JPH0539299A - 新規なカルシトニン - Google Patents
新規なカルシトニンInfo
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- JPH0539299A JPH0539299A JP3249322A JP24932291A JPH0539299A JP H0539299 A JPH0539299 A JP H0539299A JP 3249322 A JP3249322 A JP 3249322A JP 24932291 A JP24932291 A JP 24932291A JP H0539299 A JPH0539299 A JP H0539299A
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- peptide
- gland
- gln
- thr
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/585—Calcitonins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/10—Drugs for disorders of the endocrine system of the posterior pituitary hormones, e.g. oxytocin, ADH
- A61P5/12—Drugs for disorders of the endocrine system of the posterior pituitary hormones, e.g. oxytocin, ADH for decreasing, blocking or antagonising the activity of the posterior pituitary hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 軟骨魚類の鰓後腺由来の血中カルシウム低下
作用を示すカルシトニンで、次のアミノ酸配列を有す
る。Ｈ−Cys-Thr-Ser-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Val-Gly-Ly
s-Leu-Ser-Gln-Gln-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Asn-Ile-Gln-
Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Ala-Thr-Pro-NH2 （ペプチド
中のシスティン残基は相互にジスルフィド結合で架橋さ
れていてもよい） 【効果】 血中カルシウム低下作用および軟骨細胞分化
促進作用を示すので、高カルシウム血症治療剤、骨粗鬆
症治療剤、骨ページェット病治療剤等として有用である
のに加え、生体カルシウム調節機構の解明や、骨代謝機
構の解明にも重要な役割を果たすと期待される。
作用を示すカルシトニンで、次のアミノ酸配列を有す
る。Ｈ−Cys-Thr-Ser-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Val-Gly-Ly
s-Leu-Ser-Gln-Gln-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Asn-Ile-Gln-
Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Ala-Thr-Pro-NH2 （ペプチド
中のシスティン残基は相互にジスルフィド結合で架橋さ
れていてもよい） 【効果】 血中カルシウム低下作用および軟骨細胞分化
促進作用を示すので、高カルシウム血症治療剤、骨粗鬆
症治療剤、骨ページェット病治療剤等として有用である
のに加え、生体カルシウム調節機構の解明や、骨代謝機
構の解明にも重要な役割を果たすと期待される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規なペプチドに関
し、より詳しくは、軟骨魚類の鰓後腺から得られたカル
シトニンに関する。また、本発明はこのペプチドの製造
方法、およびこのペプチドを有効成分とする薬剤組成
物、特に血中カルシウム低下剤および軟骨細胞分化促進
剤にも関する。
し、より詳しくは、軟骨魚類の鰓後腺から得られたカル
シトニンに関する。また、本発明はこのペプチドの製造
方法、およびこのペプチドを有効成分とする薬剤組成
物、特に血中カルシウム低下剤および軟骨細胞分化促進
剤にも関する。
【０００２】
【従来の技術】カルシトニン（以下、ＣＴと略す）は、
哺乳類等の甲状腺、および鳥類や硬骨魚類等の鰓後腺に
存在し、カルシウムやリン等の電解質代謝に関与するペ
プチドホルモンである。現在までに、甲状腺を主たるオ
リジンとするＣＴはブタ（Potts 等、Pro. Natl. Acad.
Sci. USA 59:1321-1328,1968)、ヒト (Neher 等、Natu
re 220:984-986, 1968) 、ウシ (Brewer等、Biochemist
ry 63:940-947, 1969)、ヒツジ (Potts 等、Calcium, P
arathyroid Hormone and the Calcitonin :121-127, 19
72)、ラット (Raulais 等、Eur. J. Biochem. 64:607-6
11, 1976)で構造が決定されている。
哺乳類等の甲状腺、および鳥類や硬骨魚類等の鰓後腺に
存在し、カルシウムやリン等の電解質代謝に関与するペ
プチドホルモンである。現在までに、甲状腺を主たるオ
リジンとするＣＴはブタ（Potts 等、Pro. Natl. Acad.
Sci. USA 59:1321-1328,1968)、ヒト (Neher 等、Natu
re 220:984-986, 1968) 、ウシ (Brewer等、Biochemist
ry 63:940-947, 1969)、ヒツジ (Potts 等、Calcium, P
arathyroid Hormone and the Calcitonin :121-127, 19
72)、ラット (Raulais 等、Eur. J. Biochem. 64:607-6
11, 1976)で構造が決定されている。
【０００３】また、鰓後腺を主たるオリジンとするＣＴ
