JPH05340946A - Competitive immunoassay and measuring kit - Google Patents
Competitive immunoassay and measuring kitInfo
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- JPH05340946A JPH05340946A JP17491292A JP17491292A JPH05340946A JP H05340946 A JPH05340946 A JP H05340946A JP 17491292 A JP17491292 A JP 17491292A JP 17491292 A JP17491292 A JP 17491292A JP H05340946 A JPH05340946 A JP H05340946A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、免疫測定法および免疫
測定用試薬に関する。更に詳しくは、ヘテロジニアスな
競合法による免疫測定法および免疫測定用キットに関す
る。TECHNICAL FIELD The present invention relates to an immunoassay and an immunoassay reagent. More specifically, it relates to an immunoassay and an immunoassay kit by a heterogeneous competitive method.
【０００２】[0002]
【従来の技術】従来、ヘテロジニアスな競合法免疫測定
においては、水不溶性担体に固定化された測定対象物質
に対する抗体または抗原に、酵素、蛍光物質、発光物
質、もしくは放射性同位元素などで標識された測定対象
物質あるいは測定対象物質の誘導体とサンプル中の測定
対象物質が競合反応することにより、水不溶性担体上に
免疫複合体を形成させ、その免疫複合体中の標識物質量
を測定することにより実施されてきた。2. Description of the Related Art Conventionally, in a heterogeneous competitive immunoassay, an antibody or an antigen against a substance to be measured immobilized on a water-insoluble carrier is labeled with an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, a radioactive isotope or the like. By measuring the amount of labeled substance in the immunocomplex by forming an immune complex on the water-insoluble carrier by the competitive reaction of the measurement target substance or the derivative of the measurement target substance and the measurement target substance in the sample Has been implemented.
【０００３】従来法を改良した方法として、特開昭５９
−２３２５１号公報には液層中に存在する抗原と結合性
の第１のレセプター、標識された第３のレセプターおよ
び第１のレセプターと結合性である第２のレセプターを
固相化抗体として用いることによりあらゆる測定項目に
対応した固相化抗体を提供することを特徴とした免疫測
定法および測定試薬キットに関する記載がある。As a method improved from the conventional method, Japanese Patent Laid-Open No. 59-59
No. 23251 uses a first receptor capable of binding to an antigen present in a liquid layer, a labeled third receptor and a second receptor capable of binding to the first receptor as immobilized antibodies. Thus, there is a description regarding an immunoassay method and a measurement reagent kit characterized by providing a solid-phased antibody corresponding to all measurement items.
【０００４】しかしながら、上記特開昭５９−２３２５
１号公報は、サンドイッチ法に限定された方法であり、
検査室において免疫化学的に測定される全ての項目に適
用することはできない、例えばＴ３、Ｔ４の様な甲状腺
ホルモン；コーチゾール、エストラジオールなどのステ
ロイドホルモン；ジゴキシン、ジギトキシンの様な薬物
などのハプテンは上記方法では測定できない。However, the above-mentioned Japanese Patent Laid-Open No. 59-2325.
No. 1 publication is a method limited to the sandwich method,
Not applicable to all items measured immunochemically in the laboratory, for example, thyroid hormones such as T3 and T4; steroid hormones such as cortisol and estradiol; haptens such as drugs such as digoxin and digitoxin. It cannot be measured by the above method.
【０００５】また、この方法において、第２のレセプタ
ーとして、第１のレセプターのＦｃ部分に特異的な抗体
を用いる方法が例示されているが、この場合第２のレセ
プターと第１のレセプターはそれぞれ異なる動物種から
得られた抗体を用いる必要がある。In this method, an antibody specific to the Fc portion of the first receptor is used as the second receptor. In this case, the second receptor and the first receptor are respectively It is necessary to use antibodies obtained from different animal species.
【０００６】近年、免疫測定の分野においてはモノクロ
ーナル抗体がその特異性の高さ、常に均一な性能の抗体
が得られるなどの特徴により広く利用されるようになっ
てきている。通常モノクローナル抗体はマウス由来のも
のが非常に一般的であるため、特開昭５９−２３２５１
号公報に記載されているような方法においては、第１の
レセプターにモノクローナル抗体を用いた場合、第２の
レセプターにマウスから得られたモノクローナル抗体を
用いることは通常困難であり、いずれか一方のレセプタ
ーにはマウス以外の動物が産生する抗体、すなわちポリ
クローナル抗体を使用しなくてはならなかった。In recent years, in the field of immunoassay, monoclonal antibodies have come to be widely used because of their high specificity and the ability to always obtain antibodies with uniform performance. Usually, a mouse-derived monoclonal antibody is very common.
In the method described in Japanese Patent Laid-Open Publication No. 2004-242, it is usually difficult to use a monoclonal antibody obtained from a mouse as the second receptor when the monoclonal antibody is used as the first receptor. For the receptor, an antibody produced by an animal other than mouse, that is, a polyclonal antibody had to be used.
【０００７】しかしながら、ポリクローナル抗体は力
価、特異性が不十分なため、ポリクローナル抗体を免疫
測定用試薬に使用した場合、測定感度、再現性の低下と
いった問題を発生させてきた。However, since the polyclonal antibody has insufficient titer and specificity, the use of the polyclonal antibody as a reagent for immunoassay has caused problems such as deterioration of measurement sensitivity and reproducibility.
【０００８】[0008]
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するため鋭意検討した結果、本発明に到達した。す
なわち、本発明は、試料中の測定対象物質（Ａ）、
（Ａ）に対する第一のモノクローナル抗体（Ｂ）、標識
された測定対象物質あるいは測定対象物質の誘導体であ
る（Ｃ）および水不溶性担体に固定化され、かつ第一の
モノクローナル抗体のＦｃ部分に特異的に反応する第二
のモノクローナル抗体（Ｄ）を反応させて形成された免
疫複合体中の標識物質量を測定することにより試料中の
（Ａ）の量を測定する免疫測定法ならびに上記（Ｂ）、
（Ｃ）、（Ｄ）からなる免疫測定用キットに関するもの
である。The present inventors have arrived at the present invention as a result of extensive studies to solve the above problems. That is, the present invention relates to a measurement target substance (A) in a sample,
A first monoclonal antibody (B) against (A), a labeled substance to be measured or a derivative of the substance to be measured (C), and a substance immobilized on a water-insoluble carrier and specific to the Fc portion of the first monoclonal antibody. Immunoassay method for measuring the amount of (A) in a sample by measuring the amount of a labeling substance in an immune complex formed by reacting a second monoclonal antibody (D) that reacts with the above ),
The present invention relates to an immunoassay kit comprising (C) and (D).
