JPH05336963A - New alpha2-3 sialyltransferase - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To provide a new enzyme useful for producing valuable physiological activity-bearing sugar chains and modified products thereof, improving sugar chains bound to valuable physiologically active proteins, curing inflammation and metastases etc., and diagnosing diseases. CONSTITUTION:The alpha 3 sialyltransferase, which can be obtained by culture in a medium of the host cells (pref. 'namaluba' cells as a kind of human cells) transformed by a recombinant vector incorporated with cDNA coding this enzyme to produce and accumulate the aimed enzyme in the resulting cultured product. The above recombinant vector, which is also a new substance, can be obtained by the following process: a cDNA synthesized using, as template, mRNA extracted from animal cells is incorporated into a manifestation cloning vector and the resulting cDNA library is introduced into cells, and the resultant cells are cultured in the presence of lectin, and the cDNA coding the above enzyme is taken from the cells proliferated, and this cDNA is then introduced into the downstream portion of a promoter in the vector.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、新規α２→３シアリル
トランスフェラーゼ、該α２→３シアリルトランスフェ
ラーゼをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡが組み込まれた組
換え体ベクターおよび該組換え体ベクターを含有する細
胞ならびにそれらの製造法に関する。さらに、該α２→
３シアリルトランスフェラーゼを用いる糖鎖の製造法お
よび該α２→３シアリルトランスフェラーゼを形質転換
細胞内に生産させることによる糖鎖の製造法に関する。
さらには、本発明のα２→３シアリルトランスフェラー
ゼをコードするＤＮＡを用いる該α２→３シアリルトラ
ンスフェラーゼの検出法およびその生産の抑制法に関す
る。本発明のα２→３シアリルトランスフェラーゼは、
有用生理活性を有する糖鎖とその修飾物の製造および有
用生理活性タンパク質に結合している糖鎖の改良に有用
である。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel α2 → 3 sialyltransferase, a DNA encoding the α2 → 3 sialyltransferase, a recombinant vector having the DNA incorporated therein, and a cell containing the recombinant vector, and Regarding their manufacturing method. Furthermore, the α2 →
The present invention relates to a method for producing a sugar chain using 3 sialyltransferase and a method for producing a sugar chain by producing the α2 → 3 sialyltransferase in a transformed cell.
Furthermore, the present invention relates to a method for detecting the α2 → 3 sialyltransferase using a DNA encoding the α2 → 3 sialyltransferase and a method for suppressing the production thereof. The α2 → 3 sialyltransferase of the present invention is
It is useful for producing a sugar chain having a useful bioactivity and a modified product thereof, and improving a sugar chain bound to a useful bioactive protein.

【０００２】[0002]

【従来の技術】大腸菌などの原核生物によって生産され
るタンパク質が糖鎖を有していないのに対し、酵母、カ
ビ、植物細胞、動物細胞等の真核生物によって生産され
るタンパク質および脂質には糖鎖が結合している場合が
多い。動物細胞の糖鎖としては、タンパク質に付加する
ものとして、タンパク質中のアスパラギン（Ａｓｎ）残
基に結合するＮ−グリコシド結合型糖鎖（Ｎ−グリカン
とも呼ばれる）、およびセリン（Ｓｅｒ）またはスレオ
ニン（Ｔｈｒ）残基に結合するＯ−グリコシド結合型糖
鎖（Ｏ−グリカンとも呼ばれる）が知られている。最
近、数多くのタンパク質には糖鎖を含むある種の脂質が
共有結合しており、この脂質を介してそれらのタンパク
質は細胞膜に付着していることが明らかとなった。糖鎖
を含むこの脂質はグリコシル・ホスファチジルイノシト
ール・アンカー（glycosyl phosphatidylinositol anch
or）と呼ばれる。2. Description of the Related Art Proteins produced by prokaryotes such as Escherichia coli do not have sugar chains, whereas proteins and lipids produced by eukaryotes such as yeast, mold, plant cells and animal cells In many cases, sugar chains are attached. As sugar chains of animal cells, N-glycoside-linked sugar chains (also called N-glycans) that bind to asparagine (Asn) residues in proteins and serine (Ser) or threonine (as added to proteins). An O-glycoside-linked sugar chain (also called O-glycan) that binds to a Thr residue is known. Recently, it has been clarified that a certain kind of lipid containing a sugar chain is covalently bound to many proteins, and these proteins are attached to the cell membrane via this lipid. This lipid containing sugar chains is a glycosyl phosphatidylinositol anch
or)).

【０００３】他に、動物細胞の糖鎖としては、グリコサ
ミノグリカン(Glycosaminoglycan)があげられる。タン
パク質とグリコサミノグリカンが共有結合している化合
物はプロテオグリカン(proteoglycan)と呼ばれる。プロ
テオグリカンの糖鎖を構成するグリコサミノグリカン
は、糖タンパク質糖鎖であるＯ−グリカンと構造が類似
しているが化学的には異なっている。グリコサミノグリ
カンは、グルコサミン(glucosamine) またはガラクトサ
ミン(galactosamine) とウロン酸〔但し、ケラタン硫酸
(keratan sulfate) はウロン酸を有していない〕を含む
２糖単位の繰り返し構造から成り、硫酸基が共有結合し
ている〔但し、ヒアルロン酸(hyaluronicacid) は硫酸
基を有していない〕という特徴を有している。In addition, as a sugar chain of animal cells, glycosaminoglycan can be mentioned. A compound in which a protein and a glycosaminoglycan are covalently bound is called a proteoglycan. The glycosaminoglycan constituting the sugar chain of proteoglycan has a structure similar to that of O-glycan, which is a sugar chain of a glycoprotein, but is chemically different. Glycosaminoglycans include glucosamine or galactosamine and uronic acid (however, keratan sulfate
(keratan sulfate does not have uronic acid), which is composed of repeating structures of disaccharide units and has a sulfate group covalently bonded (however, hyaluronic acid does not have a sulfate group). It has features.

【０００４】さらに、動物細胞の糖鎖として、糖脂質(g
lycolipid)と呼ばれる物質に含まれる糖鎖が挙げられ
る。動物細胞の糖脂質としては、糖と長鎖脂肪酸と長鎖
塩基であるスフィンゴシン(sphingosine) が共有結合し
たスフィンゴ糖脂質(sphingoglycolipid) と、糖鎖がグ
リセロールに共有結合したグリセロ糖脂質(glyceroglyc
olipid) とが知られている。Furthermore, glycolipids (g
An example is a sugar chain contained in a substance called lycolipid). Glycolipids in animal cells include sphingoglycolipids in which sugars, long-chain fatty acids, and long-chain bases, sphingosine, are covalently linked, and glyceroglycolipids in which sugar chains are covalently linked to glycerol.
olipid) is known.

【０００５】最近、糖鎖の機能については分子生物学や
細胞生物学の進歩とともに急速に解明が進んでおり、現
在までに糖鎖の多様な機能が明らかにされてきている。
糖鎖は血中における糖タンパク質のクリアランスに重要
な役割を果たしている。大腸菌に遺伝子を移入して作ら
れたエリスロポイエチン(erythropoietin)は、生体外(i
n vitro)では活性を示すが、生体内(in vivo) では急速
にクリアランス(clearance) されることが知られている
〔ドーダル(Dordal)ら：エンドクリノロジー(Endocrino
logy), 116, 2293 (1985) およびブローネ(Browne)ら：
コールド・スプリング・ハーバー・シンポジア・オン・
クアンティテェイティブ・バイオロジー(Cold Spr.Har
b.Symp.Quant.Biol.), 51, 693 (1986)〕。またヒト顆
粒球・マクロファージコロニー刺激因子（human granul
ocyte-macrophage colony stimulating factor；ｈＧＭ
−ＣＳＦ）は、天然ではＮ−グリコシド結合型糖鎖を２
本持っているが、糖鎖の本数を減らすとそれに比例して
ラット血漿のクリアランス速度が速まることが知られて
いる〔ドナヒュー(Donahue) ら：コールド・スプリング
・ハーバー・シンポジア・オン・クアンティテェイティ
ブ・バイオロジー(Cold Spr.Harb.Symp.Quant.Biol.),
51, 685 (1986)〕。クリアランスの速度およびクリアラ
ンスされる部位は糖鎖の構造によっても変化し、シアル
酸がついたｈＧＭ−ＣＳＦは腎臓でクリアランスされる
のに対し、シアル酸を除去したｈＧＭ−ＣＳＦはクリア
ランス速度が速まり、肝臓でクリアランスされることが
知られている。また、ラット肝初代培養の系で各種のＮ
−グリコシド結合型糖鎖生合成阻害剤存在下に生合成さ
れた糖鎖構造の異なるα1-acid glycoprotein につい
て、ラットの血漿中でのクリアランス速度及びラット灌
流液からのクリアランス速度を調べたところ、どちらの
場合も、高マンノース型、糖鎖欠損、ハイブリッド型、
複合型（天然型）の順でクリアランス速度が遅くなっ
た。また、血栓溶解剤としてすでに医薬品として用いら
れている組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−Ｐ
Ａ；tissue-type plasminogen activator ）の血中での
クリアランスもその糖鎖の構造が大きく影響を与えるこ
とが知られている。Recently, the functions of sugar chains have been rapidly elucidated with the progress of molecular biology and cell biology, and various functions of sugar chains have been clarified to date.
Sugar chains play an important role in clearance of glycoproteins in blood. Erythropoietin made by transferring genes into E. coli is
It is known to be active in vitro, but rapidly cleared in vivo (Dordal et al .: Endocrino
logy), 116 , 2293 (1985) and Browne et al .:
Cold Spring Harbor Symposia On
Quantitative Biology (Cold Spr. Har
b.Symp.Quant.Biol.), 51 , 693 (1986)]. In addition, human granulocyte / macrophage colony stimulating factor (human granul
ocyte-macrophage colony stimulating factor; hGM
-CSF) is a natural N-glycoside-linked sugar chain containing 2
It is known that the clearance rate of rat plasma increases in proportion to the decrease in the number of glycans [Donahue et al .: Cold Spring Harbor Symposia on Quantitey. Tiv Biology (Cold Spr.Harb.Symp.Quant.Biol.),
51 , 685 (1986)]. The rate of clearance and the site to be cleared also vary depending on the structure of the sugar chain. HGM-CSF with sialic acid is cleared in the kidney, whereas hGM-CSF without sialic acid has a faster clearance rate. , Known to be cleared in the liver. In addition, in the rat liver primary culture system, various N
-When the clearance rate in rat plasma and clearance rate from rat perfusate were investigated for α1-acid glycoproteins with different sugar chain structures biosynthesized in the presence of glycoside-linked sugar chain biosynthesis inhibitors, In the case of, high mannose type, sugar chain deficiency, hybrid type,
The clearance rate became slower in the order of composite type (natural type). In addition, a tissue-type plasminogen activator (t-P) that has already been used as a drug as a thrombolytic agent.
It is known that the structure of the sugar chain greatly affects the clearance of A; tissue-type plasminogen activator) in blood.

【０００６】糖鎖がタンパク質にプロテアーゼ抵抗性を
付与することが知られており、例えば、フィブロネクチ
ン（fibronectin)の糖鎖形成をツニカマイシンで阻害す
ると、得られた糖鎖欠損フィブロネクチンの細胞内タン
パク質の分解の速度が増進する。糖鎖の付加により、熱
安定性や抗凍結性が増大することも知られている。ま
た、エリスロポイエチンやβ−インターフェロンなどに
おいては、タンパク質の溶解性の増大に糖鎖が寄与して
いることが知られている。[0006] It is known that sugar chains impart protease resistance to proteins. For example, when the sugar chain formation of fibronectin is inhibited by tunicamycin, the intracellular protein degradation of the obtained sugar chain-deficient fibronectin is caused. Will increase the speed of. It is also known that the addition of sugar chains increases the thermal stability and the antifreezing property. In addition, in erythropoietin and β-interferon, it is known that sugar chains contribute to the increase in protein solubility.

【０００７】糖鎖は、タンパク質が正しい立体構造を保
持するのにも役立っている。水泡性口内炎ウイルスの膜
結合糖タンパク質の天然に存在する２本のＮ−グリコシ
ド結合型糖鎖を除去すると、タンパク質の細胞表面への
輸送が阻害されるが、そのタンパク質に新たな糖鎖が付
加されるとそれが回復することが知られている。この場
合、糖鎖の除去により、ジスルフィド結合によるタンパ
ク質分子間の会合が誘起され、その結果タンパク質の輸
送が阻害されることが明らかとなった。また新たに糖鎖
を付加すると、この会合が阻害されることによりタンパ
ク質の正しい立体構造が保持されるため、タンパク質の
輸送が可能になる。また、その際新たな糖鎖が付加され
る位置については、かなりの融通性があることが示され
ている。またその反面、導入される位置によっては天然
の糖鎖を有するタンパク質の輸送をも完全に阻害する場
合があることも明らかとなった。[0007] Sugar chains also help proteins maintain the correct three-dimensional structure. Removal of two naturally-occurring N-glycoside-linked sugar chains of the vesicular stomatitis virus membrane-bound glycoprotein inhibits transport of the protein to the cell surface, but adds a new sugar chain to the protein. It is known to recover when done. In this case, it was revealed that removal of the sugar chain induces association between protein molecules by disulfide bond, resulting in inhibition of protein transport. In addition, when a sugar chain is newly added, this association is inhibited, so that the correct three-dimensional structure of the protein is maintained, so that the protein can be transported. Further, it has been shown that there is considerable flexibility in the position where a new sugar chain is added at that time. On the other hand, it has also been clarified that the transport of a protein having a natural sugar chain may be completely inhibited depending on the position of introduction.

【０００８】糖鎖がポリペプチド上の抗原部位をマスク
している例も知られている。ｈＧＭ−ＣＳＦ、プロラク
チン(prolactin) 、インターフェロン−γ、ラウシャー
（Rauscher）白血病ウィルスgp70およびインフルエンザ
ヘマグルチニン(influenza hemagglutinin) において、
ポリクローナル抗体またはペプチド上の特定の領域に対
する単クローン抗体を用いた実験から、これらタンパク
の糖鎖が、抗体との反応を阻害していると考えられてい
る。また、糖鎖自身が糖タンパク質の活性発現に直接か
かわっている場合があることも知られており、例えば、
黄体形成ホルモン、濾胞刺激ホルモン、絨毛性性腺刺激
ホルモン等のような糖タンパク質ホルモンの活性発現に
糖鎖が関与していると考えられている。An example in which a sugar chain masks an antigenic site on a polypeptide is also known. In hGM-CSF, prolactin, interferon-γ, Rauscher leukemia virus gp70 and influenza hemagglutinin,
From the experiments using a polyclonal antibody or a monoclonal antibody against a specific region on a peptide, it is considered that the sugar chains of these proteins inhibit the reaction with the antibody. It is also known that the sugar chain itself may be directly involved in the expression of glycoprotein activity.
It is considered that sugar chains are involved in the active expression of glycoprotein hormones such as luteinizing hormone, follicle-stimulating hormone, chorionic gonadotropin, and the like.

【０００９】特開平2-227075に顆粒球コロニー刺激因子
（Ｇ−ＣＳＦ；granulocyte colony-stimulating facto
r ）やプロウロキナーゼ（pro-UK; pro-urokinase ）等
の有用生理活性タンパク質に、組換えＤＮＡ技術を用い
て人為的にかつ意図的に糖鎖を導入することにより、こ
れらのタンパク質の性質を改善することができることが
開示されている。[0009] Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-227075 discloses a granulocyte colony-stimulating facto.
r) and pro-urokinase (pro-UK; pro-urokinase), etc. It is disclosed that it can be improved.

【００１０】糖鎖の重要な機能として、糖鎖が細胞間、
タンパク質間または細胞とタンパク質間の認識現象に関
与していることが挙げられる。例えば、糖鎖の構造の違
いにより生体内でクリアランスされる場所が異なること
が知られている。また、最近、炎症反応に対し特異的に
血管内皮細胞上に発現し、好中球との接着を促すタンパ
ク質であるELAM-1のリガンドがSialyl-Le ^X と呼ばれる
糖鎖〔NeuAc α２→3Galβ１→４(Fuc α１→３)GlcNAc
:NeuAc , シアル酸；Gal , ガラクトース；Fuc , フコ
ース；GlcNAc, Ｎ−アセチルグルコサミン〕であること
が判明し、糖鎖自体あるいは糖鎖の修飾物が医薬品など
に利用できる可能性がでてきた〔フィリプス (Phillip
s) ら：サイエンス(Science),250, 1130 (1990)、ゲル
ツ(Goelz)ら：トレンズ・イン・グライコサイエンス・
アンド・グライコテクノロジー(Trends in Glycoscienc
e and Glycotechnology) 4, 14 (1992)〕。さらに、一
部のＴリンパ球や好中球に発現しているL-セレクチン
（L-selectin）や炎症刺激によって血小板や血管内皮細
胞の膜表面に発現するGMP-140 （P-セレクチンとも呼
ぶ）はELAM-1と同じく炎症反応に関係しており、それら
のリガンドもELAM-1のリガンドであるSialyl-Le ^X 糖鎖
に類似した糖鎖であることが示唆されている〔ロ−ゼン
(Rosen) ら：トレンズ・イン・グライコサイエンス・ア
ンド・グライコテクノロジー(Trends in Glycoscience
and Glycotechnology),4, 1 (1992)、ラ−セン(Larsen)
ら：トレンズ・イン・グライコサイエンス・アンド・グ
ライコテクノロジー(Trends in Glycoscience and Glyc
otechnology),4, 25 (1992) 、アルフォ(Aruffo)ら：ト
レンズ・イン・グライコサイエンス・アンド・グライコ
テクノロジー(Trends in Glycoscience and Glycotechn
ology),4, 146 (1992)〕。As an important function of sugar chains, sugar chains are
It is involved in the recognition phenomenon between proteins or between cells and proteins. For example, it is known that the location of clearance in a living body differs depending on the difference in the sugar chain structure. Recently, a ligand for ELAM-1, which is a protein that is specifically expressed on vascular endothelial cells in response to inflammatory reactions and promotes adhesion to neutrophils, is a sugar chain called Sialyl-Le ^X [NeuAc α2 → 3Galβ1 → 4 (Fuc α1 → 3) GlcNAc
: NeuAc, sialic acid; Gal, galactose; Fuc, fucose; GlcNAc, N-acetylglucosamine], and the possibility that the sugar chain itself or a modified sugar chain can be used as a drug etc. Phillips
s) et al .: Science, 250, 1130 (1990), Goelz et al .: Torrens in Glycoscience.
And Glycos Technology (Trends in Glycoscienc
e and Glycotechnology) 4, 14 (1992)]. Furthermore, L-selectin expressed on some T lymphocytes and neutrophils, and GMP-140 (also called P-selectin) expressed on the membrane surface of platelets and vascular endothelial cells by inflammatory stimulation. Are involved in inflammatory responses like ELAM-1, and their ligands have been suggested to be sugar chains similar to the ELAM-1 ligand Sialyl-Le ^X sugar chains [Rosen]
(Rosen) et al .: Trends in Glycoscience
and Glycotechnology) , 4 , 1 (1992), Larsen
Et al: Trends in Glycoscience and Glyc
otechnology) , 4 , 25 (1992), Aruffo et al .: Trends in Glycoscience and Glycotechn
ology), 4, 146 (1992)].

【００１１】炎症反応と同様に、癌の転移においても、
ELAM-1やGMP-140 は癌細胞の血管内壁への接着や癌細胞
と血小板との凝集を引き起こすことにより癌転移を促進
していることが示唆されている〔ゲルツ(Goelz) ら：ト
レンズ・イン・グライコサイエンス・アンド・グライコ
テクノロジー(Trends in Glycoscience and Glycotechn
ology),4, 14 (1992) 、ラ−セン(Larsen)ら：トレンズ
・イン・グライコサイエンス・アンド・グライコテクノ
ロジー(Trends in Glycoscience and Glycotechnolog
y),4, 25 (1992) 〕。このことは転移能の高い癌細胞で
はSialyl-Le ^X 糖鎖の発現量が高いという知見とも符合
する〔入村(Irimura) ら：実験医学(Experimental Medc
ine),6, 33 (1988) 〕。Similar to the inflammatory reaction, in the metastasis of cancer,
It has been suggested that ELAM-1 and GMP-140 promote cancer metastasis by causing adhesion of cancer cells to the inner wall of blood vessels and aggregation of cancer cells with platelets [Goelz et al .: Trens. Trends in Glycoscience and Glycotechn
, 4 , 14 (1992), Larsen et al .: Trends in Glycoscience and Glycotechnolog
y) , 4 , 25 (1992)]. This is consistent with the finding that the expression level of Sialyl-Le ^X sugar chains is high in cancer cells with high metastatic potential [Irimura et al .: Experimental Medicine (Experimental Medc
ine) , 6 , 33 (1988)].

【００１２】これらの知見から、Sialyl-Le ^X 糖鎖ある
いはその誘導体は、ELAM-1、L-セレクチンまたはGMP-14
0 に結合することにより優れた抗炎症効果を発揮するこ
と、および癌転移が抑制されることが期待される。上述
の炎症反応と癌転移の機構を考慮すると、ELAM-1、L-セ
レクチン、GMP-140 が認識するリガンド糖鎖の合成を司
る糖転移酵素の発現を抑制することによっても炎症反応
を抑制したり、癌転移を防止できることが期待される。
ある特定の遺伝子の発現を抑制するには、アンチセンス
ＲＮＡ／アンチセンスＤＮＡ技術〔徳久(Tokuhisa)：バ
イオサイエンスとインダストリー,50, 322 (1992) 、村
上(Murakami)：化学 46, 681 (1991) 〕またはトリプル
・ヘリックス (Triple helix) 技術〔チュブ(Chubb) と
ホーガン(Hogan) ：トレンズ・イン・バイオテクノジー
(Trends in Biotechnology),10, 132 (1992)〕が有用で
ある。このアンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術を用いて所
望の糖転移酵素の生産を抑制するには、その遺伝子ある
いは遺伝子の塩基配列情報が必要であるため、所望の糖
転移酵素の遺伝子をクローン化すること、およびその塩
基配列情報を解析することは重要である。From these findings, the Sialyl-Le ^X sugar chain or its derivative was found to be ELAM-1, L-selectin or GMP-14.
By binding to 0, it is expected to exert an excellent anti-inflammatory effect and suppress cancer metastasis. Considering the above-mentioned mechanism of inflammatory reaction and cancer metastasis, the inflammatory reaction is also suppressed by suppressing the expression of glycosyltransferase that synthesizes the ligand sugar chain recognized by ELAM-1, L-selectin and GMP-140. It is expected that it can prevent cancer metastasis.
To suppress the expression of a specific gene, antisense RNA / antisense DNA technology [Tokuhisa: Bioscience and Industry , 50, 322 (1992), Murakami: Chemistry 46, 681 (1991) ] Or Triple helix technology [Chubb and Hogan: Trens in Biotechnology
(Trends in Biotechnology), 10 , 132 (1992)] is useful. In order to suppress the production of a desired glycosyltransferase using this antisense RNA / DNA technique, information on the gene or the nucleotide sequence of the gene is necessary. Therefore, cloning the gene for the desired glycosyltransferase, And it is important to analyze the nucleotide sequence information.

【００１３】さらに、炎症性白血球や癌細胞での特定の
糖転移酵素の発現を調べることにより、炎症性疾患や癌
の悪性度を診断することもできる。所望の糖転移酵素遺
伝子の発現を調べるには、該遺伝子を放射能などで標識
したものをプローブとするノーザンハイブリダイゼーシ
ョン法〔サンブルック(Sambrook)、フリッチ(Fritsch)
、マニアチス(Maniatis)（モレキュラー・クローニン
グ：ア・ラボラトリー・マニュアル(Molecular Clonin
g, A laboratory manual)、第２版、コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring H
arbor Laboratory Press) 、１９８９年刊〕やポリメラ
ーゼ・チェイン・リアクション法（以下、ＰＣＲ法と略
記する）〔イニス(Innis) ら：ＰＣＲプロトコールズ
(PCR Protocols)、アカデミック・プレス(Academic Pre
ss)、1990年刊〕が有用である。これらの手法を適用す
るには、所望の糖転移酵素遺伝子あるいは遺伝子の塩基
配列情報が必要である。この点からも、所望の糖転移酵
素の遺伝子をクローン化すること、およびその塩基配列
情報を解析することは重要である。Furthermore, by examining the expression of a specific glycosyltransferase in inflammatory leukocytes and cancer cells, the malignancy of inflammatory diseases and cancer can be diagnosed. In order to investigate the expression of a desired glycosyltransferase gene, the Northern hybridization method [Sambrook, Fritsch] using the gene labeled with radioactivity as a probe.
, Maniatis (Molecular Cloning: A Laboratory Manual
g, A laboratory manual), 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press
arbor Laboratory Press), published in 1989] and polymerase chain reaction method (hereinafter abbreviated as PCR method) [Innis et al .: PCR Protocols
(PCR Protocols), Academic Press (Academic Pre
ss), published in 1990] is useful. In order to apply these techniques, information on the desired glycosyltransferase gene or the nucleotide sequence of the gene is required. From this point as well, it is important to clone the gene for the desired glycosyltransferase and analyze its nucleotide sequence information.

【００１４】以上のように、糖タンパク質の糖鎖の構造
を改変したり、特定の糖鎖あるいはその修飾物を大量に
調製することは産業上重要な課題である。糖鎖の構造を
改変する手段については近年著しく進展している。特に
糖鎖を逐次解離してゆく特異性の高い酵素（エキソグリ
コシダーゼ）やペプチド鎖との結合点をペプチド鎖と糖
鎖の双方を変化させずに解裂させるグリコペプチダーゼ
やエンド型グリコシダーゼによって、糖鎖の構造を改変
させることができ、糖鎖の生物学的な役割についても詳
細な研究ができるようになった。さらに、最近、糖脂質
の糖鎖とセラミドの間を開裂するエンドグリコセラミダ
ーゼ(endoglycoceramidase) が見出され〔伊東と山形：
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J.B
iol.Chem.) 261, 14278 (1986)〕、これにより、糖脂質
の糖鎖の調製が容易になっただけでなく、糖脂質、特に
細胞表層糖脂質の機能を解明する研究が進展した。ま
た、糖転移酵素により、新たな糖鎖を付加することも可
能となってきた。例えば、シアリルトランスフェラーゼ
により、糖鎖の末端にシアル酸を新たに付加することが
できる〔サベサン (Sabesan)とポールソン (Paulson)：
ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ
ー(J.Am.Chem.Soc.)108, 2068 (1986)〕。その他種々の
糖転移酵素やグリコシダーゼの阻害剤〔アランら：アニ
ュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー(Annu. R
ev. Biochem.) 56,497 (1097)］を用いることにより、
付加する糖鎖を変化させることも可能である。しかしな
がら、糖鎖の合成に用いる糖転移酵素を大量に製造する
ことは極めて困難である。そこで、組換えＤＮＡ技術を
用いて糖転移酵素をクローン化し、糖転移酵素を宿主細
胞内で効率よく発現させることにより、糖転移酵素を大
量に製造することが望まれる。As described above, it is an industrially important task to modify the sugar chain structure of a glycoprotein and to prepare a large amount of a specific sugar chain or a modified product thereof. Means for modifying the structure of sugar chains have made remarkable progress in recent years. In particular, a highly specific enzyme (exoglycosidase) that sequentially dissociates sugar chains and glycopeptidases and endoglycosidases that cleave the bond point with the peptide chain without changing both the peptide chain and sugar chain The structure of the chain can be modified, and detailed studies on the biological role of sugar chains have become possible. Furthermore, recently, an endoglycoceramidase that cleaves between the sugar chain of glycolipids and ceramide has been found [Ito and Yamagata:
Journal of Biological Chemistry (JB
iol.Chem.) 261 , 14278 (1986)], which not only facilitated the preparation of sugar chains of glycolipids, but also advanced the research to elucidate the functions of glycolipids, particularly cell surface glycolipids. Moreover, it has become possible to add a new sugar chain by using a glycosyltransferase. For example, sialyltransferase can add a new sialic acid to the end of a sugar chain [Sabesan and Paulson:
Journal of American Chemical Society (J. Am. Chem. Soc.) 108, 2068 (1986)]. Inhibitors of various other glycosyltransferases and glycosidases [Alan et al .: Annual Review of Biochemistry (Annu. R
The ev. Biochem.) 56, 497 (1097)] using a
It is also possible to change the sugar chain to be added. However, it is extremely difficult to produce a large amount of glycosyltransferase used for the synthesis of sugar chains. Therefore, it is desired to mass-produce the glycosyltransferase by cloning the glycosyltransferase using recombinant DNA technology and efficiently expressing the glycosyltransferase in the host cell.

【００１５】これまでに糖転移酵素のクローン化法とし
ては、タンパク質を精製後、それに対する抗体を作成
し、それを用いてイムノスクリーニングを行なう方法
〔ワインスタイン(Wienstein) ら：ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー(J.Biol.Chem.)262, 177
35 (1987) 〕、タンパク質を精製後、アミノ酸配列を決
定し、それに対応する合成ＤＮＡ作成し、それをプロー
ブとしてハイブリダイゼーションを行なう方法〔成松
ら：プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci.),US
A 83, 4720 (1986) 〕が知られている。クローン化した
糖転移酵素の遺伝子をプローブにしてハイブリダイゼー
ションを行なうことにより、その糖転移酵素にホモロジ
ーのある糖転移酵素の遺伝子をクローン化する方法が知
られている〔ロウ(John.B. Lowe)ら：ジャーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリー(J.Biol.Chem.) 266,
17467 (1991)］。糖鎖に対する抗体やレクチンを用いた
パンニング(panning) 法をスクリーニング法として用い
る直接発現クローン化法が知られている〔ロウ(John.
B.Lowe) ら：プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス (Proc.Natl.Acad.Sc
i.),USA,86,8227(1989)、ロウ(John.B.Lowe) ら：ジー
ンズ・アンド・ディベラプメント（Genes Develop.) ,
4,1288 （1990) 〕。As a glycosyltransferase cloning method, a protein is purified, an antibody against the protein is prepared, and immunoscreening is performed using the purified protein [Wienstein et al .: Journal of.
Biological Chemistry (J. Biol. Chem.) 262, 177
35 (1987)], a method of purifying a protein, then determining an amino acid sequence, producing a corresponding synthetic DNA, and performing hybridization using the same as a probe [Narumatsu et al .: Proceeding of the National Academy of・ Science (Proc. Natl. Acad. Sci.), US
A 83 , 4720 (1986)] is known. A method is known in which a gene for a glycosyltransferase having homology to the glycosyltransferase is cloned by performing hybridization using the cloned gene for the glycosyltransferase as a probe [John (B. Lowe ) Et al .: Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.) 266 ,
17467 (1991)]. A direct expression cloning method using a panning method using an antibody against a sugar chain or a lectin as a screening method is known [John (John.
B.Lowe) et al .: Proceeding of the National Academy of Sciences (Proc.Natl.Acad.Sc
i.), USA , 86, 8227 (1989), Lowe (John.B.Lowe) et al .: Jeans and Development (Genes Develop.) ,
4 , 1288 (1990)].

【００１６】レクチン耐性を指標にして糖転移酵素をク
ローン化できた例はない。ＣＨＯ細胞の各種レクチン耐
性変異株に関する研究から、それらのレクチン耐性変異
株においては、新たな糖転移酵素が発現する場合、ある
糖転移酵素の活性が消失する場合、糖ヌクレオチドの合
成やゴルジ体への移行に障害がある場合があることが明
らかになっている〔スタンレー(Pamela Stanley)ら：メ
ソッド・イン・エンザイモロジー (Methods in Enzymol
ogy)，96巻,157頁〕。したがって、ＣＨＯ細胞またはＣ
ＨＯ細胞のレクチン耐性変異株に、クローン化しようと
する糖転移酵素を発現している細胞由来の遺伝子を導入
し、レクチン耐性を指標に糖転移酵素のクローン化が可
能と考えられる〔クマー(Ravindra Kumar)ら：モレキュ
ラー・アンド・セリュラー・バイオロジー(Mol.Cell.Bi
ol.),9,5713(1989) 〕。リプカ(James Ripka) らは、Ｃ
ＨＯ細胞のレクチン耐性変異株（Lec1）に、Ａ４３１細
胞由来のヒトのジェノミックＤＮＡを導入し、コンカナ
バリンＡというレクチンに対する耐性化を指標にＮ−ア
セチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩのクローン
化を試みている。しかしながら、彼らは、このレクチン
耐性を指標にしたスクリーニング法では糖転移酵素をク
ローン化することはできなかった〔リプカ(James Ripk
a) ら：バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・
リサーチ・コミュニケーション(Biochem.Biophys.Res.C
ommun.),159,554(1989) 〕。またヘファーナンらは、ポ
リオーマのラージＴ抗原を生産するようにしたＣＨＯ細
胞〔ヘファーナン(Michael Heffernan) ら：ヌクレイッ
ク・アシッド・リサーチ(NucleicAcids Res.),19,85(19
91)〕に、ｃＤＮＡライブラリーを導入後、ＷＧＡ（whe
at germ agglutinin ）というレクチンに対する耐性化
を指標にマウスの sialicacid hyroxylase のクローン
化を行なっている〔ヘファーナン(Michael Heffernan)
ら：グライココンジュゲート・ジャーナル(Glycoconjug
ate J.),8,154(1991) 〕が、このレクチン耐性を指標に
したスクリーニング系で糖転移酵素のクローン化ができ
たという報告はない。また、宿主に関しては、スタンレ
ー、リプカ、ヘファーナンらはいずれもＣＨＯ細胞また
はＣＨＯ細胞のレクチン耐性変異株を宿主として用いて
いる。There is no example in which a glycosyltransferase could be cloned using lectin resistance as an index. From studies on various lectin-resistant mutants of CHO cells, in these lectin-resistant mutants, when a new glycosyltransferase is expressed, when the activity of a certain glycosyltransferase disappears, sugar nucleotide synthesis or Golgi formation is observed. It has been shown that there may be obstacles to the migration of the population [Pamela Stanley et al .: Methods in Enzymol
ogy), 96, 157]. Therefore, CHO cells or C
A gene derived from a cell expressing the glycosyltransferase to be cloned is introduced into a lectin-resistant mutant strain of HO cells, and it is considered possible to clone the glycosyltransferase using lectin resistance as an index [Kumar (Ravindra Kumar) et al .: Molecular and Cellular Biology (Mol.Cell.Bi
ol.) , 9 , 5713 (1989)]. James Ripka et al.
A human genomic DNA derived from A431 cells was introduced into a lectin-resistant mutant strain (Lec1) of HO cells, and cloning of N-acetylglucosaminyl transferase I is attempted using resistance to the lectin called concanavalin A as an index. However, they could not clone glycosyltransferases by this lectin resistance-based screening method [Lipka (James Ripk
a) et al: Biochemical and Biophysical
Research Communication (Biochem.Biophys.Res.C
ommun.), 159, 554 (1989)]. Heffernan et al. Also reported that CHO cells that produced large T antigen of polyoma [Michael Heffernan et al .: Nucleic Acids Res. , 19, 85 (19
91)], after introducing the cDNA library, WGA (whe
Attempts to clone mouse sialic acid hyroxylase using resistance to lectin (at germ agglutinin) as an index [Michael Heffernan]
Glycoconjug Journal
ate J.), 8, 154 (1991)], but there is no report that the glycosyltransferase could be cloned by this screening system using lectin resistance as an index. Regarding the host, Stanley, Lipka, Hefernan, etc. all use CHO cells or lectin-resistant mutants of CHO cells as hosts.

【００１７】シアリルトランスフェラーゼに関しては、
βガラクトシドα２→６シアリルトランスフェラーゼ
（βGalactoside α２→６sialyltransferase)活性を有
する酵素をコードするｃＤＮＡが単離されており、その
塩基配列も明らかになっている〔ワインスタイン(Wiens
tein) ら：ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー(J.Biol.Chem.)262,17735(1987) 〕。βガラクト
シドα２→３シアリルトランスフェラーゼ（βGalactos
ide α２→３sialyltransferase)活性を有する酵素に関
しては、ギルスピー(Gillespie) らが、糖タンパク質の
Ｏグリコシド結合型糖鎖（セリンまたはスレオニン残基
に付加する糖鎖）中のガラクトースにシアル酸を付加す
る酵素をコードする遺伝子のクローン化を報告している
が、その塩基配列は明らかにされていない。〔ギルスピ
ー(Gillespie) ら：グライココンジュゲート・ジャーナ
ル(Glycoconjugate J.),7,469(1990) 〕。また、ワイン
スタイン(Weinstein) らは、ラット肝臓からβガラクト
シドα２→３シアリルトランスフェラーゼ（βGalactos
ide α２→３sialyltransferase)活性を有する酵素を精
製する方法を報告している〔ワインスタイン(Wienstei
n) ら：ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー(J.Biol.Chem.)257,13835(1982) 〕が、この方法で
は所望の酵素を極めて少量しか得ることができない。こ
れまで組換えＤＮＡ技術を用いて、タンパク質、糖脂
質、オリゴ糖などの糖鎖の所望の位置にα２→３結合で
シアル酸を付加したという報告はない。Regarding sialyltransferase,
A cDNA encoding an enzyme having β-galactoside α2 → 6 sialyltransferase activity has been isolated, and its nucleotide sequence has been clarified [Wiensstein (Wiens
tein) et al .: Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.) 262, 17735 (1987)]. β-galactoside α2 → 3 sialyltransferase (βGalactos
Regarding an enzyme having ide α2 → 3 sialyltransferase activity, Gillespie et al. added sialic acid to galactose in the O-glycoside-linked sugar chain of glycoprotein (sugar chain added to serine or threonine residue). We have reported the cloning of the gene encoding the gene, but its nucleotide sequence has not been clarified. [Gillespie et al .: Glycoconjugate J., 7, 469 (1990)]. Weinstein et al. Also reported that β-galactoside α2 → 3 sialyltransferase (βGalactos
A method for purifying an enzyme having ide α2 → 3 sialyltransferase activity has been reported [Wienstei (Wienstei
n) et al .: Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.) 257, 13835 (1982)], but this method can only give very small amounts of the desired enzyme. Up to now, there has been no report that sialic acid was added to a desired position of a sugar chain such as a protein, a glycolipid, an oligosaccharide, etc. by an α2 → 3 bond using a recombinant DNA technique.

【００１８】[0018]

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、タン
パク質の糖鎖の改変および特定の糖鎖の効率的生産を行
うことができる新規α２→３シアリルトランスフェラー
ゼおよび該α２→３シアリルトランスフェラーゼをコー
ドするＤＮＡおよび該ＤＮＡを含有するベクターを提供
することにある。The object of the present invention is to encode a novel α2 → 3 sialyltransferase capable of modifying a sugar chain of a protein and efficiently producing a specific sugar chain, and the α2 → 3 sialyltransferase. And a vector containing the DNA.

【００１９】[0019]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、動物細胞
から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを
発現クローニングベクターに組み込むことによりｃＤＮ
Ａライブラリーを構築し、該ｃＤＮＡライブラリーを細
胞に導入し、得られる細胞をその細胞の増殖を抑制する
活性を有するレクチンの存在下で培養し、増殖する細胞
を単離することによりクローン化された遺伝子を宿主細
胞に導入して発現させたところ、新規なα２→３シアリ
ルトランスフェラーゼが生産されることを見出し、本発
明を完成させた。[Means for Solving the Problems] The inventors of the present invention incorporated cDNA into an expression cloning vector by incorporating a cDNA synthesized using mRNA extracted from an animal cell as a template.
Cloning by constructing an A library, introducing the cDNA library into cells, culturing the obtained cells in the presence of a lectin having an activity of suppressing the growth of the cells, and isolating the growing cells It was found that a novel α2 → 3 sialyltransferase is produced by introducing the expressed gene into a host cell and expressing it, and completed the present invention.

【００２０】以下、本発明を詳細に説明する。本発明
は、配列番号２または７で示されるアミノ酸配列を有す
る新規α２→３シアリルトランスフェラーゼおよび該α
２→３シアリルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮ
Ａおよび該ＤＮＡを含有する組換え体ベクターに関す
る。本発明のα２→３シアリルトランスフェラーゼは、
βガラクトシドα２→３シアリルトランスフェラーゼ活
性を有する糖転移酵素であり、受容体である糖鎖の末端
にα２→３の結合様式でシアル酸を付加する活性を有す
る。The present invention will be described in detail below. The present invention provides a novel α2 → 3 sialyltransferase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 7, and the α.
CDNA encoding 2 → 3 sialyltransferase
A and a recombinant vector containing the DNA. The α2 → 3 sialyltransferase of the present invention is
It is a glycosyltransferase having β-galactoside α2 → 3 sialyltransferase activity and has the activity of adding sialic acid to the end of the sugar chain that is a receptor in the α2 → 3 binding mode.