は、サケ (Niall 等、Pro. Natl. Acad. Sci. USA 64：
771 ─778, 1969)、ウナギ (小谷等、Ｊ. Biochem. 79:
345-352, 1976) 、ニワトリ (本間等、J. Biochem. 10
0:459-467, 1986)で構造が決定されている。これまでに
見出された上記ＣＴは、図１に示すようにその構造の相
同性から、ブタ系統（ブタ、ウシ、ヒツジ）、ヒト系統
（ヒト、ラット）、サケ系統（サケ、ウナギ、ニワト
リ）の３つの系列集団に分けることができる。また、こ
れらのＣＴはいずれも３２個のアミノ酸よりなる単鎖の
ポリペプチドで、１番目と７番目のアミノ酸がジスルフ
ィド結合（Ｓ−Ｓ結合）をし、カルボキシル末端はプロ
リンアミドである。
は、サケ (Niall 等、Pro. Natl. Acad. Sci. USA 64：
771 ─778, 1969)、ウナギ (小谷等、Ｊ. Biochem. 79:
345-352, 1976) 、ニワトリ (本間等、J. Biochem. 10
0:459-467, 1986)で構造が決定されている。これまでに
見出された上記ＣＴは、図１に示すようにその構造の相
同性から、ブタ系統（ブタ、ウシ、ヒツジ）、ヒト系統
（ヒト、ラット）、サケ系統（サケ、ウナギ、ニワト
リ）の３つの系列集団に分けることができる。また、こ
れらのＣＴはいずれも３２個のアミノ酸よりなる単鎖の
ポリペプチドで、１番目と７番目のアミノ酸がジスルフ
ィド結合（Ｓ−Ｓ結合）をし、カルボキシル末端はプロ
リンアミドである。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】上記ＣＴは血清カルシ
ウムの代謝および骨代謝の調節機構に関係することが知
られているが、最近、これら以外に神経修飾物質として
鎮痛作用を示すことや、カルシウム代謝を介した抗潰瘍
作用を示すこと等が見出されてきており、その作用には
なお不明な部分がある。一方、その生理作用の強さにつ
いては、甲状腺由来のＣＴより鰓後腺由来のＣＴの方が
より強いことなど、前述の系列集団の間で大きな差があ
ることも見出されている。従って、ＣＴの生理作用の解
明およびその治療薬としての利用には、前述の系列集団
に属さない全く新規なＣＴを見出すことを含めた研究が
必要とされた。
ウムの代謝および骨代謝の調節機構に関係することが知
られているが、最近、これら以外に神経修飾物質として
鎮痛作用を示すことや、カルシウム代謝を介した抗潰瘍
作用を示すこと等が見出されてきており、その作用には
なお不明な部分がある。一方、その生理作用の強さにつ
いては、甲状腺由来のＣＴより鰓後腺由来のＣＴの方が
より強いことなど、前述の系列集団の間で大きな差があ
ることも見出されている。従って、ＣＴの生理作用の解
明およびその治療薬としての利用には、前述の系列集団
に属さない全く新規なＣＴを見出すことを含めた研究が
必要とされた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、これまで
のものとは別種のＣＴを見出すことを目的として、従
来、ＣＴの摘出材料としては用いられていなかった軟骨
魚類の鰓後腺に注目した。鰓後腺由来のＣＴは、強い生
理活性を有することも期待できる。そして、この鰓後腺
より強い血中カルシウム低下因子を見出し、この活性因
子がこれまで発見されたものとは別種の新規なペプチド
であることを突き止めた。さらに検討の結果、このペプ
チドが血中カルシウム低下作用および軟骨細胞成長分化
促進作用を示し、医薬として有用であることを見出し、
本発明を完成した。
のものとは別種のＣＴを見出すことを目的として、従
来、ＣＴの摘出材料としては用いられていなかった軟骨
魚類の鰓後腺に注目した。鰓後腺由来のＣＴは、強い生
理活性を有することも期待できる。そして、この鰓後腺
より強い血中カルシウム低下因子を見出し、この活性因
子がこれまで発見されたものとは別種の新規なペプチド
であることを突き止めた。さらに検討の結果、このペプ
チドが血中カルシウム低下作用および軟骨細胞成長分化
促進作用を示し、医薬として有用であることを見出し、
本発明を完成した。
【０００６】即ち、本発明は軟骨魚類の鰓後腺から得ら
れた、血中カルシウム低下作用および軟骨細胞分化促進
作用を有するペプチド、を要旨とする。このペプチドの
分子量は３４００±４００である。また、本発明は次の
一般式（１）で示されるアミノ酸配列を有するペプチド
およびその塩にも関する。
れた、血中カルシウム低下作用および軟骨細胞分化促進
作用を有するペプチド、を要旨とする。このペプチドの
分子量は３４００±４００である。また、本発明は次の
一般式（１）で示されるアミノ酸配列を有するペプチド
およびその塩にも関する。
【０００７】Ｘ−Cys-Thr-Ser-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Va
l-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Gln-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Asn-
Ile-Gln-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Ala-Thr-Pro-NH2 …
（１） （式中Ｘは水素、Tyr-または放射性アイソトープ標識体
と結合しうる官能基を意味する。ペプチド中のシスティ
ン残基は相互にジスルフィド結合で架橋されていてもよ
い）さらに、本発明は上記ペプチドまたはその塩を有効
成分とする血中カルシウム低下剤、および軟骨細胞分化
促進剤にも関する。
l-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Gln-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Asn-
Ile-Gln-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Ala-Thr-Pro-NH2 …
（１） （式中Ｘは水素、Tyr-または放射性アイソトープ標識体
と結合しうる官能基を意味する。ペプチド中のシスティ
ン残基は相互にジスルフィド結合で架橋されていてもよ
い）さらに、本発明は上記ペプチドまたはその塩を有効
成分とする血中カルシウム低下剤、および軟骨細胞分化
