JPH05336980A - パラヒドロキシ安息香酸の製造方法 - Google Patents
パラヒドロキシ安息香酸の製造方法Info
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- JPH05336980A JPH05336980A JP14573092A JP14573092A JPH05336980A JP H05336980 A JPH05336980 A JP H05336980A JP 14573092 A JP14573092 A JP 14573092A JP 14573092 A JP14573092 A JP 14573092A JP H05336980 A JPH05336980 A JP H05336980A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】従来は高温・高圧の反応で化学合成されていた
パラヒドロキシ安息香酸を省エネルギー的に微生物によ
る変換によってパラクレゾールから安価に製造する。 【構成】微生物Pseudomonas putida(シュードモナス・
プチダ)KS−0180株の菌体を用いて、パラクレゾ
ールをパラヒドロキシ安息香酸に変換するパラヒドロキ
シ安息香酸の製造方法。例えば、前記菌体を増殖させた
後、パラクレゾールを添加して培養を継続するか、また
は増殖の開始点でパラクレゾールを添加して培養する
か、あるいは増殖後、菌体を回収した後に、該菌体を用
いてパラクレゾールをパラヒドロキシ安息香酸に変換さ
せるパラヒドロキシ安息香酸の製造方法。
パラヒドロキシ安息香酸を省エネルギー的に微生物によ
る変換によってパラクレゾールから安価に製造する。 【構成】微生物Pseudomonas putida(シュードモナス・
プチダ)KS−0180株の菌体を用いて、パラクレゾ
ールをパラヒドロキシ安息香酸に変換するパラヒドロキ
シ安息香酸の製造方法。例えば、前記菌体を増殖させた
後、パラクレゾールを添加して培養を継続するか、また
は増殖の開始点でパラクレゾールを添加して培養する
か、あるいは増殖後、菌体を回収した後に、該菌体を用
いてパラクレゾールをパラヒドロキシ安息香酸に変換さ
せるパラヒドロキシ安息香酸の製造方法。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、パラクレゾールを微生
物を用いて変換しパラヒドロキシ安息香酸を製造する方
法に関する。さらに詳しく述べると、本発明は、新規な
微生物シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)
KS−0180株菌株を培養し、培養液に通常、防腐剤
として使用される化学品パラクレゾールを添加して、培
養液中に変換生成され蓄積したパラヒドロキシ安息香酸
を採取することからなる、パラヒドロキシ安息香酸の製
造方法に関する。
物を用いて変換しパラヒドロキシ安息香酸を製造する方
法に関する。さらに詳しく述べると、本発明は、新規な
微生物シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)
KS−0180株菌株を培養し、培養液に通常、防腐剤
として使用される化学品パラクレゾールを添加して、培
養液中に変換生成され蓄積したパラヒドロキシ安息香酸
を採取することからなる、パラヒドロキシ安息香酸の製
造方法に関する。
【0002】
【従来の技術】従来、パラヒドロキシ安息香酸の製造
は、フェノールを原料とし、そのカリウム塩に二酸化炭
素を高温・高圧下で作用させるコルベ・シュミット法に
よる化学合成法が一般に行われてきた。しかし、反応条
件として高温・高圧を要するためにエネルギー消費量が
大きく、またアルカリ塩を多量に使用するなどの問題が
あった。
は、フェノールを原料とし、そのカリウム塩に二酸化炭
素を高温・高圧下で作用させるコルベ・シュミット法に
よる化学合成法が一般に行われてきた。しかし、反応条
件として高温・高圧を要するためにエネルギー消費量が
大きく、またアルカリ塩を多量に使用するなどの問題が
あった。
【0003】一方、常温・常圧で進行する微生物による
パラヒドロキシ安息香酸の製造法は、エネルギー的に有
利なことが期待される。しかしこれまでの微生物転換法
はアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)( UB
C814)の菌体抽出酵素による安息香酸からの変換
(Reddy,C.C. & Vaidyanathan,C.S.;Biochim.Biophys.A
cta 384, 46-57) や、パラキシレンを唯一の炭素源とす
るシュードモナス・エルギノーザ(Pseudomonas aerugi
nosa) のパラキシレン代謝経路でパラクレゾールやパラ
ヒドロキシ安息香酸を検出している例(大森など、Agr
i.Biol.Chemi.Vol31, 1337(1967)) が知られている程度
で、しかもいずれの反応も安息香酸からの生成や代謝分
解中間体としてパラヒドロキシ安息香酸を検出して、パ
ラキシレンの分解がパラヒドロキシ安息香酸を経て進行
することを明らかにしているに過ぎない。また、パラク
レゾールを原料として与え、これを変換してパラヒドロ
キシ安息香酸を生成させて培地中に著量蓄積させて採取
することは示唆されていない。
パラヒドロキシ安息香酸の製造法は、エネルギー的に有
利なことが期待される。しかしこれまでの微生物転換法
はアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)( UB
C814)の菌体抽出酵素による安息香酸からの変換
(Reddy,C.C. & Vaidyanathan,C.S.;Biochim.Biophys.A
cta 384, 46-57) や、パラキシレンを唯一の炭素源とす
るシュードモナス・エルギノーザ(Pseudomonas aerugi
nosa) のパラキシレン代謝経路でパラクレゾールやパラ
ヒドロキシ安息香酸を検出している例(大森など、Agr
i.Biol.Chemi.Vol31, 1337(1967)) が知られている程度