【００２１】本発明のα２→３シアリルトランスフェラ
ーゼをコードするｃＤＮＡとしては、(a) 配列番号１ま
たは６記載の塩基配列を有するＤＮＡ、(b) 一つのアミ
ノ酸に対して複数種の遺伝暗号が存在するため、あるい
はヒトを含む動物個々に起こる自然変異などのため配列
番号１または６で示される塩基配列とは異なる塩基配列
を有するＤＮＡ、(c) (a) および(b) で定義されるＤＮ
Ａに対して、本発明のα２→３シアリルトランスフェラ
ーゼ活性を失わない範囲内で置換変異、欠失変異、挿入
変異などの変異が導入されたＤＮＡ、例えば、(a) また
は(b) で定義されるＤＮＡがコードするα２→３シアリ
ルトランスフェラーゼに対して、ハイブリダイゼーショ
ン法によって単離できる程度に相同性を有するＤＮＡな
どを包含する。本発明のα２→３シアリルトランスフェ
ラーゼは上記(a) 、(b) および(c) で定義されるＤＮＡ
によってコードされる全てのα２→３シアリルトランス
フェラーゼを包含する。The cDNA encoding the α2 → 3 sialyltransferase of the present invention includes (a) a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 6, and (b) a plurality of genetic codes for one amino acid. Or a DNA having a nucleotide sequence different from the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 6 due to natural mutation occurring in individual animals including human, (c) DN defined in (a) and (b)
DNA in which a mutation such as a substitution mutation, a deletion mutation, or an insertion mutation is introduced into A within the range of not losing the α2 → 3 sialyltransferase activity of the present invention, for example, defined by (a) or (b) DNAs having homology to the α2 → 3 sialyltransferase encoded by the DNA that is isolated by the hybridization method are included. The α2 → 3 sialyltransferase of the present invention is a DNA defined in (a), (b) and (c) above.
Includes all α2 → 3 sialyltransferases encoded by

【００２２】以下に、本発明のα２→３シアリルトラン
スフェラーゼをコードするｃＤＮＡの製造法を上記(a)
で定義されるｃＤＮＡの製造法を例にして示す。動物細
胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡ
を発現クローニングベクター(Expression Cloning Vect
or) に組み込むことにより、ｃＤＮＡライブラリーを構
築する。このｃＤＮＡライブラリーを動物細胞あるいは
昆虫細胞に導入し、その細胞の増殖を抑制する活性を有
するレクチンの存在下で細胞を培養する。ｃＤＮＡが導
入された細胞クローンのなかに、糖転移酵素をコードす
る遺伝子が発現したために、レクチンが認識する糖鎖構
造が変化し、レクチンに対する感受性を失い、レクチン
存在下で増殖する細胞クローンが現れる。この細胞を単
離し、該細胞から所望のα２→３シアリルトランスフェ
ラーゼをコードするｃＤＮＡを得る。The method for producing the cDNA encoding the α2 → 3 sialyltransferase of the present invention is described below in (a) above.
An example of the method for producing the cDNA defined by CDNA synthesized using mRNA extracted from animal cells as a template
Expression cloning vector (Expression Cloning Vect
or) to construct a cDNA library. This cDNA library is introduced into animal cells or insect cells, and the cells are cultured in the presence of a lectin having an activity of suppressing the growth of the cells. Expression of a gene encoding glycosyltransferase in a cell clone into which cDNA was introduced changes the sugar chain structure recognized by the lectin, loses sensitivity to lectin, and a cell clone that proliferates in the presence of lectin appears. . This cell is isolated, and a cDNA encoding the desired α2 → 3 sialyltransferase is obtained from the cell.

【００２３】上記の方法で用いられる動物細胞は、本発
明のα２→３シアリルトランスフェラーゼを生産してい
る動物細胞であればいかなる細胞でも用いることができ
る。例えば、ヒト組織球腫細胞株ＴＹＨ〔Haranakaら：
インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー(I
nt.J.Cancer),36,313(1985) 〕、ヒトメラノーマ細胞Ｗ
Ｍ２６６−４(ATCC CRL1676)等が用いられる。これらの
細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮ
Ａを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込み発現で
きるベクターであればいかなるものでも用いることがで
きる。例えば、ｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃ等が用いられる。
該ベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導
入する動物細胞あるいは昆虫細胞は、該ｃＤＮＡライブ
ラリーを導入し、発現できるものであればいかなるもの
でも用いることができる。例えば、ヒトナマルバ(Namal
wa) 細胞〔細井ら：サイトテクノロジー(Cytotechnolog
y),1,151(1988)〕等が用いられる。また、本発明で用い
られるレクチンは、宿主細胞の増殖を抑制できるもので
あればいかなるものでも用いることができる。例えば、
ヒママメレクチン１２０等が用いられる。レクチンは使
用する宿主細胞の該レクチンに対する耐性度を決定した
後に、宿主細胞の成育を阻止する濃度で使用する。レク
チン存在下で増殖する細胞から公知の方法、例えば、ハ
ート法〔ロバート・エフ・マーゴルスキー (Robert F.M
argolskee)ら：モレキュラー・アンド・セリュラー・バ
イオロジー (Mol.Cell.Biol.),8,2837(1988)〕により、
本発明のα２→３シアリルトランスフェラーゼをコード
するｃＤＮＡを有するプラスミドあるいは該ｃＤＮＡ部
分を含むＤＮＡ断片を回収する。本発明の酵素をコード
するｃＤＮＡを有するプラスミドとしては、例えば、ｐ
ＵＣ１１９−ＬＥＣおよびｐＵＣ１１９−ＷＭ１７が挙
げられる。ｐＵＣ１１９−ＬＥＣを含む大腸菌であるEs
cherichia coli HB101/pUC119-LEC およびｐＵＣ１１９
−ＷＭ１７を含む大腸菌であるEscherichia coli HB101
/pUC119-WM17は、それぞれ平成３年10月29日、平成４年
９月22日付で工業技術院微生物工業技術研究所にFERM B
P-3625、FERM BP-4013として寄託されている。Any animal cell can be used as the animal cell used in the above method as long as it is an animal cell producing the α2 → 3 sialyltransferase of the present invention. For example, the human histiocytoma cell line TYH [Haranaka et al .:
International Journal of Cancer (I
nt.J.Cancer) , 36,313 (1985)], human melanoma cells W
M266-4 (ATCC CRL1676) or the like is used. CDNA synthesized using mRNA extracted from these cells as a template
As the vector incorporating A, any vector can be used as long as it can incorporate and express the cDNA. For example, pAMoERC3Sc or the like is used.
Any animal cell or insect cell into which the cDNA library constructed by the vector is introduced can be used as long as it can introduce and express the cDNA library. For example, Namalva
wa) Cell [Hosoi et al .: Cytotechnolog
y) , 1 , 151 (1988)] and the like are used. Any lectin can be used in the present invention as long as it can suppress the growth of host cells. For example,
Lima bean lectin 120 or the like is used. The lectin is used at a concentration that inhibits the growth of the host cell after determining the degree of resistance of the host cell to be used to the lectin. Known methods such as the Hart method (Robert F. Margolsky (Robert FM
Argolskee) et al .: Molecular and Cellular Biology (Mol.Cell.Biol.), 8, 2837 (1988)].
A plasmid having a cDNA encoding the α2 → 3 sialyltransferase of the present invention or a DNA fragment containing the cDNA portion is recovered. Examples of the plasmid having cDNA encoding the enzyme of the present invention include p
UC119-LEC and pUC119-WM17. Es that is E. coli containing pUC119-LEC
cherichia coli HB101 / pUC119-LEC and pUC119
-Escherichia coli HB101 which is E. coli containing WM17
/ pUC119-WM17 is FERM B on October 29, 1991 and September 22, 1992, respectively, at the Institute of Microbial Technology, Institute of Industrial Science and Technology.
Deposited as P-3625 and FERM BP-4013.

【００２４】上記(b) および(c) で定義されるＤＮＡは
上記の製造法で得られるα２→３シアリルトランスフェ
ラーゼをコードするｃＤＮＡをもとに、ハイブリダイゼ
ーション法やＤＮＡに変異を導入する方法などの周知の
組換えＤＮＡ技術を用いて製造することができる。ま
た、本発明のα２→３シアリルトランスフェラーゼをコ
ードするｃＤＮＡは化学合成法を用いても製造すること
ができる。The DNAs defined in (b) and (c) above are based on the cDNA encoding the α2 → 3 sialyltransferase obtained by the above-mentioned production method, and based on the hybridization method or the method of introducing a mutation into DNA. Can be produced by using the well-known recombinant DNA technology. The cDNA encoding the α2 → 3 sialyltransferase of the present invention can also be produced by using a chemical synthesis method.

【００２５】上記の方法により得られる本発明のα２→
３シアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを適
当なベクターのプロモーター下流に挿入した組換え体ベ
クターを造成し、それを宿主細胞に導入し、得られた細
胞を培養することにより、本発明のα２→３シアリルト
ランスフェラーゼを製造することができる。ここで、用
いられる宿主細胞としては、原核細胞、動物細胞、酵
母、カビ、昆虫細胞など、これまで組換えＤＮＡ技術で
用いられた宿主細胞ならば、いかなる細胞でも用いるこ
とができる。例えば、原核細胞としては大腸菌、動物細
胞としてはチャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨ
Ｏ細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、ヒトの細胞であ
るナマルバ細胞等が挙げられる。宿主としてナマルバ細
胞を用いる直接発現クローン化系は、宿主であるナマル
バ細胞へのｃＤＮＡライブラリーの導入効率が極めて高
く、しかも導入されたプラスミド（ｃＤＮＡライブラリ
ー）は、染色体外で存在可能であり、取得したレクチン
耐性株からのプラスミドの回収が容易であるという利点
を有しているため、好適に用いられる。Α2 of the present invention obtained by the above method
The α2 → 3 sialyl of the present invention is prepared by constructing a recombinant vector in which a DNA encoding 3 sialyltransferase is inserted downstream of the promoter of an appropriate vector, introducing it into a host cell, and culturing the obtained cell. A transferase can be produced. Here, as the host cell to be used, any cell can be used, such as a prokaryotic cell, an animal cell, a yeast, a fungus, an insect cell, etc., as long as it is a host cell used in the recombinant DNA technology so far. For example, E. coli as a prokaryotic cell and CH as a Chinese hamster cell as an animal cell.
Examples thereof include O cells, COS cells that are monkey cells, and Namalwa cells that are human cells. The direct expression cloning system using Namalwa cells as the host has extremely high efficiency of introducing the cDNA library into the host Namalwa cells, and the introduced plasmid (cDNA library) can exist extrachromosomally, It is preferably used because it has the advantage that the plasmid can be easily recovered from the obtained lectin-resistant strain.

【００２６】本発明のα２→３シアリルトランスフェラ
ーゼをコードするＤＮＡを導入するベクターとしては、
該α２→３シアリルトランスフェラーゼをコードするＤ
ＮＡを組み込むことができ、宿主細胞で発現できるもの
であればいかなるベクターでも用いることができる。例
えば、ｐＡＧＥ１０７〔特開平3-22979,Miyajiら：サイ
トテクノロジー(Cytotechnology),3,133(1990)〕，ｐＡ
Ｓ３−３（特開平2-227075），ｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃ，
ＣＤＭ８〔ブライアン・シード(Brian Seed)ら：ネイチ
ャー(Nature),329,840(1987)〕等が挙げられる。また、
大腸菌内で本発明の酵素を生産させるためには、trp プ
ロモーターなどの強力な転写活性を有するプロモーター
の下流に外来ＤＮＡを挿入することができ、しかもシャ
イン−ダルガノ (Shine-Dalgarno) 配列（以下、ＳＤ配
列と略記する）と開始コドンの間を適当な距離（例え
ば、６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いること
が好ましい。具体的には、ｐＫＹＰ１０（特開昭58-110
600 ）、ｐＬＳＡ１〔宮地ら：アグリカルチュラル・ア
ンド・バイオロジカル・ケミストリー(Agric.Biol.Che
m.),53,277(1989) 〕、ｐＧＥＬ１〔関根ら：プロシー
ディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンス (Proc.Natl.Acad.Sci.),USA, 82,4306(198
5) 〕等が挙げられる。The vector into which the DNA encoding the α2 → 3 sialyltransferase of the present invention is introduced is
D encoding the α2 → 3 sialyltransferase
Any vector can be used as long as it can incorporate NA and can be expressed in a host cell. For example, pAGE107 [Japanese Patent Laid-Open No. 3-22979, Miyaji et al .: Cytotechnology , 3 , 133 (1990)], pA
S3-3 (JP-A-2-227075), pAMoERC3Sc,
CDM8 [Brian Seed et al .: Nature , 329 , 840 (1987)] and the like can be mentioned. Also,
In order to produce the enzyme of the present invention in Escherichia coli, a foreign DNA can be inserted downstream of a promoter having a strong transcription activity such as trp promoter, and a Shine-Dalgarno sequence (hereinafter, It is preferable to use a plasmid in which an appropriate distance (for example, 6 to 18 bases) between the start codon and the SD sequence) is adjusted. Specifically, pKYP10 (JP-A-58-110)
600), pLSA1 [Miyaji et al .: Agricultural and Biological Chemistry (Agric.Biol.Che
m.) , 53, 277 (1989)], pGEL1 [Sekine et al .: Proceeding of the National Academy of
Science (Proc.Natl.Acad.Sci.), USA, 82 , 4306 (198
5)] and the like.

【００２７】本発明で用いる組換えＤＮＡ技術の一般的
手法については、特開平2-227075あるいはサンブルック
(Sambrook)、フリッチ(Fritsch) 、マニアチス(Maniati
s)らの方法〔モレキュラー・クローニング：ア・ラボラ
トリー・マニュアル(Molecular Cloning, A laboratory
manual)、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory
Press) 、１９８９年刊〕に記載されている方法を用い
ることができる。ｍＲＮＡの単離およびｃＤＮＡライブ
ラリーの合成は、上記の方法の他、市販されている多く
のキットを用いて行なうことができる。動物細胞へのＤ
ＮＡの導入法としては、現在までに知られているいかな
る方法も用いることができる。例えば、エレクトロポー
レーション法〔Miyajiら：サイトテクノロジー(Cytotec
hnology) ,3 ,133(1990)〕、リン酸カルシウム法（特開
平2-227075）、リポフェクション法〔フィリップ・エル
・フェルグナー（Philip L. Felgner)ら：プロシーディ
ング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンス (Proc.Natl.Acad.Sci.),USA,84,7413 (1987) 〕
等を用いることができる。形質転換株の取得および培養
は、特開平2-227075あるいは特開平2-257891に記載され
ている方法に準じて行なうことができる。Regarding the general method of the recombinant DNA technology used in the present invention, see Japanese Patent Laid-Open No. 227075 / Sunbrook.
(Sambrook), Fritsch, Maniati
s) et al. [Molecular Cloning, A laboratory
manual), 2nd edition, Cold Spring Harbor
Laboratory Press (Cold Spring Harbor Laboratory
Press), 1989] can be used. The isolation of mRNA and the synthesis of cDNA library can be performed using the above-mentioned method and many commercially available kits. D to animal cells
As a method of introducing NA, any method known to date can be used. For example, the electroporation method [Miyaji et al .: Cytotec
hnology, 3 , 133 (1990)], calcium phosphate method (JP-A-2-227075), lipofection method [Philip L. Felgner, et al .: Proceeding of the National Academy of Science (Proc.Natl.Acad.Sci.), USA , 84, 7413 (1987))
Etc. can be used. The transformant can be obtained and cultivated according to the method described in JP-A-2-227075 or JP-A-2-257891.

【００２８】クローン化したα２→３シアリルトランス
フェラーゼの生産方法としては、宿主細胞内に生産させ
る方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細
胞外膜上に生産させる方法がある。生産部位は、使用す
る宿主細胞の種類、生産させる糖転移酵素の形によって
変わってくる。糖転移酵素をそのままの形で動物細胞を
宿主細胞として生産させる場合は、一般的に、宿主細胞
内あるいは宿主細胞外膜上に生産され、一部は、プロテ
アーゼにより切断されて細胞外に分泌される。宿主細胞
外に積極的に分泌させる場合は、ポールソンらの方法
〔C. Paulsonら：ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー（J.Biol.Chem.) ，264,17619 (198
9)〕およびロウらの方法〔John. B. Lowe ら：プロシー
ディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンス (Proc.Natl.Acad.Sci.),USA,86 ,8227 (198
9)、John. B. Lowe ら：ジーンズ・アンド・ディベラプ
メント（Genes Develop.),4,1288（1990) 〕に準じて遺
伝子組換えの手法を用いて、糖転移酵素の活性部位を含
む部分にシグナルペプチドを付加した形で生産させる。As a method for producing the cloned α2 → 3 sialyltransferase, there are a method for producing it inside the host cell, a method for secreting it outside the host cell, and a method for producing it on the outer membrane of the host cell. The production site depends on the type of host cell used and the form of the glycosyltransferase to be produced. When an animal cell is used as a host cell to produce a glycosyltransferase as it is, it is generally produced in the host cell or on the outer membrane of the host cell, and a part thereof is cleaved by protease and secreted extracellularly. It In the case of positive secretion outside the host cell, the method of Paulson et al. [C. Paulson et al .: The Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), 264, 17619 (198)
9)] and Law et al. [John. B. Lowe et al .: Proceedings of the National Academy of
Science (Proc.Natl.Acad.Sci.), USA , 86 , 8227 (198
9), John. B. Lowe et al .: A portion containing a glycosyltransferase active site using a gene recombination method according to Jeans and Development (Genes Develop.), 4, 1288 (1990)]. It is produced in a form in which a signal peptide is added.

【００２９】特開平2-227075に記載されている方法に準
じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増
幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。この
ようにして生産させた本発明のα２→３シアリルトラン
スフェラーゼは、通常の糖転移酵素の精製方法〔J. Eva
n. Sadler ら：メソッド・イン・エンザイモロジー (Me
thods in Enzymology)，83、458〕に準じて精製できる。
また、大腸菌内に生産させる場合は、上記の方法と特開
昭63-267292 に記載された方法を組み合わせることによ
り効率的に精製することができる。また、本発明の酵素
を他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融
合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたアフィニ
ティークロマトグラフィーを利用して精製することもで
きる。例えば、ロウらの方法〔John. B. Lowe ら：プロ
シーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンス (Proc.Natl.Acad.Sci.),USA,86,8227(1
989)、John. B. Lowe ら：ジーンズ・アンド・ディベラ
プメント（Genes Develop.),4,1288（1990) 〕に準じ
て、本発明の酵素をプロテインＡとの融合タンパク質と
して生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティ
ークロマトグラフィーにより精製することができる。ま
た、該酵素自身に対する抗体を用いたアフィニティーク
ロマトグラフィーで精製することもできる。According to the method described in JP-A-2-227075, the production amount can be increased by utilizing a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like. The α2 → 3 sialyltransferase of the present invention produced in this manner is a conventional glycosyltransferase purification method [J. Eva
n. Sadler et al .: Method in Enzymology (Me
thods in Enzymology), 83 , 458].
When produced in E. coli, it can be efficiently purified by combining the above method with the method described in JP-A-63-267292. It is also possible to produce the enzyme of the present invention as a fusion protein with another protein and purify it using affinity chromatography using a substance having an affinity for the fused protein. For example, the method of Law et al. [John. B. Lowe et al .: Proceeding of the National Academy of Science (Proc. Natl. Acad. Sci.), USA , 86, 8227 (1
989), John. B. Lowe et al .: Jeans and Development (Genes Develop.), 4, 1288 (1990)], the enzyme of the present invention is produced as a fusion protein with protein A to produce an immunoglobulin. It can be purified by affinity chromatography using G. It can also be purified by affinity chromatography using an antibody against the enzyme itself.

【００３０】シアリルトランスフェラーゼの活性は、公
知の測定法〔J. Evan. Sadler ら：メソッド・イン・エ
ンザイモロジー (Methods in Enzymology)，83,458、Na
oyuki Tanigutiら：メソッド・イン・エンザイモロジー
(Methods in Enzymology),179,397 〕に準じて測定す
る。本発明のα２→３シアリルトランスフェラーゼを用
いて、イン・ビトロ(in vitro)で、糖鎖を合成すること
ができる。例えば、糖タンパク質、糖脂質またはオリゴ
糖が有するラクトサミン構造（Gal β１→４GlcNAc構
造）の非還元末端にα２→３結合でシアル酸を付与する
ことができる。また、基質となる糖タンパク質、糖脂質
またはオリゴ糖に本発明のα２→３シアリルトランスフ
ェラーゼを作用させることにより、非還元末端の糖鎖の
構造をSialyl-Le ^X 構造にすることができる。また、非
還元末端にラクトサミン構造を有するオリゴ糖に対し
て、本発明のα２→３シアリルトランスフェラーゼを作
用させた後、公知のα１→３フコシルトランスフェラー
ゼ（α１→３Fucosyltransferase) 〔ロウ (Lowe) ら：
ジーンズ・アンド・ディベラプメント（Genes Develo
p.),4,1288（1990) 、ゲルツ(Goelz) ら：セル(Cell),6
3 、1349 (1990) 〕を用いて、Sialyl-Le ^X およびその
修飾物を非還元末端に有するオリゴ糖を合成することが
できる。The activity of sialyltransferase can be measured by a known assay method [J. Evan. Sadler et al .: Methods in Enzymology, 83 , 458, Na.
oyuki Taniguti et al .: Method in Enzymology
(Methods in Enzymology), 179, 397]. The α2 → 3 sialyltransferase of the present invention can be used to synthesize sugar chains in vitro. For example, sialic acid can be attached to the non-reducing end of the lactosamine structure (Gal β1 → 4GlcNAc structure) possessed by glycoprotein, glycolipid or oligosaccharide by α2 → 3 bond. In addition, the α2 → 3 sialyltransferase of the present invention is allowed to act on a glycoprotein, glycolipid, or oligosaccharide serving as a substrate, so that the sugar chain at the non-reducing end can have a Sialyl-Le ^X structure. Moreover, after the α2 → 3 sialyltransferase of the present invention is allowed to act on an oligosaccharide having a lactosamine structure at the non-reducing end, a known α1 → 3 fucosyltransferase (α1 → 3 Fucosyltransferase) [Lowe et al.
Jeans and Development (Genes Develo
p.), 4, 1288 (1990), Goelz et al .: Cell, 6
3 , 1349 (1990)] can be used to synthesize an oligosaccharide having Sialyl-Le ^X and its modified product at the non-reducing end.

【００３１】本発明のα２→３シアリルトランスフェラ
ーゼをコードするＤＮＡを用いて、該α２→３シアリル
トランスフェラーゼの受容基質である糖鎖を生産してい
る動物細胞あるいは昆虫細胞の中で、該α２→３シアリ
ルトランスフェラーゼと有用生理活性を有する糖タンパ
ク質、糖脂質またはオリゴ糖とを同時に生産させること
により、生産したα２→３シアリルトランスフェラーゼ
を細胞の中で糖タンパク質、糖脂質またはオリゴ糖に作
用させ、糖鎖構造が変化した糖タンパク質、糖脂質また
はオリゴ糖を細胞の中で得ることができる。The α2 → 3 sialyltransferase of the present invention is used to produce the α2 → 3 sialyltransferase in an animal cell or an insect cell producing a sugar chain that is a receptor substrate for the α2 → 3 sialyltransferase. By simultaneously producing a sialyltransferase and a glycoprotein, glycolipid or oligosaccharide having a useful physiological activity, the produced α2 → 3 sialyltransferase is allowed to act on the glycoprotein, glycolipid or oligosaccharide in a cell to form a sugar chain. Glycoproteins, glycolipids or oligosaccharides with altered structure can be obtained in cells.

【００３２】さらに、上記の方法により得られる糖鎖構
造が変化した糖タンパク質、糖脂質またはオリゴ糖から
公知の酵素的手法または化学的手法によりオリゴ糖の一
部を切り出すこともできる。本発明のα２→３シアリル
トランスフェラーゼをコードするＤＮＡは、タンパク質
や糖脂質の糖鎖の改変および特定の糖鎖の効率的生産に
用いることができるだけでなく、アンチセンスＲＮＡ／
ＤＮＡ技術を用いて炎症や癌転移などの疾病の治療に利
用すること、ならびにノーザンハイブリダイゼーション
法またはＰＣＲ法を用いてそれらの疾病の診断に利用す
ることもできる。Further, a part of the oligosaccharide can be excised from the glycoprotein, glycolipid or oligosaccharide having the altered sugar chain structure obtained by the above method by a known enzymatic method or chemical method. The DNA encoding the α2 → 3 sialyltransferase of the present invention can be used not only for modification of sugar chains of proteins and glycolipids and efficient production of specific sugar chains, but also for antisense RNA /
It can also be used for treating diseases such as inflammation and cancer metastasis by using DNA technology, and can be used for diagnosing such diseases by using Northern hybridization method or PCR method.

【００３３】例えば、本発明のα２→３シアリルトラン
スフェラーゼをコードするＤＮＡを用いて、アンチセン
スＲＮＡ／ＤＮＡ技術〔徳久(Tokuhisa)：バイオサイエ
ンスとインダストリー,50, 322 (1992) 、村上(Murakam
i)：化学,46, 681 (1991) 、ミラー(Miller)：バイオテ
クノロジー(Biotechnology),9, 358 (1992) 、コーエン
(Cohen) ：トレンズ・イン・バイオテクノジー(Trends
in Biotechnology),10, 87 (1992) 、アグラワル(Agraw
al) ：トレンズ・イン・バイオテクノジー(Trends in B
iotechnology) 10, 152 (1992)〕あるいはトリプル・ヘ
リックス技術〔チュブ(Chubb) とホーガン(Hogan) ：ト
レンズ・イン・バイオテクノジー(Trends in Biotechno
logy),10, 132 (1992)〕により該α２→３シアリルトラ
ンスフェラーゼの生産を抑制することができる。具体的
には、本発明のα２→３シアリルトランスフェラーゼを
コードするＤＮＡの一部の塩基配列、好ましくは翻訳開
始領域内の10〜50塩基の塩基配列を基にしてオリゴヌク
レオチドを設計・調製し、生体内に投与することにより
該α２→３シアリルトランスフェラーゼの生産を抑制で
きる。合成オリゴヌクレオチドの塩基配列としては、本
発明で開示されるアンチセンス鎖の塩基配列の一部と一
致するもの、あるいは該α２→３シアリルトランスフェ
ラーゼの生産を抑制する活性を失わない範囲内で改変し
たものを利用できる。トリプル・ヘリックス技術を用い
る場合、センス鎖およびアンチセンス鎖の双方の塩基配
列の塩基配列情報をもとに、合成オリゴヌクレオチドの
塩基配列を設計する。For example, using the DNA encoding the α2 → 3 sialyltransferase of the present invention, antisense RNA / DNA technology [Tokuhisa: Bioscience and Industry , 50, 322 (1992), Murakami (Murakam).
i): Chemistry , 46, 681 (1991), Miller: Biotechnology, 9, 358 (1992), Cohen
(Cohen): Trends in Biotechnology (Trends)
in Biotechnology), 10 , 87 (1992), Agrawal (Agraw
al): Trends in B
(iotechnology) 10, 152 (1992)] or triple helix technology (Chubb and Hogan): Trends in Biotechno
logy), 10 , 132 (1992)], the production of the α2 → 3 sialyltransferase can be suppressed. Specifically, an oligonucleotide is designed and prepared based on a part of the base sequence of the DNA encoding the α2 → 3 sialyltransferase of the present invention, preferably a base sequence of 10 to 50 bases in the translation initiation region, When administered in vivo, the production of the α2 → 3 sialyltransferase can be suppressed. The base sequence of the synthetic oligonucleotide is the same as a part of the base sequence of the antisense strand disclosed in the present invention, or modified within a range that does not lose the activity of suppressing the production of the α2 → 3 sialyltransferase. Stuff available. When the triple helix technique is used, the base sequence of the synthetic oligonucleotide is designed based on the base sequence information of the base sequences of both the sense strand and the antisense strand.

【００３４】また、以下のようにしてハイブリダイゼー
ション法またはＰＣＲ法により本発明のα２→３シアリ
ルトランスフェラーゼを検出することができる。ノーザ
ンハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法を用いて、
本発明のα２→３シアリルトランスフェラーゼの生産を
調べるには、本発明のα２→３シアリルトランスフェラ
ーゼをコードするＤＮＡまたはそれらの塩基配列に基づ
いてＤＮＡプローブまたは合成オリゴヌクレオチドを調
製する。ノーザンハイブリダイゼーション法およびＰＣ
Ｒ法は、それぞれ公知の方法〔サンブルック(Sambroo
k)、フリッチ(Fritsch) 、マニアチス(Maniatis)（モレ
キュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュア
ル(Molecular Cloning, A laboratory manual)、第２
版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・
プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press) 、１９
８９年刊およびイニス(Innis) ら：ＰＣＲプロトコール
ズ (PCR Protocols)、アカデミック・プレス(Academic
Press)、1990年刊〕に従って行う。Further, the α2 → 3 sialyltransferase of the present invention can be detected by the hybridization method or the PCR method as follows. By using the Northern hybridization method or the PCR method,
In order to investigate the production of the α2 → 3 sialyltransferase of the present invention, a DNA probe or a synthetic oligonucleotide is prepared based on the DNA encoding the α2 → 3 sialyltransferase of the present invention or their nucleotide sequences. Northern hybridization method and PC
Each of the R methods is a known method [Sambroo
k), Fritsch, Maniatis (Molecular Cloning, A laboratory manual), 2nd
Edition, Cold Spring Harbor Laboratory
Press (Cold Spring Harbor Laboratory Press), 19
1989 and Innis et al .: PCR Protocols, Academic Press (Academic)
Press), published in 1990].

【００３５】以下、本発明の実施例を示す。Examples of the present invention will be shown below.

【００３６】[0036]

【実施例】【Example】

実施例１ １．直接発現クローニングベクター（Expression Cloni
ng Vector)ｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃの造成： （１）ｐＡＧＥＬ１０６の造成 （図１参照） 以下に示す方法に従って、simian virus 40 (SV40)初期
遺伝子プロモーターとヒトＴ細胞白血病ウイルス(human
T-cell leukemia virus type-1 : HTLV-1) のロング・
ターミナル・リピート(long terminal repeat : LTR)の
Ｒ領域とU5領域の一部を融合したプロモーターを有する
プラスミドｐＡＧＥＬ１０６の造成を行なった。すなわ
ち、Ｒ領域とU5領域の一部を含むＤＮＡ断片〔BanII-Sa
u3AI断片(0.27kb)〕をｐＡＴＫ０３から切り出し、合成
リンカーを介してｐＡＧＥ１０６のBglI-BamHI間に挿入
した。Example 1 1. Direct Expression Cloning Vector (Expression Cloni
ng Vector) Construction of pAMoERC3Sc: (1) Construction of pAGEL106 (see FIG. 1) The simian virus 40 (SV40) early gene promoter and human T cell leukemia virus (human
T-cell leukemia virus type-1: HTLV-1)
A plasmid pAGEL106 having a promoter in which the R region of a long terminal repeat (LTR) and a part of the U5 region were fused was constructed. That is, a DNA fragment containing the R region and a part of the U5 region [BanII-Sa
u3AI fragment (0.27 kb)] was excised from pATK03 and inserted between BglI and BamHI of pAGE106 via a synthetic linker.

【００３７】特開平2-227075記載の方法により得られた
ｐＡＧＥ１０６の１μg を10mM トリス−塩酸(pH7.5)
，6mM 塩化マグネシウム，100mM 塩化ナトリウム, 6mM
２−メルカプトエタノールからなる緩衝液（以下、Ｙ
−１００緩衝液と略記する）30μl に溶解し、10単位の
BglI（宝酒造社製、以下、とくに断らないかぎり制限酵
素は宝酒造社製のものを用いた）と10単位のBamHI を加
え、37℃で２時間消化反応を行なった。該反応液をアガ
ロースゲル電気泳動後、約4.9kb のＤＮＡ断片を回収し
た。1 μg of pAGE106 obtained by the method described in JP-A-2-227075 was treated with 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5).
, 6mM magnesium chloride, 100mM sodium chloride, 6mM
A buffer solution consisting of 2-mercaptoethanol (hereinafter Y
Dissolve in 30 μl and abbreviate 10 units of buffer.
BglI (manufactured by Takara Shuzo, hereinafter, unless otherwise specified, restriction enzymes manufactured by Takara Shuzo were used) and 10 units of BamHI were added, and a digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 4.9 kb was recovered.

【００３８】また、ｐＡＴＫ０３〔清水ら：プロシーデ
ィング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サ
イエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.),USA ,80 ,3618(1983)
〕１μg をＹ−１００緩衝液 30 μl に溶解し、10単
位のBanII を加え、37℃で２時間消化反応を行ない、ア
ガロースゲル電気泳動後、約0.4kb のDNA 断片を回収し
た。回収したＤＮＡ断片は30μl のＹ−１００緩衝液に
溶解し、10単位のSau3AIを加え37℃で２時間消化反応を
行ない、アガロースゲル電気泳動後、約0.27kbのＤＮＡ
断片を回収した。Further, pATK03 [Shimizu et al .: Proceeding of the National Academic of Science (Proc. Natl. Acad. Sci.), USA , 80 , 3618 (1983)]
] 1 μg was dissolved in 30 μl of Y-100 buffer, 10 units of BanII was added, digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours, and after electrophoresis on agarose gel, a DNA fragment of about 0.4 kb was recovered. The recovered DNA fragment was dissolved in 30 μl of Y-100 buffer, 10 units of Sau3AI was added, and the digestion reaction was performed at 37 ° C. for 2 hours. After agarose gel electrophoresis, about 0.27 kb of DNA was obtained.
The fragments were collected.

【００３９】また別に、BglI切断部位とBanII 切断部位
を連結するためのリンカーとして以下のＤＮＡリンカー
を合成した。Separately, the following DNA linker was synthesized as a linker for connecting the BglI cleavage site and the BanII cleavage site.

【００４０】[0040]

【化１】 [Chemical 1]

【００４１】このＤＮＡリンカーの5merと6merの１本鎖
ＤＮＡはそれぞれアプライド・バイオシステムズ社３８
０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。合成したＤＮＡ
はそれぞれ0.2 μg ずつ、50mM トリス−塩酸(pH7.5)
，10mM 塩化マグネシウム，5mM ジチオスレイトール
（以下DTT と略記する), 0.1nM EDTA および1mM アデノ
シン３リン酸（以下ATP と略記する）を含む緩衝液（以
下、Ｔ４キナーゼ緩衝液と略記する）40μl に溶解し、
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製、以下同
じ）30単位を加えて、37℃で２時間リン酸化反応を行な
った。The 5 mer and 6 mer single-stranded DNAs of this DNA linker are 38 of Applied Biosystems, respectively.
It was synthesized using a 0A DNA synthesizer. Synthesized DNA
0.2 μg each, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)
, 10 mM magnesium chloride, 5 mM dithiothreitol (hereinafter abbreviated as DTT), 0.1 nM EDTA and 1 mM adenosine triphosphate (hereinafter abbreviated as ATP) in a buffer solution (hereinafter abbreviated as T4 kinase buffer) 40 μl Dissolve
30 units of T4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo, the same applies hereinafter) was added, and phosphorylation was performed at 37 ° C for 2 hours.

【００４２】上記で得たｐＡＧＥ１０６由来のBglI -Ba
mHI 断片(4.9kb) 0.2 μg とｐＡＴＫ０３由来のBanII-
Sau3AI断片(0.27kb) 0.01 μg を 66mM トリス−塩酸(p
H7.5) ，6.6mM 塩化マグネシウム，10mM DTTおよび0.1m
M ATP からなる緩衝液（以下、Ｔ４リガーゼ緩衝液と略
記する）30μl に溶解し、上記ＤＮＡリンカー0.01μg
とＴ４DNA リガーゼ（宝酒造社製、以下同じ）175 単位
を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。BglI-Ba derived from pAGE106 obtained above
0.2 µg of mHI fragment (4.9 kb) and BanII-derived from pATK03
0.01 μg of Sau3AI fragment (0.27 kb) was added to 66 mM Tris-HCl (p
H7.5), 6.6mM magnesium chloride, 10mM DTT and 0.1m
Dissolve in 30 μl of a buffer solution consisting of M ATP (hereinafter abbreviated as T4 ligase buffer solution), and 0.01 μg of the above DNA linker
And 175 units of T4 DNA ligase (manufactured by Takara Shuzo, the same applies hereinafter) were added, and a binding reaction was carried out at 12 ° C for 16 hours.

【００４３】該反応液を用いて大腸菌HB101 株〔ボリバ
ー(Bolivar) ら：ジーン(Gene),2,75,(1977)〕をコーエ
ンらの方法〔エス・エヌ・コーエン(S.N.Cohen) ら：プ
ロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンス (Proc.Natl.Acad.Sci.),USA,69 ,211
0(1972) 〕に従って形質転換し、カナマイシン耐性株を
得た。この形質転換株から公知の方法〔エイチ・シー・
バーンボイム (H.C.Birnboim) ら：ヌクレイック・アシ
ッド・リサーチ (Nucleic Acids Res.),7 ,1513,(197
9)〕に従ってプラスミドを単離した。このプラスミドを
ｐＡＧＥＬ１０６と名付けた。プラスミドｐＡＧＥＬ１
０６の構造は制限酵素消化により確認した。Using the reaction solution, Escherichia coli HB101 strain [Bolivar et al .: Gene , 2 , 75, (1977)] was subjected to the method of Cohen et al. [SN Cohen et al .: Proceeding].・ Of the National Academy ・
Of Science (Proc.Natl.Acad.Sci.), USA , 69 , 211
0 (1972)] to obtain a kanamycin resistant strain. A known method [H.C.
HC Birnboim et al .: Nucleic Acids Res., 7 , 1513, (197
9)] was used to isolate the plasmid. This plasmid was named pAGEL106. Plasmid pAGEL1
The structure of 06 was confirmed by restriction enzyme digestion.

【００４４】（２）ｐＡＳＬＢ３−３−１の造成 （図
２参照） 以下に示す方法に従って、SV40初期遺伝子プロモーター
とHTLV-1のロング・ターミナル・リピート(LTR) のR 領
域とU5領域の一部を融合したプロモーターを有する、ヒ
ト顆粒球コロニー刺激因子(hG-CSF)の発現プラスミドｐ
ＡＳＬＢ３−３−１の造成を行なった。(2) Construction of pASLB3-3-1 (see FIG. 2) According to the method described below, the SV40 early gene promoter and HTLV-1 long terminal repeat (LTR) R region and part of U5 region Expression plasmid p of human granulocyte colony stimulating factor (hG-CSF) having a promoter fused with
The creation of ASLB3-3-1 was performed.

【００４５】（１）で得られたｐＡＧＥＬ１０６の 0.5
μg を10mM トリス−塩酸(pH7.5),6mM 塩化マグネシウ
ム，20mM 塩化カリウムおよび6mM 2 −メルカプトエタ
ノールからなる緩衝液（以下、Ｋ−２０緩衝液と略記す
る）30μl に溶解し、10単位のSmaIを加え、37℃で２時
間消化反応を行なった。エタノールで沈殿させた後、30
μl のＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、ＳａｌＩリンカー
（5'pGGTCGACC3' ：宝酒造社製）0.01μg とＴ４ＤＮＡ
リガーゼ175 単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行
なった。エタノールで沈澱させた後、10mM トリス−塩
酸(pH7.5) ，6mM 塩化マグネシウム，175mM 塩化ナトリ
ウム，6mM 2 −メルカプトエタノールからなる緩衝液
（以下、Ｙ−１７５緩衝液と略記する）30μl に溶解
し、10単位のSalIと10単位のMluIを加え、37℃で２時間
消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳
動後、約1.7kb のＤＮＡ断片を回収した。0.5 of pAGEL106 obtained in (1)
μg was dissolved in 30 μl of a buffer containing 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 6 mM magnesium chloride, 20 mM potassium chloride and 6 mM 2-mercaptoethanol (hereinafter abbreviated as K-20 buffer), and 10 units of SmaI was used. Was added and the digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours. After precipitation with ethanol, 30
Dissolve in μl of T4 ligase buffer, 0.01 μg of SalI linker (5'pGGTCGACC3 ': Takara Shuzo) and T4 DNA
After adding 175 units of ligase, the binding reaction was carried out at 12 ° C for 16 hours. After precipitation with ethanol, it was dissolved in 30 μl of a buffer solution (hereinafter referred to as Y-175 buffer solution) consisting of 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 6 mM magnesium chloride, 175 mM sodium chloride, 6 mM 2-mercaptoethanol. , 10 units of SalI and 10 units of MluI were added, and a digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 1.7 kb was recovered.

【００４６】一方、特開平2-227075記載の方法により得
られたｐＡＳ３−３の１μg をＹ−１７５緩衝液 30 μ
l に溶解し、10単位のSalIと10単位のMluIを加え、37℃
で２時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲ
ル電気泳動後、約6.7kb のＤＮＡ断片を回収した。上記
で得たｐＡＧＥＬ１０６由来のMluI-SalI 断片(1.7kb)
0.1 μg とｐＡＳ３−３由来のMluI-SalI 断片(6.7kb)
0.2 μg をＴ４リガーゼ緩衝液 30 μl に溶解し、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ175 単位を加えて、12℃で16時間結合反
応を行なった。On the other hand, 1 μg of pAS3-3 obtained by the method described in JP-A-2-227075 was added to 30 μ of Y-175 buffer solution.
Dissolve in l, add 10 units SalI and 10 units MluI, 37 ℃
The digestion reaction was carried out for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 6.7 kb was recovered. MluI-SalI fragment (1.7 kb) derived from pAGEL106 obtained above
0.1 μg and MluI-SalI fragment (6.7 kb) derived from pAS3-3
0.2 μg was dissolved in 30 μl of T4 ligase buffer and
175 units of DNA ligase was added and the ligation reaction was carried out at 12 ° C. for 16 hours.

【００４７】該反応液を用いて大腸菌HB101 株をコーエ
ンらの方法によって形質転換し、カナマイシン耐性株を
得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミ
ドを単離した。このプラスミドをｐＡＳＬＢ３−３−１
と名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。Escherichia coli HB101 strain was transformed with the reaction solution by the method of Cohen et al. To obtain a kanamycin resistant strain. A plasmid was isolated from this transformant according to a known method. This plasmid was designated as pASLB3-3-1.
And its structure was confirmed by restriction enzyme digestion.

【００４８】（３）ｐＡＳＬＢ３−３の造成 （図３参
照） 以下に示す方法に従って、ｐＡＳＬＢ３−３−１にアン
ピシリン耐性遺伝子を導入したプラスミドｐＡＳＬＢ３
−３の造成を行なうため、ｐＡＳ３−３のアンピシリン
耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片〔XhoI-MluI 断片(2.58k
b)〕をｐＡＳＬＢ３−３−１のXhoI-MluI 間に導入し
た。(3) Construction of pASLB3-3 (see FIG. 3) The plasmid pASLB3 in which the ampicillin resistance gene was introduced into pASLB3-3-1 according to the method described below.
-3, a DNA fragment containing the ampicillin resistance gene of pAS3-3 [XhoI-MluI fragment (2.58k
b)] was introduced between XhoI and MluI of pASLB3-3-1.