促進剤にも関する。
【０００８】この明細書および図面で使用するアミノ酸
の略号は次の意味である。
の略号は次の意味である。
【０００９】 三文字表記 Cys : システィン Thr : スレオニン Ser : セリン Leu : ロイシン Val : バリン Gly : グリシン Lys : リジン Gln : グルタミン His : ヒスチジン Asn : アスパラギン Ile : イソロイシン Arg : アルギニン Asp : アスパラギン酸 Gly : グリシン Ala : アラニン Pro : プロリン 一文字表記 Ａ：アラニン Ｃ：システィン Ｄ： アスパラギン酸 Ｅ：グルタミン酸 Ｆ：フェニルアラニン Ｇ： グリンシン Ｈ：ヒスチジン Ｉ：イソロイシン Ｋ： リジン Ｌ：ロイシン Ｍ：メチオニン Ｎ： アスパラギン Ｐ：プロリン Ｑ：グルタミン Ｒ： アルギニン Ｓ：セリン Ｔ：スレオニン Ｖ： バリン Ｗ：トリプトファン Ｙ：チロシン 本発明のペプチドは軟骨魚類アカエイの鰓後腺由来のＣ
Ｔである。硬骨性の骨格を有する脊椎動物では、ＣＴは
骨からのカルシウム溶出の阻止、骨中の骨塩量の増加等
による骨の硬化に関与している。軟骨魚類は、その骨格
が軟骨性である点で他の脊椎動物とは異なるため、硬骨
性の骨格を有する他の脊椎動物において示されるＣＴの
生理作用がそのまま示されるとは考え難く、むしろ他の
生理作用を担っていることが予想される。
Ｔである。硬骨性の骨格を有する脊椎動物では、ＣＴは
骨からのカルシウム溶出の阻止、骨中の骨塩量の増加等
による骨の硬化に関与している。軟骨魚類は、その骨格
が軟骨性である点で他の脊椎動物とは異なるため、硬骨
性の骨格を有する他の脊椎動物において示されるＣＴの
生理作用がそのまま示されるとは考え難く、むしろ他の
生理作用を担っていることが予想される。
【００１０】本発明のペプチドはその構造において、従
来のＣＴのいずれの系列集団にも属さない新規な種類の
ＣＴである。そのため、血中カルシウムの代謝調節機構
や骨代謝異常疾患の原因、およびＣＴの生理作用の解明
に大きな役割を果たすことが期待される。例えば、前記
一般式(1) においてＸがTyr-であるか放射性アイソトー
プ標識体と結合しうる官能基である場合、本発明のペプ
チドを標識することができ、これを用いてその血中濃度
の測定、あるいは半減期や作用部位の測定により本発明
ペプチドの代謝動態の解明に利用できる。
来のＣＴのいずれの系列集団にも属さない新規な種類の
ＣＴである。そのため、血中カルシウムの代謝調節機構
や骨代謝異常疾患の原因、およびＣＴの生理作用の解明
に大きな役割を果たすことが期待される。例えば、前記
一般式(1) においてＸがTyr-であるか放射性アイソトー
プ標識体と結合しうる官能基である場合、本発明のペプ
チドを標識することができ、これを用いてその血中濃度
の測定、あるいは半減期や作用部位の測定により本発明
ペプチドの代謝動態の解明に利用できる。
【００１１】本発明のペプチドの製造方法には、該ペプ
チドを産生する細胞より回収する方法がある。用いる産
生細胞としては、軟骨魚類アカエイの鰓後腺組織細胞、
それらを細胞培養により増殖させた細胞、あるいは遺伝
子組み換え手段によって目的のペプチドを産生するよう
にした細胞がある。これらの細胞から本発明のペプチド
を単離精製するには、抽出、ゲル濾過クロマトグラフィ
ー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマト
グラフィー、電気泳動、再結晶等の、ペプチドの単離精
製に通常用いられる処理を組み合わせて行うことがで
き、特に逆相の高速液体クロマトグラフィーを含む方法
が好ましい。
チドを産生する細胞より回収する方法がある。用いる産
生細胞としては、軟骨魚類アカエイの鰓後腺組織細胞、
それらを細胞培養により増殖させた細胞、あるいは遺伝
子組み換え手段によって目的のペプチドを産生するよう
にした細胞がある。これらの細胞から本発明のペプチド
を単離精製するには、抽出、ゲル濾過クロマトグラフィ
ー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマト
グラフィー、電気泳動、再結晶等の、ペプチドの単離精
製に通常用いられる処理を組み合わせて行うことがで
き、特に逆相の高速液体クロマトグラフィーを含む方法
が好ましい。
【００１２】あるいは、このようにして単離精製したＣ
Ｔの分析により判明したアミノ酸配列の情報に基づき、
アミノ酸から化学的に合成することができる。合成法に
は例えばYanagisawa等の固相法アミノ酸合成法、液相法
アミノ酸合成法等の慣用のペプチド合成方法が使用でき
る。以下、アカエイを使用した場合のＣＴの単離精製に
ついて具体例を説明する。
Ｔの分析により判明したアミノ酸配列の情報に基づき、
アミノ酸から化学的に合成することができる。合成法に
は例えばYanagisawa等の固相法アミノ酸合成法、液相法
アミノ酸合成法等の慣用のペプチド合成方法が使用でき
る。以下、アカエイを使用した場合のＣＴの単離精製に
ついて具体例を説明する。
【００１３】まず、アカエイの鰓後腺を摘出する。アカ
エイの鰓後腺は心臓の背面に一対あって、肉眼で識別可
能であるため摘出は容易である。鰓後腺を多量に集めて
使用してもよいが、鰓後腺組織細胞を細胞培養により増
殖させ多量に得ることも可能である。摘出した鰓後腺を
凍結後破砕して蒸留水中で煮沸し、冷却後酢酸を加えホ
モジナイズして抽出を行う。得られた抽出液を遠心分離
して上清を得、これにアセトンを加え遠心分離する。こ
の上清を減圧乾固の後、酢酸に溶解し、さらにアセトン
を加え遠心分離する。ここで得られた沈渣を0.1 ％トリ
フルオロ酢酸に溶解後、逆相高速液体クロマトグラフィ
ーに付し、イムノブロッティング法により活性のある分
画を確認採取し、再度逆相高速液体クロマトグラフィー
に付し精製する。
エイの鰓後腺は心臓の背面に一対あって、肉眼で識別可
能であるため摘出は容易である。鰓後腺を多量に集めて
使用してもよいが、鰓後腺組織細胞を細胞培養により増
殖させ多量に得ることも可能である。摘出した鰓後腺を
凍結後破砕して蒸留水中で煮沸し、冷却後酢酸を加えホ
モジナイズして抽出を行う。得られた抽出液を遠心分離
して上清を得、これにアセトンを加え遠心分離する。こ
の上清を減圧乾固の後、酢酸に溶解し、さらにアセトン
を加え遠心分離する。ここで得られた沈渣を0.1 ％トリ