で、しかもいずれの反応も安息香酸からの生成や代謝分
解中間体としてパラヒドロキシ安息香酸を検出して、パ
ラキシレンの分解がパラヒドロキシ安息香酸を経て進行
することを明らかにしているに過ぎない。また、パラク
レゾールを原料として与え、これを変換してパラヒドロ
キシ安息香酸を生成させて培地中に著量蓄積させて採取
することは示唆されていない。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、常温
・常圧で進行する経済的な微生物転換法を利用して、パ
ラヒドロキシ安息香酸を製造する新規な方法を提供する
ことである。
・常圧で進行する経済的な微生物転換法を利用して、パ
ラヒドロキシ安息香酸を製造する新規な方法を提供する
ことである。
【0005】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、化学的合
成法よりも省エネルギー的な微生物の物質変換能に着目
した。すなわち、微生物に増殖を支える基質を与えて増
殖させ、この培養液にパラクレゾールを共存させて、こ
れを酸化・変換させるコ・オキシデーション(Co-oxida
tion) の方法によってパラヒドロキシ安息香酸を生成さ
せ、これを分解させることなく著量蓄積させる方法を完
成することを目的とした。そこで、本発明者らはコ・オ
キシデーションによりパラクレゾールからパラヒドロキ
シ安息香酸を生成する能力を持つ微生物を各地の土壌か
ら検索した結果、シュードモナス・プチダ種に属する細
菌菌株に、パラクレゾールのみをパラヒドロキシ安息香
酸に変換する菌株を見いだし、本発明を完成した。
成法よりも省エネルギー的な微生物の物質変換能に着目
した。すなわち、微生物に増殖を支える基質を与えて増
殖させ、この培養液にパラクレゾールを共存させて、こ
れを酸化・変換させるコ・オキシデーション(Co-oxida
tion) の方法によってパラヒドロキシ安息香酸を生成さ
せ、これを分解させることなく著量蓄積させる方法を完
成することを目的とした。そこで、本発明者らはコ・オ
キシデーションによりパラクレゾールからパラヒドロキ
シ安息香酸を生成する能力を持つ微生物を各地の土壌か
ら検索した結果、シュードモナス・プチダ種に属する細
菌菌株に、パラクレゾールのみをパラヒドロキシ安息香
酸に変換する菌株を見いだし、本発明を完成した。
【0006】すなわち、本発明は、微生物Pseudomonas
putida(シュードモナス・プチダ)KS−0180株を
用いて、パラクレゾールをパラヒドロキシ安息香酸に変
換するパラヒドロキシ安息香酸の製造方法を提供する。
さらに、前記微生物をパラクレゾールを添加した培地で
培養するパラヒドロキシ安息香酸の製造方法を提供す
る。また、前記微生物を培養して微生物を増殖させた
後、前記パラクレゾールを添加した培地で増殖させた
後、菌体を回収し、得られた菌体を用いてパラクレゾー
ルをパラヒドロキシ安息香酸に変換するパラヒドロキシ
安息香酸の製造方法を提供する。さらに、前記微生物を
培養して微生物を増殖させた後、パラクレゾールを添加
して培養を継続し、パラクレゾールをパラヒドロキシ安
息香酸に変換するパラヒドロキシ安息香酸の製造方法を
提供する。さらに、Pseudomonas putida(シュードモナ
ス・プチダ) KS−0180株を提供する。なお、本発
明の発明者らは、千葉県千葉市の土壌から下記の方法に
より目的とする微生物を分離した。
putida(シュードモナス・プチダ)KS−0180株を
用いて、パラクレゾールをパラヒドロキシ安息香酸に変
換するパラヒドロキシ安息香酸の製造方法を提供する。
さらに、前記微生物をパラクレゾールを添加した培地で
培養するパラヒドロキシ安息香酸の製造方法を提供す
る。また、前記微生物を培養して微生物を増殖させた
後、前記パラクレゾールを添加した培地で増殖させた
後、菌体を回収し、得られた菌体を用いてパラクレゾー
ルをパラヒドロキシ安息香酸に変換するパラヒドロキシ
安息香酸の製造方法を提供する。さらに、前記微生物を
培養して微生物を増殖させた後、パラクレゾールを添加
して培養を継続し、パラクレゾールをパラヒドロキシ安
息香酸に変換するパラヒドロキシ安息香酸の製造方法を
提供する。さらに、Pseudomonas putida(シュードモナ
ス・プチダ) KS−0180株を提供する。なお、本発
明の発明者らは、千葉県千葉市の土壌から下記の方法に
より目的とする微生物を分離した。
【0007】分離の方法は、千葉県千葉市の土壌から得
られた標本土1gに滅菌水10mLを加えて懸濁し、得
られた懸濁液を1白金耳取り、通常の細菌用培地を用い
た寒天平板に接種し、28℃で1日間静置培養し、得ら
れたコロニーの内の1つを1白金耳取り、再び前記と同
じ平板培地に移植した。この継代培養を数回繰り返し
て、本発明の目的とする微生物を得た。
られた標本土1gに滅菌水10mLを加えて懸濁し、得
られた懸濁液を1白金耳取り、通常の細菌用培地を用い
た寒天平板に接種し、28℃で1日間静置培養し、得ら
れたコロニーの内の1つを1白金耳取り、再び前記と同
じ平板培地に移植した。この継代培養を数回繰り返し
て、本発明の目的とする微生物を得た。
【0008】(作用)本発明において利用する上記菌株
の菌学的性質は次の通りである。シュードモナス・プチ
ダ(Pseudomonas putida) KS−0180株の菌学的性
質 (a)形態 1.細胞の形と大きさ:桿菌、約0.7〜1.0×2.
0〜3.0μm 2.運動性の有無と鞭毛の着生状態:有り、極鞭毛(2
本) 3.細胞の多形性および胞子の有無:共になし 4.グラム染色性:陰性 (b)各種培地における成育状態 1.肉汁寒天平板培養: (1)不定形、灰白色 (2)円形、なめらかなコロニー、淡黄褐色(植継時) 2.肉汁寒天斜面培養:成育良好、淡黄褐色、コロニー
の外側に透明帯 3.肉汁液体培養:成育良好 4.肉汁ゼラチン穿刺培養:液化しない 5.リトマス・ミルク:リトマスを還元、アルカリ性化
(微弱)
の菌学的性質は次の通りである。シュードモナス・プチ
ダ(Pseudomonas putida) KS−0180株の菌学的性
質 (a)形態 1.細胞の形と大きさ:桿菌、約0.7〜1.0×2.
