JPH05336983A - Production of phospholipid - Google Patents
Production of phospholipidInfo
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- JPH05336983A JPH05336983A JP17197592A JP17197592A JPH05336983A JP H05336983 A JPH05336983 A JP H05336983A JP 17197592 A JP17197592 A JP 17197592A JP 17197592 A JP17197592 A JP 17197592A JP H05336983 A JPH05336983 A JP H05336983A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明はリン脂質の生産方法に関
し、更に詳しくは、簡便な操作で収率よく塩基構造の変
換されたリン脂質を効率的に生産する方法に関する。リ
ン脂質は、その界面活性や生理作用を生かして、単に乳
化剤として用い得るのみならずリポソームの基材として
薬剤運搬体、人工血液、人工細胞等への応用が近年注目
されており、また、それ自体生理活性、薬理作用を持つ
ものとして、医学、薬学、工学的分野の様々の用途が考
えられている。このような多様な要求に対応するため
に、各々の用途に応じた構造を有するリン脂質を効率的
に製造する方法を開発することは、産業上非常に意義あ
ることである。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a method for producing phospholipids, and more particularly to a method for efficiently producing a phospholipid having a converted base structure with a high yield by a simple operation. Phospholipids can be used not only as emulsifiers by taking advantage of their surface activity and physiological action, but also have recently attracted attention for application to drug carriers, artificial blood, artificial cells, etc. as liposome substrates. Various applications in the fields of medicine, pharmacy, and engineering are considered as those having physiological activity and pharmacological action themselves. In order to meet such various demands, it is very significant industrially to develop a method for efficiently producing a phospholipid having a structure suitable for each application.
【０００２】[0002]
【従来の技術】従来、このようなリン脂質を製造する方
法としては、キャベツ由来、膵臓由来、或いは微生物由
来の種々の精製リン脂質分解酵素を直接或いは固定化等
を行って反応させる方法が提案されている（特開昭６３
−４２６９１、同６３−４４８９３、特開平１−１５３
０９０、同２−３５０９３、同２−４９５９３）。2. Description of the Related Art Conventionally, as a method for producing such phospholipids, a method has been proposed in which various purified phospholipid-degrading enzymes derived from cabbage, pancreas, or microorganisms are reacted directly or by immobilization. (JP-A-63
-42691, 63-44893, JP-A-1-153.
090, ibid. 2-35093, ibid. 2-49593).
【０００３】このようなホスホリパーゼＤによるホスフ
ァチジル基転移反応を利用してリン脂質の塩基部分を交
換しようとする場合、一般に水相と有機溶媒相とからな
る２相系で反応が行なわれる。即ち、主として水溶性酵
素、受容体、pH緩衝液、無機塩等を含む水相と、主とし
て親油性である原料リン脂質を含む有機溶媒相とを攪
拌、混合する反応系である。When the phosphatidyl group transfer reaction with phospholipase D is used to exchange the base moiety of phospholipid, the reaction is generally carried out in a two-phase system consisting of an aqueous phase and an organic solvent phase. That is, it is a reaction system in which an aqueous phase mainly containing a water-soluble enzyme, a receptor, a pH buffer solution, an inorganic salt and the like and an organic solvent phase mainly containing a lipophilic raw material phospholipid are stirred and mixed.
【０００４】しかし乍ら、既に報告されているような精
製酵素を使用する場合、酵素の製造プロセス（分離、精
製プロセス）に要するコストが高くなるため、リン脂質
製造プロセスの工業化に際して酵素コストが割高となる
など経済的に大きな課題となっている。更に、高価なホ
スホリパーゼＤを再利用すべく、固定化酵素による反応
系の構築を考えた場合にも、例えば酵素をセライト等の
担体に固定化する方法は反応物質が担体上の酵素まで拡
散しにくく、特に担体の細孔内に吸着された酵素は反応
には実質的に関与せず、有効に働く酵素が減少する等の
問題がある。また、上記該反応が２相系で行なわれるた
め、酵素の担体への吸着力がかなり強固なものでなけれ
ば、水相への酵素の漏出が懸念される。また、ゲル化剤
などによる包括固定化法は固定化の操作が複雑で、しか
も攪拌律速による反応速度の低下等の不都合な点が多く
工業化を企てる上で改善が望まれている。However, when the purified enzyme as reported above is used, the cost required for the enzyme production process (separation / purification process) is high, and therefore the enzyme cost is high when the phospholipid production process is industrialized. Has become a major economic issue. Furthermore, even when considering the construction of a reaction system with an immobilized enzyme in order to reuse expensive phospholipase D, for example, the method of immobilizing the enzyme on a carrier such as Celite is such that the reaction substance diffuses to the enzyme on the carrier. This is difficult, and in particular, the enzyme adsorbed in the pores of the carrier does not substantially participate in the reaction, and there is a problem that the enzyme that works effectively decreases. Further, since the above-mentioned reaction is carried out in a two-phase system, there is a concern that the enzyme may leak into the aqueous phase unless the adsorption of the enzyme on the carrier is fairly strong. Further, the entrapping immobilization method using a gelling agent or the like has complicated immobilization operations, and there are many inconveniences such as a decrease in reaction rate due to stirring rate control, and improvement is desired in industrialization.