フルオロ酢酸に溶解後、逆相高速液体クロマトグラフィ
ーに付し、イムノブロッティング法により活性のある分
画を確認採取し、再度逆相高速液体クロマトグラフィー
に付し精製する。
【００１４】このようにして得られたアカエイＣＴは、
自動アミノ酸配列分析装置を用いて、エドマン分解によ
ってＮ末端より段階的に切断し、高速液体クロマトグラ
フィーによってアミノ酸配列を決定できる。結果は配列
表の配列番号１に示す通りである。また、得られたペプ
チドのアミノ酸分析により次のアミノ酸組成を得た。
自動アミノ酸配列分析装置を用いて、エドマン分解によ
ってＮ末端より段階的に切断し、高速液体クロマトグラ
フィーによってアミノ酸配列を決定できる。結果は配列
表の配列番号１に示す通りである。また、得られたペプ
チドのアミノ酸分析により次のアミノ酸組成を得た。
【００１５】Asp 2.0 (2) 、Gln 4.6 (4) 、CM-Cys 1.3
(2)、Ser 3.0 (3) 、Gly2.2 (2) 、His 1.0 (1) 、Arg
1.1 (1) 、Thr 4.2 (4) 、Ala 2.2 (2) 、Pro 1.1
(1) 、Val 2.4 (3) 、Ile 1.0 (1) 、Leu 4.2 (4) 、Ly
s 2.0 (2) 但し、括弧内の数字は理論モル比である。このペプチド
の分子量は3395であった。
(2)、Ser 3.0 (3) 、Gly2.2 (2) 、His 1.0 (1) 、Arg
1.1 (1) 、Thr 4.2 (4) 、Ala 2.2 (2) 、Pro 1.1
(1) 、Val 2.4 (3) 、Ile 1.0 (1) 、Leu 4.2 (4) 、Ly
s 2.0 (2) 但し、括弧内の数字は理論モル比である。このペプチド
の分子量は3395であった。
【００１６】これらの得られた結果を基に、例えばYana
gisawa等の方法 (Pro. Natl. Acad.Sci. USA 85: 6964-
6967, 1988)に準じてアカエイＣＴを合成することがで
きる。アカエイの鰓後腺から抽出した純粋なアカエイＣ
Ｔ、および合成アカエイＣＴをHomma 等の手法 (J. Bio
chem. 100: 459-467, 1986) に従い生理活性を測定する
と、強い血中カルシウム低下作用が認められる。
gisawa等の方法 (Pro. Natl. Acad.Sci. USA 85: 6964-
6967, 1988)に準じてアカエイＣＴを合成することがで
きる。アカエイの鰓後腺から抽出した純粋なアカエイＣ
Ｔ、および合成アカエイＣＴをHomma 等の手法 (J. Bio
chem. 100: 459-467, 1986) に従い生理活性を測定する
と、強い血中カルシウム低下作用が認められる。
【００１７】また、Bessey等の手法 (J. Boiol. Chem.
164:321-329,1964) およびLowry 等の手法 (J. Boiol.
Chem. 193:265-275,1951) に従い軟骨細胞に対する生理
活性を測定すると、強い細胞分化促進活性が認められ
る。
164:321-329,1964) およびLowry 等の手法 (J. Boiol.
Chem. 193:265-275,1951) に従い軟骨細胞に対する生理
活性を測定すると、強い細胞分化促進活性が認められ
る。
【００１８】
【作用】本発明の、軟骨魚類の鰓後腺から得られたペプ
チドは、血中カルシウム低下作用を有することから、骨
粗鬆症治療剤、高カルシウム血症治療剤、骨ページェッ
ト（Paget)病治療剤として利用できる。さらに、神経ペ
プチドとしての作用も有することから、鎮静剤としても
利用できる。また、軟骨魚類由来であることから、軟骨
細胞分化促進活性を示し、小人症、骨折、骨粗鬆症の治
療薬として有用である。また、治療に用いられるばかり
でなく、生体のカルシウム調節機構の解明や、骨代謝機
構の解明の手掛かりともなりうる治療剤として投与する
場合は、静脈注射、筋肉内注射、皮下注射等の非経口投
与や経口投与によって、または点眼剤、経鼻投与剤等の
局所投与により行うことができるが、本発明ペプチドの
場合は筋肉内注射が好ましい。投与量は0.01〜１００nm
ol／Kgであり、筋肉注射の場合、体重および期待効果に
応じた投与量を通常0.1 〜10mlの生理食塩水に溶解して
用いる。本発明ペプチドを薬剤として用いる場合、該ペ
プチドおよび添加剤を含む乳剤、水和剤、水溶剤、錠
剤、粉剤、粒剤、カプセル剤、丸剤等の種々の形態に製
剤化して使用できる。
チドは、血中カルシウム低下作用を有することから、骨
粗鬆症治療剤、高カルシウム血症治療剤、骨ページェッ
ト（Paget)病治療剤として利用できる。さらに、神経ペ
プチドとしての作用も有することから、鎮静剤としても
利用できる。また、軟骨魚類由来であることから、軟骨
細胞分化促進活性を示し、小人症、骨折、骨粗鬆症の治
療薬として有用である。また、治療に用いられるばかり
でなく、生体のカルシウム調節機構の解明や、骨代謝機
構の解明の手掛かりともなりうる治療剤として投与する
場合は、静脈注射、筋肉内注射、皮下注射等の非経口投
与や経口投与によって、または点眼剤、経鼻投与剤等の
局所投与により行うことができるが、本発明ペプチドの
場合は筋肉内注射が好ましい。投与量は0.01〜１００nm
ol／Kgであり、筋肉注射の場合、体重および期待効果に
応じた投与量を通常0.1 〜10mlの生理食塩水に溶解して
用いる。本発明ペプチドを薬剤として用いる場合、該ペ
プチドおよび添加剤を含む乳剤、水和剤、水溶剤、錠
剤、粉剤、粒剤、カプセル剤、丸剤等の種々の形態に製
剤化して使用できる。
【００１９】上記製剤化に用いる添加剤は、薬理学的に
許容しうる等張化剤、安定剤、保存剤、pH調整剤、賦形
剤、崩壊剤、潤滑剤、結合剤、分散剤、可塑剤等が使用
できる。等張化剤としては塩化ナトリウム等が、安定化
剤としては精製ゼラチン等が、保存剤としてはフェノー
ル等が、pH調節剤としては塩酸、水酸化ナトリウム等
が、賦形剤としては乳糖、ブドウ糖等が、崩壊剤として
は澱粉、寒天等が、潤滑剤としてはタルク、流動パラフ
ィン等が、結合剤としては単シロップ、エタノール等
が、分散剤としてはメチルセルロース、エチルセルロー
ス等が、可塑剤としてはグリセリン、澱粉等が例示でき
る。
許容しうる等張化剤、安定剤、保存剤、pH調整剤、賦形
剤、崩壊剤、潤滑剤、結合剤、分散剤、可塑剤等が使用
できる。等張化剤としては塩化ナトリウム等が、安定化
