JPH05336987A - 酵素的ペプチド合成 - Google Patents
酵素的ペプチド合成Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 酸性アミノ酸残基のカルボキシル末端で開裂
するエンドペプチダーゼを使用して二種のアミノ酸残基
および／またはペプチド残基をカップリングする方法の
提供。 【構成】 N末端アミノ酸残基またはN末端ペプチドフラ
グメントをC末端アミノ酸残基またはC末端ペプチドフラ
グメントにカップリングして式Ｉ （式中、Y N はＨまたはN末端アミノ酸残基もしくはN末
端ペプチドフラグメント、Ｑは酸性アミノ酸残基、かつ
X C はC末端アミノ酸残基またはC末端ペプチドフラグメ
ント）を有する化合物を生成する方法であって式II （式中、Ｒは水素、アルキル、ハロアルキル、アリー
ル、アラルキル、または１個以上のヘテロ原子を有する
５員もしくは６員の複素環）を有する基質成分を、pH約
５〜10.5の水溶液または分散液中でエンドペプチダーゼ
の存在下でアミノ酸またはペプチドX C と反応させて式
Ｉの化合物を生成する方法。
するエンドペプチダーゼを使用して二種のアミノ酸残基
および／またはペプチド残基をカップリングする方法の
提供。 【構成】 N末端アミノ酸残基またはN末端ペプチドフラ
グメントをC末端アミノ酸残基またはC末端ペプチドフラ
グメントにカップリングして式Ｉ （式中、Y N はＨまたはN末端アミノ酸残基もしくはN末
端ペプチドフラグメント、Ｑは酸性アミノ酸残基、かつ
X C はC末端アミノ酸残基またはC末端ペプチドフラグメ
ント）を有する化合物を生成する方法であって式II （式中、Ｒは水素、アルキル、ハロアルキル、アリー
ル、アラルキル、または１個以上のヘテロ原子を有する
５員もしくは６員の複素環）を有する基質成分を、pH約
５〜10.5の水溶液または分散液中でエンドペプチダーゼ
の存在下でアミノ酸またはペプチドX C と反応させて式
Ｉの化合物を生成する方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はペプチド合成、特に、２
以上のペプチドフラグメントおよび／またはアミノ酸残
基の酵素的カップリングに関する。
以上のペプチドフラグメントおよび／またはアミノ酸残
基の酵素的カップリングに関する。
【０００２】
【従来の技術】ペプチドの合成は均一合成および不均一
固相合成の両方に関して多少複雑なカップリング反応に
より行い得ることが知られている。しかしながら、これ
らの全ての化学的方法は好ましくない二次反応およびラ
セミ化のリスクを伴い、それ故、化学反応を注意して制
御してこれらの問題を最小にし、または排除することが
必要である。更に、アミノ酸側鎖はしばしば保護される
必要があり、所望のペプチドを生成するために最後の化
学工程として脱ブロッキングを必要とする。合成される
ペプチドのサイズに応じて、収率が低いことがあり、そ
して二次反応は純粋なペプチドを得るために面倒な精製
操作を頻繁に必要とする。化学的ペプチド合成のこれら
の全ての固有の問題並びに幾つかのカップリング試薬お
よびブロッキングアミノ酸誘導体の高価は、小さい合成
ペプチド、例えば、ペンタペプチドでさえもが生成する
のに比較的費用がかかることを意味する。
固相合成の両方に関して多少複雑なカップリング反応に
より行い得ることが知られている。しかしながら、これ
らの全ての化学的方法は好ましくない二次反応およびラ
セミ化のリスクを伴い、それ故、化学反応を注意して制
御してこれらの問題を最小にし、または排除することが
必要である。更に、アミノ酸側鎖はしばしば保護される
必要があり、所望のペプチドを生成するために最後の化
学工程として脱ブロッキングを必要とする。合成される
ペプチドのサイズに応じて、収率が低いことがあり、そ
して二次反応は純粋なペプチドを得るために面倒な精製
操作を頻繁に必要とする。化学的ペプチド合成のこれら
の全ての固有の問題並びに幾つかのカップリング試薬お
よびブロッキングアミノ酸誘導体の高価は、小さい合成
ペプチド、例えば、ペンタペプチドでさえもが生成する
のに比較的費用がかかることを意味する。
【０００３】ペプチド（オリゴペプチドおよびポリペプ
チド）の如き生物活性化合物の合成においてペプチド結
合の形成を触媒作用するためにタンパク質分解酵素を使
用することに関心がある(Fruton,J.S.(1982)Adv.Enzymo
l.Relat.Areas Mol.Biol.53,239-306;Nakanishi,K.＆Ma
tsuno,R.(1988)Adv.Biotechnol.Processes10,173-202)
。これらの触媒の使用は、それらの高い位置選択性お
よび立体選択性のためにペプチド合成、そして一般に有
機合成に魅力的である。
チド）の如き生物活性化合物の合成においてペプチド結
合の形成を触媒作用するためにタンパク質分解酵素を使
用することに関心がある(Fruton,J.S.(1982)Adv.Enzymo
l.Relat.Areas Mol.Biol.53,239-306;Nakanishi,K.＆Ma
tsuno,R.(1988)Adv.Biotechnol.Processes10,173-202)
。これらの触媒の使用は、それらの高い位置選択性お
よび立体選択性のためにペプチド合成、そして一般に有
機合成に魅力的である。
【０００４】酵素的カップリングはペプチドの合成のた
めのフラグメント縮合戦略に適用し得る。フラグメント
縮合はしばしば側鎖の保護ペプチドフラグメントの一つ
または両方の低溶解性により妨げられる。プロテアーゼ
の高い位置選択性は側鎖保護を必要としないで酵素的カ
ップリングを可能にする。また、通常の化学量論量のカ
ップリング試薬によるフラグメント縮合は、カルボキシ
ルドナーのα炭素原子に於けるかなりのラセミ化により
悩まされることがある。プロテアーゼの立体特異性は最
高の光学純度の生成物を確保する。酵素的カップリング
の速度論的に制御された方法はフラグメント縮合に関し
て特に有望である。
めのフラグメント縮合戦略に適用し得る。フラグメント
縮合はしばしば側鎖の保護ペプチドフラグメントの一つ
または両方の低溶解性により妨げられる。プロテアーゼ
の高い位置選択性は側鎖保護を必要としないで酵素的カ
ップリングを可能にする。また、通常の化学量論量のカ
ップリング試薬によるフラグメント縮合は、カルボキシ
ルドナーのα炭素原子に於けるかなりのラセミ化により
悩まされることがある。プロテアーゼの立体特異性は最
高の光学純度の生成物を確保する。酵素的カップリング
の速度論的に制御された方法はフラグメント縮合に関し
て特に有望である。
【０００５】また、酵素的ペプチド合成は生合成前駆体
からのペプチド類縁体の半合成に使用し得る。生合成ペ
プチドの潜在的に有益な半合成修飾は、“非天然”アミ
ノ酸側鎖の組み込み、C-末端アミド化、そして既存の組
換えDNA 法では利用できない非天然産のアミノ酸を含む
フラグメントを含むその他の構造上の特徴を含む。特に
重要な一つの領域は、ヒトの種々の成長ホルモンに関連
する問題を処理するのに使用でき、そして動物および水
産養殖に於ける性能強化に使用できる成長ホルモン放出
活性を有するペプチドを生成することを伴う。成長ホル
モン放出(GRF) 因子の使用の背景が、例えば、米国特許
第4,622,312 号、同第4,649,131 号、同第4,732,972 号
および同第4,734,399 号明細書に記載されている。しか
しながら、その他の型のペプチドおよび化合物がまた本
発明の範囲内でつくることができる。
からのペプチド類縁体の半合成に使用し得る。生合成ペ
プチドの潜在的に有益な半合成修飾は、“非天然”アミ
ノ酸側鎖の組み込み、C-末端アミド化、そして既存の組
換えDNA 法では利用できない非天然産のアミノ酸を含む
フラグメントを含むその他の構造上の特徴を含む。特に
重要な一つの領域は、ヒトの種々の成長ホルモンに関連
する問題を処理するのに使用でき、そして動物および水
産養殖に於ける性能強化に使用できる成長ホルモン放出
活性を有するペプチドを生成することを伴う。成長ホル
モン放出(GRF) 因子の使用の背景が、例えば、米国特許
第4,622,312 号、同第4,649,131 号、同第4,732,972 号
および同第4,734,399 号明細書に記載されている。しか
しながら、その他の型のペプチドおよび化合物がまた本
発明の範囲内でつくることができる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】こうして、本発明の目
的は、酸性アミノ酸残基のカルボキシル末端で開裂する
エンドペプチダーゼを使用して二種のアミノ酸残基およ
び／またはペプチド残基をカップリングすることであ
る。このようなエンドペプチダーゼの例はS.アウレウス
(aureus)からのV8プロテアーゼである。本発明は、固相
ペプチド合成の如き従来のペプチド合成により生成さ
れ、または組み換えDNA 合成により生成されるペプチド
フラグメントまたは残基をカップリングするのに良く適
する。
的は、酸性アミノ酸残基のカルボキシル末端で開裂する
エンドペプチダーゼを使用して二種のアミノ酸残基およ
び／またはペプチド残基をカップリングすることであ
る。このようなエンドペプチダーゼの例はS.アウレウス
(aureus)からのV8プロテアーゼである。本発明は、固相
ペプチド合成の如き従来のペプチド合成により生成さ
れ、または組み換えDNA 合成により生成されるペプチド
フラグメントまたは残基をカップリングするのに良く適