【０００９】本発明において、固相化抗体として測定対
象物質に対するモノクローナル抗体のＦｃ部分に特異的
なモノクローナル抗体を用いることが可能となったこと
により、先に挙げた測定感度、再現性の低下といった問
題を発生させることがなくなり、常に安定した性能の免
疫測定用キットを供給することが可能となった。In the present invention, since it becomes possible to use a monoclonal antibody specific to the Fc portion of the monoclonal antibody against the substance to be measured as the immobilized antibody, the measurement sensitivity and reproducibility mentioned above are reduced. It has become possible to supply an immunoassay kit with stable performance without causing problems.
【００１０】本発明において、モノクローナル抗体はマ
ウス、ラットなどから得られたものが挙げられるが、好
ましいのは抗体同志の非特異的吸着が小さく、かつ抗原
性物質との親和力の強いモノクローナル抗体を作製でき
るマウスから得られたものである。モノクローナル抗体
はケラー等の方法（ネイチャー、第２５６巻、４９５
頁、１９７５年）によって得ることができる。In the present invention, examples of the monoclonal antibody include those obtained from mouse, rat and the like, but it is preferable to prepare a monoclonal antibody which has a small non-specific adsorption between the antibodies and has a strong affinity with an antigenic substance. It was obtained from a mouse that can. Monoclonal antibodies can be obtained by the method of Keller et al. (Nature, Vol. 256, 495).
P., 1975).
【００１１】本発明において、測定対象物質（Ａ）とし
てはＴ３、Ｔ４などの甲状腺ホルモン；コーチゾール、
エストラジオール、プロゲステロンなどのステロイドホ
ルモン；およびジゴキシン、ジギトキシン、テオフィリ
ン、ジフェニルヒダントインなどの薬物に代表されるハ
プテン抗原が挙げられる。さらに、ＡＦＰ、ＣＥＡ、Ｃ
Ａ１９−９などの腫瘍マーカー；ＴＳＨ、ＬＨ、ＦＳ
Ｈ、インスリンなどのホルモン；ＣＲＰ、β２−マイク
ログロブリンの様な蛋白；肝炎抗原などの感染性物質、
肝炎抗体、ＩｇＥなどの抗体のような通常サンドイッチ
法で測定される物質も本発明における方法によって測定
することができる。In the present invention, thyroid hormones such as T3 and T4 are used as the substance (A) to be measured; cortisol,
Steroid hormones such as estradiol and progesterone; and hapten antigens represented by drugs such as digoxin, digitoxin, theophylline, and diphenylhydantoin. In addition, AFP, CEA, C
Tumor markers such as A19-9; TSH, LH, FS
H, hormones such as insulin; CRP, proteins such as β2-microglobulin; infectious substances such as hepatitis antigens,
Substances that are usually measured by the sandwich method, such as hepatitis antibodies and antibodies such as IgE, can also be measured by the method of the present invention.
【００１２】本発明において、第一のモノクローナル抗
体（Ｂ）としてはＦｃ部分を含む全抗体を用いることが
必要である。In the present invention, it is necessary to use a whole antibody containing the Fc portion as the first monoclonal antibody (B).
【００１３】さらに、（Ｂ）としてはＩｇＧ、ＩｇＭ、
ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥのそれぞれのクラスの抗体を用
いることができる。これらのうち、好ましいのはＩｇ
Ｇ、ＩｇＭ、ＩｇＡクラスである。Further, (B) includes IgG, IgM,
Antibodies of the respective classes of IgA, IgD and IgE can be used. Of these, Ig is preferred.
G, IgM, IgA class.
【００１４】本発明において、測定対象物質もしくは測
定対象物質の誘導体（Ｃ）を標識する物質としては酵
素、蛍光物質、発光物質もしくは放射性同位元素が好適
に用いられる。In the present invention, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance or a radioisotope is preferably used as the substance for labeling the substance to be measured or the derivative (C) of the substance to be measured.
【００１５】これらの標識物質としては、免疫測定にお
いて既に公知な物質のいずれもが使用することができ
る。酵素としては西洋ワサビぺルオキシダーゼ、アルカ
リフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−Ｄ
−ガラクトシダーゼなどが；蛍光物質としてはフルオレ
セイン、ユーロピウム誘導体などが；発光物質としては
アクリジニウムエステル、Ｎ−アミノブチル−Ｎ−エチ
ルイソルミノール（ＡＢＥＩ）などが；放射性同位元素
としては125Ｉや131Ｉが挙げられる。As the labeling substance, any substance already known in immunoassay can be used. Enzymes include horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase, β-D
Galactosidase and the like; fluorescent substances such as fluorescein and europium derivatives; luminescent substances such as acridinium ester and N-aminobutyl-N-ethylisoluminol (ABEI); and radioactive isotopes such as 125 I and 131. I is mentioned.
【００１６】この標識方法としては上記の何れのタイプ
の場合も従来公知の標識方法で作製することができる。
例えば、酵素により標識する方法としては石川らの方
法（アナリティカル・レター、第１５巻、１４７頁、１
９８２年）；蛍光物質を標識する方法としてはヘミラ
等の方法（アナリティカル・バイオケミストリー、第１
３７巻、３３５頁、１９８４年）；発光物質を標識す
る方法としてはウッドヘッド等の方法（クリニカル・ケ
ミストリー、第２９巻、１４８０頁、１９８３年）；
放射性同位元素を標識する方法としてはハンター等の方
法（ネイチャー、１９４巻、４９５頁、１９６２年）な
どが挙げられる。As the labeling method, any of the above types can be prepared by a conventionally known labeling method.
For example, as a method of labeling with an enzyme, the method of Ishikawa et al. (Analytical Letter, Vol. 15, pp. 147, 1
982); as a method for labeling a fluorescent substance, a method such as hemila (Analytical Biochemistry, No. 1)
37, 335, 1984); Woodhead et al. (Clinical Chemistry, 29, 1480, 1983) as a method for labeling a luminescent substance;
As a method for labeling the radioisotope, a method such as Hunter (Nature, 194, 495, 1962) and the like can be mentioned.