【０００５】[0005]
【発明が解決しようとする課題】本発明はかかる実情に
鑑み、上記問題点を解決し、工業的、経済的に有利なリ
ン脂質の生産方法を提供するものである。SUMMARY OF THE INVENTION In view of such circumstances, the present invention solves the above problems and provides an industrially and economically advantageous method for producing phospholipids.
【０００６】[0006]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上述の課
題を解決するべく鋭意検討を重ねた結果、微生物により
生産されるホスホリパーゼＤを含む培養液を直接塩基交
換反応に供することにより、精製した酵素を利用する場
合と比べて工業的、経済的に極めて有利となるのみなら
ず、酵素の安定性も増大することを見いだし、本発明を
完成した。即ち、本発明は、塩基構造が変換されたリン
脂質を製造するにあたり、ホスホリパーゼＤを生産する
微生物の培養液の存在下に、原料リン脂質と水酸基を有
する受容体とを接触させて反応を行なうことを特徴とす
るリン脂質の生産方法を内容とするものである。Means for Solving the Problems As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the inventors of the present invention directly provided a culture solution containing phospholipase D produced by a microorganism to a base exchange reaction, The inventors have found that not only is it industrially and economically extremely advantageous as compared with the case of using a purified enzyme, but also the stability of the enzyme is increased, and the present invention has been completed. That is, in the present invention, in the production of a phospholipid having a converted base structure, the raw material phospholipid and a receptor having a hydroxyl group are contacted with each other in the presence of a culture solution of a phospholipase D-producing microorganism. A method for producing a phospholipid characterized by the above.
【０００７】本発明によると、微生物を培養した際の培
養液を直接酵素溶液として用いるため、煩雑な酵素の精
製プロセスを回避することが可能となる。一般的に、直
接酵素を含む培養液を利用した場合、培養液中に存在す
る酵素以外の不純物、例えば培地成分、代謝産物などの
反応生成物への混入が考えられる。特に、食品、医療品
用途の製品を目的とする場合、安全性の点で問題が多い
と考えられる。しかし、本反応は上述の如く２相系で反
応が進行するので、問題となると考えられる物質は水相
に存在し、目的生産物が存在する有機溶媒相には殆ど移
行しないため、危惧されるような問題点を回避すること
が可能となる。更に、反応終了後、有機溶媒相から塩基
構造が変化されたリン脂質のみを容易に回収できるた
め、分離型バイオリアクターとして利用することが可能
になり工業的には極めて好都合である。According to the present invention, since a culture solution obtained by culturing a microorganism is directly used as an enzyme solution, it is possible to avoid a complicated enzyme purification process. Generally, when a culture medium containing an enzyme is directly used, impurities other than the enzyme present in the culture medium, such as medium components and metabolites, may be contaminated with reaction products. In particular, it is considered that there are many problems in terms of safety when the product is intended for food and medical products. However, since this reaction proceeds in a two-phase system as described above, the substance considered to be a problem is present in the aqueous phase and hardly migrates to the organic solvent phase in which the target product is present, which may be a concern. It is possible to avoid such problems. Furthermore, after the completion of the reaction, only the phospholipid having a modified base structure can be easily recovered from the organic solvent phase, which makes it possible to use it as a separation-type bioreactor, which is extremely convenient industrially.
【０００８】本発明に用いられる微生物としては、ホス
ホリパーゼＤを生産するものであればいかなる微生物も
利用することができるが、代表的なものとして、リゾプ
ス(Rhizopus)属、アスペルギルス(Aspergillus) 属、ム
コール(Mucor) 属、シュードモナス(Psedomonas)属、キ
ャンディダ(Candida) 属、ペリシリウム(Penicillium)
属、クロモバクテリウム(Chromobacterium) 属、ストレ
プトマイセス（Streptomyces）属、ストレプトバーチシ
リウム（Streptoverticillium ）属、ミクロモノスポラ
（Micromonospora) 属、ノカルディア（Nocardia) 属、
ノカルディオプシス（Nocardiopsis) 属、アクチノマヂ
ューラ（Actinomadura) 属、等に属する微生物を挙げる
ことができる。より具体的には、リゾプス・ジャパニカ
ス（Rhizopus japonicus, IFO 4785)、リゾプス・デレ
マー(Rhizopus delemar, IFO 4730)、アスペルギルス・
ニガー(Aspergillus niger, IFO 4091) 、シュードモナ
ス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens, IFO
12055)、ムコール・ジャバニカス(Mucor javanicus, IF
O 4572) 、キャンディダ・ルゴサ(Candida rugosa, IFO