する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】それ故、最も広い意味
で、本発明は、N-末端アミノ酸残基またはN-末端ペプチ
ドフラグメント（これらのそれぞれは必要により置換さ
れていてもよい）をC-末端アミノ酸残基またはC-末端ペ
プチドフラグメント（そのそれぞれは必要により置換さ
れていてもよい）にカップリングして式
で、本発明は、N-末端アミノ酸残基またはN-末端ペプチ
ドフラグメント（これらのそれぞれは必要により置換さ
れていてもよい）をC-末端アミノ酸残基またはC-末端ペ
プチドフラグメント（そのそれぞれは必要により置換さ
れていてもよい）にカップリングして式
【０００８】
【化５】
【０００９】（式中、Y N はＨまたはN-末端アミノ酸残
基もしくはN-末端ペプチドフラグメント（これらのそれ
ぞれは必要により置換されていてもよい）であり、Ｑは
酸性アミノ酸残基であり、かつX C はC-末端アミノ酸残
基またはC-末端ペプチドフラグメント（これらのそれぞ
れは必要により置換されていてもよい）である）を有す
る化合物を生成する方法であって、式
基もしくはN-末端ペプチドフラグメント（これらのそれ
ぞれは必要により置換されていてもよい）であり、Ｑは
酸性アミノ酸残基であり、かつX C はC-末端アミノ酸残
基またはC-末端ペプチドフラグメント（これらのそれぞ
れは必要により置換されていてもよい）である）を有す
る化合物を生成する方法であって、式
【００１０】
【化６】
【００１１】（式中、Ｒは水素、アルキル、ハロアルキ
ル、アリール、アラルキル、または少なくとも１個のヘ
テロ原子を有する５員もしくは６員の複素環である）を
有する基質成分を、約５〜約10.5のpHを有する水溶液ま
たは分散液中でエンドペプチダーゼの存在下でアミノ酸
またはペプチドX C と反応させて式Ｉの化合物を生成す
ることを特徴とする前記のカップリング方法に関する。
ル、アリール、アラルキル、または少なくとも１個のヘ
テロ原子を有する５員もしくは６員の複素環である）を
有する基質成分を、約５〜約10.5のpHを有する水溶液ま
たは分散液中でエンドペプチダーゼの存在下でアミノ酸
またはペプチドX C と反応させて式Ｉの化合物を生成す
ることを特徴とする前記のカップリング方法に関する。
【００１２】エンドペプチダーゼは酵母源、動物源、植
物源、または微生物源のものである。エンドペプチダー
ゼは、ペプチドを内部で開裂する酵素を言う。エンドペ
プチダーゼは酸性アミノ酸残基のカルボキシル側で特異
的に開裂することが好ましい。酸性アミノ酸は例えばグ
ルタミン酸またはアスパラギン酸である。このようなエ
ンドペプチダーゼの例はS.アウレウスからのV8プロテア
ーゼである。
物源、または微生物源のものである。エンドペプチダー
ゼは、ペプチドを内部で開裂する酵素を言う。エンドペ
プチダーゼは酸性アミノ酸残基のカルボキシル側で特異
的に開裂することが好ましい。酸性アミノ酸は例えばグ
ルタミン酸またはアスパラギン酸である。このようなエ
ンドペプチダーゼの例はS.アウレウスからのV8プロテア
ーゼである。
【００１３】好ましい実施態様では、本発明は、式 desNH2-Tyr-D-Ala-Asp(OH)-OEt を有する基質成分IIを式
【００１４】
【化７】
【００１５】(=SEQ ID NO:3-NH2)の化合物X C と反応さ
せて配列
せて配列
【００１６】
【化８】
【００１７】を有する式Ｉの生成物を生成する方法に関
する。本発明に有益なアミノ酸の例は、モノアミノモノ
カルボン酸、例えば、グリシン(Gly) 、アラニン(Ala)
、バリン(Val) ノルバリン(Nva) 、ロイシン(Leu) 、
イソロイシン(Ile) 、およびノルロイシン(Nle) の如き
脂肪族アミノ酸、セリン(Ser) 、トレオニン(Thr) およ
びホモセリン(homo-Ser)の如きヒドロキシアミノ酸、メ
チオニン(Met) またはシスチン(CysS)およびシステイン
(CysH)の如き硫黄を含むアミノ酸、アスパラギン酸(As
p) 、グルタミン酸(Glu) 、アスパラギン(Asn) および
グルタミン(Gln) の如きモノアミノジカルボン酸、オル
チニン(Orn)、リシン(Lys) およびアルギニン(Arg) の
如きジアミノモノカルボン酸、フェニルアラニン(Phe)
およびチロシン(Tyr) の如き芳香族アミノ酸であるだけ
でなく、ヒスチジン(His) およびトリプトファン(Trp)
の如き複素環アミノ酸である。
する。本発明に有益なアミノ酸の例は、モノアミノモノ
カルボン酸、例えば、グリシン(Gly) 、アラニン(Ala)
、バリン(Val) ノルバリン(Nva) 、ロイシン(Leu) 、
イソロイシン(Ile) 、およびノルロイシン(Nle) の如き
脂肪族アミノ酸、セリン(Ser) 、トレオニン(Thr) およ
びホモセリン(homo-Ser)の如きヒドロキシアミノ酸、メ
チオニン(Met) またはシスチン(CysS)およびシステイン
(CysH)の如き硫黄を含むアミノ酸、アスパラギン酸(As
p) 、グルタミン酸(Glu) 、アスパラギン(Asn) および
グルタミン(Gln) の如きモノアミノジカルボン酸、オル
チニン(Orn)、リシン(Lys) およびアルギニン(Arg) の
如きジアミノモノカルボン酸、フェニルアラニン(Phe)
およびチロシン(Tyr) の如き芳香族アミノ酸であるだけ
でなく、ヒスチジン(His) およびトリプトファン(Trp)
の如き複素環アミノ酸である。
【００１８】また、本発明は上記の方法により生成され
たペプチドまたはポリペプチドに関する。ペプチド化学
で普通のアミノ保護基、例えば、ベンジル(Bzl-)、アセ
チル(Ac-) またはターシャリーアルコキシカルボニル
基、例えば、t-ブチルオキシカルボニル(Boc-)、t-アミ
ルオキシカルボニル(t-AOC-)、ベンジルオキシカルボニ
ル(Z-)、p-メトキシベンジルオキシカルボニル(PMZ-)、
3,5-ジメトキシ- ベンジルオキシカルボニル(Z(OMe)
2-)、2,4,6-トリメチル- ベンジルオキシカルボニル(TM
Z-)、p-フェニル- アゾベンジルオキシカルボニル(PZ-)
、p-トルエンスルホニル(Tos-)、o-ニトロ- フェニル
スルフェニル(Nps-)、ジクロロベンジル(Dcb-)、2-クロ
ロベンジルオキシカルボニル(2ClZ-) 、シクロヘキシル
エステル(OcHex-)、フルオレニル-9- イルメチル- オキ
シカルボニル(Fmoc-) 等が保護基として使用し得る。
たペプチドまたはポリペプチドに関する。ペプチド化学
で普通のアミノ保護基、例えば、ベンジル(Bzl-)、アセ
チル(Ac-) またはターシャリーアルコキシカルボニル
基、例えば、t-ブチルオキシカルボニル(Boc-)、t-アミ
ルオキシカルボニル(t-AOC-)、ベンジルオキシカルボニ
ル(Z-)、p-メトキシベンジルオキシカルボニル(PMZ-)、
3,5-ジメトキシ- ベンジルオキシカルボニル(Z(OMe)
2-)、2,4,6-トリメチル- ベンジルオキシカルボニル(TM
Z-)、p-フェニル- アゾベンジルオキシカルボニル(PZ-)
、p-トルエンスルホニル(Tos-)、o-ニトロ- フェニル
スルフェニル(Nps-)、ジクロロベンジル(Dcb-)、2-クロ
ロベンジルオキシカルボニル(2ClZ-) 、シクロヘキシル
エステル(OcHex-)、フルオレニル-9- イルメチル- オキ
シカルボニル(Fmoc-) 等が保護基として使用し得る。
【００１９】好ましい保護基はベンジルオキシカルボニ
ルおよびt-ブチルオキシカルボニルである。何となれ
ば、これらの誘導体は生成するのが容易であり、経済的
に魅力があり、かつ除去するのに容易であるからであ
る。本明細書で使用される“アルキル" は、好ましくは
１〜６個の炭素原子を有する直鎖または分枝アルキル、
例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブ
チル、イソブチル、tert. ブチル、アミル、ヘキシル等
を意味する。
ルおよびt-ブチルオキシカルボニルである。何となれ
ば、これらの誘導体は生成するのが容易であり、経済的
に魅力があり、かつ除去するのに容易であるからであ
る。本明細書で使用される“アルキル" は、好ましくは
１〜６個の炭素原子を有する直鎖または分枝アルキル、
例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブ
チル、イソブチル、tert. ブチル、アミル、ヘキシル等
を意味する。
【００２０】本明細書で使用される“ハロアルキル"
は、フッ素、臭素、塩素、およびヨウ素の如きハロゲン
により置換されたアルキルを意味する。本明細書で使用
される“アラルキル" は、芳香族構造および脂肪族構造
の両方を有する炭化水素基を意味する。即ち、アルキル
基の水素原子の代わりに置換または未置換のアリールが
置換されている。その例は、ベンジル、フェネチル、α
- メシチル、等を含む。
は、フッ素、臭素、塩素、およびヨウ素の如きハロゲン
により置換されたアルキルを意味する。本明細書で使用
される“アラルキル" は、芳香族構造および脂肪族構造
の両方を有する炭化水素基を意味する。即ち、アルキル
基の水素原子の代わりに置換または未置換のアリールが
置換されている。その例は、ベンジル、フェネチル、α
- メシチル、等を含む。
【００２１】全てのこれらの基は、酵素に対して不活性
である置換基、例えば、ハロ（フルオロ、クロロ、ブロ
モ、ヨード）、ニトロ、アルコキシ（メトキシ、エトキ
シ、等）、またはアルキル（メチル、エチル、等）で置