【００１７】本発明において、第二のモノクローナル抗
体（Ｄ）としては、第一のモノクローナル抗体（Ｂ）と
同じ動物種から得られたものである。また、（Ｄ）はＦ
ｃ部分を含む全抗体であってもよいし、その全抗体をペ
プシンまたはパパインなどの酵素で分解することによっ
て得られるＦ（ａｂ’）2、Ｆａｂフラグメント、また
はＦ（ａｂ’）2フラグメントをメルカプトエチルアミ
ンなどの還元剤で還元することによって得られるＦａ
ｂ’フラグメントであってもよい。In the present invention, the second monoclonal antibody (D) is obtained from the same animal species as the first monoclonal antibody (B). Also, (D) is F
It may be a whole antibody containing the c portion, or F (ab ′) 2 , Fab fragment, or F (ab ′) 2 fragment obtained by degrading the whole antibody with an enzyme such as pepsin or papain may be mercapto. Fa obtained by reducing with a reducing agent such as ethylamine
It may be a b'fragment.
【００１８】また、（Ｄ）は、（Ｂ）がＩｇＧの場合、
ＩｇＧ由来のＦｃ部分を；（Ｂ）がＩｇＭの場合、Ｉｇ
Ｍ由来のＦｃ部分を；（Ｂ）がＩｇＡの場合は、ＩｇＡ
由来のＦｃ部分をというように、（Ｂ）のクラス、サブ
クラスに対応したＦｃ部分を免疫することによって得る
ことができる。さらに、より特異性の高い抗体を得るた
めには、ポリクローナルなマウスのＩｇＧ、ＩｇＭ、Ｉ
ｇＡ由来のＦｃ部分を免疫するよりも、モノクローナル
なマウスのＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ由来のＦｃ部分を免
疫した方が、より特異性の高いモノクローナル抗体を得
ることができる。Further, (D) is, when (B) is IgG,
Fc portion derived from IgG; (B) IgM when IgM
Fc portion from M; IgA when (B) is IgA
The derived Fc portion can be obtained by immunizing the Fc portion corresponding to the class and subclass of (B). Furthermore, in order to obtain a more specific antibody, polyclonal mouse IgG, IgM, I
It is possible to obtain a more specific monoclonal antibody by immunizing the Fc portion derived from IgG, IgM, or IgA of a monoclonal mouse, rather than the Fc portion derived from gA.
【００１９】本発明において、（Ｄ）を固定化する水不
溶性担体としてはガラスビーズ、プラスティックビー
ズ、プラスティック試験管、ガラスフィルター、マイク
ロパーティクルなどこれまで公知の担体のいずれも使用
することができる。In the present invention, as the water-insoluble carrier for immobilizing (D), any of known carriers such as glass beads, plastic beads, plastic test tubes, glass filters and microparticles can be used.
【００２０】水不溶性担体に、上記（Ｄ）を結合させる
方法としては、特開平２−２０５７７４号公報に記載の
方法と同様でよい。すなわち、ガラスと（Ｄ）を化学的
に結合させる方法（例えば、米国特許第４２８０９９２
号明細書および同第３６５２７６１号明細書）、および
プラスティックに抗体を物理吸着させる方法（例えば、
イー・エングバル等；バイオキム・バイオフィズ・アク
タ、２５１巻、４２７頁、１９７１年）がある。The method of binding the above-mentioned (D) to the water-insoluble carrier may be the same as the method described in JP-A-2-205774. That is, a method of chemically bonding glass and (D) (for example, US Pat. No. 4,280,992).
And No. 3652561), and a method of physically adsorbing an antibody to a plastic (for example,
E. Engval et al .; Biokim Biofiz Actor, Vol. 251, 427, 1971).
【００２１】本発明において、免疫複合体は（Ｂ）、
（Ｃ）、（Ｄ）および（Ａ）を含む試料をいかに示した
［方法１］〜［方法３］の３通りの方法で反応させるこ
とによって水不溶性担体上に形成させることができる。
すなわち、［方法１］として（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）お
よび（Ａ）を同時に反応させる方法、［方法２］として
（Ｂ）、（Ｃ）および（Ａ）を反応させてから（Ｄ）と
反応させる方法、および［方法３］として（Ｂ）、
（Ｄ）および（Ａ）を反応させ、Ｂ／Ｆ分離によって未
反応物を除去してから（Ｃ）と反応させる方法、の以上
３通りの順序での測定方法のいずれもが本発明において
は適用することができる。In the present invention, the immune complex (B) is
A sample containing (C), (D) and (A) can be formed on a water-insoluble carrier by reacting in three ways, [Method 1] to [Method 3].
That is, as [Method 1], (B), (C), (D), and (A) are simultaneously reacted, and as [Method 2], (B), (C), and (A) are reacted. D) and as [Method 3] (B),
In the present invention, any of the measuring methods in the above three orders, that is, the method of reacting (D) and (A), removing the unreacted material by B / F separation and then reacting with (C), is used in the present invention. Can be applied.
【００２２】該免疫複合体中の標識物質量は、いずれも
これまで公知の方法を用いて測定することができる。標
識物が酵素の場合、その酵素活性は分光光度計を用いる
比色法（エングバル等、ジェー・イムノール、１０９
巻、１２９頁、１９７２年）；蛍光光度計を用いる蛍光
法（渡辺等、クリニカル・ケミストリー、２５巻、８０
頁、１９７９年）；ルミノメーターを用いる発光法（ソ
ルペ等、メッソズ・イン・エンザイモロジー、１３３
巻、３３１頁、１９８６年）などにより測定することが
できる。また、標識物が蛍光物質の場合、ヘミラ等の方
法（アナリティカル・バイオケミストリー、１３７巻、
３３５頁、１９８４年）などによって蛍光光度計を用い
て測定することができ、標識物が発光物質の場合、ウィ
ークス等の方法（クリニカル・ケミストリー、２９巻、
１４７４頁、１９８３年）などによってルミノメーター
を用いて測定することができ、標識物が放射性同位元素
の場合、エスピノーザ等の方法（クリニカル・ケミスト
リー、３３巻、１４３９頁、１９８７年）などによって
シンチレーションカウンターを用いて測定することがで
きる。該免疫複合体中の標識物質量は、いずれもこれま
で公知の方法を用いて測定することができる。The amount of the labeling substance in the immune complex can be measured by any conventionally known method. When the labeled substance is an enzyme, the enzyme activity is measured by a colorimetric method using a spectrophotometer (Engval et al., J. Imnor, 109
Vol., 129, 1972); Fluorescence method using a fluorometer (Watanabe et al., Clinical Chemistry, 25, 80)
P., 1979); Luminescence method using luminometer (Solpe et al., Messo's in Enzymology, 133)
Vol., Page 331, 1986) and the like. In addition, when the labeling substance is a fluorescent substance, a method such as hemila (Analytical Biochemistry, Volume 137,
335, 1984) and the like using a fluorometer, and when the labeled substance is a luminescent substance, a method such as Weeks (Clinical Chemistry, Vol. 29,
(1474, 1983) and the like using a luminometer, and when the labeled substance is a radioisotope, a scintillation counter is used by a method such as Espinosa (Clinical Chemistry, 33, 1439, 1987). Can be used for measurement. The amount of the labeling substance in the immune complex can be measured by any method known so far.