1152)、ペニシリウム・アルビカンス(Penicillium alb
icans, IFO 6771)、クロモバクテリウム・ビオラセウム
(Chromobacterium violaceum, IFO 12614)、ストレプト
マイセス・メディオシディカス（Streptomyces medioci
dicus, IFO 13202）、ストレプトマイセス・プルニカラ
ー(Streptomyces prunicolor, IFO 13075)、ストレプト
マイセス・アンチバイオティカス(Streptomyces antibi
oticus, IFO 13271)、ストレプトバーチシリウム・ハチ
ジョーエンセ（Streptoverticillium hachijoense, IFO
12782）、ストレプトバーチシリウム・シンナモネウム
(Streptoverticillium cinnamoneum, IFO 12852)、ミク
ロモノスポラ・チャルセア（Micromonospora chalcea,
ATCC 12135) 、ノカルディア・アステロイデス（Nocard
ia asteroides, IFO 3424)、ノカルディオプシス・アト
ラ（Nocardiopsis atra, IFO 14198) 、アクチノマジュ
ーラ・リバノチカ（Actinomadura libanotica, IFO 140
96) 等が挙げられる。これらは単独又は２種以上組み合
わせて用いられ、これらの他にも公知の微生物が適用さ
れる。As the microorganism used in the present invention, any microorganism can be used as long as it produces phospholipase D. As typical ones, the representatives are Rhizopus, Aspergillus and Mucor. (Mucor) genus, Psedomonas genus, Candida genus, Pericillium (Penicillium)
Genus, Chromobacterium genus, Streptomyces genus, Streptoverticillium (Streptoverticillium) genus, Micromonospora genus, Nocardia genus,
The microorganisms belonging to the genus Nocardiopsis, the genus Actinomadura, etc. can be mentioned. More specifically, Rhizopus japonicus (IFO 4785), Rhizopus delemar (IFO 4730), Aspergillus
Niger (Aspergillus niger, IFO 4091), Pseudomonas fluorescens, IFO
12055), Mucor javanicus, IF
O 4572), Candida rugosa, IFO
1152), Penicillium albkans
icans, IFO 6771), Chromobacterium violaceum
(Chromobacterium violaceum, IFO 12614), Streptomyces medioci
dicus, IFO 13202), Streptomyces prunicolor (Streptomyces prunicolor, IFO 13075), Streptomyces antibioticus (Streptomyces antibiticus)
oticus, IFO 13271), Streptoverticillium hachijoense, IFO
12782), Streptoverticillium cinnamonium
(Streptoverticillium cinnamoneum, IFO 12852), Micromonospora chalcea,
ATCC 12135), Nocardia Asteroides (Nocard
ia asteroides, IFO 3424), Nocardiopsis atra (IFO 14198), Actinomadura libanotica, IFO 140
96) and the like. These may be used alone or in combination of two or more, and other known microorganisms may be applied.
【０００９】上記該微生物を培養して、培養液中にホス
ホリパーゼＤを分泌させるために用いられる培地成分と
しては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用
され得る。炭素源としては同化可能な炭素化合物、例え
ばブドウ糖、ショ糖、乳糖、麦芽糖、澱粉、デキストリ
ン、糖蜜等の糖類、グリセリン、炭化水素類、有機酸、
脂肪酸、油脂、アルコール類等が単独又は２種以上の組
み合わせで使用される。窒素源としては利用可能な窒素
化合物であればよく、無機窒素源、有機窒素源いずれで
も利用可能であり、例えばコーンスチープリカー、大豆
粉、小麦グルテン、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、
麦芽エキス、カゼイン加水分解物、尿素、カザミノ酸、
硝酸態窒素、アンモニウム態窒素等が単独又は２種以上
の組み合わせで使用される。その他、リン酸塩、マグネ
シウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛、
食塩等の塩類が必要に応じて単独又は２種以上の組み合
わせで使用される。As the medium component used for culturing the above-mentioned microorganism to secrete phospholipase D into the culture medium, those usually used for culturing the microorganism can be widely used. As a carbon source, assimilable carbon compounds such as glucose, sucrose, lactose, maltose, starch, dextrin, sugars such as molasses, glycerin, hydrocarbons, organic acids,
Fatty acids, oils and fats, alcohols and the like are used alone or in combination of two or more. As the nitrogen source, any available nitrogen compound may be used, and any of an inorganic nitrogen source and an organic nitrogen source can be used, for example, corn steep liquor, soybean flour, wheat gluten, peptone, meat extract, yeast extract,
Malt extract, casein hydrolyzate, urea, casamino acid,
Nitrate nitrogen, ammonium nitrogen and the like are used alone or in combination of two or more kinds. Others, phosphate, magnesium, calcium, potassium, iron, manganese, zinc,
Salts such as sodium chloride are used alone or in combination of two or more as required.