0〜3.0μm 2.運動性の有無と鞭毛の着生状態:有り、極鞭毛(2
本) 3.細胞の多形性および胞子の有無:共になし 4.グラム染色性:陰性 (b)各種培地における成育状態 1.肉汁寒天平板培養: (1)不定形、灰白色 (2)円形、なめらかなコロニー、淡黄褐色(植継時) 2.肉汁寒天斜面培養:成育良好、淡黄褐色、コロニー
の外側に透明帯 3.肉汁液体培養:成育良好 4.肉汁ゼラチン穿刺培養:液化しない 5.リトマス・ミルク:リトマスを還元、アルカリ性化
(微弱)
【0009】(c)生理学的性質 1.硝酸塩の還元:陰性 2.亜硝酸塩の還元:陰性 3.MRテスト:陰性 4.VPテスト:陰性 5.インドールの生成:陰性 6.硫化水素の生成:陰性(TSI培地) 7.澱粉の加水分解:陰性 8.脱窒反応:陰性 9.プロトカテキン酸の開裂:陽性 10.アルギニンジヒドロラーゼ:陽性 11.色素:生成せず(Difco 社製 Pseudomonas F Aga
r および Pseudomonas P Agar ) 12.リパーゼ:± 13.ウレアーゼ:陰性 14.カタラーゼ:陽性 15.オキシダーゼ:陽性 16.成育範囲 温度:10〜40℃ PH:5.0〜9.5 17.グルコン酸の酸化:微陽性 18.アセトアミドの加水分解:陰性 19.酸素に対する態度:好気的 20.O−Fテスト:酸化的 21.糖類からの酸の生成(Hugh−Leifson
法): L−アラビノース − D−キシロース + D−グルコース + D−マンノース + D−フラクトース + D−ガラクトース + 麦芽糖 − ショ糖 − 乳糖 − D−マンニット + グリセリン + 澱粉 − トレハロース − イノシット −
r および Pseudomonas P Agar ) 12.リパーゼ:± 13.ウレアーゼ:陰性 14.カタラーゼ:陽性 15.オキシダーゼ:陽性 16.成育範囲 温度:10〜40℃ PH:5.0〜9.5 17.グルコン酸の酸化:微陽性 18.アセトアミドの加水分解:陰性 19.酸素に対する態度:好気的 20.O−Fテスト:酸化的 21.糖類からの酸の生成(Hugh−Leifson
法): L−アラビノース − D−キシロース + D−グルコース + D−マンノース + D−フラクトース + D−ガラクトース + 麦芽糖 − ショ糖 − 乳糖 − D−マンニット + グリセリン + 澱粉 − トレハロース − イノシット −
【0010】 22.ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の蓄積: − 23.炭素化合物の資化性(飯塚・駒形法) L−アラビノース − D−キシロース − D−グルコース + D−マンノース + D−フラクトース + D−ガラクトース − 麦芽糖 − ショ糖 − 乳糖 − D−マンニット + グリセリン + 澱粉 − トレハロース − ソルビトール − イノシット − セロビオース − D−ソルボース − meso−エリスリトール − 酢酸 + 安息香酸 + フェニル酢酸 + プロピオン酸 + 酒石酸 + クエン酸 + マロン酸 + L−リンゴ酸 + ベタイン + フマル酸 + ニコチン酸 − β−アラニン + L−アラニン + L−オルニチン + L−アルギニン + L−フェニルアラニン + グリシン + L−トリプトファン − L−シトルリン + エタノール + 1−プロパノール + 2−プロパノール + 1−ブタノール + サリシン − α−ケトグルタル酸 +
【0011】本発明者らは、パラクレゾールに対して、
微生物学的コ・オキシデーション作用を示す上記細菌菌
株について、その菌学的性質に基づき、バージース・マ
ニュアル・オブ・システマチック・バクテリオロジー
(Bergey's Mannual of Systematic Bacteriology),V
ol.1,140〜220(1984)に記載の基準に
従って公知の菌株との異同を検討した。その結果、シュ
ードモナス・プチダ種に属する新規な菌株と認め、シュ
ードモナス・プチダ(Pseudomonas putida) KS−01
80株と命名した。
微生物学的コ・オキシデーション作用を示す上記細菌菌
株について、その菌学的性質に基づき、バージース・マ
ニュアル・オブ・システマチック・バクテリオロジー
(Bergey's Mannual of Systematic Bacteriology),V
ol.1,140〜220(1984)に記載の基準に
従って公知の菌株との異同を検討した。その結果、シュ
ードモナス・プチダ種に属する新規な菌株と認め、シュ
ードモナス・プチダ(Pseudomonas putida) KS−01
80株と命名した。
【0012】この菌株は、通商産業省工業技術院微生物
工業技術研究所に、平成4年3月17日付けで、Pseudo
monas putida KS−0180という識別のための表示
で寄託・保管されており、その寄託番号は、微工研菌寄
第12880号(FERMP−12880)である。本
発明で使用する細菌菌株は、シュードモナス・プチダK
S−0180株と同定される菌株であって、パラクレゾ
ールをパラヒドロキシ安息香酸に変換する能力のある菌
株であれはよい。したがって、土壌から単離した菌株
で、バージース・マニュアル・オブ・システマチック・
バクテリオロジー(Bergey's Mannual of Systematic B
acteriology),Vol.1,140〜220(198
4)に記載の基準により、シュードモナス・プチダKS
−0180株の菌株であると同定した菌株であってもよ
い。また微工研などの機関から入手したものであっても
よい。
工業技術研究所に、平成4年3月17日付けで、Pseudo
monas putida KS−0180という識別のための表示
で寄託・保管されており、その寄託番号は、微工研菌寄
第12880号(FERMP−12880)である。本
発明で使用する細菌菌株は、シュードモナス・プチダK
S−0180株と同定される菌株であって、パラクレゾ
ールをパラヒドロキシ安息香酸に変換する能力のある菌
株であれはよい。したがって、土壌から単離した菌株
で、バージース・マニュアル・オブ・システマチック・
バクテリオロジー(Bergey's Mannual of Systematic B
acteriology),Vol.1,140〜220(198
4)に記載の基準により、シュードモナス・プチダKS