【００４９】（２）で得られたｐＡＳＬＢ３−３−１の
１μg を10mM トリス−塩酸(pH7.5) ，6mM 塩化マグネ
シウム，150mM 塩化ナトリウム，6mM ２−メルカプトエ
タノールからなる緩衝液（以下、Ｙ−１５０緩衝液と略
記する）30μl に溶解し、10単位のXhoIと10単位のMluI
を加え、37℃で２時間消化反応を行なった。該反応液を
アガロースゲル電気泳動後、約7.26kbのＤＮＡ断片を回
収した。1 μg of pASLB3-3-1 obtained in (2) was added to a buffer solution containing 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 6 mM magnesium chloride, 150 mM sodium chloride, 6 mM 2-mercaptoethanol (hereinafter referred to as Y- Dissolved in 30 μl of 150 buffer, and 10 units of XhoI and 10 units of MluI
Was added and the digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 7.26 kb was recovered.

【００５０】一方、ｐＡＳ３−３の１μg をＹ−１５０
緩衝液 30 μl に溶解し、10単位のXhoIと10単位のMluI
を加え、37℃で２時間消化反応を行なった。該反応液を
アガロースゲル電気泳動後、約2.58kbのＤＮＡ断片を回
収した。上記で得られた、ｐＡＳＬＢ３−３−１由来の
XhoI-MluI 断片(7.26kb) 0.2μg とｐＡＳ３−３由来の
XhoI-MluI 断片(2.58kb) 0.1μg とをＴ４リガーゼ緩衝
液 30 μl に溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ175 単位を加
えて、12℃で16時間結合反応を行なった。On the other hand, 1 μg of pAS3-3 was added to Y-150.
Dissolve in 30 μl of buffer and add 10 units of XhoI and 10 units of MluI.
Was added and the digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 2.58 kb was recovered. Derived from pASLB3-3-1 obtained above
XhoI-MluI fragment (7.26 kb) 0.2 μg and pAS3-3
0.1 μg of XhoI-MluI fragment (2.58 kb) was dissolved in 30 μl of T4 ligase buffer, 175 units of T4 DNA ligase was added, and ligation reaction was carried out at 12 ° C. for 16 hours.

【００５１】該反応液を用いて大腸菌HB101 株をコーエ
ンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を
得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミ
ドを単離した。このプラスミドをｐＡＳＬＢ３−３と名
付け、その構造を制限酵素消化により確認した。Escherichia coli HB101 strain was transformed with the reaction solution by the method of Cohen et al. To obtain ampicillin resistant strain. A plasmid was isolated from this transformant according to a known method. This plasmid was named pASLB3-3, and its structure was confirmed by digestion with restriction enzymes.

【００５２】（４）ｐＡＳＬＢＥ３−３の造成 （図４
参照） 以下に示す方法に従って、ｐＡＳＬＢ３−３中のジヒド
ロ葉酸還元酵素(dhfr)発現ユニットを除去し、エプスタ
イン・バール・ウイルス（Epstein -Barr virus ）の複
製開始点（oriP）とoriPにトランスに作用し複製を引き
起こす因子であるEBNA-1遺伝子を導入したプラスミドｐ
ＡＳＬＢＥ３−３の造成を行なった。oriPとEBNA-1遺伝
子は、ｐ２０１〔ビル・ズグデン(Bill Sugden) ら、ネ
イチャー(Nature) ,313,812(1985)〕のNarI部位にｐＵ
Ｃ１２〔メッシング(Messing) ら：メソッド・イン・エ
ンザイモロジー (Methods in Enzymology), 101, 20 (1
983)〕由来のマルチクローニングサイトを含む SmaI-Ha
eIII断片が組み込まれたプラスミドであるｐ２２０．２
から切り出して使用した。(4) Construction of pASLBE3-3 (Fig. 4
Reference) According to the method described below, the dihydrofolate reductase (dhfr) expression unit in pASLB3-3 was removed, and the replication origin (oriP) and oriP of Epstein-Barr virus act on trans. Plasmid p into which the EBNA-1 gene, which is a factor that causes replication, is introduced
ASLBE3-3 was created. The oriP and EBNA-1 genes have pU at the NarI site of p201 [Bill Sugden et al., Nature , 313 , 812 (1985)].
C12 [Messing et al .: Methods in Enzymology, 101, 20 (1
983)] SmaI-Ha containing the multiple cloning site derived from
p220.2, which is a plasmid incorporating the eIII fragment
It was cut from and used.

【００５３】ｐ２０１のNarI部位にｐＵＣ１２由来のマ
ルチクローニングサイトを含む SmaI-HaeIII 断片が組
み込まれたプラスミドであるｐ２２０．２の１μg をＹ
−１００緩衝液30μl に溶解し、20単位のEcoRI を加
え、37℃で２時間消化反応を行なった。エタノールで沈
殿させた後、30μl のＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液〔50
mM トリス−塩酸(pH7.5) ，10mM 塩化マグネシウム，
0.1mM dATP（デオキシアデノシン３リン酸），0.1mM dC
TP（デオキシシチジン３リン酸），0.1mM dGTP（デオキ
シグアノシン３リン酸），0.1mM dTTP（デオキシチミジ
ン３リン酸）〕に溶解し、６単位の大腸菌ＤＮＡポリメ
ラーゼＩクレノー(Klenow)断片を加え、37℃で60分間反
応させ、EcoRI 消化によって生じた５’突出末端を平滑
末端に変えた。反応をフェノールで抽出することによっ
て止め、クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させ
た後、20μl のＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、ＸｈｏＩ
リンカー（5'pCCTCGAGG3' ：宝酒造社製）を0.05μg と
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ175 単位を加えて、12℃で16時間結
合反応を行なった。エタノールで沈殿させた後、Ｙ−１
００緩衝液30μl に溶解し、10単位のBamHI を加え、37
℃で２時間消化反応を行なった。エタノールで沈殿させ
た後、30μl のＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、
６単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノー断片を加
え、37℃で60分間反応させ、BamHI 消化によって生じた
５’突出末端を平滑末端に変えた。反応をフェノールで
抽出することによって止め、クロロホルムで抽出し、エ
タノールで沈澱させた後、Ｙ−１００緩衝液30μl に溶
解し、10単位のXhoIを加え、37℃で２時間消化反応を行
なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約4.9k
bのＤＮＡ断片を回収した。1 μg of p220.2, which is a plasmid in which the SmaI-HaeIII fragment containing the multi-cloning site derived from pUC12 was incorporated into the NarI site of p201, was Y.
It was dissolved in 30 µl of -100 buffer, 20 units of EcoRI was added, and the digestion reaction was carried out at 37 ° C for 2 hours. After precipitation with ethanol, 30 μl of DNA polymerase I buffer [50
mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride,
0.1 mM dATP (deoxyadenosine triphosphate), 0.1 mM dC
TP (deoxycytidine triphosphate), 0.1 mM dGTP (deoxyguanosine triphosphate), 0.1 mM dTTP (deoxythymidine triphosphate)], and added 6 units of E. coli DNA polymerase I Klenow (Klenow) fragment, The reaction was carried out at 37 ° C for 60 minutes, and the 5'protruding ends generated by EcoRI digestion were changed to blunt ends. The reaction was stopped by extraction with phenol, extracted with chloroform, precipitated with ethanol, dissolved in 20 μl of T4 ligase buffer and added to XhoI.
0.05 μg of a linker (5'pCCTCGAGG3 ': manufactured by Takara Shuzo) and 175 units of T4 DNA ligase were added, and a ligation reaction was performed at 12 ° C for 16 hours. After precipitation with ethanol, Y-1
Dissolve in 30 μl of 00 buffer and add 10 units of BamHI,
The digestion reaction was carried out at 0 ° C for 2 hours. After precipitation with ethanol, dissolve in 30 μl of DNA polymerase I buffer,
6 units of Escherichia coli DNA polymerase I Klenow fragment was added and reacted at 37 ° C for 60 minutes to change the 5'protruding end generated by BamHI digestion into a blunt end. The reaction was stopped by extraction with phenol, extracted with chloroform, precipitated with ethanol, dissolved in 30 μl of Y-100 buffer, added with 10 units of XhoI, and digested at 37 ° C. for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, about 4.9k
The DNA fragment of b was recovered.

【００５４】また、ｐＡＳＬＢ３−３の１μg をＹ−１
００緩衝液 30 μl に溶解し、20単位のXhoIを加え、37
℃で２時間消化反応を行なった。エタノールで沈澱させ
た後、30μl のＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、
６単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノー断片を加
え、37℃で60分間反応させ、XhoI消化によって生じた
５’突出末端を平滑末端に変えた。反応をフェノールで
抽出することによって止め、クロロホルムで抽出し、エ
タノールで沈澱させた後、10mM トリス−塩酸(pH7.5),
6mM 塩化マグネシウム, 6mM 2 −メルカプトエタノー
ルからなる緩衝液（以下、Ｙ−０緩衝液と略記する）30
μl に溶解し、20単位のKpnIを加え、37℃で２時間消化
反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動
後、約1.3kbのＤＮＡ断片を回収した。Also, 1 μg of pASLB3-3 was added to Y-1.
Dissolve in 30 μl of 00 buffer and add 20 units of XhoI.
The digestion reaction was carried out at 0 ° C for 2 hours. After precipitation with ethanol, it was dissolved in 30 μl of DNA polymerase I buffer,
6 units of Escherichia coli DNA polymerase I Klenow fragment was added and reacted at 37 ° C for 60 minutes to change the 5'protruding end generated by XhoI digestion into a blunt end. The reaction was stopped by extraction with phenol, extracted with chloroform and precipitated with ethanol, then 10 mM Tris-HCl (pH 7.5),
A buffer solution consisting of 6 mM magnesium chloride and 6 mM 2-mercaptoethanol (hereinafter abbreviated as Y-0 buffer solution) 30
It was dissolved in μl, 20 units of KpnI was added, and the digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 1.3 kb was recovered.

【００５５】また、ｐＡＧＥ１０７〔特開平3-22979 、
Miyajiら：サイトテクノロジー(Cytotechnology),3,133
(1990)〕の１μg をＹ−０緩衝液 30 μl に溶解し、20
単位のKpnIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。
その後、塩化ナトリウム濃度が100mM になるように塩化
ナトリウムを添加し、20単位のXhoIを加え、さらに37℃
で２時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲ
ル電気泳動後、約6.0kb のＤＮＡ断片を回収した。In addition, pAGE107 [JP-A-3-22979,
Miyaji et al .: Cytotechnology , 3 , 133
(1990)] and dissolved in 30 μl of Y-0 buffer,
A unit of KpnI was added, and a digestion reaction was carried out at 37 ° C for 2 hours.
Then add sodium chloride to a sodium chloride concentration of 100 mM, add 20 units of XhoI, and then add 37 ° C.
The digestion reaction was carried out for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 6.0 kb was recovered.

【００５６】上記で得たｐ２２０・２由来のXhoI-BamHI
(平滑末端) 断片(4.9kb) 0.2 μgとｐＡＳＬＢ３−３
由来のXhoI（平滑末端)-KpnI断片(1.3kb) 0.1 μg とｐ
ＡＧＥ１０７由来のKpnI-XhoI 断片(6.0kb) 0.2 μg を
Ｔ４リガーゼ緩衝液 30 μlに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ175 単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なっ
た。XhoI-BamHI derived from p220.2 obtained above
(Blunt end) 0.2 μg of fragment (4.9 kb) and pASLB3-3
XhoI (blunt end) -KpnI fragment (1.3 kb) of 0.1 μg and p
0.2 μg of KpnI-XhoI fragment (6.0 kb) derived from AGE107 was dissolved in 30 μl of T4 ligase buffer, 175 units of T4 DNA ligase was added, and a ligation reaction was carried out at 12 ° C. for 16 hours.

【００５７】該反応液を用いて大腸菌HB101 株をコーエ
ンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を
得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミ
ドを単離した。このプラスミドをｐＡＳＬＢＥ３−３と
名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。The reaction solution was used to transform Escherichia coli HB101 strain by the method of Cohen et al. To obtain ampicillin resistant strain. A plasmid was isolated from this transformant according to a known method. This plasmid was named pASLBE3-3, and its structure was confirmed by digestion with restriction enzymes.

【００５８】（５）ｐＡＳＬＢＣの造成 （図５参照） 以下に示す方法に従って、ｐＡＳＬＢ３−３中のhG-CSF
遺伝子を除去し、そのかわりにマルチクローニングサイ
トを導入したプラスミドｐＡＳＬＢＣを造成した。マル
チクローニングサイトは、合成ＤＮＡを用いて作成し
た。(5) Construction of pASLBC (see FIG. 5) hG-CSF in pASLB3-3 was prepared according to the method described below.
The gene was removed, and instead, a plasmid pASLBC having a multicloning site introduced was constructed. The multi-cloning site was created using synthetic DNA.

【００５９】（４）で得られたｐＡＳＬＢ３−３の１μ
g をＹ−１７５緩衝液30μl に溶解し、20単位のSalIと
20単位のMluIを加え、37℃で２時間消化反応を行なっ
た。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約3.1kb の
DNA 断片を回収した。また、ｐＡＳＬＢ３−３の１μg
をＹ−０緩衝液 30 μl に溶解し、20単位のKpnIを加
え、37℃で２時間消化反応を行なった。その後、塩化ナ
トリウム濃度が150mM になるように塩化ナトリウムを添
加し、20単位のMluIを加え、さらに37℃で２時間消化反
応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、
約6.0kbのＤＮＡ断片を回収した。1 μm of pASLB3-3 obtained in (4)
g in 30 μl of Y-175 buffer and 20 units of SalI
20 units of MluI was added and a digestion reaction was carried out at 37 ° C for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, about 3.1 kb of
The DNA fragment was recovered. In addition, 1 μg of pASLB3-3
Was dissolved in 30 μl of Y-0 buffer, 20 units of KpnI was added, and a digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours. Then, sodium chloride was added so that the sodium chloride concentration would be 150 mM, 20 units of MluI was added, and the digestion reaction was further carried out at 37 ° C. for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis,
A DNA fragment of about 6.0 kb was recovered.

【００６０】また別に、SalI切断部位とKpnI切断部位を
連結するためのリンカーとして以下のＤＮＡリンカーを
合成した。なお、このリンカー中にはHindIII, EcoRV,
SfiI, StuI, NotIの各制限酵素切断部位が組み込まれて
いる。Separately, the following DNA linker was synthesized as a linker for connecting the SalI cleavage site and the KpnI cleavage site. In this linker, HindIII, EcoRV,
SfiI, StuI, and NotI restriction enzyme cleavage sites are incorporated.

【００６１】[0061]

【化２】 [Chemical 2]

【００６２】このＤＮＡリンカーの52mer と44mer の１
本鎖ＤＮＡはそれぞれアプライド・バイオシステムズ社
製３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。合成した
ＤＮＡはそれぞれ0.2 μg ずつ、Ｔ４キナーゼ緩衝液20
μl に溶解し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造
社製、以下同じ）30単位を加えて、37℃で２時間リン酸
化反応を行なった。One of 52mer and 44mer of this DNA linker
The single-stranded DNAs were each synthesized using an Applied Biosystems 380A DNA synthesizer. 0.2 μg of each synthesized DNA was added to T4 kinase buffer 20
After dissolving in μl, 30 units of T4 polynucleotide kinase (manufactured by Takara Shuzo, the same applies hereinafter) was added, and phosphorylation was carried out at 37 ° C. for 2 hours.

【００６３】上記で得た、ｐＡＳＬＢ３−３由来のSalI
-MluI 断片(3.1kb) 0.1 μg とKpnI-MluI 断片(6.0kb)
0.2 μg とをＴ４リガーゼ緩衝液30μl に溶解し、上記
ＤＮＡリンカーを0.01μg とＴ４ＤＮＡリガーゼ175 単
位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。該反応
液を用いて大腸菌HB101 株をコーエンらの方法によって
形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換
株から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。この
プラスミドをｐＡＳＬＢＣと名付け、その構造を制限酵
素消化により確認した。SalI derived from pASLB3-3 obtained above
-MluI fragment (3.1 kb) 0.1 μg and KpnI-MluI fragment (6.0 kb)
0.2 μg was dissolved in 30 μl of T4 ligase buffer, 0.01 μg of the above DNA linker and 175 units of T4 DNA ligase were added, and a ligation reaction was carried out at 12 ° C. for 16 hours. Escherichia coli HB101 strain was transformed with the reaction solution by the method of Cohen et al. To obtain an ampicillin resistant strain. A plasmid was isolated from this transformant according to a known method. This plasmid was named pASLBC, and its structure was confirmed by restriction enzyme digestion.

【００６４】（６）ｐＡＳＬＢＥＣの造成 （図６参
照） 以下に示す方法に従って、ｐＡＳＬＢＣ中のジヒドロ葉
酸還元酵素(dhfr)発現ユニットを除去し、oriPとEBNA-1
遺伝子を導入したプラスミドｐＡＳＬＢＥＣを造成し
た。(6) Construction of pASLBEC (See FIG. 6) The dihydrofolate reductase (dhfr) expression unit in pASLBC was removed according to the method described below to obtain oriP and EBNA-1.
A plasmid pASLBEC into which the gene was introduced was constructed.

【００６５】（４）で得られたｐＡＳＬＢＥ３−３の１
μg をＹ−１５０緩衝液30μl に溶解し、20単位のMluI
と20単位のXhoIを加え、37℃で２時間消化反応を行なっ
た。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約1.3kb の
ＤＮＡ断片を回収した。また、ｐＡＳＬＢＥ３−３の１
μg をＹ−０緩衝液 30 μl に溶解し、20単位のKpnIを
加え、37℃で２時間消化反応を行なった。その後、塩化
ナトリウム濃度が150mM になるように塩化ナトリウムを
添加し、５単位のMluIを加え、さらに37℃で20分間部分
消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳
動後、約9.6kb のＤＮＡ断片を回収した。1 of pASLBE3-3 obtained in (4)
μg was dissolved in 30 μl of Y-150 buffer and 20 units of MluI
And 20 units of XhoI were added, and the digestion reaction was carried out at 37 ° C for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 1.3 kb was recovered. In addition, 1 of pASLBE3-3
μg was dissolved in 30 μl of Y-0 buffer, 20 units of KpnI was added, and digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours. Then, sodium chloride was added so that the sodium chloride concentration was 150 mM, 5 units of MluI was added, and a partial digestion reaction was further carried out at 37 ° C. for 20 minutes. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 9.6 kb was recovered.

【００６６】次に、（５）で得られたｐＡＳＬＢＣの１
μg をＹ−０緩衝液 30 μl に溶解し、20単位のKpnIを
加え、37℃で２時間消化反応を行なった。その後、塩化
ナトリウム濃度が100mM になるように塩化ナトリウムを
添加し、20単位のXhoIを加え、さらに37℃で２時間消化
反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動
後、約0.6kb のＤＮＡ断片を回収した。Next, 1 of pASLBC obtained in (5)
μg was dissolved in 30 μl of Y-0 buffer, 20 units of KpnI was added, and digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours. Then, sodium chloride was added so that the concentration of sodium chloride was 100 mM, 20 units of XhoI was added, and the digestion reaction was further carried out at 37 ° C. for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 0.6 kb was recovered.

【００６７】上記で得られたｐＡＳＬＢＥ３−３由来の
MluI-XhoI 断片(1.3kb) 0.2 μg とKpnI-MluI 断片(9.6
kb) 0.2 μg とｐＡＳＬＢＣ由来のKpnI-XhoI 断片(0.6
kb)0.05μg とをＴ４リガーゼ緩衝液30μl に溶解し、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ175 単位を加えて、12℃で16時間結
合反応を行なった。該反応液を用いて大腸菌HB101 株を
コーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐
性株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプ
ラスミドを単離した。このプラスミドをｐＡＳＬＢＥＣ
と名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。Derived from pASLBE3-3 obtained above
MluI-XhoI fragment (1.3 kb) 0.2 μg and KpnI-MluI fragment (9.6
kb) 0.2 μg and KpnI-XhoI fragment (0.6 from pASLBC)
kb) 0.05 μg was dissolved in 30 μl of T4 ligase buffer,
175 units of T4 DNA ligase was added and the ligation reaction was carried out at 12 ° C. for 16 hours. Escherichia coli HB101 strain was transformed with the reaction solution by the method of Cohen et al. To obtain an ampicillin resistant strain. A plasmid was isolated from this transformant according to a known method. This plasmid is called pASLBEC
And its structure was confirmed by restriction enzyme digestion.

【００６８】（７）ｐＡＳＬＢＥＣ２の造成 （図７参
照） 以下に示す方法に従って、ｐＡＳＬＢＥＣのマルチクロ
ーニングサイト中のStuIサイトにBamHI リンカーを導入
したプラスミドｐＡＳＬＢＥＣ２を造成した。ｐＡＳＬ
ＢＥＣ２では、マルチクローニングサイト中のStuIサイ
トは消失している。(7) Construction of pASLBEC2 (see FIG. 7) According to the method described below, a plasmid pASLBEC2 was constructed by introducing a BamHI linker into the StuI site of the multicloning site of pASLBEC. pASL
In BEC2, the StuI site in the multi-cloning site has disappeared.

【００６９】（６）で得られたｐＡＳＬＢＥＣの１μg
をＹ−１００緩衝液30μl に溶解し、５単位のStuIを加
え、37℃で20分間部分消化反応を行なった。該反応液を
アガロースゲル電気泳動後、約11.5kbのＤＮＡ断片を回
収した。回収したＤＮＡ断片を30μl のＴ４リガーゼ緩
衝液に溶解し、ＢａｍＨＩリンカー（5'pCCGGATCCGG3'
：宝酒造社製）の0.01μg とＴ４ＤＮＡリガーゼ175
単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。エタ
ノールで沈澱させた後、Ｙ−１００緩衝液30μlに溶解
し、20単位のBamHI を加え、37℃で２時間消化反応を行
なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約11.5
kbのＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡ断片を20μ
l のＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
175 単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。1 μg of pASLBEC obtained in (6)
Was dissolved in 30 μl of Y-100 buffer, 5 units of StuI was added, and a partial digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 20 minutes. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 11.5 kb was recovered. The recovered DNA fragment was dissolved in 30 μl of T4 ligase buffer, and the BamHI linker (5'pCCGGATCCGG3 '
: Takara Shuzo) 0.01 μg and T4 DNA ligase 175
The unit was added and the binding reaction was carried out at 12 ° C. for 16 hours. After precipitation with ethanol, the precipitate was dissolved in 30 μl of Y-100 buffer, 20 units of BamHI was added, and digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, about 11.5
A kb DNA fragment was recovered. 20μ of recovered DNA fragment
l dissolved in T4 ligase buffer to give T4 DNA ligase
175 units were added and the binding reaction was carried out at 12 ° C for 16 hours.

【００７０】該反応液を用いて大腸菌HB101 株をコーエ
ンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を
得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミ
ドを単離した。このプラスミドをｐＡＳＬＢＥＣ２と名
付け、その構造を制限酵素消化により確認した。Escherichia coli HB101 strain was transformed with the reaction solution by the method of Cohen et al. To obtain ampicillin resistant strain. A plasmid was isolated from this transformant according to a known method. This plasmid was named pASLBEC2, and its structure was confirmed by restriction enzyme digestion.

【００７１】（８）ｐＡＭｏＥＣ２の造成 （図８参
照） 以下に示す方法に従って、ｐＡＳＬＢＥＣ２中のプロモ
ーター〔SV40初期遺伝子プロモーターとHTLV-1のロング
・ターミナル・リピート(long terminal repeat ：LTR)
のR 領域とU5領域の一部を融合したプロモーター〕をモ
ロニー・マウス白血病ウイルスのロング・ターミナル・
リピート（long terminal repeat：LTR）のプロモータ
ーにすげかえたプラスミドｐＡＭｏＥＣ２の造成を行な
った。モロニー・マウス白血病ウイルスLTR のプロモー
ターは、プラスミドMolp-1〔アキノリ・イシモト (Akin
ori Ishimoto) ら：ビロロジー(Virology),141,30(198
5)〕から切り出して使用した。(8) Construction of pAMoEC2 (see FIG. 8) The promoter in pASLBEC2 [SV40 early gene promoter and HTLV-1 long terminal repeat (LTR)] was prepared according to the following method.
Of the Moloney murine leukemia virus long terminal
A plasmid pAMoEC2 having the promoter of a repeat (long terminal repeat: LTR) replaced was constructed. The promoter of Moloney murine leukemia virus LTR is derived from the plasmid Molp-1 [Akinori Ishimoto (Akin
ori Ishimoto) et al .: Virology , 141 , 30 (198
5)] was cut out and used.

【００７２】（７）で得られたｐＡＳＬＢＥＣ２の１μ
g を10mM トリス−塩酸(pH7.5),6mM 塩化マグネシウ
ム，50mM 塩化カリウム, 6mM ２−メルカプトエタノー
ルからなる緩衝液（以下、Ｋ−５０緩衝液と略記する）
30μl に溶解し、20単位のHindIII と20単位のAatII
（東洋紡績社製) を加え、37℃で２時間消化反応を行な
った。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約4.8kb
のＤＮＡ断片を回収した。1 μ of pASLBEC2 obtained in (7)
g buffer solution consisting of 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 6 mM magnesium chloride, 50 mM potassium chloride, 6 mM 2-mercaptoethanol (hereinafter abbreviated as K-50 buffer solution)
Dissolve in 30 μl, 20 units of HindIII and 20 units of AatII
(Manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was added and the digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, about 4.8 kb
Was recovered.

【００７３】また、ｐＡＳＬＢＥＣ２の１μg をＫ−５
０緩衝液 30 μl に溶解し、20単位のAatII を加え、37
℃で２時間消化反応を行なった。その後、5 単位のXhoI
を加え、さらに37℃で20分間部分消化反応を行なった。
該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約6.1kb のＤＮ
Ａ断片を回収した。次に、XhoI切断部位とClaI切断部位
を連結するためのリンカーとして以下のＤＮＡリンカー
を合成した。Further, 1 μg of pASLBEC2 was added to K-5.
Dissolve in 30 μl of 0 buffer, add 20 units of AatII,
The digestion reaction was carried out at 0 ° C for 2 hours. Then 5 units of XhoI
Was added, and a partial digestion reaction was further performed at 37 ° C for 20 minutes.
After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, DN of about 6.1 kb was obtained.
The A fragment was recovered. Next, the following DNA linker was synthesized as a linker for connecting the XhoI cleavage site and the ClaI cleavage site.

【００７４】[0074]

【化３】 [Chemical 3]

【００７５】上記ＤＮＡリンカーの9merと7merの１本鎖
ＤＮＡはそれぞれアプライド・バイオシステムズ社製３
８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。合成したＤＮ
Ａはそれぞれ0.2 μg ずつＴ４キナーゼ緩衝液40μl に
溶解し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ30単位を加え
て、37℃で２時間リン酸化反応を行った。また別に、Ｍ
ｏｌｐ−１〔アキノリ・イシモト (Akinori Ishimoto)
ら：ビロロジ−(Virology),141,30(1985) 〕の１μg を
Ｋ−２０緩衝液30μl に溶解し、20単位のSmaIを加え、
37℃で２時間消化反応を行なった。その後、塩化ナトリ
ウム濃度が50mMになるように塩化ナトリウムを添加し、
20単位のClaIを加え、37℃で２時間消化反応を行った。
該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約0.6kb のＤＮ
Ａ断片を回収した。回収したＤＮＡ断片を30μl のＴ４
リガーゼ緩衝液に溶解し、上記ＤＮＡリンカー0.01μg
とHindIII リンカー（5'pCAAGCTTG3' ：宝酒造社製）を
0.03μg とＴ４ＤＮＡリガーゼ175 単位とを加えて、12
℃で16時間結合反応を行なった。エタノールで沈澱させ
た後、10mM トリス−塩酸(pH7.5) ，6mM 塩化マグネシ
ウム，50mM 塩化ナトリウム，6mM ２−メルカプトエタ
ノールからなる緩衝液（以下、Ｙ−５０緩衝液と略記す
る）30μl に溶解し、10単位のHindIII を加え、37℃で
２時間消化反応を行なった。その後、塩化ナトリウム濃
度が100mM になるように塩化ナトリウムを添加し、10単
位のXhoIを加え、さらに37℃で２時間消化反応を行なっ
た。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約0.6kb の
ＤＮＡ断片を回収した。The 9-mer and 7-mer single-stranded DNAs of the above-mentioned DNA linkers are 3 by Applied Biosystems, respectively.
It was synthesized using an 80A DNA synthesizer. Synthesized DN
0.2 μg of each A was dissolved in 40 μl of T4 kinase buffer, 30 units of T4 polynucleotide kinase was added, and phosphorylation reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours. Separately, M
olp-1 [Akinori Ishimoto]
Et al .: Virology , 141 , 30 (1985)] 1 μg was dissolved in 30 μl of K-20 buffer and 20 units of SmaI was added.
The digestion reaction was carried out at 37 ° C for 2 hours. Then, add sodium chloride so that the sodium chloride concentration becomes 50 mM,
20 units of ClaI was added and the digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours.
After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, DN of about 0.6 kb was obtained.
The A fragment was recovered. Collect the recovered DNA fragment in 30 μl of T4
Dissolve in ligase buffer, 0.01 μg of the above DNA linker
And HindIII linker (5'pCAAGCTTG3 ': manufactured by Takara Shuzo)
Add 0.03 μg and 175 units of T4 DNA ligase to give 12
The binding reaction was performed at 16 ° C for 16 hours. After precipitating with ethanol, it was dissolved in 30 μl of a buffer solution (hereinafter abbreviated as Y-50 buffer solution) consisting of 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 6 mM magnesium chloride, 50 mM sodium chloride, 6 mM 2-mercaptoethanol. 10 units of HindIII were added and the digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours. Then, sodium chloride was added so that the sodium chloride concentration was 100 mM, 10 units of XhoI was added, and the digestion reaction was further carried out at 37 ° C. for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 0.6 kb was recovered.

【００７６】上記で得られたｐＡＳＬＢＥＣ２由来のHi
ndIII-AatII 断片(4.8kb) 0.2 μgとAatII-XhoI断片(6.
1kb) 0.2 μg とＭｏｌｐ−１由来のHindIII-XhoI断片
(0.6kb) 0.05μg とをＴ４リガーゼ緩衝液30μl に溶解
し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時
間結合反応を行なった。該反応液を用いて大腸菌HB101
株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリ
ン耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法に従っ
てプラスミドを単離した。このプラスミドをｐＡＭｏＥ
Ｃ２と名付け、その構造を制限酵素消化により確認し
た。Hi derived from pASLBEC2 obtained above
ndIII-AatII fragment (4.8 kb) 0.2 μg and AatII-XhoI fragment (6.
1 kb) 0.2 μg and HindIII-XhoI fragment derived from Molp-1
0.05 μg (0.6 kb) was dissolved in 30 μl of T4 ligase buffer, 175 units of T4 DNA ligase was added, and a ligation reaction was carried out at 12 ° C. for 16 hours. E. coli HB101 using the reaction solution
The strain was transformed by the method of Cohen et al. To obtain an ampicillin resistant strain. A plasmid was isolated from this transformant according to a known method. This plasmid is called pAMoE
It was named C2 and its structure was confirmed by digestion with restriction enzymes.

【００７７】（９）ｐＡＭｏＥＣ３の造成 （図９参
照） 以下に示す方法に従って、ｐＡＭｏＥＣ２のマルチクロ
ーニングサイト中のBamHI サイトに、詰め込みＤＮＡ
(Stuffer DNA)として、ｐＢＲ３２２のテトラサイクリ
ン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片〔DraI - PvuII断片(2.5
kb) 〕を挿入し、プラスミドｐＡＭｏＥＣ３を造成し
た。(9) Construction of pAMoEC3 (see FIG. 9) The packed DNA was inserted into the BamHI site in the multicloning site of pAMoEC2 according to the method described below.
As (Stuffer DNA), a DNA fragment containing the tetracycline resistance gene of pBR322 [DraI-PvuII fragment (2.5
kb)] was inserted to construct the plasmid pAMoEC3.

【００７８】（８）で得られたｐＡＭｏＥＣ２の１μg
をＹ−１００緩衝液30μl に溶解し、20単位のBamHI を
加え、37℃で２時間消化反応を行なった。エタノールで
沈澱させた後、30μl のＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に
溶解し、６単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノー
断片を加え、37℃で60分間反応させ、BamHI 消化によっ
て生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。該反応液を
アガロースゲル電気泳動後、約11.5kbのＤＮＡ断片を回
収した。1 μg of pAMoEC2 obtained in (8)
Was dissolved in 30 μl of Y-100 buffer, 20 units of BamHI was added, and the digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours. After precipitating with ethanol, it was dissolved in 30 μl of DNA polymerase I buffer solution, 6 units of E. coli DNA polymerase I Klenow fragment was added, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 60 minutes, and the 5'protruding end generated by BamHI digestion was blunt-ended. Changed to. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 11.5 kb was recovered.

【００７９】また、ｐＢＲ３２２〔ボリバー(Bolivar)
ら：ジーン(Gene),2,95(1977) 〕１μg をＹ−５０緩衝
液 30 μl に溶解し、20単位のDraIと20単位のPvuII を
加え、37℃で２時間消化反応を行なった。該反応液をア
ガロースゲル電気泳動後、約2.5kb のＤＮＡ断片を回収
した。上記で得られたｐＡＭｏＥＣ２由来のBamHI （平
滑末端）断片(11.5kb) 0.1μg とｐＢＲ３２２由来のDr
aI-PvuII断片(2.5kb) 0.2 μg とをＴ４リガーゼ緩衝液
30μl に溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ175 単位を加え
て、12℃で16時間結合反応を行なった。In addition, pBR322 [Bolivar]
Et al., Gene , 2 , 95 (1977)] 1 μg was dissolved in 30 μl of Y-50 buffer, 20 units of DraI and 20 units of PvuII were added, and digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 2.5 kb was recovered. 0.1 μg of BamHI (blunt end) fragment (11.5 kb) derived from pAMoEC2 obtained above and Dr derived from pBR322
0.2 μg of aI-PvuII fragment (2.5 kb) in T4 ligase buffer
It was dissolved in 30 μl, 175 units of T4 DNA ligase was added, and the binding reaction was carried out at 12 ° C. for 16 hours.

【００８０】該反応液を用いて大腸菌HB101 株をコーエ
ンらの方法によって形質転換し、アンピシリンとテトラ
サイクリンに耐性である株を得た。この形質転換株から
公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプラス
ミドをｐＡＭｏＥＣ３と名付け、その構造を制限酵素消
化により確認した。Escherichia coli HB101 strain was transformed with the reaction solution by the method of Cohen et al. To obtain a strain resistant to ampicillin and tetracycline. A plasmid was isolated from this transformant according to a known method. This plasmid was named pAMoEC3, and its structure was confirmed by digestion with restriction enzymes.

【００８１】（１０）ｐＡＭｏＥＲＣ３の造成 （図１
０参照） 以下に示す方法に従って、ｐＡＭｏＥＣ３中のoriPとEB
NA-1遺伝子のプラスミド上での向きを逆にしたプラスミ
ドｐＡＭｏＥＲＣ３を造成した。（９）で得られたｐＡ
ＭｏＥＣ３の１μg をＹ−１００緩衝液30μl に溶解
し、20単位のXhoIを加え、37℃で２時間消化反応を行な
った。その後、1Mトリス−塩酸(pH8.0) 30μl と大腸菌
アルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）１単位とを加
え、37℃で２時間脱リン酸化反応を行なった。エタノー
ルで沈澱させた後、10mM トリス−塩酸(pH8.0) ，1mM
EDTAからなる緩衝液（以下、ＴＥ緩衝液と略記する）30
μl に溶解し、アガロースゲル電気泳動を行ない、約9.
1kb のＤＮＡ断片を回収した。(10) Construction of pAMoERC3 (Fig. 1
0) oriP and EB in pAMoEC3 according to the following method
A plasmid pAMoERC3 in which the direction of the NA-1 gene on the plasmid was reversed was constructed. PA obtained in (9)
1 μg of MoEC3 was dissolved in 30 μl of Y-100 buffer, 20 units of XhoI was added, and the digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours. Then, 30 μl of 1 M tris-hydrochloric acid (pH 8.0) and 1 unit of Escherichia coli alkaline phosphatase (Takara Shuzo) were added, and dephosphorylation reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours. After precipitating with ethanol, 10 mM Tris-HCl (pH8.0), 1 mM
Buffer solution consisting of EDTA (hereinafter abbreviated as TE buffer solution) 30
Dissolve in μl and perform agarose gel electrophoresis.
A 1 kb DNA fragment was recovered.

【００８２】また、ｐＡＭｏＥＣ３の１μg をＹ−１０
０緩衝液 30 μl に溶解し、20単位のXhoIを加え、37℃
で２時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲ
ル電気泳動後、約4.9kb のＤＮＡ断片を回収した。上記
で得られたｐＡＭｏＥＣ３由来のXhoI断片(9.1kb) 0.1
μg とXhoI断片(4.9kb) 0.2 μg とをＴ４リガーゼ緩衝
液30μl に溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ175 単位を加え
て、12℃で16時間結合反応を行なった。Also, 1 μg of pAMoEC3 was added to Y-10.
Dissolve in 30 μl of 0 buffer, add 20 units of XhoI, and incubate at 37 ℃
The digestion reaction was carried out for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 4.9 kb was recovered. The XhoI fragment (9.1 kb) 0.1 derived from pAMoEC3 obtained above
μg and 0.2 μg of XhoI fragment (4.9 kb) were dissolved in 30 μl of T4 ligase buffer, 175 units of T4 DNA ligase was added, and a ligation reaction was carried out at 12 ° C. for 16 hours.

【００８３】該反応液を用いて大腸菌HB101 株をコーエ
ンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を
得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミ
ドを単離した。このプラスミドをｐＡＭｏＥＲＣ３と名
付け、その構造を制限酵素消化により確認した。Escherichia coli HB101 strain was transformed with the reaction solution by the method of Cohen et al. To obtain ampicillin resistant strain. A plasmid was isolated from this transformant according to a known method. This plasmid was named pAMoERC3 and its structure was confirmed by restriction enzyme digestion.

【００８４】（１１）ｐＡＧＥ２０７の造成 （図１１
参照） 以下に示す方法に従って、ｐＡＧＥ１０７中のG418耐性
遺伝子をハイグロマイシン(hyg) 耐性遺伝子にすげかえ
たプラスミドｐＡＧＥ２０７を造成した。hyg耐性遺伝
子は、ｐ２０１〔ビル・ズグデン(Bill Sugden) ら、ネ
イチャー (Nature),313,812(1985) 〕より切り出して使
用した。(11) Construction of pAGE207 (Fig. 11)
Reference) According to the method described below, a plasmid pAGE207 was constructed by replacing the G418 resistance gene in pAGE107 with a hygromycin (hyg) resistance gene. The hyg resistance gene was excised from p201 [Bill Sugden et al., Nature, 313, 812 (1985)] and used.

【００８５】特開平3-22979 記載の方法により得られた
ｐＡＧＥ１０７の１μg をＹ−５０緩衝液30μl に溶解
し、20単位のClaIを加え、37℃で２時間消化反応を行な
った。その後、塩化ナトリウム濃度が150 mMになるよう
に塩化ナトリウムを添加し、20単位のMluIを加え、さら
に37℃で２時間消化反応を行なった。該反応液をアガロ
ースゲル電気泳動後、約4.6kb のＤＮＡ断片を回収し
た。1 μg of pAGE107 obtained by the method described in JP-A-3-22979 was dissolved in 30 μl of Y-50 buffer, 20 units of ClaI was added, and a digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours. Then, sodium chloride was added so that the sodium chloride concentration would be 150 mM, 20 units of MluI was added, and the digestion reaction was further carried out at 37 ° C. for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 4.6 kb was recovered.

【００８６】また、ｐ２０１〔ビル・ズグデン (Bill S
udgen) ら：ネイチャー (Nature),313 ,812(1985)〕0.
5 μｇをＹ−５０緩衝液30μl に溶解し、20単位のNarI
〔ニュー・イングランド・バイオラボ (New England Bi
olab) 社製〕を加え、37℃で２時間消化反応を行なっ
た。エタノールで沈澱させた後、30μl のＤＮＡポリメ
ラーゼＩ緩衝液に溶解し、６単位の大腸菌ＤＮＡポリメ
ラーゼＩクレノー断片を加え、37℃で60分間反応させ、
NarI消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変え
た。反応をフェノールで抽出することによって止め、ク
ロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、20μ
l のＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、ClaIリンカー（5'pC
ATCGATG3' ：宝酒造社製）を0.05μg とＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ175 単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なっ
た。エタノールで沈澱させた後、Ｙ−５０緩衝液30μl
に溶解し、10単位のClaIを加え、37℃で２時間消化反応
を行なった。その後、塩化ナトリウム濃度が150 mMにな
るように塩化ナトリウムを添加し、10単位のMluIを加
え、さらに37℃で２時間消化反応を行なった。該反応液
をアガロースゲル電気泳動後、約1.6kb のＤＮＡ断片を
回収した。In addition, p201 [Bill Sugden (Bill S
Judgen et al .: Nature, 313 , 812 (1985)] 0.
Dissolve 5 μg in 30 μl of Y-50 buffer and add 20 units of NarI.
(New England Bi-Lab
olab) was added, and the digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours. After precipitation with ethanol, it was dissolved in 30 μl of DNA polymerase I buffer, 6 units of E. coli DNA polymerase I Klenow fragment was added, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 60 minutes,
The 5'overhanging ends generated by NarI digestion were changed to blunt ends. The reaction was stopped by extracting with phenol, extracting with chloroform and precipitating with ethanol, followed by 20μ
l dissolved in T4 ligase buffer and claI linker (5'pC
ATCGATG3 ': manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was added to 0.05 μg and 175 units of T4 DNA ligase, and a ligation reaction was carried out at 12 ° C. for 16 hours. After precipitation with ethanol, 30 μl of Y-50 buffer
10 units of ClaI was added and digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours. Then, sodium chloride was added so that the sodium chloride concentration was 150 mM, 10 units of MluI was added, and the digestion reaction was further carried out at 37 ° C. for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 1.6 kb was recovered.