剤としては精製ゼラチン等が、保存剤としてはフェノー
ル等が、pH調節剤としては塩酸、水酸化ナトリウム等
が、賦形剤としては乳糖、ブドウ糖等が、崩壊剤として
は澱粉、寒天等が、潤滑剤としてはタルク、流動パラフ
ィン等が、結合剤としては単シロップ、エタノール等
が、分散剤としてはメチルセルロース、エチルセルロー
ス等が、可塑剤としてはグリセリン、澱粉等が例示でき
る。
【００２０】
【００２１】
【実施例１】アカエイＣＴの単離精製 200 匹のアカエイより摘出した鰓後腺 2.2ｇを−50℃で
凍結後、破砕機を用いて破砕し、７倍量の蒸留水を加え
５分間煮沸した。冷却後、酢酸を加え１Ｍとし、ポリト
ロンミキサーでホモジナイズを行った。得られた懸濁液
を４℃、25000×ｇで30分間遠心分離した。この上清に
２倍量の冷却したアセトンを加え67％として、４℃、16
000 ×ｇで30分間遠心分離して上清を得た。この上清か
ら減圧下アセトンを留去後、凍結乾燥を行い得られたも
のを１Ｍ酢酸10mlに溶解し、さらに冷却したアセトンを
600 ml加え98.5％とし、16000 ×ｇで30分間遠心分離し
た。
凍結後、破砕機を用いて破砕し、７倍量の蒸留水を加え
５分間煮沸した。冷却後、酢酸を加え１Ｍとし、ポリト
ロンミキサーでホモジナイズを行った。得られた懸濁液
を４℃、25000×ｇで30分間遠心分離した。この上清に
２倍量の冷却したアセトンを加え67％として、４℃、16
000 ×ｇで30分間遠心分離して上清を得た。この上清か
ら減圧下アセトンを留去後、凍結乾燥を行い得られたも
のを１Ｍ酢酸10mlに溶解し、さらに冷却したアセトンを
600 ml加え98.5％とし、16000 ×ｇで30分間遠心分離し
た。
【００２２】この沈渣を乾燥した後、0.1 ％トリフルオ
ロ酢酸に溶解し、この溶液を以下の条件に従い逆相高速
液体クロマトグラフィーに付した。 条件１： カラム：東ソー（株）製 ＯＤＳ−１２０Ｔ 4.6 ×25
0mm 流速 ：１ml／分 溶解液：Ａ液（0.1 ％トリフルオロ酢酸：アセトニトリ
ル＝８：２） Ｂ液（0.1 ％トリフルオロ酢酸：アセトニトリル＝２：
８） Ａ液からＢ液の直線型濃度勾配溶出（60分間) 。
ロ酢酸に溶解し、この溶液を以下の条件に従い逆相高速
液体クロマトグラフィーに付した。 条件１： カラム：東ソー（株）製 ＯＤＳ−１２０Ｔ 4.6 ×25
0mm 流速 ：１ml／分 溶解液：Ａ液（0.1 ％トリフルオロ酢酸：アセトニトリ
ル＝８：２） Ｂ液（0.1 ％トリフルオロ酢酸：アセトニトリル＝２：
８） Ａ液からＢ液の直線型濃度勾配溶出（60分間) 。
【００２３】このようにして得られた各画分を、抗サケ
ＣＴ血清が本発明のＣＴと交差反応することを利用して
イムノブロッティング法に付し、活性画分 (No.12)を得
た。即ち、凍結乾燥した画分および合成サケＣＴを0.1
Ｍ炭酸ナトリウムとメタノールの混合溶液 (4:1 、V/V
、pH9.5)10μｌに溶解し、ナイロンメンブレン (Milli
pore 社製、Immobilin PVDF trasfer membrane)上に滴
下吸着させた。この膜を100 ％メタノールに３秒間漬け
た後、0.05％Tween20 を含む10mMリン酸緩衝液 (pH7.2
：PBST) で３回洗浄後、１％ヤギ血清を含むＰＢＳＴ
で２回洗浄した。その後さらにＰＢＳＴで３回洗浄した
膜を、合成サケＣＴを用いて免疫したウサギの抗血清
（１／40000 希釈) に対し、２時間室温で反応させた。
この膜をＰＢＳＴで３回洗浄後、Vectastain ABCキット
(Vector Laboratories 社製) を用いた免疫染色を行い
活性画分を確認した。
ＣＴ血清が本発明のＣＴと交差反応することを利用して
イムノブロッティング法に付し、活性画分 (No.12)を得
た。即ち、凍結乾燥した画分および合成サケＣＴを0.1
Ｍ炭酸ナトリウムとメタノールの混合溶液 (4:1 、V/V
、pH9.5)10μｌに溶解し、ナイロンメンブレン (Milli
pore 社製、Immobilin PVDF trasfer membrane)上に滴
下吸着させた。この膜を100 ％メタノールに３秒間漬け
た後、0.05％Tween20 を含む10mMリン酸緩衝液 (pH7.2
：PBST) で３回洗浄後、１％ヤギ血清を含むＰＢＳＴ
で２回洗浄した。その後さらにＰＢＳＴで３回洗浄した
膜を、合成サケＣＴを用いて免疫したウサギの抗血清
（１／40000 希釈) に対し、２時間室温で反応させた。
この膜をＰＢＳＴで３回洗浄後、Vectastain ABCキット
(Vector Laboratories 社製) を用いた免疫染色を行い
活性画分を確認した。
【００２４】この得られた活性画分を凍結乾燥後、同様
に以下の条件にて再度逆相高速液体クロマトグラフィー
に付した。 条件２: カラム：東ソー（株）製 ＯＤＳ−１２０Ｔ 4.6 ×２
５０ｍｍ 流速 ：１ml／分 溶解液：Ａ液（水：アセトニトリル：１Ｍ酢酸アンモニ
ウム、pH4.6＝72：８：１、V/V) Ｂ液（水：アセトニトリル：１Ｍ酢酸アンモニウム、pH
4.6＝25：100 ：１、V/V) Ａ液からＢ液の直線型濃度勾配溶出（40分間) 。
に以下の条件にて再度逆相高速液体クロマトグラフィー
に付した。 条件２: カラム：東ソー（株）製 ＯＤＳ−１２０Ｔ 4.6 ×２
５０ｍｍ 流速 ：１ml／分 溶解液：Ａ液（水：アセトニトリル：１Ｍ酢酸アンモニ
ウム、pH4.6＝72：８：１、V/V) Ｂ液（水：アセトニトリル：１Ｍ酢酸アンモニウム、pH
4.6＝25：100 ：１、V/V) Ａ液からＢ液の直線型濃度勾配溶出（40分間) 。
【００２５】その結果、ペプチドに基づく強い吸光度
(A230) が単一ピークに認められた。この画分を凍結乾
燥して純粋な本発明ＣＴ122nmolｅを得た。以上のよう
にして得られた純粋な本発明ＣＴ 12.2nmoleをＳ−カル
ボキシルメチル化した後、条件１と同様にして逆相高速
液体クロマトグラフィーに付し精製した。これをアミノ
酸分析に供し、前述のアミノ酸組成値を得た。さらに、
常法によりエドマン分解を行い、公知のアミノ酸配列分
析法によりアミノ基末端より順次アミノ酸配列を決定し
た。カルボキシル基末端のプロリンがアミド化されてい
ることは、アミド化された合成アカエイＣＴと共に上記
条件１および２の下で高速液体クロマトグラフィーに付
し、単一のピークとなることで確認した。このようにし