−0180株の菌株であると同定した菌株であってもよ
い。また微工研などの機関から入手したものであっても
よい。
【0013】本発明者は、この細菌菌株が、上述したよ
うに、コ・オキシデーション作用によりパラクレゾール
を変換して、パラヒドロキシ安息香酸を生成することが
できることを知見し本発明に至った。
うに、コ・オキシデーション作用によりパラクレゾール
を変換して、パラヒドロキシ安息香酸を生成することが
できることを知見し本発明に至った。
【0014】本発明の製造方法は、シュードモナス・プ
チダKS−0180株の菌体のコ・オキシデーション作
用を利用することにより、微生物の培養液中に出発物質
を共存させ、微生物の増殖は、変換させたい出発物質と
は別の増殖に必要な炭素源、窒素源で行い、増殖した微
生物が培養液中に共存させた出発物質を酸化変換させる
こと、あるいは増殖した微生物を分離・回収した後、微
生物菌体を懸濁した反応液を調整して、変換反応に必要
なエネルギー源、例えばグルコース、グリセリンなどを
供給しながら、微生物の酸化能を利用して出発物質を酸
化変換させることである。本発明では、微生物シュード
モナス属を用いて工業的規模でパラクレゾールをパラヒ
ドロキシ安息香酸に酸化することができる。特に、微生
物シュードモナス・プチダKS−0180株を用いて、
パラクレゾールをパラヒドロキシ安息香酸に酸化・変換
することである。
チダKS−0180株の菌体のコ・オキシデーション作
用を利用することにより、微生物の培養液中に出発物質
を共存させ、微生物の増殖は、変換させたい出発物質と
は別の増殖に必要な炭素源、窒素源で行い、増殖した微
生物が培養液中に共存させた出発物質を酸化変換させる
こと、あるいは増殖した微生物を分離・回収した後、微
生物菌体を懸濁した反応液を調整して、変換反応に必要
なエネルギー源、例えばグルコース、グリセリンなどを
供給しながら、微生物の酸化能を利用して出発物質を酸
化変換させることである。本発明では、微生物シュード
モナス属を用いて工業的規模でパラクレゾールをパラヒ
ドロキシ安息香酸に酸化することができる。特に、微生
物シュードモナス・プチダKS−0180株を用いて、
パラクレゾールをパラヒドロキシ安息香酸に酸化・変換
することである。
【0015】本発明の製造方法は、微生物を増殖させる
工程および微生物を利用してパラクレゾールをパラヒド
ロキシ安息香酸に変換する工程を包含する。また、微生
物を増殖させる工程(増殖工程)と微生物を利用してパ
ラクレゾールをパラヒドロキシ安息香酸に変換する工程
(変換工程)は、別々の工程であっても、同時に行われ
る工程であってもよい。
工程および微生物を利用してパラクレゾールをパラヒド
ロキシ安息香酸に変換する工程を包含する。また、微生
物を増殖させる工程(増殖工程)と微生物を利用してパ
ラクレゾールをパラヒドロキシ安息香酸に変換する工程
(変換工程)は、別々の工程であっても、同時に行われ
る工程であってもよい。
【0016】本発明の方法で使用する細菌菌株を増殖す
る(増殖工程)ための培地としては、通常の細菌用培地
を使用してもよいが、この菌株が良好に成育できる培地
で、かつ微生物変換反応を進行させるものであれば、い
かなる組成の培地も使用できる。この時に用いる培地
は、培地成分として、適当な炭素源、窒素源および無機
塩などを含有しうる。また、本発明の変換工程に使用す
る培地は、菌体増殖用と同様の培地を用いてもよく、ま
た異なる培地を用いてもよい。また、菌体を増殖させた
後、菌体の置換作用を維持できる溶液、例えば、生理食
塩水のような溶液を培地の代わりに用いてもよい。培地
成分に、前記菌体を増殖するための培地に含まれる成分
と同じ成分を含み得る。
る(増殖工程)ための培地としては、通常の細菌用培地
を使用してもよいが、この菌株が良好に成育できる培地
で、かつ微生物変換反応を進行させるものであれば、い
かなる組成の培地も使用できる。この時に用いる培地
は、培地成分として、適当な炭素源、窒素源および無機
塩などを含有しうる。また、本発明の変換工程に使用す
る培地は、菌体増殖用と同様の培地を用いてもよく、ま
た異なる培地を用いてもよい。また、菌体を増殖させた
後、菌体の置換作用を維持できる溶液、例えば、生理食
塩水のような溶液を培地の代わりに用いてもよい。培地
成分に、前記菌体を増殖するための培地に含まれる成分
と同じ成分を含み得る。
【0017】炭素源としては、本発明の菌株が利用でき
る任意の炭素源を使用できる。かかる炭素源として利用
できる有機物には、上記の菌学的性質において示したよ
うに、グリセリンなどの有機化合物、グルコース、フラ
クトースなどの炭水化物、オリーブ油、大豆油などの脂
質、エタノールなどのアルコール、コーンスティープリ
カー、廃糖蜜などの農産物抽出・精製残渣あるいはマロ
ン酸、クエン酸などの有機酸が例示できる。菌体増殖用
の培地の場合には、上述したような本発明の菌株が利用
し得る1種または2種以上の炭素化合物を任意に炭素源
として利用できる。また、変換培養の培地の場合には、
増殖用に使用した全ての炭素源が利用できるが、グルコ
ース、グリセリンなど本菌の利用しやすい単糖類や有機
物が好ましい。炭素源の含有量は、炭素源の種類によっ
ても異なるが、培地中2重量%以上であるのが好まし
い。
る任意の炭素源を使用できる。かかる炭素源として利用
できる有機物には、上記の菌学的性質において示したよ
うに、グリセリンなどの有機化合物、グルコース、フラ
クトースなどの炭水化物、オリーブ油、大豆油などの脂
質、エタノールなどのアルコール、コーンスティープリ
カー、廃糖蜜などの農産物抽出・精製残渣あるいはマロ
ン酸、クエン酸などの有機酸が例示できる。菌体増殖用
の培地の場合には、上述したような本発明の菌株が利用
し得る1種または2種以上の炭素化合物を任意に炭素源
として利用できる。また、変換培養の培地の場合には、
増殖用に使用した全ての炭素源が利用できるが、グルコ
ース、グリセリンなど本菌の利用しやすい単糖類や有機
物が好ましい。炭素源の含有量は、炭素源の種類によっ
ても異なるが、培地中2重量%以上であるのが好まし
い。
【0018】窒素源としては、特に限定されないが、硫
酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素化合
物、およびペプトン、酵母エキス、カザミノ酸などの有
機窒素源が利用できる。有機窒素化合物を用いた場合、
