む前記の方法。