【００１０】上記該微生物の培養方法としては一般に微
生物の培養に用いられる方法が利用される。即ち、回分
培養法、流加培養法、連続培養法等が用いられ、培養温
度は、菌体が生育しホスホリパーゼＤを生産可能な範囲
内で適宜採用し得るが、通常１５〜４０℃が好ましい。
回分培養においては、培養時間は菌体内リン脂質分解酵
素活性が最大となる時点で培養を終了すればよく、通常
は１〜７日程度である。As a method for culturing the above-mentioned microorganism, a method generally used for culturing a microorganism is used. That is, a batch culture method, a fed-batch culture method, a continuous culture method, or the like is used, and the culture temperature can be appropriately adopted within a range in which the cells grow and can produce phospholipase D, but usually 15 to 40 ° C. is preferable. .
In batch culture, the culture time may be terminated when the intracellular phospholipid degrading enzyme activity is maximized, and is usually about 1 to 7 days.
【００１１】得られた培養液は、そのまま反応に用いて
もよいし、静置分離、濾過、或いは遠心分離などの方法
を用いて菌体を分離した後に利用してもよいが、菌体を
除去した後培養液を濃縮し反応に利用するほうが、ホス
ファチジル基とアルコール性水基を有する化合物より新
たなエステルを生成するホスファチジル基転移反応を効
率よく実施する上で好ましい。The obtained culture solution may be used as it is for the reaction, or may be used after separating the cells by a method such as static separation, filtration, or centrifugation. After removal, it is preferable to concentrate the culture solution and use it for the reaction in order to efficiently carry out the phosphatidyl group transfer reaction which produces a new ester from the compound having the phosphatidyl group and the alcoholic water group.
【００１２】本発明に用いられるホスファチジル基転移
反応の原料リン脂質としては、ホスホリパーゼＤの基質
となり得るものであれば、天然資源から抽出したもの、
又は抽出後精製したもの、或いは合成したものの如何を
問わず使用できる。また、市販のもの、或いは公知の方
法で調整したものを使用してもよい。例えば、大豆レシ
チン、脱脂大豆レシチン、卵黄レシチン、ホスファチジ
ルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファ
チジルセリン、ホスファチジルグリセロール、リゾレシ
チン、ホスファチジン酸等、又はそれらの混合物等が挙
げられる。本発明の効果を最大に発揮するためには、原
料リン脂質として精製したもの、ないしは組成の単純な
ものを用いた方が純粋な反応生成物が得られる面で都合
が良い。また、原料リン脂質の価格及び人手の容易さ、
更には酵素に対する反応性の面から、特にホスファチジ
ルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファ
チジルセリンが工業的に効果が高く好ましい。The raw material phospholipids for the phosphatidyl group transfer reaction used in the present invention are those extracted from natural resources as long as they can be substrates for phospholipase D.
Alternatively, it can be used regardless of whether it is purified after extraction or synthesized. In addition, a commercially available product or one prepared by a known method may be used. Examples thereof include soybean lecithin, defatted soybean lecithin, egg yolk lecithin, phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylglycerol, lysolecithin, phosphatidic acid, and the like, or a mixture thereof. In order to maximize the effects of the present invention, it is convenient to use a purified phospholipid as a raw material or a simple phospholipid having a simple composition because a pure reaction product can be obtained. In addition, the price of raw phospholipids and the ease of manpower,
Further, from the viewpoint of reactivity with enzymes, phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, and phosphatidylserine are industrially effective and preferred.
【００１３】これらのリン脂質の構成脂肪酸としては同
種又は異種であって、炭素数８〜２４の飽和又は不飽和
脂肪酸であり、例えばカプロン酸、カプリル酸、ラウリ
ン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベ
ヘン酸、アラキジン酸、パルミトオレイン酸、オレイン
酸、リノール酸、α−及びγ−リノレイン酸、エルシン
酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキ
サエン酸、テトラコサテトラエン酸等が挙げられる。The constituent fatty acids of these phospholipids are the same or different, and are saturated or unsaturated fatty acids having 8 to 24 carbon atoms, such as caproic acid, caprylic acid, lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearin. Examples thereof include acids, behenic acid, arachidic acid, palmitooleic acid, oleic acid, linoleic acid, α- and γ-linolenic acid, erucic acid, arachidonic acid, eicosapentaenoic acid, docosahexaenoic acid, and tetracosatetraenoic acid.
【００１４】本発明における受容体としては、コリン、
エタノールアミン、セリン、Ｎーメチルエタノールアミ
ン、Ｎ，Ｎージメチルエタノールアミン等の含窒素アル
コール類やイノシトール、グリセロール、グルコース、
フラクトース等のポリオール、単糖類等、カルニチン、
アスコルビン酸等の水酸基を有するビタミン類等を挙げ
ることができる。これらは単独又は２種以上組み合わせ
て用いられる。As the receptor in the present invention, choline,
Nitrogen-containing alcohols such as ethanolamine, serine, N-methylethanolamine, N, N-dimethylethanolamine, inositol, glycerol, glucose,
Fructose and other polyols, monosaccharides, carnitine,
Examples thereof include vitamins having a hydroxyl group such as ascorbic acid. These are used alone or in combination of two or more.