【００８７】上記で得られたｐＡＧＥ１０７由来のClaI
-MluI 断片(4.6kb) 0.2 μg とｐ２０１由来の ClaI-Ml
uI断片(1.6kb) 0.1 μg とをＴ４リガーゼ緩衝液30μl
に溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ175 単位を加えて、12℃
で16時間結合反応を行なった。該反応液を用いて大腸菌
HB101 株をコーエンらの方法によって形質転換し、アン
ピシリン耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法
に従ってプラスミドを単離した。このプラスミドをｐＡ
ＧＥ２０７と名付け、その構造を制限酵素消化により確
認した。ClaI derived from pAGE107 obtained above
-MluI fragment (4.6kb) 0.2 μg and p201-derived ClaI-Ml
uI fragment (1.6 kb) 0.1 μg and T4 ligase buffer 30 μl
And 175 units of T4 DNA ligase,
The binding reaction was carried out for 16 hours. E. coli using the reaction solution
The HB101 strain was transformed by the method of Cohen et al. To obtain an ampicillin resistant strain. A plasmid was isolated from this transformant according to a known method. PA of this plasmid
It was named GE207 and its structure was confirmed by restriction enzyme digestion.

【００８８】（１２）ｐＡＧＥ２０７ＳｃＮの造成
（図１２参照） 以下に示す方法に従って、ラビットβグロビン遺伝子中
に存在するSfiIサイトの類似配列を除去するため、ｐＡ
ＧＥ２０７のBalIサイトにScaIリンカーを挿入したプラ
スミドｐＡＧＥ２０７ＳｃＮを造成した。ｐＡＧＥ２０
７ＳｃＮにおいては、挿入されたScaIリンカーの数は明
らかではない。(12) Construction of pAGE207ScN
(See FIG. 12) In order to remove the similar sequence of the SfiI site present in the rabbit β globin gene according to the method described below, pA
A plasmid pAGE207ScN having a ScaI linker inserted at the BalI site of GE207 was constructed. pAGE20
In 7ScN, the number of ScaI linkers inserted is not clear.

【００８９】（１１）で得られたｐＡＧＥ２０７の0.5
μg をＹ−０緩衝液30μl に溶解し、10単位のBalIを加
え、37℃で２時間消化反応を行なった。エタノールで沈
澱させた後、20μl のＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、Sc
aIリンカー（5'pAAGTACTT3'：宝酒造社製）を0.01μg
とＴ４ＤＮＡリガーゼ175 単位を加えて、12℃で16時間
結合反応を行なった。0.5 of pAGE207 obtained in (11)
μg was dissolved in 30 μl of Y-0 buffer, 10 units of BalI was added, and digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours. After precipitation with ethanol, dissolve in 20 μl of T4 ligase buffer and
0.01 μg of aI linker (5'pAAGTACTT3 ': manufactured by Takara Shuzo)
And 175 units of T4 DNA ligase were added and the ligation reaction was carried out at 12 ° C. for 16 hours.

【００９０】該反応液を用いて大腸菌HB101 株をコーエ
ンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を
得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミ
ドを単離した。このプラスミドをｐＡＧＥ２０７ＳｃＮ
と名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。The reaction solution was used to transform Escherichia coli HB101 strain by the method of Cohen et al. To obtain ampicillin resistant strain. A plasmid was isolated from this transformant according to a known method. This plasmid was designated as pAGE207ScN.
And its structure was confirmed by restriction enzyme digestion.

【００９１】（１３）ｐＡＭｏＣ３Ｓｃの造成 （図１
３参照） 以下に示す方法に従って、ｐＡＭｏＥＲＣ３中のラビッ
トβグロビン遺伝子中に存在するSfiIサイトの類似配列
を除去するため、ｐＡＭｏＥＲＣ３中のラビットβグロ
ビン遺伝子を、すでにその類似配列を除去してあるｐＡ
ＧＥ２０７ＳｃＮ中のラビットβグロビン遺伝子にすげ
かえ、プラスミドｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃを造成した。造
成の都合上まずｐＡＭｏＣ３Ｓｃを造成し、次いでｐＡ
ＭｏＥＲＣ３Ｓｃの造成を行なった。前記のｐＡＧＥ２
０７ＳｃＮにおいては、SfiIサイトの類似配列を除去す
るために挿入されたScaIリンカーの数は明らかではない
が、ｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃの場合は、造成の際にｐＡＧ
Ｅ２０７ＳｃＮを一度ScaIで切断しているため、挿入さ
れたScaIサイトの数は1 つであると推定される。(13) Construction of pAMoC3Sc (Fig. 1
3) In order to remove the similar sequence of the SfiI site present in the rabbit β globin gene in pAMoERC3 according to the method described below, the rabbit β globin gene in pAMoERC3 has already been deleted in its similar sequence.
The rabbit βglobin gene in GE207ScN was replaced and the plasmid pAMoERC3Sc was constructed. For the convenience of construction, first pAMoC3Sc was constructed, and then pA
MoERC3Sc was created. PAGE2 above
In 07ScN, the number of ScaI linkers inserted in order to remove the similar sequence at the SfiI site is not clear, but in the case of pAMoERC3Sc, pAGoERC3Sc has pAGo at the time of construction.
Since E207ScN was once cleaved with ScaI, it is estimated that the number of inserted ScaI sites is one.

【００９２】（１２）で得られたｐＡＧＥ２０７ＳｃＮ
の１μg をＹ−０緩衝液30μl に溶解し、20単位のKpnI
を加え、37℃で２時間消化反応を行なった。その後、塩
化ナトリウム濃度が100mM になるように塩化ナトリウム
を添加し、20単位のScaIを加え、さらに37℃で２時間消
化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動
後、約0.7kb のＤＮＡ断片を回収した。PAGE207ScN obtained in (12)
1 μg of the above was dissolved in 30 μl of Y-0 buffer to obtain 20 units of KpnI.
Was added and the digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours. Then, sodium chloride was added so that the concentration of sodium chloride was 100 mM, 20 units of ScaI was added, and the digestion reaction was further carried out at 37 ° C. for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 0.7 kb was recovered.

【００９３】また、ｐＡＧＥ２０７ＳｃＮの１μg をＹ
−１００緩衝液 30 μl に溶解し、20単位のScaIと20単
位のClaIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。該
反応液をアガロースゲル電気泳動後、約0.9kb のＤＮＡ
断片を回収した。また別に、（１０）で得られたｐＡＭ
ｏＥＲＣ３の１μg をＹ−０緩衝液30μl に溶解し、20
単位のKpnIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。
その後、塩化ナトリウム濃度が100mM になるように塩化
ナトリウムを添加し、20単位のXhoIを加え、さらに37℃
で２時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲ
ル電気泳動後、約3.2kb のＤＮＡ断片を回収した。In addition, 1 μg of pAGE207ScN was added to Y.
It was dissolved in 30 μl of -100 buffer, 20 units of ScaI and 20 units of ClaI were added, and digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA of about 0.9 kb was obtained.
The fragments were collected. Separately, pAM obtained in (10)
Dissolve 1 μg of oERC3 in 30 μl of Y-0 buffer,
A unit of KpnI was added, and a digestion reaction was carried out at 37 ° C for 2 hours.
Then add sodium chloride to a sodium chloride concentration of 100 mM, add 20 units of XhoI, and then add 37 ° C.
The digestion reaction was carried out for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 3.2 kb was recovered.

【００９４】次に、特開平2-227075記載の方法により得
られたｐＡＧＥ１０７の１μg をＹ−１００緩衝液 30
μl に溶解し、20単位のXhoIと20単位のClaIを加え、37
℃で２時間消化反応を行なった。該反応液をアガロース
ゲル電気泳動後、約4.3kb のＤＮＡ断片を回収した。上
記で得られたｐＡＧＥ２０７ＳｃＮ由来のKpnI -ScaI断
片(0.7kb) 0.1 μgと同プラスミド由来のScaI-ClaI 断
片(0.9kb) 0.1 μg とｐＡＭｏＥＲＣ３由来のKpnI-Xho
I 断片(3.2kb) 0.3 μg とｐＡＧＥ１０７由来のXhoI-C
laI 断片(4.3kb)0.3μg とをＴ４リガーゼ緩衝液30μl
に溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ175 単位を加えて、12℃
で16時間結合反応を行なった。Next, 1 μg of pAGE107 obtained by the method described in JP-A-2-227075 was added to Y-100 buffer solution.
Dissolve in μl, add 20 units of XhoI and 20 units of ClaI,
The digestion reaction was carried out at 0 ° C for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 4.3 kb was recovered. 0.1 μg of KpnI-ScaI fragment (0.7 kb) derived from pAGE207ScN obtained above and 0.1 μg of ScaI-ClaI fragment (0.9 kb) derived from the same plasmid and KpnI-Xho derived from pAMoERC3
0.3 μg of I fragment (3.2 kb) and XhoI-C derived from pAGE107
0.3 μg of laI fragment (4.3 kb) and 30 μl of T4 ligase buffer
And 175 units of T4 DNA ligase,
The binding reaction was carried out for 16 hours.

【００９５】該反応液を用いて大腸菌HB101 株をコーエ
ンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を
得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミ
ドを単離した。このプラスミドをｐＡＭｏＣ３Ｓｃと名
付け、その構造を制限酵素消化により確認した。Escherichia coli HB101 strain was transformed with the reaction solution by the method of Cohen et al. To obtain an ampicillin resistant strain. A plasmid was isolated from this transformant according to a known method. This plasmid was named pAMoC3Sc, and its structure was confirmed by digestion with restriction enzymes.

【００９６】（１４）ｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃの造成
（図１４参照） （１０）で得られたｐＡＭｏＥＲＣ３の１μg をＹ−０
緩衝液30μl に溶解し、20単位のKpnIを加え、37℃で２
時間消化反応を行なった。その後、塩化ナトリウム濃度
が150mM になるように塩化ナトリウムを添加し、20単位
のMluIを加え、さらに37℃で２時間消化反応を行なっ
た。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約6.8kb の
ＤＮＡ断片を回収した。(14) Construction of pAMoERC3Sc
(See FIG. 14) 1 μg of pAMoERC3 obtained in (10) was added to Y-0.
Dissolve in 30 μl of buffer, add 20 units of KpnI, and add 2 at 37 ℃.
A time digestion reaction was performed. Then, sodium chloride was added so that the sodium chloride concentration would be 150 mM, 20 units of MluI was added, and the digestion reaction was further carried out at 37 ° C. for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 6.8 kb was recovered.

【００９７】また、ｐＡＭｏＥＲＣ３の１μg をＹ−１
５０緩衝液 30 μl に溶解し、20単位のXhoIと20単位の
MluIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。該反応
液をアガロースゲル電気泳動後、約1.3kb のＤＮＡ断片
を回収した。また別に、ｐＡＭｏＣ３Ｓｃの１μg をＹ
−０緩衝液30μl に溶解し、20単位のKpnIを加え、37℃
で２時間消化反応を行なった。その後、塩化ナトリウム
濃度が100mM になるように塩化ナトリウムを添加し、20
単位のXhoIを加え、さらに37℃で２時間消化反応を行な
った。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約5.9kb
のＤＮＡ断片を回収した。Also, 1 μg of pAMoERC3 was added to Y-1.
Dissolve in 30 μl of 50 buffer and add 20 units of XhoI and 20 units of
MluI was added and the digestion reaction was performed at 37 ° C. for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 1.3 kb was recovered. Separately, 1 μg of pAMoC3Sc was added to Y
-Dissolve in 30 μl of 0 buffer solution, add 20 units of KpnI, and
The digestion reaction was carried out for 2 hours. Then, add sodium chloride so that the sodium chloride concentration becomes 100 mM, and
A unit of XhoI was added, and the digestion reaction was further performed at 37 ° C. for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, about 5.9 kb
Was recovered.

【００９８】上記で得られたｐＡＭｏＥＲＣ３由来のKp
nI-MluI 断片(6.8kb) 0.2 μg と同プラスミド由来のXh
oI-MluI 断片(1.3kb) 0.05μg とｐＡＭｏＣ３Ｓｃ由来
のKpnI-XhoI 断片(5.9kb) 0.2 μg とをＴ４リガーゼ緩
衝液30μl に溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ175 単位を加
えて、12℃で16時間結合反応を行なった。該反応液を用
いて大腸菌HB101 株をコーエンらの方法によって形質転
換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換株から
公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプラス
ミドをｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃと名付け、その構造を制限
酵素消化により確認した。Kp derived from pAMoERC3 obtained above
0.2 μg of nI-MluI fragment (6.8 kb) and Xh derived from the same plasmid
0.05 μg of oI-MluI fragment (1.3 kb) and 0.2 μg of KpnI-XhoI fragment (5.9 kb) derived from pAMoC3Sc were dissolved in 30 μl of T4 ligase buffer, 175 units of T4 DNA ligase was added, and the reaction was carried out at 12 ° C. for 16 hours. Was done. Escherichia coli HB101 strain was transformed with the reaction solution by the method of Cohen et al. To obtain an ampicillin resistant strain. A plasmid was isolated from this transformant according to a known method. This plasmid was named pAMoERC3Sc, and its structure was confirmed by restriction enzyme digestion.

【００９９】ｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃは、異種遺伝子発現
用のプロモーターとして、モロニー・マウス白血病ウイ
ルスのロング・ターミナル・リピート（long terminal
repeat ）を有している。また、異種遺伝子の効率良い
発現のために、ラビットβグロビン遺伝子スプライシン
グシグナル、ラビットβグロビン遺伝子ポリＡ付加シグ
ナルおよびＳＶ４０初期遺伝子ポリＡ付加シグナルが、
挿入する異種遺伝子のうしろに付加するように設計され
ている。また、動物細胞用の薬剤耐性マーカーとしてＧ
４１８耐性遺伝子を、大腸菌用の薬剤耐性マーカーとし
てカナマイシン耐性遺伝子（Ｇ４１８耐性遺伝子と同じ
もの）とアンピシリン耐性遺伝子をそれぞれ有してい
る。さらに、エプスタイン・バール・ウイルス（Epstei
n-Barr virus）の複製開始点（ｏｒｉＰ）とｏｒｉＰに
トランスに作用し複製を引き起こす因子であるＥＢＮＡ
−１遺伝子とを有するため、ナマルバ細胞をはじめとし
て齧歯類を除く多くの細胞中で、染色体に組み込まれる
ことなくプラスミドの状態で存在することが可能であ
る。PAMoERC3Sc is a long terminal repeat of Moloney murine leukemia virus as a promoter for expressing a heterologous gene.
repeat). Further, for efficient expression of a heterologous gene, a rabbit β globin gene splicing signal, a rabbit β globin gene poly A addition signal and an SV40 early gene poly A addition signal are
It is designed to be added behind a heterologous gene to be inserted. G is used as a drug resistance marker for animal cells.
It has a kanamycin resistance gene (the same as the G418 resistance gene) and an ampicillin resistance gene as a drug resistance marker for E. coli. In addition, the Epstein Barr virus (Epstei
n-Barr virus) origin of replication (oriP) and EBNA, a factor that acts in trans on oriP and causes replication
Since it has the -1 gene, it can exist in the form of a plasmid without being integrated into the chromosome in many cells except rodents including Namalwa cells.

【０１００】２．ナマルバ細胞のヒママメレクチン１２
０に対する耐性度の検討 無血清培地馴化ナマルバ細胞（ＫＪＭ−１株）〔細井
ら、サイトテクノロジー(Cytotechnology),1,151(1988)
〕を種々の濃度のヒママメレクチン１２０存在下で培
養し、ＫＪＭ−１株のヒママメレクチン１２０に対する
耐性度を調べた。ＫＪＭ−１株をＲＰＭＩ１６４０・Ｉ
ＴＰＳＧＦ培地〔7.5%炭酸水素ナトリウムを1/40量、 2
00mM Ｌ−グルタミン溶液 (GIBCO 社製) を3%、ペニシ
リン・ストレプトマイシン溶液 (GIBCO 社製、5000 unit
s/ml ペニシリン、 5000μg/ml ストレプトマイシン)
を0.5%、 Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’
−２−エタンスルホン酸(N-(2-hydroxyethyl)piperazin
e-N'-2-ethanesulfonic acid; HEPES)（10mM）、インシ
ュリン（３μg/ml）、トランスフェリン（５μg/ml）、
ピルビン酸ナトリウム（5mM ）、セレン酸ナトリウム
（125nM ）、ガラクトース（1mg/ml）、プルロニックＦ
６８（0.1% w/v）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（日水製
薬社製）〕で 5×10⁴ 細胞/ml の濃度になるように懸濁
し、96穴マイクロタイタープレートに200 μl ずつ分注
した。そこに各種濃度のヒママメレクチン１２０（生化
学工業社製）を 1/100量ずつ添加し、 CO₂インキュベー
ター中で37℃で１〜２週間培養した。その結果、ＫＪＭ
−１株の成育を完全に阻止するヒママメレクチン１２０
の最小濃度は50ng/ml であった。400 万個のＫＪＭ−１
株について調べたところ、この濃度において、ヒママメ
レクチン１２０耐性株の自然発祥的な出現は認められな
かった。2. Namaluba cell chickpea lectin 12
Examination of degree of resistance to 0 Namalwa cells conditioned in serum-free medium (KJM-1 strain) [Hosoi et al., Cytotechnology, 1, 151 (1988)
] Was cultured in the presence of various concentrations of Himameme lectin 120, and the degree of resistance of KJM-1 strain to Himameme lectin 120 was examined. KJM-1 strain as RPMI1640.I
TPSGF medium [1/40 volume of 7.5% sodium bicarbonate, 2
3% of 00 mM L-glutamine solution (GIBCO), penicillin / streptomycin solution (GIBCO, 5000 unit)
s / ml penicillin, 5000 μg / ml streptomycin)
0.5%, N-2-hydroxyethylpiperazine-N '
-2-ethanesulfonic acid (N- (2-hydroxyethyl) piperazin
e-N'-2-ethanesulfonic acid; HEPES) (10 mM), insulin (3 μg / ml), transferrin (5 μg / ml),
Sodium pyruvate (5 mM), sodium selenate (125 nM), galactose (1 mg / ml), Pluronic F
RPMI1640 medium containing 68 (0.1% w / v) (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.)] was suspended at a concentration of 5 × 10 ⁴ cells / ml, and 200 μl of the suspension was dispensed into a 96-well microtiter plate. Himame lectin 120 (manufactured by Seikagaku Corporation) at various concentrations was added thereto in an amount of 1/100, and the mixture was cultured in a CO ₂ incubator at 37 ° C for 1 to 2 weeks. As a result, KJM
-1 Strained lentil lectin 120 that completely prevents the growth of 1 strain
The minimum concentration was 50 ng / ml. 4 million KJM-1
When the strains were examined, no spontaneous occurrence of Himalayan lectin 120-resistant strains was observed at this concentration.

【０１０１】３．ヒト組織球腫細胞株ＴＹＨ由来のα２
→３シアリルトランスフェラーゼｃＤＮＡ（ＬＥＣ）の
クローン化 （１）ヒト組織球腫細胞株であるＴＹＨ細胞からのｍＲ
ＮＡの取得 １×10⁸ 個のＴＹＨ細胞〔Haranakaら：インターナショ
ナル・ジャーナル・オブ・キャンサー(Int.J.Cancer),3
6,313(1985) 〕より、インビトロジェン (Invitrogen)
社製のｍＲＮＡ抽出キットであるFast Track (商品番号
K1593-02) を用いて、約40μg のｍＲＮＡを取得した。3. Α2 derived from human histiocytoma cell line TYH
→ 3 Cloning of sialyltransferase cDNA (LEC) (1) mR from TYH cells, a human histiocytoma cell line
Acquisition of NA 1 × 10 ⁸ TYH cells [Haranaka et al .: International Journal of Cancer, Int. J. Cancer , 3
6, 313 (1985)], Invitrogen
Fast Track (product number)
Using K1593-02), about 40 μg of mRNA was obtained.

【０１０２】（２）ｃＤＮＡライブラリーの作製 （図
１５参照） 上記で得られたｍＲＮＡの８μg から、インビトロジェ
ン (Invitrogen) 社製のｃＤＮＡ合成キットであるThe
Librarian I を用いて、ランダム・プライマーをプライ
マーとして２本鎖ｃＤＮＡを合成した。その後、ｃＤＮ
Ａの両末端にＢｓｔＸＩリンカーの代わりに、以下に示
すＳｆｉＩ（配列番号５）リンカーを付与し、アガロー
スゲル電気泳動によりｃＤＮＡをサイズにより分画を行
ない、約1.2 kb以上のｃＤＮＡ断片を回収した。(2) Preparation of cDNA library (see FIG. 15) A cDNA synthesis kit manufactured by Invitrogen was prepared from 8 μg of the mRNA obtained above.
Double-stranded cDNA was synthesized using Librarian I using a random primer as a primer. Then cDN
Instead of the BstXI linker, the following SfiI (SEQ ID NO: 5) linker was added to both ends of A, and the cDNA was fractionated by agarose gel electrophoresis according to size to recover a cDNA fragment of about 1.2 kb or more.

【０１０３】[0103]

【化４】 [Chemical 4]

【０１０４】ＳｆｉＩリンカーの11mer と8merの１本鎖
ＤＮＡはそれぞれアプライド・バイオシステムズ社製の
３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。合成したＤ
ＮＡはそれぞれ50μg ずつ、別々にＴ４キナーゼ緩衝液
50μl に溶解し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒
造社製）30単位を加えて、37℃で16時間リン酸化反応を
行なった後に用いた。具体的試薬および方法は、Ｂｓｔ
ＸＩリンカーの代わりに、上記のＳｆｉＩリンカーを使
用した以外は、キットに付与されている説明書に従っ
た。The 11-mer and 8-mer single-stranded DNAs of SfiI linker were respectively synthesized using 380A DNA synthesizer manufactured by Applied Biosystems. Synthesized D
NA is 50 μg each, separately in T4 kinase buffer
It was dissolved in 50 μl, 30 units of T4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo) was added, and phosphorylation reaction was carried out at 37 ° C. for 16 hours before use. Specific reagents and methods are described in Bst
The instructions provided with the kit were followed, except that the SfiI linker described above was used instead of the XI linker.

【０１０５】また、直接発現クローニングベクター（Ex
pression Cloning Vector ）であるｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓ
ｃの 24 μg をＹ−５０緩衝液590 μl に溶解し、80単
位のSfiIを加え、37℃で16時間消化反応を行なった。こ
の反応液から５μl をとりアガロースゲル電気泳動にか
けて切断が完了したのを確認後、ｃＤＮＡライブラリー
造成時のｃＤＮＡインサートが挿入されていないクロー
ンの量を減少させるために、反応液に40単位のBamHI を
加え、さらに37℃で２時間消化反応を行なった。その
後、該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約11.5kbの
ＤＮＡ断片を回収した。In addition, a direct expression cloning vector (Ex
pAMoERC3S which is the compression cloning vector)
24 μg of c was dissolved in 590 μl of Y-50 buffer, 80 units of SfiI was added, and digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 16 hours. After taking 5 μl from this reaction mixture and confirming that the digestion was completed by agarose gel electrophoresis, 40 units of BamHI were added to the reaction mixture in order to reduce the amount of clones in which the cDNA insert was not inserted when the cDNA library was constructed. Was added and the digestion reaction was further carried out at 37 ° C. for 2 hours. Then, the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 11.5 kb was recovered.

【０１０６】上記で得られたｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃ由来
のSfiI断片(11.5kb) 2μg とｃＤＮＡとをＴ４リガーゼ
緩衝液 250μl に溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ2000単位
を加え、12℃で16時間結合反応を行なった。その後、ト
ランスファーＲＮＡ（tRNA）５μg を添加し、エタノー
ルで沈澱させた後、ＴＥ緩衝液20μl に溶解した。該反
応液を用いて大腸菌ＬＥ３９２株〔マニアティス (Mani
atis) ら編集：モレキュラー・クローニング (Molecula
r Cloning), 2.58,Cold Spring Harbor 1989年刊〕をエ
レクトロポーレーション法〔ウイリアム・ジェイ・ドゥ
ワー (WilliamJ.Dower)ら：ヌクレイック・アシッド・
リサーチ (Nucleic Acids Res.),16,6127(1988) 〕によ
り形質転換し、約20万個のアンピシリン耐性株を得た。2 μg of the SfiI fragment (11.5 kb) derived from pAMoERC3Sc obtained above and cDNA were dissolved in 250 μl of T4 ligase buffer, 2000 units of T4 DNA ligase was added, and a ligation reaction was carried out at 12 ° C. for 16 hours. Thereafter, 5 μg of transfer RNA (tRNA) was added, precipitated with ethanol, and then dissolved in 20 μl of TE buffer. Escherichia coli LE392 strain [Maniatis (Manitis)
Edited by atis): Molecular cloning (Molecula
r Cloning), 2.58, Cold Spring Harbor 1989) by the electroporation method [William J. Dower et al .: Nucleic Acid.
Research (Nucleic Acids Res.), 16 , 6127 (1988)] to obtain about 200,000 ampicillin-resistant strains.

【０１０７】（３）α２→３シアリルトランスフェラー
ゼｃＤＮＡ（ＬＥＣ）のクローン化 （２）で得られた約20万個のアンピシリン耐性株（ｃＤ
ＮＡライブラリー）を混合した後、キィアジェン (Qiag
en) 社製のプラスミド調製キットである>plasmid<maxi
kit （商品番号 41031 ）を用いてプラスミドを調製し
た。取得したプラスミドはエタノールで沈澱させた後、
１μg/μl になるようにＴＥ緩衝液に溶解した。(3) Cloning of α2 → 3 sialyltransferase cDNA (LEC) About 200,000 ampicillin-resistant strains (cDs) obtained in (2)
After mixing the NA library, Qiag (Qiag
en) 's plasmid preparation kit> plasmid <maxi
A plasmid was prepared using the kit (Product No. 41031). After the obtained plasmid was precipitated with ethanol,
It was dissolved in TE buffer so that the concentration was 1 μg / μl.

【０１０８】上記プラスミドは、エレクトロポーレーシ
ョン法〔Miyajiら：サイトテクノロジー(Cytotechnolog
y),3,133(1990)〕により、ＫＪＭ−１株に導入した。1.
6 ×10⁶ 細胞あたり４μg のプラスミドを導入後、8ml
のＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地に懸濁し、CO₂
インキュベーター中で37℃で24時間培養した。その後、
G418（ギブコ社製）を0.5mg/mlになるように添加してさ
らに５〜７日培養して形質転換株を得た。得られた形質
転換株は、ヒママメレクチン１２０（50ng/ml) が含ま
れたＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地で５×10⁴ 細
胞/ml になるように懸濁し、96穴マイクロタイタープレ
ートに200 μl ずつ分注した。 CO₂インキュベーター中
で37℃で２〜３週間培養した結果、ヒママメレクチン１
２０に耐性となった株が７株得られた。この耐性株より
ハート法〔ロバート・エフ・マーゴルスキー (Robert
F.Margolskee)ら：モレキュラー・アンド・セルラー・
バイオロジー (Mol.Cell.Biol.) ,8,2837(1988) 〕に従
って、プラスミドを回収し、エレクトロポーレーション
法〔ウイリアム・ジェイ・ドゥワー (William J.Dower)
ら：ヌクレイック・アシッド・リサーチ (Nucleic Ac
ids Res.),16,6127(1988) 〕により大腸菌ＬＥ３９２株
を形質転換した。この形質転換株よりキィアジェン (Qi
agen) 社製のプラスミド調製キットを用いてプラスミド
を調製し、その構造を各種制限酵素で切断して調べたと
ころ、約1.9kb のｃＤＮＡを含んでいた。このｃＤＮＡ
を含むプラスミドをｐＡＭｏＥＲＬと名付け、これを上
記の方法で再度ＫＪＭ−１株に導入したところ、再びヒ
ママメレクチン１２０耐性となったことから、このｃＤ
ＮＡがレクチン耐性の原因遺伝子であることが明らかと
なった。ｐＡＭｏＥＲＬを導入したＫＪＭ−１株は200n
g/mlのヒママメレクチン１２０存在下でも成育が可能で
あった。The above plasmid was prepared by the electroporation method [Miyaji et al .: Cytotechnolog
y) , 3 , 133 (1990)]. 1.
8 ml after introducing 4 μg of plasmid per 6 × 10 ⁶ cells
Suspended in RPMI1640-ITPSGF medium and CO ₂
It culture | cultivated at 37 degreeC in the incubator for 24 hours. afterwards,
G418 (manufactured by Gibco) was added at 0.5 mg / ml and the cells were further cultured for 5 to 7 days to obtain a transformant. The transformant thus obtained was suspended in RPMI1640-ITPSGF medium containing Himameme lectin 120 (50 ng / ml) at 5 × 10 ⁴ cells / ml, and 200 μl of each suspension was placed in a 96-well microtiter plate. I made a note. As a result of culturing at 37 ° C for 2-3 weeks in a CO ₂ incubator, linden lectin 1
Seven strains that became resistant to 20 were obtained. From this resistant strain, the Hart method [Robert F. Margolsky (Robert
F. Margolskee) et al: Molecular and Cellular
Biology (Mol.Cell.Biol.) , 8,2837 (1988)], the plasmid was recovered and electroporated [William J. Dower].
Et al: Nucleic Ac Research
ids Res.), 16 , 6127 (1988)], and E. coli LE392 strain was transformed. From this transformant, Qiagen (Qi
A plasmid was prepared using a plasmid preparation kit manufactured by agen), and its structure was cleaved with various restriction enzymes and examined. As a result, it was found to contain about 1.9 kb of cDNA. This cDNA
The plasmid containing pAMoERL was named pAMoERL, and was introduced into the KJM-1 strain again by the method described above.
It was revealed that NA is the causative gene of lectin resistance. The KJM-1 strain introduced with pAMoERL is 200n
It was possible to grow even in the presence of g / ml Himame lectin 120.

【０１０９】４．α２→３シアリルトランスフェラーゼ
ｃＤＮＡ（ＬＥＣ）の塩基配列の決定 （１）α２→３シアリルトランスフェラーゼｃＤＮＡ
（ＬＥＣ）のｐＵＣ１１９への組み込み（図１６参照） ３（３）で得られたｐＡＭｏＥＲＬの１μg をＹ−１０
０緩衝液30μl に溶解し、20単位のEcoRV と20単位のAs
p718〔ベーリンガー・マンハイム(BoehringerMannheim)
社製〕を加え、37℃で２時間消化反応を行なった。該
反応液をアガロースゲル電気泳動後、約1.97kbのＤＮＡ
断片を回収した。4. Determination of base sequence of α2 → 3 sialyltransferase cDNA (LEC) (1) α2 → 3 sialyltransferase cDNA
Incorporation of (LEC) into pUC119 (see FIG. 16) 3 μg of pAMoERL obtained in (3) was added to Y-10
Dissolve in 30 μl of 0 buffer, 20 units of EcoRV and 20 units of As
p718 (Boehringer Mannheim)
Manufactured by the company) was added and the digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA of about 1.97 kb was obtained.
The fragments were collected.

【０１１０】また、ｐＵＣ１１９〔メッシング(Messin
g) ら：メソッド・イン・エンザイモロジー (Methods i
n Enzymology),153,3(1987)〕１μg をＫ−２０緩衝液
30 μl に溶解し、20単位のSmaIを加え、37℃で２時間
消化反応を行なった。その後、塩化ナトリウム濃度が10
0mM になるように塩化ナトリウムを添加し、20単位のAs
p718を加え、さらに37℃で２時間消化反応を行なった。
該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約3.16kbのＤＮ
Ａ断片を回収した。In addition, pUC119 [Messing (Messin
g) et al .: Methods in Enzymology (Methods i
n Enzymology) , 153 , 3 (1987)] 1 μg in K-20 buffer
It was dissolved in 30 μl, 20 units of SmaI was added, and a digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours. After that, the sodium chloride concentration is 10
Sodium chloride was added to 0 mM and 20 units of As
p718 was added, and the digestion reaction was further carried out at 37 ° C for 2 hours.
After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, DN of about 3.16 kb was obtained.
The A fragment was recovered.

【０１１１】上記で得られたｐＡＭｏＥＲＬ由来のEcoR
V-Asp718断片(1.97kb) 0.2μg とｐＵＣ１１９由来のSm
aI-Asp718 断片(3.16kb) 0.1μg とをＴ４リガーゼ緩衝
液30μl に溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ175 単位を加え
て、12℃で16時間結合反応を行なった。該反応液を用い
て大腸菌HB101 株をコーエンらの方法によって形質転換
し、アンピシリンに耐性な株を得た。この形質転換株か
ら公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプラ
スミドをｐＵＣ１１９−ＬＥＣと名付け、その構造を制
限酵素消化により確認した。EcoR from pAMoERL obtained above
0.2 μg of V-Asp718 fragment (1.97 kb) and Sm derived from pUC119
0.1 μg of aI-Asp718 fragment (3.16 kb) was dissolved in 30 μl of T4 ligase buffer, 175 units of T4 DNA ligase was added, and a ligation reaction was carried out at 12 ° C. for 16 hours. Escherichia coli HB101 strain was transformed with the reaction solution by the method of Cohen et al. To obtain a strain resistant to ampicillin. A plasmid was isolated from this transformant according to a known method. This plasmid was named pUC119-LEC, and its structure was confirmed by restriction enzyme digestion.

【０１１２】（２）塩基配列決定用デレーションプラス
ミドの造成 上記（１）で得られたｐＵＣ１１９−ＬＥＣの２μg を
Ｙ−１５０緩衝液30μl に溶解し、20単位のBamHI と20
単位のSphIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。
エタノールで沈澱させた後、ExoIII Buffer （宝酒造社
製のキロシークエンス用デレーションキット）100 μl
に溶解した。また、ｐＵＣ１１９−ＬＥＣの２μg をＹ
−０緩衝液 30 μl に溶解し、20単位のSacIを加え、37
℃で２時間消化反応を行なった。その後、塩化ナトリウ
ム濃度が150mM になるように塩化ナトリウムを添加し、
20単位のNotIを加え、さらに37℃で２時間消化反応を行
なった。エタノールで沈澱させた後、ExoIII Buffer 10
0 μl に溶解した。(2) Construction of deletion plasmid for nucleotide sequence determination 2 μg of pUC119-LEC obtained in the above (1) was dissolved in 30 μl of Y-150 buffer to prepare 20 units of BamHI and 20 units.
A unit of SphI was added, and a digestion reaction was carried out at 37 ° C for 2 hours.
After precipitating with ethanol, 100 μl of ExoIII Buffer (Takara Shuzo's deletion kit for kilosequencing)
Dissolved in. In addition, 2 μg of pUC119-LEC was added to Y.
-Dissolve in 30 μl of 0 buffer, add 20 units of SacI,
The digestion reaction was carried out at 0 ° C for 2 hours. After that, add sodium chloride so that the sodium chloride concentration becomes 150 mM,
20 units of NotI was added, and the digestion reaction was further carried out at 37 ° C for 2 hours. After precipitation with ethanol, ExoIII Buffer 10
It was dissolved in 0 μl.

【０１１３】上記で得られたｐＵＣ１１９−ＬＥＣ由来
の BamHI-SphI 断片およびSacI-NotI 断片より、宝酒造
社製のキロシークエンス用デレーションキットを用い
て、それぞれ数十種のデレーションプラスミドを作成し
た。上記で得られたデレーションプラスミドの塩基配列
は、アプライド・バイオシステムズ社のTaq DyeDeoxy T
erminator Cycle Sequencing Kit（商標番号401113）を
用いて決定した。決定した塩基配列を配列番号１に示し
た。またそのアミノ酸配列より、このタンパク質がグリ
コシルトランスフェラーゼ（以下、GTと略記する）に共
通な構造を有することが明らかになった。すなわち、Ｎ
末の８アミノ酸を細胞質側にだし、それに続く１８アミ
ノ酸からなる疎水性に富む領域で膜に結合し、触媒部位
を含む残りの大半のＣ末部分をゴルジ体内腔に露出する
といった構造をとっていると考えられる。他のGTとアミ
ノ酸配列を比較したところ、ラットのα２→６シアリル
トランスフェラーゼと相同性があることも判明した。以
上のことから、ヒママメレクチン１２０耐性遺伝子は、
GTをコードしていると考えられる。From the pUC119-LEC-derived BamHI-SphI fragment and SacI-NotI fragment obtained above, several tens of deletion plasmids were prepared using the Kairokusetsu delation kit manufactured by Takara Shuzo. The nucleotide sequence of the deletion plasmid obtained above is Taq DyeDeoxy T of Applied Biosystems.
It was determined using the erminator Cycle Sequencing Kit (trademark number 401113). The determined nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 1. In addition, it was revealed from the amino acid sequence that this protein has a structure common to glycosyltransferases (hereinafter abbreviated as GT). That is, N
The structure is such that the last 8 amino acids are exposed to the cytoplasmic side, and the subsequent 18 amino acids, which are rich in hydrophobicity, are bound to the membrane, and most of the remaining C-terminal portion including the catalytic site is exposed to the Golgi body lumen. It is believed that When amino acid sequences were compared with those of other GTs, it was also found to have homology with rat α2 → 6 sialyltransferase. From the above, the Himaima lectin 120 resistance gene is
It is considered to code GT.

【０１１４】５．ヒママメレクチン１２０耐性遺伝子発
現プラスミドを導入したＫＪＭ−１株のα２→３シアリ
ルトランスフェラーゼ活性の測定 ４で得られたｐＡＭｏＥＲＬを導入したＫＪＭ−１株を
G418を0.5mg/ml含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧＦ培
地30mlに５×10⁵ 細胞/ml になるように懸濁し、CO₂ イ
ンキュベーター中で37℃で３日間培養した。培養後、16
0 ×g で10分間遠心分離することにより細胞を集め、Ｐ
ＢＳ〔8g/l塩化ナトリウム, 0.2g/l塩化カリウム, 1.15
g/l 無水リン酸１水素ナトリウム, 0.2g/lリン酸２水素
カリウム〕10mlで洗浄後、再度遠心し分離して細胞を集
めた。5. Measurement of α2 → 3 sialyltransferase activity of the KJM-1 strain into which the chickpea lectin 120 resistance gene expression plasmid was introduced.
The cells were suspended in 30 ml of RPMI1640 / ITPSGF medium containing 0.5 mg / ml of G418 at 5 × 10 ⁵ cells / ml, and cultured in a CO ₂ incubator at 37 ° C. for 3 days. 16 after culture
Collect cells by centrifugation at 0 xg for 10 minutes and
BS [8g / l sodium chloride, 0.2g / l potassium chloride, 1.15
The cells were collected by washing with 10 ml of g / l sodium dihydrogen phosphate anhydrous, 0.2 g / l potassium dihydrogen phosphate], followed by centrifugation again.

【０１１５】上記で得られた細胞の約1.4 ×10⁷ 個にホ
モジナイズ用緩衝液〔250mM サッカロース，10mM トリ
ス−塩酸 (pH7.4)〕100 μl を加えて懸濁した後、超音
波により細胞を破砕した。破砕液を550 × gで10分間遠
心分離し上清を取得した。また、コントロールとしてベ
クターであるｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃを導入したＫＪＭ−
１株を作成し、同様にして上清を取得した。About 1.4 × 10 ⁷ cells obtained above were suspended by adding 100 μl of a homogenization buffer [250 mM saccharose, 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.4)], and the cells were sonicated. Crushed. The disrupted liquid was centrifuged at 550 x g for 10 minutes to obtain a supernatant. As a control, KJM-introduced with vector pAMoERC3Sc
One strain was prepared and the supernatant was obtained in the same manner.