てアカエイＣＴは配列表の配列番号１に示すアミノ酸配
列を有することが決定された。
(A230) が単一ピークに認められた。この画分を凍結乾
燥して純粋な本発明ＣＴ122nmolｅを得た。以上のよう
にして得られた純粋な本発明ＣＴ 12.2nmoleをＳ−カル
ボキシルメチル化した後、条件１と同様にして逆相高速
液体クロマトグラフィーに付し精製した。これをアミノ
酸分析に供し、前述のアミノ酸組成値を得た。さらに、
常法によりエドマン分解を行い、公知のアミノ酸配列分
析法によりアミノ基末端より順次アミノ酸配列を決定し
た。カルボキシル基末端のプロリンがアミド化されてい
ることは、アミド化された合成アカエイＣＴと共に上記
条件１および２の下で高速液体クロマトグラフィーに付
し、単一のピークとなることで確認した。このようにし
てアカエイＣＴは配列表の配列番号１に示すアミノ酸配
列を有することが決定された。
【００２６】
【実施例２】実施例１で得られた本発明ＣＴと同じアミ
ノ酸配列を有する32個のアミノ酸からなるペプチドを、
Yanagisawa等の方法 (Pro. Natl. Acad. Sci. USA 85：
6964-6967, 1988)に準じて合成した。即ち、アプライド
・バイオシステム社製全自動ペプチド合成機を用い、第
３級ブチルオキシカルボニル（BOC)法によるアミノ酸の
カップリングを行った。得られた直鎖ペプチド中のシス
ティンの保護基をフェリシアン化カリウムによる酸化に
よってジスルフィド結合を形成させた。合成品は逆相高
速液体クロマトグラフィー (島津製作所LC8A)によって
精製した。以上のようにして得られた合成ペプチドを、
実施例１で得られた本発明ＣＴと共に条件１および２に
従い逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、両者が同
一の溶出位置にあることを確認した。
ノ酸配列を有する32個のアミノ酸からなるペプチドを、
Yanagisawa等の方法 (Pro. Natl. Acad. Sci. USA 85：
6964-6967, 1988)に準じて合成した。即ち、アプライド
・バイオシステム社製全自動ペプチド合成機を用い、第
３級ブチルオキシカルボニル（BOC)法によるアミノ酸の
カップリングを行った。得られた直鎖ペプチド中のシス
ティンの保護基をフェリシアン化カリウムによる酸化に
よってジスルフィド結合を形成させた。合成品は逆相高
速液体クロマトグラフィー (島津製作所LC8A)によって
精製した。以上のようにして得られた合成ペプチドを、
実施例１で得られた本発明ＣＴと共に条件１および２に
従い逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、両者が同
一の溶出位置にあることを確認した。
【００２７】
【実施例３】実験前24時間絶食した、体重90〜110 ｇの
Wistar系雄性ラット (１群１０匹）に、ウシ血清アルブ
ミン0.1 ％を含む0.9 ％食塩水溶液 (pH4.6)に溶解した
サケＣＴ標準溶液、ウナギＣＴ標準溶液ならびに本発明
ＣＴの合成品の溶液 (１pmolおよび10pmol／ラット）を
静脈注射した。投与後正確に１時間経過後、動脈より採
血し、血清中のカルシウム濃度を原子吸光分光光度計に
より測定した。標準溶液１pmolおよび10pmol／ラット投
与群のラットの血清カルシウム値とそれぞれに対応する
本発明ＣＴ投与群のラットの血清カルシウム値より、平
行検定法を用いて相対力価を求めた。用いたサケＣＴお
よびウナギＣＴ標準値の力価は、約3500ＩＵ／mgと約45
00ＩＵ／mgであり、一方本発明ＣＴの力価は約3770ＩＵ
／mgであった。このように本発明ペプチドは優れた血中
カルシウム低下作用を示す。
Wistar系雄性ラット (１群１０匹）に、ウシ血清アルブ
ミン0.1 ％を含む0.9 ％食塩水溶液 (pH4.6)に溶解した
サケＣＴ標準溶液、ウナギＣＴ標準溶液ならびに本発明
ＣＴの合成品の溶液 (１pmolおよび10pmol／ラット）を
静脈注射した。投与後正確に１時間経過後、動脈より採
血し、血清中のカルシウム濃度を原子吸光分光光度計に
より測定した。標準溶液１pmolおよび10pmol／ラット投
与群のラットの血清カルシウム値とそれぞれに対応する
本発明ＣＴ投与群のラットの血清カルシウム値より、平
行検定法を用いて相対力価を求めた。用いたサケＣＴお
よびウナギＣＴ標準値の力価は、約3500ＩＵ／mgと約45
00ＩＵ／mgであり、一方本発明ＣＴの力価は約3770ＩＵ
／mgであった。このように本発明ペプチドは優れた血中
カルシウム低下作用を示す。
【００２８】
【実施例４】鈴木等の方法（最新組織培養応用研究法：
山根績、遠藤浩良編、116 〜128 、ソフトサイエンス
社、東京、1985) に従い準備したウサギ肋軟骨成長軟骨
培養細胞を、ウシ胎児血清10％を含むαMEM 培地(Flow
Laboratory社) に3.5万個／mlになるように懸濁し、コ
ラーゲンでコートした24穴のマルチウエルプレート (直
径16mm: Corning 社製) の各穴に１mlづつ播種する。こ
れを炭酸ガスインキュベーター (サンヨー／フォーマ
社) を用い、５％炭酸ガス−95％空気中、37℃で９日間
培養する。この途中、培養４日目および６日目に培地交
換を行い、このとき、ウシ血清アルブミン 0.2％を含む
リン酸緩衝液に、それぞれ、サケCT標準品、ウナギCT標
準品および本発明CTを10-12mol/ml を含んだリン酸緩衝
液10μl を加えた。なお、ウシ血清アルブミン 0.2％は
含むがCTは含まないリン酸緩衝液を加えたものをコント
ロールとした。培養９日目に細胞層(1) を回収し、Ｐ−
ニトロフェニルリン酸を基質としてBesseyらの方法(J.B
iol, Chem. 164:321-329, 1946)に従って各穴当りのア
ルカリホスファターゼ活性を求めた。
山根績、遠藤浩良編、116 〜128 、ソフトサイエンス
社、東京、1985) に従い準備したウサギ肋軟骨成長軟骨
培養細胞を、ウシ胎児血清10％を含むαMEM 培地(Flow
Laboratory社) に3.5万個／mlになるように懸濁し、コ
ラーゲンでコートした24穴のマルチウエルプレート (直
径16mm: Corning 社製) の各穴に１mlづつ播種する。こ
れを炭酸ガスインキュベーター (サンヨー／フォーマ
社) を用い、５％炭酸ガス−95％空気中、37℃で９日間