換されていてもよい。但し、アミノ酸残基またはペプチ
ド誘導体がエンドペプチダーゼの基質であることを条件
とする。
である置換基、例えば、ハロ（フルオロ、クロロ、ブロ
モ、ヨード）、ニトロ、アルコキシ（メトキシ、エトキ
シ、等）、またはアルキル（メチル、エチル、等）で置
換されていてもよい。但し、アミノ酸残基またはペプチ
ド誘導体がエンドペプチダーゼの基質であることを条件
とする。
【００２２】本明細書で使用される“アリール”は、一
つの水素原子の除去により芳香族炭化水素から誘導され
た置換または未置換の芳香族部分、例えば、フェニル、
トリル、キシリル、メシチル、クメニル、ナフチル等を
意味し、この場合、そのアリール基はハロ（フルオロ、
クロロ、ブロモ、ヨード）、ヒドロキシ、アミノ、ニト
ロ、等の如き１〜３個の適当な置換基を有していてもよ
い。アリールが誘導される芳香族炭化水素は、単核、二
核または多核芳香族炭化水素であってもよい。
つの水素原子の除去により芳香族炭化水素から誘導され
た置換または未置換の芳香族部分、例えば、フェニル、
トリル、キシリル、メシチル、クメニル、ナフチル等を
意味し、この場合、そのアリール基はハロ（フルオロ、
クロロ、ブロモ、ヨード）、ヒドロキシ、アミノ、ニト
ロ、等の如き１〜３個の適当な置換基を有していてもよ
い。アリールが誘導される芳香族炭化水素は、単核、二
核または多核芳香族炭化水素であってもよい。
【００２３】本明細書で使用される“複素環”は、環中
に炭素原子および少なくとも１個のヘテロ原子を含む未
置換または置換、飽和、不飽和、または芳香族の環基を
言う。複素環は単環式または多環式である。多環系は縮
合、橋かけまたはスピロである。単環式の環は３〜９
個、好ましくは３〜７個の原子を含む。多環は７〜17
個、好ましくは７〜13個の原子を含む。置換基の例は、
低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲン基、ハロ
ゲン置換低級アルキル基、アミノ基、メルカプト基、シ
アノ基、ヒドロキシ基、カルバモイル基、カルボキシ
基、等およびその他の置換基を含む。単環式の複素環の
例は、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニ
ル、ピロリニル、ピロリル、イミダゾリル、フリル、チ
エニル、1H- テトラゾリル、1,2,3-チアジアゾリル、1,
2,4-チアジアゾリル、1,3,4-トリアゾリル、1,2,3-オキ
サジアゾリル、1,2,4-オキサジアゾリル、1,3,4-オキサ
ジアゾリル、1,2,5-オキサジアゾリル、1,2,4-トリアゾ
リル、ピペリジル、ピペラジニル、ピリジル、ピラジニ
ル、ピリミジニル、モルホリニル、4-チアモルホリニ
ル、2-アミノ-4- チアゾリル、5-アミノ-1,2,4- チアジ
アゾリル、等およびその他を含む。多環式の複素環の例
は、ベンゾフラニル、4,1,2-ベンゾオキサチオジニル、
2,1,4-ベンゾオキサジアジニル、2,1-ベンゾオキサジニ
ル、等を含む。
に炭素原子および少なくとも１個のヘテロ原子を含む未
置換または置換、飽和、不飽和、または芳香族の環基を
言う。複素環は単環式または多環式である。多環系は縮
合、橋かけまたはスピロである。単環式の環は３〜９
個、好ましくは３〜７個の原子を含む。多環は７〜17
個、好ましくは７〜13個の原子を含む。置換基の例は、
低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲン基、ハロ
ゲン置換低級アルキル基、アミノ基、メルカプト基、シ
アノ基、ヒドロキシ基、カルバモイル基、カルボキシ
基、等およびその他の置換基を含む。単環式の複素環の
例は、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニ
ル、ピロリニル、ピロリル、イミダゾリル、フリル、チ
エニル、1H- テトラゾリル、1,2,3-チアジアゾリル、1,
2,4-チアジアゾリル、1,3,4-トリアゾリル、1,2,3-オキ
サジアゾリル、1,2,4-オキサジアゾリル、1,3,4-オキサ
ジアゾリル、1,2,5-オキサジアゾリル、1,2,4-トリアゾ
リル、ピペリジル、ピペラジニル、ピリジル、ピラジニ
ル、ピリミジニル、モルホリニル、4-チアモルホリニ
ル、2-アミノ-4- チアゾリル、5-アミノ-1,2,4- チアジ
アゾリル、等およびその他を含む。多環式の複素環の例
は、ベンゾフラニル、4,1,2-ベンゾオキサチオジニル、
2,1,4-ベンゾオキサジアジニル、2,1-ベンゾオキサジニ
ル、等を含む。
【００２４】本明細書で使用される“ヘテロ原子" は窒
素、酸素または硫黄を言う。“酸性アミノ酸残基" は酸
性側鎖を有するアミノ酸を言う。これらの例はAsp、Glu
等を含む。個々のアミノ酸中に存在し得るイオン化で
きる基は、所望により、基の種類に応じて当業者に知ら
れている方法でブロックし得ることが記載されるべきで
ある。ω−アミノ基(Nω) の好適な保護基は、例えば、
N ω- ベンジルオキシカルボニル(Nω-Z) 、t-ブトキシ
カルボニル(Nω-Boc) またはトシル(Nω-Tos) を含む。
N-グアニジノ基(NG ) の好適な保護基は、例えば、ニト
ロ(NG -NO2) 、N G -ベンジルオキシカルボニル(NG -Z)
およびN G ,N G-,ジベンジルオキシカルボニル(NG -Z-
Z) を含む。His 中のイミダゾール環(Nim) の好適な保
護基は、例えば、N im- ベンジル(Nim-Bzl) およびトシ
ル(Nim-Tos) を含む。ω−カルボキシル基の好適な保護
基は、例えば、ω−ベンジルエステル(-OBzl) を含む。
脂肪族または芳香族のヒドロキシアミノ酸中のヒドロキ
シル基の好適な保護基は、例えば、ベンジル(Bzl-)の如
きアラルキル基を含む。CysH中のメルカプト基の好適な
S-保護基は、例えば、ベンジル基(Bzl-)を含む。これら
の保護基は一次反応中に安定であり、かつ二次反応を生
じないで最終生成物から開裂するのに容易である必要が
ある。
素、酸素または硫黄を言う。“酸性アミノ酸残基" は酸
性側鎖を有するアミノ酸を言う。これらの例はAsp、Glu
等を含む。個々のアミノ酸中に存在し得るイオン化で
きる基は、所望により、基の種類に応じて当業者に知ら
れている方法でブロックし得ることが記載されるべきで
ある。ω−アミノ基(Nω) の好適な保護基は、例えば、
N ω- ベンジルオキシカルボニル(Nω-Z) 、t-ブトキシ
カルボニル(Nω-Boc) またはトシル(Nω-Tos) を含む。
N-グアニジノ基(NG ) の好適な保護基は、例えば、ニト
ロ(NG -NO2) 、N G -ベンジルオキシカルボニル(NG -Z)
およびN G ,N G-,ジベンジルオキシカルボニル(NG -Z-
Z) を含む。His 中のイミダゾール環(Nim) の好適な保
護基は、例えば、N im- ベンジル(Nim-Bzl) およびトシ
ル(Nim-Tos) を含む。ω−カルボキシル基の好適な保護
基は、例えば、ω−ベンジルエステル(-OBzl) を含む。
脂肪族または芳香族のヒドロキシアミノ酸中のヒドロキ
シル基の好適な保護基は、例えば、ベンジル(Bzl-)の如
きアラルキル基を含む。CysH中のメルカプト基の好適な
S-保護基は、例えば、ベンジル基(Bzl-)を含む。これら
の保護基は一次反応中に安定であり、かつ二次反応を生
じないで最終生成物から開裂するのに容易である必要が
ある。
【００２５】アミノ酸残基が異性体を有する場合、特に
ことわらない限り、表されるのはアミノ酸のL-形態であ
る。C-末端で“SEQ ID NO:#(式中、# は配列数である)
の後の添字“OH" および“NH2"は、夫々、化合物の遊離
カルボン酸形態およびアミド形態を言う。添字が使用さ
れない場合、その表現は両方の形態を含むことが意図さ
れている。“BOC-SEQ ID NO:#-PAM 樹脂" という用語は
SEQ ID NO:# の保護配列を言い、この場合、BOC はN-末
端でアミノ基を保護し、そしてPAM-樹脂はC-末端を保護
する。これらの化合物は遊離カルボン酸形態またはアミ
ド形態を含むことができる。塩基性GRF 分子は、SEQ ID
NO:1 に示されるように44のアミノ酸を含む。GRF の類
縁体は“GRF"の前に括弧中に置換アミノ酸を記載するこ
とにより示される。例えば、“［His1,Ala15］-GRF" は
GRF に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチドを示
し、この場合、ヒスチジン残基が位置１でチロシン残基
に代えて置き換えられており、アラニン残基が位置15で
グリシン残基に代えて置き換えられている。“GRF"の後
の括弧中の数は、アミノ酸残基の位置数を示すことによ
り完全ポリペプチドのフラグメントを示す。例えば、GR
F(1-29) は完全配列の最初の29のアミノ酸を有するフラ
グメントを示す。
ことわらない限り、表されるのはアミノ酸のL-形態であ
る。C-末端で“SEQ ID NO:#(式中、# は配列数である)
の後の添字“OH" および“NH2"は、夫々、化合物の遊離
カルボン酸形態およびアミド形態を言う。添字が使用さ
れない場合、その表現は両方の形態を含むことが意図さ
れている。“BOC-SEQ ID NO:#-PAM 樹脂" という用語は
SEQ ID NO:# の保護配列を言い、この場合、BOC はN-末
端でアミノ基を保護し、そしてPAM-樹脂はC-末端を保護
する。これらの化合物は遊離カルボン酸形態またはアミ