【００１５】反応は、原料リン脂質を溶解又は懸濁する
有機溶媒の存在下で行うことが好ましく、微生物酵素を
失活させることの少ない溶媒系であればいずれも使用で
きる。例えば石油エーテル、ジエチルエーテル、メチル
エチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、クロロホル
ム、ジクロロメタン、四塩化炭素、ジクロロエタン、ｎ
−オクタン、イソオクタン、酢酸エチル、ジオキサン、
ベンゼン等の溶媒、又はこれらの混合溶媒系等が挙げら
れる。ただし、前述の如くアルコール類は目的反応の基
質となるため、基質として添加する以外に用いることは
あまり好ましくない。The reaction is preferably carried out in the presence of an organic solvent that dissolves or suspends the raw material phospholipid, and any solvent system that does not inactivate microbial enzymes can be used. For example, petroleum ether, diethyl ether, methyl ethyl ether, diisopropyl ether, chloroform, dichloromethane, carbon tetrachloride, dichloroethane, n
-Octane, isooctane, ethyl acetate, dioxane,
Examples thereof include solvents such as benzene, and mixed solvent systems thereof. However, as described above, alcohols serve as a substrate for the desired reaction, and therefore it is not preferable to use them other than adding as a substrate.
【００１６】反応温度は、用いる微生物の生産するホス
ホリパーゼＤの至適温度付近が好ましく、通常２０〜６
０℃の範囲である。ただし、用いる溶媒が低沸点のもの
である場合等はこの限りではない。反応時間については
回分法の場合は概ね０．５〜４０時間、半回分法や連続
法においても、この反応条件に見合った反応時間を設定
することにより、目的とする反応を行わせることができ
る。また反応様式としては、容器に入れた有機溶媒相と
水相とを懸濁し接触反応させればよく、回転撹拌や超音
波による撹拌方式、カラム中において水相と有機溶媒相
を向流に流して接触させる方式、カラム中に酵素を含む
水相を保持しておいて、油滴状に導入した有機溶媒相を
自然浮上させながら反応を行なう方式等のあらゆる形式
の反応様式が適用可能である。The reaction temperature is preferably near the optimum temperature of phospholipase D produced by the microorganism used, and usually 20 to 6
It is in the range of 0 ° C. However, this does not apply when the solvent used has a low boiling point. The reaction time is about 0.5 to 40 hours in the case of the batch method, and even in the semi-batch method or the continuous method, the desired reaction can be carried out by setting the reaction time suitable for this reaction condition. . As the reaction mode, it suffices to suspend the organic solvent phase and the aqueous phase in a container and carry out a catalytic reaction.The stirring method is rotary stirring or ultrasonic waves, and the aqueous phase and the organic solvent phase are countercurrently flown in the column. It is possible to apply all types of reaction modes such as a method of contacting with water, a method of holding the aqueous phase containing the enzyme in the column and allowing the reaction while allowing the organic solvent phase introduced in the form of oil droplets to spontaneously float. .
【００１７】[0017]
【発明の効果】叙上のごとく、微生物の培養液を原料リ
ン脂質と水酸基を有する受容体に直接作用させることに
より、充分な反応速度が得られるとともに、反応終了後
有機溶媒相から塩基構造が変換されたリン脂質を容易に
回収することが可能になる。また、精製した酵素を使用
する場合と比べて安価な上に酵素の安定性が増すため経
済的にも有利になり、効率的に塩基構造が変換されたリ
ン脂質を製造することが可能となる。更に本発明によれ
ば、例えば近年、ドラッグデリバリーシステムにおける
リポソームの基材として工業的生産が望まれている高純
度のリン脂質を生産するにあたり、ホスファチジル基転
移反応を利用して効率的且つ経済的に所望のリン脂質を
高収率で得ることが可能となる。As described above, by directly acting the culture solution of the microorganism on the raw material phospholipid and the receptor having a hydroxyl group, a sufficient reaction rate can be obtained and the basic structure from the organic solvent phase after the reaction is completed. It becomes possible to easily recover the converted phospholipid. In addition, compared to the case of using a purified enzyme, the stability of the enzyme is increased in addition to being cheaper, which is economically advantageous, and it becomes possible to efficiently produce a phospholipid having a converted base structure. . Further, according to the present invention, for example, in producing a high-purity phospholipid, which has recently been desired to be industrially produced as a base material for liposomes in a drug delivery system, it is efficient and economical to utilize a phosphatidyl group transfer reaction. In addition, the desired phospholipid can be obtained in high yield.