【０１１６】上記で得られた２種類の上清のそれぞれ20
μl を用いて最終容量50μl のアッセイ溶液〔0.1Mカコ
ジル酸−塩酸 (pH6.5), 0.01M 塩化マンガン，0.45% ト
ライトンX-100, 0.08mM 基質,5mM CMP- シアル酸 (添加
あるいは無添加) 〕中で、37℃、２時間反応させた後、
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により生産物
の同定を行なうことによりそれぞれの上清中のα２→３
シアリルトランスフェラーゼ活性を測定した。活性測定
に用いた上清のタンパク質の量は200 μg であり、タン
パク質の定量はBCA Protein Assay Reagent (PIERCE 社
製) を用いて行った。基質としてはアミノピリジンで蛍
光標識した糖鎖（Gal β１→４GlcNAcβ１→３Gal β１
→４Glc- アミノピリジン）を用いた。基質の蛍光標識
は、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（バイオカーブ社
製）を用いて、常法〔Akimoto Kondo ら：アグリカルチ
ュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー(Agri
c.Biol.Chem.),54,2169(1990)〕に従って行なった。そ
れぞれの上清について、糖供与体であるCMP-シアル酸を
含むアッセイ溶液と含まないアッセイ溶液を用いてそれ
ぞれ反応させた後、反応液をそれぞれＨＰＬＣで分離
し、CMP-シアル酸が含まれたアッセイ溶液でのみ出現す
るピークを生成物とした。反応の終了したアッセイ溶液
は、100 ℃で５分間処理後、10000 ×g で10分間遠心分
離し、その上清をＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣは、ＴＳ
Ｋｇｅｌ ＯＤＳ- ８０Ｔ_M カラム（4.6mm ×30cm；To
soh 社製）を使用し、0.02M 酢酸アンモニウム緩衝液
(pH4.0)を用い、溶出温度50℃、流速 1ml/ 分で溶出を
行なった。生成物の検出は、島津製作所製のFluorescen
ce HPLC Monitor (RF-535T) を用いて行なった（励起波
長320nM 、放射波長400nM ）。その結果、図１７に示す
ように生成物としてピーク１とピーク２が検出された。
スタンダードと溶出時間が一致すること、および生成物
をシアリダーゼ処理した時に基質が再生成することか
ら、ピーク１が NeuAcα２→６Galβ１→４GlcNAcβ１
→３Gal β１→４Glc −アミノピリジンで、ピーク２が
NeuAc α２→３Gal β１→４GlcNAc β１→３Gal β１
→４Glc−アミノピリジンであることが明らかとなっ
た。生成物のシアリダーゼ処理は以下のようにして行な
った。前述の上清10μl をＨＰＬＣにかけてピーク１と
ピーク２をそれぞれ分取し、凍結乾燥後、20mM トリス
−マレイン酸 (pH6.0), 1mM クエン酸カルシウムからな
る緩衝液50μl に溶解した。次いで、その溶解液20μl
に400mU/mlシアリダーゼ（neuraminidase,シグマ社製，
N-2133）を２μl 加え、37℃で16時間反応を行なった。
また、コントロールとして、シアリダーゼの代わりに水
を２μl 加え、同様に反応を行なった。反応の終了した
溶液は、100 ℃で5 分処理後、10000 × gで10分間遠心
分離し、その上清10μl を前述のＨＰＬＣに供した。そ
の結果を図１８に示す。ピーク１においてもピーク２に
おいても、シアリダーゼ処理により生成物としてピーク
３が検出された。ピーク３はその溶出時間から基質であ
るGal β１→４GlcNAc β１→３Gal β１→４Glc−アミ
ノピリジンであると考えられる。20 of each of the two types of supernatants obtained above
Use a final volume of 50 μl of assay solution (0.1 M cacodylic acid-hydrochloric acid (pH 6.5), 0.01 M manganese chloride, 0.45% Triton X-100, 0.08 mM substrate, 5 mM CMP-sialic acid (added or not added). ], After reacting at 37 ° C. for 2 hours,
By identifying the product by high performance liquid chromatography (HPLC), α2 → 3 in each supernatant
Sialyltransferase activity was measured. The amount of the protein in the supernatant used for the activity measurement was 200 μg, and the protein was quantified using BCA Protein Assay Reagent (PIERCE). As a substrate, a sugar chain fluorescently labeled with aminopyridine (Gal β1 → 4GlcNAcβ1 → 3Gal β1
→ 4Glc-aminopyridine) was used. Fluorescent labeling of the substrate was carried out using lacto-N-neotetraose (manufactured by Biocarb) in a conventional method [Akimoto Kondo et al .: Agricultural and Biological Chemistry (Agri.
c. Biol. Chem.) , 54, 2169 (1990)]. After reacting each supernatant with an assay solution containing a sugar donor, CMP-sialic acid, and an assay solution containing no sugar donor, the reaction solutions were separated by HPLC to contain CMP-sialic acid. The peak was the product that appeared only in the assay solution. The assay solution after the reaction was treated at 100 ° C. for 5 minutes and then centrifuged at 10,000 × g for 10 minutes, and the supernatant was subjected to HPLC. HPLC is TS
Kgel ODS-80T _M column (4.6mm x 30cm; To
0.02M ammonium acetate buffer solution
Elution was performed using (pH 4.0) at an elution temperature of 50 ° C. and a flow rate of 1 ml / min. Fluorescen manufactured by Shimadzu is used for product detection.
It was performed using a ce HPLC Monitor (RF-535T) (excitation wavelength 320 nM, emission wavelength 400 nM). As a result, as shown in FIG. 17, peak 1 and peak 2 were detected as products.
Peak 1 is NeuAcα2 → 6Galβ1 → 4GlcNAcβ1 because the elution time matches that of the standard and the substrate is regenerated when the product is treated with sialidase.
→ 3Gal β1 → 4Glc-Aminopyridine with peak 2
NeuAc α2 → 3Gal β1 → 4GlcNAc β1 → 3Gal β1
→ It was revealed to be 4Glc-aminopyridine. The sialidase treatment of the product was performed as follows. 10 μl of the above-mentioned supernatant was subjected to HPLC to separate peak 1 and peak 2, and each was lyophilized and then dissolved in 50 μl of a buffer solution containing 20 mM tris-maleic acid (pH 6.0) and 1 mM calcium citrate. Then 20 μl of the lysate
400 mU / ml sialidase (neuraminidase, manufactured by Sigma,
2 μl of N-2133) was added and the reaction was carried out at 37 ° C. for 16 hours.
As a control, 2 μl of water was added instead of sialidase, and the reaction was performed in the same manner. The solution after the reaction was treated at 100 ° C. for 5 minutes and then centrifuged at 10,000 × g for 10 minutes, and 10 μl of the supernatant was subjected to the above-mentioned HPLC. The result is shown in FIG. In both peak 1 and peak 2, peak 3 was detected as a product by the sialidase treatment. Peak 3 is considered to be Gal β1 → 4GlcNAc β1 → 3Gal β1 → 4Glc-aminopyridine which is the substrate from the elution time.

【０１１７】ｐＡＭｏＥＲＬを導入したＫＪＭ−１株
と、ベクターであるｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃを導入したＫ
ＪＭ−１株のＨＰＬＣパターンを比較すると、ピーク１
に関してはほぼ等しいのに対し、ピーク２においては、
ｐＡＭｏＥＲＬを導入したものの方が有意に高かった。
ｐＡＭｏＥＲＬを導入したＫＪＭ−１株のピーク１に対
するピーク２の比は、ベクターであるｐＡＭｏＥＲＣ３
Ｓｃを導入したＫＪＭ−１株の場合の比の６〜７倍であ
った（図１７参照）。以上の結果から、このヒママメレ
クチン耐性遺伝子はα２→３シアリルトランスフェラー
ゼ遺伝子であること、および当該遺伝子がコードするα
２→３シアリルトランスフェラーゼを用いてシアル酸を
付加したオリゴ糖を製造できることが示された。KJM-1 strain into which pAMoERL was introduced, and K into which the vector pAMoERC3Sc was introduced.
Comparing the HPLC patterns of JM-1 strain, peak 1
Are almost equal to each other, while in peak 2,
The pAMoERL introduced was significantly higher.
The ratio of peak 2 to peak 1 of the KJM-1 strain into which pAMoERL was introduced is the vector pAMoERC3.
The ratio was 6 to 7 times that in the case of the KJM-1 strain introduced with Sc (see FIG. 17). From the above results, it is confirmed that this chickpea lectin resistance gene is the α2 → 3 sialyltransferase gene, and that α
It was shown that sialic acid-added oligosaccharides can be produced using 2 → 3 sialyltransferase.

【０１１８】実施例２ α２→３シアリルトランスフェラーゼ発現プラスミドを
導入したＫＪＭ−１株におけるSialyl-Le ^X の合成：実
施例１の３（３）で得られたｐＡＭｏＥＲＬおよび実施
例１の１（１４）で得られた直接発現クローニングベク
ターｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃをそれぞれ導入したＫＪＭ−
１株を、G418を0.5mg/ml含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰ
ＳＧＦ培地でそれぞれ培養後、それぞれ約１×10⁶ 個の
細胞をマイクロチューブ（1.5 ml：エッペンドルフ社
製）にとり、550 ×g で７分間遠心分離し細胞を集め
た。次に、0.1 ％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ（以
下、Ａ−ＰＢＳと略記する）1ml で細胞を洗浄後、Sial
yl-Le ^X に対する単クローン性抗体であるＫＭ９３〔設
楽ら：アンチキャンサー・リサーチ (Anticancer Re
s.),9,999(1989)〕を用いて以下のようにして間接蛍光
抗体染色を行い、それぞれの細胞におけるSialyl-Le ^X
の発現を調べた。Example 2 Synthesis of Sialyl-Le ^X in KJM-1 strain into which α2 → 3 sialyltransferase expression plasmid was introduced: pAMoERL obtained in 3 (3) of Example 1 and 1 (14) of Example 1 KJM- into which the direct expression cloning vector pAMoERC3Sc obtained in
1 strain containing RPMI 1640 / ITP containing 0.5 mg / ml G418
After culturing in SGF medium, about 1 × 10 ⁶ cells were placed in a microtube (1.5 ml: manufactured by Eppendorf) and centrifuged at 550 × g for 7 minutes to collect the cells. Next, the cells were washed with 1 ml of PBS containing 0.1% sodium azide (hereinafter abbreviated as A-PBS), and then Sial.
KM93, a monoclonal antibody against yl-Le ^X [Shiratara et al .: Anticancer Research
s.) , 9 , 999 (1989)], and indirect fluorescent antibody staining was performed as follows, and Sialyl-Le ^X
Was examined.

【０１１９】それぞれの細胞に対し、ＫＭ９３を50μl
(10μg/ml) 加えて懸濁し、４℃で１時間反応させた。
次いで、細胞をＡ−ＰＢＳで３回洗浄後、フルオレセイ
ンイソチオシアネート(FITC)で蛍光標識した抗マウスＩ
ｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体（カッペル社製、Ａ−ＰＢＳ
で20倍に希釈して使用）20μl を加えて懸濁し、４℃で
30分間反応させた。反応後、細胞をＡ−ＰＢＳで３回洗
浄した後、再度Ａ−ＰＢＳに懸濁し、フローセルソータ
ーＦＣＳ−１（日本分光社製）で解析を行った。対照と
して、ＫＭ９３の代わりに正常マウス血清（Ａ−ＰＢＳ
で500 倍に希釈して使用）を用いて上記と同様に解析を
行った。結果を図１９に示す。直接発現クローニングベ
クターｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃを導入したＫＪＭ−１株に
おいて、ＫＭ９３で染色した細胞の蛍光強度は、対照の
蛍光強度よりも強い（図１９のａ）。このことは、ＫＪ
Ｍ−１株がもともとSialyl-Le ^X を発現していることを
示している。また、本発明のα２→３シアリルトランス
フェラーゼを発現するプラスミドｐＡＭｏＥＲＬを導入
したＫＪＭ−１株をＫＭ９３で染色した細胞の蛍光強度
は、ｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃを導入したＫＪＭ−１株より
もさらに強くなっている（図１９のｂ）。このことは、
本発明のα２→３シアリルトランスフェラーゼが、細胞
内でSialyl-Le ^X を合成していることを示している。50 μl of KM93 was added to each cell.
(10 μg / ml) was added and suspended, and the mixture was reacted at 4 ° C. for 1 hour.
Then, the cells were washed three times with A-PBS and then fluorescently labeled with anti-mouse I with fluorescein isothiocyanate (FITC).
gG antibody and IgM antibody (A-PBS manufactured by Kappel)
Use it after diluting it 20 times with 20 μl and suspend it at 4 ℃.
Allowed to react for 30 minutes. After the reaction, the cells were washed 3 times with A-PBS, suspended again in A-PBS, and analyzed with a flow cell sorter FCS-1 (manufactured by JASCO Corporation). As a control, normal mouse serum (A-PBS) was used instead of KM93.
Was used after diluting it by 500 times) and analyzed in the same manner as above. The results are shown in Fig. 19. In the KJM-1 strain into which the direct expression cloning vector pAMoERC3Sc was introduced, the fluorescence intensity of the cells stained with KM93 is stronger than that of the control (a in FIG. 19). This is KJ
It is shown that the M-1 strain originally expresses Sialyl-Le ^X. Moreover, the fluorescence intensity of the cells stained with KM93 of the KJM-1 strain into which the plasmid pAMoERL expressing the α2 → 3 sialyltransferase of the present invention was stained is higher than that of the KJM-1 strain into which pAMoERC3Sc was introduced (FIG. 19b). This is
It is shown that the α2 → 3 sialyltransferase of the present invention synthesizes Sialyl-Le ^X intracellularly.

【０１２０】実施例３ 動物細胞によるＴＹＨ細胞由来α２→３シアリルトラン
スフェラーゼの生産 １．α２→３シアリルトランスフェラーゼ分泌発現用プ
ラスミドｐＡＭｏＰＲＳＡＬ- ３５Ｆの造成 （１）ｐＡＧＥ１４７の造成 （図２０参照） 以下に示す方法に従って、ｐＡＧＥ１０７のSV40初期遺
伝子プロモーターをモロニー・マウス白血病ウイルスの
ロング・ターミナル・リピート（long terminal repea
t；LTR ）のプロモーターにすげかえたプラスミドｐＡ
ＧＥ１４７の造成を行なった。Example 3 Production of α2 → 3 sialyltransferase derived from TYH cells by animal cells 1. Construction of plasmid pAMoPRSAL-35F for expressing α2 → 3 sialyltransferase secretion (1) Construction of pAGE147 (see FIG. 20) According to the method shown below, the SV40 early gene promoter of pAGE107 was expressed as a long terminal repeat of Moloney murine leukemia virus (long terminal repeat). long terminal repea
t; LTR) promoter replaced by plasmid pA
Construction of GE147 was performed.

【０１２１】特開平1-63394 記載の方法で得られたプラ
スミドｐＰＭＯＬ１の２μg をＹ−０緩衝液30μl に溶
解し、20単位のSmaIを加え、30℃で３時間消化反応を行
った。その後、塩化ナトリウムを50mMになるように添加
し、20単位のClaIを加えて37℃で２時間消化反応を行っ
た。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、モロニー・
マウス白血病ウイルスのLTR プロモーターを含む約0.6k
b のDNA 断片を回収した。2 μg of the plasmid pPMOL1 obtained by the method described in JP-A-1-63394 was dissolved in 30 μl of Y-0 buffer, 20 units of SmaI was added, and digestion reaction was carried out at 30 ° C. for 3 hours. Then, sodium chloride was added to 50 mM, 20 units of ClaI was added, and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, Moloney
About 0.6k containing mouse leukemia virus LTR promoter
The DNA fragment of b was recovered.

【０１２２】次に、実施例１の１の（8)で合成した下記
の２種の合成DNANext, the following two kinds of synthetic DNAs synthesized in (8) of 1 of Example 1

【０１２３】[0123]

【化５】 [Chemical 5]

【０１２４】をそれぞれ25ピコモル(pmoles)ずつT4キナ
ーゼ緩衝液10μl に溶解し、5 単位のT4DNA キナーゼを
加え、37℃で30分間反応させることにより５’末端をリ
ン酸化した。上記で得られたｐＰＭＯＬ１由来のClaI-S
maI 断片(0.6kb)0.05 μg と５’リン酸化された２種の
合成DNA （１ピコモルずつ）およびHindIII リンカー
(5'-pCAAGCTTG-3'; 宝酒造社製) （１ピコモル）をT4リ
ガーゼ緩衝液30μl に溶解し、T4DNA リガーゼ200 単位
を加え、12℃で16時間結合反応を行った。エタノール沈
澱により該DNA 断片を回収した後、Ｙ−１００緩衝液に
溶解し、10単位のHindIII および10単位のXhoIを加えて
37℃で２時間消化反応を行った。反応をフェノール−ク
ロロホルム抽出により停止させ、エタノール沈澱により
該DNA 断片を回収した。25 pmoles (pmoles) of each were dissolved in 10 μl of T4 kinase buffer, 5 units of T4 DNA kinase was added, and the reaction was carried out at 37 ° C. for 30 minutes to phosphorylate the 5 ′ end. ClaI-S derived from pPMOL1 obtained above
0.05 μg of maI fragment (0.6 kb) and 2 kinds of 5'-phosphorylated synthetic DNA (1 pmol each) and HindIII linker
(5'-pCAAGCTTG-3 '; manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) (1 picomole) was dissolved in 30 μl of T4 ligase buffer, 200 units of T4 DNA ligase was added, and a ligation reaction was carried out at 12 ° C. for 16 hours. After recovering the DNA fragment by ethanol precipitation, it was dissolved in Y-100 buffer and added with 10 units of HindIII and 10 units of XhoI.
The digestion reaction was performed at 37 ° C for 2 hours. The reaction was stopped by phenol-chloroform extraction, and the DNA fragment was recovered by ethanol precipitation.

【０１２５】一方、ｐＡＧＥ１０７〔特開平３−２２９
７９、Miyajiら：サイトテクノロジー(Cytotechnolog
y)、３、１３３（１９９０）〕の１μg を30μl のＹ−
１００緩衝液に溶解し、10単位のHindIII と10単位のXh
oIを加えて37℃で２時間消化反応を行った。該反応液を
アガロースゲル電気泳動後、G418耐性遺伝子およびアン
ピシリン耐性遺伝子を含む約6.0kb のDNA 断片を回収し
た。On the other hand, pAGE107 [JP-A-3-229]
79, Miyaji et al .: Site Technology (Cytotechnolog
y), 3 , 133 (1990)] and 30 μl of Y-
Dissolve in 100 buffers, 10 units HindIII and 10 units Xh
oI was added and the digestion reaction was performed at 37 ° C. for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 6.0 kb containing the G418 resistance gene and the ampicillin resistance gene was recovered.

【０１２６】上記で得られたｐＡＧＥ１０７由来のHind
III-XhoI断片(6.0kb)0.3μg とｐＰＭＯＬ１由来のHind
III-XhoI断片(0.6kb)0.01 μg とをT4リガーゼ緩衝液20
μlに溶解し、T4DNA リガーゼ200 単位を加え、12℃で1
6時間結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌HB101
株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシ
リン耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法に従
ってプラスミドを単離した。このプラスミドをｐＡＧＥ
１４７と名付け、その構造を制限酵素消化により確認し
た。Hind from pAGE107 obtained above
III-XhoI fragment (6.0 kb) 0.3 μg and Hind derived from pPMOL1
III-XhoI fragment (0.6 kb) 0.01 μg with T4 ligase buffer 20
Dissolve in μl, add 200 units of T4 DNA ligase, and add 1 at 12 ℃.
The binding reaction was performed for 6 hours. E. coli HB101 using the reaction solution
The strain was transformed by the method of Cohen et al. To obtain an ampicillin resistant strain. A plasmid was isolated from this transformant according to a known method. This plasmid is called pAGE
It was named 147 and its structure was confirmed by digestion with restriction enzymes.

【０１２７】（２）ｐＡＧＥ２４７の造成 （図２１参
照） 以下の示す方法に従って、ｐＡＧＥ２０７のSV40初期遺
伝子プロモーターをモロニー・マウス白血病ウイルスの
ロング・ターミナル・リピート（long terminal repea
t：LTR ）のプロモーターにすげかえたプラスミドｐＡ
ＧＥ２４７の造成を行なった。(2) Construction of pAGE247 (see FIG. 21) According to the method described below, the SV40 early gene promoter of pAGE207 was used as a long terminal repeat of Moloney murine leukemia virus.
t: LTR) plasmid replaced with the promoter pA
Construction of GE247 was performed.

【０１２８】上記(1) で得られたｐＡＧＥ１４７の２μ
g を30μl のＹ−１００緩衝液に溶解し、10単位のHind
III と10単位のXhoIを加えて37℃で２時間消化反応を行
った。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、モロニー
・マウス白血病ウイルスのLTR プロモーターを含む約0.
63kbのDNA 断片を回収した。一方、実施例１の１（１
１）で得られたｐＡＧＥ２０７の２μg を30μl のＹ−
１００緩衝液に溶解し、10単位のHindIII と10単位のXh
oIとを加えて37℃で２時間消化反応を行った。該反応液
をアガロースゲル電気泳動後、hyg 耐性遺伝子およびア
ンピシリン耐性遺伝子を含む約5.84kbのDNA 断片を回収
した。2 μm of pAGE147 obtained in the above (1)
g was dissolved in 30 μl of Y-100 buffer and 10 units of Hind
III and 10 units of XhoI were added and the digestion reaction was carried out at 37 ° C for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, the reaction solution containing the LTR promoter of Moloney murine leukemia virus was about 0.
A 63 kb DNA fragment was recovered. On the other hand, 1 (1
2 μg of pAGE207 obtained in 1) was added to 30 μl of Y-
Dissolve in 100 buffers, 10 units HindIII and 10 units Xh
oI was added and the digestion reaction was carried out at 37 ° C for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 5.84 kb containing a hyg resistance gene and an ampicillin resistance gene was recovered.

【０１２９】上記で得られたｐＡＧＥ１４７由来のHind
III-XhoI断片(0.63kb)0.05μg とｐＡＧＥ２０７由来の
HindIII-XhoI断片(5.84kb)0.1 μg をT4リガーゼ緩衝液
30μl に溶解し、T4DNA リガーゼ100 単位を加え、12℃
で16時間結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌HB
101 株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピ
シリン耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法に
従ってプラスミドを単離した。このプラスミドをｐＡＧ
Ｅ２４７と名付け、その構造を制限酵素消化により確認
した。Hind from pAGE147 obtained above
III-XhoI fragment (0.63 kb) from 0.05 μg and pAGE207
0.1 μg of HindIII-XhoI fragment (5.84 kb) in T4 ligase buffer
Dissolve in 30 µl, add 100 units of T4 DNA ligase, and
The binding reaction was carried out for 16 hours. E. coli HB using the reaction solution
101 strains were transformed by the method of Cohen et al. To obtain ampicillin resistant strains. A plasmid was isolated from this transformant according to a known method. This plasmid is pAG
It was named E247 and its structure was confirmed by restriction enzyme digestion.

【０１３０】（３）ｐＡＭＮ６ｈｙｇの造成 （図２２
参照） 以下の方法に従って、モロニー・マウス白血病ウイルス
のLTR をプロモーターとし、hyg 耐性遺伝子をマーカー
として有するヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の発現
プラスミドｐＡＭＮ６ｈｙｇの造成を行なった。(3) Construction of pAMN6hyg (Fig. 22)
Reference) According to the following method, an expression plasmid pAMN6hyg of human granulocyte colony stimulating factor derivative having LTR of Moloney murine leukemia virus as a promoter and a hyg resistance gene as a marker was constructed.

【０１３１】上記(2) で得られたｐＡＧＥ２４７の２μ
g をＹ−５０緩衝液30μl に溶解し、20単位のClaIを加
え、37℃で２時間消化反応を行った。その後、塩化ナト
リウムを175mM になるように添加し、20単位のSalIを加
えて37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロ
ースゲル電気泳動後、モロニー・マウス白血病ウイルス
のLTR プロモーター、アンピシリン耐性遺伝子およびhy
g 耐性遺伝子を含む約4.8kb のDNA 断片を回収した。2 μm of pAGE247 obtained in the above (2)
g was dissolved in 30 μl of Y-50 buffer, 20 units of ClaI was added, and digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours. Then, sodium chloride was added to 175 mM, 20 units of SalI was added, and a digestion reaction was carried out at 37 ° C for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, Moloney murine leukemia virus LTR promoter, ampicillin resistance gene and hy
A DNA fragment of about 4.8 kb containing the g resistance gene was recovered.

【０１３２】一方、特開平2-227075記載の方法により得
られたプラスミドｐＡＳＮ６の２μg をＹ−５０緩衝液
30μl に溶解し、20単位のClaIを加え、37℃で２時間消
化反応を行った。その後、塩化ナトリウムを175mM にな
るように添加し、20単位のSalIと20単位のMluIを加えて
37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロース
ゲル電気泳動後、ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体遺
伝子を含む約5.0kb のDNA 断片を回収した。On the other hand, 2 μg of the plasmid pASN6 obtained by the method described in JP-A-2-227075 was added to Y-50 buffer solution.
It was dissolved in 30 μl, 20 units of ClaI was added, and a digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours. Then add sodium chloride to 175 mM and add 20 units SalI and 20 units MluI.
The digestion reaction was performed at 37 ° C for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 5.0 kb containing a human granulocyte colony stimulating factor derivative gene was recovered.

【０１３３】上記で得られたｐＡＧＥ２４７由来のClaI
-SalI 断片(4.8kb) 0.1 μg とｐＡＳＮ６由来のClaI-S
alI 断片(5.0kb) 0.1 μg とをT4リガーゼ緩衝液20μl
に溶解し、T4DNA リガーゼ200 単位を加え、12℃で16時
間結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌HB101 株
をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン
耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法に従って
プラスミドを単離した。このプラスミドをｐＡＭＮ６ｈ
ｙｇと名付け、その構造を制限酵素消化により確認し
た。ClaI from pAGE247 obtained above
-SalI fragment (4.8 kb) 0.1 μg and ClaI-S derived from pASN6
0.1 μg of alI fragment (5.0 kb) and 20 μl of T4 ligase buffer
Then, 200 units of T4 DNA ligase was added, and the binding reaction was performed at 12 ° C for 16 hours. Escherichia coli HB101 strain was transformed with the reaction solution by the method of Cohen et al. To obtain an ampicillin resistant strain. A plasmid was isolated from this transformant according to a known method. This plasmid is called pAMN6h
It was named yg and its structure was confirmed by restriction enzyme digestion.

【０１３４】（４）ｐＡＭｏＥＲＳＡの造成 （図２３
参照） 以下の方法に従って、Staphylococcus aureus のプロテ
インＡのイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）との結合領域と
の融合タンパク質として任意のタンパク質を分泌発現す
るための分泌発現ベクターｐＡＭｏＥＲＳＡの造成を行
なった。(4) Construction of pAMoERSA (FIG. 23)
Reference) According to the following method, a secretory expression vector pAMoERSA for secreting and expressing an arbitrary protein as a fusion protein with a binding region of Staphylococcus aureus protein A with immunoglobulin G (IgG) was constructed.

【０１３５】上記(3) で得られたｐＡＭＮ６ｈｙｇの 2
μg をＹ−５０緩衝液30μl に溶解し、20単位のSnaBI
を加え、37℃２時間消化反応を行なった。その後、塩化
ナトリウムを100mM になるように添加し、20単位のXbaI
を加えて37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をア
ガロースゲル電気泳動後、ヒト顆粒球コロニー刺激因子
のシグナル配列を含む約0.33kbのDNA 断片を回収した。2 of pAMN6hyg obtained in (3) above
μg was dissolved in 30 μl of Y-50 buffer and 20 units of SnaBI
Was added and the digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours. Then add sodium chloride to 100 mM and add 20 units of XbaI.
Was added and the digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 0.33 kb containing a signal sequence of human granulocyte colony stimulating factor was recovered.

【０１３６】また、ｐＰｒＡＳ１〔Saito ら：プロテイ
ン・エンジニアリング (Protein Engneering) 、２、４
８１（１９８９）〕の 2μg をＹ−５０緩衝液 30 μl
に溶解し、20単位のClaIを加え、37℃２時間消化反応を
行なった。エタノール沈澱後、30μl のDNA ポリメラー
ゼＩ緩衝液に溶解し、６単位の大腸菌DNA ポリメラーゼ
Ｉクレノー断片を加え、37℃で60分間反応させ、ClaI消
化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。反
応をフェノール抽出によって止め、クロロホルム抽出と
エタノール沈澱の後、Ｙ−１００緩衝液 30 μl に溶解
し、20単位のBamHI を加え、37℃で２時間消化反応を行
なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、Staphy
lococcus aureus のプロテインＡのＩｇＧとの結合領域
を含む約0.21kbのDNA 断片を回収した。Also, pPrAS1 [Saito et al .: Protein Engineering (Protein Engneering), 2 , 4
81 (1989)] in 30 μl of Y-50 buffer.
20 units of ClaI was added, and a digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours. After ethanol precipitation, it was dissolved in 30 μl of DNA polymerase I buffer, 6 units of Escherichia coli DNA polymerase I Klenow fragment was added, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 60 minutes to change the 5 ′ protruding end generated by ClaI digestion into a blunt end. .. The reaction was stopped by phenol extraction, followed by chloroform extraction and ethanol precipitation, followed by dissolution in 30 μl of Y-100 buffer, 20 units of BamHI was added, and a digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, Staphy
A DNA fragment of about 0.21 kb containing the IgG binding region of lococcus aureus protein A was recovered.

【０１３７】また、実施例１の１（１４）で得られたｐ
ＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃの 2μg をＹ−１００緩衝液 30 μ
l に溶解し、20単位のXbaIと20単位のBamHI を加え、37
℃で２時間消化反応を行なった。該反応液をアガロース
ゲル電気泳動後、約12.1kbのDNA 断片を回収した。上記
（３）で得られたｐＡＭＮ６ｈｙｇ由来のSnaBI - XbaI
断片(0.33kb) 0.05 μg とｐＰｒＡＳ１由来のClaI（平
滑末端） - BamHI断片(0.21kb) 0.05 μgとｐＡＭｏＥ
ＲＣ３Ｓｃ由来のXbaI - BamHI断片(12.1kb) 0.1μg と
をＴ４リガーゼ緩衝液30μl に溶解し、 T4DNAリガーゼ
175 単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。In addition, p obtained in 1 (14) of Example 1
2 μg of AMoERC3Sc was added to Y-100 buffer solution 30 μg.
Dissolve in l, add 20 units of XbaI and 20 units of BamHI,
The digestion reaction was carried out at 0 ° C for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 12.1 kb was recovered. PAMN6hyg-derived SnaBI-XbaI obtained in (3) above
Fragment (0.33 kb) 0.05 μg and pPrAS1-derived ClaI (blunt end) -BamHI fragment (0.21 kb) 0.05 μg and pAMoE
0.1 μg of XbaI-BamHI fragment (12.1 kb) derived from RC3Sc was dissolved in 30 μl of T4 ligase buffer, and T4 DNA ligase was added.
175 units were added and the binding reaction was carried out at 12 ° C for 16 hours.

【０１３８】該反応液を用いて大腸菌HB101 株をコーエ
ンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を
得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミ
ドを単離した。このプラスミドをｐＡＭｏＥＲＳＡと名
付け、その構造を制限酵素消化により確認した。Escherichia coli HB101 strain was transformed with the reaction solution by the method of Cohen et al. To obtain an ampicillin resistant strain. A plasmid was isolated from this transformant according to a known method. This plasmid was named pAMoERSA, and its structure was confirmed by digestion with restriction enzymes.

【０１３９】（５）ｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃの造成 （図
２４参照） ナマルバ細胞のようにＥＢＮＡ−１遺伝子をもともと発
現している細胞を宿主として用いる際には、プラスミド
ｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃ中のＥＢＮＡ−１遺伝子がなくて
も宿主に導入したプラスミドは染色体に組み込まれるこ
となくプラスミド状態で存在することが可能であると推
定される。そこで、以下に示す方法に従って、ｐＡＭｏ
ＥＲＣ３Ｓｃ中のＥＢＮＡ−１遺伝子を除去したプラス
ミドｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃの造成を行なった。ｐＡＭｏ
ＰＲＣ３Ｓｃは、ｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃと同様にして直
接発現クローニングベクターとして使用することができ
る。(5) Construction of pAMoPRC3Sc (see FIG. 24) When a cell originally expressing the EBNA-1 gene such as Namalwa cell is used as a host, the EBNA-1 gene in the plasmid pAMoERC3Sc is not necessary. It is presumed that the plasmid introduced into the host can exist in a plasmid state without being integrated into the chromosome. Therefore, according to the method described below, pAMo
A plasmid pAMoPRC3Sc from which the EBNA-1 gene in ERC3Sc was removed was constructed. pAMo
PRC3Sc can be used as a direct expression cloning vector in the same manner as pAMoERC3Sc.

【０１４０】実施例１の１（１４）で得られたｐＡＭｏ
ＥＲＣ３Ｓｃの 2μg をＹ−５０緩衝液 30 μl に溶解
し、20単位のNsiI〔ニュー・イングランド・バイオラブ
ズ（New England Biolabs ）社製〕を加え、37℃で２時
間消化反応を行なった。エタノール沈澱後、30μl のDN
A ポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、６単位の大腸菌DNA
ポリメラーゼＩクレノー断片を加え、37℃で60分間反応
させ、NsiI消化によって生じた３’突出末端を平滑末端
に変えた。反応をフェノール抽出によって止め、クロロ
ホルム抽出とエタノール沈澱の後、Ｙ−１００緩衝液 3
0 μl に溶解し、20単位のNotIを加え、37℃で２時間消
化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動
後、約8.1kb のDNA 断片を回収した。PAMo obtained in 1 (14) of Example 1
2 μg of ERC3Sc was dissolved in 30 μl of Y-50 buffer, 20 units of NsiI (manufactured by New England Biolabs) was added, and digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours. After ethanol precipitation, 30 μl DN
6 units of E. coli DNA dissolved in A polymerase I buffer
Polymerase I Klenow fragment was added and reacted at 37 ° C for 60 minutes to change the 3'protruding end generated by NsiI digestion into a blunt end. The reaction was stopped by phenol extraction, chloroform extraction and ethanol precipitation followed by Y-100 buffer.
It was dissolved in 0 μl, 20 units of NotI was added, and a digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 8.1 kb was recovered.

【０１４１】また、同プラスミド 2μg をＹ−１００緩
衝液 30 μl に溶解し、20単位のXhoIを加え、37℃で２
時間消化反応を行なった。エタノール沈澱後、30μl の
DNAポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、６単位の大腸菌DNA
ポリメラーゼＩクレノー断片を加え、37℃で60分間反
応させ、XhoI消化によって生じた５’突出末端を平滑末
端に変えた。反応をフェノール抽出によって止め、クロ
ロホルム抽出とエタノール沈澱の後、Ｙ−１００緩衝液
30 μl に溶解し、20単位のNotIを加え、37℃で２時間
消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳
動後、約3.2kbのDNA 断片を回収した。2 μg of the plasmid was dissolved in 30 μl of Y-100 buffer, 20 units of XhoI was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 2 hours.
A time digestion reaction was performed. After ethanol precipitation, 30 μl
6 units of E. coli DNA dissolved in DNA polymerase I buffer
The polymerase I Klenow fragment was added and reacted at 37 ° C for 60 minutes to change the 5'protruding end generated by XhoI digestion into a blunt end. The reaction was stopped by phenol extraction, followed by chloroform extraction and ethanol precipitation, followed by Y-100 buffer solution.
It was dissolved in 30 μl, 20 units of NotI was added, and a digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 3.2 kb was recovered.

【０１４２】上記で得られたｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃ由来
のNsiI (平滑末端) - NotI断片(8.1kb) 0.1 μg と同プ
ラスミド由来のXhoI (平滑末端) - NotI断片(3.2kb) 0.
1 μg とをＴ４リガーゼ緩衝液30μl に溶解し、 T4DNA
リガーゼ175 単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行
なった。該反応液を用いて大腸菌HB101 株をコーエンら
の方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得
た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミド
を単離した。このプラスミドをｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃと
名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。NsiI (blunt end) -NotI fragment (8.1 kb) derived from pAMoERC3Sc and 0.1 μg of XhoI (blunt end) -NotI fragment (3.2 kb) derived from the plasmid obtained above.
Dissolve 1 μg and 30 μl of T4 ligase buffer,
After adding 175 units of ligase, the binding reaction was carried out at 12 ° C for 16 hours. Escherichia coli HB101 strain was transformed with the reaction solution by the method of Cohen et al. To obtain an ampicillin resistant strain. A plasmid was isolated from this transformant according to a known method. This plasmid was named pAMoPRC3Sc, and its structure was confirmed by digestion with restriction enzymes.

【０１４３】（６）ｐＡＭｏＰＲＳＡの造成 （図２５
参照） 以下に示す方法に従って、ｐＡＭｏＥＲＳＡ中のＥＢＮ
Ａ−１遺伝子を除去したプラスミドｐＡＭｏＰＲＳＡの
造成を行なった。ｐＡＭｏＰＲＳＡは、ｐＡＭｏＥＲＳ
Ａと同様に分泌発現ベクターとして使用することができ
る。(6) Construction of pAMoPRSA (Fig. 25)
Reference) EBN in pAMoERSA according to the method shown below
The plasmid pAMoPRSA in which the A-1 gene was removed was constructed. pAMoPRSA is pAMoERS
Similar to A, it can be used as a secretory expression vector.

【０１４４】上記（４）で得られたｐＡＭｏＥＲＳＡの
２μg を10mMトリス−塩酸(pH7.5),6mM 塩化マグネシウ
ム，80mM塩化ナトリウム, 6mM 2−メルカプトエタノー
ルからなる緩衝液（以下これをＹ−８０緩衝液と略記す
る）30μl に溶解し、20単位のXbaIと20単位のAsp718
〔ベーリンガー・マンハイム(Boehringer mannheim)社
製〕を加え、37℃で２時間消化反応を行なった。該反応
液をアガロースゲル電気泳動後、約1.3kb のDNA 断片を
回収した。2 μg of pAMoERSA obtained in the above (4) was added to a buffer solution containing 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 6 mM magnesium chloride, 80 mM sodium chloride, 6 mM 2-mercaptoethanol (hereinafter referred to as Y-80 buffer). Dissolved in 30 μl, 20 units of XbaI and 20 units of Asp718
[Boehringer Mannheim] was added and the digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 1.3 kb was recovered.

【０１４５】また、ｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃの２μg をＹ
−１００緩衝液 30 μl に溶解し、20単位のXbaIと20単
位のAsp718を加え、37℃で２時間消化反応を行なった。
該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約8.5kb のDNA
断片を回収した。上記で得られたｐＡＭｏＥＲＳＡ由来
のXbaI - Asp718 断片(1.3kb) 0.05μgとｐＡＭｏＰＲ
Ｃ３Ｓｃ由来の XbaI - Asp718断片(8.5kb) 0.1 μg と
をＴ４リガーゼ緩衝液30μl に溶解し、 T4DNAリガーゼ
175 単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。In addition, 2 μg of pAMoPRC3Sc was added to Y.
It was dissolved in 30 μl of -100 buffer, 20 units of XbaI and 20 units of Asp718 were added, and the digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours.
After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, about 8.5 kb of DNA was
The fragments were collected. 0.05 μg of XbaI-Asp718 fragment (1.3 kb) derived from pAMoERSA obtained above and pAMoPR
0.1 μg of XbaI-Asp718 fragment (8.5 kb) derived from C3Sc was dissolved in 30 μl of T4 ligase buffer, and T4 DNA ligase was added.
175 units were added and the binding reaction was carried out at 12 ° C for 16 hours.

【０１４６】該反応液を用いて大腸菌HB101 株をコーエ
ンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を
得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミ
ドを単離した。このプラスミドをｐＡＭｏＰＲＳＡと名
付け、その構造を制限酵素消化により確認した。Escherichia coli HB101 strain was transformed with the reaction solution by the method of Cohen et al. To obtain ampicillin resistant strain. A plasmid was isolated from this transformant according to a known method. This plasmid was named pAMoPRSA, and its structure was confirmed by digestion with restriction enzymes.

【０１４７】（７）ｐＡＭｏＰＲＳＡＬ−３５Ｆの造成
（図２６参照） クローン化したα２→３シアリルトランスフェラーゼは
そのアミノ酸配列から、Ｎ末の８アミノ酸を細胞質側に
だし、それに続く１８アミノ酸からなる疎水性に富む領
域で膜に結合し、残りの大半の触媒部位を含むＣ末部分
をゴルジ体内腔に露出するといった構造をとると推定さ
れる。そこで、以下に示す方法に従って、α２→３シア
リルトランスフェラーゼの膜結合領域を除去し、かわり
にヒト顆粒球コロニー刺激因子のシグナル配列ならびに
Staphylococcus aureus のプロテインＡのＩｇＧとの結
合領域を付加することによりα２→３シアリルトランス
フェラーゼを分泌生産させた。(7) Construction of pAMoPRSAL-35F (see FIG. 26) From the amino acid sequence of the cloned α2 → 3 sialyltransferase, 8 amino acids at the N-terminus were taken out to the cytoplasmic side, and the following 18 amino acids were made hydrophobic. It is presumed to have a structure in which it is bound to the membrane in a rich region and exposes the C-terminal portion containing most of the remaining catalytic site to the Golgi body lumen. Therefore, according to the method described below, the membrane-binding region of α2 → 3 sialyltransferase was removed, and instead the signal sequence of human granulocyte colony stimulating factor and
The α2 → 3 sialyltransferase was secreted and produced by adding the binding region of Staphylococcus aureus protein A to IgG.

【０１４８】α２→３シアリルトランスフェラーゼの膜
結合領域以降〔35番目のＰｈｅから333 番目のＰｈｅま
で］をコードする遺伝子部分をＰＣＲ法を用いて調製
し、上記(6) で得られた分泌発現ベクターｐＡＭｏＰＲ
ＳＡに組み込んだ。ＰＣＲ用のプライマーとして、以下
に示す２種の合成ＤＮＡ[L-A(35F)(44mer)および L-3NN
(36mer)]をアプライド・バイオシステムズ社３８０Ａ・
ＤＮＡ合成機を用いて合成した。The gene portion encoding the membrane-binding region of α2 → 3 sialyltransferase and thereafter [from Phe at position 35 to Phe at position 333] was prepared by the PCR method, and the secretory expression vector obtained in (6) above was prepared. pAMoPR
Incorporated into SA. The following two types of synthetic DNA [LA (35F) (44mer) and L-3NN were used as primers for PCR.
(36mer)] by Applied Biosystems 380A
It was synthesized using a DNA synthesizer.

【０１４９】[0149]

【化６】 [Chemical 6]

【０１５０】L-A(35F)にはEcoRV サイトがL-3NN にはAs
p718サイトが導入されるように設計されているため、Ｐ
ＣＲで増幅されたＤＮＡ断片はEcoRV とAsp718で切断さ
れ後に、ｐＡＭｏＰＲＳＡのStuIサイトとAsp718サイト
間に組み込むことができる。ＰＣＲは、GeneAmp ^TM DNA
Amplification Reagent Kit with AmpliTaq ^TM Recomb
inant Taq DNA Polymerase（宝酒造社製）を用いて行な
った。反応液の調製はキットの方法にしたがって行な
い、PERKIN ELMER CETUS DNA Thermal Cycler （宝酒造
社製）を用いて、９４℃／１分、５５℃／１分、７２℃
／３分のインキュベーションを３０サイクル行なった
後、さらに７２℃で７分間インキュベートした。鋳型と
しては、実施例１で得られたプラスミドｐＵＣ１１９−
ＬＥＣを１ng使用した。反応終了後、クロロホルム抽出
およびエタノール沈澱を行なった後、Ｙ−１００緩衝液
30 μl に溶解し、20単位のEcoRV および20単位のAsp7
18を加え、37℃で２時間消化反応を行なった。該反応液
をアガロースゲル電気泳動後、約0.9kb のDNA 断片を回
収した。There is an EcoRV site in LA (35F) and As in L-3NN.
Since the p718 site is designed to be installed, P
The CR-amplified DNA fragment can be inserted between EcoRV and Asp718 and then inserted between the StuI site and the Asp718 site of pAMoPRSA. PCR is GeneAmp ^™ DNA
Amplification Reagent Kit with AmpliTaq ^TM Recomb
It was performed using inant Taq DNA Polymerase (Takara Shuzo). The reaction solution is prepared according to the method of the kit, and using a PERKIN ELMER CETUS DNA Thermal Cycler (manufactured by Takara Shuzo), 94 ° C / 1 minute, 55 ° C / 1 minute, 72 ° C.
After 30 cycles of incubation for / 3 minutes, the cells were further incubated at 72 ° C. for 7 minutes. As a template, the plasmid pUC119- obtained in Example 1 was used.
1 ng of LEC was used. After completion of the reaction, chloroform extraction and ethanol precipitation were performed, and then Y-100 buffer solution was used.
Dissolve in 30 μl, 20 units EcoRV and 20 units Asp7
18 was added and the digestion reaction was performed at 37 ° C. for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 0.9 kb was recovered.