【００２３】本発明はまた、上記第一、第二の２種類の
モノクローナル抗体からなる免疫測定用キット、特に競
合法免疫測定用キットに関するものである。The present invention also relates to an immunoassay kit comprising the above-mentioned first and second monoclonal antibodies, particularly a competitive immunoassay kit.
【００２４】本発明の免疫測定用キットは、必須構成成
分である上記２種類の抗体以外に、この免疫測定用キッ
トの使用を便ならしめるために、種々の補助剤を含有さ
せることができる。例えば、免疫反応におけるサンプル
のｐＨの影響を回避するために用いられる各種緩衝液も
しくは緩衝剤；免疫反応を効率よく進行させ、かつ様々
な血清成分の免疫反応への阻害を回避するための様々な
蛋白成分や糖成分；免疫測定において非特異的吸着を防
止するのに用いられる界面活性剤；キットの保存安定性
のための防腐剤などを任意の組合せで包含させることが
できる。The immunoassay kit of the present invention may contain various auxiliary agents in addition to the above-mentioned two kinds of antibodies which are essential constituents in order to make the use of the immunoassay kit convenient. For example, various buffers or buffers used for avoiding the influence of the pH of the sample on the immune reaction; various buffers or buffers for efficiently promoting the immune reaction and avoiding inhibition of various serum components on the immune reaction. A protein component and a sugar component; a surfactant used for preventing nonspecific adsorption in immunoassays; a preservative for the storage stability of the kit and the like can be included in any combination.
【００２５】[0025]
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに説明する
が本発明はこれに限定されるものではない。EXAMPLES The present invention will be further described below with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
【００２６】実施例 Ｔ４の測定Example T4 measurement
【００２７】(1) 固相用モノクローナル抗体の作製 抗ＡＦＰモノクローナル抗体のＦｃ部分１００μｇをフ
ロイントの完全アジュバントとともにＢＡＬＢ／ｃマウ
スの腹腔内に投与し免疫した。２ヶ月後に再び抗ＡＦＰ
モノクローナル抗体のＦｃ部分１００μｇを静脈内に投
与し、３日後に脾臓を摘出して脾細胞を採取した。ＲＰ
ＭＩ １６４０培地にて洗浄した後、脾細胞全量を２×
１０7 個のマウスミエローマ細胞（Ｐ３−ＮＳ１／１−
Ａｇ４．１）と混ぜ、３７℃の４２．５％ポリエチレン
グリコール１５４０および７．５％ジメチルスルホキシ
ドを含むＲＰＭＩ １６４０培地１ｍｌ中で１分間融合
させた。１分後にその細胞懸濁物をＲＰＭＩ １６４０
培地５ｍｌで徐々に希釈した。それらの細胞を遠心分離
し、洗浄した後、ＨＡＴ培地（ヒポシサンチン、アミノ
プテリン、チミジン、１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ
１６４０培地）を２０ｍｌになるよう加えて、９６ウ
ェルマイクロプレートに０．２ｍｌずつ分注して２週間
培養した後、増殖したウェル中の培養上清の抗体活性を
測定した。(1) Preparation of Monoclonal Antibody for Solid Phase 100 μg of Fc portion of anti-AFP monoclonal antibody was administered intraperitoneally to BALB / c mouse together with Freund's complete adjuvant for immunization. Anti-AFP again after 2 months
100 μg of Fc portion of the monoclonal antibody was intravenously administered, and 3 days later, the spleen was excised and splenocytes were collected. RP
After washing with MI 1640 medium, the total amount of splenocytes was 2 ×.
10 7 mouse myeloma cells (P3-NS1 / 1-
Ag 4.1) and mixed at 37 ° C. for 1 minute in 1 ml of RPMI 1640 medium containing 42.5% polyethylene glycol 1540 and 7.5% dimethylsulfoxide. After 1 minute, the cell suspension was washed with RPMI 1640.
It was gradually diluted with 5 ml of medium. The cells were centrifuged and washed, and then HAT medium (hypocysantin, aminopterin, thymidine, RPMI containing 10% fetal bovine serum was used.
(1640 medium) was added to 20 ml, and 0.2 ml of each was dispensed into a 96-well microplate and cultured for 2 weeks. Then, the antibody activity of the culture supernatant in the grown wells was measured.
【００２８】次に、活性の認められたウェルの細胞を限
界希釈法により繰り返してクローン化し、抗マウスＦｃ
モノクローナル抗体を産生する細胞を得た。この細胞を
無血清培養液中で培養し、培養上清液を採取した。この
培養液中のモノクローナル抗体をアフィ・ゲル・プロテ
インＡ ＭＡＰＳキット（バイオラッド社製）を用いて
精製単離し、以下の検討に用いた。Next, the cells in the wells in which the activity was recognized were repeatedly cloned by the limiting dilution method to obtain anti-mouse Fc.
Cells that produce monoclonal antibodies were obtained. The cells were cultured in a serum-free culture medium, and the culture supernatant was collected. The monoclonal antibody in this culture solution was purified and isolated using the Affi-Gel Protein A MAPS kit (manufactured by Bio-Rad) and used for the following studies.