【００１８】[0018]
【実施例】次に実施例を用いて本発明を更に詳しく説明
するが、本発明はもとよりかかる実施例のみに限定され
るものではない。以下の記載において、「％」は特に断
らない限り「重量％」を意味する。尚、リン脂質の分析
は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて行なっ
た。固定相には、シリカゲルにアミノプロピル基を化学
結合させたカラムを、また移動相溶媒としてはアセトニ
トリル：メタノール：１０mMリン酸二水素アンモニウム
＝６１２：２８９：１００の混合溶媒系をそれぞれ用
い、２０５nmにおける吸収を測定することにより定量を
行なった。ホスホリパーゼＤの加水分解活性は、ホスフ
ァチジルコリンがホスホリパーゼＤにより加水分解され
る際に遊離してくるコリンの量を酵素法を用いることに
より測定を行なった。酵素活性の定義として、３７℃、
pH８．０における反応で、１分間あたり１μmol のコリ
ンを遊離する酵素量を１ユニット（Unit）と定義した。EXAMPLES Next, the present invention will be described in more detail by way of examples, but the present invention is not limited to such examples as a matter of course. In the following description, “%” means “% by weight” unless otherwise specified. The analysis of phospholipids was performed by high performance liquid chromatography (HPLC). A column in which aminopropyl group was chemically bonded to silica gel was used as a stationary phase, and a mixed solvent system of acetonitrile: methanol: 10 mM ammonium dihydrogen phosphate = 612: 289: 100 was used as a mobile phase solvent, respectively, at 205 nm. Quantitation was performed by measuring the absorption. The hydrolysis activity of phospholipase D was measured by using the enzymatic method to measure the amount of choline released when phosphatidylcholine was hydrolyzed by phospholipase D. As a definition of enzyme activity, 37 ℃,
The amount of enzyme that liberates 1 μmol of choline per minute in the reaction at pH 8.0 was defined as 1 unit.
【００１９】実施例１ ストレプトバーチシリウム・シナモネウム IFO 12363
を、グルコース１％、肉エキス０．７５％、ポリペプト
ン０．７５％、NaCl０．３％、MgSO4 ０．１％を含む培
地（pH７．２）で、温度３０℃、５日間振盪培養した。
得られた培養液は３０００rpm で１０分間遠心分離を行
なうことにより菌体を除去した後塩基交換反応に供し
た。こうして得られた培養液の３７℃、pH８．０におけ
るＰＬ−Ｄ加水分解活性は培養液１リットルあたり１１
２０ユニットであった。密栓したサンプル瓶に、ホスフ
ァチジルコリン（旭化成製）７０mg、ジエチルエーテル
３２ml、１Ｍモノエタノールアミン−HCl バッファー
（pH８．０）１５．５ml、上記の如く調製した培養上清
０．５ml（ＰＬ−Ｄ加水分解活性で０．５６ユニット相
当）を加え、３０℃にて５時間反応を行なった。分析の
結果、５時間反応後の反応液組成は、ホスファチジルコ
リン０．２％、ホスファチジルエタノールアミン９９．
８％、ホスファチジン酸０％であった。ＰＬ−Ｄを生産
する微生物の培養液を用いた場合もホスファチジル基転
移反応を効率的に行なうことができることが確認され
た。Example 1 Streptoverticillium cinnamonium IFO 12363
Was cultured in a medium (pH 7.2) containing 1% glucose, 0.75% meat extract, 0.75% polypeptone, 0.3% NaCl, and 0.1% MgSO 4 at a temperature of 30 ° C. for 5 days with shaking.
The obtained culture broth was centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes to remove the cells, and then subjected to a base exchange reaction. The PL-D hydrolysis activity of the thus obtained culture broth at 37 ° C. and pH 8.0 was 11 per liter of the culture broth.
It was 20 units. In a tightly stoppered sample bottle, 70 mg of phosphatidylcholine (manufactured by Asahi Kasei), 32 ml of diethyl ether, 15.5 ml of 1M monoethanolamine-HCl buffer (pH 8.0), 0.5 ml of culture supernatant prepared as above (PL-D hydrolysis) 0.56 units of activity was added), and the reaction was carried out at 30 ° C. for 5 hours. As a result of the analysis, the reaction solution composition after the reaction for 5 hours was as follows: phosphatidylcholine 0.2%, phosphatidylethanolamine 99.
8% and phosphatidic acid 0%. It was confirmed that the phosphatidyl group transfer reaction can be efficiently carried out even when a culture solution of a microorganism producing PL-D is used.
【００２０】実施例２ 実施例１で使用した微生物の代わりに、ストレプトマイ
セス・プルニカラー IFO 13075、ミクロモノスポラ・チ
ャルセア IFO 12135、ノカルディア・アステロイデス I
FO 3424 、ノカルディオプシス・アトラ IFO 14198、ア
クチノマジューラ・リバノチカ IFO 14096、リゾプス・
デレマー IFO 4730 、アスペルギルス・ニガー IFO 409
1 、シュードモナス・フルオレッセンス IFO 12055、ム
コール・ジャバニカス IFO 4572 、キャンディダ・ルゴ
サ IFO 1152 、ペニシリウム・アルビカンス IFO 6771
、クロモバクテリウム・ビオラセウム IFO 12614を使
用した以外は、実施例１と全く同様に行なった。表１に
各微生物を培養した際の培養上清を用いて、実施例１と
同様にＰＣからＰＥの塩基交換反応を行なった場合の５
時間後の反応液組成の分析結果を示した。Example 2 Instead of the microorganism used in Example 1, Streptomyces purnicolor IFO 13075, Micromonospora charsea IFO 12135, Nocardia Asteroides I
FO 3424, Nocardiopsis Atlas IFO 14198, Actino Majura Rivanotika IFO 14096, Rhizopus
Dermer IFO 4730, Aspergillus Niger IFO 409
1, Pseudomonas fluorescens IFO 12055, Mucor Javanicus IFO 4572, Candida Lugosa IFO 1152, Penicillium albicans IFO 6771
The same procedure as in Example 1 was carried out except that Chromobacterium violaceum IFO 12614 was used. Table 5 shows the results obtained when the base exchange reaction of PE from PC was carried out in the same manner as in Example 1 using the culture supernatant obtained by culturing each microorganism.