【０１５１】また、ｐＡＭｏＰＲＳＡの２μg をＹ−１
００緩衝液 30 μl に溶解し、20単位のStuIと20単位の
Asp718を加え、37℃２時間消化反応を行なった。該反応
液をアガロースゲル電気泳動後、約9.06kbのDNA 断片を
回収した。上記で得られたＰＣＲで増幅したＤＮＡ由来
のEcoRV - Asp718断片(0.9kb) 0.1 μg とｐＡＭｏＰＲ
ＳＡ由来のStuI - Asp718 断片(9.06kb) 0.1μg とをＴ
４リガーゼ緩衝液30μl に溶解し、 T4DNAリガーゼ175
単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。Further, 2 μg of pAMoPRSA was added to Y-1.
Dissolve in 30 μl of 00 buffer and add 20 units of StuI and 20 units of StuI.
Asp718 was added, and a digestion reaction was carried out at 37 ° C for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 9.06 kb was recovered. PCR-amplified DNA-derived EcoRV-Asp718 fragment (0.9 kb) 0.1 μg and pAMoPR
SA-derived StuI-Asp718 fragment (9.06 kb) 0.1 μg and T
4 Dissolve in 30 μl of ligase buffer and use T4 DNA ligase175
The unit was added and the binding reaction was carried out at 12 ° C. for 16 hours.

【０１５２】該反応液を用いて大腸菌HB101 株をコーエ
ンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を
得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミ
ドを単離した。このプラスミドをｐＡＭｏＰＲＳＡＬ-
３５Ｆと名付け、その構造を制限酵素消化により確認し
た。Escherichia coli HB101 strain was transformed with the reaction solution by the method of Cohen et al. To obtain ampicillin resistant strain. A plasmid was isolated from this transformant according to a known method. This plasmid was designated as pAMoPRSAL-
It was named 35F and its structure was confirmed by restriction enzyme digestion.

【０１５３】２．ナマルバＫＪＭー１細胞を宿主とした
α２→３シアリルトランスフェラーゼの分泌生産 上記の１（６）で得られたプラスミドｐＡＭｏＰＲＳＡ
（分泌発現ベクター；コントロール）および１（７）で
得られたｐＡＭｏＰＲＳＡＬ−３５Ｆ（α２→３シアリ
ルトランスフェラーゼ分泌発現用プラスミド）をキィア
ジェン (Qiagen) 社製のプラスミド調製キットである>p
lasmid<maxi kit （商品番号 41031)を用いて調製し
た。取得したプラスミドはエタノール沈澱後、1 μg/μ
l になるようにＴＥ緩衝液に溶解した。その後、両プラ
スミドを、エレクトロポーレーション法〔Miyajiら：サ
イトテクノロジー(Cytotechnology)、３、１３３（１９
９０）〕により、それぞれナマルバＫＪＭ−１株に導入
した。1.6 ×10⁶ 細胞あたり4 μg のプラスミドを導入
後、8ml のＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地に懸濁
し、CO₂ インキュベーターで37℃で24時間培養した。そ
の後、G418（ギブコ社製）を0.5mg/mlになるように添加
してさらに７日から14日培養し、形質転換株を得た。取
得した形質転換株は、それぞれG418を0.5mg/ml含むＲＰ
ＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地30mlに1 ×10⁵ 細胞/m
l になるように懸濁し、CO₂ インキュベーターで37℃で
８日間培養した。その後、遠心分離（160 × g、10分
間）により細胞を除き上清を回収し、再度遠心分離（15
00× g、10分間）後、その上清を回収した。このように
して取得した培養上清は、使用するまで -80℃で保存し
た。2. Secretory production of α2 → 3 sialyltransferase using Namalwa KJM-1 cells as a host. Plasmid pAMoPRSA obtained in 1 (6) above.
(Secretion expression vector; control) and pAMoPRSAL-35F (α2 → 3 sialyltransferase secretory expression plasmid) obtained in 1 (7) are plasmid preparation kits manufactured by Qiagen> p
It was prepared using lasmid <maxi kit (product number 41031). The obtained plasmid was ethanol-precipitated at 1 μg / μ
It was dissolved in TE buffer so that it became l. Then, both plasmids were subjected to electroporation [Miyaji et al .: Cytotechnology, 3 , 133 (19
90)], and introduced into the Namalba KJM-1 strain. After introducing 4 μg of plasmid per 1.6 × 10 ⁶ cells, the cells were suspended in 8 ml of RPMI1640.ITPSGF medium and cultured in a CO ₂ incubator at 37 ° C. for 24 hours. Then, G418 (manufactured by Gibco) was added at 0.5 mg / ml and the cells were further cultured for 7 to 14 days to obtain a transformant. The obtained transformants were RP containing G418 0.5 mg / ml, respectively.
1 × 10 ⁵ cells / m in 30 ml of MI1640 / ITPSGF medium
The cells were suspended to a volume of 1 and cultured in a CO ₂ incubator at 37 ° C for 8 days. After that, the cells are removed by centrifugation (160 × g, 10 minutes), the supernatant is collected, and centrifugation (15
(00 × g, 10 minutes), the supernatant was collected. The culture supernatant thus obtained was stored at -80 ° C until use.

【０１５４】プラスミドｐＡＭｏＰＲＳＡＬ−３５Ｆの
コードするα２→３シアリルトランスフェラーゼはStap
hylococcus aureus のプロテインＡのＩｇＧとの結合領
域との融合タンパク質として分泌生産されることになる
ため、ＩｇＧセファロース（Sepharose ）を用いて、容
易に精製することができる。そこで、上記で得られた培
養上清にアジ化ナトリウムを最終濃度0.1 ％になるよう
に添加した後、添付の説明書にしたがって前処理したＩ
ｇＧセファロース〔ファルマシア(Pharmacia)製 ]を100
μl 添加し、４℃で１晩緩やかに攪拌した。遠心分離
（160 × g、10分間）してＩｇＧセファロースを回収
し、ＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地１mlで３回洗
浄後、このＩｇＧセファロース 5μl を直接用いて、シ
アリルトランスフェラーゼ活性を測定した。活性測定は
30μl のアッセイ溶液〔 0.1M カコジル酸−塩酸 (pH6.
5), 0.01M 塩化マンガン, 0.45% トライトンX-100, 0.1
mM基質, 上記ＩｇＧセファロース(5μl), 5mM CMP- シ
アル酸 (添加あるいは無添加) 〕中で37℃で２時間反応
後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により生
産物の同定を行なうことにより行なった。基質としては
各種糖鎖〔Lacto-N-neotetraose (LNnT)、Lacto-N-tetr
aose (LNT)、Lacto-N-fucopentaose III (LNFP-III) お
よび Lacto-N-fucopentaose V (LNFP-V)；いずれもオッ
クスフォード・グライコシステムズ社製でそれぞれの構
造は第１表に示すとおりである〕をアミノピリジンで蛍
光標識したものを使用した。基質の蛍光標識は、常法
〔AkihiroKondo ら：アグリカルチュラル・アンド・バ
イオロジカル・ケミストリー (Agric. Biol. Chem.) ，
54, 2169 (1990) 〕に従って行なった。それぞれのＩｇ
Ｇセファロースについて、CMP-シアル酸（糖供与体）の
含まれたアッセイ溶液と含まれないアッセイ溶液とを用
いて反応後、ＨＰＬＣで解析し、CMP-シアル酸が含まれ
たアッセイ溶液でのみ出現するピークを生成物とした。
反応の終了したアッセイ溶液は、100 ℃で5 分処理後、
遠心分離（10000 × g、10分間）し、その上清のうち10
μl をＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣは、ＴＳＫｇｅｌ
ＯＤＳ- ８０Ｔ _M カラム（4.6mm ×30cm；東ソー社製）
を使用し、溶出液として0.02M 酢酸アンモニウム緩衝液
(pH4.0)を用い、溶出温度50℃、流速 1ml／分で溶出を
行なった。生成物の検出は、島津製作所製のFluorescen
ce HPLC Monitor (RF-535T) を用いて行なった（励起波
長320nm 、放射波長400nm ）。生成物の同定は、スタン
ダ−ドと溶出時間が一致することおよび生成物のシアリ
ダーゼ処理により基質が再生成することより行なった。
生成物の定量は、同様にしてアミノピリジル化したラク
トースをスタンダードとして用い、蛍光強度を比較する
ことにより行なった。アッセイの結果を第１表に示す。
LNnTに対する活性を100 としたときの各種糖鎖基質に対
する相対活性を合わせて示した。Of the plasmid pAMoPRSAL-35F
The encoded α2 → 3 sialyltransferase is Stap
Binding region of hylococcus aureus protein A to IgG
Will be secreted and produced as a fusion protein with the region
Therefore, using IgG Sepharose,
It can be easily purified. Therefore, the culture obtained above
Sodium azide is added to the culture supernatant to a final concentration of 0.1%
And then pretreated according to the attached instructions.
GG Sepharose [Pharmacia] 100
 μl was added, and the mixture was gently stirred at 4 ° C. overnight. Centrifuge
(160 × g, 10 minutes) to collect IgG Sepharose
And wash 3 times with 1 ml of RPMI1640.ITPSGF medium.
After purification, 5 μl of this IgG sepharose was directly used to
Allyltransferase activity was measured. Activity measurement
30 μl of assay solution (0.1 M cacodylic acid-hydrochloric acid (pH 6.
5), 0.01M manganese chloride, 0.45% Triton X-100, 0.1
mM substrate, above IgG sepharose (5 μl), 5 mM CMP-shi
Reaction at 37 ° C for 2 hours in alkaline acid (with or without addition)
Afterwards, perform high performance liquid chromatography (HPLC).
This was done by identifying the product. As a substrate
Various sugar chains (Lacto-N-neotetraose (LNnT), Lacto-N-tetr
aose (LNT), Lacto-N-fucopentaose III (LNFP-III)
And Lacto-N-fucopentaose V (LNFP-V); both are off
Made by Cusford Glyco Systems, Inc.
The structure is as shown in Table 1.]
The one labeled with light was used. Fluorescent labeling of substrates
[Akihiro Kondo et al: Agricultural and Ba
Iodological Chemistry (Agric. Biol. Chem.),
54, 2169 (1990)]. Each Ig
For G Sepharose, of CMP-sialic acid (sugar donor)
Use with and without assay solutions
After the reaction, the product was analyzed by HPLC and contained CMP-sialic acid.
The peak that appeared only in the assay solution was used as the product.
The reacted assay solution should be treated at 100 ° C for 5 minutes and then
Centrifuge (10 000 × g, 10 minutes), and remove 10
μl was subjected to HPLC. HPLC is TSKgel
ODS-80T _MColumn (4.6mm x 30cm; Tosoh Corporation)
Using 0.02M ammonium acetate buffer as eluent
 (pH4.0), elution temperature 50 ℃, flow rate 1ml / min
I did. Fluorescen manufactured by Shimadzu is used for product detection.
ce HPLC Monitor (RF-535T) (excitation wave
Long 320nm, emission wavelength 400nm). The product identification is
That the elution time matches that of the d
It was performed by regenerating the substrate by the treatment with dase.
The product was quantified in the same manner with aminopyridylated lac
Compare fluorescence intensities using torse as a standard
This was done by The results of the assay are shown in Table 1.
When the activity against LNnT is set to 100,
The relative activity was shown together.

【０１５５】[0155]

【表１】 [Table 1]

【０１５６】ｐＡＭｏＰＲＳＡＬ−３５Ｆを導入したナ
マルバ細胞の培養上清由来のＩｇＧセファロースを使用
した場合は、いずれの糖鎖を基質とした場合もα２→３
シアリルトランスフェラ−ゼ活性が検出された。一方、
ベクターであるｐＡＭｏＰＲＳＡを導入したナマルバ細
胞の培養上清由来のＩｇＧセファロースを使用した場合
には、いずれの糖鎖を基質とした場合も活性は検出され
なかった。以上の結果から、α２→３シアリルトランス
フェラーゼがStaphylococcus aureus のプロテインＡの
ＩｇＧとの結合領域との融合タンパク質として培養上清
中に分泌生産されること、また、それがＩｇＧセファロ
ースを用いて、容易に回収、精製されることが示され
た。また、これまでに精製が報告されている公知のα２
→３シアリルトランスフェラーゼのLNT に対する活性を
100 としたときの各種糖鎖基質に対する相対活性〔ワイ
ンスタイン(Wienstein) ら：ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem.),257, 13845
(1982)〕を第１表に合わせて示した。公知のα２→３シ
アリルトランスフェラーゼは、LNnTよりもLNT に対して
特異性が高いのに対し、本発明のα２→３シアリルトラ
ンスフェラーゼはLNTよりもLNnTに対して特異性が高い
ことから、本発明のα２→３シアリルトランスフェラー
ゼは、公知の酵素とは基質特異性の異なる新規な酵素で
あることが明らかとなった。また、本発明のα２→３シ
アリルトランスフェラーゼは、LNFP-IIIをも基質としう
ることが明らかになったが、これまでにこのようにLNFP
-IIIに対して酵素活性を有するα２→３シアリルトラン
スフェラーゼの報告はない。このことは、この酵素を用
いることによりin vitroでLe^X 糖鎖から直接Sialyl-Le
^X糖鎖を合成することができることを示している。ま
た、本発明のα２→３シアリルトランスフェラーゼは、
基質としてLNnTだけでなくLNT も利用することができる
ことから、Sialyl-Le ^X 糖鎖のみならずSialyl-Le ^a 糖
鎖も合成することができる。すなわち、本発明のα２→
３シアリルトランスフェラーゼを用いて糖鎖の末端構造
をNeuAc α2-3Galβ1-4GlcNAc あるいはNeuAc α2-3Gal
β1-3GlcNAc に変換した後、α１→３フコシルトランス
フェラーゼ（fucosyltransferase）あるいはα１→４フ
コシルトランスフェラーゼ（fucosyltransferase）を用
いて、それぞれSialyl-Le ^X 糖鎖あるいはSialyl-Le ^a
糖鎖を合成することができる。また、本発明のα２→３
シアリルトランスフェラーゼは、公知のα２→３シアリ
ルトランスフェラーゼよりもLNnTに対する基質特異性が
高いため、Sialyl-Le ^X 糖鎖の合成において、公知のα
２→３シアリルトランスフェラーゼよりも優れている。When IgG sepharose derived from the culture supernatant of Namalwa cells into which pAMoPRSAL-35F was introduced was used, α2 → 3 was obtained when any sugar chain was used as a substrate.
Sialyltransferase activity was detected. on the other hand,
When IgG sepharose derived from the culture supernatant of Namalwa cells into which the vector pAMoPRSA was introduced was used, no activity was detected using any sugar chain as a substrate. From the above results, α2 → 3 sialyltransferase was secreted and produced in the culture supernatant as a fusion protein with the binding region of Staphylococcus aureus protein A to IgG, and it was easily produced using IgG sepharose. It was shown to be recovered and purified. In addition, known α2 whose purification has been reported so far
→ 3 The activity of sialyltransferase against LNT
Relative activity against various sugar chain substrates when set to 100 [Wienstein et al .: Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.) , 257 , 13845
(1982)] is also shown in Table 1. The known α2 → 3 sialyltransferase has higher specificity for LNT than LNnT, whereas the α2 → 3 sialyltransferase of the present invention has higher specificity for LNnT than LNT. It was revealed that α2 → 3 sialyltransferase is a novel enzyme having a substrate specificity different from that of a known enzyme. Further, it was revealed that the α2 → 3 sialyltransferase of the present invention can also use LNFP-III as a substrate.
There is no report of α2 → 3 sialyltransferase having enzymatic activity for -III. This is directly Sialyl-Le from Le ^X sugar chains in vitro by the use of this enzyme
It shows that ^X sugar chains can be synthesized. Further, the α2 → 3 sialyltransferase of the present invention is
Since not only LNnT but also LNT can be used as a substrate, not only Sialyl-Le ^X sugar chains but also Sialyl-Le ^a sugar chains can be synthesized. That is, α2 of the present invention →
The terminal structure of the sugar chain was analyzed by NeuAc α2-3Gal β1-4GlcNAc or NeuAc α2-3Gal using 3 sialyltransferase.
After converting into β1-3GlcNAc, α1 → 3 fucosyltransferase (fucosyltransferase) or α1 → 4 fucosyltransferase (fucosyltransferase) was used to convert Sialyl-Le ^X sugar chains or Sialyl-Le ^a , respectively.
A sugar chain can be synthesized. In addition, α2 → 3 of the present invention
Since sialyltransferase has higher substrate specificity for LNnT than known α2 → 3 sialyltransferase, a known α is used in the synthesis of Sialyl-Le ^X sugar chain.
Better than 2 → 3 sialyltransferase.

【０１５７】実施例４ 動物細胞によるヒトメラノーマ細胞株WM266-4 由来のα
２→３シアリルトランスフェラーゼの分泌生産 １．ヒト・メラノーマ細胞株WM266-4 からのα２→３シ
アリルトランスフェラーゼｃＤＮＡ（WM17）のクローン
化 （１）ヒト・メラノーマ細胞株であるWM266-4 細胞から
のmRNAの取得 1 ×10⁸ 個のWM266-4 細胞(ATCC CRL1676)より、インビ
トロジェン (Invitrogen) 社製のmRNA抽出キットである
Fast Track (商品番号K1593-02) を用い、キットに添付
されている説明書に従って、約30μg のmRNAを取得し
た。Example 4 α from human melanoma cell line WM266-4 in animal cells
Secretion production of 2 → 3 sialyltransferase 1. Cloning of α2 → 3 sialyltransferase cDNA (WM17) from human melanoma cell line WM266-4 (1) Acquisition of mRNA from human melanoma cell line WM266-4 cells 1 × 10 ⁸ WM266-4 This is an mRNA extraction kit from cells (ATCC CRL1676) manufactured by Invitrogen.
Using Fast Track (Product No. K1593-02), about 30 μg of mRNA was obtained according to the instruction attached to the kit.

【０１５８】（２）cDNAライブラリーの作製 上記で得られた mRNA の8 μg から、インビトロジェン
(Invitrogen) 社製のcDNA合成キットであるThe Librar
ian I を用いて、ランダム・プライマーをプライマーと
して２本鎖cDNAを合成した。その後、cDNAの両末端にBs
tXI リンカーのかわりに、実施例１の３（２）で合成し
た下記SfiIリンカー(2) Preparation of cDNA library From 8 μg of the mRNA obtained above, Invitrogen
(Invitrogen) cDNA synthesis kit from The Librar
Double-stranded cDNA was synthesized using ian I using a random primer as a primer. Then, Bs at both ends of the cDNA
Instead of the tXI linker, the following SfiI linker synthesized in 3 (2) of Example 1 was used.

【０１５９】[0159]

【化７】 [Chemical 7]

【０１６０】を付与し、アガロースゲル電気泳動により
cDNAをサイズにより分画を行ない、約1.2 kb以上のcDNA
断片を回収した。SfiIリンカー（11mer と8mer）はそれ
ぞれ100nM ずつ、別々にＴ４キナーゼ緩衝液50μl に溶
解し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）30
単位を加えて、37℃で16時間リン酸化反応を行なった後
使用した。具体的試薬および方法は、BstXI リンカーの
代わりに、上記のSfiIリンカーを使用した以外は、キッ
トに付与されている説明書に従った。また、直接発現ク
ローニングベクター（Expression Cloning Vector ）と
しては、実施例３の１（５）で得られたｐＡＭｏＰＲＣ
３Ｓｃを使用した。ｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃの 24 μg を
Ｙ−５０緩衝液590μl に溶解し、80単位のSfiIを加
え、37℃で16時間消化反応を行なった。その後、反応液
の5 μl をとり、アガロースゲル電気泳動にかけ、切断
が完了したのを確認後、40単位のBamHI を加え、さらに
37℃で２時間消化反応を行なった。BamHI で切断するの
は、cDNAライブラリー造成時のバックグラウンド（cDNA
インサートが挿入されていないクローン）の量を減少さ
せるためである。該反応液をアガロースゲル電気泳動
後、約 8.8kbのDNA 断片を回収した。By applying agarose gel electrophoresis
Fractionation of cDNA is performed according to size, and cDNA of about 1.2 kb or more
The fragments were collected. SfiI linkers (11mer and 8mer) were separately dissolved in 50 μl of T4 kinase buffer at 100 nM each, and T4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo) 30
The unit was added and the phosphorylation reaction was carried out at 37 ° C. for 16 hours before use. The specific reagents and methods were in accordance with the instructions given in the kit, except that the above SfiI linker was used instead of the BstXI linker. Further, as a direct expression cloning vector (Expression Cloning Vector), pAMoPRC obtained in 1 (5) of Example 3 was used.
3Sc was used. 24 μg of pAMoPRC3Sc was dissolved in 590 μl of Y-50 buffer, 80 units of SfiI was added, and digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 16 hours. After that, 5 μl of the reaction solution was taken, subjected to agarose gel electrophoresis, and after confirming that the cleavage was completed, 40 units of BamHI was added, and
The digestion reaction was carried out at 37 ° C for 2 hours. Cleavage with BamHI is the background (cDNA
This is to reduce the amount of clones in which the insert is not inserted). After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 8.8 kb was recovered.

【０１６１】上記で得られたｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃ由来
のSfiI断片(8.8kb) 2 μg と cDNAとをＴ４リガーゼ緩
衝液 250μl に溶解し、 T4DNAリガーゼ2000単位を加え
て、12℃で16時間結合反応を行なった。その後、トラン
スファーＲＮＡ（tRNA）5 μg を添加し、エタノール沈
澱後、ＴＥ緩衝液20μl に溶解した。該反応液を用いて
大腸菌ＬＥ３９２株〔マニアティス (Maniatis) ら編
集：モレキュラー・クローニング (Molecular Clonin
g)、 2.58 、Cold Spring Harbor 1989 年刊行］をエレ
クトロポーレーション法〔ウイリアム・ジェイ・ドゥワ
ー (William J.Dower)ら：ヌクレイック・アシッド・リ
サーチ (Nucleic Acids Res.),１６, ６１２７（１９８
８）〕により形質転換し、約20万個のアンピシリン耐性
株を得た。 （３）α２→３シアリルトランスフェラ−ゼ遺伝子（WM
17）のクローン化 上記(2) で得られた約20万個のアンピシリン耐性株（cD
NAライブラリー）を混合後、キィアジェン (Qiagen) 社
製のプラスミド調製キットである>plasmid<maxi kit
（商品番号 41031)を用いてプラスミドを調製した。取
得したプラスミドはエタノール沈澱後、1 μg/μl にな
るようにＴＥ緩衝液に溶解した。2 μg of the SfiI fragment (8.8 kb) derived from pAMoPRC3Sc obtained above and cDNA were dissolved in 250 μl of T4 ligase buffer, 2000 units of T4 DNA ligase was added, and a ligation reaction was carried out at 12 ° C. for 16 hours. .. After that, 5 μg of transfer RNA (tRNA) was added, and after ethanol precipitation, it was dissolved in 20 μl of TE buffer. Using the reaction mixture, E. coli LE392 strain [Maniatis et al., Edited by: Molecular Clonin
g), 2.58, Cold Spring Harbor, 1989] electroporation method [William J. Dower et al .: Nucleic Acids Res., 16 , 6127 (198).
8)] to obtain about 200,000 ampicillin-resistant strains. (3) α2 → 3 sialyltransferase gene (WM
Cloning of 17) About 200,000 ampicillin-resistant strains (cD obtained in (2) above)
NA library), and then plasmid preparation kit from Qiagen> plasmid <maxi kit
(Product number 41031) was used to prepare the plasmid. The obtained plasmid was precipitated with ethanol and then dissolved in TE buffer at 1 μg / μl.

【０１６２】上記プラスミドは、エレクトロポーレーシ
ョン法〔Miyajiら：サイトテクノロジー(Cytotechnolog
y)、３、１３３（１９９０）］により、ＫＪＭ−１株に
導入した。1.6 ×10⁶ 細胞あたり4 μg のプラスミドを
導入後、8ml のＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地に
懸濁し、CO₂ インキュベーターで37℃で24時間培養し
た。その後、G418（ギブコ社製）を0.5mg/mlになるよう
に添加してさらに５〜７日間培養し、形質転換株を得
た。得られた形質転換株は、ヒママメレクチン１２０
（50ng/ml ）が含まれたＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ
Ｆ培地で 5× 10⁴細胞/ml になるように懸濁し、96穴マ
イクロタイタープレートに200 μl ずつ分注した。 CO₂
インキュベーター中で37℃で４週間培養後、ヒママメレ
クチン１２０耐性株を取得した。その耐性株を培養後、
約 5×10⁶ の細胞からハ−ト法〔ロバート・エフ・マー
ゴルスキー (Robert F.Margolskee)ら：モレキュラー・
アンド・セリュラー・バイオロジー (Mol.Cell.Biol.)
、８、２８３７（１９８８）〕によりプラスミドを回
収した。回収したプラスミドは、エレクトロポーレーシ
ョン法［ウイリアム・ジェイ・ドゥワー (William J.Do
wer)ら：ヌクレイック・アシッド・リサーチ (Nucleic
Acids Res.) 、１６、６１２７（１９８８）〕により大
腸菌ＬＥ３９２株に導入し、アンピシリン耐性株を取得
した。その形質転換株よりキィアジェン (Qiagen) 社製
のプラスミド調製キット>plasmid<maxi kit を用いてプ
ラスミドを調製し、その構造を各種制限酵素で切断して
調べたところ、約1.9kb のcDNAを含んでいることが明ら
かとなった。このプラスミドをｐＡＭｏＰＲＷＭ１７と
名付け、上記と同じ方法で再度ＫＪＭ−１株に導入した
ところ、再びヒママメレクチン１２０耐性となったこと
から、このcDNAがレクチン耐性の原因遺伝子であること
が明らかとなった。ｐＡＭｏＰＲＷＭ１７を導入したＫ
ＪＭ−１株は200ng/mlのヒママメレクチン１２０存在下
でも生育することができる。The above plasmid was prepared by the electroporation method [Miyaji et al .: Cytotechnolog
y), 3 , 133 (1990)]. After introducing 4 μg of plasmid per 1.6 × 10 ⁶ cells, the cells were suspended in 8 ml of RPMI1640.ITPSGF medium and cultured in a CO ₂ incubator at 37 ° C. for 24 hours. Then, G418 (manufactured by Gibco) was added at 0.5 mg / ml and the cells were further cultured for 5 to 7 days to obtain a transformant. The obtained transformant strain is linseed lectin 120.
RPMI1640 / ITPSG containing (50ng / ml)
The cells were suspended in F medium at 5 × 10 ⁴ cells / ml, and 200 μl each was dispensed to a 96-well microtiter plate. CO ₂
After culturing in an incubator at 37 ° C. for 4 weeks, a chickpea lectin 120 resistant strain was obtained. After culturing the resistant strain,
From about 5 × 10 ⁶ cells ha - door method [Robert F. Magorusuki (Robert F.Margolskee), et al: Molecular
And Cellular Biology (Mol.Cell.Biol.)
, 8 , 2837 (1988)]. The recovered plasmid was electroporated [William J. Dower
wer) et al .: Nucleic Acid Research (Nucleic
Acids Res.), 16 , 6127 (1988)], and introduced into E. coli LE392 strain to obtain ampicillin resistant strain. A plasmid was prepared from the transformant using the plasmid preparation kit <plasmid <maxi kit manufactured by Qiagen, Inc., and its structure was cleaved with various restriction enzymes and examined, and it contained a cDNA of about 1.9 kb. It became clear. When this plasmid was named pAMoPRWM17 and was reintroduced into the KJM-1 strain by the same method as described above, it became resistant to Himaima lectin 120 again, which revealed that this cDNA was the causative gene of lectin resistance. .. K with pAMoPRWM17 introduced
The JM-1 strain can grow even in the presence of 200 ng / ml of Lima bean lectin 120.

【０１６３】２．α２→３シアリルトランスフェラ−ゼ
ｃＤＮＡ（WM17）の塩基配列の決定 （１）α２→３シアリルトランスフェラ−ゼｃＤＮＡ
（WM17）のｐＵＣ１１９への組み込み（図２７参照） ｐＡＭｏＰＲＷＭ１７の 1 μg をＹ−１００緩衝液30
μl に溶解し、20単位のEcoRV と20単位のAsp718〔ベー
リンガー・マンハイム(boehringer mannheim)社製〕を
加え、37℃で２時間消化反応を行なった。該反応液をア
ガロースゲル電気泳動後、約1.9kb のDNA 断片を回収し
た。2. Determination of the nucleotide sequence of α2 → 3 sialyltransferase cDNA (WM17) (1) α2 → 3 sialyltransferase cDNA
Incorporation of (WM17) into pUC119 (see FIG. 27) 1 μg of pAMoPRWM17 was added to Y-100 buffer 30.
After dissolving in μl, 20 units of EcoRV and 20 units of Asp718 (manufactured by Boehringer mannheim) were added, and a digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 1.9 kb was recovered.

【０１６４】また、ｐＵＣ１１９〔メッシング(Messin
g) ら：メソッド・イン・エンザイモロジー (Methods i
n Enzymology)、153 、3 、 (1987) 〕の1 μg をＫ−
２０緩衝液 30 μl に溶解し、20単位のSmaIを加え、37
℃で２時間消化反応を行なった。その後、塩化ナトリウ
ム濃度が１００ｍＭになるように塩化ナトリウムを添加
し、20単位のAsp718を加え、さらに37℃で２時間消化反
応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、
約3.16kbのDNA 断片を回収した。In addition, pUC119 [Messing (Messin
g) et al .: Methods in Enzymology (Methods i
n Enzymology), 153 , 3, (1987)].
Dissolve in 30 μl of 20 buffer and add 20 units of SmaI.
The digestion reaction was carried out at 0 ° C for 2 hours. Then, sodium chloride was added so that the sodium chloride concentration would be 100 mM, 20 units of Asp718 was added, and the digestion reaction was further carried out at 37 ° C. for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis,
A DNA fragment of about 3.16 kb was recovered.

【０１６５】上記で得られたｐＡＭｏＰＲＷＭ１７由来
のEcoRV - Asp718 断片(1.9kb) 0.2 μg とｐＵＣ１１
９由来の SmaI - Asp718断片(3.16kb) 0.1μg とをＴ４
リガーゼ緩衝液30μl に溶解し、T4DNA リガーゼ175 単
位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。該反応
液を用いて大腸菌HB101 株をコーエンらの方法によって
形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換
株から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。この
プラスミドをｐＵＣ１１９−ＷＭ１７と名付け、その構
造を制限酵素消化により確認した。0.2 μg of the EcoRV-Asp718 fragment (1.9 kb) derived from pAMoPRWM17 obtained above and pUC11
9-derived SmaI-Asp718 fragment (3.16 kb) 0.1 μg and T4
It was dissolved in 30 μl of ligase buffer, 175 units of T4 DNA ligase was added, and the binding reaction was performed at 12 ° C. for 16 hours. Escherichia coli HB101 strain was transformed with the reaction solution by the method of Cohen et al. To obtain an ampicillin resistant strain. A plasmid was isolated from this transformant according to a known method. This plasmid was named pUC119-WM17, and its structure was confirmed by restriction enzyme digestion.

【０１６６】（２）塩基配列決定用デレーションプラス
ミドの造成 ｐＵＣ１１９−ＷＭ１７の 2μg をＹ−１５０緩衝液30
μl に溶解し、20単位のBamHI と20単位のSphIを加え、
37℃で２時間消化反応を行なった。エタノール沈澱後、
Exo III 緩衝液（宝酒造社製のキロシークエンス用デレ
ーションキットに添付）100 μl に溶解した。また、同
プラスミド 2 μg をＹ−０緩衝液 30μl に溶解し、2
0単位のSacIを加え、37℃で２時間消化反応を行なっ
た。その後、塩化ナトリウム濃度が１５０ｍＭになるよ
うに塩化ナトリウムを添加し、20単位のNotIを加え、さ
らに37℃で２時間消化反応を行なった。エタノール沈澱
後、Exo III 緩衝液100 μl に溶解した。(2) Construction of deletion plasmid for nucleotide sequence determination 2 μg of pUC119-WM17 was added to Y-150 buffer 30.
Dissolve in μl, add 20 units BamHI and 20 units SphI,
The digestion reaction was carried out at 37 ° C for 2 hours. After ethanol precipitation,
It was dissolved in 100 μl of Exo III buffer solution (supplied with Takara Shuzo's kilosequencing deletion kit). Also, 2 μg of the plasmid was dissolved in 30 μl of Y-0 buffer and
0 unit of SacI was added and the digestion reaction was carried out at 37 ° C for 2 hours. Then, sodium chloride was added so that the sodium chloride concentration would be 150 mM, 20 units of NotI was added, and the digestion reaction was further carried out at 37 ° C. for 2 hours. After ethanol precipitation, it was dissolved in 100 μl of Exo III buffer.

【０１６７】上記で得られたｐＵＣ１１９−ＷＭ１７由
来の BamHI - SphI 断片および同プラスミド由来の Sac
I - NotI断片より、宝酒造社製のキロシークエンス用デ
レーションキットを用いてそれぞれ数十種のデレーショ
ンプラスミドを作成した。具体的な試薬および方法は、
キットに付与されている説明書に従った。上記で得られ
たデレーションプラスミドの塩基配列は、アプライド・
バイオシステムズ社のTaq DyeDeoxy^TM Terminator Cycl
e Sequencing Kit（商品番号401113）を用いて決定し
た。決定した塩基配列を配列番号６に示した。1742ベー
スペアー（bp）後はポリＡが付加している。この塩基配
列より、このＤＮＡは、329アミノ酸からなるタンパク
質をコードしていることが明らかになった。その配列を
配列番号７に示した。また、そのアミノ酸配列は、実施
例１でＴＹＨ細胞よりクローン化したα２→３シアリル
トランスフェラーゼをコードするＤＮＡのものと約９１
％の相同性があることも判明した。以上のことから、ヒ
ママメレクチン１２０に対する耐性化を指標に取得され
たｃＤＮＡ（WM17）は、α２→３シアリルトランスフェ
ラーゼをコードしていると推定される。BamHI-SphI fragment derived from pUC119-WM17 obtained above and Sac derived from the same plasmid
Dozens of deletion plasmids were prepared from the I-NotI fragment using a deletion kit for kilosequencing manufactured by Takara Shuzo. Specific reagents and methods are
The instructions given in the kit were followed. The nucleotide sequence of the deletion plasmid obtained above is
Biosystems Taq DyeDeoxy ^™ Terminator Cycl
It was determined using the e Sequencing Kit (product number 401113). The determined nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 6. After the 1742 base pair (bp), poly A is added. From this nucleotide sequence, it was revealed that this DNA codes for a protein consisting of 329 amino acids. The sequence is shown in SEQ ID NO: 7. The amino acid sequence was about 91 with that of the DNA encoding α2 → 3 sialyltransferase cloned from TYH cells in Example 1.
It was also found to be% homology. From the above, it is presumed that the cDNA (WM17) obtained using the resistance to Himame lectin 120 as an index encodes α2 → 3 sialyltransferase.

【０１６８】３．ＷＭ１７発現プラスミドを導入したＫ
ＪＭ−１株のα２→３シアリルトランスフェラーゼ活性
の測定 実施例１の５と同様の方法で、ＷＭ１７発現プラスミド
（ｐＡＭｏＰＲＷＭ１７）を導入したＫＪＭ−１株とコ
ントロールプラスミドであるｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃを導
入したＫＪＭ−１株のα２→３シアリルトランスフェラ
ーゼ活性を比較した。その結果、ｐＡＭｏＰＲＷＭ１７
を導入したＫＪＭ−１株のα２→３シアリルトランスフ
ェラーゼ活性は、ｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃを導入したＫＪ
Ｍ−１株の活性に比べて６〜７倍高かった。3. K introduced with WM17 expression plasmid
Measurement of α2 → 3 sialyltransferase activity of JM-1 strain In the same manner as in 5 of Example 1, the KJM-1 strain into which the WM17 expression plasmid (pAMoPRWM17) was introduced and the KJM-1 strain into which the control plasmid pAMoPRC3Sc was introduced. The α2 → 3 sialyltransferase activity of each was compared. As a result, pAMoPRWM17
The α2 → 3 sialyltransferase activity of the KJM-1 strain into which pAMoPRC3Sc was introduced was
It was 6 to 7 times higher than the activity of the M-1 strain.

【０１６９】４．α２→３シアリルトランスフェラーゼ
発現プラスミドを導入したＫＪＭ−１株におけるSialyl
-Le ^X 糖鎖の合成 実施例４の１で得られたｐＡＭｏＰＲＷＭ１７（α２→
３シアリルトランスフェラーゼ発現プラスミド）、およ
びｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃ（コントロールプラスミド）を
導入したＫＪＭ−１株を、G418を0.5mg/ml含むＲＰＭＩ
１６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地で培養後、それぞれ約 1×
10⁶ 個の細胞をマイクロチューブ（1.5ml：エッペンド
ルフ社製）にとり、遠心分離（550 × g、7 分間）によ
り細胞を集めた。ついで、0.1%のアジ化ナトリウムを含
むＰＢＳ（Ａ- ＰＢＳ）1ml で細胞の洗浄した。つい
で、集めた細胞に対し、Sialyl-Le ^X 糖鎖に対する抗体
であるＫＭ９３〔設楽ら：アンチキャンサー・リサーチ
( Anticancer Res.) 、9 、999 (1989)〕を用いて間接
蛍光抗体染色を行ない、これらの細胞におけるSialyl-L
e ^X 糖鎖の生産を調べた。集めた細胞に対しＫＭ９３を
それぞれ50μl ( 10μg / ml )加えて懸濁し、4 ℃で１
時間反応させた。ついで、細胞をＡ−ＰＢＳで３回洗浄
後、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)で蛍光標
識した抗マウスＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体（カッペル
社製、Ａ−ＰＢＳで20倍希釈して使用）20μl を加えて
懸濁し、4 ℃で30分間反応させた。ついで、細胞をＡ−
ＰＢＳで３回洗浄した後、再度Ａ−ＰＢＳに懸濁し、エ
ピックス・エリート・フローサイトメーター〔EPICS El
ite Flow Cytometer；コールター（COULTER ）社製〕で
解析を行なった。4. Sialyl in KJM-1 strain introduced with α2 → 3 sialyltransferase expression plasmid
-Le ^X sugar chain synthesis pAMoPRWM17 (α2 →
3 sialyltransferase expression plasmid) and pAMoPRC3Sc (control plasmid) -introduced KJM-1 strain in RPMI containing G418 at 0.5 mg / ml.
After culturing in 1640 · ITPSGF medium, each about 1 ×
10 ⁶ cells were placed in a microtube (1.5 ml: manufactured by Eppendorf), and the cells were collected by centrifugation (550 × g, 7 minutes). The cells were then washed with 1 ml of PBS containing 0.1% sodium azide (A-PBS). Then, for the collected cells, KM93, an antibody against the Sialyl-Le ^X sugar chain, [Shiratara et al .: AntiCancer Research]
(Anticancer Res.), 9 , 999 (1989)], and indirect fluorescent antibody staining was performed.
We examined the production of e ^X sugar chain. Add 50 μl (10 μg / ml) of KM93 to each of the collected cells and suspend.
Reacted for hours. After washing the cells 3 times with A-PBS, 20 μl of anti-mouse IgG antibody and IgM antibody fluorescently labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) (Kappel, diluted 20-fold with A-PBS) were added. The cells were suspended and reacted at 4 ° C for 30 minutes. Then, the cells are A-
After washing 3 times with PBS, resuspend in A-PBS and use the Epics Elite Flow Cytometer [EPICS El
ite Flow Cytometer; manufactured by COULTER).

【０１７０】対照として、ＫＭ９３の代わりに正常マウ
ス血清（Ａ−ＰＢＳで500 倍希釈して使用）を用いて上
記と同様に解析を行なった。結果を図２８に示す。直接
発現クローニングベクターｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃ（コン
トロールプラスミド）を導入したＫＪＭ−１株におい
て、ＫＭ９３で染色した細胞の蛍光強度は、対照のそれ
と比較して強いことがわかる。このことは、ＫＪＭ−１
株がもともとSialyl-Le ^X 糖鎖を発現していることを意
味している。また、ｐＡＭｏＰＲＷＭ１７（α２→３シ
アリルトランスフェラーゼ発現プラスミド）を導入した
ＫＪＭ−１株をＫＭ９３で染色した際の蛍光強度は、ｐ
ＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃ（コントロールプラスミド）を導入
したＫＪＭ−１株をＫＭ９３で染色した際の蛍光強度よ
りさらに強くなっていた。このことは、ＷＭ１７がコー
ドするα２→３シアリルトランスフェラーゼが、細胞内
で実際にSialyl-Le ^X 糖鎖を合成できることを示してい
る。As a control, normal mouse serum (500-fold diluted with A-PBS was used) instead of KM93, and the same analysis as above was performed. The results are shown in Fig. 28. It can be seen that in the KJM-1 strain into which the direct expression cloning vector pAMoPRC3Sc (control plasmid) was introduced, the fluorescence intensity of cells stained with KM93 is stronger than that of the control. This is KJM-1
This means that the strain originally expresses the Sialyl-Le ^X sugar chain. In addition, the fluorescence intensity when the KJM-1 strain into which pAMoPRWM17 (α2 → 3 sialyltransferase expression plasmid) was stained with KM93 was p
It was even stronger than the fluorescence intensity when the KJM-1 strain introduced with AMoPRC3Sc (control plasmid) was stained with KM93. This indicates that the α2 → 3 sialyltransferase encoded by WM17 can actually synthesize Sialyl-Le ^X sugar chains in cells.