ド形態を含むことができる。塩基性GRF 分子は、SEQ ID
NO:1 に示されるように44のアミノ酸を含む。GRF の類
縁体は“GRF"の前に括弧中に置換アミノ酸を記載するこ
とにより示される。例えば、“［His1,Ala15］-GRF" は
GRF に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチドを示
し、この場合、ヒスチジン残基が位置１でチロシン残基
に代えて置き換えられており、アラニン残基が位置15で
グリシン残基に代えて置き換えられている。“GRF"の後
の括弧中の数は、アミノ酸残基の位置数を示すことによ
り完全ポリペプチドのフラグメントを示す。例えば、GR
F(1-29) は完全配列の最初の29のアミノ酸を有するフラ
グメントを示す。
【００２６】“SEQ ID NO:#"前後の“OH" および“NH2"
以外の接頭辞および添字は“SEQ IDNO:#"の保護配列を
言い、この場合、保護基が上に示されている。Xaa が上
に記入された数を有する場合、その数は特別な配列中の
Xaa の位置を言い、これはN-末端で出発して、C-末端の
方向に進む。下記の実施例は本発明の方法の一つの局面
を説明するために示される。実施例は本発明の範囲を限
定することを目的とするものではない。これらの実施例
を以下に示されるように行った。
以外の接頭辞および添字は“SEQ IDNO:#"の保護配列を
言い、この場合、保護基が上に示されている。Xaa が上
に記入された数を有する場合、その数は特別な配列中の
Xaa の位置を言い、これはN-末端で出発して、C-末端の
方向に進む。下記の実施例は本発明の方法の一つの局面
を説明するために示される。実施例は本発明の範囲を限
定することを目的とするものではない。これらの実施例
を以下に示されるように行った。
【００２７】
【実施例】実験操作 全てのアミノ酸誘導体をBachem,Inc.(Torrance,CA)から
購入した。使用した側鎖保護アミノ酸は、Boc-Arg(Tos)
-OH 、Boc-Asp(OcHex)-OH 、Boc-Lys(2ClZ)-OH、Boc-Se
r(Bzl)-OH 、Boc-Thr(Bzl)-OH 、およびBoc-Tyr(Dcb)-O
H であった。固相ペプチド合成をApplied Biosystems43
0A ペプチド合成装置(Foster City,CA)で行った。分取
HPLCをWaters Delta Prep 3000装置で行った。分析HPLC
を、勾配マスターおよびSpectromonitor III U.V. 可変
波長検出器を取り付けたLDC Constametric IIG集成装置
を使用して行った。カルボキシペプチダーゼY(CPD-Y)を
Carlbiotech Ltd.,Copenhagen,Denmark から得た。この
酵素は米国特許第4,339,534 号および同第4,806,473 号
明細書に更に詳しく記載されており、これらの二つの特
許は参考として本明細書に明らかに含まれる。
購入した。使用した側鎖保護アミノ酸は、Boc-Arg(Tos)
-OH 、Boc-Asp(OcHex)-OH 、Boc-Lys(2ClZ)-OH、Boc-Se
r(Bzl)-OH 、Boc-Thr(Bzl)-OH 、およびBoc-Tyr(Dcb)-O
H であった。固相ペプチド合成をApplied Biosystems43
0A ペプチド合成装置(Foster City,CA)で行った。分取
HPLCをWaters Delta Prep 3000装置で行った。分析HPLC
を、勾配マスターおよびSpectromonitor III U.V. 可変
波長検出器を取り付けたLDC Constametric IIG集成装置
を使用して行った。カルボキシペプチダーゼY(CPD-Y)を
Carlbiotech Ltd.,Copenhagen,Denmark から得た。この
酵素は米国特許第4,339,534 号および同第4,806,473 号
明細書に更に詳しく記載されており、これらの二つの特
許は参考として本明細書に明らかに含まれる。
【００２８】V8プロテアーゼ( スタフィロコッカス・ア
ウレウス(staphylococcus aureus)のV8株からのプロテ
アーゼ、エンドプロテアーゼGlu-C)はSigma Chemical C
o.(Type XVII-B) から得られ、そして770U mg -1(1U=pH
7.8 、37℃で毎分１μモルのN-t-Boc-Glu-αOPh を加水
分解する酵素の量) の比活性を有していた。全ての温度
は℃である。
ウレウス(staphylococcus aureus)のV8株からのプロテ
アーゼ、エンドプロテアーゼGlu-C)はSigma Chemical C
o.(Type XVII-B) から得られ、そして770U mg -1(1U=pH
7.8 、37℃で毎分１μモルのN-t-Boc-Glu-αOPh を加水
分解する酵素の量) の比活性を有していた。全ての温度
は℃である。
【００２９】実施例１ desNH2Tyr-D-Ala-Asp(OH)-OEt の調製 NaHCO30.52g(6.21ミリモル、１eq）を含む水(10 mL) 中
のL-アスパラギン酸α- エチルエステル1.0g(6.21 ミリ
モル) の溶液をエチレングリコールジメチルエーテル中
でBoc-D-Ala-OSu1.95g(6.8ミリモル、1.1eq)で処理し
た。25℃で1.5 時間攪拌を続け、４℃で一夜攪拌を続け
た。反応混合物を、固体クエン酸を使用してpH3.5 まで
酸性にし、蒸発させて乾燥した。残渣を水(100mL) に吸
収させ、凍結乾燥した。得られた生成物、Boc-D-Ala-As
p(OH)-OEt を25℃で20分間にわたって50％のTFA-CH2Cl2
(60 mL) で処理した。その溶液を蒸発、乾燥させ、そし
てCH 2Cl2( 夫々60mL) から２回再度蒸発させた。残渣を
水(50 mL) に溶解し、固体NaHCO3を添加してpH7.4 にし
た。エチレングリコールジエチルエーテル(100mL) 中の
desNH2-L-Tyr-OSu(1.95g、7.4 ミリモル、1.2eq)の溶液
を添加し、４℃で一夜攪拌を続けた。その反応混合物を
蒸発させ、水(100mL) に吸収させ、アセトニトリル（約
10mL) を添加し、続いて50％のTFA を添加してpH2.8 に
した。濾過(0.45Aフィルター) した後、溶液をYMC フェ
ニルカラム(2.0 x 30cm)に入れ、分取HPLCにより精製し
た。溶離剤：90分で０％(B) から35％(B) までの線形勾
配の(A)水(0.025％のTFA)-(B)CH3CN(0.025 ％のTFA)；
流量15mL/ 分。
のL-アスパラギン酸α- エチルエステル1.0g(6.21 ミリ
モル) の溶液をエチレングリコールジメチルエーテル中
でBoc-D-Ala-OSu1.95g(6.8ミリモル、1.1eq)で処理し
た。25℃で1.5 時間攪拌を続け、４℃で一夜攪拌を続け
た。反応混合物を、固体クエン酸を使用してpH3.5 まで
酸性にし、蒸発させて乾燥した。残渣を水(100mL) に吸
収させ、凍結乾燥した。得られた生成物、Boc-D-Ala-As
p(OH)-OEt を25℃で20分間にわたって50％のTFA-CH2Cl2
(60 mL) で処理した。その溶液を蒸発、乾燥させ、そし
てCH 2Cl2( 夫々60mL) から２回再度蒸発させた。残渣を
水(50 mL) に溶解し、固体NaHCO3を添加してpH7.4 にし
た。エチレングリコールジエチルエーテル(100mL) 中の
desNH2-L-Tyr-OSu(1.95g、7.4 ミリモル、1.2eq)の溶液
を添加し、４℃で一夜攪拌を続けた。その反応混合物を
蒸発させ、水(100mL) に吸収させ、アセトニトリル（約
10mL) を添加し、続いて50％のTFA を添加してpH2.8 に
した。濾過(0.45Aフィルター) した後、溶液をYMC フェ
ニルカラム(2.0 x 30cm)に入れ、分取HPLCにより精製し
た。溶離剤：90分で０％(B) から35％(B) までの線形勾
配の(A)水(0.025％のTFA)-(B)CH3CN(0.025 ％のTFA)；
流量15mL/ 分。
【００３０】画分を１分間隔で回収した。生成物が画分
43-62 で現れ、これらを溜め、そして蒸発させてdesNH2
Tyr-D-Ala-Asp(OH)-OEt1.25g(53.1 ％) を得た。生成物
は分析HPLCにより均一であることが示され、そして酸加
水分解(6N HCl;110 ℃;24 時間) 後に予想アミノ酸組
成：Asp,1.00;Ala,0.99 を示した。構造を1H NMRにより
確認し、FAB-MS: 計算値:(M+H)+ 381.4;実測値:381.3に
より分子式C18H24N2O7と一致した。
43-62 で現れ、これらを溜め、そして蒸発させてdesNH2
Tyr-D-Ala-Asp(OH)-OEt1.25g(53.1 ％) を得た。生成物
は分析HPLCにより均一であることが示され、そして酸加
水分解(6N HCl;110 ℃;24 時間) 後に予想アミノ酸組
成：Asp,1.00;Ala,0.99 を示した。構造を1H NMRにより
確認し、FAB-MS: 計算値:(M+H)+ 381.4;実測値:381.3に
より分子式C18H24N2O7と一致した。
【００３１】実施例２ SEQ ID NO:2-OHの合成 t-ブチルオキシカルボニル-L- アラニル-O- フェニルア
セトアミドメチル- 樹脂(Boc-Ala-PAM- 樹脂)(0.64g;0.