The analysis results of the reaction solution composition after the elapse of time are shown.
【００２１】[0021]
【表１】 ＰＣ：ホスファチジルコリン ＰＥ：ホスファチジルエタノールアミン ＰＡ：ホスファチジン酸[Table 1] PC: phosphatidylcholine PE: phosphatidylethanolamine PA: phosphatidic acid
【００２２】実施例３ 塩基交換反応の際の受容体として、エタノールアミンの
代わりにセリンを１．６８ｇ加え、バッファーとして
０．１Ｍクエン酸−クエン酸ナトリウムバッファー（pH
８．０）を１５．５ml加えた以外は実施例１と全く同様
に行なった。結果を表２に示す。Example 3 As the acceptor for the base exchange reaction, 1.68 g of serine was added instead of ethanolamine, and 0.1 M citric acid-sodium citrate buffer (pH
Example 1 was repeated except that 15.5 ml of 8.0) was added. The results are shown in Table 2.
【００２３】実施例４ 塩基交換反応の際の受容体として、エタノールアミンの
代わりにグリセロールを１．４７ｇ加えた以外は実施例
３と全く同様に行なった。結果を表２に示す。Example 4 The procedure of Example 3 was repeated except that 1.47 g of glycerol was added instead of ethanolamine as an acceptor in the base exchange reaction. The results are shown in Table 2.
【００２４】実施例５ 塩基交換反応の際の受容体として、エタノールアミンの
代わりにイノシトールを２．８８ｇ加えた以外は実施例
３と全く同様に行なった。結果を表２に示す。Example 5 The procedure of Example 3 was repeated except that 2.88 g of inositol was added instead of ethanolamine as an acceptor in the base exchange reaction. The results are shown in Table 2.
【００２５】実施例６ 塩基交換反応の際の受容体として、エタノールアミンの
代わりにアスコルビン酸を２．８２ｇ加えた以外は実施
例３と全く同様に行なった。結果を表２に示す。Example 6 The procedure of Example 3 was repeated except that 2.82 g of ascorbic acid was added instead of ethanolamine as the acceptor in the base exchange reaction. The results are shown in Table 2.
【００２６】実施例７ 塩基交換反応の際の受容体として、エタノールアミンの
代わりにカルニチンを２．５９ｇ加えた以外は実施例３
と全く同様に行なった。結果を表２に示す。Example 7 Example 3 except that 2.59 g of carnitine was added instead of ethanolamine as an acceptor in the base exchange reaction.
And did exactly the same. The results are shown in Table 2.
【００２７】[0027]
【表２】 ＰＣ：ホスファチジルコリン ＰＡ：ホスファチジン酸 ＰＸ：ホスファチジルセリン（実施例３） ホスファチジルグリセロール（実施例４） ホスファチジルイノシトール（実施例５） ホスファチジルアスコルビン酸（実施例６） ホスファチジルカルニチン（実施例７）[Table 2] PC: Phosphatidylcholine PA: Phosphatidic acid PX: Phosphatidylserine (Example 3) Phosphatidylglycerol (Example 4) Phosphatidylinositol (Example 5) Phosphatidylascorbic acid (Example 6) Phosphatidylcarnitine (Example 7)
【００２８】実施例８ 実施例１と全く同様の反応条件でＰＣからＰＥへの塩基
交換反応を繰り返し実施した。３０℃で５時間１回目の
反応を行なった後、遠心分離（１０００rpm 、２min ）
により水相と有機溶媒相とを分離した。２相に分かれた
反応液から有機溶媒相を除去した後、新たに調製した有
機溶媒相を加えて次の反応を実施した。この様な繰り返
し反応を３０回繰り返した。各回の反応においてそのＰ
Ｅ生成の初速度を測定し、１回目の反応の初速度を１０
０％として繰り返し反応における初速度の推移を図１に
示す。Example 8 Under the same reaction conditions as in Example 1, the base exchange reaction from PC to PE was repeatedly carried out. After the first reaction at 30 ° C for 5 hours, centrifugation (1000 rpm, 2 min)
To separate the aqueous phase from the organic solvent phase. After removing the organic solvent phase from the reaction liquid separated into two phases, a newly prepared organic solvent phase was added to carry out the next reaction. Such a repeated reaction was repeated 30 times. P in each reaction
The initial rate of E formation was measured, and the initial rate of the first reaction was 10
The transition of the initial velocity in the repeated reaction is shown in FIG. 1 as 0%.