【０１７１】５．動物細胞によるＷＭ２６６−４由来α
２→３シアリルトランスフェラーゼの分泌生産 （１）α２→３シアリルトランスフェラーゼ分泌生産用
プラスミドｐＡＭｏＰＲＳＡＷ１７−３１Ｆの造成（図
２９参照） クローン化したＷＭ１７がコードするα２→３シアリル
トランスフェラーゼはそのアミノ酸配列から、Ｎ末の８
アミノ酸を細胞質側にだし、それに続く１８アミノ酸か
らなる疎水性に富む領域で膜に結合し、残りの大半の触
媒部位を含むＣ末部分をゴルジ体内腔に露出するといっ
た構造をとると推定される。そこで、以下に示す方法に
従って、α２→３シアリルトランスフェラーゼの膜結合
領域を除去し、かわりにヒト顆粒球コロニー刺激因子の
シグナル配列ならびにStaphylococcus aureus のプロテ
インＡのＩｇＧとの結合領域を付加することによりα２
→３シアリルトランスフェラーゼを分泌生産させた。α
２→３シアリルトランスフェラーゼの膜結合領域以降
〔31番目のＰｈｅから329 番目のＰｈｅまで〕をコード
するＤＮＡをＰＣＲ法を用いて調製し、実施例１の３
（６）で得られた分泌発現ベクターｐＡＭｏＰＲＳＡに
組み込んだ。5. WM266-4 derived α by animal cells
Secretion production of 2 → 3 sialyltransferase (1) Construction of plasmid pAMoPRSAW17-31F for secretory production of α2 → 3 sialyltransferase (see FIG. 29) The α2 → 3 sialyltransferase encoded by the cloned WM17 was determined from its amino acid sequence to N-terminal. Of 8
It is presumed to have a structure in which the amino acid is exposed to the cytoplasmic side, and the subsequent 18-amino acid-rich region that binds to the membrane and exposes the C-terminal part containing most of the remaining catalytic site to the Golgi body lumen. .. Therefore, according to the method described below, the membrane-binding region of α2 → 3 sialyltransferase was removed, and instead the signal sequence of human granulocyte colony-stimulating factor and the binding region of Staphylococcus aureus protein A to IgG were added.
→ 3 Sialyltransferase was secreted and produced. α
A DNA encoding the membrane-binding region of 2 → 3 sialyltransferase and thereafter [31st Phe to 329th Phe] was prepared by the PCR method, and the DNA of 3 of Example 1 was prepared.
It was incorporated into the secretory expression vector pAMoPRSA obtained in (6).

【０１７２】ＰＣＲ用のプライマーとして、以下に示す
２種の合成ＤＮＡ〔W17-A(31F) (44mer)および W17-C
(36mer)〕をアプライド・バイオシステムズ社３８０Ａ
・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。As primers for PCR, the following two kinds of synthetic DNAs [W17-A (31F) (44mer) and W17-C were used.
(36mer)] by Applied Biosystems 380A
-Synthesized using a DNA synthesizer.

【０１７３】[0173]

【化８】 [Chemical 8]

【０１７４】W17-A(31F)にはEcoRV サイトが W17-Cには
Asp718サイトが導入されるように設計されているため、
ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片はEcoRV とAsp718で切断
した後に、ｐＡＭｏＰＲＳＡのStuIサイトとAsp718サイ
ト間に組み込むことができる。ＰＣＲは、GeneAmp ^TM D
NA Amplification Reagent Kit with AmpliTaq^TM Recom
binant Taq DNA Polymerase （宝酒造社製）を用いて行
なった。反応液の調製はキットに指示された方法にした
がって行ない、PERKIN ELMER CETUS DNA Thermal Cycle
r （宝酒造社製）を用いて、９４℃／１分、５５℃／１
分、７２℃／３分のインキュベーションを３０サイクル
行なった後、さらに７２℃で７分間インキュベートし
た。鋳型としては、上記２（１）で造成したプラスミド
ｐＵＣ１１９−ＷＭ１７を１ng使用した。反応終了後、
クロロホルム抽出およびエタノール沈澱を行なった後、
Ｙ−１００緩衝液 30 μl に溶解し、20単位のEcoRV お
よび20単位のAsp718を加え、37℃で２時間消化反応を行
なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約0.91
kbのDNA 断片を回収した。There is an EcoRV site on W17-A (31F) on W17-C
Asp718 site is designed to be deployed,
The DNA fragment amplified by PCR can be inserted between EcoRV and Asp718 and then inserted between the StuI site and the Asp718 site of pAMoPRSA. PCR is GeneAmp ^™ D
NA Amplification Reagent Kit with AmpliTaq ^TM Recom
It was performed using binant Taq DNA Polymerase (Takara Shuzo). The reaction solution is prepared according to the method specified in the kit, and the PERKIN ELMER CETUS DNA Thermal Cycle is used.
r (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), 94 ° C / 1 min, 55 ° C / 1
After 30 minutes of 72 ° C./3 min incubation for 30 cycles, the cells were further incubated at 72 ° C. for 7 minutes. As a template, 1 ng of the plasmid pUC119-WM17 constructed in 2 (1) above was used. After the reaction,
After performing chloroform extraction and ethanol precipitation,
It was dissolved in 30 μl of Y-100 buffer, 20 units of EcoRV and 20 units of Asp718 were added, and digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, about 0.91
A kb DNA fragment was recovered.

【０１７５】また、ｐＡＭｏＰＲＳＡの２μg をＹ−１
００緩衝液 30 μl に溶解し、20単位のStuIと20単位の
Asp718を加え、37℃２時間消化反応を行なった。該反応
液をアガロースゲル電気泳動後、約9.06kbのDNA 断片を
回収した。上記で得られたＰＣＲで増幅したＤＮＡ由来
のEcoRV - Asp718断片(0.91kb) 0.1μg とｐＡＭｏＰＲ
ＳＡ由来のStuI - Asp718 断片(9.06kb) 0.1μg とをＴ
４リガーゼ緩衝液30μl に溶解し、T4DNA リガーゼ175
単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。In addition, 2 μg of pAMoPRSA was added to Y-1.
Dissolve in 30 μl of 00 buffer and add 20 units of StuI and 20 units of StuI.
Asp718 was added, and a digestion reaction was carried out at 37 ° C for 2 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 9.06 kb was recovered. PCR-amplified DNA-derived EcoRV-Asp718 fragment (0.91 kb) 0.1 μg and pAMoPR
SA-derived StuI-Asp718 fragment (9.06 kb) 0.1 μg and T
4 Dissolve in 30 μl of ligase buffer and use T4 DNA ligase175
The unit was added and the binding reaction was carried out at 12 ° C. for 16 hours.

【０１７６】該反応液を用いて大腸菌HB101 株をコーエ
ンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を
得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミ
ドを単離した。このプラスミドをｐＡＭｏＰＲＳＡＷ１
７- ３１Ｆと名付け、その構造を制限酵素消化により確
認した。 （２）ナマルバＫＪＭ−１細胞を宿主としたα２→３シ
アリルトランスフェラーゼの分泌生産 実施例３の１（６）で得られたプラスミドｐＡＭｏＰＲ
ＳＡ（分泌発現ベクター；コントロール）および上記
（１）で造成したｐＡＭｏＰＲＳＡＷ１７- ３１Ｆ（α
２→３シアリルトランスフェラーゼ分泌発現用プラスミ
ド）をキィアジェン (Qiagen) 社製のプラスミド調製キ
ットである>plasmid<maxi kit （商品番号41031)を用い
て調製した。取得したプラスミドはエタノール沈澱後、
1 μg/μl になるようにＴＥ緩衝液に溶解した。その
後、両プラスミドを、エレクトロポーレーション法〔Mi
yajiら：サイトテクノロジー(Cytotechnology)、３、１
３３（１９９０）〕により、それぞれナマルバＫＪＭ−
１株に導入した。1.6 ×10⁶細胞あたり4 μg のプラス
ミドを導入後、8ml のＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧＦ
培地に懸濁し、CO₂ インキュベーターで37℃で24時間培
養した。その後、G418（ギブコ社製）を0.5mg/mlになる
ように添加してさらに７〜14日間培養し、形質転換株を
得た。取得した形質転換株は、それぞれG418を0.5mg/ml
含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地30mlに1 ×10
⁵ 細胞/ml になるように懸濁し、CO₂ インキュベーター
で37℃で８日間培養した。その後、遠心分離（160 ×
g、10分間）により細胞を除き上清を回収し、再度遠心
分離（1500× g、10分間）後、その上清を回収した。こ
のようにして取得した培養上清は、使用するまで -80℃
で保存した。The reaction solution was used to transform Escherichia coli HB101 strain by the method of Cohen et al. To obtain an ampicillin resistant strain. A plasmid was isolated from this transformant according to a known method. This plasmid was designated as pAMoPRSAW1.
It was named 7-31F and its structure was confirmed by digestion with restriction enzymes. (2) Secretory production of α2 → 3 sialyltransferase using Namalwa KJM-1 cells as a host The plasmid pAMoPR obtained in 1 (6) of Example 3
SA (secretory expression vector; control) and pAMoPRSAW17-31F (α) constructed in (1) above.
A 2 → 3 sialyltransferase secretory expression plasmid) was prepared using> plasmid <maxi kit (product number 41031), which is a plasmid preparation kit manufactured by Qiagen. The obtained plasmid was precipitated with ethanol,
It was dissolved in TE buffer so that the concentration became 1 μg / μl. Then, both plasmids were electroporated [Mi
yaji et al .: Cytotechnology, 3 , 1
33 (1990)], respectively, Namalba KJM-
It was introduced into 1 strain. After introducing 4 μg of plasmid per 1.6 × 10 ⁶ cells, 8 ml of RPMI1640.ITPSGF
The cells were suspended in a medium and cultured in a CO ₂ incubator at 37 ° C for 24 hours. Then, G418 (manufactured by Gibco) was added at 0.5 mg / ml and the cells were further cultured for 7 to 14 days to obtain a transformant. The obtained transformants each contained 0.5 mg / ml of G418.
1 x 10 in 30 ml of RPMI1640 / ITPSGF medium containing
^The cells were suspended at ⁵ cells / ml and cultured in a CO ₂ incubator at 37 ° C for 8 days. Then centrifuge (160 x
The cells were removed by g (10 minutes), and the supernatant was recovered. After centrifugation (1500 × g, 10 minutes) again, the supernatant was recovered. The culture supernatant obtained in this way is kept at -80 ° C until use.
Saved in.

【０１７７】プラスミドｐＡＭｏＰＲＳＡＷ１７−３１
Ｆのコードするα２→３シアリルトランスフェラーゼは
Staphylococcus aureus のプロテインＡのＩｇＧとの結
合領域との融合タンパク質として分泌生産されることに
なるため、ＩｇＧセファロース（Sepharose ）を用い
て、容易に精製することができる。そこで、上記で得ら
れた培養上清にアジ化ナトリウムを最終濃度0.1 ％にな
るように添加した後、製品説明書にしたがって前処理し
たＩｇＧセファロース〔ファルマシア(Pharmacia) 製 ]
を100 μl 添加し、４℃で１晩緩やかに攪拌した。その
後、遠心分離（160 × g、10分間）によりＩｇＧセファ
ロースを回収し、ＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地
１mlで３回洗浄後、このＩｇＧセファロース 5μl を直
接用いて、α２→３シアリルトランスフェラーゼ活性を
測定した。活性測定は30μl のアッセイ溶液〔 0.1M カ
コジル酸−塩酸 (pH6.5), 0.01M 塩化マンガン， 0.45%
トライトンX-100, 0.1mM基質, 上記ＩｇＧセファロース
(5μl), 5mM CMP−シアル酸(添加あるいは無添加) 〕
中で37℃で2 時間反応後、高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）により生産物の同定を行なうことにより行
なった。基質としては各種糖鎖［Lacto-N-neotetraose
(LNnT)、Lacto-N-tetraose (LNT)、Lacto-N-fucopentao
se III (LNFP-III) および Lacto-N-fucopentaose V (L
NFP-V)；いずれもオックスフォード・グライコシステム
ズ社製でそれぞれの構造は第２表に示すとおりである〕
をアミノピリジンで蛍光標識したものを使用した。基質
の蛍光標識は、常法〔Akihiro Kondo ら：アグリカルチ
ュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー (Agri
c. Biol. Chem.) 、54, 2169 (1990) 〕に従って行なっ
た。それぞれのＩｇＧセファロースについて、CMP-シア
ル酸（糖供与体）の含まれたアッセイ溶液と含まれない
アッセイ溶液を用いて反応後、ＨＰＬＣで解析し、CMP-
シアル酸が含まれたアッセイ溶液でのみ出現するピーク
を生成物とした。反応の終了したアッセイ溶液は、100
℃で5 分処理後、遠心分離（10000 × g、10分間）し、
その上清のうち10μl をＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣ
は、ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ- ８０Ｔ_M カラム（4.6mm ×
30cm；東ソー社製）を使用し、溶出液として0.02M 酢酸
アンモニウム緩衝液 (pH4.0)を用い、溶出温度50℃、流
速 1ml/分で溶出を行なった。生成物の検出は、島津製
作所製のFluorescence HPLC Monitor (RF-535T) を用い
て行なった（励起波長320nm 、放射波長400nm ）。生成
物の同定は、スタンダードと溶出時間が一致すること、
および生成物のシアリダーゼ処理により基質が再生成す
ることより行なった。生成物の定量は、同様にしてアミ
ノピリジル化したラクトースをスタンダードとして用
い、蛍光強度を比較することにより行なった。アッセイ
の結果を第２表に示す。LNnTに対する活性を100 とした
ときの各種糖鎖基質に対する相対活性を合わせて示し
た。Plasmid pAMoPRSAW17-31
The α2 → 3 sialyltransferase encoded by F is
Since it will be secreted and produced as a fusion protein with the binding region of Staphylococcus aureus protein A with IgG, it can be easily purified using IgG sepharose. Therefore, after adding sodium azide to the above-obtained culture supernatant to a final concentration of 0.1%, pretreatment was carried out according to the product instructions IgG sepharose [Pharmacia].
Was added to the mixture, and the mixture was gently stirred overnight at 4 ° C. After that, IgG sepharose was recovered by centrifugation (160 × g, 10 minutes), washed 3 times with 1 ml of RPMI1640.ITPSGF medium, and 5 μl of this IgG sepharose was directly used to measure α2 → 3 sialyltransferase activity. 30 μl of assay solution [0.1 M cacodylic acid-hydrochloric acid (pH 6.5), 0.01 M manganese chloride, 0.45%
Triton X-100, 0.1 mM substrate, above IgG Sepharose
(5 μl), 5 mM CMP-sialic acid (added or not added))
The reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours, and the product was identified by high performance liquid chromatography (HPLC). As a substrate, various sugar chains [Lacto-N-neotetraose
(LNnT), Lacto-N-tetraose (LNT), Lacto-N-fucopentao
se III (LNFP-III) and Lacto-N-fucopentaose V (L
NFP-V); all manufactured by Oxford Glyco Systems, Inc., and their structures are shown in Table 2.]
Was fluorescently labeled with aminopyridine. Fluorescent labeling of substrates is carried out by conventional methods [Akihiro Kondo et al .: Agricultural and Biological Chemistry (Agrihiro Kondo et al.
Biol. Chem.), 54 , 2169 (1990)]. Each IgG sepharose was reacted with an assay solution containing CMP-sialic acid (sugar donor) and an assay solution not containing CMP-sialic acid, and then analyzed by HPLC to obtain CMP-
The peak was the product that appeared only in the assay solution containing sialic acid. After the reaction is completed,
After treatment at ℃ for 5 minutes, centrifuge (10000 × g, 10 minutes),
10 μl of the supernatant was subjected to HPLC. HPLC
Is a TSKgel ODS-80T _M column (4.6 mm ×
30 cm; manufactured by Tosoh Corporation) was used, and 0.02 M ammonium acetate buffer (pH 4.0) was used as an eluent, and elution was performed at an elution temperature of 50 ° C. and a flow rate of 1 ml / min. The product was detected using a Fluorescence HPLC Monitor (RF-535T) manufactured by Shimadzu Corporation (excitation wavelength 320 nm, emission wavelength 400 nm). The identity of the product is determined by matching the elution time with the standard,
And sialidase treatment of the product to regenerate the substrate. The product was quantified by comparing the fluorescence intensities using lactose similarly aminopyridylated as a standard. The results of the assay are shown in Table 2. The relative activity to various sugar chain substrates when the activity to LNnT was set to 100 is also shown.

【０１７８】[0178]

【表２】 [Table 2]

【０１７９】ｐＡＭｏＰＲＳＡＷ１７−３１Ｆを導入し
たナマルバ細胞の培養上清由来のＩｇＧセファロースを
使用した場合には、いずれの糖鎖を基質とした場合もα
２→３シアリルトランスフェラーゼ活性が検出された。
一方、ベクターであるｐＡＭｏＰＲＳＡを導入したナマ
ルバ細胞の培養上清由来のＩｇＧセファロースを使用し
た場合には、いずれの糖鎖を基質とした場合も活性は検
出されなかった。以上の結果から、α２→３シアリルト
ランスフェラーゼがStaphylococcus aureus のプロテイ
ンＡのＩｇＧとの結合領域との融合タンパク質として培
養上清中に分泌生産されること、また、それがＩｇＧセ
ファロースを用いて、容易に回収、精製されることが示
された。また、これまでに精製が報告されている公知の
α２→３シアリルトランスフェラーゼのLTN に対する活
性を100 としたときの各種糖鎖基質に対する相対活性
〔ワインスタイン(Wienstein) ら：ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem.) 257,
13845 (1982)〕を第２表に合わせて示した。公知のα２
→３シアリルトランスフェラーゼは、LNnTよりもLNTに
対して特異性が高いのに対し、本発明のＷＭ１７のコー
ドするα２→３シアリルトランスフェラーゼはLNT より
もLNnTに対して特異性が高いことから、このα２→３シ
アリルトランスフェラーゼは、公知の酵素とは基質特異
性の異なる新規な酵素であることが明らかとなった。ま
た、本発明のＷＭ１７のコードするα２→３シアリルト
ランスフェラーゼは、LNFP-IIIも基質とし得るが、これ
までにこのようにLNFP-IIIに対して酵素活性を有するα
２→３シアリルトランスフェラーゼの報告はない。この
ことは、この酵素を用いることによりin vitroでLe^X 糖
鎖から直接Sialyl-Le ^X 糖鎖を合成することができるこ
とを示している。また、本発明のＷＭ１７のコードする
α２→３シアリルトランスフェラーゼは、基質としてLN
nTだけでなくLNT も利用可能なことから、Sialyl-Le ^X
糖鎖のみならずSialyl-Le ^a 糖鎖も合成することができ
る。すなわち本発明のＷＭ１７のコードするα２→３シ
アリルトランスフェラーゼを用いて糖鎖の末端構造をNe
uAc α2-3Galβ1-4GlcNAc あるいはNeuAc α2-3Galβ1-
3GlcNAc に変換した後、α１→３フコシルトランスフェ
ラーゼ（fucosyltransferase）あるいはα１→４フコシ
ルトランスフェラーゼ（fucosyltransferase）を用い
て、それぞれSialyl-Le ^X 糖鎖またはSialyl-Le ^a 糖鎖
を合成することができる。また、本発明のＷＭ１７のコ
ードするα２→３シアリルトランスフェラーゼは、公知
のα２→３シアリルトランスフェラーゼよりもLNnTに対
する基質特異性が強いので、Sialyl-Le ^X 糖鎖の合成に
おいて、公知のα２→３シアリルトランスフェラーゼよ
りも優れている。When IgG sepharose derived from the culture supernatant of Namalwa cells into which pAMoPRSAW17-31F had been introduced was used, α was obtained when any sugar chain was used as a substrate.
2 → 3 sialyltransferase activity was detected.
On the other hand, when IgG sepharose derived from the culture supernatant of Namalwa cells into which the vector pAMoPRSA was introduced was used, no activity was detected using any sugar chain as a substrate. From the above results, α2 → 3 sialyltransferase was secreted and produced in the culture supernatant as a fusion protein with the binding region of Staphylococcus aureus protein A to IgG, and it was easily produced using IgG sepharose. It was shown to be recovered and purified. Also, relative activity of various known α2 → 3 sialyltransferases, which have been reported to be purified, to various sugar chain substrates when the activity against LTN was set to 100 [Wienstein et al .: Journal of.
Biological Chemistry (J. Biol. Chem.) 257 ,
13845 (1982)] is also shown in Table 2. Known α2
→ 3 sialyltransferase has higher specificity for LNT than LNnT, whereas α2 → 3 sialyltransferase encoded by WM17 of the present invention has higher specificity for LNnT than LNT. → 3 sialyltransferase was revealed to be a novel enzyme having a substrate specificity different from that of a known enzyme. The α2 → 3 sialyltransferase encoded by WM17 of the present invention can also use LNFP-III as a substrate, but α has an enzymatic activity against LNFP-III thus far.
There is no report of 2 → 3 sialyltransferase. This indicates that the Sialyl-Le ^X sugar chain can be directly synthesized from the Le ^X sugar chain in vitro by using this enzyme. Further, the α2 → 3 sialyltransferase encoded by WM17 of the present invention is LN as a substrate.
Not only nT but also LNT is available, so Sialyl-Le ^X
Not only sugar chains but also Sialyl-Le ^a sugar chains can be synthesized. That is, the terminal structure of the sugar chain is expressed by Ne using α2 → 3 sialyltransferase encoded by WM17 of the present invention.
uAc α2-3Galβ1-4GlcNAc or NeuAc α2-3Galβ1-
After conversion into 3GlcNAc, α1 → 3 fucosyltransferase (fucosyltransferase) or α1 → 4 fucosyltransferase (fucosyltransferase) can be used to synthesize ^a Sialyl-Le ^X sugar chain or a Sialyl-Le ^a sugar chain, respectively. In addition, the α2 → 3 sialyltransferase encoded by WM17 of the present invention has a stronger substrate specificity for LNnT than the known α2 → 3 sialyltransferase, and therefore, in the synthesis of Sialyl-Le ^X sugar chain, the known α2 → 3 sialyltransferase is Better than transferase.

【０１８０】[0180]

【発明の効果】本発明により、有用生理活性を有する糖
鎖とその修飾物の製造および有用生理活性タンパク質に
結合している糖鎖の改良に有用な新規α２→３シアリル
トランスフェラーゼが提供される。INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention provides a novel α2 → 3 sialyltransferase useful for producing a sugar chain having a useful physiological activity and a modified product thereof and for improving a sugar chain bound to a useful physiologically active protein.

【０１８１】[0181]

【配列表】配列番号： 1 配列の長さ： 1919 配列の型： 核酸 鎖の数： 二本鎖 配列の種類： cDNA to mRNA 起源： 生物名： ヒト 株名： ＴＹＨ細胞 細胞の種類： 組織球腫細胞株 配列： GTCGGGGCGC CTAACGGATC GGAGCTGCGC GCGGATTTAC CTCGCCCCGC CCCGCTCCAC 60 CCGCGAGGGT GGCCCGAGGC AGCCGGGATG ACACTTCTCC CCAGGAACCC TGCTATCTGC 120 TGAGAAAC ATG ACC AGC AAA TCT CAC TGG AAG CTC CTG GCC CTG GCT CTG 170 Met Thr Ser Lys Ser His Trp Lys Leu Leu Ala Leu Ala Leu 1 5 10 GTC CTT GTT GTT GTC ATG GTG TGG TAT TCC ATC TCC CGA GAA GAT AGG 218 Val Leu Val Val Val Met Val Trp Tyr Ser Ile Ser Arg Glu Asp Arg 15 20 25 30 TAC ATT GAG TTC TTT TAT TTT CCC ATC TCA GAG AAG AAA GAG CCA TGC 266 Tyr Ile Glu Phe Phe Tyr Phe Pro Ile Ser Glu Lys Lys Glu Pro Cys 35 40 45 TTC CAG GGT GAG GCA GAG AGA CAG GCC TCT AAG ATT TTT GGC AAC CGT 314 Phe Gln Gly Glu Ala Glu Arg Gln Ala Ser Lys Ile Phe Gly Asn Arg 50 55 60 TCT AGG GAC CAG CCC ATC TTT CTG CAG CTT AAG GAT TAT TTC TGG GTA 362 Ser Arg Asp Gln Pro Ile Phe Leu Gln Leu Lys Asp Tyr Phe Trp Val 65 70 75 AAG ACG CCA TCC ACC TAT GAG CTG CCC TTT GGG ACT AAA GGA AGT GAA 410 Lys Thr Pro Ser Thr Tyr Glu Leu Pro Phe Gly Thr Lys Gly Ser Glu 80 85 90 GAC CTT CTT CTC CGG GTG CTG GCC ATC ACT AGC TAT TCT ATA CCT GAG 458 Asp Leu Leu Leu Arg Val Leu Ala Ile Thr Ser Tyr Ser Ile Pro Glu 95 100 105 110 AGC ATA AAG AGC CTG GAG TGT CGT CGC TGT GTT GTG GTG GGA AAT GGG 506 Ser Ile Lys Ser Leu Glu Cys Arg Arg Cys Val Val Val Gly Asn Gly 115 120 125 CAC CGG TTG CGG AAC AGC TCG CTG GGC GGT GTC ATC AAC AAG TAC GAC 554 His Arg Leu Arg Asn Ser Ser Leu Gly Gly Val Ile Asn Lys Tyr Asp 130 135 140 GTG GTC ATC AGA TTG AAC AAT GCT CCT GTG GCT GGC TAC GAG GGA GAT 602 Val Val Ile Arg Leu Asn Asn Ala Pro Val Ala Gly Tyr Glu Gly Asp 145 150 155 GTG GGC TCC AAG ACC ACC ATA CGT CTC TTC TAT CCT GAG TCG GCC CAC 650 Val Gly Ser Lys Thr Thr Ile Arg Leu Phe Tyr Pro Glu Ser Ala His 160 165 170 TTT GAC CCT AAA ATA GAA AAC AAC CCA GAC ACG CTC TTG GTC CTG GTA 698 Phe Asp Pro Lys Ile Glu Asn Asn Pro Asp Thr Leu Leu Val Leu Val 175 180 185 190 GCT TTC AAG GCG ATG GAC TTC CAC TGG ATT GAG ACC ATC TTG AGT GAT 746 Ala Phe Lys Ala Met Asp Phe His Trp Ile Glu Thr Ile Leu Ser Asp 195 200 205 AAG AAG CGG GTG CGA AAA GGC TTC TGG AAA CAG CCT CCC CTC ATC TGG 794 Lys Lys Arg Val Arg Lys Gly Phe Trp Lys Gln Pro Pro Leu Ile Trp 210 215 220 GAT GTC AAC CCC AAA CAG GTC CGG ATT CTA AAC CCC TTC TTT ATG GAG 842 Asp Val Asn Pro Lys Gln Val Arg Ile Leu Asn Pro Phe Phe Met Glu 225 230 235 ATT GCA GCA GAC AAG CTC CTG AGC CTG CCC ATA CAA CAG CCT CGA AAG 890 Ile Ala Ala Asp Lys Leu Leu Ser Leu Pro Ile Gln Gln Pro Arg Lys 240 245 250 ATC AAG CAG AAG CCA ACC ACG GGT CTG CTA GCC ATC ACC TTG GCT CTA 938 Ile Lys Gln Lys Pro Thr Thr Gly Leu Leu Ala Ile Thr Leu Ala Leu 255 260 265 270 CAC CTC TGC GAC TTA GTG CAC ATT GCT GGC TTT GGC TAT CCA GAT GCC 986 His Leu Cys Asp Leu Val His Ile Ala Gly Phe Gly Tyr Pro Asp Ala 275 280 285 TCC AAC AAG AAG CAG ACC ATC CAC TAC TAT GAA CAG ATC ACA CTT AAG 1034 Ser Asn Lys Lys Gln Thr Ile His Tyr Tyr Glu Gln Ile Thr Leu Lys 290 295 300 TCT ATG GCG GGA TCA GGC CAT AAT GTC TCC CAA GAG GCT ATC GCC ATC 1082 Ser Met Ala Gly Ser Gly His Asn Val Ser Gln Glu Ala Ile Ala Ile 305 310 315 AAG CGG ATG CTA GAG ATG GGA GCT GTC AAG AAC CTC ACA TAC TTC TGA 1130 Lys Arg Met Leu Glu Met Gly Ala Val Lys Asn Leu Thr Tyr Phe TER 320 325 330 333 CTTGGATGGG AGCTGTAACA CCTTGGTTCC CTACTTTGCC ATCTGAGTAG GCCCTGTCTA 1190 CAGCTTAGGG GTTCCTGGTG CCAGTACAAT CCAATTGAAC TCACCCTCAA TGGAGAGGGT 1250 GTTCTGGGGC TGTCCAGGTC TCCAGAGAGG CTATGTCCCT GCCTACTTTG GTGGATTTCA 1310 AATCCAGACA GGGTAGTCAC ACCAGGCTAC AGGAGCCTGG CTAAAAGGGG GGGGGGGGCT 1370 GTTACTGTGG CATCCCCTCT CTCAGCCAGC ACAAAGAGCT GTTTTGTTTT GTTTTGTTTT 1430 GTTTTGTTTT GTTTCGTTTT GTTTCGTTTT GTTTTGTCTT GTATTGTTGG TGGTGGTTGG 1490 TTGGGTTTTG TTTGTTTGTT TTTGTTTGCT TTGTTTTGTT CTTGAGACAG GGTCTGACTG 1550 TGAAACCCTG GCTAATCTGG AACTCACTAT GTAGACCAGA CTGGTCTTGA ACTCACAGAG 1610 ATCCAACTGC CTTTGCCTCC CAAGTGTTGG GATGAAAGGC ATGTACTACG CCTGGCCCCA 1670 ACACCAAGAG ATTATTTAAC ATTCTATTTA ATTAAGGGGT AGGAAAATGA ATGGGCTGGT 1730 CCCAGGATGT TCATGAAAGG GACACAATAC AGTGTTCTGC CCACTTTTTA ATAAAATTTA 1790 CATGTGATTG GCCTGTTAAG GCCCAATTCT AGAGCTGGCC TCCCAGAAAG ATGGAGGCAT 1850 CAAGAGTGGG AGGGTGTCCT CCAGAGAGGG GTTGCTACTT CCCAGCAGGC ATGGGGGGAG 1910 CATTGACAA 1919[Sequence listing] SEQ ID NO: 1 Sequence length: 1919 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double-stranded Sequence type: cDNA to mRNA Origin: Organism name: Human strain name: TYH cell Cell type: Histiosphere Tumor Cell Line Sequence: GTCGGGGCGC CTAACGGATC GGAGCTGCGC GCGGATTTAC CTCGCCCCGC CCCGCTCCAC 60 CCGCGAGAGTGT GGCCCGAGGC AGCCGGGATG ACACTTCTCC CCAGGAACCC TGCTATCTGC 120 TGAGAuACu Leu Lau Cru Cru 5 10 GTC CTT GTT GTT GTC ATG GTG TGG TAT TCC ATC TCC CGA GAA GAT AGG 218 Val Leu Val Val Val Met Val Trp Tyr Ser Ile Ser Arg Glu Asp Arg 15 20 25 30 TAC ATT GAG TTC TTT TAT TTT CCC ATC TCA GAG AAG AAA GAG CCA TGC 266 Tyr Ile Glu Phe Phe Tyr Phe Pro Ile Ser Glu Lys Lys Glu Pro Cys 35 40 45 TTC CAG GGT GAG GCA GAG AGA CAG GCC TCT AAG ATT TTT GGC AAC CGT 314 Phe Gln Gly Glu Ala Glu Arg Gln Ala Ser Lys Ile Phe Gly Asn Arg 50 55 60 TCT AGG GAC CAG CCC ATC TTT CTG CAG CTT AAG GAT TAT TTC TGG G TA 362 Ser Arg Asp Gln Pro Ile Phe Leu Gln Leu Lys Asp Tyr Phe Trp Val 65 70 75 AAG ACG CCA TCC ACC TAT GAG CTG CCC TTT GGG ACT AAA GGA AGT GAA 410 Lys Thr Pro Ser Thr Tyr Glu Leu Pro Phe Gly Thr Lys Gly Ser Glu 80 85 90 GAC CTT CTT CTC CGG GTG CTG GCC ATC ACT AGC TAT TCT ATA CCT GAG 458 Asp Leu Leu Leu Arg Val Leu Ala Ile Thr Ser Tyr Ser Ile Pro Glu 95 100 105 110 AGC ATA AAG AGC CTG GAG TGT CGT CGC TGT GTT GTG GTG GGA AAT GGG 506 Ser Ile Lys Ser Leu Glu Cys Arg Arg Cys Val Val Val Gly Asn Gly 115 120 125 CAC CGG TTG CGG AAC AGC TCG CTG GGC GGT GTC ATC AAC AAG TAC GAC 554 His Arg Leu Arg Asn Ser Ser Leu Gly Gly Val Ile Asn Lys Tyr Asp 130 135 140 GTG GTC ATC AGA TTG AAC AAT GCT CCT GTG GCT GGC TAC GAG GGA GAT 602 Val Val Ile Arg Leu Asn Asn Ala Pro Val Ala Gly Tyr Glu Gly Asp 145 150 155 GTG GGC TCC AAG ACC ACC ATA CGT CTC TTC TAT CCT GAG TCG GCC CAC 650 Val Gly Ser Lys Thr Thr Ile Arg Leu Phe Tyr Pro Glu Ser Ala His 160 165 170 TTT GAC CCT AAA ATA GAA AAC AAC CCA GAC ACG CTC TTG GTC CTG GTA 698 Phe Asp Pro Lys Ile Glu Asn Asn Pro Asp Thr Leu Leu Val Leu Val 175 180 185 190 GCT TTC AAG GCG ATG GAC TTC CAC TGG ATT GAG ACC ATC TTG AGT GAT 746 Ala Phe Lys Ala Met Asp Phe His Trp Ile Glu Thr Ile Leu Ser Asp 195 200 205 AAG AAG CGG GTG CGA AAA GGC TTC TGG AAA CAG CCT CCC CTC ATC TGG 794 Lys Lys Arg Val Arg Lys Gly Phe Trp Lys Gln Pro Pro Leu Ile Trp 210 215 220 GAT GTC AAC CCC AAA CAG GTC CGG ATT CTA AAC CCC TTC TTT ATG GAG 842 Asp Val Asn Pro Lys Gln Val Arg Ile Leu Asn Pro Phe Phe Met Glu 225 230 235 ATT GCA GCA GAC AAG CTC CTG AGC CTG CCC ATA CAA CAG CCT CGA AAG 890 Ile Ala Ala Asp Lys Leu Leu Ser Leu Pro Ile Gln Gln Pro Arg Lys 240 245 250 ATC AAG CAG AAG CCA ACC ACG GGT CTG CTA GCC ATC ACC TTG GCT CTA 938 Ile Lys Gln Lys Pro Thr Thr Gly Leu Leu Ala Ile Thr Leu Ala Leu 255 260 265 270 CAC CTC TGC GAC TTA GTG CAC ATT GCT GGC TTT GGC TAT CCA GAT GCC 986 His Leu Cys Asp Leu Val His Ile Ala Gly Phe Gly Tyr Pro Asp Ala 275 280 285 TCC AAC AAG AAG CAG ACC ATC CAC TAC TATGAA CAG ATC ACA CTT AAG 1034 Ser Asn Lys Lys Gln Thr Ile His Tyr Tyr Glu Gln Ile Thr Leu Lys 290 295 300 TCT ATG GCG GGA TCA GGC CAT AAT GTC TCC CAA GAG GCT ATC GCC ATC 1082 Ser Met Ala Gly Ser Gly His Asn Val Ser Gln Glu Ala Ile Ala Ile 305 310 315 AAG CGG ATG CTA GAG ATG GGA GCT GTC AAG AAC CTC ACA TAC TTC TGA 1130 Lys Arg Met Leu Glu Met Gly Ala Val Lys Asn Leu Thr Tyr Phe TER 320 325 330 333 CTTGGATGGG AGCTGTAACA CCTTGGTTCC CTACTTTGCC ATCTGAGTAG GCCCTGTCTA 1190 CAGCTTAGGG GTTCCTGGTG CCAGTACAAT CCAATTGAAC TCACCCTCAA TGGAGAGGGT 1250 GTTCTGGGGC TGTCCAGGTC TCCAGAGAGG CTATGTCCCT GCCTACTTTG GTGGATTTCA 1310 AATCCAGACA GGGTAGTCAC ACCAGGCTAC AGGAGCCTGG CTAAAAGGGG GGGGGGGGCT 1370 GTTACTGTGG CATCCCCTCT CTCAGCCAGC ACAAAGAGCT GTTTTGTTTT GTTTTGTTTT 1430 GTTTTGTTTT GTTTCGTTTT GTTTCGTTTT GTTTTGTCTT GTATTGTTGG TGGTGGTTGG 1490 TTGGGTTTTG TTTGTTTGTT TTTGTTTGCT TTGTTTTGTT CTTGAGACAG GGTCTGACTG 1550 TGAAACCCTG GCTAATCTGG AACTCACTAT GTAGACCAGA CTGGTCTTGA ACTCACAGAG 1610 ATCCAACTGC CTTTGCCTCC CAAGTGTTGG GATGAAAGGC ATGTACTACG CCTGGCCCCA 1670 ACACCAAGAG ATTATTTAAC ATTCTATTTA ATTAAGGGGT AGGAAAATGA ATGGGCTGGT 1730 CCCAGGATGT TCATGAAAGG GACACAATAC AGTGTTCTGC CCACTTTTTA ATAAAATTTA 1790 CATGTGATTG GCCTGTTAAG GCCCAATTCT AGAGCTGGCC TCCCAGAAAG ATGGAGGCAT 1850 CAAGAGTGGG AGGGTGTCCT CCAGAGAGGG GTTGCTACTT CCCAGCAGGC ATGGGGGGAG 1910 CATTGACAA 1919

【０１８２】配列番号： 2 配列の長さ： 333 配列の型 ： アミノ酸 鎖の数： 直鎖状 配列の種類： タンパク質 起源： 生物名： ヒト 株名： ＴＹＨ細胞 細胞の種類： 組織球腫細胞株 配列： Met Thr Ser Lys Ser His Trp Lys Leu Leu Ala Leu Ala Leu Val Leu 1 5 10 15 Val Val Val Met Val Trp Tyr Ser Ile Ser Arg Glu Asp Arg Tyr Ile 20 25 30 Glu Phe Phe Tyr Phe Pro Ile Ser Glu Lys Lys Glu Pro Cys Phe Gln 35 40 45 Gly Glu Ala Glu Arg Gln Ala Ser Lys Ile Phe Gly Asn Arg Ser Arg 50 55 60 Asp Gln Pro Ile Phe Leu Gln Leu Lys Asp Tyr Phe Trp Val Lys Thr 65 70 75 80 Pro Ser Thr Tyr Glu Leu Pro Phe Gly Thr Lys Gly Ser Glu Asp Leu 85 90 95 Leu Leu Arg Val Leu Ala Ile Thr Ser Tyr Ser Ile Pro Glu Ser Ile 100 105 110 Lys Ser Leu Glu Cys Arg Arg Cys Val Val Val Gly Asn Gly His Arg 115 120 125 Leu Arg Asn Ser Ser Leu Gly Gly Val Ile Asn Lys Tyr Asp Val Val 130 135 140 Ile Arg Leu Asn Asn Ala Pro Val Ala Gly Tyr Glu Gly Asp Val Gly 145 150 155 160 Ser Lys Thr Thr Ile Arg Leu Phe Tyr Pro Glu Ser Ala His Phe Asp 165 170 175 Pro Lys Ile Glu Asn Asn Pro Asp Thr Leu Leu Val Leu Val Ala Phe 180 185 190 Lys Ala Met Asp Phe His Trp Ile Glu Thr Ile Leu Ser Asp Lys Lys 195 200 205 Arg Val Arg Lys Gly Phe Trp Lys Gln Pro Pro Leu Ile Trp Asp Val 210 215 220 Asn Pro Lys Gln Val Arg Ile Leu Asn Pro Phe Phe Met Glu Ile Ala 225 230 235 240 Ala Asp Lys Leu Leu Ser Leu Pro Ile Gln Gln Pro Arg Lys Ile Lys 245 250 255 Gln Lys Pro Thr Thr Gly Leu Leu Ala Ile Thr Leu Ala Leu His Leu 260 265 270 Cys Asp Leu Val His Ile Ala Gly Phe Gly Tyr Pro Asp Ala Ser Asn 275 280 285 Lys Lys Gln Thr Ile His Tyr Tyr Glu Gln Ile Thr Leu Lys Ser Met 290 295 300 Ala Gly Ser Gly His Asn Val Ser Gln Glu Ala Ile Ala Ile Lys Arg 305 310 315 320 Met Leu Glu Met Gly Ala Val Lys Asn Leu Thr Tyr Phe 325 330 333 SEQ ID NO: 2 Sequence Length: 333 Sequence Type: Amino Acid Number of Chains: Linear Sequence Type: Protein Origin: Organ Name: Human Strain Name: TYH Cell Cell Type: Histiocytoma Cell Line Sequence: Met Thr Ser Lys Ser His Trp Lys Leu Leu Ala Leu Ala Leu Val Leu 1 5 10 15 Val Val Val Met Val Trp Tyr Ser Ile Ser Arg Glu Asp Arg Tyr Ile 20 25 30 Glu Phe Phe Tyr Phe Pro Ile Ser Glu Lys Lys Glu Pro Cys Phe Gln 35 40 45 Gly Glu Ala Glu Arg Gln Ala Ser Lys Ile Phe Gly Asn Arg Ser Arg 50 55 60 Asp Gln Pro Ile Phe Leu Gln Leu Lys Asp Tyr Phe Trp Val Lys Thr 65 70 75 80 Pro Ser Thr Tyr Glu Leu Pro Phe Gly Thr Lys Gly Ser Glu Asp Leu 85 90 95 Leu Leu Arg Val Leu Ala Ile Thr Ser Tyr Ser Ile Pro Glu Ser Ile 100 105 110 Lys Ser Leu Glu Cys Arg Arg Cys Val Val Val Gly Asn Gly His Arg 115 120 125 Leu Arg Asn Ser Ser Leu Gly Gly Val Ile Asn Lys Tyr Asp Val Val 130 135 140 Ile Arg Leu Asn Asn Ala Pro Val Ala Gly Tyr Glu Gly Asp Val Gly 145 150 155 160 Ser Lys Thr Thr Ile Arg Leu Phe Tyr Pro Glu Ser Ala His Phe Asp 165 170 175 Pro Lys Ile Glu Asn Asn Pro Asp Thr Leu Leu Val Leu Val Ala Phe 180 185 190 Lys Ala Met Asp Phe His Trp Ile Glu Thr Ile Leu Ser Asp Lys Lys 195 200 205 Arg Val Arg Lys Gly Phe Trp Lys Gln Pro Pro Leu Ile Trp Asp Val 210 215 220 Asn Pro Lys Gln Val Arg Ile Leu Asn Pro Phe Phe Met Glu Ile Ala 225 230 235 240 Ala Asp Lys Leu Leu Ser Leu Pro Ile Gln Gln Pro Arg Lys Ile Lys 245 250 255 Gln Lys Pro Thr Thr Gly Leu Leu Ala Ile Thr Leu Ala Leu His Leu 260 265 270 Cys Asp Leu Val His Ile Ala Gly Phe Gly Tyr Pro Asp Ala Ser Asn 275 280 285 Lys Lys Gln Thr Ile His Tyr Tyr Glu Gln Ile Thr Leu Lys Ser Met 290 295 300 Ala Gly Ser Gly His Asn Val Ser Gln Glu Ala Ile Ala Ile Lys Arg 305 310 315 320 Met Leu Glu Met Gly Ala Val Lys Asn Leu Thr Tyr Phe 325 330 333