これには炭素も含まれているので、別の炭素源を新たに
加えることは増殖用培地の場合には必ずしも必要でな
い。
酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素化合
物、およびペプトン、酵母エキス、カザミノ酸などの有
機窒素源が利用できる。有機窒素化合物を用いた場合、
これには炭素も含まれているので、別の炭素源を新たに
加えることは増殖用培地の場合には必ずしも必要でな
い。
【0019】無機塩類としては、各種の硫酸塩、リン酸
塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カル
シウム塩などが使用できる。さらに、微量の重金属類
(例えば、鉄塩、マンガン塩、銅塩、亜鉛塩、モリブデ
ン塩、コバルト塩など)を培地に含有させてもよい。
塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カル
シウム塩などが使用できる。さらに、微量の重金属類
(例えば、鉄塩、マンガン塩、銅塩、亜鉛塩、モリブデ
ン塩、コバルト塩など)を培地に含有させてもよい。
【0020】培養方法としては、振盪培養法、深部通気
攪拌培養法などの方法により行うことができる。培養温
度は、20〜37℃、PHは中性付近、攪拌は80〜4
00rpm、培養日数は反応の進行に応じて決めること
ができるが、通常は菌体増殖に1〜2日、パラクレゾー
ルをパラヒドロキシ安息香酸に変換するのには、約1〜
2日が適当である。2日を超えると、菌体の増殖工程で
は、副生物を生じることや、変換生物の若干の分解を生
じるので好ましくない。さらに、菌体の増殖とパラクレ
ゾールの変換の工程は合計で2〜3日程度であるのが適
当である。この時に変換の原料となるパラクレゾールは
水に難溶性であるために、ポリオキシエチレンソルビタ
ンなどの各種の界面活性剤を培地に添加することも可能
である。また、必要に応じて、脂肪酸エステル系、シリ
コン系などの消泡剤を添加してもよい。
攪拌培養法などの方法により行うことができる。培養温
度は、20〜37℃、PHは中性付近、攪拌は80〜4
00rpm、培養日数は反応の進行に応じて決めること
ができるが、通常は菌体増殖に1〜2日、パラクレゾー
ルをパラヒドロキシ安息香酸に変換するのには、約1〜
2日が適当である。2日を超えると、菌体の増殖工程で
は、副生物を生じることや、変換生物の若干の分解を生
じるので好ましくない。さらに、菌体の増殖とパラクレ
ゾールの変換の工程は合計で2〜3日程度であるのが適
当である。この時に変換の原料となるパラクレゾールは
水に難溶性であるために、ポリオキシエチレンソルビタ
ンなどの各種の界面活性剤を培地に添加することも可能
である。また、必要に応じて、脂肪酸エステル系、シリ
コン系などの消泡剤を添加してもよい。
【0021】本発明の製造方法に用いるパラクレゾール
は、菌体の増殖培養開始時に添加してもよく、また、菌
体の増殖培養後添加してもよい。さらに、増殖培養時お
よび増殖培養後の両方に添加してもよい。また、パラク
レゾールの添加方法としては、一度にあるいは少量ずつ
添加してもよいし、その添加の時期は菌体増殖の開始時
に加えてもよい。菌体の増殖培養後添加する場合、パラ
クレゾールを添加する時期は、菌体濃度が、660nm
の吸光度で、1.0〜10.0の時に添加するのが好ま
しい。また、経時的に添加する場合、増殖後1日目、2
日目に等量に分割して添加してもよい。さらに、パラク
レゾールが0.1〜0.2重量%となるように連続的に
添加してもよい。添加するパラクレゾールの培養液中の
濃度は、3重量%以下、特に1重量%以下であるのが好
ましく、さらに0.2〜0.5重量%であるのが好まし
い。3重量%超では、微生物が十分に作用しなくなるの
で好ましくない。パラクレゾールを添加する時期を、菌
体の増殖前にするのと増殖後にするのとでは、菌体の増
殖後に添加した方が5〜10%変換率が高い。
は、菌体の増殖培養開始時に添加してもよく、また、菌
体の増殖培養後添加してもよい。さらに、増殖培養時お
よび増殖培養後の両方に添加してもよい。また、パラク
レゾールの添加方法としては、一度にあるいは少量ずつ
添加してもよいし、その添加の時期は菌体増殖の開始時
に加えてもよい。菌体の増殖培養後添加する場合、パラ
クレゾールを添加する時期は、菌体濃度が、660nm
の吸光度で、1.0〜10.0の時に添加するのが好ま
しい。また、経時的に添加する場合、増殖後1日目、2
日目に等量に分割して添加してもよい。さらに、パラク
レゾールが0.1〜0.2重量%となるように連続的に
添加してもよい。添加するパラクレゾールの培養液中の
濃度は、3重量%以下、特に1重量%以下であるのが好
ましく、さらに0.2〜0.5重量%であるのが好まし
い。3重量%超では、微生物が十分に作用しなくなるの
で好ましくない。パラクレゾールを添加する時期を、菌
体の増殖前にするのと増殖後にするのとでは、菌体の増
殖後に添加した方が5〜10%変換率が高い。
【0022】さらに、増殖工程および変換工程を、パラ
クレゾールを添加する時期の組み合わせで考えると、以
下の組み合わせが例示される。 1)パラクレゾールを、増殖工程の開始点で加え、増殖
工程と変換工程を同時に行う。 2)微生物を増殖させた後パラクレゾールを加えて、変
換工程を行う。パラクレゾールの添加は、変換工程の途
中、または開始点と途中の両方で添加する。 3)パラクレゾールの添加を増殖工程と変換工程とに各
々少なくとも1回以上行い、増殖工程の後に菌体を培地
から分離して変換工程の培地に移植する。 上述の変換工程の培地は、増殖工程に用いた培地と同様
の培地であってもよく、また、本発明の菌体が有する変
換作用を妨げない溶液、例えば、生理食塩水のような溶
液であってもよい。また、前記2)の方法では、菌体を
増殖後、パラクレゾールを添加して培養を継続すること
が含まれる。
クレゾールを添加する時期の組み合わせで考えると、以
下の組み合わせが例示される。 1)パラクレゾールを、増殖工程の開始点で加え、増殖
工程と変換工程を同時に行う。 2)微生物を増殖させた後パラクレゾールを加えて、変
換工程を行う。パラクレゾールの添加は、変換工程の途
中、または開始点と途中の両方で添加する。 3)パラクレゾールの添加を増殖工程と変換工程とに各
々少なくとも1回以上行い、増殖工程の後に菌体を培地