培養する。この途中、培養４日目および６日目に培地交
換を行い、このとき、ウシ血清アルブミン 0.2％を含む
リン酸緩衝液に、それぞれ、サケCT標準品、ウナギCT標
準品および本発明CTを10-12mol/ml を含んだリン酸緩衝
液10μl を加えた。なお、ウシ血清アルブミン 0.2％は
含むがCTは含まないリン酸緩衝液を加えたものをコント
ロールとした。培養９日目に細胞層(1) を回収し、Ｐ−
ニトロフェニルリン酸を基質としてBesseyらの方法(J.B
iol, Chem. 164:321-329, 1946)に従って各穴当りのア
ルカリホスファターゼ活性を求めた。
【００２９】また、回収した細胞層(1) をLowry 等の方
法 (J.Biol, Chem, 193:265-275,1951) に従い、ウシ血
清アルブミンを標準として各穴当りの蛋白量を測定し
た。
法 (J.Biol, Chem, 193:265-275,1951) に従い、ウシ血
清アルブミンを標準として各穴当りの蛋白量を測定し
た。
【００３０】こうして得られたアルカリホスファターゼ
活性値と蛋白量より、単位蛋白当りのアルカリホスファ
ターゼ活性を求めると、コントロールの値の約88150nmo
l/30min/mg proteinに対し、サケCT標準品およびウナギ
CT標準品の値はそれぞれ約95000nmol/30min/mg protein
および約103000nmol/30min/mg protein であり、一方、
本発明CTの値は約106000nmol/30min/mg protein であっ
た。このように本発明CTは優れた軟骨細胞分化促進活性
を示す。
活性値と蛋白量より、単位蛋白当りのアルカリホスファ
ターゼ活性を求めると、コントロールの値の約88150nmo
l/30min/mg proteinに対し、サケCT標準品およびウナギ
CT標準品の値はそれぞれ約95000nmol/30min/mg protein
および約103000nmol/30min/mg protein であり、一方、
本発明CTの値は約106000nmol/30min/mg protein であっ
た。このように本発明CTは優れた軟骨細胞分化促進活性
を示す。
【００３１】
【発明の効果】以上詳述したように、本発明によれば、
軟骨魚類の鰓後腺から、これまでに見出されたＣＴとは
異なった新規なＣＴが提供できる。このペプチドは血中
カルシウム低下作用および軟骨細胞分化促進作用を有
し、高カルシウム血症治療剤、骨粗鬆症治療剤、骨ペー
ジェット病治療剤等の医薬として有用であるのに加え、
生体カルシウム調節機構の解明や、骨代謝機構の解明に
も重要な役割を果たすと期待される。また、従来より臨
床応用されているウナギＣＴやサケＣＴと構造が異なる
ため、ヒトの免疫機構によりそれらのＣＴが無効になっ
た後でも使用できる可能性が高い。
軟骨魚類の鰓後腺から、これまでに見出されたＣＴとは
異なった新規なＣＴが提供できる。このペプチドは血中
カルシウム低下作用および軟骨細胞分化促進作用を有
し、高カルシウム血症治療剤、骨粗鬆症治療剤、骨ペー
ジェット病治療剤等の医薬として有用であるのに加え、
生体カルシウム調節機構の解明や、骨代謝機構の解明に
も重要な役割を果たすと期待される。また、従来より臨
床応用されているウナギＣＴやサケＣＴと構造が異なる
ため、ヒトの免疫機構によりそれらのＣＴが無効になっ
た後でも使用できる可能性が高い。
【００３２】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：３２ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：アカエイ（Dasyatis akajei） 組織名：鰓後腺 配列の特徴 存在位置：３２ 他の情報：カルボキシル基がアミド化されている 配列 Cys Thr Ser Leu Ser Thr Cys Val Val Gly Lys Leu Ser Gln Gln Leu 1 5 10 15 His Lys Leu Gln Asn Ile Gln Arg Thr Asp Val Gly Ala Ala Thr Pro 20 25 30
【図１】従来のカルシトニンおよび本発明カルシトニン
のアミノ酸配列を示す図である。
のアミノ酸配列を示す図である。
Claims (7)
- 【請求項１】 軟骨魚類の鰓後腺から得られた、血中カ
ルシウム低下作用を有するペプチド。 - 【請求項２】 分子量が３４００±４００である請求項
１記載のペプチド。 - 【請求項３】 次の一般式で表されるペプチドおよびそ
の塩。 Ｘ−Cys-Thr-Ser-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Val-Gly-Lys-Le
u-Ser-Gln-Gln-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Asn-Ile-Gln-Arg-
Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Ala-Thr-Pro-NH2 （式中Ｘは水素、Tyr-または放射性アイソトープ標識体
と結合しうる官能基を意味する。ペプチド中のシスティ
ン残基は相互にジスルフィド結合で架橋されていてもよ
い） - 【請求項４】 請求項１、２または３に記載のペプチド
を産生する細胞より、請求項１、２または３に記載のペ
プチドを回収することを特徴とする請求項１、２または
３に記載のペプチドの製造方法。 - 【請求項５】 請求項１、２、または３に記載のペプチ
ドまたはその塩を有効成分とし、薬剤的に許容しうる添
加剤を含有する薬剤組成物。 - 【請求項６】 請求項１、２または３に記載のペプチド
またはその塩を有効成分とする血中カルシウム低下剤。 - 【請求項７】 請求項１、２または３に記載のペプチド
またはその塩を有効成分とする軟骨細胞分化促進剤。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3249322A JPH0539299A (ja) | 1991-05-31 | 1991-09-27 | 新規なカルシトニン |
| PCT/JP1992/000706 WO1992021700A1 (fr) | 1991-05-31 | 1992-05-29 | Nouvelle calcitonine, et production et utilisation de cette substance |