5 ミリモル) をApplied Biosystems(AB)430A自動ペプチ
ド合成装置の反応容器に仕込んだ。AB430Aプロトコルを
使用して固相ペプチド合成を行い、カップリング時間を
２時間に延長してBoc-SEQ ID NO:2-PAM-樹脂、｛Boc-
［Ala15,Ala29 ］-GRF(4-29)-PAM- 樹脂｝2.2gを得た。
保護ペプチド樹脂の1g部分を、“low-high" 操作［Tam,
J.P.,Heath,W.F. およびMerrifield,R.B.(1983)J.Am.Ch
em.Soc.,105,6442-6445 ］を使用して無水HFで処理し、
粗ペプチド樹脂をEtOAc ですり砕き、そしてTFA で抽出
した。溶媒を蒸発させ、残渣をエーテルですり砕き、乾
燥させて粗SEQ ID NO:2-OH、｛［Ala15,29］-GRF(4-29)
-OH ｝660mg を得た。
セトアミドメチル- 樹脂(Boc-Ala-PAM- 樹脂)(0.64g;0.
5 ミリモル) をApplied Biosystems(AB)430A自動ペプチ
ド合成装置の反応容器に仕込んだ。AB430Aプロトコルを
使用して固相ペプチド合成を行い、カップリング時間を
２時間に延長してBoc-SEQ ID NO:2-PAM-樹脂、｛Boc-
［Ala15,Ala29 ］-GRF(4-29)-PAM- 樹脂｝2.2gを得た。
保護ペプチド樹脂の1g部分を、“low-high" 操作［Tam,
J.P.,Heath,W.F. およびMerrifield,R.B.(1983)J.Am.Ch
em.Soc.,105,6442-6445 ］を使用して無水HFで処理し、
粗ペプチド樹脂をEtOAc ですり砕き、そしてTFA で抽出
した。溶媒を蒸発させ、残渣をエーテルですり砕き、乾
燥させて粗SEQ ID NO:2-OH、｛［Ala15,29］-GRF(4-29)
-OH ｝660mg を得た。
【００３２】粗物質(660mg) を0.1 ％のTFA/H2O 25 mL
に溶解し、濾過し(0.45 ミクロンの型HAMillipore フィ
ルター) 、そしてYMC ODS Basic Prep-PAK HPLC カラム
に装填した。カラムを90分で20％(B) から50％(B) まで
の線形勾配の(A) 水(0.1％のTFA)-(B)CH3CN(0.1 ％のTF
A)で流量50mL/ 分で溶離した。画分を回収し(0.5分／画
分）、そしてアリコートを分析HPLC系：(A)0.1M のNaCl
O4( pH2.5)-(B)CH3CN;１ml/ 分で20分で40％(B) から55
％(B) 、0.2AUFS 、206nm 、カラム：Lichrosorb RP-8
(5 ミクロン) により分析した。生成物が画分78-85 中
に現れ、これらを合わせ、蒸発させ、そして凍結乾燥し
て純粋なSEQ ID NO:2-OH、｛［Ala15,29］-GRF(4-29)-O
H ｝を得た。収量：125mg 。
に溶解し、濾過し(0.45 ミクロンの型HAMillipore フィ
ルター) 、そしてYMC ODS Basic Prep-PAK HPLC カラム
に装填した。カラムを90分で20％(B) から50％(B) まで
の線形勾配の(A) 水(0.1％のTFA)-(B)CH3CN(0.1 ％のTF
A)で流量50mL/ 分で溶離した。画分を回収し(0.5分／画
分）、そしてアリコートを分析HPLC系：(A)0.1M のNaCl
O4( pH2.5)-(B)CH3CN;１ml/ 分で20分で40％(B) から55
％(B) 、0.2AUFS 、206nm 、カラム：Lichrosorb RP-8
(5 ミクロン) により分析した。生成物が画分78-85 中
に現れ、これらを合わせ、蒸発させ、そして凍結乾燥し
て純粋なSEQ ID NO:2-OH、｛［Ala15,29］-GRF(4-29)-O
H ｝を得た。収量：125mg 。
【００３３】生成物は分析HPLCにより均一であることが
示され、そして酸加水分解(6N HCl-１％TGA;150 ℃; １
時間) 後に予想アミノ酸組成：Thr0.97(1);Ser3.01(3);
Tyr1.02(1).110℃;24 時間:Asp2.01(2);Glu2.07(2);Ala
4.18(4);Val0.91(1);Met1.03(1);Ile1.91(2);Leu4.07
(4);Phe0.94(1);Lys1.86(2);Arg2.00(2)を示した。構造
の確認はFAB 質量分析によりなされた。計算値:(M+H)+
2939.5実測値:2938.7実施例３ SEQ ID NO:3-NH2 の酵素的合成 Arg-NH2 ・2HCl(353.5mg) を水(0.49 mL) に溶解し、続
いて3.0MのNaOH(0.22mL) 、1MのNa-EDTA(0.005 mL) 、
カルボキシペプチダーゼ-Y(0.002mLのH2O 中0.041mg)を
添加し、そしてその溶液を37℃に加熱した（最終pH=7.7
0)。この溶液の一部(0.350mL) を37℃のH2O(0.350 mL)
中のSEQ ID NO:2-OH［実施例２から、10.14mg ］の溶液
に添加した。その反応を37℃で1.1 時間進め、そして氷
酢酸(2.0mL) の添加により停止した。その反応混合物を
Alltech(5 μ) 混合式（カチオン)HPLC カラム(1 x 25c
m)に装填し、そしてカラムを段階式勾配：20分間で10％
の(B) 、20分間で15％の(B) で(A)H2O(0.1％のTFA)-(B)
CH3CN(0.1 ％のTFA)で洗浄し(4.0mL/ 分) 、そして生成
物を40分で20％から34％の(B) まで変化する線形勾配を
使用して溶離した。画分を回収し(0.5分毎) 、そして分
析HPLC系（実施例２と同様）で分析し、生成物を含む画
分を溜め、凍結乾燥してSEQ ID NO:3-NH2 、｛［Ala
15 ］-GRF(4-29)-NH2｝5.30mgを得た。
示され、そして酸加水分解(6N HCl-１％TGA;150 ℃; １
時間) 後に予想アミノ酸組成：Thr0.97(1);Ser3.01(3);
Tyr1.02(1).110℃;24 時間:Asp2.01(2);Glu2.07(2);Ala
4.18(4);Val0.91(1);Met1.03(1);Ile1.91(2);Leu4.07
(4);Phe0.94(1);Lys1.86(2);Arg2.00(2)を示した。構造
の確認はFAB 質量分析によりなされた。計算値:(M+H)+
2939.5実測値:2938.7実施例３ SEQ ID NO:3-NH2 の酵素的合成 Arg-NH2 ・2HCl(353.5mg) を水(0.49 mL) に溶解し、続
いて3.0MのNaOH(0.22mL) 、1MのNa-EDTA(0.005 mL) 、
カルボキシペプチダーゼ-Y(0.002mLのH2O 中0.041mg)を
添加し、そしてその溶液を37℃に加熱した（最終pH=7.7
0)。この溶液の一部(0.350mL) を37℃のH2O(0.350 mL)
中のSEQ ID NO:2-OH［実施例２から、10.14mg ］の溶液
に添加した。その反応を37℃で1.1 時間進め、そして氷
酢酸(2.0mL) の添加により停止した。その反応混合物を
Alltech(5 μ) 混合式（カチオン)HPLC カラム(1 x 25c
m)に装填し、そしてカラムを段階式勾配：20分間で10％
の(B) 、20分間で15％の(B) で(A)H2O(0.1％のTFA)-(B)
CH3CN(0.1 ％のTFA)で洗浄し(4.0mL/ 分) 、そして生成
物を40分で20％から34％の(B) まで変化する線形勾配を
使用して溶離した。画分を回収し(0.5分毎) 、そして分
析HPLC系（実施例２と同様）で分析し、生成物を含む画
分を溜め、凍結乾燥してSEQ ID NO:3-NH2 、｛［Ala
15 ］-GRF(4-29)-NH2｝5.30mgを得た。
【００３４】生成物は分析HPLCにより均一であることが
示され、そして酸加水分解(6N HCl-１％TGA;110 ℃; 72
時間) 後に予想アミノ酸組成：Asx1.99(2);Thr0.96(1);
Ser2.69(3);Glx1.95(2);Ala2.94(3);Val0.84(1);Met1.0
0(1);Ile1.84(2);Leu4.11(4);Tyr1.02(1);Phe0.98(1);L
ys2.22(2);Arg3.46(3)を示した。構造の更なる確認はFA
B 質量分析によりなされた。計算値:(M+H)+ 3023.6実測
値:3023.8 。
示され、そして酸加水分解(6N HCl-１％TGA;110 ℃; 72
時間) 後に予想アミノ酸組成：Asx1.99(2);Thr0.96(1);
Ser2.69(3);Glx1.95(2);Ala2.94(3);Val0.84(1);Met1.0
0(1);Ile1.84(2);Leu4.11(4);Tyr1.02(1);Phe0.98(1);L
ys2.22(2);Arg3.46(3)を示した。構造の更なる確認はFA
B 質量分析によりなされた。計算値:(M+H)+ 3023.6実測
値:3023.8 。
【００３５】実施例４ S.アウレウスV8プロテアーゼを使用するSEQ ID NO:4-NH
2(この場合、Xaa1はdesNH2Tyr であり、かつXaa2はD-Al
a である) の酵素的合成 desNH2Tyr-D-Ala-Asp(OH)-OEt トリペプチド( 実施例１