から分離して変換工程の培地に移植する。 上述の変換工程の培地は、増殖工程に用いた培地と同様
の培地であってもよく、また、本発明の菌体が有する変
換作用を妨げない溶液、例えば、生理食塩水のような溶
液であってもよい。また、前記2)の方法では、菌体を
増殖後、パラクレゾールを添加して培養を継続すること
が含まれる。
【0023】変換反応終了後、生成したパラヒドロキシ
安息香酸の培養液からの分離・精製は、一般の有機化合
物の分離・精製と同様に、溶媒抽出、カラムクロマトグ
ラフィー、中和、濃縮、結晶化などの当業者に周知の手
段を適宜組合わせることにより行うことができる。たと
えば、培養液から固体を遠心分離によって除いた後、上
清を濃縮し、次いで酸性化してパラヒドロキシ安息香酸
を沈殿させて固液分離する方法、あるいは上記上清を酸
性化した後、酢酸エチル、クロロホルムなどの有機溶媒
による溶媒抽出で生成物を分離する方法がある。また、
パラヒドロキシ安息香酸が生成沈澱している場合は、溶
媒抽出による回収が有効な方法である。得られた粗製物
を各種のカラムクロマトグラフィーあるいは再結晶など
の方法によって精製することができる。
安息香酸の培養液からの分離・精製は、一般の有機化合
物の分離・精製と同様に、溶媒抽出、カラムクロマトグ
ラフィー、中和、濃縮、結晶化などの当業者に周知の手
段を適宜組合わせることにより行うことができる。たと
えば、培養液から固体を遠心分離によって除いた後、上
清を濃縮し、次いで酸性化してパラヒドロキシ安息香酸
を沈殿させて固液分離する方法、あるいは上記上清を酸
性化した後、酢酸エチル、クロロホルムなどの有機溶媒
による溶媒抽出で生成物を分離する方法がある。また、
パラヒドロキシ安息香酸が生成沈澱している場合は、溶
媒抽出による回収が有効な方法である。得られた粗製物
を各種のカラムクロマトグラフィーあるいは再結晶など
の方法によって精製することができる。
【0024】本発明の方法により製造されるパラヒドロ
キシ安息香酸は、防腐剤として使用される他、医薬品、
農薬、染料、液晶などの原料として有用である。
キシ安息香酸は、防腐剤として使用される他、医薬品、
農薬、染料、液晶などの原料として有用である。
【0025】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。
説明する。
【0026】(実施例1)本実施例は、本発明の方法に
よるパラクレゾールからパラヒドロキシ安息香酸への微
生物による変換を例示する。使用した培地は下記組成の
ものであった。 (PH調整後、120℃、1.2Kg/cm2 、20分
間滅菌して使用)
よるパラクレゾールからパラヒドロキシ安息香酸への微
生物による変換を例示する。使用した培地は下記組成の
ものであった。 (PH調整後、120℃、1.2Kg/cm2 、20分
間滅菌して使用)
【0027】上記培地100mLにシュードモナス・プ
チダ(Pseudomonas putida) KS−0180株の菌株1
白金耳を接種し、30℃で1夜振盪培養した。得られた
培養液の10mLを、同様の培地100mLを仕込んだ
300mL容フラスコに接種して1日間振盪培養を行っ
た。培養条件は、温度30℃、PH6.8、180rp
mであった。培養開始1日後および2日後にパラクレゾ
ールを各々0.1gづつ添加して合計3日間の培養を行
った。培養終了後、遠心分離によって菌体を除き、減圧
下で20mLに濃縮し、20mLの酢酸エチルで3回抽
出を行った。酢酸エチル層を合わせて蒸発乾固し、粗結
晶を得た。粗結晶をエタノール:キシレンの1:1混合
溶媒により再結晶させて、0.24g(92.3%)の
精製物を得た。得られた物質は、元素分析およびNMR
測定によって、パラヒドロキシ安息香酸と確認された。 元素分析値(C7,H6,O3) 計算値:C 60.87%、H 4.38% 実測値:C 60.87%、H 4.38%13 C−NMR(δppm、DMSO−d6 中のTMS) カルボニルC:169.1 フェニレンC:115.4、121.3、132.1、
161.8
チダ(Pseudomonas putida) KS−0180株の菌株1
白金耳を接種し、30℃で1夜振盪培養した。得られた
培養液の10mLを、同様の培地100mLを仕込んだ
300mL容フラスコに接種して1日間振盪培養を行っ
た。培養条件は、温度30℃、PH6.8、180rp
mであった。培養開始1日後および2日後にパラクレゾ
ールを各々0.1gづつ添加して合計3日間の培養を行
った。培養終了後、遠心分離によって菌体を除き、減圧
下で20mLに濃縮し、20mLの酢酸エチルで3回抽
出を行った。酢酸エチル層を合わせて蒸発乾固し、粗結
晶を得た。粗結晶をエタノール:キシレンの1:1混合
溶媒により再結晶させて、0.24g(92.3%)の
精製物を得た。得られた物質は、元素分析およびNMR
測定によって、パラヒドロキシ安息香酸と確認された。 元素分析値(C7,H6,O3) 計算値:C 60.87%、H 4.38% 実測値:C 60.87%、H 4.38%13 C−NMR(δppm、DMSO−d6 中のTMS) カルボニルC:169.1 フェニレンC:115.4、121.3、132.1、
161.8
【0028】(実施例2)実施例1で使用したものと同
様の組成の培地に対して0.2重量%のパラクレゾール
を添加した培地100mLに、実施例1と同様にシュー
ドモナス・ プチダ(Pseudomonas putida) KS−01
80株を1白金耳接種して培養した前培養液10mL
を、同様にパラクレゾール0.2重量%を添加した培地
100mLを仕込んだ300mL容フラスコに接種して
2日間、実施例1と同様の培養条件で培養を行った。2
日後の培養液中のパラヒドロキシ安息香酸の生成量は
0.24g(92.3%)であった。培養液からのパラ
ヒドロキシ安息香酸の分離・精製は遠心分離によって菌
体を除き、上清に硫酸を加えPHを1とした後、この酸
性溶液よりクロロホルムでパラヒドロキシ安息香酸を抽
出分離し、抽出液を減圧濃縮することによって粗結晶を
得た。この粗結晶を実施例1と同様にエタノール:キシ
レンの1:1混合溶媒により再結晶することによって白
色針状結晶0.22g(84.6%)を得た。
様の組成の培地に対して0.2重量%のパラクレゾール
を添加した培地100mLに、実施例1と同様にシュー
ドモナス・ プチダ(Pseudomonas putida) KS−01