【００２９】比較例１ 比較例として、培養液を用いる代わりに市販のＰＬ−Ｄ
酵素（東洋醸造製、Streptomyces sp., ３７℃、pH８．
０における加水分解活性で０．０５ユニット相当）を用
いた以外は実施例８と全く同様に行なった。結果を図１
に併記する。図１から明かなように、ＰＬ−Ｄを生産す
る微生物の培養液をリン脂質の塩基交換反応に直接利用
することは、市販のＰＬ−Ｄ酵素を用いる場合と比べ酵
素の安定性が増大するため、繰り返し塩基交換反応を安
定して行なうことが可能である。Comparative Example 1 As a comparative example, a commercially available PL-D was used instead of using the culture solution.
Enzyme (Streptomyces sp., 37 ° C., pH 8.
Example 8 was carried out in the same manner as in Example 8 except that the hydrolysis activity at 0 was equivalent to 0.05 unit). The result is shown in Figure 1.
Also described in. As is clear from FIG. 1, direct use of the culture solution of a PL-D-producing microorganism for the base exchange reaction of phospholipids increases the stability of the enzyme as compared with the case of using a commercially available PL-D enzyme. Therefore, it is possible to stably carry out repeated base exchange reactions.
【図１】実施例８と比較例１において、繰り返し反応に
おける初速度の推移を示すグラフである。FIG. 1 is a graph showing the transition of initial velocity in repeated reaction in Example 8 and Comparative Example 1.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:39） (Ｃ１２Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:785） (Ｃ１２Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:80） (Ｃ１２Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:48） (Ｃ１２Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:30） (Ｃ１２Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:365） ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 5 Identification code Internal reference number FI Technical indication (C12P 9/00 C12R 1:39) (C12P 9/00 C12R 1: 785) (C12P 9/00 C12R 1:72) (C12P 9/00 C12R 1:80) (C12P 9/00 C12R 1:01) (C12P 9/00 C12R 1: 465) (C12P 9/00 C12R 1:48) (C12P 9/00 C12R 1:30) (C12P 9/00 C12R 1: 365)
Claims (2)
るにあたり、ホスホリパーゼＤを生産する微生物の培養
液の存在下に、原料リン脂質と水酸基を有する受容体と
を接触させて反応を行なうことを特徴とするリン脂質の
生産方法。1. When producing a phospholipid having a converted base structure, the reaction is carried out by contacting the starting phospholipid with a receptor having a hydroxyl group in the presence of a culture solution of a phospholipase D-producing microorganism. A method for producing a phospholipid, comprising:
属、シュードモナス属、ムコール属、キャンディダ属、
ペニシリウム属、クロモバクテリウム属、ストレプトマ
イセス属、ストレプトバーチシリウム属、ミクロモノス
ポラ属、ノカルディア属、ノカルディオプシス属及びア
クチノマヂューラ属から選択される少なくとも１種であ
る請求項１記載の生産方法。2. The microorganisms are Rhizopus, Aspergillus, Pseudomonas, Mucor, Candida,
The at least one species selected from the genus Penicillium, chromobacterium, streptomyces, streptoverticillium, micromonospora, nocardia, nocardiopsis and actinomadura. The production method described.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17197592A JPH05336983A (en) | 1992-06-04 | 1992-06-04 | Production of phospholipid |
Applications Claiming Priority (1)
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| JP17197592A JPH05336983A (en) | 1992-06-04 | 1992-06-04 | Production of phospholipid |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05336983A true JPH05336983A (en) | 1993-12-21 |
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ID=15933216
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| JP17197592A Withdrawn JPH05336983A (en) | 1992-06-04 | 1992-06-04 | Production of phospholipid |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05336983A (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997017460A1 (en) * | 1995-11-08 | 1997-05-15 | Kabushiki Kaisha Yakult Honsha | Process for producing phosphatidylserines having polybasic unsaturated fatty acid as side chain |
| EP0776976A2 (en) | 1995-12-08 | 1997-06-04 | ITALFARMACO SUD S.p.A. | A process for the industrial preparation of phosphatidylserine |
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| CN107723282A (en) * | 2017-11-27 | 2018-02-23 | 盐城工学院 | The production technology and phospholipase D product of a kind of phospholipase D |
-
1992
- 1992-06-04 JP JP17197592A patent/JPH05336983A/en not_active Withdrawn
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| CN1103818C (en) * | 1995-11-08 | 2003-03-26 | 株式会社雅库路特本社 | Process for producing phosphatidylserines having polybasic unsaturated fatty acid and as side chain |
| EP0776976A2 (en) | 1995-12-08 | 1997-06-04 | ITALFARMACO SUD S.p.A. | A process for the industrial preparation of phosphatidylserine |
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| JP2006211974A (en) * | 2005-02-04 | 2006-08-17 | Yakult Honsha Co Ltd | Method for culturing bacterium of genus streptomyces and method for producing useful substance using the same |
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