から、2.69mg) を0.5MのNa2HPO4/H3PO4 緩衝液(31.0 μ
L 、pH10.0) に溶解し、スタフィロコッカス・アウレウ
スV8プロテアーゼを0.33mgを添加した。
2(この場合、Xaa1はdesNH2Tyr であり、かつXaa2はD-Al
a である) の酵素的合成 desNH2Tyr-D-Ala-Asp(OH)-OEt トリペプチド( 実施例１
から、2.69mg) を0.5MのNa2HPO4/H3PO4 緩衝液(31.0 μ
L 、pH10.0) に溶解し、スタフィロコッカス・アウレウ
スV8プロテアーゼを0.33mgを添加した。
【００３６】カップリング反応をジメチルアセトアミド
中のSEQ ID NO:3-NH2(実施例３から、2.0mg)の溶液(7.0
μL)の添加により開始し、そしてその反応混合物を35℃
で２時間放置した。この時間の終了時に、反応を氷酢酸
(0.050mL) の添加により停止し、そして反応混合物を実
施例２のようにしてHPLC精製にかけて純粋なSEQ ID NO:
4-NH2(この場合、Xaa1はdesNH2Tyr であり、かつXaa2は
D-Ala である)0.5mgを得た。
中のSEQ ID NO:3-NH2(実施例３から、2.0mg)の溶液(7.0
μL)の添加により開始し、そしてその反応混合物を35℃
で２時間放置した。この時間の終了時に、反応を氷酢酸
(0.050mL) の添加により停止し、そして反応混合物を実
施例２のようにしてHPLC精製にかけて純粋なSEQ ID NO:
4-NH2(この場合、Xaa1はdesNH2Tyr であり、かつXaa2は
D-Ala である)0.5mgを得た。
【００３７】生成物は分析HPLCにより均一であることが
示され、そして酸加水分解(6N HCl;110 ℃; 24時間) 後
に予想アミノ酸組成：Asx3.07(3);Thr0.90(1);Ser2.53
(2);Glx2.04(2);Ala4.40(4);Val0.94(1);Met1.02(1);Il
e2.07(2);Leu4.31(4);Tyr1.01(1);Phe1.01(1);Lys1.98
(2);Arg3.08(3)を示した。構造の更なる確認はFAB 質量
分析によりなされた。計算値:(M+H)+ 3357.9実測値:335
8.1 。
示され、そして酸加水分解(6N HCl;110 ℃; 24時間) 後
に予想アミノ酸組成：Asx3.07(3);Thr0.90(1);Ser2.53
(2);Glx2.04(2);Ala4.40(4);Val0.94(1);Met1.02(1);Il
e2.07(2);Leu4.31(4);Tyr1.01(1);Phe1.01(1);Lys1.98
(2);Arg3.08(3)を示した。構造の更なる確認はFAB 質量
分析によりなされた。計算値:(M+H)+ 3357.9実測値:335
8.1 。
【００３８】実施例５ SEQ ID NO:4-NH2(この場合、Xaa1はdesNH2Tyr であり、
かつXaa2はD-Ala である) の別の酵素的合成 desNH2Tyr-D-Ala-Asp(OH)-OEt(16.1mg、42μモル) を水
280 μL に溶解し、1Mのトリス塩基(45 μL)でpH8.4(ガ
ラス電極) まで滴定し、次に水で希釈して645μL の最
終容積にした。SEQ ID NO:2-OH、｛［Ala15,29］-GRF(4
-29)-OH ｝・5TFA(22.3mg 、6.4 μモル) をDMSO360 μ
L に溶解し、続いて水630 μL に溶解し、続いて上記の
desNH2Tyr-D-Ala-Asp(OH)-OEt 溶液630 mLに溶解した。
4.8mgmL -1のV8プロテアーゼ180 μL を37℃で添加する
ことにより反応を開始し、そして反応を37℃に保った。
反応の進行を、2 μL のアリコートを取り出し、HPLCに
より分析することにより監視した。カラム：WatersμBo
ndapakC18(5 μ、0.4 x 30cm) 、溶離剤：(A)0.025％TF
A-(B)CH3CN(0.025％TFA)、勾配：15分で10％から42％ま
でのＢ、流量：1.5 mL/ 分、検出：206nm 。
かつXaa2はD-Ala である) の別の酵素的合成 desNH2Tyr-D-Ala-Asp(OH)-OEt(16.1mg、42μモル) を水
280 μL に溶解し、1Mのトリス塩基(45 μL)でpH8.4(ガ
ラス電極) まで滴定し、次に水で希釈して645μL の最
終容積にした。SEQ ID NO:2-OH、｛［Ala15,29］-GRF(4
-29)-OH ｝・5TFA(22.3mg 、6.4 μモル) をDMSO360 μ
L に溶解し、続いて水630 μL に溶解し、続いて上記の
desNH2Tyr-D-Ala-Asp(OH)-OEt 溶液630 mLに溶解した。
4.8mgmL -1のV8プロテアーゼ180 μL を37℃で添加する
ことにより反応を開始し、そして反応を37℃に保った。
反応の進行を、2 μL のアリコートを取り出し、HPLCに
より分析することにより監視した。カラム：WatersμBo
ndapakC18(5 μ、0.4 x 30cm) 、溶離剤：(A)0.025％TF
A-(B)CH3CN(0.025％TFA)、勾配：15分で10％から42％ま
でのＢ、流量：1.5 mL/ 分、検出：206nm 。
【００３９】その反応を、氷酢酸(0.5mL) を添加するこ
とにより76分のマーク(HPLC により60％の転化率) で停
止した。冷却した反応混合物をHPLCにより分別した。カ
ラム：VydacC18 218TP1022(2.2 x 25cm)、溶離剤：(A)
0.1％TFA-(B)CH3CN(0.1％TFA)、勾配：60分で20％から4
0％までのＢ、流量：25mL/ 分、検出：210nm 。生成物
を含む画分を溜め、そして凍結乾燥して純粋な半合成SE
Q ID NO:5-OH( この場合、Xaa1はdesNH2Tyr であり、か
つXaa2はD-Ala である) 、｛［desNH2Tyr1,D-Ala 2,Ala
15,29］-GRF(1-29)-OH ｝8.0mg(2.1 μモル、33％) を
得た。
とにより76分のマーク(HPLC により60％の転化率) で停
止した。冷却した反応混合物をHPLCにより分別した。カ
ラム：VydacC18 218TP1022(2.2 x 25cm)、溶離剤：(A)
0.1％TFA-(B)CH3CN(0.1％TFA)、勾配：60分で20％から4
0％までのＢ、流量：25mL/ 分、検出：210nm 。生成物
を含む画分を溜め、そして凍結乾燥して純粋な半合成SE
Q ID NO:5-OH( この場合、Xaa1はdesNH2Tyr であり、か
つXaa2はD-Ala である) 、｛［desNH2Tyr1,D-Ala 2,Ala
15,29］-GRF(1-29)-OH ｝8.0mg(2.1 μモル、33％) を
得た。
【００４０】生成物は分析HPLCにより均一であることが
示され、そして酸加水分解(6N HCl-１％TGA;110 ℃; 72
時間) 後に予想アミノ酸組成：Asx2.9(3);Thr1.2(1);Se
r2.4(3);Glx3.0(3);Ala4.6(5);Val1.2(1);Met0.8(1);Il
e2.0(2);Leu4.2(4);Tyr0.9(1);Phe0.9(1);Lys2.1(2);Ar
g2.0(2) を示した。FAB 質量分析：計算値 (M+H)+ 327
3.8実測値:3273 。
示され、そして酸加水分解(6N HCl-１％TGA;110 ℃; 72
時間) 後に予想アミノ酸組成：Asx2.9(3);Thr1.2(1);Se
r2.4(3);Glx3.0(3);Ala4.6(5);Val1.2(1);Met0.8(1);Il
e2.0(2);Leu4.2(4);Tyr0.9(1);Phe0.9(1);Lys2.1(2);Ar
g2.0(2) を示した。FAB 質量分析：計算値 (M+H)+ 327
3.8実測値:3273 。
【００４１】カルボキシペプチダーゼＹ触媒によるペプ
チド転移反応 Arg-NH2 ・2HCl(0.53g) を水500 μL 、0.1MのEDTA50μ
L に溶解し、5Mのトリス塩基(750μL)でpH8.0(ガラス電
極) まで滴定した。SEQ ID NO:5-OH( この場合、Xaa1は
desNH2Tyr であり、かつXaa2はD-Ala である) 、｛［de
sNH2Tyr1,D-Ala 2,Ala15,29］-GRF(1-29)-OH ｝(7.2mg、
1.9 μモル) を水27μL に溶解し、続いて上記のArg-NH
2 溶液に37℃で溶解した。1.0mg mL-1のカルボキシペプ
チダーゼＹ3.0 μL を添加することにより反応を開始
し、反応混合物を37℃に保った。反応の進行を、1.5 μ
L のアリコートを取り出し、HPLCにより分析することに
より監視した。カラム：VydacC18 218TP54(0.46 x 25c
m) 、溶離剤：(A)0.025％TFA-(B)CH3CN(0.025％TFA)、
勾配：10分で38％から44％までのＢ、流量：1.5 mL/
分、検出：206nm 。
チド転移反応 Arg-NH2 ・2HCl(0.53g) を水500 μL 、0.1MのEDTA50μ
L に溶解し、5Mのトリス塩基(750μL)でpH8.0(ガラス電
極) まで滴定した。SEQ ID NO:5-OH( この場合、Xaa1は