80株を1白金耳接種して培養した前培養液10mL
を、同様にパラクレゾール0.2重量%を添加した培地
100mLを仕込んだ300mL容フラスコに接種して
2日間、実施例1と同様の培養条件で培養を行った。2
日後の培養液中のパラヒドロキシ安息香酸の生成量は
0.24g(92.3%)であった。培養液からのパラ
ヒドロキシ安息香酸の分離・精製は遠心分離によって菌
体を除き、上清に硫酸を加えPHを1とした後、この酸
性溶液よりクロロホルムでパラヒドロキシ安息香酸を抽
出分離し、抽出液を減圧濃縮することによって粗結晶を
得た。この粗結晶を実施例1と同様にエタノール:キシ
レンの1:1混合溶媒により再結晶することによって白
色針状結晶0.22g(84.6%)を得た。
【0029】(実施例3)実施例1で使用したものと同
様の組成の培地100mLを仕込んだ300mL容三角
フラスコ6本を使用し、シュードモナス・プチダKS−
0180株を各々のフラスコに1白金耳接種し、30
℃、180rpmで振盪培養した。得られた培養液60
0mLを母菌として、前記と同様の培地7Lを仕込んだ
10L容のジャー・ファーメンターに添加し、同時に基
質としてパラクレゾール15gを添加して培養を行っ
た。1日後にさらに、パラクレゾール12gを添加して
培養を継続し、合計2日間の培養を行った。培養条件
は、温度30℃、PH7.0、攪拌300rpm、通気
量0.5容量/容量/分であった。培養終了後、10,
000×Gで15分間の遠心分離によって菌体を除き、
硫酸によりPH1とした後、実施例2と同様に処理して
パラヒドロキシ安息香酸34.0g(98.6%)を得
た。
様の組成の培地100mLを仕込んだ300mL容三角
フラスコ6本を使用し、シュードモナス・プチダKS−
0180株を各々のフラスコに1白金耳接種し、30
℃、180rpmで振盪培養した。得られた培養液60
0mLを母菌として、前記と同様の培地7Lを仕込んだ
10L容のジャー・ファーメンターに添加し、同時に基
質としてパラクレゾール15gを添加して培養を行っ
た。1日後にさらに、パラクレゾール12gを添加して
培養を継続し、合計2日間の培養を行った。培養条件
は、温度30℃、PH7.0、攪拌300rpm、通気
量0.5容量/容量/分であった。培養終了後、10,
000×Gで15分間の遠心分離によって菌体を除き、
硫酸によりPH1とした後、実施例2と同様に処理して
パラヒドロキシ安息香酸34.0g(98.6%)を得
た。
【0030】(実施例4)実施例1で使用したものと同
様の組成の培地に対して0.2重量%のパラクレゾール
を添加した培地3.5Lで、5L容ジャー・ファーメン
ターを用いて実施例3と同様の培養条件で2日間培養を
行った。2日後に菌体を10,000×Gで、20分の
遠心分離によって集菌した。菌体収量は、105℃、2
時間乾燥で4.5g/Lであった。集菌した生菌体全量
をグリセリン0.1%を含有する0.2%の生理食塩水
500mLに懸濁し、これにパラクレゾール1.5gを
添加して30℃で弱く攪拌しながら1時間反応させた。
反応終了後、実施例3と同様の方法によりパラヒドロキ
シ安息香酸を抽出し、精製して再結晶によりパラヒドロ
キシ安息香酸1.85gを得た。収率は96.4%であ
った。
様の組成の培地に対して0.2重量%のパラクレゾール
を添加した培地3.5Lで、5L容ジャー・ファーメン
ターを用いて実施例3と同様の培養条件で2日間培養を
行った。2日後に菌体を10,000×Gで、20分の
遠心分離によって集菌した。菌体収量は、105℃、2
時間乾燥で4.5g/Lであった。集菌した生菌体全量
をグリセリン0.1%を含有する0.2%の生理食塩水
500mLに懸濁し、これにパラクレゾール1.5gを
添加して30℃で弱く攪拌しながら1時間反応させた。
反応終了後、実施例3と同様の方法によりパラヒドロキ
シ安息香酸を抽出し、精製して再結晶によりパラヒドロ
キシ安息香酸1.85gを得た。収率は96.4%であ
った。
【0031】
【発明の効果】本発明の方法により、従来は高温・高圧
の反応で化学合成されていた防腐剤、医薬品、農薬、染
料、液晶などの原料として有用なパラヒドロキシ安息香
酸をエネルギーをほとんど要せずに微生物による酸化に
よってパラクレゾールから安価に製造することができ
た。
の反応で化学合成されていた防腐剤、医薬品、農薬、染
料、液晶などの原料として有用なパラヒドロキシ安息香
酸をエネルギーをほとんど要せずに微生物による酸化に
よってパラクレゾールから安価に製造することができ
た。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:40)
Claims (5)
- 【請求項1】微生物Pseudomonas putida(シュードモナ
ス・プチダ) KS−0180株を用いて、パラクレゾー
ルをパラヒドロキシ安息香酸に変換することを特徴とす
るパラヒドロキシ安息香酸の製造方法。 - 【請求項2】前記微生物をパラクレゾールを添加した培
地で培養する請求項1に記載のパラヒドロキシ安息香酸
の製造方法。 - 【請求項3】前記微生物を培養して増殖させた後、パラ
クレゾールを添加して培養を継続し、パラクレゾールを
パラヒドロキシ安息香酸に変換する請求項1に記載のパ
ラヒドロキシ安息香酸の製造方法。 - 【請求項4】前記微生物を培養して増殖させた後、菌体
を回収して、該菌体を用いてパラクレゾールをパラヒド
ロキシ安息香酸に変換する請求項1に記載のパラヒドロ
キシ安息香酸の製造方法。 - 【請求項5】Pseudomonas putida(シュードモナス・プ
チダ) KS−0180株であることを特徴とする微生
物。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP14573092A JPH05336980A (ja) | 1992-06-05 | 1992-06-05 | パラヒドロキシ安息香酸の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP14573092A JPH05336980A (ja) | 1992-06-05 | 1992-06-05 | パラヒドロキシ安息香酸の製造方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH05336980A true JPH05336980A (ja) | 1993-12-21 |