【００２９】(2) 固相への抗体の結合 炭酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ９．５）に先に得られた
抗マウスＦｃモノクローナル抗体を１００μｇ／ｍｌに
なるように溶解した。ヌンク社製ポリスチレン試験管
（１２×７５ｍｍ）にこのモノクローナル抗体含有炭酸
緩衝液を各５００μｌずつ分注し、４℃で４８時間反応
させ抗体を試験管内壁に固定化した。反応終了後、アス
ピレーターを用いて試験管内の液を除去した。生理食塩
水１ｍｌで試験管内を３回洗浄し、さらに１％牛血清ア
ルブミン（以下ＢＳＡと略す）を含むリン酸緩衝液
（０．０２Ｍ、ｐＨ７．２）１ｍｌを加え、使用時まで
４℃で保存した。(2) Binding of Antibody to Solid Phase The anti-mouse Fc monoclonal antibody obtained above was dissolved in a carbonate buffer (0.02M, pH 9.5) to a concentration of 100 μg / ml. 500 μl of each carbonate buffer solution containing this monoclonal antibody was dispensed into a polystyrene test tube (12 × 75 mm) manufactured by Nunc Co., Ltd., and reacted at 4 ° C. for 48 hours to immobilize the antibody on the inner wall of the test tube. After the reaction was completed, the liquid in the test tube was removed using an aspirator. The inside of the test tube was washed 3 times with 1 ml of physiological saline, and 1 ml of a phosphate buffer solution (0.02M, pH 7.2) containing 1% bovine serum albumin (hereinafter abbreviated as BSA) was added, and the mixture was kept at 4 ° C until use. saved.
【００３０】(3) 西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗Ｔ
４の調製 Ｔ４（カルバイオケミストリー社製）と西洋ワサビペル
オキシダーゼ（東洋紡社製）をアブラメス等の方法（イ
ムノケミストリー、第６巻、４３ページ、１９６９年）
に従って結合し、酵素標識Ｔ４を得た。(3) Horseradish peroxidase-labeled anti-T
Preparation of 4 T4 (manufactured by Calbio Chemistry) and horseradish peroxidase (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) by a method such as Abrames (Immunochemistry, Volume 6, p. 43, 1969)
According to the procedure described above, the enzyme label T4 was obtained.
【００３１】(4) 発光試薬の調製 ルミノール（東京化成製）０．１８ｇ、ｐ−ヨードフェ
ノール（ナカライテスク社製）０．１０ｇおよび３０％
過酸化水素溶液５００μｌを０．１Ｍ、ｐＨ８．０のト
リス／塩酸緩衝液１リットルに溶解し、これをストック
溶液とした。(4) Preparation of luminescent reagent Luminol (Tokyo Kasei) 0.18 g, p-iodophenol (Nacalai Tesque) 0.10 g and 30%
500 μl of hydrogen peroxide solution was dissolved in 1 L of 0.1 M Tris / hydrochloric acid buffer having a pH of 8.0, and this was used as a stock solution.
【００３２】(5) 血中Ｔ４の測定 第一抗体溶液の調製 抗Ｔ４モノクローナル抗体（ベーリンガー・マンハイム
社製）を１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐ
Ｈ７．２）で１００μｇ／ｍｌとなるよう希釈した。(5) Measurement of T4 in blood Preparation of first antibody solution An anti-T4 monoclonal antibody (Boehringer Mannheim) was added to 1% BSA-containing phosphate buffer (0.02M, p).
It was diluted to 100 μg / ml with H7.2).
【００３３】酵素標識Ｔ４液の調製 (3) で得たペルオキシダーゼ標識Ｔ４を０．２％ＢＳ
Ａ、０．０４％ＡＮＳ（８−アニリノ−１−ナフタレン
スルホン酸・アンモニウム、ナカライテスク社製）含有
バリビタール緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ８．６）で５０
００培に希釈した。Preparation of enzyme-labeled T4 solution The peroxidase-labeled T4 obtained in (3) was added to 0.2% BS.
A, 50 with a 0.04% ANS (8-anilino-1-naphthalene sulfonic acid / ammonium, manufactured by Nacalai Tesque, Inc.) barbital buffer (0.02M, pH 8.6)
It was diluted to 00 culture.
【００３４】標準液標準液の調製 標準液は宮井等の方法（エンドクリノール・ジャパン、
第２７巻、３７５ページ、１９８０年）に従い、ヒト血
清を活性炭処理することにより得られたＴ３、Ｔ４フリ
ー血清にＴ４（カルバイオケミストリー社製）を添加
し、２．０、６．０、１２．０、２４．０μｇ／ｄｌと
なるよう調製した。Standard Solution Preparation of Standard Solution The standard solution was prepared by Miyai et al. (Endocrinol Japan,
(Vol. 27, p. 375, 1980), T4 (manufactured by Calbio Chemistry) was added to T3 and T4 free serum obtained by treating human serum with activated charcoal to obtain 2.0, 6.0, 12 It was adjusted to 0.0 and 24.0 μg / dl.
【００３５】測定操作法 (a) ［方法１］による測定 (2) で作製した抗体結合試験管中の浸漬液をアスピレー
ターを用いて除去した。生理食塩水１ｍｌを用いて試験
管内を１回洗浄した。洗浄した試験管に標準液またはサ
ンプル（ヒトプール血清）２０μｌをサンプリングし、
(5) ので調製した第一のモノクローナル抗体溶液２５
０μｌおよび(5) ので調製した酵素標識Ｔ４液２５０
μｌを加えよく攪拌し、３７℃で３０分間インキュベー
トした。反応終了後、反応液をアスピレーターを用いて
除去し、生理食塩水１ｍｌを加えて再び同様に操作し
た。この操作を３回繰り返して未反応物を除去した。Measurement Operation Method (a) Measurement by [Method 1] The immersion liquid in the antibody-binding test tube prepared in (2) was removed using an aspirator. The inside of the test tube was washed once with 1 ml of physiological saline. Sampling 20 μl of standard solution or sample (human pool serum) into the washed test tube,
(5) The first monoclonal antibody solution prepared in 25
0 μl and enzyme-labeled T4 solution 250 prepared in (5)
μl was added, the mixture was stirred well and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. After completion of the reaction, the reaction solution was removed using an aspirator, 1 ml of physiological saline was added, and the same operation was performed again. This operation was repeated 3 times to remove unreacted materials.