desNH2Tyr であり、かつXaa2はD-Ala である) 、｛［de
sNH2Tyr1,D-Ala 2,Ala15,29］-GRF(1-29)-OH ｝(7.2mg、
1.9 μモル) を水27μL に溶解し、続いて上記のArg-NH
2 溶液に37℃で溶解した。1.0mg mL-1のカルボキシペプ
チダーゼＹ3.0 μL を添加することにより反応を開始
し、反応混合物を37℃に保った。反応の進行を、1.5 μ
L のアリコートを取り出し、HPLCにより分析することに
より監視した。カラム：VydacC18 218TP54(0.46 x 25c
m) 、溶離剤：(A)0.025％TFA-(B)CH3CN(0.025％TFA)、
勾配：10分で38％から44％までのＢ、流量：1.5 mL/
分、検出：206nm 。
【００４２】その反応を、氷酢酸(0.6mL) を添加するこ
とにより62分のマーク(HPLC により70％の転化率) で停
止した。冷却した反応混合物をHPLCにより分別した。カ
ラム：VydacoC18 218TP1022(2.2 x 25cm)、溶離剤：(A)
0.1％TFA-(B)CH3CN(0.1％TFA)、勾配：60分で20％から4
0％までのＢ、流量：25mL/ 分、検出：210nm 。生成物
を含む画分を溜め、そして凍結乾燥して純粋な半合成SE
Q ID NO:4-NH2(この場合、Xaa1はdesNH2Tyr であり、か
つXaa2はD-Ala である) 、｛［desNH2Tyr1,D-Ala2,Ala
15 ］-GRF(1-29)-NH2｝3.8mg(0.97μモル、収率51％、
全収率17％) を得た。
とにより62分のマーク(HPLC により70％の転化率) で停
止した。冷却した反応混合物をHPLCにより分別した。カ
ラム：VydacoC18 218TP1022(2.2 x 25cm)、溶離剤：(A)
0.1％TFA-(B)CH3CN(0.1％TFA)、勾配：60分で20％から4
0％までのＢ、流量：25mL/ 分、検出：210nm 。生成物
を含む画分を溜め、そして凍結乾燥して純粋な半合成SE
Q ID NO:4-NH2(この場合、Xaa1はdesNH2Tyr であり、か
つXaa2はD-Ala である) 、｛［desNH2Tyr1,D-Ala2,Ala
15 ］-GRF(1-29)-NH2｝3.8mg(0.97μモル、収率51％、
全収率17％) を得た。
【００４３】生成物は分析HPLCにより均一であることが
示され、そして酸加水分解(6N HCl-１％TGA;110 ℃; 72
時間) 後に予想アミノ酸組成：Asx3.3(3);Thr1.0(1);Se
r2.5(3);Glx2.3(3);Ala4.0(4);Val1.0(1);Met0.9(1);Il
e2.0(2);Leu4.2(4);Tyr1.0(1);Phe1.0(1);Lys2.0(2);Ar
g2.9(3) を示した。FAB 質量分析：計算値 (M+H)+ 335
7.9実測値:3358 。生成物のトリプシン消化のHPLCは、
固相ペプチド合成により生成された標準SEQ ID NO:4-NH
2(この場合、Xaa1はdesNH2Tyr であり、かつXaa2題はD-
Ala である) のトリプシン消化のHPLCと同じであった。
1987年３月10日に発行された米国特許第4,649,131 号明
細書の14欄、47〜67行を参照のこと。この特許は参考と
して本明細書に含まれる。生体外バイオアッセイにおい
て、4.33の相対効力(GRF(1-44)-NH2［SEQ ID NO:1-N
H2 ］と比較した場合) 。生体外バイオアッセイに関し
て、下記の実施例６を参照のこと。
示され、そして酸加水分解(6N HCl-１％TGA;110 ℃; 72
時間) 後に予想アミノ酸組成：Asx3.3(3);Thr1.0(1);Se
r2.5(3);Glx2.3(3);Ala4.0(4);Val1.0(1);Met0.9(1);Il
e2.0(2);Leu4.2(4);Tyr1.0(1);Phe1.0(1);Lys2.0(2);Ar
g2.9(3) を示した。FAB 質量分析：計算値 (M+H)+ 335
7.9実測値:3358 。生成物のトリプシン消化のHPLCは、
固相ペプチド合成により生成された標準SEQ ID NO:4-NH
2(この場合、Xaa1はdesNH2Tyr であり、かつXaa2題はD-
Ala である) のトリプシン消化のHPLCと同じであった。
1987年３月10日に発行された米国特許第4,649,131 号明
細書の14欄、47〜67行を参照のこと。この特許は参考と
して本明細書に含まれる。生体外バイオアッセイにおい
て、4.33の相対効力(GRF(1-44)-NH2［SEQ ID NO:1-N
H2 ］と比較した場合) 。生体外バイオアッセイに関し
て、下記の実施例６を参照のこと。
【００４４】実施例６ 新規ペプチドの生物活性をGRF(1-44)-NH2(SEQ ID NO:1-
NH2)の天然配列の合成 標準物質（これは末端肥大症を患う個人のヒト膵臓腫瘍
から単離された）（SalkInstitute 標準物質hp-GRF-NH2
(NL-A-10))の生物活性と比較した。生物活性に関するア
ッセイ（これは組織培養中のラット下垂体細胞中の成長
ホルモンの生産を刺激する能力に基いている）を、以下
のようにして行った。
NH2)の天然配列の合成 標準物質（これは末端肥大症を患う個人のヒト膵臓腫瘍
から単離された）（SalkInstitute 標準物質hp-GRF-NH2
(NL-A-10))の生物活性と比較した。生物活性に関するア
ッセイ（これは組織培養中のラット下垂体細胞中の成長
ホルモンの生産を刺激する能力に基いている）を、以下
のようにして行った。
【００４５】30〜40の雄のSDラット(175g)からの下垂体
を断頭後に無菌で取り出した。前葉を回収し、無菌Hepe
s 緩衝液(0.025M)( pH7.35) で３回洗浄し、そしてコラ
ーゲナーゼ（４mg/ ml) およびディスパーゼ（プロテア
ーゼグランデII、２mg/ ml)を含むHepes 緩衝液20〜30m
l中に37℃で分散させた。80分間穏やかに攪拌し、パス
ツールピペットですり砕いた後、分散した細胞を遠心分
離(150 x g、４分）により分離し、そしてノイラミニダ
ーゼ（４mg/ ml) および200mg/mlのエチレンジアミンテ
トラ酢酸(EDTA)二ナトリウム塩を含むHepes 緩衝液、pH
7.35中に10分間再度懸濁させた。細胞を塗布培地で２回
洗浄し、そして下記の既知組成の培地を使用してマルチ
ウェル・プレートに塗布した。BSA/L.2g、Hepes/L.2.38
g 、ゲンタマイシン/L(Schering Co.)50mgを含むF-12/D
MEM/BGJ(6:3:1)(Gibco:430-1700/430-1600/320-2591)。
夫々のウェル中の培地に、培地１ml当たり3.1 〜200fモ
ルの範囲の濃度の新規ペプチドまたは天然GRF(1-44)-NH
2(SEQ ID NO:1-NH2)を補給した。対照ウェルは補給物を
含んでいなかった。２％のウシ胎児血清を添加したこの
培地で塗布を行って細胞の迅速な固定を確実にした。４
日目に、細胞を、ウシ胎児血清を含まない既知組成の培
地で２回洗浄した。最後に、既知組成の培地900 mlを夫
々のウェルに添加し、加えて夫々の個人の処置物質を含
む同培地100mlを３重で添加した。３時間のインキュベ
ーション後に、培地を回収し、そして必要により希釈し
てラット成長ホルモンのラジオイムノアッセイ(RIA) を
行った。Sinha の抗ネズミGH免疫血清および抗体抗原複
合体を沈殿するためにプロテインＡを使用するNational
Pituitary Agency の操作を使用してRIA を行った。 配列リスト (1) 全般の情報： (i) 出願人： (A) 住所：F.Hoffmann-La Roche AG (B) 街：Grenzacherstrasse 124 (C) 市：Basel (D) 州：Basel City (E) 国：スイス (F)ZIP:CH-4002 (G) 電話番号：061 688 3943 (H) テレファックス番号：061 688 1395 (ii)発明の名称：酵素的ペプチド合成 (iii) 配列の数：５ (iv)コンピューターで解読できるフォーム： (A) 媒体の型：フロッピーデスク (B) コンピューター：IBM PC コンパチブル (C) 操作系：PC-DOS/MS-DOS (D) ソフトウェアー：PatentIn Release#1.0,Version#
1.25 (2)SEQ ID NO:1に関する情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：44のアミノ酸 (B) 型：アミノ酸 (D) トポロジー：線状 (ii)分子の型：ペプチド (xi)配列の記載：SEQ ID NO:1:
を断頭後に無菌で取り出した。前葉を回収し、無菌Hepe
s 緩衝液(0.025M)( pH7.35) で３回洗浄し、そしてコラ
ーゲナーゼ（４mg/ ml) およびディスパーゼ（プロテア
ーゼグランデII、２mg/ ml)を含むHepes 緩衝液20〜30m
l中に37℃で分散させた。80分間穏やかに攪拌し、パス
ツールピペットですり砕いた後、分散した細胞を遠心分
離(150 x g、４分）により分離し、そしてノイラミニダ
ーゼ（４mg/ ml) および200mg/mlのエチレンジアミンテ