【０１８３】配列番号：３ 配列の長さ：52 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCGACAAGCT TGATATCGGC CTGTGAGGCC TCACTGGCCG CGGCCGCGGT AC 52SEQ ID NO: 3 Sequence Length: 52 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Double Strand Topology: Linear Sequence Type: Other Nucleic Acid Synthetic DNA Sequence TCGACAAGCT TGATATCGGC CTGTGAGGCC TCACTGGCCG CGGCCGCGGT AC 52

【０１８４】配列番号：４ 配列の長さ：44 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGCGGCCGCG GCCAGTGAGG CCTCACAGGC CGATATCAAG CTTG 44SEQ ID NO: 4 Sequence Length: 44 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Double Strand Topology: Linear Sequence Type: Other Nucleic Acid Synthetic DNA Sequence CGCGGCCGCG GCCAGTGAGG CCTCACAGGC CGATATCAAG CTTG 44

【０１８５】配列番号：５ 配列の長さ：11 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTTTAGAGCA C 11SEQ ID NO: 5 Sequence Length: 11 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Double Strand Topology: Linear Sequence Type: Other Nucleic Acid Synthetic DNA Sequence CTTTAGAGCA C 11

【０１８６】配列番号： 6 配列の長さ： 1766 配列の型： 核酸 鎖の数： 二本鎖 配列の種類： cDNA to mRNA 起源： 生物名： ヒト 株名： WM266-4細胞 細胞の種類： メラノーマ 配列： CGGTCAGGTC CAGCACTTGG GAGCTGACTG TGCTGGAGGT GACAGGCTTT GCGGGGTCCG 60 CCTGTGTGCA GGAGTCGCAA GGTCGCTGAG CAGGACCCAA AGGTGGCCCG AGGCAGCCGG 120 GATGACAGCT CTCCCCAGGA ATCCTGCTGC CTGCTGAGAA AC ATG GTC AGC AAG 174 Met Val Ser Lys 1 TCC CGC TGG AAG CTC CTG GCC ATG TTG GCT CTG GTC CTG GTC GTC ATG 222 Ser Arg Trp Lys Leu Leu Ala Met Leu Ala Leu Val Leu Val Val Met 5 10 15 20 GTG TGG TAT TCC ATC TCC CGG GAA GAC AGT TTT TAT TTT CCC ATC CCA 270 Val Trp Tyr Ser Ile Ser Arg Glu Asp Ser Phe Tyr Phe Pro Ile Pro 25 30 35 GAG AAG AAG GAG CCG TGC CTC CAG GGT GAG GCA GAG AGC AAG GCC TCT 318 Glu Lys Lys Glu Pro Cys Leu Gln Gly Glu Ala Glu Ser Lys Ala Ser 40 45 50 AAG CTC TTT GGC AAC TAC TCC CGG GAT CAG CCC ATC TTC CTG CGG CTT 366 Lys Leu Phe Gly Asn Tyr Ser Arg Asp Gln Pro Ile Phe Leu Arg Leu 55 60 65 GAG GAT TAT TTC TGG GTC AAG ACG CCA TCT GCT TAC GAG CTG CCC TAT 414 Glu Asp Tyr Phe Trp Val Lys Thr Pro Ser Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr 70 75 80 GGG ACC AAG GGG AGT GAG GAT CTG CTC CTC CGG GTG CTA GCC ATC ACC 462 Gly Thr Lys Gly Ser Glu Asp Leu Leu Leu Arg Val Leu Ala Ile Thr 85 90 95 100 AGC TCC TCC ATC CCC AAG AAC ATC CAG AGC CTC AGG TGC CGC CGC TGT 510 Ser Ser Ser Ile Pro Lys Asn Ile Gln Ser Leu Arg Cys Arg Arg Cys 105 110 115 GTG GTC GTG GGG AAC GGG CAC CGG CTG CGG AAC AGC TCA CTG GGA GAT 558 Val Val Val Gly Asn Gly His Arg Leu Arg Asn Ser Ser Leu Gly Asp 120 125 130 GCC ATC AAC AAG TAC GAT GTG GTC ATC AGA TTG AAC AAT GCC CCA GTG 606 Ala Ile Asn Lys Tyr Asp Val Val Ile Arg Leu Asn Asn Ala Pro Val 135 140 145 GCT GGC TAT GAG GGT GAC GTG GGC TCC AAG ACC ACC ATG CGT CTC TTC 654 Ala Gly Tyr Glu Gly Asp Val Gly Ser Lys Thr Thr Met Arg Leu Phe 150 155 160 TAC CCT GAA TCT GCC CAC TTC GAC CCC AAA GTA GAA AAC AAC CCA GAC 702 Tyr Pro Glu Ser Ala His Phe Asp Pro Lys Val Glu Asn Asn Pro Asp 165 170 175 180 ACA CTC CTC GTC CTG GTA GCT TTC AAG GCA ATG GAC TTC CAC TGG ATT 750 Thr Leu Leu Val Leu Val Ala Phe Lys Ala Met Asp Phe His Trp Ile 185 190 195 GAG ACC ATC CTG AGT GAT AAG AAG CGG GTG CGA AAG GGT TTC TGG AAA 798 Glu Thr Ile Leu Ser Asp Lys Lys Arg Val Arg Lys Gly Phe Trp Lys 200 205 210 CAG CCT CCC CTC ATC TGG GAT GTC AAT CCT AAA CAG ATT CGG ATT CTC 846 Gln Pro Pro Leu Ile Trp Asp Val Asn Pro Lys Gln Ile Arg Ile Leu 215 220 225 AAC CCC TTC TTC ATG GAG ATT GCA GCT GAC AAA CTG CTG AGC CTG CCA 894 Asn Pro Phe Phe Met Glu Ile Ala Ala Asp Lys Leu Leu Ser Leu Pro 230 235 240 ATG CAA CAG CCA CGG AAG ATT AAG CAG AAG CCC ACC ACG GGC CTG TTG 942 Met Gln Gln Pro Arg Lys Ile Lys Gln Lys Pro Thr Thr Gly Leu Leu 245 250 255 260 GCC ATC ACG CTG GCC CTC CAC CTC TGT GAC TTG GTG CAC ATT GCC GGC 990 Ala Ile Thr Leu Ala Leu His Leu Cys Asp Leu Val His Ile Ala Gly 265 270 275 TTT GGC TAC CCA GAC GCC TAC AAC AAG AAG CAG ACC ATT CAC TAC TAT 1038 Phe Gly Tyr Pro Asp Ala Tyr Asn Lys Lys Gln Thr Ile His Tyr Tyr 280 285 290 GAG CAG ATC ACG CTC AAG TCC ATG GCG GGG TCA GGC CAT AAT GTC TCC 1086 Glu Gln Ile Thr Leu Lys Ser Met Ala Gly Ser Gly His Asn Val Ser 295 300 305 CAA GAG GCC CTG GCC ATT AAG CGG ATG CTG GAG ATG GGA GCT ATC AAG 1134 Gln Glu Ala Leu Ala Ile Lys Arg Met Leu Glu Met Gly Ala Ile Lys 310 315 320 AAC CTC ACG TCC TTC TGA CCTGGGCAAG AGCTGTAGCC TGTCGGTTGC 1182 Asn Leu Thr Ser Phe TER 325 329 CTACTCTGCT GTCTGGGTGA CCCCCATGCG TGGCTGTGGG GGTGGCTGGT GCCAGTATGA 1242 CCCACTTGGA CTCACCCCCT CTTGGGGAGG GAGTTCTGGG CCTGGCCAGG TCTGAGATGA 1302 GGCCATGCCC CTGGCTGCTC TTATGGAGCC GAGATCCAGT CAGGGTGGGG GCGCTGGAGC 1362 CGTGGGAGCC CGGCCAGGGC AGGGGGCTCG TCGCTGTGGC ACCCCCTCTC TGCCAGCACC 1422 AAGAGATTAT TTAATGGGCT ATTTAATTAA GGGGTAGGAA GGTGCTGTGG GCTGGTCCCA 1482 CACATCCAGG AAAGAGGCCA GTAGAGAATT CTGCCCACTT TTTATAAAAA CTTACAGCGA 1542 TGGCCCCACC AAGGCCTAGA CACGGCACTG GCCTCCCAGG AGGGCAGGGG CATTGGGAAT 1602 GGGTGGGTGC CCTCCAGAGA GGGGCTGCTA CCTCCCAGCA GGCATGGGAA GAGCACTGGT 1662 GTGGGGGTTC CACCGAGAAG GGGACCTCAT CTAGAAAAGA GGTTACAAAC CTACCATTAA 1722 ACTATTTTTC CTAAAACGGA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAA 1766SEQ ID NO: 6 Sequence Length: 1766 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Double Strand Sequence Type: cDNA to mRNA Origin: Organism Name: Human Strain Name: WM266-4 Cell Cell Type: Melanoma Sequences: CGGTCAGGTC CAGCACTTGG GAGCTGACTG TGCTGGAGGT GACAGGCTTT GCGGGGTCCG 60 CCTGTGTGCA GGAGTCGCAA GGTCGCTGAG CAGGACCCAA AGCT AG LyctCTG CGC CGCAGCTG CGC Serving Trp Lys Leu Leu Ala Met Leu Ala Leu Val Leu Val Val Met 5 10 15 20 GTG TGG TAT TCC ATC TCC CGG GAA GAC AGT TTT TAT TTT CCC ATC CCA 270 Val Trp Tyr Ser Ile Ser Arg Glu Asp Ser Phe Tyr Phe Pro Ile Pro 25 30 35 GAG AAG AAG GAG CCG TGC CTC CAG GGT GAG GCA GAG AGC AAG GCC TCT 318 Glu Lys Lys Glu Pro Cys Leu Gln Gly Glu Ala Glu Ser Lys Ala Ser 40 45 50 AAG CTC TTT GGC AAC TAC TCC CGG GAT CAG CCC ATC TTC CTG CGG CTT 366 Lys Leu Phe Gly Asn Tyr Ser Arg Asp Gln Pro Il e Phe Leu Arg Leu 55 60 65 GAG GAT TAT TTC TGG GTC AAG ACG CCA TCT GCT TAC GAG CTG CCC TAT 414 Glu Asp Tyr Phe Trp Val Lys Thr Pro Ser Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr 70 75 80 GGG ACC AAG GGG AGT GAG GAT CTG CTC CTC CGG GTG CTA GCC ATC ACC 462 Gly Thr Lys Gly Ser Glu Asp Leu Leu Leu Arg Val Leu Ala Ile Thr 85 90 95 100 AGC TCC TCC ATC CCC AAG AAC ATC CAG AGC CTC AGG TGC CGC CGC TGT 510 Ser Ser Ser Ile Pro Lys Asn Ile Gln Ser Leu Arg Cys Arg Arg Cys 105 110 115 GTG GTC GTG GGG AAC GGG CAC CGG CTG CGG AAC AGC TCA CTG GGA GAT 558 Val Val Val Gly Asn Gly His Arg Leu Arg Asn Ser Ser Leu Gly Asp 120 125 130 GCC ATC AAC AAG TAC GAT GTG GTC ATC AGA TTG AAC AAT GCC CCA GTG 606 Ala Ile Asn Lys Tyr Asp Val Val Ile Arg Leu Asn Asn Ala Pro Val 135 140 145 GCT GGC TAT GAG GGT GAC GTG GGC TCC AAG ACC ACC ATG CGT CTC TTC 654 Ala Gly Tyr Glu Gly Asp Val Gly Ser Lys Thr Thr Met Arg Leu Phe 150 155 160 TAC CCT GAA TCT GCC CAC TTC GAC CCC AAA GTA GAA AAC AAC CCA GAC 702 Tyr Pro Glu Ser Ala His Phe Asp Pro Lys Va l Glu Asn Asn Pro Asp 165 170 175 180 ACA CTC CTC GTC CTG GTA GCT TTC AAG GCA ATG GAC TTC CAC TGG ATT 750 Thr Leu Leu Val Leu Val Ala Phe Lys Ala Met Asp Phe His Trp Ile 185 190 195 GAG ACC ATC CTG AGT GAT AAG AAG CGG GTG CGA AAG GGT TTC TGG AAA 798 Glu Thr Ile Leu Ser Asp Lys Lys Arg Val Arg Lys Gly Phe Trp Lys 200 205 210 CAG CCT CCC CTC ATC TGG GAT GTC AAT CCT AAA CAG ATT CGG ATT CTC 846 Gln Pro Pro Leu Ile Trp Asp Val Asn Pro Lys Gln Ile Arg Ile Leu 215 220 225 AAC CCC TTC TTC ATG GAG ATT GCA GCT GAC AAA CTG CTG AGC CTG CCA 894 Asn Pro Phe Phe Met Glu Ile Ala Ala Asp Lys Leu Leu Ser Leu Pro 230 235 240 ATG CAA CAG CCA CGG AAG ATT AAG CAG AAG CCC ACC ACG GGC CTG TTG 942 Met Gln Gln Pro Arg Lys Ile Lys Gln Lys Pro Thr Thr Gly Leu Leu 245 250 255 260 GCC ATC ACG CTG GCC CTC CAC CTC TGT GAC TTG GTG CAC ATT GCC GGC 990 Ala Ile Thr Leu Ala Leu His Leu Cys Asp Leu Val His Ile Ala Gly 265 270 275 TTT GGC TAC CCA GAC GCC TAC AAC AAG AAG CAG ACC ATT CAC TAC TAT 1038 Phe Gly Tyr Pro Asp Ala T yr Asn Lys Lys Gln Thr Ile His Tyr Tyr 280 285 290 GAG CAG ATC ACG CTC AAG TCC ATG GCG GGG TCA GGC CAT AAT GTC TCC 1086 Glu Gln Ile Thr Leu Lys Ser Met Ala Gly Ser Gly His Asn Val Ser 295 300 305 CAA GAG GCC CTG GCC ATT AAG CGG ATG CTG GAG ATG GGA GCT ATC AAG 1134 Gln Glu Ala Leu Ala Ile Lys Arg Met Leu Glu Met Gly Ala Ile Lys 310 315 320 AAC CTC ACG TCC TTC TGA CCTGGGCAAG AGCTGTAGCC TGTChe Leu TER 325 329 CTACTCTGCT GTCTGGGTGA CCCCCATGCG TGGCTGTGGG GGTGGCTGGT GCCAGTATGA 1242 CCCACTTGGA CTCACCCCCT CTTGGGGAGG GAGTTCTGGG CCTGGCCAGG TCTGAGATGA 1302 GGCCATGCCC CTGGCTGCTC TTATGGAGCC GAGATCCAGT CAGGGTGGGG GCGCTGGAGC 1362 CGTGGGAGCC CGGCCAGGGC AGGGGGCTCG TCGCTGTGGC ACCCCCTCTC TGCCAGCACC 1422 AAGAGATTAT TTAATGGGCT ATTTAATTAA GGGGTAGGAA GGTGCTGTGG GCTGGTCCCA 1482 CACATCCAGG AAAGAGGCCA GTAGAGAATT CTGCCCACTT TTTATAAAAA CTTACAGCGA 1542 TGGCCCCACC AAGGCCTAGA CACGGCACTG GCCTCCCAGG AGGGCAGGGG CATTGGGAAT 1602 GGGTGGGTGC CCTCCAGAGA GGGGCTGCTA CCTCCCAGCA GGCATGGGAA GAGCACTGGT 16 62 GTGGGGGTTC CACCGAGAAG GGGACCTCAT CTAGAAAAGA GGTTACAAAC CTACCATTAA 1722 ACTATTTTTC CTAAAACGGA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAA 1766

【０１８７】配列番号： 7 配列の長さ： 329 配列の型 ： アミノ酸 鎖の数： 直鎖状 配列の種類： タンパク質 起源： 生物名： ヒト 株名： WM266-4 細胞 細胞の種類： メラノーマ 配列： Met Val Ser Lys Ser Arg Trp Lys Leu Leu Ala Met Leu Ala Leu Val 1 5 10 15 Leu Val Val Met Val Trp Tyr Ser Ile Ser Arg Glu Asp Ser Phe Tyr 20 25 30 Phe Pro Ile Pro Glu Lys Lys Glu Pro Cys Leu Gln Gly Glu Ala Glu 35 40 45 Ser Lys Ala Ser Lys Leu Phe Gly Asn Tyr Ser Arg Asp Gln Pro Ile 50 55 60 Phe Leu Arg Leu Glu Asp Tyr Phe Trp Val Lys Thr Pro Ser Ala Tyr 65 70 75 80 Glu Leu Pro Tyr Gly Thr Lys Gly Ser Glu Asp Leu Leu Leu Arg Val 85 90 95 Leu Ala Ile Thr Ser Ser Ser Ile Pro Lys Asn Ile Gln Ser Leu Arg 100 105 110 Cys Arg Arg Cys Val Val Val Gly Asn Gly His Arg Leu Arg Asn Ser 115 120 125 Ser Leu Gly Asp Ala Ile Asn Lys Tyr Asp Val Val Ile Arg Leu Asn 130 135 140 Asn Ala Pro Val Ala Gly Tyr Glu Gly Asp Val Gly Ser Lys Thr Thr 145 150 155 160 Met Arg Leu Phe Tyr Pro Glu Ser Ala His Phe Asp Pro Lys Val Glu 165 170 175 Asn Asn Pro Asp Thr Leu Leu Val Leu Val Ala Phe Lys Ala Met Asp 180 185 190 Phe His Trp Ile Glu Thr Ile Leu Ser Asp Lys Lys Arg Val Arg Lys 195 200 205 Gly Phe Trp Lys Gln Pro Pro Leu Ile Trp Asp Val Asn Pro Lys Gln 210 215 220 Ile Arg Ile Leu Asn Pro Phe Phe Met Glu Ile Ala Ala Asp Lys Leu 225 230 235 240 Leu Ser Leu Pro Met Gln Gln Pro Arg Lys Ile Lys Gln Lys Pro Thr 245 250 255 Thr Gly Leu Leu Ala Ile Thr Leu Ala Leu His Leu Cys Asp Leu Val 260 265 270 His Ile Ala Gly Phe Gly Tyr Pro Asp Ala Tyr Asn Lys Lys Gln Thr 275 280 285 Ile His Tyr Tyr Glu Gln Ile Thr Leu Lys Ser Met Ala Gly Ser Gly 290 295 300 His Asn Val Ser Gln Glu Ala Leu Ala Ile Lys Arg Met Leu Glu Met 305 310 315 320 Gly Ala Ile Lys Asn Leu Thr Ser Phe 325 329SEQ ID NO: 7 Sequence Length: 329 Sequence Type: Amino Acid Number of Chains: Linear Sequence Type: Protein Origin: Organism Name: Human Strain Name: WM266-4 Cell Cell Type: Melanoma Sequence: Met Val Ser Lys Ser Arg Trp Lys Leu Leu Ala Met Leu Ala Leu Val 1 5 10 15 Leu Val Val Met Val Trp Tyr Ser Ile Ser Arg Glu Asp Ser Phe Tyr 20 25 30 Phe Pro Ile Pro Glu Lys Lys Glu Pro Cys Leu Gln Gly Glu Ala Glu 35 40 45 Ser Lys Ala Ser Lys Leu Phe Gly Asn Tyr Ser Arg Asp Gln Pro Ile 50 55 60 Phe Leu Arg Leu Glu Asp Tyr Phe Trp Val Lys Thr Pro Ser Ala Tyr 65 70 75 80 Glu Leu Pro Tyr Gly Thr Lys Gly Ser Glu Asp Leu Leu Leu Arg Val 85 90 95 Leu Ala Ile Thr Ser Ser Ser Ile Pro Lys Asn Ile Gln Ser Leu Arg 100 105 110 Cys Arg Arg Cys Val Val Val Gly Asn Gly His Arg Leu Arg Asn Ser 115 120 125 Ser Leu Gly Asp Ala Ile Asn Lys Tyr Asp Val Val Ile Arg Leu Asn 130 135 140 Asn Ala Pro Val Ala Gly Tyr Glu Gly Asp Val Gly Ser Lys Thr Thr 145 150 155 160 Met Arg Leu Phe Tyr Pro Glu Ser Ala His Phe Asp Pro Lys Val Glu 165 170 175 Asn Asn Pro Asp Thr Leu Leu Val Leu Val Ala Phe Lys Ala Met Asp 180 185 190 Phe His Trp Ile Glu Thr Ile Leu Ser Asp Lys Lys Arg Val Arg Lys 195 200 205 Gly Phe Trp Lys Gln Pro Pro Leu Ile Trp Asp Val Asn Pro Lys Gln 210 215 220 Ile Arg Ile Leu Asn Pro Phe Phe Met Glu Ile Ala Ala Asp Lys Leu 225 230 235 240 Leu Ser Leu Pro Met Gln Gln Pro Arg Lys Ile Lys Gln Lys Pro Thr 245 250 255 Thr Gly Leu Leu Ala Ile Thr Leu Ala Leu His Leu Cys Asp Leu Val 260 265 270 His Ile Ala Gly Phe Gly Tyr Pro Asp Ala Tyr Asn Lys Lys Gln Thr 275 280 285 Ile His Tyr Tyr Glu Gln Ile Thr Leu Lys Ser Met Ala Gly Ser Gly 290 295 300 His Asn Val Ser Gln Glu Ala Leu Ala Ile Lys Arg Met Leu Glu Met 305 310 315 320 Gly Ala Ile Lys Asn Leu Thr Ser Phe 325 329

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】は、プラスミドｐＡＧＥＬ１０６の造成工程を
示す図である。FIG. 1 is a diagram showing a construction process of a plasmid pAGEL106.

【図２】は、プラスミドｐＡＳＬＢ３−３−１の造成工
程を示す図である。FIG. 2 is a diagram showing a construction process of a plasmid pASLB3-3-1.

【図３】は、プラスミドｐＡＳＬＢ３−３の造成工程を
示す図である。FIG. 3 is a diagram showing a construction process of a plasmid pASLB3-3.

【図４】は、プラスミドｐＳＡＬＢＥ３−３の造成工程
を示す図である。FIG. 4 is a diagram showing a construction process of a plasmid pSALBE3-3.

【図５】は、プラスミドｐＡＳＬＢＣの造成工程を示す
図である。FIG. 5 is a diagram showing a construction process of a plasmid pASLBC.

【図６】は、プラスミドｐＡＳＬＢＥＣの造成工程を示
す図である。FIG. 6 is a diagram showing a construction process of a plasmid pASLBEC.

【図７】は、プラスミドｐＡＳＬＢＥＣ２の造成工程を
示す図である。FIG. 7 is a diagram showing a construction process of a plasmid pASLBEC2.

【図８】は、プラスミドｐＡＭｏＥＣ２の造成工程を示
す図である。FIG. 8 is a diagram showing a construction process of a plasmid pAMoEC2.

【図９】は、プラスミドｐＡＭｏＥＣ３の造成工程を示
す図である。FIG. 9 is a diagram showing a construction process of a plasmid pAMoEC3.

【図１０】は、プラスミドｐＡＭｏＥＲＣ３の造成工程
を示す図である。FIG. 10 is a diagram showing a construction process of a plasmid pAMoERC3.

【図１１】は、プラスミドｐＡＧＥ２０７の造成工程を
示す図である。FIG. 11 is a diagram showing a construction process of a plasmid pAGE207.

【図１２】は、プラスミドｐＡＧＥ２０７ＳｃＮの造成
工程を示す図である。FIG. 12 is a diagram showing a construction process of a plasmid pAGE207ScN.

【図１３】は、プラスミドｐＡＭｏＣ３Ｓｃの造成工程
を示す図である。FIG. 13 is a diagram showing a construction process of a plasmid pAMoC3Sc.

【図１４】は、プラスミドｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃの造成
工程を示す図である。FIG. 14 is a diagram showing a construction step of a plasmid pAMoERC3Sc.

【図１５】は、ｃＤＮＡライブラリーの造成工程を示す
図である。FIG. 15 is a diagram showing a construction process of a cDNA library.

【図１６】は、プラスミドｐＵＣ１１９−ＬＥＣの造成
工程を示す図である。FIG. 16 is a diagram showing a construction process of a plasmid pUC119-LEC.

【図１７】は、ＨＰＬＣを用いたシアリルトランスフェ
ラーゼ活性測定の結果を示す図である。ａ、ｂはｐＡＭ
ｏＥＲＬを導入したＫＪＭ−１株の、ｃ、ｄはベクター
であるｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃを導入したＫＪＭ−１株の
ＨＰＬＣのパターンをそれぞれ示す。ａ、ｃは糖供与体
であるCMP-シアル酸を含むアッセイ溶液を用いた時の、
ｂ、ｄはCMP-シアル酸を含まないアッセイ溶液を用いた
時のＨＰＬＣのパターンをそれぞれ示す。FIG. 17 is a diagram showing the results of sialyltransferase activity measurement using HPLC. a and b are pAM
The oERL-introduced KJM-1 strains, c and d, show the HPLC patterns of the KJM-1 strain in which the vector pAMoERC3Sc was introduced. a and c are when an assay solution containing the sugar donor CMP-sialic acid is used,
b and d show HPLC patterns when an assay solution containing no CMP-sialic acid was used.

【図１８】は、図１７のピーク１とピーク２をシアリダ
ーゼ処理後、ＨＰＬＣにより解析した結果を示す図であ
る。ａ、ｃはそれぞれシアリダーゼで未処理のピーク１
およびピーク２のＨＰＬＣのパターンを示す。ｂ、ｄは
それぞれシアリダーゼ処理後のピーク１およびピーク２
のＨＰＬＣのパターンを示す。FIG. 18 is a diagram showing the results of HPLC analysis of peak 1 and peak 2 of FIG. 17 after sialidase treatment. a and c are sialidase untreated peak 1
And the HPLC pattern of peak 2 is shown. b and d are peak 1 and peak 2 after sialidase treatment, respectively
The HPLC pattern of is shown.

【図１９】は、間接蛍光抗体染色後、フローセルソータ
ーＦＣＳ−１（日本分光社製）で解析を行った結果を示
す図である。ａはｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃを導入したＫＪ
Ｍ−１株について、ＫＭ−９３あるいは正常マウス血清
を用いて間接蛍光抗体染色を行った結果を示す。点線が
正常マウス血清を用いた場合のパターン、実線がＫＭ９
３を用いた場合のパターンをそれぞれ示す。ｂはｐＡＭ
ｏＥＲＬを導入したＫＪＭ−１株について、ＫＭ−９３
あるいは正常マウス血清を用いて間接蛍光抗体染色を行
った結果を示す。点線が正常マウス血清を用いた場合の
パターン、実線がＫＭ９３を用いた場合のパターンをそ
れぞれ示す。FIG. 19 is a diagram showing the results of analysis with a flow cell sorter FCS-1 (manufactured by JASCO Corporation) after indirect fluorescent antibody staining. a is KJ which introduced pAMoERC3Sc
The results of indirect fluorescent antibody staining of the M-1 strain using KM-93 or normal mouse serum are shown. The dotted line is the pattern when using normal mouse serum, the solid line is KM9
The patterns when 3 is used are shown. b is pAM
Regarding the KJM-1 strain into which oERL was introduced, KM-93
Alternatively, the results of indirect fluorescent antibody staining using normal mouse serum are shown. The dotted line shows the pattern when normal mouse serum was used, and the solid line shows the pattern when KM93 was used.

【図２０】は、プラスミドpAGE147 の造成工程を示す図
である。FIG. 20 is a diagram showing a construction step of plasmid pAGE147.

【図２１】は、プラスミドpAGE247 の造成工程を示す図
である。FIG. 21 is a diagram showing a construction step of plasmid pAGE247.

【図２２】は、プラスミドpAMN6hygの造成工程を示す図
である。FIG. 22 is a diagram showing a construction process of a plasmid pAMN6hyg.

【図２３】は、プラスミドpAMoERSAの造成工程を示す図
である。FIG. 23 is a diagram showing a construction process of a plasmid pAMoERSA.

【図２４】は、プラスミドpAMoPRC3Scの造成工程を示す
図である。FIG. 24 is a diagram showing a construction process of a plasmid pAMoPRC3Sc.

【図２５】は、プラスミドpAMoPRSAの造成工程を示す図
である。FIG. 25 is a diagram showing a construction step of plasmid pAMoPRSA.

【図２６】は、プラスミドpAMoPRSAL-35F の造成工程を
示す図である。FIG. 26 is a diagram showing a construction step of plasmid pAMoPRSAL-35F.

【図２７】は、プラスミドpUC119-WM17 の造成工程を示
す図である。FIG. 27 is a diagram showing a construction process of plasmid pUC119-WM17.

【図２８】は、間接蛍光抗体染色後、エピックス エリ
ート フローサイトメーター〔EPICS Elite Flow Cytom
eter；コールター（COULTER ）社製〕で解析を行なった
結果を示す図である。pAMoPRC3Sc（コントロールプラス
ミド）を導入したＫＪＭ−１株について、正常マウス血
清を用いて間接蛍光抗体染色を行なった結果を対照とし
て示した。また、pAMoPRC3Sc（コントロールプラスミ
ド）あるいはpAMoPRWM17（α２→３シアリルトランスフ
ェラーゼ発現プラスミド）を導入したＫＪＭ−１株につ
いてＫＭ９３を用いて間接蛍光抗体染色を行なった結果
をそれぞれpAMoPRC3Sc、pAMoPRWM17として示した。[Fig. 28] shows an EPICS Elite Flow Cytommeter after indirect fluorescent antibody staining.
eter; manufactured by Coulter Inc.] is a diagram showing the results of analysis. The KJM-1 strain introduced with pAMoPRC3Sc (control plasmid) was subjected to indirect fluorescent antibody staining using normal mouse serum, and the result is shown as a control. In addition, the results of indirect fluorescent antibody staining using KM93 for the KJM-1 strain into which pAMoPRC3Sc (control plasmid) or pAMoPRWM17 (α2 → 3 sialyltransferase expression plasmid) were shown are shown as pAMoPRC3Sc and pAMoPRWM17, respectively.

【図２９】は、プラスミドpAMoPRSAW17-31F の造成工程
を示す図である。FIG. 29 is a diagram showing a construction step of plasmid pAMoPRSAW17-31F.

【符号の説明】[Explanation of symbols]

dhfr ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子 hG-CSF ヒト顆粒球コロニー刺激因子 bp base pairs kb kilobase pairs G418/Km トランスポゾン５(Tn5) 由来G418、カナマ
イシン耐性遺伝子 hyg ハイグロマイシン耐性遺伝子 Ap pBR322由来アンピシリン耐性遺伝子 Tc pBR322由来テトラサイクリン耐性遺伝子 P1 pBR322由来P1プロモーター Ptk Herpes simplex virus (HSV)チミジンキナ
ーゼ(tk)遺伝子プロモーター Sp. βG ラビットβグロビン遺伝子スプライシング
シグナル A.βG ラビットβグロビン遺伝子ポリＡ付加シグ
ナル A. SE simian virus 40 (SV40)初期遺伝子ポリＡ
付加シグナル Atk Herpes simplex virus (HSV)チミジンキナ
ーゼ(tk)遺伝子のポリＡ付加シグナル Pse simian virus 40 (SV40)初期遺伝子プロモ
ーター Pmo モロニー・マウス白血病ウイルスのロング
・ターミナル・リピート（long terminal repeat : LT
R）プロモーター HTLV-1 ヒトＴ細胞白血病ウイルス(human T-cell
leukemia virus type-1:HTLV-1) 遺伝子 EBNA-1 エプスタイン・バール・ウイルス（Epstei
n-Barr virus）EBNA-1遺伝子 oriP エプスタイン・バール・ウイルス（Epstei
n-Barr virus) の複製開始点 ori pUC119の複製開始点 lac'Z 大腸菌のβガラクトシダーゼ遺伝子の一部 IG M13 ファージDNA のintergenic regiondhfr Dihydrofolate reductase gene hG-CSF Human granulocyte colony stimulating factor bp base pairs kb kilobase pairs G418 / Km transposon 5 (Tn5) -derived G418, kanamycin resistance gene hyg hygromycin resistance gene Ap pBR322-derived ampicillin resistance gene Tc pBR322-derived tetracycline Resistance gene P1 pBR322-derived P1 promoter Ptk Herpes simplex virus (HSV) Thymidine kinase (tk) gene promoter Sp. ΒG rabbit β globin gene splicing signal A. βG rabbit β globin gene poly A addition signal A. SE simian virus 40 (SV40) Early gene poly A
Additional signal Atk Herpes simplex virus (HSV) Thymidine kinase (tk) gene poly A additional signal Pse simian virus 40 (SV40) early gene promoter Pmo Moloney murine leukemia virus long terminal repeat (LT)
R) promoter HTLV-1 human T-cell leukemia virus
leukemia virus type-1: HTLV-1) gene EBNA-1 Epstein Barr virus (Epstei)
n-Barr virus) EBNA-1 gene oriP Epstein Barr virus (Epstei)
(n-Barr virus) origin of replication ori pUC119 origin of replication lac'Z Part of β-galactosidase gene of E. coli IG M13 phage DNA intergenic region

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｂ 8214−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 7823−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 37/52 8314−4Ｃ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 長谷川 護 神奈川県川崎市麻生区片平１−９−26─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁵ Identification code Office reference number FI technical display location C12P 21/02 B 8214-4B C12Q 1/68 A 7823-4B // A61K 37/52 8314-4C (C12N 1/21 C12R 1:19) (C12P 21/00 C12R 1:19) (72) Inventor Mamoru Hasegawa 1-9-26 Katahira, Aso-ku, Kawasaki City, Kanagawa Prefecture

Claims (25)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 配列番号２または７記載のアミノ酸配列
を有する新規α２→３シアリルトランスフェラーゼ。1. A novel α2 → 3 sialyltransferase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 7. 【請求項２】 請求項１記載のα２→３シアリルトラン
スフェラーゼをコードするｃＤＮＡまたは該ｃＤＮＡと
相同性を有するＤＮＡ。2. A cDNA encoding the α2 → 3 sialyltransferase according to claim 1, or a DNA having homology with the cDNA. 【請求項３】 配列番号１または６記載の塩基配列を有
するＤＮＡ。3. A DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 6. 【請求項４】 請求項１記載のα２→３シアリルトラン
スフェラーゼをコードするｃＤＮＡが組み込まれた組換
え体ベクター。4. A recombinant vector incorporating the cDNA encoding the α2 → 3 sialyltransferase according to claim 1. 【請求項５】 配列番号１または６記載の塩基配列を有
するＤＮＡが組み込まれた組換え体ベクター。5. A recombinant vector incorporating a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 6. 【請求項６】 動物細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型と
して合成したｃＤＮＡを発現クローニングベクターに組
み込むことによりｃＤＮＡライブラリーを構築し、該ｃ
ＤＮＡライブラリーを細胞に導入し、得られる細胞を、
その細胞の増殖を抑制する活性を有するレクチンの存在
下で培養し、増殖する細胞を単離し、該細胞よりα２→
３シアリルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡを
採取することを特徴とする請求項２または３記載のＤＮ
Ａの製造法。6. A cDNA library is constructed by incorporating a cDNA synthesized using an mRNA extracted from an animal cell as a template into an expression cloning vector, and
The DNA library is introduced into cells, and the resulting cells are
The cells are cultured in the presence of a lectin having an activity of suppressing the growth of the cells, and the cells that grow are isolated.
The DN according to claim 2 or 3, wherein a cDNA encoding 3 sialyltransferase is collected.
Manufacturing method of A. 【請求項７】 動物細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型と
して合成したｃＤＮＡを発現クローニングベクターに組
み込むことによりｃＤＮＡライブラリーを構築し、該ｃ
ＤＮＡライブラリーを細胞に導入し、得られる細胞を、
その細胞の増殖を抑制する活性を有するレクチンの存在
下で培養し、増殖する細胞を単離し、該細胞よりα２→
３シアリルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡを
ベクター中のプロモーターの下流に導入することを特徴
とする請求項４または５記載の組換え体ベクターの製造
法。7. A cDNA library is constructed by incorporating a cDNA synthesized using an mRNA extracted from an animal cell as a template into an expression cloning vector, and c
The DNA library is introduced into cells, and the resulting cells are
The cells are cultured in the presence of a lectin having an activity of suppressing the growth of the cells, and the cells that grow are isolated.
The method for producing a recombinant vector according to claim 4 or 5, wherein a cDNA encoding 3 sialyltransferase is introduced downstream of the promoter in the vector. 【請求項８】 請求項４または５記載の組換え体ベクタ
ーを保有する細胞を培地に培養し、培養物中にα２→３
シアリルトランスフェラーゼを生成蓄積させ、該培養物
からα２→３シアリルトランスフェラーゼを採取するこ
とを特徴とする請求項１記載のα２→３シアリルトラン
スフェラーゼの製造法。8. A cell harboring the recombinant vector according to claim 4 or 5 is cultured in a medium, and α2 → 3 in the culture.
The method for producing α2 → 3 sialyltransferase according to claim 1, wherein α2 → 3 sialyltransferase is collected from the culture by accumulating and accumulating sialyltransferase. 【請求項９】 動物細胞がＴＹＨ細胞またはヒトメラノ
ーマＷＭ２６６−４細胞である請求項６記載のＤＮＡの
製造法。9. The method for producing DNA according to claim 6, wherein the animal cell is TYH cell or human melanoma WM266-4 cell. 【請求項１０】 動物細胞がＴＹＨ細胞またはヒトメラ
ノーマＷＭ２６６−４細胞である請求項７記載の組換え
体ベクターの製造法。10. The method for producing a recombinant vector according to claim 7, wherein the animal cell is TYH cell or human melanoma WM266-4 cell. 【請求項１１】 レクチンがヒママメレクチン１２０で
ある請求項６記載のＤＮＡの製造法。11. The method for producing a DNA according to claim 6, wherein the lectin is bean lectin 120. 【請求項１２】 レクチンがヒママメレクチン１２０で
ある請求項７記載の組換え体ベクターの製造法。12. The method for producing a recombinant vector according to claim 7, wherein the lectin is Lima bean lectin 120. 【請求項１３】 プラスミドｐＵＣ１１９−ＬＥＣ。13. The plasmid pUC119-LEC. 【請求項１４】 プラスミドｐＵＣ１１９−ＷＭ１７。14. The plasmid pUC119-WM17. 【請求項１５】 請求項４または５記載の組換え体ベク
ターを含有する細胞。15. A cell containing the recombinant vector according to claim 4 or 5. 【請求項１６】 請求項１５記載の細胞を用いて糖タン
パク質または糖脂質が有するラクトサミン構造の非還元
末端にα２→３結合でシアル酸を付与する方法。16. A method for imparting α2 → 3 sialic acid to the non-reducing end of the lactosamine structure of a glycoprotein or glycolipid using the cell according to claim 15. 【請求項１７】 請求項１５記載の細胞を用いて糖タン
パク質または糖脂質の非還元末端をSialyl-Le ^X 構造に
変換する方法。17. A method for converting the non-reducing end of a glycoprotein or glycolipid into a Sialyl-Le ^X structure using the cell according to claim 15. 【請求項１８】 請求項１記載のα２→３シアリルトラ
ンスフェラーゼを用いて糖タンパク質または糖脂質が有
するラクトサミン構造の非還元末端にα２→３結合でシ
アル酸を付与する方法。18. A method for imparting sialic acid by an α2 → 3 bond to the non-reducing end of the lactosamine structure of a glycoprotein or glycolipid using the α2 → 3 sialyltransferase according to claim 1. 【請求項１９】 請求項１記載のα２→３シアリルトラ
ンスフェラーゼを用いて糖タンパク質または糖脂質の非
還元末端をSialyl-Le ^X 構造に変換する方法。19. A method for converting the non-reducing end of a glycoprotein or glycolipid into a Sialyl-Le ^X structure using the α2 → 3 sialyltransferase according to claim 1. 【請求項２０】 請求項２または３記載のＤＮＡを用い
るハイブリダイゼーション法により、請求項１記載のα
２→３シアリルトランスフェラーゼを検出する方法。20. The α according to claim 1, which is obtained by the hybridization method using the DNA according to claim 2 or 3.
A method for detecting 2 → 3 sialyltransferase. 【請求項２１】 請求項２または３記載のＤＮＡの塩基
配列に基づくオリゴペプチドをプローブとして用いるポ
リメラーゼ・チェイン・リアクション法により請求項１
記載のα２→３シアリルトランスフェラーゼを検出する
方法。21. The polymerase chain reaction method, wherein the oligopeptide based on the nucleotide sequence of the DNA according to claim 2 or 3 is used as a probe.
A method for detecting the described α2 → 3 sialyltransferase. 【請求項２２】 請求項２または３記載のＤＮＡの塩基
配列の一部または全部を含むオリゴヌクレオチドを用い
て請求項１記載のα２→３シアリルトランスフェラーゼ
を生産を抑制する方法。22. A method for suppressing the production of α2 → 3 sialyltransferase according to claim 1, using an oligonucleotide containing a part or all of the nucleotide sequence of the DNA according to claim 2 or 3. 【請求項２３】 請求項４または５記載の組換え体ベク
ターを含有する大腸菌。23. Escherichia coli containing the recombinant vector according to claim 4 or 5. 【請求項２４】 Escherichia coli HB101/pUC119-LEC
(FERM BP-3625) 。24. Escherichia coli HB101 / pUC119-LEC
(FERM BP-3625). 【請求項２５】 Escherichia coli HB101/pUC119-WM17
(FERM BP-4013)。25. Escherichia coli HB101 / pUC119-WM17
(FERM BP-4013).