【００３６】洗浄の終了した先の試験管をアロカ社製ル
ミネッセンスリーダーＢＬＲ−２０１型のサンプルホル
ダーにセットし、(4) で調製した発光試薬５００μｌを
加え、化学発光反応を行った。測定値は１０秒間の積分
値として得た。The test tube after washing was set in a sample holder of luminescence reader BLR-201 type manufactured by Aloka Co., Ltd., and 500 μl of the luminescent reagent prepared in (4) was added to carry out a chemiluminescent reaction. The measured value was obtained as an integrated value for 10 seconds.
【００３７】(b) ［方法２］による測定 (2) で調製したのとは別の試験管に標準液またはサンプ
ル（ヒトプール血清）２０μｌをサンプリングし、(5)
ので調製した第一のモノクローナル抗体溶液２５０μ
ｌおよび(5) ので調製した酵素標識Ｔ４液２５０μｌ
を加えよく攪拌し、３７℃で３０分間インキュベートし
た。(B) Measurement by [Method 2] 20 μl of the standard solution or sample (human pool serum) was sampled in a test tube different from that prepared in (2), and (5)
250μ of the first monoclonal antibody solution prepared in
250 μl of enzyme-labeled T4 solution prepared in 1 and (5)
Was added, and the mixture was stirred well and incubated at 37 ° C. for 30 minutes.
【００３８】(2) で作製した抗体結合試験管中の浸漬液
をアスピレーターを用いて除去した。生理食塩水１ｍｌ
を用いて試験管内を１回洗浄した。洗浄した試験管に上
記の反応液５００μｌを加え、さらに３７℃で３０分間
反応した。反応終了後、反応液をアスピレーターを用い
て除去し、生理食塩水１ｍｌを加えて再び同様に操作し
た。この操作を３回繰り返して未反応物を除去した。The immersion liquid in the antibody-binding test tube prepared in (2) was removed using an aspirator. 1 ml saline
Was used to wash the inside of the test tube once. 500 μl of the above reaction solution was added to the washed test tube, and the mixture was further reacted at 37 ° C. for 30 minutes. After completion of the reaction, the reaction solution was removed using an aspirator, 1 ml of physiological saline was added, and the same operation was performed again. This operation was repeated 3 times to remove unreacted materials.
【００３９】洗浄の終了した先の試験管をアロカ社製ル
ミネッセンスリーダーＢＬＲ−２０１型のサンプルホル
ダーにセットし、［方法１］の場合と同様に化学発光反
応を行った。測定値は１０秒間の積分値として得た。The test tube after washing was set in a sample holder of luminescence reader BLR-201 manufactured by Aloka Co., Ltd., and chemiluminescence reaction was carried out in the same manner as in [Method 1]. The measured value was obtained as an integrated value for 10 seconds.
【００４０】(c) ［方法３］による測定 (2) で作製した抗体結合試験管中の浸漬液をアスピレー
ターを用いて除去した。生理食塩水１ｍｌを用いて試験
管内を１回洗浄した。洗浄した試験管に標準液またはサ
ンプル（ヒトプール血清）２０μｌをサンプリングし、
さらに(5) ので調製した第一のモノクローナル抗体溶
液２５０μｌを加えよく攪拌し、３７℃で３０分間イン
キュベートした。反応終了後、反応液をアスピレーター
を用いて除去し、生理食塩水１ｍｌを加えて再び同様に
操作した。この操作を３回繰り返して未反応物を除去し
た。(C) Measurement by [Method 3] The immersion liquid in the antibody-binding test tube prepared in (2) was removed using an aspirator. The inside of the test tube was washed once with 1 ml of physiological saline. Sampling 20 μl of standard solution or sample (human pool serum) into the washed test tube,
Further, 250 μl of the first monoclonal antibody solution prepared in (5) was added, stirred well, and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. After completion of the reaction, the reaction solution was removed using an aspirator, 1 ml of physiological saline was added, and the same operation was performed again. This operation was repeated 3 times to remove unreacted materials.
【００４１】先の洗浄の終了した試験管に(5) ので調
製した酵素標識Ｔ４液５００μｌを加えよく攪拌し、３
７℃で３０分間インキュベートした。反応終了後、反応
液をアスピレーターを用いて除去し、生理食塩水１ｍｌ
を加えて再び同様に操作した。この操作を３回繰り返し
て未反応物を除去した。500 μl of the enzyme-labeled T4 solution prepared in (5) was added to the test tube which had been washed as above, and the mixture was stirred well and mixed with 3
Incubated at 7 ° C for 30 minutes. After the reaction was completed, the reaction solution was removed using an aspirator, and 1 ml of physiological saline was used.
Was added and the same operation was performed again. This operation was repeated 3 times to remove unreacted materials.
【００４２】洗浄の終了した先の試験管をアロカ社製ル
ミネッセンスリーダーＢＬＲ−２０１型のサンプルホル
ダーにセットし、［方法１］の場合と同様に化学発光反
応を行った。測定値は１０秒間の積分値として得た。The test tube after washing was set in a sample holder of luminescence reader BLR-201 type manufactured by Aloka Co., Ltd., and chemiluminescence reaction was performed in the same manner as in [Method 1]. The measured value was obtained as an integrated value for 10 seconds.
【００４３】［方法１］〜［方法３］での各標準液にお
ける発光量と、その発光量をグラフにプロットして得ら
れた検量線から読み取ったヒトプール血清測定値（同一
検体をｎ＝１０で測定）と測定値の平均、標準偏差、Ｃ
Ｖを表１に示した。The amount of luminescence in each standard solution in [Method 1] to [Method 3] and the human pool serum measurement value read from the calibration curve obtained by plotting the amount of luminescence (n = 10 for the same sample) Measurement) and the average of the measured values, standard deviation, C
V is shown in Table 1.
【００４４】[0044]
【表１】 [Table 1]
【００４５】比較例 Ｔ４の測定Comparative Example T4 measurement
【００４６】比較検討用として固相に抗マウスＦｃポリ
クローナル抗体を用いた場合の測定例を以下に示した。For comparison, a measurement example using an anti-mouse Fc polyclonal antibody as the solid phase is shown below.