トラ酢酸(EDTA)二ナトリウム塩を含むHepes 緩衝液、pH
7.35中に10分間再度懸濁させた。細胞を塗布培地で２回
洗浄し、そして下記の既知組成の培地を使用してマルチ
ウェル・プレートに塗布した。BSA/L.2g、Hepes/L.2.38
g 、ゲンタマイシン/L(Schering Co.)50mgを含むF-12/D
MEM/BGJ(6:3:1)(Gibco:430-1700/430-1600/320-2591)。
夫々のウェル中の培地に、培地１ml当たり3.1 〜200fモ
ルの範囲の濃度の新規ペプチドまたは天然GRF(1-44)-NH
2(SEQ ID NO:1-NH2)を補給した。対照ウェルは補給物を
含んでいなかった。２％のウシ胎児血清を添加したこの
培地で塗布を行って細胞の迅速な固定を確実にした。４
日目に、細胞を、ウシ胎児血清を含まない既知組成の培
地で２回洗浄した。最後に、既知組成の培地900 mlを夫
々のウェルに添加し、加えて夫々の個人の処置物質を含
む同培地100mlを３重で添加した。３時間のインキュベ
ーション後に、培地を回収し、そして必要により希釈し
てラット成長ホルモンのラジオイムノアッセイ(RIA) を
行った。Sinha の抗ネズミGH免疫血清および抗体抗原複
合体を沈殿するためにプロテインＡを使用するNational
Pituitary Agency の操作を使用してRIA を行った。 配列リスト (1) 全般の情報： (i) 出願人： (A) 住所：F.Hoffmann-La Roche AG (B) 街：Grenzacherstrasse 124 (C) 市：Basel (D) 州：Basel City (E) 国：スイス (F)ZIP:CH-4002 (G) 電話番号：061 688 3943 (H) テレファックス番号：061 688 1395 (ii)発明の名称：酵素的ペプチド合成 (iii) 配列の数：５ (iv)コンピューターで解読できるフォーム： (A) 媒体の型：フロッピーデスク (B) コンピューター：IBM PC コンパチブル (C) 操作系：PC-DOS/MS-DOS (D) ソフトウェアー：PatentIn Release#1.0,Version#
1.25 (2)SEQ ID NO:1に関する情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：44のアミノ酸 (B) 型：アミノ酸 (D) トポロジー：線状 (ii)分子の型：ペプチド (xi)配列の記載：SEQ ID NO:1:
【００４６】
【化９】
【００４７】(2)SEQ ID NO:2に関する情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：26のアミノ酸 (B) 型：アミノ酸 (D) トポロジー：線状 (ii)分子の型：ペプチド (xi)配列の記載：SEQ ID NO:2:
【００４８】
【化１０】
【００４９】(2)SEQ ID NO:3に関する情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：26のアミノ酸 (B) 型：アミノ酸 (D) トポロジー：線状 (ii)分子の型：ペプチド (xi)配列の記載：SEQ ID NO:3:
【００５０】
【化１１】
【００５１】(2)SEQ ID NO:4に関する情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：29のアミノ酸 (B) 型：アミノ酸 (D) トポロジー：線状 (ii)分子の型：ペプチド (xi)配列の記載：SEQ ID NO:4:
【００５２】
【化１２】
【００５３】(2)SEQ ID NO:5に関する情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：29のアミノ酸 (B) 型：アミノ酸 (D) トポロジー：線状 (ii)分子の型：ペプチド (xi)配列の記載：SEQ ID NO:5:
【００５４】
【化１３】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 エドガー フィリップ ハイマー アメリカ合衆国 07110 ニュージャージ ー州 ナットレイ， プロスペクト スト リート 539
Claims (10)
- 【請求項１】 N-末端アミノ酸残基またはN-末端ペプチ
ドフラグメント（これらのそれぞれは必要により置換さ
れていてもよい）をC-末端アミノ酸残基またはC-末端ペ
プチドフラグメント（そのそれぞれは必要により置換さ
れていてもよい）にカップリングして式 【化１】 （式中、Y N はＨまたはN-末端アミノ酸残基もしくはN-
末端ペプチドフラグメント（これらのそれぞれは必要に
より置換されていてもよい）であり、Ｑは酸性アミノ酸
残基であり、かつX C はC-末端アミノ酸残基またはC-末
端ペプチドフラグメント（これらのそれぞれは必要によ
り置換されていてもよい）である）を有する化合物を生
成する方法であって、式 【化２】 （式中、Ｒは水素、アルキル、ハロアルキル、アリー
ル、アラルキル、または少なくとも１個のヘテロ原子を
有する５員もしくは６員の複素環である）を有する基質
成分を、約５〜約10.5のpHを有する水溶液または分散液
中でエンドペプチダーゼの存在下でアミノ酸またはペプ
チドX C と反応させて式Ｉの化合物を生成することを特
徴とする前記のカップリング方法。 - 【請求項２】 前記のエンドペプチダーゼが酵母源、動
物源、植物源、または微生物源のものである請求項１に
記載の方法。 - 【請求項３】 前記のエンドペプチダーゼが酸性アミノ
酸残基のカルボキシル側で特異的に開裂する請求項１ま
たは請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 ＱがAsp 残基またはGlu 残基である請求
項１〜３のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項５】 式IIの基質化合物がY N -Asp(OH)-OR で
ある請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項６】 Ｒがエチルである請求項１〜５のいずれ
か一項に記載の方法。 - 【請求項７】 Y N がdesNH2Tyr-D-Ala である請求項１
〜６のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項８】 X C がSEQ ID NO:3-NH2 である請求項１
〜７のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項９】 エンドペプチダーゼがS.アウレウスから
のV8プロテアーゼである請求項１〜８のいずれか一項に
記載の方法。 - 【請求項１０】 式 desNH2-Tyr-D-Ala-Asp(OH)-OEt を有する基質成分IIを式 【化３】 (=SEQ ID NO:3-NH2)の化合物X C と反応させて配列 【化４】 を有する式Ｉの生成物を生成する請求項１〜９のいずれ
か一項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US82768692A | 1992-01-28 | 1992-01-28 | |
| US07/827:686 | 1992-01-28 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05336987A true JPH05336987A (ja) | 1993-12-21 |
Family
ID=25249868
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1255693A Pending JPH05336987A (ja) | 1992-01-28 | 1993-01-28 | 酵素的ペプチド合成 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0566824A1 (ja) |
| JP (1) | JPH05336987A (ja) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FI70597C (fi) * | 1979-04-06 | 1986-09-24 | Carlsberg Biotechnology Ltd | Foerfarande foer enzymatisk framstaellning av peptider |
| DK72587D0 (da) * | 1987-02-13 | 1987-02-13 | Carlsberg Biotechnology Ltd | Fremgangsmaade til enzymatisk fremstilling af dipeptider |
-
1993
- 1993-01-20 EP EP93100754A patent/EP0566824A1/en not_active Withdrawn
- 1993-01-28 JP JP1255693A patent/JPH05336987A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0566824A1 (en) | 1993-10-27 |
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