Family
ID=15391818
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP14573092A Withdrawn JPH05336980A (ja) | 1992-06-05 | 1992-06-05 | パラヒドロキシ安息香酸の製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH05336980A (ja) |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6410265B1 (en) * | 1997-10-31 | 2002-06-25 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Gene encoding a putive efflux protein for solvents/antibiotics in Pseudomonas mendocina |
US6586229B1 (en) | 2000-06-01 | 2003-07-01 | North Carolina State University | Method for the production of ρ-Hydroxybenzoate in species of pseudomonas and agrobacterium |
US6683231B2 (en) | 2000-06-02 | 2004-01-27 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | High level production of p-hydroxybenzoic acid in green plants |
US6830899B1 (en) | 1997-06-13 | 2004-12-14 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method for the production of para-hydroxybenzoate in Pseudomonas mendocina |
US7217810B2 (en) | 2003-06-16 | 2007-05-15 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | High level production of arbutin in green plants and microbes |
US7348421B1 (en) | 2000-09-30 | 2008-03-25 | North Carolina State University | Methods for production of p-hydroxybenzoate in bacteria |
-
1992
- 1992-06-05 JP JP14573092A patent/JPH05336980A/ja not_active Withdrawn
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6830899B1 (en) | 1997-06-13 | 2004-12-14 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method for the production of para-hydroxybenzoate in Pseudomonas mendocina |
US6410265B1 (en) * | 1997-10-31 | 2002-06-25 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Gene encoding a putive efflux protein for solvents/antibiotics in Pseudomonas mendocina |
US6586229B1 (en) | 2000-06-01 | 2003-07-01 | North Carolina State University | Method for the production of ρ-Hydroxybenzoate in species of pseudomonas and agrobacterium |
US7083953B2 (en) | 2000-06-01 | 2006-08-01 | North Carolina State University | Method for the production of p-Hydrozybenzoate in species of Pseudomonas and Agrobacterium |
US6683231B2 (en) | 2000-06-02 | 2004-01-27 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | High level production of p-hydroxybenzoic acid in green plants |
US7361811B2 (en) | 2000-06-02 | 2008-04-22 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | High level production of p-hydroxybenzoic acid in green plants |
US7348421B1 (en) | 2000-09-30 | 2008-03-25 | North Carolina State University | Methods for production of p-hydroxybenzoate in bacteria |
US7217810B2 (en) | 2003-06-16 | 2007-05-15 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | High level production of arbutin in green plants and microbes |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 19990831 |