【００４７】(1) 固相への抗体の結合 炭酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ９．５）に抗マウスＦｃ
ポリクローナル抗体（カッペル社製）を１００μｇ／ｍ
ｌになるように溶解した。ヌンク社製ポリスチレン試験
管（１２×７５ｍｍ）にこのモノクローナル抗体含有炭
酸緩衝液を各５００μｌずつ分注し、４℃で４８時間反
応させ抗体を試験管内壁に固定化した。反応終了後、ア
スピレーターを用いて試験管内の液を除去した。生理食
塩水１ｍｌで試験管内を３回洗浄し、さらに１％ＢＳＡ
を含むリン酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ７．２）１ｍｌ
を加え、使用時まで４℃で保存した。(1) Binding of antibody to solid phase Anti-mouse Fc was added to carbonate buffer (0.02M, pH 9.5).
100 μg / m of polyclonal antibody (Kappel)
It melt | dissolved so that it might become l. 500 μl of each carbonate buffer solution containing this monoclonal antibody was dispensed into a polystyrene test tube (12 × 75 mm) manufactured by Nunc Co., Ltd., and reacted at 4 ° C. for 48 hours to immobilize the antibody on the inner wall of the test tube. After the reaction was completed, the liquid in the test tube was removed using an aspirator. The inside of the test tube was washed 3 times with 1 ml of physiological saline, and further with 1% BSA.
1 ml of phosphate buffer (0.02M, pH 7.2) containing
Was added and stored at 4 ° C. until use.
【００４８】(2) 血中Ｔ４の測定 試薬の調製 比較例における測定についても固相化抗体以外の発光試
薬、第一のモノクローナル抗体溶液、酵素標識Ｔ４液お
よび標準液などの試薬は先の実施例での検討において用
いた試薬をそのまま用いた。但し、酵素標識Ｔ４につい
ては１０００培希釈で使用した。(2) Measurement of T4 in Blood Preparation of Reagent Also in the measurement in the comparative example, reagents other than the immobilized antibody, such as the luminescent reagent, the first monoclonal antibody solution, the enzyme-labeled T4 solution and the standard solution were used in the above The reagents used in the study of the examples were used as received. However, the enzyme-labeled T4 was diluted to 1000 times.
【００４９】測定操作法 (a) ［方法１］による測定 (1) で作製した抗体結合試験管中の浸漬液をアスピレー
ターを用いて除去した。生理食塩水１ｍｌを用いて試験
管内を１回洗浄した。洗浄した試験管に標準液またはサ
ンプル（ヒトプール血清）２０μｌをサンプリングし、
で調製した第一のモノクローナル抗体溶液２５０μｌ
および酵素標識Ｔ４液２５０μｌを加えよく攪拌し、３
７℃で３０分間インキュベートした。 反応終了後、反
応液をアスピレーターを用いて除去し、生理食塩水１ｍ
ｌを加えて再び同様に操作した。この操作を３回繰り返
して未反応物を除去した。Measurement Operation Method (a) Measurement by [Method 1] The immersion liquid in the antibody-binding test tube prepared in (1) was removed using an aspirator. The inside of the test tube was washed once with 1 ml of physiological saline. Sampling 20 μl of standard solution or sample (human pool serum) into the washed test tube,
250 μl of the first monoclonal antibody solution prepared in
And 250 μl of enzyme-labeled T4 solution were added and mixed well.
Incubated at 7 ° C for 30 minutes. After the reaction was completed, the reaction solution was removed using an aspirator, and the physiological saline solution was 1 m.
1 was added and the same operation was performed again. This operation was repeated 3 times to remove unreacted materials.
【００５０】洗浄の終了した先の試験管をアロカ社製ル
ミネッセンスリーダーＢＬＲ−２０１型のサンプルホル
ダーにセットし、で調製した発光試薬５００μｌを加
え、化学発光反応を行った。測定値は１０秒間の積分値
として得た。The test tube which had been washed was set in a sample holder of luminescence reader BLR-201 type manufactured by Aloka Co., Ltd., and 500 μl of the luminescent reagent prepared in (3) was added to carry out a chemiluminescent reaction. The measured value was obtained as an integrated value for 10 seconds.
【００５１】(b) ［方法２］による測定 (1) で調製したのとは別の試験管に標準液またはサンプ
ル（ヒトプール血清）２０μｌをサンプリングし、で
調製した第一のモノクローナル抗体溶液２５０μｌおよ
び酵素標識Ｔ４液２５０μｌを加えよく攪拌し、３７℃
で３０分間インキュベートした。(B) Measurement by [Method 2] 20 μl of the standard solution or sample (human pool serum) was sampled in a test tube different from that prepared in (1), and 250 μl of the first monoclonal antibody solution prepared in Add 250 μl of enzyme-labeled T4 solution and stir well, 37 ° C
For 30 minutes.
【００５２】(1) で作製した抗体結合試験管中の浸漬液
をアスピレーターを用いて除去した。生理食塩水１ｍｌ
を用いて試験管内を１回洗浄した。洗浄した試験管に上
記の反応液５００μｌを加え、さらに３７℃で３０分間
反応した。反応終了後、反応液をアスピレーターを用い
て除去し、生理食塩水１ｍｌを加えて再び同様に操作し
た。この操作を３回繰り返して未反応物を除去した。The immersion liquid in the antibody-binding test tube prepared in (1) was removed using an aspirator. 1 ml saline
Was used to wash the inside of the test tube once. 500 μl of the above reaction solution was added to the washed test tube, and the mixture was further reacted at 37 ° C. for 30 minutes. After completion of the reaction, the reaction solution was removed using an aspirator, 1 ml of physiological saline was added, and the same operation was performed again. This operation was repeated 3 times to remove unreacted materials.
【００５３】洗浄の終了した先の試験管をアロカ社製ル
ミネッセンスリーダーＢＬＲ−２０１型のサンプルホル
ダーにセットし、［方法１］の場合と同様に化学発光反
応を行った。測定値は１０秒間の積分値として得た。The test tube after washing was set in a sample holder of luminescence reader BLR-201 type manufactured by Aloka Co., Ltd., and chemiluminescence reaction was carried out in the same manner as in [Method 1]. The measured value was obtained as an integrated value for 10 seconds.