| ES92910720T ES2073924T3 (es) | 1991-05-31 | 1992-05-29 | Nueva calcitonina y metodo para la preparacion y uso de la misma. |
| EP92910720A EP0541822B1 (en) | 1991-05-31 | 1992-05-29 | Novel calcitonin, and production and use thereof |
| DE69202136T DE69202136T2 (de) | 1991-05-31 | 1992-05-29 | Neuartiges calcitonin, und seine herstellung und verwendung. |
| US07/952,735 US5440012A (en) | 1991-05-31 | 1992-05-29 | Calcitonin and method for the preparation and use thereof |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12969591 | 1991-05-31 | ||
| JP3-129695 | 1991-05-31 | ||
| JP3249322A JPH0539299A (ja) | 1991-05-31 | 1991-09-27 | 新規なカルシトニン |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0539299A true JPH0539299A (ja) | 1993-02-19 |
Family
ID=26465007
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3249322A Withdrawn JPH0539299A (ja) | 1991-05-31 | 1991-09-27 | 新規なカルシトニン |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5440012A (ja) |
| EP (1) | EP0541822B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0539299A (ja) |
| DE (1) | DE69202136T2 (ja) |
| ES (1) | ES2073924T3 (ja) |
| WO (1) | WO1992021700A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5571788A (en) * | 1991-12-09 | 1996-11-05 | Ciba-Geigy Corporation | Stable calcitonin pharmaceutical compositions |
| US5962270A (en) * | 1996-02-06 | 1999-10-05 | Bionebraska, Inc. | Recombinant preparation of calcitonin fragments and use thereof in the preparation of calcitonin and related analogs |
| GB9610281D0 (en) * | 1996-05-16 | 1996-07-24 | Ralston Stuart H | Diagnostic method and apparatus |
| EP1053243B1 (en) * | 1998-02-12 | 2011-03-30 | Emory University | Sphingolipid derivatives and their methods of use |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4898009A (ja) * | 1972-03-31 | 1973-12-13 | ||
| US4397780A (en) * | 1982-02-12 | 1983-08-09 | Armour Pharmaceutical Company | Leucine22 -calcitonin |
-
1991
- 1991-09-27 JP JP3249322A patent/JPH0539299A/ja not_active Withdrawn
-
1992
- 1992-05-29 ES ES92910720T patent/ES2073924T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-05-29 DE DE69202136T patent/DE69202136T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-05-29 EP EP92910720A patent/EP0541822B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-05-29 WO PCT/JP1992/000706 patent/WO1992021700A1/ja active IP Right Grant
- 1992-05-29 US US07/952,735 patent/US5440012A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0541822A4 (ja) | 1994-01-19 |
| EP0541822B1 (en) | 1995-04-19 |
| ES2073924T3 (es) | 1995-08-16 |
| DE69202136T2 (de) | 1995-11-30 |
| WO1992021700A1 (fr) | 1992-12-10 |
| EP0541822A1 (en) | 1993-05-19 |
| DE69202136D1 (de) | 1995-05-24 |
| US5440012A (en) | 1995-08-08 |
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