【００５４】(c) ［方法３］による測定 (1) で作製した抗体結合試験管中の浸漬液をアスピレー
ターを用いて除去した。生理食塩水１ｍｌを用いて試験
管内を１回洗浄した。洗浄した試験管に標準液またはサ
ンプル（ヒトプール血清）２０μｌをサンプリングし、
さらにで調製した第一のモノクローナル抗体溶液２５
０μｌを加えよく攪拌し、３７℃で３０分間インキュベ
ートした。反応終了後、反応液をアスピレーターを用い
て除去し、生理食塩水１ｍｌを加えて再び同様に操作し
た。この操作を３回繰り返して未反応物を除去した。(C) Measurement by [Method 3] The immersion liquid in the antibody-binding test tube prepared in (1) was removed using an aspirator. The inside of the test tube was washed once with 1 ml of physiological saline. Sampling 20 μl of standard solution or sample (human pool serum) into the washed test tube,
Further prepared first monoclonal antibody solution 25
0 μl was added, and the mixture was stirred well and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. After completion of the reaction, the reaction solution was removed using an aspirator, 1 ml of physiological saline was added, and the same operation was performed again. This operation was repeated 3 times to remove unreacted materials.
【００５５】先の洗浄の終了した試験管にで調製した
酵素標識Ｔ４液５００μｌを加えよく攪拌し、３７℃で
３０分間インキュベートした。反応終了後、反応液をア
スピレーターを用いて除去し、生理食塩水１ｍｌを加え
て再び同様に操作した。この操作を３回繰り返して未反
応物を除去した。500 μl of the enzyme-labeled T4 solution prepared in was added to the test tube which had been washed as above, and the mixture was well stirred and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. After completion of the reaction, the reaction solution was removed using an aspirator, 1 ml of physiological saline was added, and the same operation was performed again. This operation was repeated 3 times to remove unreacted materials.
【００５６】洗浄の終了した先の試験管をアロカ社製ル
ミネッセンスリーダーＢＬＲ−２０１型のサンプルホル
ダーにセットし、［方法１］の場合と同様に化学発光反
応を行った。測定値は１０秒間の積分値として得た。The test tube after washing was set in a sample holder of luminescence reader BLR-201 type manufactured by Aloka Co., Ltd., and chemiluminescence reaction was carried out in the same manner as in [Method 1]. The measured value was obtained as an integrated value for 10 seconds.
【００５７】［方法１］〜［方法３］での各標準液にお
ける発光量と、その発光量をグラフにプロットして得ら
れた検量線から読み取ったヒトプール血清測定値（同一
検体をｎ＝１０で測定）と測定値の平均、標準偏差、Ｃ
Ｖを表２に示した。しかしながら、ポリクローナル抗体
を用いて測定した場合の結果は、測定検量線の感度、プ
ール血清の測定値の再現性いずれもモノクローナル抗体
を用いた場合より不良な結果となった。The amount of luminescence in each standard solution in [Method 1] to [Method 3] and the human pool serum measurement value read from the calibration curve obtained by plotting the amount of luminescence on a graph (n = 10 for the same sample) Measurement) and the average of the measured values, standard deviation, C
V is shown in Table 2. However, the results obtained by using the polyclonal antibody were inferior to those obtained by using the monoclonal antibody in both the sensitivity of the measurement calibration curve and the reproducibility of the measured values of the pooled serum.
【００５８】[0058]
【表２】 [Table 2]
【００５９】[0059]
【発明の効果】本発明において、固相化抗体にマウス抗
体のＦｃ部分に特異的なモノクローナル抗体を用いるこ
とにより、現行のポリクローナル抗体を用いた場合にみ
られる測定感度、再現性の劣化といった問題を発生させ
ることなく常に均一な性能の測定用キットを提供するこ
とが可能となった。INDUSTRIAL APPLICABILITY In the present invention, the use of a monoclonal antibody specific for the Fc portion of a mouse antibody as a solid-phased antibody leads to problems such as deterioration in measurement sensitivity and reproducibility observed with the current polyclonal antibody. It is now possible to provide a measurement kit that always has uniform performance without causing any problems.
Claims (4)
対する第一のモノクローナル抗体（Ｂ）、標識された測
定対象物質あるいは測定対象物質の誘導体である（Ｃ）
および水不溶性担体に固定化され、かつ第一のモノクロ
ーナル抗体のＦｃ部分に特異的に結合する第二のモノク
ローナル抗体（Ｄ）を反応させて形成された免疫複合体
中の標識物質量を測定することにより試料中の（Ａ）の
量を測定する免疫測定法。1. A substance to be measured (A) in a sample, a first monoclonal antibody (B) to (A), a labeled substance to be measured or a derivative of the substance to be measured (C).
And the amount of the labeling substance in the immune complex formed by reacting the second monoclonal antibody (D) immobilized on the water-insoluble carrier and specifically binding to the Fc portion of the first monoclonal antibody An immunoassay method by which the amount of (A) in the sample is thereby measured.
（Ｂ）と同じ動物種から得られたモノクローナル抗体で
ある請求項１記載の免疫測定法。2. The immunoassay method according to claim 1, wherein (D) is a monoclonal antibody obtained from the same animal species as the first monoclonal antibody (B).
くは放射性同位元素で標識されていることを特徴とする
請求項１または２記載の免疫測定法。3. The immunoassay method according to claim 1 or 2, wherein (C) is labeled with an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance or a radioisotope.
（Ｃ）および（Ｄ）から成る免疫測定用キット。4. (B) according to any one of claims 1 to 3,
An immunoassay kit comprising (C) and (D).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17491292A JP3174402B2 (en) | 1992-06-08 | 1992-06-08 | Competitive immunoassay and assay kit |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17491292A JP3174402B2 (en) | 1992-06-08 | 1992-06-08 | Competitive immunoassay and assay kit |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05340946A true JPH05340946A (en) | 1993-12-24 |
| JP3174402B2 JP3174402B2 (en) | 2001-06-11 |
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ID=15986876
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| JP17491292A Expired - Fee Related JP3174402B2 (en) | 1992-06-08 | 1992-06-08 | Competitive immunoassay and assay kit |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3174402B2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002040024A (en) * | 2000-03-31 | 2002-02-06 | Ortho-Clinical Diagnostics Inc | Immunoassay on c-reactive protein |
-
1992
- 1992-06-08 JP JP17491292A patent/JP3174402B2/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002040024A (en) * | 2000-03-31 | 2002-02-06 | Ortho-Clinical Diagnostics Inc | Immunoassay on c-reactive protein |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3174402B2 (en) | 2001-06-11 |
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